ES2901212T3

ES2901212T3 - Procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica

Info

Publication number: ES2901212T3
Application number: ES17808919T
Authority: ES
Inventors: Robert Ventzki; Fred S Wouters-Bunt
Original assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2022-03-21
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: RU2019120838A; DE102016123458B3; CA3046046C; AU2017373587A1; KR20190092446A; CN110036272B; RU2019120838A3; CA3046046A1; JP2020501141A; BR112019011494A2; WO2018104282A1; JP6906813B2; US11662332B2; CN110036272A; EP3548864A1; KR102427233B1; AU2017373587B2; EP3548864B1; US20190302053A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica, en el que se aclara de manera electroforética tejido biológico (2), sumergiéndose el tejido en una solución de electroforesis alcalina acuosa (23), y exponiéndose en la solución de electroforesis a un campo eléctrico, en donde la solución de electroforesis contiene una base en una concentración de 5 mol/m3 a 100 mol/m3 y un detergente en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v), caracterizado por que la base es una base tampón, cuyos cationes presentan un peso molecular de al menos 50 Da, y por que el detergente es un detergente no iónico.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de este tipo, en el que se aclara de manera electroforética tejido biológico, sumergiéndose el tejido en una solución de electroforesis alcalina acuosa y exponiéndose en la solución de electroforesis a un campo eléctrico, conteniendo la solución de electroforesis una base y un detergente.

Los preparados biológicos transparentes son necesarios para poder reproducir los preparados tridimensionalmente por ejemplo por medio de microscopía óptica. Para conseguir la transparencia de preparados biológicos han de separarse en particular los grupos hemo de la sustancia colorante sanguínea hemoglobina y los lípidos de los preparados biológicos.

Estado de la técnica

Por el documento US 2015/0144490 A1 se conoce un modo de procedimiento conocido también como procedimiento CLARITY en la preparación de muestras biológicas para el análisis microscópico. En el procedimiento CLARITY se fija la respectiva muestra en primer lugar en hidrogel. Sólo después de esto se añade la muestra a una solución de electroforesis alcalina acuosa y se expone en esta solución de electroforesis a un campo eléctrico. La solución de electroforesis contiene ácido bórico, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,4 % (m/v) e hidróxido de sodio (NaOH) para el ajuste de un valor de pH de 8,5. La solución de electroforesis se hace circular en la cámara, en la que se expone la respectiva muestra al campo eléctrico. La temperatura de la solución de electroforesis asciende a este respecto a 37-50 °C, la tensión eléctrica aplicada a 10-60 V (sin indicación del trayecto por el que cae esta tensión). Prácticamente requiere el aclaramiento electroforético según el procedimiento CLARITY algunos días. Tras el aclaramiento electroforético se transfiere la muestra a un medio con un índice de refracción de 1,5 y ésta adicionalmente puede teñirse, por ejemplo, por medio de tinción con anticuerpos.

El documento US 2005/0130317 A1 describe un dispositivo para el análisis paralelo de moléculas biológicas con un espacio de reacción que se extiende por dos electrodos. En los electrodos se aplica una tensión que conduce a una migración de las moléculas biológicas introducidas entre los electrodos.

Por el documento WO 2017/096248 A1 no publicado hasta la fecha de prioridad de esta solicitud de patente se conocen procedimientos para la preparación y análisis de muestras de tejido tumoral para detectar y controlar tumores. Los procedimientos presentan el tratamiento de una muestra biológica mediante fijación de la muestra en presencia de subunidades de hidrogel, la polimerización de las subunidades de hidrogel para la formación de una muestra incrustada en hidrogel, el aclaramiento de la muestra incrustada en hidrogel y la marcación de la muestra incrustada en hidrogel aclarada con uno o varios marcadores que pueden detectarse. El aclaramiento de la muestra comprende por ejemplo la exposición frente a disolventes orgánicos, la exposición frente a detergentes, tal como por ejemplo saponina, Triton X-100 y Tween-20, la exposición frente a agentes tensioactivos iónicos, por ejemplo dodecilsulfato de sodio (SDS), y en particular la electroforesis usando una solución tampón, que presenta un agente tensioactivo iónico, en particular dodecilsulfato de sodio.

Objetivo de la invención

La invención se basa en el objetivo de mostrar un procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica, que sea menos costoso y considerablemente más rápido que el procedimiento CLARITY conocido.

Solución

El objetivo de la invención se consigue mediante un procedimiento con las características de la reivindicación 1 independiente. Las reivindicaciones dependientes se refieren a formas de realización preferentes del procedimiento de acuerdo con la invención.

Descripción de la invención

En un procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica se aclara de manera electroforética tejido biológico, sumergiendo el tejido en una solución de electroforesis alcalina acuosa y exponiéndose en la solución de electroforesis a un campo eléctrico. La solución de electroforesis contiene una base tampón, cuyos cationes presentan un peso molecular de al menos 50 Da, en una concentración de 5 mol/m3 a 100 mol/m3 (5 a 100 mmol/l) y un detergente no iónico en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v, es decir peso en kilogramo con respecto al volumen en litro).

Con la base tampón, cuyos cationes presentan un peso molecular de al menos 50 Da, si bien ajusta la base tampón la alcalinidad deseada de la solución de electroforesis, sus cationes son, sin embargo - en particular en comparación con iones sodio - comparativamente grandes e inmóviles. Esto tiene como consecuencia que el campo eléctrico no produce particularmente sólo una corriente eléctrica en forma de cationes movidos de la base tampón, sino también, con respecto a una proporción esencial, una corriente de micelas en las que están incluidos grupos hemo y/o lípidos en el detergente. La corriente eléctrica a base de estas micelas conduce al aclaramiento deseado del tejido biológico, retirando ésta las micelas y con ello los grupos hemo y lípidos del tejido biológico.

Usando un detergente no iónico en el procedimiento de acuerdo con la invención, no se produce tampoco ninguna corriente eléctrica provocada por el campo eléctrico aplicado en forma de iones de detergente, que sería sólo parasitaria como tal al igual que una corriente de los cationes de la base tampón con relación al aclaramiento pretendido del tejido biológico. La consecuencia de tales corrientes iónicas parasitarias sería entre otras cosas un calentamiento del tejido biológico, sin que este calentamiento estuviera unido con un aclaramiento el tejido biológico. Las corrientes parasitarias impedirían también que puedan formarse campos eléctricos de intensidad de campo más grande por encima del tejido biológico, ya que las grandes corrientes provocadas por esto calentarían mucho el tejido biológico. Tales campos eléctricos de intensidad de campo más grande son ventajosos sin embargo para la retirada eléctrica también de micelas más grandes y correspondientemente inmóviles del tejido biológico.

Ya que en el procedimiento de acuerdo con la invención tanto los cationes de la base tampón son relativamente inmóviles como también el detergente es no iónico, se mantienen pequeñas las corrientes parasitarias, de modo que aumenta considerablemente la eficacia del aclaramiento electroforético con respecto a las corrientes que fluyen. Además, la tendencia de detergentes no iónicos a unirse a las proteínas que deben permanecer en el tejido biológico es más baja que la tendencia de detergentes iónicos, tal como por ejemplo SDS. Por este motivo, en el procedimiento de acuerdo con la invención puede prescindirse sin más de una fijación del tejido biológico en hidrogel, con el que se garantiza, en el caso del procedimiento CLARITY conocido, que las proteínas permanezcan en el respectivo tejido biológico. La supresión de la necesidad de la fijación del tejido biológico en hidrogel tiene a este respecto no sólo la ventaja de que se ahorra gasto de procedimiento considerable, sino que también se consigue que la movilidad de las micelas, que deben retirarse del tejido biológico con ayuda del campo eléctrico aplicado, no se haya reducido por el hidrogel.

En total se consigue con el procedimiento de acuerdo con la invención un aclaramiento de tejido biológico para la preparación de preparados biológicos para un estudio mediante microscopía óptica de manera regular ya en el intervalo de pocas horas.

Se entiende que la indicación “detergente no iónico” no ha de entenderse de modo que con ello se quiera decir sólo un detergente con una ionicidad de cero. Más bien se refiere la indicación a todos los detergentes que no presentan ninguna ionicidad marcada, es decir al menos esencialmente no presentan ionicidad. Preferentemente se selecciona el detergente no iónico además según que éste presente una afinidad a proteínas a ser posible baja. El experto puede seleccionar sin más, por medio de estas especificaciones, detergentes no iónicos adecuados.

Las pruebas prácticas del procedimiento de acuerdo con la invención han mostrado que al menos los siguientes detergentes son adecuados como detergentes no iónicos: Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X1 00, Triton X1 02, n-octil-beta-D-glucopiranósido, fenoletoxilato de octilo, Brij35 y Nonidet P40. Los detergentes no iónicos Tween 80, Triton X45, Triton X102, n-octil-beta-D-glucopiranósido, Brij35 y Nonidet P40 mostraron propiedades especialmente buenas para su uso en la presente invención. Tween 80, Triton X102 y Nonidet P40 mostraron las propiedades más favorables.

El detergente no iónico que se usa en el procedimiento de acuerdo con la invención, puede estar compuesto también de más de uno de los detergentes mencionados anteriormente. La mezcla de los detergentes puede ajustarse de manera dirigida a distintas sustancias constitutivas del respectivo tejido biológico que van a eliminarse durante el aclaramiento electroforético.

La concentración de la base tampón en la solución de electroforesis asciende preferentemente a de 10 mol/m3a 50 mol/m3 y aún más preferentemente a de 15 mol/m3a 25 mol/m3, es decir a aproximadamente 20 mol/m3.

La concentración del detergente no iónico en la solución de electroforesis asciende preferentemente a del 0,5 % al 1,5 % (p/v), es decir a aproximadamente el 1 % (p/v).

El peso molecular de los cationes de la base tampón asciende preferentemente a al menos 100 Da. Las bases tampón que cumplen este requerimiento en medida creciente en el orden de su mención, son Tris, Bicine y BisTris. Una temperatura máxima de la solución de electroforesis durante el aclaramiento electroforético puede mantenerse en un intervalo de 20 °C a 90 °C. En cualquier caso, ha de mantenerse la temperatura por debajo de un punto de ebullición de la solución de electroforesis. Normalmente se prefiere mantener la temperatura máxima de la solución de electroforesis durante el aclaramiento electroforético en un intervalo de 40 °C a 60 °C, es decir a aproximadamente 50 °C. Con una temperatura adicional puede conseguirse sin embargo que los puntos de unión de anticuerpos a proteínas se desenmascaren térmicamente, de modo que estas proteínas pueden marcarse a continuación con los anticuerpos.

En el procedimiento de acuerdo con la invención resulta un aumento de la temperatura del tejido biológico mediante la entrada de energía eléctrica, que se transforma en calor. Esto es básicamente inevitable. Sin embargo, en el procedimiento de acuerdo con la invención es el aclaramiento del tejido biológico conseguido especialmente grande con respecto a la energía eléctrica introducida. Con ello resulta también especialmente fácil limitar la temperatura del tejido biológico a una temperatura máxima en los intervalos mencionados, sin que para ello fuera necesario por ejemplo un enfriamiento activo de la solución de electroforesis.

En la realización del procedimiento de acuerdo con la invención puede mantenerse durante el aclaramiento electroforético un valor de pH de la solución de electroforesis en un intervalo de 8 a 9. La corriente eléctrica que fluye como consecuencia del campo eléctrico aplicado reduce normalmente el valor de pH de la solución de electroforesis, aunque la base tampón facilita una reserva de grupos OH. Para mantener alto el grado de acción del aclaramiento del tejido biológico es práctico por tanto mantener el valor de pH de la solución de electroforesis en el intervalo alcalino mencionado. Para este fin, durante el aclaramiento electroforético puede añadirse base tampón fresca. También el detergente que se consume mediante la retirada de las micelas con acción del campo eléctrico puede rellenarse de nuevo durante el aclaramiento electroforético, añadiéndose detergente fresco a la solución de electroforesis. Un grado de acción máximo del procedimiento de acuerdo con la invención se consigue cuando la solución de electroforesis se intercambia de manera continua por solución de electroforesis no consumida.

En el procedimiento de acuerdo con la invención puede regularse una potencia eléctrica, que se emite a la solución de electroforesis y el tejido sumergido en la misma, durante el aclaramiento electroforético. Esta regulación puede realizarse dependiendo de la temperatura del tejido biológico o de la solución de electroforesis o también hasta un valor constante que garantice el cumplimiento de una determinada temperatura máxima. Al menos puede regularse la potencia eléctrica durante un espacio de tiempo parcial del aclaramiento electroforético hasta un valor fijo de este tipo. Cuando el aclaramiento del tejido biológico avanza mucho y/o la solución de electroforesis ya se ha consumido con respecto a partes esenciales, con frecuencia ya no es práctica la regulación adicional de la potencia eléctrica hasta un valor fijo.

El avance del aclaramiento del tejido biológico puede observarse mediante el registro de una resistencia eléctrica de la solución de electroforesis y del tejido biológico sumergido en la misma. En primer lugar, disminuye la resistencia eléctrica, es decir la conductividad eléctrica, cuando se forman las micelas que van a retirarse en el tejido biológico. Con el consumo de la solución de electroforesis y/o la derivación ya realizada de las partes esenciales de los grupos hemo y lípidos que van a separarse aumenta de nuevo entonces la resistencia o bien disminuye de nuevo la conductividad eléctrica. Así pueden modificarse entonces, en el procedimiento de acuerdo con la invención, las condiciones del aclaramiento electroforético y/o puede finalizarse el aclaramiento electroforético cuando la resistencia eléctrica o su modificación temporal sobrepasa y/o queda por debajo de un valor límite predeterminado.

Antes de que el tejido biológico se aclare de manera electroforética de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención, puede someterse éste ya a otros tratamientos. A esto pertenece que se fije el tejido biológico, por ejemplo, con formaldehído, que sin embargo no limita la movilidad de las micelas al contrario que un hidrogel usado para la fijación. Además, pertenece el lavado del tejido biológico, por ejemplo con agua o también con también con la solución de electroforesis usada posteriormente durante el aclaramiento electroforético, a las posibles etapas antes del verdadero aclaramiento electroforético. Además, puede incubarse el tejido biológico, antes de que se aclare de manera electroforética, en una solución alcalina acuosa. En esta incubación resulta favorable cuando se cumplen los siguientes parámetros al menos parcialmente: La incubación se realiza durante un espacio de tiempo de 30 min a 120 min, preferentemente de 45 min a 90 min. La incubación se realiza a una temperatura de 20 °C a 50 °C, preferentemente de 35 °C a 40 °C, es decir de aproximadamente 37,5 °C. La solución alcalina acuosa presenta una concentración alcalina de 50 mol/m3 a 2.000 mol/m3, preferentemente de 100 mol/m3 a 1 .000 mol/m3. La solución alcalina acuosa presenta NaOH para la facilitación de su concentración alcalina. La solución alcalina acuosa presenta un alcohol C^{1 - 6}en una concentración del 10 % al 70 % (v/v) o preferentemente del 40 % al 60 % (v/v). La solución alcalina acuosa presenta etanol; y la solución alcalina acuosa presenta un detergente en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v) y preferentemente del 0,5 % al 2 % (p/v).

Adicionalmente al aclaramiento electroforético en la solución de electroforesis alcalina acuosa puede incubarse el tejido biológico en una solución ácida acuosa y entonces puede exponerse en una solución de electroforesis ácida acuosa para el aclaramiento electroforético posterior a un campo eléctrico.

Durante la incubación del tejido en la solución ácida acuosa puede cumplirse al menos uno de los siguientes parámetros: La incubación se realiza durante de 30 min a 120 min, preferentemente durante de 45 min a 90 min. La incubación se realiza a de 20 °C a 50 °C, preferentemente a de 35 °C a 40 °C. la solución ácida acuosa presenta una concentración de protones de 50 mol/m3 a 2.000 mol/m3, preferentemente de 100 mol/m3 a 1.000 mol/m3. La solución ácida acuosa presenta ácido tricloroacético para facilitar su concentración de protones. La solución ácida acuosa presenta un alcohol C1-6 en una concentración del 10 % al 70 % (v/v), preferentemente del 40 % al 60 % (v/v). La solución ácida acuosa presenta etanol; y la solución ácida acuosa presenta un detergente en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v), preferentemente del 0,5 % al 2 % (p/v). Además, puede cumplir la solución de electroforesis ácida acuosa al menos uno de los siguientes parámetros: La solución de electroforesis ácida acuosa contiene un ácido tampón en una concentración de 5 mol/m3a 100 mol/m3 y un detergente no iónico en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v); y la solución de electroforesis ácida acuosa contiene ácido acético en una concentración de 10 mol/m3 a 50 mol/m3 y un detergente no iónico en una concentración del 0,5 % al 2 % (p/v).

Después de que se haya aclarado de manera electroforética el tejido biológico, puede prepararse éste posteriormente para el estudio mediante microscopía óptica. A esto puede pertenecer al menos una de las siguientes etapas: El tejido biológico se incuba con al menos un anticuerpo. El tejido biológico se expone en una solución de un anticuerpo a un campo eléctrico. El tejido biológico se tiñe con al menos un colorante. El tejido biológico se expone en una solución de un colorante a un campo eléctrico. El tejido biológico se lava con un disolvente orgánico. El tejido biológico se lava con xileno o diclorometano. El tejido biológico se introduce en una solución con un índice de refracción en el intervalo de n = 1,4 a n = 1,6. El intervalo de índice de refracción de n = 1,4 a n = 1,6, es decir de aproximadamente n = 1,5 significa que la solución presenta el mismo índice de refracción que el tejido biológico aclarado. Con ello no se producen dispersiones en las superficies límite del tejido biológico durante su estudio mediante microscopía óptica.

De manera concreta puede introducirse el tejido biológico, después de que se haya aclarado de manera electroforética, en una solución acuosa y/o en una solución de azúcar o de poliol con un índice de refracción en el intervalo mencionado de aproximadamente n = 1,5. Como alternativa puede deshidratarse el tejido biológico, después de que se haya aclarado de manera electroforética, en una serie de alcoholes con concentración de alcohol creciente y/o puede introducirse en un disolvente orgánico, en salicilato de metilo o en una solución de salicilato de metilo con un índice de refracción en el intervalo de aproximadamente n = 1,5.

Para la realización concreta del procedimiento de acuerdo con la invención puede disponerse el tejido para el aclaramiento electroforético en una cámara de reacción, que presenta un espacio de reacción formado de manera simétrica de rotación alrededor de un eje vertical y que presenta un entallamiento, que va a llenarse con la solución de electroforesis, un canal anular abierto hacia abajo en el espacio de reacción por debajo del entallamiento, que está en contacto con un canal de descarga de gas que conduce hacia arriba, un primer electrodo en forma de anillo dentro del canal anular y/o en el espacio de reacción por debajo del canal anular y un segundo electrodo en forma de anillo en el espacio de reacción por encima del entallamiento. El primer y el segundo electrodo se conectan entonces con las dos salidas de una fuente de tensión continua, para exponer el tejido biológico al campo eléctrico. El tejido se dispone en una sección transversal libre reducida del espacio de reacción en el entallamiento, donde se concentra un campo eléctrico aproximadamente homogéneo entre los electrodos. A través del canal de descarga de gas pueden eliminarse burbujas de gas formadas en el electrodo inferior y que suben desde allí, de modo que éstas no se acumulan en el espacio de reacción e impiden el flujo de corriente eléctrica. Además, se impide la producción del gas fulminante cuando las burbujas de gas contienen hidrógeno formado mediante hidrolisis, que podría mezclarse con el oxígeno formado mediante la hidrolisis en el electrodo superior. La cámara de reacción puede presentar otras características, tal como se conocen por el documento US 2005/0130317 A1.

Los perfeccionamientos ventajosos de la invención resultan de las reivindicaciones, de la descripción y los dibujos. Las ventajas mencionadas en la descripción de características y de combinaciones de varias características son únicamente a modo de ejemplo y pueden actuar como alternativa o de manera acumulativa, sin que las ventajas deban conseguirse forzosamente de formas de realización de acuerdo con la invención. Sin que mediante esto se modifique el objeto de las reivindicaciones adjuntas, se aplica con respecto al contenido de divulgación de los documentos de solicitud originales y de la patente lo siguiente: otras características pueden deducirse de los dibujos - en particular de las geometrías representadas y de las dimensiones relativas de varias piezas de construcción una con respecto a otra, así como de su disposición relativa y conexión eficaz. La combinación de características de distintas formas de realización de la invención o de características de distintas reivindicaciones es posible igualmente desviándose de las aplicaciones retroactivas seleccionadas de las reivindicaciones y se sugiere por el presente documento. Esto se refiere también a tales características que se representan en dibujos separados o se mencionan en su descripción. Estas características pueden combinarse también con características de distintas reivindicaciones. Igualmente pueden suprimirse características mencionadas en las reivindicaciones para otras formas de realización de la invención.

Las características mencionadas en las reivindicaciones y la descripción han de entenderse con respecto a su número de modo que exactamente está presente este número o un número mayor que el número mencionado, sin que se requiera un uso explícito del adverbio “al menos”. Por tanto, cuando por ejemplo se habla de un detergente, esto ha de entenderse de modo que están presentes exactamente un detergente, dos detergentes o más detergentes. Las características enumeradas en las reivindicaciones pueden complementarse mediante otras características o pueden ser las únicas características que presenta el respectivo procedimiento o una solución usada en el respectivo procedimiento.

Los números de referencia contenidos en las reivindicaciones no representan ninguna limitación del alcance de los objetos protegidos por las reivindicaciones. Estos sirven únicamente para el fin de hacer más fácilmente entendible las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se explica en más detalle y se describe la invención por medio de ejemplos de realización preferentes representados en las figuras.

La figura 1 es una vista en despiece ordenado de una cámara de reacción para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención.

La figura 2 muestra un detalle de una forma de realización modificada de la cámara de reacción en un corte vertical; y

la figura 3 es un diagrama de flujo de una forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención. Descripción de las figuras

En una forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica se dispone una muestra 1 de tejido biológico 2 con ayuda de un soporte de muestras 3 en una cámara de reacción 4 que está representada en la figura 1 en una vista en despiece ordenado. La cámara de reacción 4 presenta un espacio de reacción 5 que está formado de manera simétrica de rotación alrededor de un eje vertical 6. En el espacio de reacción 5 se dispuso el tejido biológico 2 en aproximadamente la mitad de la altura, formándose mediante el soporte de muestras 3 un entallamiento, es decir una reducción del diámetro del espacio de reacción 5. El tejido biológico está dispuesto a este respecto en la zona de la sección transversal 16 libre reducida del espacio de reacción 5 en el entallamiento. El espacio de reacción 5 se llena durante la realización del procedimiento de acuerdo con la invención al menos con una solución de electroforesis alcalina acuosa. También todas las otras soluciones, con las que entra en contacto el tejido biológico 2 durante la realización del procedimiento de acuerdo con la invención, pueden introducirse en el espacio de reacción 5 o bien pueden conducirse a través del espacio de reacción 5. El espacio de reacción 5 presenta para ello una conexión 7 superior y una conexión 8 inferior. Estas conexiones 7 y 8 pueden usarse durante el tratamiento del tejido biológico 2 no sólo para modificar la composición de la solución en el espacio de reacción 5 o incluso para intercambiarla por otra solución, sino también para hacer circular la respectiva solución por el espacio de reacción 5. En esta circulación puede conducirse la respectiva solución por ejemplo por un intercambiador de calor para calentar esta o la solución puede regenerarse con respecto a los componentes consumidos.

Para un aclaramiento electroforético del tejido biológico 2, para separar a partir de esto en particular grupos hemo y lípidos, están previstos un electrodo 9 superior y un electrodo 10 inferior que se sumergen en la solución que se encuentra en el espacio de reacción. Mediante aplicación de una tensión entre los electrodos 9 y 10 se forma un campo eléctrico por encima del tejido biológico 2, que facilita la fuerza eléctrica motriz para el aclaramiento electroforético. Para la aplicación de la tensión entre los electrodos 9 y 10 están previstas conducciones de conexión 11 en el electrodo 9 superior y 12 en el electrodo inferior, con las que los electrodos 9 y 10 están conectados con una fuente de tensión continua 13. Los electrodos 9 y 10 están configurados en forma de anillo para causar en la zona del entallamiento, es decir de la sección transversal libre del soporte de muestras 3, en el que está dispuesto el tejido biológico 2, un campo eléctrico a ser posible homogéneo. Se entiende que tanto el soporte de muestras 3 como también las dos partes colindantes 14 y 15 de la cámara de muestras 4 están formados de material eléctricamente aislante.

El detalle representado en la figura 2 en un corte vertical de otra forma de realización de la cámara de reacción 4 muestra la parte inferior del espacio de reacción 5, en el que se ha colocado el soporte de muestras 3 con la muestra 1, de modo que el tejido biológico 2 está dispuesto en la sección transversal 16 libre del entallamiento del espacio de reacción 5 mediante el soporte de muestras 3. Una conexión 8 inferior con el espacio de reacción 5 si bien no está representado en este caso, sin embargo, puede estar presente como en la figura 1. El electrodo 10 inferior está dispuesto parcialmente por debajo y parcialmente dentro de un canal anular 17 cerrado hacia arriba, que está configurado mediante una pieza insertada 29 en la cámara de muestras. El canal anular 17 abierto hacia abajo está conectado con un canal de descarga de gas 18 que conduce hacia arriba, para descargar de manera controlada burbujas de gas 19 que suben desde el electrodo 10 como consecuencia de la tensión aplicada, que contiene por ejemplo hidrógeno formado mediante hidrólisis, para que no se acumulen éstas en el espacio de reacción 5 e impidan el flujo de corriente por el espacio de reacción 5 y para que se evite también la formación de gas fulminante en el espacio de reacción 5.

El procedimiento de acuerdo con la invención ilustrado en la figura 3 en un diagrama de bloques comienza con una fijación 20 del tejido biológico 2 por ejemplo con formaldehído. A esto le sigue un lavado 21 del tejido 2 por ejemplo con agua. En el transcurso de la realización del procedimiento de acuerdo con la invención pueden insertarse otras etapas de lavado, que no se han destacado en la figura 3. Básicamente se aplica que el tejido 2 puede lavarse antes de cada tratamiento más largo en una solución, tal como se explicará a continuación, en primer lugar con esta solución.

Una incubación alcalina 22 se realiza por ejemplo durante una hora a 37 °C en una solución acuosa con 100 mol/m3 de NaOH, 50 % de EtOH y 1 % (p/v) de un detergente. Una siguiente electroforesis alcalina 23 se realiza por ejemplo durante 45 min a 50 °C en una solución de electroforesis alcalina acuosa con 20 mol/m3 de Tris y el 1 % (p/v) del respectivo detergente. La verdadera electroforesis se realiza con una tensión continua entre los electrodos 9 y 10 de como máximo 1000 V, un flujo máximo de 150 mA y un límite de potencia en 10 W. Esto puede conducir por ejemplo a una tensión promedio de 500 V con una corriente promedio de 20 mA. A esto puede seguirle, con intercalación de una etapa de lavado no representada, una incubación ácida 24. La incubación ácida 24 puede corresponder a la incubación alcalina 22, excepto que se realiza con adición de ácido tricloroacético en lugar de NaOH. Igualmente, durante una electroforesis ácida 25 siguiente pueden imperar básicamente las mismas condiciones que durante la electroforesis alcalina 23, excepto que en lugar de Tris se usa ácido tricloroacético. A continuación o en otro punto adecuado del procedimiento de acuerdo con la invención se realiza una tinción con anticuerpos 26, es decir una tinción inmunológica de determinadas proteínas que tras el aclaramiento electroforético están presentes adicionalmente en el tejido 2. A este respecto se usan anticuerpos que se unen específicamente a estas proteínas y que o bien llevan un colorante o a continuación se marcan con un colorante. En tanto que el tejido biológico 2 aclarado y eventualmente teñido no deba someterse a estudio mediante microscopía óptica en una solución acuosa, se realiza una deshidratación 27, a la que sigue una transferencia 28 a un medio con el índice de refracción del tejido aclarado de aproximadamente 1,5. Un medio adecuado para ello es esencia de gaulteria. A continuación es adecuado el tejido por ejemplo para un estudio mediante microscopía óptica con aplicación de una técnica de hojas de luz. En comparación con el conocido procedimiento CLARITY se caracteriza el procedimiento de acuerdo con la invención por una duración del procedimiento total muy corta de pocas horas. A este respecto ha de considerarse también que la incubación ácida 24 y la electroforesis ácida 25 con frecuencia no son necesarias para aclarar suficientemente el tejido biológico 2.

Según el siguiente protocolo para la realización del procedimiento de acuerdo con la invención se aclararon con éxito muestras 1 de tejido de pulmón de cerdo de en cada caso aprox. 250 mg. La fijación 20 del tejido 2 se realiza en formaldehído. El lavado 21 del tejido 2 se realiza durante 10 min con agua. La incubación alcalina 22 se realizó durante una hora a 37 °C en solución acuosa con 500 mol/m3 de NaOH, el 50 % (v/v) de EtOH y el 1 % (p/v) de un detergente no iónico. La electroforesis alcalina 23 se realizó durante 45 min en solución de electroforesis acuosa con 20 mol/m3 de Tris y el 1 % (p/v) del respectivo detergente no iónico. A este respecto se encontraba entre los electrodos 9 y 10 una tensión continua de como máximo 1000 V y la corriente máxima ascendía a 150 mA, limitándose la potencia a 10 W. La deshidratación 27 se realizó en cuatro etapas de 30 minutos con el 50 %, 70 %, 90 % y 100 % de etanol. La transferencia 28 se realizó en esencia de gaulteria. Los distintos detergentes no iónicos probados dieron como resultado con aplicación de este protocolo buenos resultados de manera distinta, que se evaluaron tal como sigue según una escala de estimación de 0 (mal aclaramiento, muestra teñida de manera oscura) hasta +++ (buena transparencia y acromatismo):

0: ningún detergente

: Tween 20, Triton X100

+: n-octil-beta-D-glucopiranósido, Brie 35

++: Nonidet P40, Triton X45 (solución lechosa), Tween 80

+++: Triton X102

En otro experimento se sometió a estudio la relación entre el desarrollo de la resistencia eléctrica durante la electroforesis alcalina 23, la carga de sangre del tejido 2 y el resultado del aclaramiento. La resistencia eléctrica disminuye al inicio de la electroforesis alcalina 23. Esto puede deberse a la formación y liberación de las micelas que contienen los grupos hemo y lípidos como portadores de carga móviles, que pueden retirarse del tejido 2 a continuación mediante el campo eléctrico. En el caso de alta carga de sangre del tejido pueden formarse más soportes de carga de este tipo. De manera correspondiente disminuye la resistencia eléctrica mucho más rápidamente y consigue también un valor mínimo más pequeño. Con el consumo de los componentes que forman los soportes de carga de la solución de electroforesis aumenta de nuevo la resistencia, igualmente cuando las partes constituyentes del tejido que forman los soportes de carga, es decir los grupos hemo y lípidos, se separaron ya esencialmente del tejido. Este desarrollo de la resistencia eléctrica puede usarse de manera dirigida para el control de la electroforesis alcalina, en particular para reconocer el momento en el que se finaliza la electroforesis alcalina de manera razonable. Además es este desarrollo de la resistencia eléctrica una prueba de la exactitud de las reflexiones en las que se basa la invención, mantener la conductividad eléctrica de la propia solución de electroforesis lo más baja posible y ocuparse de que se formen a ser posible sólo soportes de carga que contengan realmente sustancias que van a separarse del tejido para su aclaramiento, tal como grupos hemo y lípidos. La corriente eléctrica que fluye en estas condiciones conduce de manera eficaz al aclaramiento electroforético del tejido 2. Con ello se evita tanto un calentamiento eléctrico de la muestra 2 mediante corrientes eléctricas parasitarias como también se evita que tales corrientes eléctricas parasitarias impidan prácticamente la formación de altas intensidades de campo del campo eléctrico formado por encima de la muestra, tal como son necesarias para ejercer fuerzas eléctricas suficientemente grandes sobre micelas comparativamente grandes que comprenden grupos hemo y/o lípidos, para retirarlas del tejido biológico 2.

Lista de números de referencia

1 muestra

2 tejido biológico

3 soporte de muestras

4 cámara de reacción

5 espacio de reacción

6 eje vertical

7 conexión superior

8 conexión inferior

9 electrodo superior

10 electrodo inferior

11 conducción

12 conducción

13 fuente de tensión continua

14 parte superior de la cámara de reacción 4 15 parte inferior de la cámara de reacción 4 16 sección transversal libre

17 canal anular

18 canal de descarga de gas

19 burbujas de gas

20 fijación

21 lavado

22 incubación alcalina

23 electroforesis alcalina

24 incubación ácida

25 electroforesis ácida

26 tinción con anticuerpos

27 deshidratación

28 transferencia

29 pieza insertada

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la preparación de preparados biológicos transparentes para un estudio mediante microscopía óptica, en el que se aclara de manera electroforética tejido biológico (2), sumergiéndose el tejido en una solución de electroforesis alcalina acuosa (23), y exponiéndose en la solución de electroforesis a un campo eléctrico, en donde la solución de electroforesis contiene una base en una concentración de 5 mol/m3a 100 mol/m3 y un detergente en una concentración del 0,1 % al 10 % (p/v), caracterizado por que la base es una base tampón, cuyos cationes presentan un peso molecular de al menos 50 Da, y por que el detergente es un detergente no iónico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el detergente no iónico está compuesto al menos predominantemente de al menos una sustancia que se selecciona del grupo que está constituido por: Tween 20, Tween 80, Triton X45, Triton X100, Triton X102, n-octil-beta-D-glucopiranósido, fenoletoxilato de octilo, Brij35 y Nonidet P40.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la solución de electroforesis contiene la base tampón en una concentración de 10 mol/m3 a 50 mol/m3, preferentemente de 15 mol/m3 a 25 mol/m3.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la solución de electroforesis contiene el detergente no iónico en una concentración del 0,5 % al 1,5 % (p/v).

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el peso molecular de los cationes de la base tampón asciende a al menos 100 Da, estando la base tampón opcionalmente compuesta al menos predominantemente de al menos una sustancia que se selecciona del grupo que está constituido por: Tris, Bicine y BisTris.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se mantiene una temperatura máxima de la solución de electroforesis durante el aclaramiento electroforético en un intervalo de 20 °C a 90 °C por debajo de un punto de ebullición de la solución de electroforesis, manteniéndose la temperatura máxima de la solución de electroforesis durante el aclaramiento electroforético opcionalmente en un intervalo de 40 °C a 60 °C.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se mantiene un valor de pH de la solución de electroforesis durante el aclaramiento electroforético en un intervalo de 8 a 9.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que, durante el aclaramiento electroforético, se añade base tampón fresca y/o detergente fresco a la solución de electroforesis o la solución de electroforesis se intercambia de manera contina.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se regula una potencia eléctrica, que se emite a la solución de electroforesis y al tejido sumergido en la misma, durante el aclaramiento electroforético, regulándose la potencia eléctrica, opcionalmente al menos durante un espacio de tiempo parcial del aclaramiento electroforético, en un valor fijo.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que, durante el aclaramiento electroforético, se registra una resistencia eléctrica de la solución de electroforesis y del tejido biológico (2) sumergido en la misma.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por que se modifican las condiciones del aclaramiento electroforético y/o se finaliza el aclaramiento electroforético cuando la resistencia eléctrica o su modificación temporal sobrepasan y/o quedan por debajo de un valor límite predeterminado.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el tejido biológico (2), antes de que se aclare de manera electroforética:

- se fija y/o

- se fija con formaldehído y/o

- se lava y/o

- se lava con agua y/o

- se lava con la solución de electroforesis y/o

- se incuba en una solución alcalina acuosa.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el tejido biológico (2), antes de que se aclare o después de que se haya aclarado de manera electroforética en la solución de electroforesis alcalina acuosa, se incuba en una solución ácida acuosa y se expone después a un campo eléctrico en una solución de electroforesis ácida acuosa.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el tejido biológico (2), después de que se haya aclarado de manera electroforética:

- se incuba con un anticuerpo y/o

- en una solución de un anticuerpo se expone a un campo eléctrico y/o

- se tiñe con un colorante y/o

- en una solución de un colorante se expone a un campo eléctrico y/o

- se lava con un disolvente orgánico y/o

- se lava con xileno o diclorometano y/o

- se introduce en una solución con un índice de refracción en el intervalo de n = 1,4 a n = 1,6.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el tejido se dispone para el aclaramiento electroforético en una cámara de reacción (4), que presenta:

- un espacio de reacción (5), formado de manera simétrica de rotación alrededor de un eje vertical (6), y que presenta un entallamiento, que va a llenarse con la solución de electroforesis,

- un canal anular (17), abierto hacia abajo en el espacio de reacción (5) por debajo del entallamiento que está en contacto con un canal de descarga de gas (18) que conduce hacia arriba,

- un primer electrodo (10) en forma de anillo dentro del canal anular (17) y/o en el espacio de reacción (5) por debajo del canal de anillo (17), y

- un segundo electrodo (9) en forma de anillo en el espacio de reacción (5) por encima del entallamiento, - en el que el primer y el segundo electrodo (9, 10) se conectan con las dos salidas de una fuente de tensión continua (13), y

- en el que el tejido se dispone en una sección transversal (16) libre reducida del espacio de reacción (5) en el entallamiento.