KR20190060550A - 루푸스의 예방 또는 치료를 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 루푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 화합물을 이용한 치료 방법 및 루푸스의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 루푸스의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

루푸스의 예방 또는 치료를 위한 조성물 {Compositions for Preventing or Treating Lupus}
본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분로 함유하는 루푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 화합물을 이용한 치료 방법 및 루푸스의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.
루푸스는 결합 조직을 공격하는 항체와 관련된 자가면역질환으로, 순환성 면역 복합체인 항핵 항체의 생성과 보체 시스템의 활성화와 연관되어 있다. 이 질환은 전신성으로 모든 기관 시스템에서 발생할 수 있고, 중증의 조직 손상을 유발할 수 있다. 루푸스 환자는 항-DNA, 항-Ro, 및 항-혈소판 특이성을 지닌 자기항체를 생성시키기도 하고, 사구체 신염, 관절염, 장막염, 신생아의 완전 심장차단 또는 혈액학적 이상과 같은 질환의 발생을 야기할 수 있다.
루푸스를 치료하지 않으면 피부와 관절 공격에서부터 내부 장기, 예컨대 폐, 심장 및 신장 공격으로 진행되기 때문에 치명적일 수 있으며, 그 중에서도 신장 질환이 가장 우려된다. 소변 중의 단백뇨 양으로 측정된 신장 손상이 루푸스의 병원성과 연관된 급성 손상 부위 중 하나이고, 루푸스 질환 사망률과 발병률의 50％ 이상을 차지한다.
현재로서는 루푸스 환자에 대한 확실한 치유법이 없다. 실제적인 관점에서 보면, 의사들은 일반적으로 수많은 면역억제제, 예컨대 고용량의 코르티코스테로이드, 프레드니손, 또는 아자티오프린 또는 시클로포스파미드를 사용하고 있는데, 이들 약물 상당수는 치료받고 있는 환자에게 잠재적으로 해로운 부작용을 나타내는 문제점이 있다.
대한민국 공개특허공보 제2014-0128886호
본 발명의 목적은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 루푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 루푸스의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 루푸스의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 루푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 식에서,
A는
Figure pat00002
이고,
Xa 및 Xb 는 각각 독립적으로 CH 또는 N 이며,
L1 및 L2 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, 또는 -C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며,
Q 는 C(=O), S(=O)2, S(=O) 또는 C(=NH)이며,
Y 는 하기 그룹으로부터 선택되며
Figure pat00003
M은 C, N, O, S 또는 S(=O)2 이며 (이때, M이 C인 경우 l 및 m은 1이고, M이 N인 경우 l은 1이고 m은 0이며, M이 O, S 또는 S(=O)2 인 경우 l 및 m은 0 임),
Ra1 및 Ra2 는 각각 독립적으로, 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 할로겐으로 치환된 -C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 알코올; 벤즈하이드릴 ; N, O, S 중 1 내지 3개의 헤테로 원자를 고리원으로 포함하는 포화 또는 불포화의 5 내지 7원 헤테로 고리화 화합물로 치환된 -C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬(이때 헤테로 고리화 화합물은 비치환되거나 하나 이상의 수소가 임의적으로 OH, OCH3, CH3, CH2CH3, 또는 할로겐으로 치환될 수 있음); N, O, S 중 1 내지 3개의 헤테로 원자를 고리원으로 포함하는 포화 또는 불포화의 5 내지 7원 헤테로 고리화 화합물(이때 헤테로 고리화 화합물은 비치환되거나 하나 이상의 수소가 임의적으로 OH, OCH3, CH3, CH2CH3, 또는 할로겐으로 치환될 수 있음); 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐, C1-4알콕시, C1-2알킬 또는 하이드록시로 치환된 페닐; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐, C1-4알콕시, C1-2알킬 또는 하이드록시로 치환된 벤질; -S(=O)2CH3; 할로겐; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6 알콕시알킬; -C(=O)Rx , 여기서 Rx는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-3 알킬 또는 C3-10의 사이클로알킬이며;
Figure pat00004
, 여기서 Rc 및 Rd 는 독립적으로, 수소, C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;
Figure pat00005
또는
Figure pat00006
이며,
n 은 0, 1 또는 2의 정수이고,
Rb 는 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환된 -C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬; -C(=O)CH3; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 히드록시알킬; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6의 직쇄 또는 분지쇄의 알콕시알킬; -CF3; 할로겐; 또는
Figure pat00007
이고,
Re 및 Rf 는 각각 독립적으로, 수소 또는 -C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, 및
Z는 하기의 그룹으로부터 선택되며
Figure pat00008
,
Pa 및 Pb 는 각각 독립적으로,
Figure pat00009
; 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환된 -C1 -4 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 할로겐; -CF3; -OCF3; -CN; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6 직쇄 또는 분지쇄의 알킬 알콕시; -CH2F; 또는 -C1-3의 알코올이며,
여기서
Figure pat00010
는 페닐, 피리딘, 피리미딘, 티아졸, 인돌, 인다졸, 피페라진, 퀴놀린, 퓨란, 테트라하이드로피리딘, 피페리딘 또는 하기 그룹으로부터 선택된 고리이며
Figure pat00011
x, y 및 z 는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이며,
Rg1, Rg2 및 Rg3 은 각각 독립적으로 수소; 하이드록시; -C1-3알킬; -CF3; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 알콕시; -C(=O)CH3; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 히드록시알킬; -N(CH3)2; 할로겐; 페닐; -S((=O)2)CH3; 또는 하기 그룹으로부터 선택된다
Figure pat00012
본 발명 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 Ia]
Figure pat00013
상기 식에서,
L1 및 L2 는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고,
Y 는
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
이고,
Z 는 페닐 또는 피리디닐이고 (여기서, 페닐 또는 피리디닐의 하나 이상의 수소는 할로겐, CF3 또는 CF2H로 치환될 수 있음).
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 Ia로 표시되는 화합물은 하기 표에 기재된 화합물이다.
[표 1]
Figure pat00016
본 발명에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 대한민국 공개특허공보 제2014-0128886호에 개시된 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예컨대 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 마그네슘 등으로 제조된 무기이온염, 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산 및 황산 등으로 제조된 무기산염, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 시트르산, 말레산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만델산, 프로피온산, 시트르산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염, 글리신, 아르기닌, 라이신 등으로 제조된 아미노산염 및 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염 등이 있으나, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "루푸스"는 결합 조직을 공격하는 항체 관련 자가면역질환으로, 자가항체, 발진, 구강 궤양, 장막염, 신경 질환, 저혈구수, 관절 통증 및 부기의 존재를 특징으로 하는 만성 염증성 자가면역질환을 포함한다. 다른 언급이 없으면, 본 발명에서 용어 "루푸스"는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미를 갖는다. 본 발명에서 루푸스는 예컨대, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus; SLE), 전신성 루푸스, 원판상 루푸스, 약제 유발성 루푸스 또는 신생아 루푸스 등을 포함하나 이제 제한되지 않는 다양한 추가 형태의 루푸스를 더 포함할 수 있다. 또한, 루푸스 신염 또는 사구체 신염과 같은 만성 신염이 루푸스에 의해 야기될 수 있다.
본 발명에서 용어 "전신 홍반성 루푸스 (SLE)"는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미를 갖는다. SLE는 다계통성 자가면역성 질환으로, anti-dsDNA 항체를 포함한 항핵항체가 발생하게 되며, 항원-항체 면역복합체가 생성되어 소혈관에 자리잡음으로써, 피부나 신장의 기저막을 포함한 여러 장기에 염증 및 손상을 유발할 수 있는 질환이다.
본 발명의 실시예에서, 화학식 Ia로 표시되는 화합물 255, 280, 374, 416, 461, 476, 500, 530 또는 532은 in vitro 에서 TNFα 등의 염증성 분자의 생산을 억제하고 (도 1), 반응 T 세포의 증식을 억제하며 (도 2), 조절 T 세포의 기능을 향상시키는 효과 (도 3)가 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 화합물 374의 경우, SLE 질환 마우스의 생존율을 향상시키고 (도 5), 단백뇨 발생률 (도 6)과 anti-dsDNA 항체 농도 (도 8), 신장 내 IgG 및 C3 침윤 수준을 감소시켰고 (도 12), 혈청 내 사이토카인 중 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17A, TNFα 및 IL-22 수준을 감소시키고 (도 13), CXCL10 및 CCL2의 수준을 감소시키고 (도 14), TGF-β 수준을 상승시켰으며 (도 13), CD4-CD8- double negative T 세포의 비율, CD4-CD8+ 세포 수준에 대한 CD4+CD8- 세포 수준의 비율 (도 15), CD4+T-bet+/CD4+GATA3+의 비율 (도 16), CD4+ 세포 수준에 대한 CD4+CD25+ 세포의 수준의 비율 (도 17) 및 CD138+ 세포 수준 (도 19)을 감소시켰음을 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 각 질환에 따라 및/또는 성분에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 약학적으로 허용 가능한 염의 일일 투여량은 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위, 약 1 내지 8,000 mg/kg의 범위, 약 5 내지 6,000 mg/kg의 범위, 또는 약 10 내지 4,000 mg/kg의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 약 50 내지 2,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 우수한 효과를 발휘할 수 있으나, 치료 효율을 증가시키기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 루푸스 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 루푸스의 치료에 유효한 상기 화학식 I로 표시되는 화합물의 양을 나타낸다.
본 발명의 치료 방법에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 예컨대 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위, 약 1 내지 8,000 mg/kg의 범위, 약 5 내지 6,000 mg/kg의 범위, 또는 약 10 내지 4,000 mg/kg의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 약 50 내지 2,000 mg/kg의 범위의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 루푸스 치료 방법은 상기 화학식 I 로 표시되는 화합물을 투여함으로써, 징후의 발현 전에 질병 그 자체를 다룰뿐 아니라, 이의 징후를 저해하거나 피하는 것을 또한 포함한다. 질환의 관리에 있어서, 특정 활성 성분의 예방적 또는 치료학적 용량은 질병 또는 상태의 특성과 심각도, 그리고 활성 성분이 투여되는 경로에 따라 다양할 것이다. 용량 및 용량의 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 적합한 용량 용법은 이러한 인자를 당연히 고려하는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 루푸스 치료 방법은 상기 화학식 I로 표시되는 화합물과 함께 질환 치료에 도움이 되는 추가적인 활성 제제의 치료학적으로 유효한 양의 투여를 더 포함할 수 있으며, 추가적인 활성제제는 상기 화학식 I의 화합물과 함께 시너지 효과 또는 상가적 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 루푸스의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공하고자 한다. 약제의 제조를 위한 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 상승 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물, 치료 방법 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 약학적 조성물은 우수한 루푸스 치료 효과를 나타내는바, 루푸스의 예방 또는 치료용으로 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 약학적 조성물의 TNFα 분비 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 약학적 조성물의 반응 T 세포 증식 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 약학적 조성물의 조절 T 세포 기능 조절 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 체중 감소 증상 회복 효과를 나타낸다.
도 5는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 생존률 향상 효과를 나타낸다.
도 6은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 단백뇨 발생률 감소 효과를 나타낸다.
도 7은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 UP/C 수치 감소 효과를 나타낸다.
도 8은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 혈청 내 anti-dsDNA 항체 농도 감소 효과를 나타낸다.
도 9는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 혈청 내 BUN 및 크레아틴 농도 감소 효과를 나타낸다.
도 10은 질환 동물 모델에서 신장의 조직 염색 사진을 나타낸다.
도 11은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 신장 조직학적 변화에 미치는 영향을 나타낸다.
도 12는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 신장 내 IgG 및 C3 침착 감소 효과를 나타낸다.
도 13은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물에 의한 혈청 내 사이토카인 패턴 변화를 나타낸다.
도 14는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 혈청 내 CXCL10 및 CCL2 농도 감소 효과를 나타낸다.
도 15는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 T 세포 CD4 및 CD8 발현 비율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 16 및 17은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 CD4+CD25+ T 세포 수준에 미치는 영향을 나타낸다.
도 18은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 Treg, Th17, Th1, Th2 세포 및 master regulator 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 19는 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 CD138+ 세포에 미치는 영향을 나타낸다.
도 20은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 골수 내 PreB 및 ProB 세포에 미치는 영향을 나타낸다.
도 21은 질환 동물 모델에서 본 발명의 약학적 조성물의 면역글로불린 isotype 수준에 미치는 영향을 나타낸다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물 255, 280, 374, 416, 461, 476, 500, 530 또는 532 는 대한민국 공개특허공보 제2014-0128886호에 기재된 방법을 사용하여 제조하였으며, 구체적인 제조예를 하기에 기술한다. 각각의 제조예에서 새로 명명된 화학식은 오직 해당 제조예 내에서만 언급되며, 둘 이상의 제조예에서 언급되는 화학식들은 각각의 제조예에서 독립적으로 사용된다.
제조예 1. 화합물 255 {N-(3-브로모페닐)-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)몰포린-4-카복스아마이드}의 합성
[단계 1] 메틸 4-((N-(3-브로모페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00017
메틸 4-(((3-브로모페닐)((4-나이트로페녹시)카보닐)아미노)메틸)벤조에이트 (1.5 g, 3.09 mmol)를 아세토나이트릴 (50 ml)에 녹인 후, 탄산칼륨 (1.28 g, 9.3 mmol)과 몰포린 (0.40 mL, 4.64 mmol)을 천천히 첨가하였다. 후에, 온도를 서서히 올린 후 80 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 온도를 실온까지 내린 다음, 다이메틸포름아마이드 (50 ml)를 더 첨가하고 다시 온도를 올려 80 ℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시키고, 유기층을 포화 염화암모늄 수용액으로 세 번 세척한 후 황산나트륨을 이용하여 건조, 여과한 후 여과액을 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피법 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 0 ~ 50 %)으로 정제하여 표제 화합물 (0.45 g, 33.6 %)을 투명 오일 형태로 얻었다.
[단계 2] N-(3-브로모페닐)-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00018
메틸 4-((N-(3-브로모페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.05 g, 0.12 mmol)를 메탄올 (2 ml)에 녹인 뒤 하이드록실아민염산 (0.040 g, 0.58 mmol)을 천천히 첨가하였다. 이후, 수산화칼륨 (0.065 g, 1.15 mmol)을 넣고, 실온에서 10 분 동안 교반한 뒤 하이드록실아민 (50.0 wt % 수용액, 0.14 mL, 2.31 mmol)을 넣었다. 하루 동안 실온에서 교반한 후, 감압 하에 유기 용매를 농축시키고 2 N 염산을 넣어 중성화시킨 뒤 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세 번 세척한 후 무수 황산나트륨을 이용하여 건조 여과한 후 여과액을 감압 농축시키고, 농축액을 컬럼 크로마토그래피법 (이산화규소 ; 에틸아세테이트/헥산= 0 ~ 80 %)으로 정제하여 표제 화합물 (0.036 g, 72 %)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3-d6) δ 7.63 (d, 2 H, J = 7.8 Hz), 7.27 - 7.20 (m, 4 H), 7.13 (t, 1 H, J = 7.8 Hz), 6.96 (d, 1 H, J = 7.1 Hz), 4.83 (s, 2 H), 3.49 (brs, 4 H), 3.23 (brs, 4 H); MS (ESI) m/z 436 (M+ + H).
제조예 2. 화합물 280 {N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-N-(피리딘-2-일) 몰포린 -4- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((피리딘-2- 일아미노 ) 메틸 ) 벤조에이트의 합성
Figure pat00019
피리딘-2-아민 (0.2 g, 2.13 mmol)을 메탄올 (10 mL)에 녹인 후, 메틸 4-포밀벤조에이트 (0.35 g, 2.13 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20 분 동안 교반한 후, 소듐 시아노보로하이드라이드 (0.13 g, 2.13 mmol)와 아세트산 (0.12 mL. 2.13 mmol)을 천천히 첨가하고, 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 포화 염화나트륨 수용액으로 세 번 세척한 후 유기층을 황산나트륨을 이용하여 건조, 여과한 후 여과액을 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피법 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 0 ~ 30 %)으로 정제하여 표제 화합물 (0.10 g, 19 %)을 투명 오일 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (d, 1 H, J = 5.8 Hz), 8.06 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.66 (t, 1 H, J = 7.8 Hz), 7.44 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 6.76 (t, 1 H, J = 6.7 Hz), 6.58 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 4.67 (d, 2 H, J = 6.0 Hz), 3.92 (s, 3 H)
[단계 2] 메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(피리딘-2-일)아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00020
메틸 4-((피리딘-2-일아미노)메틸)벤조에이트 (0.040 g, 0.16 mmol)를 다이메틸포름아마이드 (3 mL)에 녹인 후, 탄산칼륨 (0.046 g, 0.33 mmol)을 천천히 첨가하였다. 후에 4-나이트로페닐 클로로포르메이트 (0.037 g, 0.18 mmol)를 첨가하고, 온도를 서서히 올려 50 ℃에서 이틀 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트 층을 포화 염화암모늄 수용액으로 세 번 세척한 후 유기층을 황산나트륨을 이용하여 건조, 여과한 후 여과액을 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피법 (이산화규소 ; 에틸아세테이트/헥산= 0 ~ 50 %)으로 정제하여 표제 화합물 (0.048 g, 71 %)을 노란색 오일 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 - 8.48 (m, 1 H), 8.24 (dd, 2 H, J = 7.0, 2.2 Hz), 8.17 (dd, 2 H, J = 7.2, 2.0 Hz), 8.00 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.78 (t, 1 H, J = 3.8 Hz), 7.44 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 6.91 (dd, 2 H, J = 7.3, 2.1 Hz), 5.39 (brs, 2 H), 3.92 (s, 3 H); MS (ESI) m/z 408 (M+ + H)
[단계 3] 메틸 4-((N-(피리딘-2-일)몰포린-4-카르복사아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00021
메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(피리딘-2-일)아미노)메틸)벤조에이트 (0.040 g, 0.098 mmol)를 다이메틸포름아마이드 (5 ml)에 녹인 후, 탄산칼륨 (0.040 g, 0.30 mmol)과 몰포린 (0.013 mL, 0.15 mmol)을 천천히 첨가하였다. 후에, 온도를 서서히 올린 후 80 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응을 종료시키고, 포화 염화암모늄 수용액으로 세 번 세척한 후 유기층을 황산나트륨을 이용하여 건조, 여과한 후 여과액을 감압 농축하였다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피법 (이산화규소 ; 에틸아세테이트/헥산= 0 ~ 50 %)으로 정제하여 표제 화합물 (0.022 g, 63 %)을 연노란색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 - 8.35 (m, 1 H), 7.95 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 7.60 - 7.58 (m, 1 H), 7.47 (d, 2 H, J = 8.4 Hz), 6.94 - 6.89 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 3.89 (s, 3 H), 3.53 - 3.51 (m, 4 H), 3.31 - 3.29 (m, 4 H)
[단계 4] N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)-N-(피리딘-2-일)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00022
메틸 4-((N-(피리딘-2-일)몰포린-4-카르복사아미도)메틸)벤조에이트 (0.022 g, 0.062 mmol)을 MeOH (2 ml)에 녹인 뒤 하이드록실아민염산 (0.022 g, 0.31 mmol)을 천천히 첨가하였다. 이후, 수산화칼륨 (0.035 g, 0.62 mmol)를 넣고 실온에서 10 분 정도 교반한 뒤 하이드록실아민 (50.0 wt% 수용액, 0.082 mL, 1.24 mmol)을 넣었다. 하루 동안 실온에서 교반한 뒤, 감압 하에 유기 용매를 농축시키고 2 N HCl을 넣어 중성화시킨 뒤 포화 염화나트륨 수용액으로 세 번 세척한 후 유기층을 무수 황산나트륨을 이용하여 건조 여과하여 표제 화합물 (0.007 g, 32 %)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 8.32 (d, 1 H, J = 3.6 Hz), 7.72 (t, 1 H, J = 6.6 Hz), 7.67 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.48 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.08-7.01 (m, 2 H), 5.08 (s, 2 H), 3.52 (t, 4 H, J = 4.8 Hz), 3.29 (t, 4 H, J = 4.8 Hz); MS (ESI) m/z 357 (M+ + H).
제조예 3. 화합물 374 {N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-N-(3-( 트라이플루오로메틸 ) 페닐 ) 몰포린 -4- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((3-( 트라이플루오로메틸 ) 페닐아미노 ) 메틸 ) 벤조에이트 )의 합성
Figure pat00023
3-(트라이플루오로메틸)벤젠아민 (0.30 g, 1.84 mmol)과 탄산칼륨 (0.76 g, 5.53 mmol)을 다이메틸포름아마이드(DMF) (5 mL)에 녹인 후 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 (0.42 g, 1.84 mmol)를 넣었다. 상온에서 하루 동안 반응하고 에틸아세테이트로 묽혔다. 반응물을 물과 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어준 후, 무수 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 20 %)로 정제하여 표제 화합물 (0.37 g, 65 %)을 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.93 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.49 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.24 (t, 1 H, J = 7.9 Hz), 6.88-6.78 (m, 4 H), 4.42 (d, 2 H, J = 6.1 Hz), 3.83 (s, 3H), MS (ESI) m/z 310 (M+ + H).
[단계 2] 메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00024
메틸 4-((3-(트라이플루오로메틸)페닐아미노)메틸)벤조에이트 (0.26 g, 0.82 mmol)와 4-나이트로페닐카보노클로리데이트 (0.33 g, 1.65 mmol)를 아세토나이트릴 (10 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (0.34 g, 2.47 mmol)을 넣었다. 상온에서 하루 동안 반응하고 에틸아세테이트로 묽혔다. 반응물을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어준 후, 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 20 %)로 정제하여 무색 오일 형태의 표제 화합물 (0.35 g, 89 %)을 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (d, 2 H, J = 10.2 Hz), 8.01 (d, 2 H, J = 7.8 Hz), 7.56-7.46 (m, 3H), 7.35 (d, 3 H, J = 8.0 Hz), 7.26 (d, 2 H, J = 8.1 Hz), 5.01 (bs, 2H), 3.90 (s, 3H).
[단계 3] 메틸 4-((N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00025
메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.29 g, 0.60 mmol)을 다이메틸포름아마이드 (10 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (0.25 g, 1.81 mmol)과 몰포린 (0.05 mL, 0.60 mmol)을 넣었다. 60 ℃에서 이틀 동안 반응시킨 후 포화 염화암모늄 용액으로 묽혔다. 에틸아세테이트로 추출한 후 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 50 %)로 정제하여 표제 화합물 (0.15 g, 60 %)을 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.43-7.32 (m, 5H), 7.20 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 4.94 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.50 (t, 4 H, J = 4.8 Hz), 3.25 (t, 4 H, J = 4.8 Hz); MS (ESI) m/z 423 (M+ + H).
[단계 4] N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00026
메틸 4-((N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.15 g, 0.36 mmol)를 메탄올 (5 mL)에 녹이고 하이드록실아민 수용액 (50 wt%, 1 mL)과 수산화칼륨 (0.10 g, 1.81 mmol)을 넣어주고 하루 밤 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 메탄올을 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트로와 물을 사용해서 추출(work up) 하였다. 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 다이에틸에테르에서 교반하여 고체 생성물을 만들고 여과한 다음 건조하여 흰색 고체 형태의 표제 화합물 (0.082 g, 54 %)을 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 11.14 (brs, 1 H), 8.99 (brs, 1 H), 7.85 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7.66-7.27 (m, 6 H), 4.94 (s, 2 H), 3.41 (s, 2 H), 3.15 (s, 2 H). MS (ESI) m/z 424 (M+ + H).
제조예 4. 화합물 416 {N-(2,4- 다이플루오로페닐 )-N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-4- 메틸피페라진 -1- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((N-(2,4-다이플루오로페닐)-4-메틸피페라진-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00027
메틸 4-(((2,4-다이플루오로페닐)((4-나이트로페녹시)카보닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.50 g, 1.13 mmol)과 1-메틸피페라진 (0.126 mL, 1.13 mmol)을 다이메틸포름아마이드 (10 mL)에 녹이고 60 ℃에서 2 일 동안 가열 교반을 수행하였다. 다이메틸포름아마이드를 감압 제거하고, 반응 혼합물에 물을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 메탄올/다이클로로메탄= 5 %) 및 농축하여 표제 화합물 (0.46 g, 101 %)을 노란색 오일 형태로 얻었다.
[단계 2] N-(2,4-다이플루오로페닐)-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)-4-메틸피페라진-1-카복스아마이드의 합성
Figure pat00028
메틸 4-((N-(2,4-다이플루오로페닐)-4-메틸피페라진-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.22 g, 0.545 mmol)를 메탄올 (20 mL)에 녹인 후, 하이드록실아민염산 (0.189 g, 2.73 mmol)과 수산화칼륨 (0.306 g, 5.45 mmol)을 첨가하고 교반 후, 하이드록실아민 (50 wt % 수용액; 0.701 mL, 10.9 mmol)을 적가하고 이후, 3 시간 동안 실온 교반을 수행하였다. 반응 종료 후, 메탄올을 감압제거하고 반응 혼합물에 물을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 이후, 다이클로로메탄에 녹인 후에 헥산을 첨가하여 고체를 석출시키고 이를 필터 건조하여 표제 화합물 (0.154 g, 70 %)을 노란색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, MeOD-d3) δ 7.65 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.40 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.26 - 7.25 (m, 1 H), 7.04 - 6.96 (m, 2 H), 4.79 (s, 2 H), 3.25 - 3.23 (m, 4 H), 2.24 - 2.21 (m, 7 H); MS (ESI) m/z 405.1 (M+ + H).
제조예 5. 화합물 461 {4-에틸-N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-N-(3-( 트라이플루오로메틸 ) 페닐 )피페라진-1- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((4-에틸-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00029
메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.346 g, 0.73 mmol)를 다이메틸포름아마이드 (10 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (0.30 g, 2.19 mmol)과 1-에틸피페라진 (0.09 mL, 0.73 mmol)을 넣었다. 60 ℃에서 하루 동안 반응시킨 후 에틸아세테이트로 묽히고 포화 염화암모늄 용액으로 씻었다. 무수 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 50 %)로 정제하여 표제 화합물 (0.15 g, 46 %)을 얻었다.
[단계 2] 4-에틸-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복스아마이드의 합성
Figure pat00030
메틸 4-((4-에틸-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.15 g, 0.33 mmol)를 메탄올 (10 mL)에 녹이고 하이드록실아민 (50 wt% 수용액, 0.20 mL)과 수산화칼륨 (0.09 g, 1.67 mmol)을 넣어주고 하루 밤 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 메탄올을 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트와 물을 사용해서 추출(work up) 하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 다이에틸에테르에서 교반하여 고체를 만들고 여과한 다음 건조하여 노란 고체 형태의 표제 화합물 (0.09 g, 61 %)을 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.1 (brs, 1 H), 7.65 (d, 2 H, J = 8.2 Hz), 7.51 (t, 1 H, J = 7.9 Hz), 7.41-7.36 (m, 5 H), 4.92 (s, 2 H), 3.17-3.14 (m, 4 H), 2.25, 2.22 (ABq, 2 H, J = 12.4, 7.2 Hz), 2.18-2.15 (m, 4 H), 0.92 (t, 3 H, J = 7.2 Hz); MS (ESI) m/z 451.1 (M+ + H).
제조예 6. 화합물 476 {3,3- 다이플루오로 -N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-N-(3-(트 라이플루오 로메틸) 페닐 ) 아제티딘 -1- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((3,3-다이플루오로-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아제티딘-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00031
메틸 4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.24 g, 0.51 mmol)을 다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (0.21 g, 1.52 mmol)과 3,3-다이플루오로아제티딘 염산염 (0.13 g, 1.10 mmol)을 넣었다. 60 ℃에서 이틀 동안 반응시킨 후 포화 염화암모늄 용액으로 묽혔다. 에틸아세테이트로 추출한 후 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 30 %)로 정제하여 표제 화합물 (0.14 g, 63 %)을 얻었다.
[단계 2] 3,3-다이플루오로-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아제티딘-1-카복스아마이드의 합성
Figure pat00032
메틸 4-((3,3-다이플루오로-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아제티딘-1-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.14 g, 0.32 mmol)를 메탄올 (10 mL)에 녹이고 하이드록실아민 수용액 (50 wt%, 0.2 mL)과 수산화칼륨 (0.09 g, 1.60 mmol)을 넣어주고 하루 밤 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 메탄올을 감압 증류하여 제거하고 에틸아세테이트와 물을 사용해서 추출(work up) 하였다. 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 다이에틸에테르에서 교반하여 고체 생성물을 만들고 여과한 다음 건조하여 흰색 고체 형태의 표제 화합물 (0.072 g, 52 %)을 얻었다.
제조예 7. 화합물 500 {N-(3-( 플루오로메틸 ) 페닐 )-N-(4-( 하이드록시카바모일 )벤질) 몰포린 -4- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((N-(3-(플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00033
4-((N-(3-(하이드록시메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조산 (1.25 g, 3.25 mmol)를 다이클로로메탄 (20 mL)에 녹이고 0 ℃에서 다이에틸아미노설퍼 트라이플루오라이드 (DAST, 0.424 mL, 3.58 mmol)를 첨가하고 같은 온도에서 1 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 다이클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 30 ~ 50 %) 및 농축하여 표제 화합물 (0.617 g, 49 %)을 무색 액체 형태로 얻었다.
[단계 2] N-(3-(플루오로메틸)페닐)-N-(4-(하이드록시카바모일)벤질)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00034
메틸 4-((N-(3-(플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.100 g, 0.259 mmol)를 메탄올 (10 mL)에 녹이고 실온에서 하이드록실아민 (50.0 wt% 수용액, 1.11 mL, 18.1 mmol)을 첨가하였다. 이어서 수산화칼륨 (0.145 g, 2.59 mmol)을 첨가한 다음 같은 온도에서 30 분 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 감압 하에서 용매를 제거하여 얻어진 농축물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물에 다이클로로메탄 (5 mL)과 헥산 (30 mL)을 넣고 교반한 후 석출된 고체를 여과하고 건조하여 표제 화합물 (0.089 g, 89 %)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.12 (brs, 1 H), 8.98 (brs, 1 H), 7.64 (d, 2 H, J = 8.3 Hz), 7.36 - 7.32 (m, 3 H), 7.20 (s, 1 H), 7.15 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.4 Hz), 5.36 (d, 2 H, J = 47.5 Hz), 4.87 (s, 2 H), 3.39 (t, 4 H, J = 4.6 Hz), 3.13 (t, 4 H, J = 4.6 Hz). MS (ESI) m/z 388 (M+ + H).
제조예 8. 화합물 530 {N-(3- 플루오로페닐 )-N-(4- 하이드록시카바모일 )벤질)몰포린-4- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 메틸 4-((3-플루오로페닐아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00035
메틸 4-포르밀벤조에이트 (1.47 g, 8.99 mmol)과 메탄올 (50 mL)에 녹인 후 3-플루오로벤젠아민 (1.0 g, 8.99 mmol)을 넣었다. 상온에서 3시간 동안 반응하고 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3) (0.56 g, 8.99 mmol)와 아세트산 (1.03 mL, 17.99 mmol)을 넣었다. 반응물을 상온에서 하루 동안 반응한 후 반응 용매을 감압하여 제거하고 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 20 %)로 정제하여 표제 화합물 (1.84 g, 79 %)을 얻었다.
[단계 2] 메틸 4-(((3-프루오로페닐)((4-나이트로펜옥시)카보닐)아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00036
메틸 4-((3-플루오로페닐아미노)메틸)벤조에이트 (2.7 g, 10.4 mmol)와 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4.20 g, 20.8 mmol)를 아세토나이트릴 (100 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (4.32 g, 31.2 mmol)을 넣었다. 상온에서 하루 동안 반응하고 에틸아세테이트로 묽혔다. 반응물을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어준 후, 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 20 %)로 정제하여 무색 오일 형태의 표제 화합물 (2.65 g, 60 %)을 얻었다.
[단계 3] 메틸 4-((N-(3-플루오로페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트)의 합성
Figure pat00037
메틸 4-(((3-프루오로페닐)((4-나이트로펜옥시)카보닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.32 g, 0.75 mmol)를 다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 녹이고 탄산칼륨 (0.31 g, 2.24 mmol)과 몰포린 (0.13 mL, 1.49 mmol)을 넣었다. 60 ℃에서 하루 동안 반응시킨 후 포화 염화암모늄 용액으로 묽혔다. 에틸아세테이트로 추출한 후 무수 황산나트륨으로 건조 여과하고 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 30 %)로 정제하여 표제 화합물 (0.13 g, 45 %)을 얻었다.
[단계 4] N-(3-플루오로페닐)-N-(4-하이드록시카바모일)벤질)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00038
메틸 4-((N-(3-플루오로페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트 (0.108 g, 0.290 mmol)을 메탄올 (10 mL)에 녹이고 실온에서 하이드록실아민 (50.0 wt% 수용액, 1.19 mL, 19.4 mmol)을 첨가하였다. 이어서 수산화칼륨 (0.156 g, 2.78 mmol)을 첨가한 다음 같은 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 감압 하에서 용매를 제거하여 얻어진 농축물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 석출된 고체를 여과하고 건조하여 표제 화합물 (0.062 g, 57 %)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.14 (brs, 1 H), 8.99 (brs, 1 H), 7.65 (d, 2 H, J = 7.0 Hz), 7.38-7.30 (m, 3H), 7.05-6.85 (m, 3H), 4.89 (s, 1H), 3.44-3.42 (m, 4H), 3.18-3.15 (m, 4H), 2.08 (s, 3H). MS (ESI) m/z 374 (M+ + H).
제조예 9. 화합물 532 {N-(2- 플루오로 -4-( 하이드록시카바모일 )벤질)-N-(3-(트 라이플루오로메틸 ) 페닐 ) 몰포린 -4- 카복스아마이드 }의 합성
[단계 1] 3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조나이트릴의 합성
Figure pat00039
3-(트라이플루오로메틸)아닐린 (0.998 mL, 8.068 mmol)을 아세토나이트릴 (60 mL)에 녹이고 실온에서 4-(브로모메틸)-3-플루오로벤조나이트릴 (2.072 g, 9.682 mmol)과 DIPEA (2.143 mL, 12.102 mmol)을 첨가하고 같은 온도에서 하루 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물을 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 5 ~ 20 %) 및 농축하여 표제 화합물 (2.380 g, 64.4 %)을 노란색 액체 형태로 얻었다.
[단계 2] 3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조산의 합성
Figure pat00040
3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조나이트릴 (2.310 g, 7.850 mmol)과 수산화리튬 (3.294 g, 78.505 mmol)을 메탄올 (40 mL) / H2O (20 mL)에 섞은 반응 혼합물을 16 시간 동안 가열환류한 후 실온으로 낮추고, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 2 M 염산 수용액을 넣어 pH = 1 로 만들고 석출된 고체를 여과한 후 건조하여 표제 화합물 (1.700 g, 69.1 %)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
[단계 3] 메틸 3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00041
3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조산 (1.700 g, 5.427 mmol), 메탄올 (4.402 mL, 108.540 mmol), EDC (2.081 g, 10.854 mmol), HOBt (1.467 g, 10.854 mmol) 그리고 DIPEA (2.883 mL, 16.281 mmol)를 실온에서 테트라하이드로퓨란(50 mL)에 녹인 반응 용액을 같은 온도에서 16 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 아세트산 에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물을 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 10 ~ 40 %) 및 농축하여 표제 화합물 (1.500 g, 84.5 %)를 무색 액체 형태로 얻었다.
[단계 4] 메틸 3-플루오로-4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00042
메틸 3-플루오로-4-(((3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (1.500 g, 4.583 mmol), 4-나이트로페닐 카보노클로리데이트 (1.848 g, 9.167 mmol) 그리고 탄산칼륨 (1.900 g, 13.750 mmol)을 실온에서 아세토나이트릴 (80 mL)에 녹인 반응 용액을 같은 온도에서 16 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 아세트산 에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물을 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 10 ~ 40 %) 및 농축하여 표제 화합물 (0.927 g, 41.1 %)을 무색 액체 형태로 얻었다.
[단계 5] 메틸 3-플루오로-4-((N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트의 합성
Figure pat00043
메틸 3-플루오로-4-((((4-나이트로페녹시)카보닐)(3-(트라이플루오로메틸)페닐)아미노)메틸)벤조에이트 (0.129 g, 0.262 mmol), 몰포린 (0.046 mL, 0.524 mmol) 그리고 탄산칼륨 (0.109 g, 0.786 mmol)을 60 ℃에서 N,N-다이메틸포름아마이드 (5 mL)에 녹인 반응 용액을 같은 온도에서 이틀 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 붓고 아세트산 에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 씻어주고 무수 황산 마그네슘으로 수분을 제거한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물을 컬럼크로마토그래피법으로 정제 (이산화규소; 에틸아세테이트/헥산= 30 ~ 60 %) 및 농축하여 표제 화합물 (0.094 g, 81.5 %)을 무색 액체 형태로 얻었다.
[단계 6] N-(2-플루오로-4-(하이드록시카바모일)벤질)-N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아마이드의 합성
Figure pat00044
화학식 6-6 메틸 3-플루오로-4-((N-(3-(트라이플루오로메틸)페닐)몰포린-4-카복스아미도)메틸)벤조에이트(0.094 g, 0.213 mmol)과 하이드록실아민(50.0 wt% 수용액, 0.071 g, 2.134 mmol)을 메탄올 (5 mL)에 녹이고 실온에서 수산화칼륨 (0.060 g, 1.067 mmol)을 첨가하고 같은 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하였다. 농축물에 다이에틸에테르(10 mL)를 넣고 교반한 후 석출된 고체를 여과하고 건조하여 화합물 532 (0.068 g, 72.2 %)을 밝은 노란색 고체 형태로 얻었다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.2 (brs, 1 H), 9.13 (brs, 1 H), 7.57 - 7.42 (m, 7 H), 4.94 (s, 2 H), 3.44 - 3.34 (m, 4 H), 3.18 - 3.12 (m, 4 H); MS (ESI) m/z 442.1 (M+ + H).
제조예 10. SLE 모델 마우스의 제조
NZB/W F1 암컷 마우스 80 두 (4 주령)를 Jackson에서 구입하여, 케이지 당 5 마리씩 SPF 사육실에서 사육하였다. 24 주령 (투여 직전)에 체중 및 요단백을 측정하여, 심한 요단백을 보이는 개체는 제외하고, 요단백 및 체중이 균등이 분포하도록 아래 표 2와 같이 군분리하였다.
[표 2]
Figure pat00045
그 다음, 마우스 24주령부터 42주령까지 약 19주간 (약 133 일) 상기 표 2에 기재된 바와 같은 투여를 매일 실시하였다.
마우스 신선뇨 채취를 투여 전 및 투여 후 2주 간격으로 실시하였고, 채혈을 투여 전 및 투여 후 4주 간격으로 실시하였다. 채집된 혈액은 원심분리하여 혈청을 수집한 뒤 -70 ℃에 보관하였다.
실시예 1. 면역 세포주에서 TNF α 분비 억제 효과 확인 ( in vitro )
면역 반응에서 본 발명의 화합물의 TNFα 분비 억제 효능을 확인하기 위해, LPS로 자극된 인간 단핵백혈구 세포주 (THP-1)에서 본 발명의 화합물 374, 461, 500, 530, 532 처리에 의한 TNFα 생성 정도를 효소면역측정법(ELISA)으로 정량하였다.
구체적으로, THP-1 세포주(ATCC) 배양에는 10% FBS를 포함한 RPMI-1640 배지를 사용하였다. 24 well plate에 각각의 well당 1 X 105 세포를 분주한 후 nM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 24 시간 동안 처리하여 마크로파지로 분화시켰다. 이후 새로운 배양배지로 교체하면서 24 시간 동안 테스트 약물을 처리하였고, 10 ng/mL LPS(E.Coli, O55:B5)를 4 시간 동안 처리하여 세포를 자극하였다. 이후 상등액을 취하여 세포에서 분비된 TNFa의 양을 Human TNFa Instant ELISA kit (eBioscience, BMS223INST)를 이용하여 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 모든 실험군에서 LPS로 염증반응을 유발한 대조군에 비해 TNFα 분비 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 특히, 화합물 374, 461 및 500은 100 nM 및 300 nM 농도 모두에서 LPS로 염증반응을 유발하지 않은 수준으로 TNFα 분비 수준이 현저히 감소하였다. 또한, 화합물 530 및 532에서, 100 nM에서 300 nM로 화합물 처리 농도를 증가시킬 경우 TNFα 분비 수준이 급격히 감소하였다 (도 1).
상기 실험 결과는 본 발명의 화합물이 루푸스에서 대표적으로 증가되는 염증반응 인자인 TNFα의 분비를 매우 효과적으로 억제함으로써 루푸스에서 나타나는 염증반응을 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 2. 반응 T 세포 증식 억제 효과 확인 ( in vitro )
본 발명의 화합물의 면역 반응에서 반응 T 세포 증식 억제 효능을 확인하기 위해, LPS로 자극된 인간 단핵백혈구 세포주 (THP-1)에서 본 발명의 화합물 255, 280, 374, 416, 476을 반응 T세포와 조절 T세포와 함께 배양한 후 조절 T 세포의 증식 억제 효능을 측정하였다.
구체적으로, 6주령 C57BL6 수컷 마우스를 중앙실험동물로부터 공급받아 1 주일간 순화한 후 실험에 사용하였다. 마우스로 부터 비장을 분리한 후 collagenase D(Roche, 11088866001)를 처리하여 splenocyte로 분리하였다. CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit (Miltenyi Biotec, 130-091-041)를 사용하여 Treg(CD4+CD25-)와 Teff(CD4+CD25+)를 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 분리해내었다. eFluor®670(Cell proliferation Dye eFluor®670, eBioscience)으로 37 ℃에서 10 분 동안 Teff 세포를 배양하여 세포막을 염색하였다. 96 well plate에 Teff와 Treg을 2:1 비율로 분주하고 anti-CD3ε과 anti-CD28 mAb magnetic bead(T cell activation/expansion kit, Miltenyi Biotec, 130-093627)를 이용하여 3일 동안 T세포를 활성화시켜 Treg suppression assay를 진행하였다. 테스트 약물은 assay가 진행되는 3일 동안 동시처리되었다. Teff 세포막에 labeling된 eFluor®670의 분할된 양을 측정하여 T세포의 증식도를 평가하였다. eFluor®670-dilution plot은 유세포 분석기(FACS LSR Fortessa, BD bioscience)를 이용하여 측정하였다(FACS LSR Fortessa, BD bioscience). T세포 증식 억제능은 다음과 같은 수식에 의해 계산하였다.
Figure pat00046
그 결과, 모든 실험군에서 반응 T 세포 증식이 억제되는 것으로 나타났다. 실험에 사용된 본 발명의 화합물은 200 nM 처리시 최대 2배가 넘는 반응 T 세포 증식 억제율 (suppression ratio)를 나타냈으며, 500 nM 처리시 최대 4배에 이르는 현저한 T 세포 증식 억제 효과를 나타냈다 (도 2).
상기 실험 결과는 본 발명의 화합물이 루푸스에서 과도하게 활성화된 반응 T 세포의 분화를 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 3. 조절 T 세포 기능 조절 효과 확인 ( in vitro )
본 발명의 화합물이 면역 반응에서 조절 T 세포의 기능을 조절하는지 확인하기 위해, 화합물 255, 280, 374, 416, 476 처리 후 조절 T 세포에서 면역관문 수용체 CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)의 발현 수준을 유세포 분석법을 통해 측정하였다.
구체적으로, 6주령 C57BL6 수컷 마우스를 중앙실험동물로부터 공급받아 1 주일간 순화한 후 실험에 사용하였다. 마우스로 부터 비장을 분리한 후 collagenase D(Roche, 11088866001)를 처리하여 splenocyte로 분리하였다. CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit (Miltenyi Biotec, 130-091-041)를 사용하여 CD4+CD25- T세포를 분리하였고, 5x105 cells/well의 CD4+CD25- T 세포를 6일 동안 anti-CD3ε/anti-CD28 mAb bead(T cell activation/expansion kit, Miltenyi Biotec, 130-093627)와 마우스 재조합 TGF-β2를 6일 동안 처리하여 iTreg으로 분화시켰다. 테스트 약물은 iTreg으로 분화되는 6일 동안 동시처리되었다. 이후 anti- CD4/ anti-CD25 mAb(eBioscience, 25-0042-82, 17-0251-82)로 4 ℃에서 20 분간 incubation하여 labeling하였다. 세포질 내 염색을 위해 Fix/permeabilization buffer(eBioscience, 00-5523-00)로 permeabilization하였고 anti-FOXP3-Alexafluor488(eBioscience, 53-5773-82)와 anti-CTLA4-PE(eBioscience, 12-1522-82)로 labeling한 후 FACS LSR Fortessa(BD bioscience)를 이용해서 유세포 분석을 진행하였다.
그 결과, 본 발명의 화합물 처리 후 T 세포의 CTLA4 발현 수준이 증가된 것을 확인하였다. 특히 화합물 255, 374 및 476 화합물의 경우, 500 nM 이상의 농도에서 40% 이상의 T 세포가 CTLA4 발현이 증가된 것으로 나타났다. 화합물 255는 1000 nM 처리시 세포독성이 심하여 데이터 분석을 진행하지 못하였다 (도 3).
상기 실험 결과는 본 발명의 화합물이 조절 T 세포의 기능을 향상시킴으로써 루푸스에서 나타나는 반응 T 세포의 과도한 활성이 효과적으로 조절될 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 동물 모델에서 체중 회복 효과
마우스 체중 변화를 확인한 결과, 처음 4 주간은 투여 후 체중이 전체적으로 감소하는 양상이 나타났으나 (에탄올+Kolliphor+saline 으로 이루어진 용매에 의한 작용인 것으로 생각됨), 36 주령 이후 음성 대조군보다 양성 대조군에서 뚜렷한 체중 회복 효과가 나타났다. 실험군의 경우, 10 mg/kg 용량 투여군에서는 40 주 부근부터 양성 대조군과 같은 수준으로 체중이 회복되었고, 30 및 50 mg/kg 용량 투여군에서는 양성 대조군보다도 우수한 체중 회복 효과를 나타냈다 (도 4).
실시예 5. 동물 모델에서 생존률 개선 효과
NZB/W F1 암컷 마우스는 사람 SLE 질환 모델로 이용되며, 아무런 치료를 하지 않으면 면역복합체성 사구체신염에 의해 12 개월 경 (약 52주령)에 모두 사망하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 SLE 동물 모델에서 생존률 개선 효과를 발휘하는지 확인하기 위해, 24 주령부터 42 주령까지 날마다 NZB/W F1 암컷 마우스의 생존률을 측정하였다.
그 결과, 약 32 주령 이전까지는 모든 군에서 생존률에 변화가 없었으며, 아무런 약물 처리를 하지 않은 음성 대조군의 경우 35 주령 이후부터 마우스 생존률이 급격히 감소하여, 42 주령에 이르러서는 15 마리 중 7 마리의 마우스가 폐사하였다 (생존률 약 53.3%). 반면, 양성 대조군과 실험군에서는 모두 음성 대조군보다 우수한 생존률 회복 양상을 보였다. 특히, 42주령에서 10 mg/kg 용량 투여군에서는 15 마리 중 4 마리 (생존률 약 73.3%)만이 폐사하였고, 30 mg/kg 및 50 mg/kg에서는 놀랍게도 오직 1 마리 (생존률 약 93.3%)만이 폐사하여, 본 발명의 약학적 조성물이 SLE 동물 모델에서 현저히 우수한 생존률 개선 효과를 발휘한다는 것을 확인하였다 (도 5).
실시예 6. 동물 모델에서 단백뇨 감소 효과
SLE 질환의 대표적인 증상인 단백뇨 생성에 본 발명의 약학적 조성물이 치료적 효과를 발휘하는지 확인하기 위해, 2 주 간격으로 마우스 소변을 채취하여 CBB (Commassie brilliant blue) 방법으로 UP/C (요단백:크레아틴 비율)을 측정하였다. 요 크레아티닌 농도는 요를 100 배 희석하여, 혈청화학분석기기 (Dri-CHEM 3000 colorimetric analyzer, Fujifilm)로 측정한 후 희석배수를 보정하여 구하였다.
그 결과, 음성 대조군에서 마우스 24 주령부터 42 주령까지 300 mg/dl 이상의 심한 단백뇨 발생률을 나타내는 비율이 급격하게 증가한 반면, 실험군의 경우 이러한 심한 단백뇨 발생률이 현저히 개선되었음을 확인하였다. 특히 42 주령에서 300 mg/dl 이상의 심한 단백뇨 발생률은 음성 대조군에서 80 %인 반면, 양성 대조군에서 20 %였고 10, 30 및 50 mg/kg 투여군에서 각각 60 %, 6.7 % 및 0 %로 현저히 우수한 단백뇨 감소 효과를 나타냈다 (도 6).
한편, 36 주령 마우스에서 UP/C는 모든 실험군에서 현저히 감소되었고, 42 주령 마우스의 경우에도 10 mg/kg 투여군을 제외한 모든 실험군에서 음성 대조군보다 UP/C 수치가 감소되었음을 확인하였다 (도 7).
실시예 7. 동물 모델에서 혈청 내 anti- dsDNA 항체 농도 감소 효과
본 발명의 약학적 조성물이 SLE 모델 동물에서 나타나는 증가된 anti-dsDNA 항체 농도를 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해, 마우스 anti-dsDNA ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit (Shibayagi)를 이용하여 마우스 혈청 내 anti-dsDNA 항체 농도를 측정하였다.
그 결과, 모든 실험군에서 약 28 주령 이후 혈청 내 anti-dsDNA 항체 농도가 음성 대조군보다 감소하는 경향을 보였으며, 특히 50 mg/kg 투여군의 경우 혈청 내 anti-dsDNA 항체 농도가 음성 대조군보다 최대 2배 이상 현저히 감소되는 것을 확인하였다 (도 8).
실시예 8. 동물 모델에서 BUN 및 혈청 크레아티닌 농도 감소 효과
SLE 모델 마우스에서 신장 기능을 평가하기 위해, 한달 간격으로 채취된 마우스 혈청 (24, 28, 32, 36, 40 주령 및 부검시)에서 BUN 및 크레아틴 농도를 Dri-CHEM 3000 colorimetric analyzer (Fuji film)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 실험군에서 BUN 및 혈청 크레아틴 농도가 대조군에 비해 향상되었음을 확인하였으며, 특히 40 주령에서 현저히 우수한 BUN 및 혈청 크레아틴 농도 감소 효과를 확인하였다 (도 9).
실시예 9. 동물 모델에서 신장 조직학적 변화
SLE 질환 모델에서 본 발명의 약학적 조성물이 신장에 미치는 영향을 알아보기 위해, 조직병리학적 평가를 수행하였다.
먼저, 부검 시 수집한 마우스 왼쪽 신장의 1/2은 10% neutral buffered formalin에 고정하고 파라핀 블록으로 제작하였다. 그 다음, 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H&E, BBC Biochemical, Mount Vernon, WA, USA), periodic acid-schiff 염색 (PAS, BBC Biochemical), 및 Masson's trichrome 염색 (BBC Biochemical)을 실시하여 조직병리학적 평가를 수행하였다.
그 결과, 음성 대조군에서 많은 수의 염증세포 침윤과 mesangial proliferation 소견이 관찰되었고, PAS 염색 시, 확장된 tubule과 tubule 내 cast가 많이 관찰되었으며, Massion trichrome 염색 시 fibrosis 정도가 더 관찰되었다 (도 10).
다음으로, 염증세포 침윤 정도에 따라 0-4까지 점수를 매겼을 때 (0: no infiltration, 4: severe infiltration), 실험군 마우스 신장의 경우 염증 세포 침윤 정도가 감소되었으며, 특히 30 및 50 mg/kg 투여군의 경우 현저히 우수한 염증세포 침윤 감소 효과를 확인하였다 (도 11).
실시예 10. 동물 모델에서 신장 내 IgG 및 C3 침착 감소 효과 확인
SLE 질환 모델에서 신장에 대한 본 발명의 약학적 조성물의 치료적 효과를 확인하기 위해, 사구체 내 IgG 및 C3의 침착 정도를 측정하였다.
실시예 9에서 수행한 부검 시 수집한 왼쪽 신장의 나머지 1/2에 대해 OCT compound를 이용하여, frozen section을 위한 동결 조직 블록을 준비하여 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 방법으로 IgG와 C3 형광 면역염색을 실시하였다.
구체적으로, 동결 조직을 4 μm의 두께로 섹션 하여, 차가운 아세톤에서 5분간 고정시킨 후, PBS (phosphate buffered saline)에 5분간 2회 세척하였다. 비특이적 반응을 없애기 위해 1% 소 혈청 알부민과 0.05%의 tween-20이 첨가된 PBS 용액으로 30분간 블로킹한 뒤, FITC-컨쥬게이션된 염소 anti-마우스 IgG 항체 (1:200, AP308F, Merck Millipore) 또는 FITC-컨쥬게이션된 염소 anti-마우스 C3 항체 (1:100, Cappel 55500, MP Bio)로 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBS로 5분간 3회 세척 후, DAPI를 포함한 mounting medium으로 커버글라스를 덮고, 컨포컬 레이저 스케닝 현미경 (LSM 700, ZEISS)으로 관찰하였다.
그 결과, 실험군에서 IgG 및 C3 침착 수준이 감소되었으며, 특히 50 mg/kg 투여군에서 현저히 침착 감소 수준이 확인되었다 (도 12).
실시예 11. 동물 모델에서 혈청 사이토카인 농도
SLE 질환 마우스에서 본 발명의 약학적 조성물이 혈청 내 사이토카인 수준 변화에 미치는 영향을 분석하기 위해, Mouse cytokine Milliplex MAP kit (Merck Millipore)을 이용하여 혈청 내 GM-CSF, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-10, IL-12(p70), IL-15, IL-17a, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α, TGF-β, IL-22, IL-23 수준을 측정하였다. 그 결과가 표 3에 나타난다.
[표 3]
Figure pat00047
상기 표 3을 보면, 양성 대조군은 음성 대조군에 비해 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, 및 TNF-α가 감소되는 경향을 나타내며, 실험군 마우스에서 혈청 내 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, TNF-α 및 IL-22 농도가 감소된 반면, TGF-β 수준은 상승하였음을 확인하였다. 특히, 대조군에 비해 50 mg/kg의 용량 투여 실험군에서 IL-10, IL-15, IL-17A, TNF-α 와 IL-22가 유의성 있게 낮았으며, TGF-β가 유의성 있게 높음을 확인하였다 (도 13).
이와 관련하여, SLE 환자의 경우, 건강한 사람보다 IL-6, IL-10, IL-17, IL-23, 및 IFN-γ의 혈청 농도가 유의성 있게 높으며, TGF-β의 혈청 농도는 유의성 있게 낮았음이 보고된 바 있다 (문헌[Zickert A et al., 2015]).
한편, 36주령 혈청에서 CXCL10 (IFN-inducible protein 10, IP-10)과 CCL2 (MCP-1) 수준을 측정하였을 때, 혈청 내 CXCL10 수준은 모든 실험군에서 감소되었으며, CCL2 수준은 50 mg/kg 용량 투여군에서 감소되었음을 확인하였다 (도 14).
실시예 12. 동물 모델에서 비장 내 T 세포 발현 양상
SLE 질환 마우스에서 비장 내 면역 T 세포의 발현 양상을 평가하기 위해, CD3, CD4, CD8a, CTLA4 발현 비율 및 Treg proportion/Th1, Th2, Th17, Treg master regulator (T-bet, GATA-3, ROR-γt, Foxp3) 발현 양상을 측정하였다.
이를 위해, 먼저 마우스 부검 시 얻은 비장에 대해 70 μm cell strainer (BD)를 이용해 비장 세포를 얻고, 적혈구를 EL buffer를 이용하여 용혈시킨 뒤, FACS 완충액 (5% BSA/PBS)으로 세척하였다. 그 다음, PerCP-cy5.5-컨쥬게이션된 anti-마우스 CD3 (ebioscience, Sandiego, CA, USA), PE-Cyanine7-컨쥬게이션된 anti-마우스 CD8a (ebioscience), FITC-컨쥬게이션된 anti-CD4 (BD), APC-컨쥬게이션된 anti-마우스 CD25 (BD), PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 FoxP3 (BD), PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 RORγt (ebioscience), PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 T-bet (ebioscience), PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 GATA3 (ebioscience), PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 CTLA4 (ebioscience) 항체를 이용하여 제조사가 추천하는 농도로 염색하였다.
비장세포와 cell surface marker 항체는 바로 반응시켰으며, FoxP3, RORγt, T-bet, GATA3 항체를 반응시키기 전에는 FoxP3/Transcription Factor staining buffer set을 이용하여, 비장세포를 고정하고, permeabilization 시킨 후 항체와 반응시켰다. CD3 세포 중의 CD4:CD8 비율 및 CD4+CD8-세포, CD4-CD8+세포, CD4+CD8+세포, double negative T 세포의 비율을 측정하여 군간 비교하였으며, Treg, Th17, Th1, Th2의 master regulator인 FoxP3, RORγt, T-bet, GATA3 비율을 알아보기 위해, CD4+CD25+FoxP3+세포, CD4+CD25+RORγt+세포, CD4+CD25+ T-bet+세포, CD4+CD25+ GATA3+세포의 비율을 측정하였다.
CD4, CD8 발현 패턴 분석
SLE 환자의 말초혈액 단핵구에서 CD4-CD8- double negative T 세포의 비율이 증가되어 있으며, 이 세포가 염증성 사이토카인인 IL-17과 IFN-γ를 생산함으로써, SLE 환자의 신손상의 병인론에 기여한다는 점이 보고된 바 있다 (문헌 [Shivakumar S et al., 1989]; 문헌[Crispㅽn JC et al., 2008]).
CD3+ cells을 gating하여 CD4와 CD8의 발현을 측정한 결과, CD4-CD+ T 세포의 비율은 실험군에서 증가하였으며, CD4-CD8- T 세포의 비율은 반대로 감소하였다. CD4+CD8- : CD4-CD8+ T세포의 비율은 실험군에서 투여 용량이 증가할수록 감소하는 경향을 나타냈다 (도 15).
Treg, Th17, Th1, 및 Th2 master regulator 발현 패턴 분석
Treg, Th17, Th1, Th2 master regulator인 Foxp3, ROR-γt, T-bet, GATA-3의 발현 정도를 알아보기 위해 비장에서 CD4+CD25+Foxp3+, CD4+CD25+RORγt+, CD4+CD25+T-bet+, CD4+CD25+GATA-3+ 세포의 비율을 비교 분석하였을 때, 군간 유의성은 보이지 않았다 (도 16).
한편, CD25+세포 비율은 50 mg/kg 투여 용량의 실험군에서 대조군보다 유의성 있게 낮았으며, CD4+CD25+세포/CD4+세포 비율 또한 유의성 있게 낮았다 (도 17).
CD4 + 세포로 gating하여, T-bet, GATA-3, Foxp3, RORγt의 발현을 조사한 결과, T-bet 발현은 50 mg/kg 투여 용량의 실험군에서 대조군보다 유의성 있게 낮았다. 또한, CD4+T-bet+/CD4+GATA-3+ 비율 (CD4 세포에서의 Th1/Th2 master regulator의 발현비율)도 30 mg/kg 및 50 mg/kg 투여 용량의 실험군에서 대조군보다 유의성 있게 감소되었음을 확인하였다 (도 18).
CD138 발현 패턴 분석
CD138+ 세포의 비율은 음성 대조군에 비해 양성 대조군은 16.3% 감소한 반면, 10 mg/kg 용량에서 21.2%, 30 mg/kg 용량에서 25.2%, 그리고 50 mg/kg 용량에서 31.6% 감소하였음을 확인하였다 (도 19).
실시예 13. 동물 모델에서 골수 내 PreB 및 ProB 세포 비율
마우스 골수 세포에서 pro B (B220+, CD43+) 및 pre B (B220+, CD43-) 세포의 비율을 FACS를 이용해 측정하였다. 이를 위해, 먼저 Femur를 5% BSA를 함유한 PBS로 flushing하여, 골수 세포를 얻었다. 그 다음, 적혈구를 EL buffer를 이용하여 용혈시키고, FACS buffer (5% BSA/PBS)로 세척하여, FITC-컨쥬게이션된 anti-mouse CD43 항체 (ebioscience)와 PE-컨쥬게이션된 anti-마우스 CD220 항체 (ebioscience)로 염색하여, Pre B (B220+CD43-)와 Pro B (B220+CD43+) 세포의 비율을 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비해 실험군에서 pre B와 pro B 세포의 유의미한 비율 변화는 관찰되지 않았다 (도 20).
실시예 14. 동물 모델에서 혈청 내 면역글로불린 이소타입 변화
마우스 부검시 얻은 혈청에서 면역글로불린 이소타입 (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM) 농도를 마우스 이소타입용 Luminex assay kit을 이용하여 측정하였다 (R&D systems, Minneapolis, MN).
그 결과, 50 mg/kg 용량 투여군에서 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 농도는 음성 대조군에 비해 감소되었으며, 특히 IgM의 농도는 현저히 감소되었음을 확인하였다 (도 21).
실시예 15. 동물 모델에서 혈청화학의 변화
SLE 동물 모델에서 장기간 약물 투여에 따른 혈청화학적 변화 여부를 확인하기 위해, 부검 시 얻은 혈청에서 ALT, AST, ALP, 총 단백질, 알부민, 총 콜레스테롤, TG, CPK, 총 빌리루빈 및 Ca 농도를 Dri-CHEM 3000 colorimetric analyzer (Fujifilm)를 이용하여 측정하였다. 그 결과가 표 4에 나타난다.
[표 4]
Figure pat00048
(ALT: alanine aminotransferase, AST: aspartate aminotransferase, ALP: alkaline phosphatase, TBIL: total bilirubin, TCHOL: total cholesterol, TG: triglyceride, TP: total protein, CPK: creatine phosphokinase)
이상 실시예에서 살핀 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 SLE 질환 마우스의 생존율을 향상시키고 (도 5), 단백뇨 발생률 (도 6)과 anti-dsDNA 항체 농도 (도 8), 신장 내 IgG 및 C3 침윤 수준을 감소시켰고 (도 12), 혈청 내 사이토카인 중 IL-10, IL-12, IL-15, IL-17A, TNFα 및 IL-22 수준 (도 13)과 CXCL10 및 CCL2의 수준 (도 14)을 감소시키고, TGF-β 수준을 상승시켰으며 (도 13), CD4-CD8- double negative T 세포의 비율, CD4-CD8+ 세포 수준에 대한 CD4+CD8- 세포 수준의 비율 (도 15), CD4+T-bet+/CD4+GATA3+의 비율 (도 16), CD4+ 세포 수준에 대한 CD4+CD25+ 세포의 수준의 비율 (도 17) 및 CD138+ 세포 수준 (도 19)을 감소시켰음을 확인하였는바, 상기 결과를 통해 본 발명의 약학적 조성물은 SLE를 포함한 루푸스의 치료에 현저히 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 루푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 I]
    Figure pat00049

    상기 식에서,
    A는
    Figure pat00050
    이고,
    Xa 및 Xb 는 각각 독립적으로 CH 또는 N 이며,
    L1 및 L2 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, 또는 -C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며,
    Q 는 C(=O), S(=O)2, S(=O) 또는 C(=NH)이며,
    Y 는 하기 그룹으로부터 선택되며
    Figure pat00051
    ,
    M은 C, N, O, S 또는 S(=O)2 이며 (이때, M이 C인 경우 l 및 m은 1이고, M이 N인 경우 l은 1이고 m은 0이며, M이 O, S 또는 S(=O)2 인 경우 l 및 m은 0 임),
    Ra1 및 Ra2 는 각각 독립적으로, 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 할로겐으로 치환된 -C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 알코올; 벤즈하이드릴 ; N, O, S 중 1 내지 3개의 헤테로 원자를 고리원으로 포함하는 포화 또는 불포화의 5 내지 7원 헤테로 고리화 화합물로 치환된 -C1-4 직쇄 또는 분지쇄 알킬(이때 헤테로 고리화 화합물은 비치환되거나 하나 이상의 수소가 임의적으로 OH, OCH3, CH3, CH2CH3, 또는 할로겐으로 치환될 수 있음); N, O, S 중 1 내지 3개의 헤테로 원자를 고리원으로 포함하는 포화 또는 불포화의 5 내지 7원 헤테로 고리화 화합물(이때 헤테로 고리화 화합물은 비치환되거나 하나 이상의 수소가 임의적으로 OH, OCH3, CH3, CH2CH3, 또는 할로겐으로 치환될 수 있음); 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐, C1-4알콕시, C1-2알킬 또는 하이드록시로 치환된 페닐; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐, C1-4알콕시, C1-2알킬 또는 하이드록시로 치환된 벤질; -S(=O)2CH3; 할로겐; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6 알콕시알킬; -C(=O)Rx , 여기서 Rx는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-3 알킬 또는 C3-10의 사이클로알킬이며;
    Figure pat00052
    , 여기서 Rc 및 Rd 는 독립적으로, 수소, C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;
    Figure pat00053
    또는
    Figure pat00054
    이며,
    n 은 0, 1 또는 2의 정수이고,
    Rb 는 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환된 -C1-6 직쇄 또는 분지쇄 알킬; -C(=O)CH3; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 히드록시알킬; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6의 직쇄 또는 분지쇄의 알콕시알킬; -CF3; 할로겐; 또는
    Figure pat00055
    이고,
    Re 및 Rf 는 각각 독립적으로, 수소 또는 -C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, 및
    Z는 하기의 그룹으로부터 선택되며
    Figure pat00056

    Pa 및 Pb 는 각각 독립적으로,
    Figure pat00057
    ; 수소; 하이드록시; 치환되지 않거나 하나 이상의 수소가 할로겐으로 치환된 -C1 -4 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 할로겐; -CF3; -OCF3; -CN; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6 직쇄 또는 분지쇄의 알킬 알콕시; -CH2F; 또는 -C1-3의 알코올이며,
    여기서
    Figure pat00058
    는 페닐, 피리딘, 피리미딘, 티아졸, 인돌, 인다졸, 피페라진, 퀴놀린, 퓨란, 테트라하이드로피리딘, 피페리딘 또는 하기 그룹으로부터 선택된 고리이며
    Figure pat00059

    x, y 및 z 는 각각 독립적으로 0 또는 1의 정수이며,
    Rg1, Rg2 및 Rg3 은 각각 독립적으로 수소; 하이드록시; -C1-3알킬; -CF3; -C1-6의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시; -C2-6의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 알콕시; -C(=O)CH3; -C1-4의 직쇄 또는 분지쇄 히드록시알킬; -N(CH3)2; 할로겐; 페닐; -S((=O)2)CH3; 또는 하기 그룹으로부터 선택된다
    Figure pat00060
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물인 약학적 조성물:
    [화학식 Ia]
    Figure pat00061

    상기 식에서,
    L1 및 L2 는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고,
    Y 는
    Figure pat00062
    또는
    Figure pat00063
    이고,
    Z 는 페닐 또는 피리디닐이고 (여기서, 페닐 또는 피리디닐의 하나 이상의 수소는 할로겐, CF3 또는 CF2H로 치환될 수 있음).
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 Ia로 표시되는 화합물은 하기 표에 기재된 화합물인 약학적 조성물:
    Figure pat00064
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 루푸스는 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus; SLE), 전신성 루푸스, 원판상 루푸스, 약제 유발성 루푸스, 신생아 루푸스 및 만성 신염으로 이루어진 군에서 선택된 것인 약학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 만성 신염은 루푸스 신염 또는 사구체 신염인 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈청 내 항-dsDNA 항체 농도를 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단백뇨 생성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 염증 반응에서 TNFα의 생성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240032668A (ko) 2022-08-31 2024-03-12 (주)지바이오로직스 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011348224A1 (en) * 2010-12-22 2013-07-11 The Feinstein Institute For Medical Research Methods for treating systemic lupus erythematosus using HIV protease inhibitors
KR20140128886A (ko) 2013-04-29 2014-11-06 주식회사 종근당 선택적 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제로서의 신규 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK6432002A3 (en) 1999-11-10 2003-02-04 Takeda Chemical Industries Ltd 5-Membered N-heterocyclic compounds with hypoglycemic and hypolipidemic activity
AU2002243231A1 (en) * 2000-11-21 2002-07-24 Wake Forest University Method of treating autoimmune diseases
ES2334990T3 (es) 2002-02-14 2010-03-18 Pharmacia Corporation Piridinonas sustituidas como moduladores de p38 map quinasa.
DE60320957D1 (en) 2002-03-13 2008-06-26 Janssen Pharmaceutica Nv Sulfonylderivate als histone-deacetylase-inhibitoren
DE10233412A1 (de) 2002-07-23 2004-02-12 4Sc Ag Neue Verbindungen als Histondeacetylase-Inhibitoren
RU2352337C2 (ru) 2002-11-12 2009-04-20 Алькон, Инк. Ингибиторы гистондеацетилазы для лечения офтальмологических неоваскулярных нарушений и заболеваний
WO2005065681A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Takeda San Diego, Inc. N- hydroxy-3-(3-(1h-imidazol-2-yl)-phenyl)-acrylamide derivatives and related compounds as histone deacetylase (hdac) inhibitors for the treatment of cancer
US7923471B2 (en) 2004-05-14 2011-04-12 Alcon, Inc. Method of treating dry eye disorders and uveitis
EA010652B1 (ru) 2004-07-28 2008-10-30 Янссен Фармацевтика Н.В. Замещенные индолильные алкиламинопроизводные в качестве новых ингибиторов гистондеацетилазы
CA2587888A1 (en) 2004-11-25 2006-06-01 Actelion Pharmaceuticals Ltd Novel 4-aminopiperidine derivatives as plasmepsin ii inhibitors
WO2007039322A1 (en) 2005-09-19 2007-04-12 Bioxell Spa Use of vitamin d3 compounds for the treatment of uveitis
GB0521244D0 (en) 2005-10-19 2005-11-30 Astrazeneca Ab Benzamide compounds
AR058296A1 (es) 2005-12-09 2008-01-30 Kalypsys Inc Inhibidores de histona desacetilasa y composicion farmaceutica
ES2529147T3 (es) 2006-12-26 2015-02-17 Pharmacyclics, Inc. Método para usar los inhibidores de la histona deacetilasa y monitorear biomarcadores en la terapia de combinación
KR101168801B1 (ko) 2009-03-27 2012-07-25 주식회사종근당 신규한 하이드록사메이트 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물
US20120282167A1 (en) 2009-08-10 2012-11-08 Institut Curie Method for predicting the sensitivity of a tumor to an epigenetic treatment
EP3091004B1 (en) 2010-01-22 2017-12-13 Acetylon Pharmaceuticals, Inc. Reverse amide compounds as protein deacetylase inhibitors and methods of use thereof
SG190211A1 (en) 2010-11-16 2013-06-28 Acetylon Pharmaceuticals Inc Pyrimidine hydroxy amide compounds as protein deacetylase inhibitors and methods of use thereof
TW201245115A (en) 2011-01-24 2012-11-16 Chdi Foundation Inc Histone deacetylase inhibitors and compositions and methods of use thereof
US9249087B2 (en) 2011-02-01 2016-02-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois HDAC inhibitors and therapeutic methods using the same
CA2880117C (en) 2012-07-27 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Inhibitors of histone deacetylase
WO2015042418A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Acetylon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of diseases caused by abnormal lymphocyte function with an hdac6 inhibitor
CN105940001B (zh) 2013-12-12 2018-02-06 株式会社钟根堂 作为选择性组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂的新型氮杂吲哚衍生物及包含其的药物组合物
TW201643139A (zh) 2015-04-17 2016-12-16 佛瑪治療公司 作為組蛋白脫乙醯基酶抑制劑之３－螺環－６－異羥肟酸萘滿
WO2017040564A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hdac inhibitors and therapeutic methods using the same
GB201609786D0 (en) 2016-06-03 2016-07-20 Karus Therapeutics Ltd Compounds and method of use
AU2018258338B2 (en) 2017-04-26 2022-07-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nrf and HIF activators/HDAC inhibitors and therapeutic methods using the same
KR20190099952A (ko) 2018-02-20 2019-08-28 주식회사 종근당 포도막염의 예방 또는 치료를 위한 조성물
KR20190118251A (ko) 2018-04-10 2019-10-18 주식회사 종근당 건성안의 예방 또는 치료를 위한 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011348224A1 (en) * 2010-12-22 2013-07-11 The Feinstein Institute For Medical Research Methods for treating systemic lupus erythematosus using HIV protease inhibitors
KR20140128886A (ko) 2013-04-29 2014-11-06 주식회사 종근당 선택적 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제로서의 신규 화합물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240032668A (ko) 2022-08-31 2024-03-12 (주)지바이오로직스 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물

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