KR20190058896A - 아시네토박터 바우마니의 박테리오파아지 pbab08 - Google Patents

Abstract

본원은 아시네토박터 바우마니에 대한 감염성을 갖는 신규한 박테리오파아지, 그 변이체 및 그 프로지니와 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 박테리오파아지는 기회감염성 균주인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)을 특이적으로 감염하여, 다양한 항생제에 내성을 가져 의료계에서 크게 문제가 되는 병원균인 아시네토박터 균주를 효과적으로 제거하여 항생제로서 사용될 수 있음 물론, 또한 생물막(biofilm)을 형성을 방해하여 식품위생기기 및 의료 기기 등에 대한 방오효과도 제공할 수 있다.

Description

아시네토박터 바우마니의 박테리오파아지 PBAB08{Bacteriophage PBAB08 of Acinetobacter baumannii}

[0001] 본원은 박테리오파아지에 관한 것이다.

[0002] 병원균을 제거하기 위해 사용되는 항생제에 대한 내성을 갖는 균의 출현은 전세계적으로 큰 문제를 야기하고 있어, 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발이 시급한 실정이다.

[0003] 박테리오파아지는 특정 박테리아를 특이적으로 감염하여, 많은 단백질이 관여하는 복잡한 융해(lysis)과정을 통해 박테리아를 사멸시키는 박테리아 바이러스이다. 박테리오파아지는 숙주 박테리아에 대한 특이성이매우 높아 항생제가 본격적으로 개발되기 전 항생제로서의 가능성이 높이 평가되었으나, 박테리오파아지에 대한부족한 이해 및 본격적인 항생제의 개발과 함께, 그 효용이 줄어드는 추세였다.

[0004] 하지만 최근들어 박테리오파아지에 대한 연구결과의 축적과 함께 최근 항생제 남용으로 불거진 문제를 해결하기 위한 대안으로 박테리오파아지를 감염치료 및 방지 등에 사용하는 항생제로서의 개발이 증가하는 추세이다.

[0005] 박테리오파아지를 인간 및 가축에 사용하는 것에 관하여 Merril 등 (J INat Rev Drug Discov 2(6):489-197, 2005)에 기술되어 있다.

[0006] 미국특허 제7674467호는 살모넬라에 대한 박테리오파아지 및 그 용도에 관하여 개시하고 있다.

[0007] 미국특허 제7622293호는 슈도모나스에 대한 박테리오파아지 및 그 용도에 관하여 개시하고 있다.

[0008] 한국특허 제941892호는 살모넬라 갈리나움에 대한 박테리오파아지 및 그 용도에 관하여 개시하고 있다.

[0009] 하지만 박테리오파아지의 항균제 등으로서의 용도에 관한 다양한 개시에도 불구하고, 신규한 박테리오파아지에 대한 발굴 및 특정 용도에 적합하게 선별된 박테리오파아지에 대한 개발이 여전히 요구된다.

[0010] 본원은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 아시네토박터 바우마니에 대한 특이성을 가지는 신규한 박테리오파아지를 제공하고자 한다.

[0011] 한 양태에서 본원은 서열번호 1(GenBank accession number MG366114)의 서열을 가지고, 아시네토박터 바우마니에 대한 융해능을 갖는 박테리오파아지를 제공한다. 한 구현예에서 본원에 따른 박테리오파아지는 아시네토박터 바우마니(성균관대 의대 임상균주)의 융해능을 갖는다.

[0012] 본원은 또한 본원에 따른 박테리오파아지와 동일한 생물학적 특성을 나타내는, 프로지니 박테리오파아지를 제공한다.

[0013] 본원은 또한 한국미생물보존센터에 2017년 11월 10일자로 기탁번호 KFCC11747P로 기탁된 것인, 박테리오파아지를 제공한다.

[0014] 본원에 따른 박테리오파아지는 기회감염성 균주인 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)을 특이적으로 감염하여, 다양한 항생제에 내성을 가져 의료계에서 크게 문제가 병원균인 아시네토박터 균주를 효과적으로 제거하여 사람은 물론 가축의 항생제로서 사용될 수 있다.

[0015] 도 1은 본원에서 규명된 박테리오파아지를 우라닐아세테이트로 네가티브 염색을 한 후 관찰 한 전자현미경 사진으로 스케일바는 1 마이크로미터이다.
도 2은 원에서 규명된 박테리오파아지의 단백질 분석결과이다. 레인 1: 본원에 따른 파아지의 분석; 레인 2: 단백질 마커.
도 3는 본원에서 규명된 박테리오파아지의 원스텝 성장 곡선이다. L: 잠복기; B: 방출수.
도 4는 본원에서 규명된 박테리오파아지의 온도에 대한 안정성을 확인한 곡선이다.
도 5는 본원에서 규명된 박테리오파아지의 pH에 대한 안정성을 확인한 곡선이다.

[0016] 아시네토박터 바우마니에는 환경에 흔하게 존재하는 기회 감염 균주로 감염시 주 증상으로 폐렴 및 혈류감염을 일으키는 박테리아로 여러 항생제에 내성을 가진 변종이 발견되어 질병의 치료에 어려움을 가중시킴은 물론 의료장비 등에 생물막(biofilm)을 형성하여 교차감염을 일으켜 이의 해결이 시급한 실정이다.

[0017] 이에 본원에서 항생제에 비해 특정 박테리아를 표적으로 하여 선택적으로 제거할 수 있고, 숙주내에서 복제를통해 지속적인 효과를 볼 수 있으며, 부작용이 없는 아시네토박터 바우마니에 특이적으로 작용하는 신규한 박테리오파아지를 분리하였다.

[0018] 따라서 한 양태에서 본원은 서열번호 1의 서열을 갖는 아시네토박터 바우마니에 대한 융해능을 갖는 박테리오파아지, 그 변이체, 유도체 및 프로지니(progeny)에 관한 것이다.

[0019] 본원에 포함되는 변이체는 서열번호 1의 서열의 변이 또는 이에 의해 코딩되는 단백질에 변이를 갖는 것으로 본원에 따른 박테리오파아지와 유전적 및 표현형 특징에서 동일한 것이다.

[0020] 본원에서 사용된 용어 프로지니는 그 것이 유래된 본원의 박테리오파아지와 동일한 생물학적 특성을 나타내는 것으로, 연속적 계대 배양 또는 기타 공지된 다른 방법을 통하여 생성된 본원에 따른 박테리오파아지의 복제산물로, 서열번호 1의 서열과 실질적으로 동일하다. 서열번호 1의 경우 실질적으로 동일한 두 서열사이의 유사도를 나타내는 것으로 공지된 서열비교 프로그램 또는 수동비교 (visual inspection)을 통해 예를 들면, 90% 이상, 특히 95% 이상, 더욱 특히 99% 이상의 유사도를 의미하는 것으로, 아미노산 변이가 수반되거나 또는 되지 않는 핵산 서열의 변이체를 포함하는 것이다.

[0021] 본원에 사용된 용어 유도체는 본원에 따른 박테리오파아지 또는 그 프로지니를 구성하는 서브유니트 또는 발현산물을 의미하는 것으로, 예를 들면 박테리오파아지 유전체, 유전자 전부 또는 일부, 유전자 발현산물, 박테리오파아지를 구성하는 산물을 포함한다.

[0022] 본원의 박테리오파아지는 아시네토박터 바우마니를 특이적으로 감염한다. 한 구현예에서 상기 아시네토박터 바우마니는 성균관대 의대 임상균주 이나 이로 제한하는 것은 아니다.

[0023] 다른 양태에서 본원의 박테리오파아지, 그 유도체, 그 변이체 또는 그 프로지니는 아시네토박터 바우마니의 성장, 분열, 집락화의 조절, 억제 또는 제어에 사용될 수 있으며, 예를 들면 가공 또는 비가공된 식품의 처리, 보관, 각종 기구, 특히 의료장비 처리, 질병의 치료를 위한 항생제를 포함하는 약학적 조성물로서의 용도를 들수 있다.

[0024] 한 측면에서 본원의 박테리오파아지는 아시네토박터 바우마니로 인한 감염 예방을 위한 가공 비가공 식품 또는 식재료의 처리에 사용될 수 있다. 이 경우, 본원에 따른 박테리오파아지를 대상 식품, 식재료, 또는 장비에스프레이하거나, 또는 박테리오파아지를 포함하는 용액에 침지할 수 있다. 본원의 박테리오파아지는 다양한 식재료에 사용될 수 있으며, 예를 들면 소고기, 특히 분쇄 쇠고기, 분쇄 쇠고기로 만들어진 가공식품 예를 들면햄버거, 노지의 발에서 자라는 각종 야채, 예를 들면 상추, 시금치, 파, 음용수, 1차 감염된 식재료 등에 의해2차 감염의 우려가 있는 식품 들을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

[0025] 본원의 박테리오파아지는 또한 아시네토박터 바우마니에 의한 생물막 형성의 제어가 필요한, 가정, 환경, 의료 및 산업 분야에 걸쳐 사용되는 장비에 폭넓게 사용될 수 있다. 예를 들면, 각종 식재료 처리, 식품 가공 등에 사용되는 장비, 각종 의학기구, 의학장비, 의학시설/설비와 같은 물건은 물론 상피세포, 뼈, 치아, 및 혈관내벽 등을 포함하는 각종 생체 조직/기관과 같은 생체조직 및 생체에 적용되는 각종 인공 삽입 보형물에 사용될 수 있다.

[0026] 본원의 박테리오파아지는 아시네토박터 바우마니의 성장, 분열, 집락화의 조절, 제어, 억제 및/또는 생물막 형성의 방지 또는 저해에 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 효과적인 양은 처리하고자 하는 대상의 종류 및 그 면적, 및 목적하는 억제/제어의 정도, 처리 시점 등을 포함하는 조건에 맞추어 결정될 수 있으며, 당업자라면 본원의 기재 및 표적 박테리오파아지에 관한 지식을 근거로 적절한 농도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 약 1 10⁵ 내지 1 10¹⁵ PFU(Plaque Forming Unit)/ml의 농도 또는 약 10-5 내지 105MOI(Multiplicity of Infection)로 사용될 수 있으며, 하루에 일회 내지 수회 및/또는 수일에 걸쳐 처리될 수 있으며, 초기에 처리하는 것이 유리할 수 있다. 당업자라면 박테리오파아지에 관한 문헌(Adams, M.H (1959), Methods of studybacterial viruses. Bacteriophages. London, Interscience Publishers, Ltd. 443-519)을 참조하여 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면 처리하고자하는 표면에 대하여 약 1ml/500cm²의 농도로 처리될 수 있다.

[0027] 본원의 박테리오파아지를 포함하는 조성물은 가정, 산업, 의학, 및 환경분야에서의 구체적인 목적에 맞추어 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 생체는 물론, 각종 장비, 기구의 세척을 위해, 아시네토박터 바우마니의 성장, 집락화, 분열의 예방, 제어, 억제, 및/또는 조절에 유효한 양의 박테리오파아지를 포함하는 액체형태, 분무형태 또는 고체형태로 제조될 수 있으며, 목적에 따라 추가의 성분 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 계면활성제, 세정제, 제균제, 살균제, 항생제, 곰팡이제거제, 산도조절제, 염료, 색소와 같은 것을 포함할 수 있다.

[0028] 한 구현예에서 본원의 박테리오파아지를 포함하는 아시네토박터 바우마니의 성장, 분열, 집락화의 조절, 제어, 억제 및/또는 생물막 형성의 방지 또는 저해를 위한 조성물의 경우, 이러한 용도에 효과적인 양의 박테리오파아지를 포함하는 수용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 다른 구현예에서는 파우더, 코팅제, 스프레이, 분배형타입, 액체에 투입할 수 있는 캡슐/타블릿형태 등으로 제조될 수 있다. 이들 조성물은 음이온성, 비이온성, 양쪽 이온성 및 생물학적 계면활성제 및 이들의 혼합물과 같은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.

[0029] 다른 구현예에서는 개인위생용품, 예를 들면, 컨택렌즈 소독약, 비누, 샤워젤, 샴푸, 또는 치아, 인공치아 또는 구강의 세정, 세척을 위한 치실, 치약, 치분 또는 가글링 세정제의 형태로 제조될 수 있다.

[0030] 다른 구현예에서 의학용 장비/기구/설비의 세정, 세척을 위한 파우더, 코팅제, 스프레이, 물수건(wipe) 형태로 제조될 수 있다.

[0031] 다른 구현예에서, 본원의 박테리오파아지를 포함하는 생물막 형성 방지 또는 저해제는 식품가공, 수(water)처리장치와 같은 산업환경에서 사용될 수 있으며, 첨가제, 액체, 코팅제의 형태로 제조될 수 있다. 첨가제로 제조될 경우, 수관, 쿨링타워, 열교환기에 사용될 수 있다.

[0032] 다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 박테리오파아지를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 박테리오파아지는 아시네토박터 바우마니를 특이적으로 사멸시키므로, 이에 의해 유발되는 각종 질환에 대한 치료, 증상의 경감, 예방 및/또는 억제에 유용하게 사용될 수 있다. 질환의 예로는, 아시네토박터 바우마니에 의한 폐렴, 혈류감염 등을 들 수 있다. 구체적으로 폐렴, 혈류감염, 뇌수막염, 요로감염 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

[0033] 본원의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

[0034] 본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

[0035] 본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 약 1 10⁵ 내지 1 10¹⁵ PFU/ml의 농도로 투여될 수 있다.

[0036] 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제

를 추가적으로 포함할 수도 있다.

[0037] 다른 측면에서 본원은 또한 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 항생제에 관한 것이다. 본원에서, '항생제라는 방부제, 살균제 및 항균제를 포함하는 것이다. 본원의 항생제는 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 각종 질환의 예방, 치료, 증상의 경감, 억제에 사용될 수 있다.

[0038] 본원의 박테리오파아지는 기존 항생제에 비하여 아시네토박터 바우마니에 대한 특이성이 매우 높은 장점을 갖고 있어, 유익한 균은 죽이지 않고 병원균인 아시네토박터만을 선택적으로 제거할 수 있어 부작용이 없는 항생제로서매우 가치가 높다. 본 발명의 박테리오파아지를 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품 수명주기가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 즉 본원의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명주기가 길어질 것으로 기대된다.

[0039] 다른 측면에서 본원은 또한 본원의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제에 관한 것이다.

[0040] 본원의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 특히 식중독 예방 등 식품위생에 그 활용가치가 높다. 식품산업에서 아시네토박터 오염 방지용 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며 또한 축산업 분야에 활용될 수 있다. 또 생활하수처리장에서 방류수 내 아시네토박터 균 제거를 위한 살포에도 활용될 수 있으며 조리장소 및 조리 설비, 위생시설의 장비, 의료시설 장비, 어린이집과 같은 공공장소의 시설, 장남감 등의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다.

[0041] 또다른 측면에서 본원은 또한 본원의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 및 음용수를 제공한다. 사람보다 가축에 들어가는 항생제가 더 많으며, 축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제 사용량은 전체 항생제 판매량의 54%를 차지한다. 특히 예방 목적 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이며, 가축에 잔류하는 항생제는 사람에게 전달될 수 있는 문제가 있다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있으며 다제 내성균 발생 확률이 높아진다. 본원에 따른 항생제는 기존의 항생제를 대체하여 사료첨가제용 항생물질로 사용될 수 있다.

[0042] 본원의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 효소제제를 첨가할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이트산(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(-1,4-glycoside bond)을 가수분해 하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase), 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

[0043] 또한, 본원의 박테리오파아지를 포함하는 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 예를 들면 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모가 사용될 수 있다.

[0044] 또한 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용할 수 있다.

[0045] 또 다른 양태에서 본원에 따른 박테리오파아지를 이용한 아시네토박터 바우마니에 의한 생물막 형성의 방지, 억제 또는 저해 방법에 관한 것이다. 본원의 박테리오파아지를 박테리아가 증식할 수 있는 또는 증식하고 있는 표면에 처리하여, 생물막의 형성을 미리 예방하거나, 또는 저해할 수 있다. 상기 박테리아와의 접촉은 물건의 표면을 본원의 방지 또는 저해제로 처리하는 것을 포함한다. 본원의 생물막 형성 방지 또는 저해제는 상기 언급한

바와 같이 목적하는 생물막 형성의 저해에 유효한 양으로 처리 될 수 있다.

[0046] 상기 표면은 내부 및 외부의 표면을 모두 칭하는 것이며, 단단하거나(고상), 유연한 것을 모두 포함하는것으로, 생체유래의 것은 물론, 가정, 산업, 환경, 의료 분야에서 사용되는 물건을 포함하는 것이다. 단단한 표면은 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 배수관, 글레이즈세라믹, 포설린, 유리, 금속, 나무, 크롬, 플라스틱, 비닐 및 포미카를 들 수 있다. 또한 고상 표면은 피부, 치아와 같은 생물체 유래 조직 또는 기관일 수있다. 또한 상기 고상 표면은 의료용 물건 유래일 수 있다. 의료용 물건은 각종 의료용 설비, 장비, 기구, 임시 또는 영구용 인공삽입 보형물 예를 들면 렌즈, 인공판막, 페이스메이커, 수술용 핀, 삽입도관, 카테터 등을 일컫는 것이나, 이로 한정하는 것은 아니다.

[0047] 이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[0048] 본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학,DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 1994); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985)을 참고할 수 있다.

[0049] [실시예]

[0050] 실시예 1 균주의 배양조건

[0051] 아시네토박터 바우마니 (KCTC 2508)을 숙주로 사용하였으며, LB(Luria-Bertani) 배지에서 37에서 진탕배양하였다.

[0052] 실시예 2 박테리오파아지의 선별

[0053] 아시네토박터 바우마니를 감염하는 파아지를 선별하기 위해서 대한민국 경기도 과천시 상하벌로 17(과천동, 하수종말처리장)에서 샘플을 채취하였다. 상기 채취한 샘플을 물에 녹여 그 상층액과 아시네토박터 바우마니를 37에서 3 시간진탕배양 한 후, 500rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이어 상등액을 멸균된 막 필터(0.45um)로 여과하였다. 여과한 시료를 이중 아가층 플라크 분석법(double agar layer plaque assay)을 사용하였다. 요약하면, 5 ml 윗층 (top) 아가에 상기 숙주 박테리아와 파아지 배양액을 0.1 MOI로 섞어 아가 플레이트에 붓고 37에서 24시간 동안 배양하여 플라크를 수득하였다.

[0054] 이어 상기 박테리오파아지로부터 유전체에 대한 서열분석을 실시하였다. 200 ml LB 배지에 아시네토박터 바우마니를 OD600=0.5까지 배양한 후, 여기에 여과한 박테리오파아지 10⁹PFU/ml 또는 0.1 MOI로 감염시켜 용균하였다. 이 후 여기에 염화나트륨을 최종농도 1M이 되도록 추가한 후 4에 1시간 두었다. 이어11000xg 에서 10분간 원심분리 한 후 침전물에 PEG (polyethylene glycol 8000)를 10% (w/v)로 넣고 4에 1시간 두었다. 이어 111000xg 에서 10분간 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고, 침전물을 SM 완충액 (100mM NaCl, 10mM MgSO4(heptahydrate), 50mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 현탁하였다. 여기에 클로로포름을 1:1의 비율로 넣고 볼텍스한 후 3000xg으로 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 폴리카보네이트 시험관에 40% 글리세롤 3ml을 넣고, 이어 5% 글리세롤 4ml을 섞이지 않게 넣었다. 여기에 상기 준비한 파아지 시료를 넣고 4에서 151000xg로 1시간 원심분리하였다. 이어 상등액을 제거한 후 침전물을 SM 완충액으로 재현탁하였다. 박테리오파아지 유전체 DNA는 phage DNA isolation kit (Norgen biotek corp.)를 제조사의 방법대로 사용하여 분리하였다.

[0055] 상기와 같이 분리된 총 유전체에 대한 염기서열을 분석하였다. (주) 마크로젠, Roche 454 차세대 유전체 분석기).

[0056] 수득한 서열에 대하여 서열비교 프로그램인 BLAST 서치를 한 결과 기존에 알려지지 않은 새로운 파아지임을 확인하였다(비교결과는 나타내지 않음). 서열은 1개의 콘티그로 나타났으며, PBAB08로 명명하였다.

[0057] 실시예 3 투과전자현미경을 이용한 바이러스 형태 분석

[0058] 실시예 2에서 수득한 박테리오파아지의 형태를 분석하기 위하여 정제한 박테리오파지를 formvar carbon film (200 mesh copper grids)에 떨어뜨린 후, 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 염색(negative staining)하고 건조한 후 투과전자현미경 (LIBRA 120 Energy-Filtering Transmission Electron Microscope (Carl Zeiss))을 통하여 그 형태를 촬영하였다.

[0059] 결과는 도 1에 있다. 분리된 박테리오파아지는 직경이 약 180nm인 icosahedral head를 가지며 360nm의 긴 꼬리를 가진 형태학적 분류상 미오비리대 과 박테리오파아지 속하는 것으로 판단되었다.

[0060] 실시예 4 박테리오파아지 구조 단백질 분석

실시예 2에서 분리된 박테리오파아지 10¹⁰

[0061] PFU에 시료완충액 (SDS 10% w/v, 10 mM DTT, glycerol 20% v/v, 0.2M tris-HCl, pH 6.8, bromophenol blue 0.05% w/v) 4 ul를 혼합한 후, 3분간 끓이고, 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동하고, 분리된 밴드는 쿠마시블루 (coomassie blue) G-250로 염색하여 가시화하였다. 결과는 도 2에 기재되어 있다. 분석 결과 PBAB08은 5개 이상의 단백질로 구성 되어있으며, 분자량은 10에서 150 kDa 범위이며, 가장 주가 되는 단백질의 분자량은 30 kDa 이었다.

[0062] 실시예 5 박테리오파아지 감염 능력 분석

[0063] 실시예 2에서 분리된 박테리오파아지의 감염 능력을 분석하기 위해 원스텝성장 (one-step growth) 실험을 수행하였다.

[0064] 아시네토박터 바우마니를 OD600=0.5까지 배양한 후 까지 키운 후 0.1 MOI의 실시예 2에서 분리된 박테리오파아지로 감염하였다. 이어 37에서 5분간 박테리오파아지 흡착(adsorption)이 일어나도록 한 후 13000rpm으로 5분간 원심분리하여 프리 파아지를 제거하였다. 이 후 20 ml LB 배지로 침전물 현탁하고, 37에서 교반하면서 배양 하였다. 이어 배양 중 시료를 5분 간격으로 채취해서 파아지 농도 (phage titer)를 측정하였다. 파아지 농도는 실시예 1에서 기술한 이중 아가층 플라크 분석법을 사용하여 수행하였다.

[0065] 원스텝성장 분석을 통해 PBAB08의 잠복기 및 파아지 방출 수(burst size) 를 확인하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. PBAB08의 잠복기는 10분이었으며, 방출수는 215로 나타났다.

[0066] 실시예 6 박테리오파아지에 대한 온도, pH 안정성 분석

[0067] 박테리아의 성장억제 여부를 확인하기 위해서 먼저 아시네토박터 바우마니를 OD600=0.5까지 배양하였다. 이 후 6.4 10⁵ PFU/ml의 실시예 2에서 분리된 박테리오파아지를 4,37,45,55,65,80에서 1시간동안 배양시킨다. 또는 pH3~11까지의 Buffer를 이용하여 1:1 희석하여 1시간동안 상온에서 배양시킨다. 이 후, 연속희석 한 박테리오파아지를 아시네토박터 바우마니에 감염시켜 이중 아가층 플라크 분석법을 사용하여 수행하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 도 4에 나타난 바와 같이 PBAB08은 특이적으로 4~55에서 안정성을 보이며, pH 5~10에서 안정성을 보이는 것으로 나타났다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11747P 20171110

<110> Hankuk University of Foreign Studies Reserch affairs/ R&DB foundation <120> Bacteriophage PBAB08 of Acinetobacter baumannii <130> PBAB08 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42312 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> It is new bacteriophage that infects Acinetobacter baumannii. <400> 1 atgagtaatc aagtattagg tttcgccttg ttctaaaaaa ccagtcataa atccaattgc 60 ttgaataaat aatactgtag gggttttcgc gtcatcaatt tcatcttccc acaagcatgg 120 gcgaggatca ccactagatg aacgattttt acacaagagt ctaaaatatc gtattttaat 180 cgcaatgaat catctggatt aattttccct aaaatcgaac caagcgcgcc tgcaatttca 240 ataatccctg attttgaatg caaattcata ttgtcaaaat caataccttt aatattcatg 300 ccagcaagcg aggcatgata aataacttca tgcgcccatc gttcagaggc atgccgccat 360 ttttgttatt tcaaattttt taccttcatc atccccatta ggaatggtga aaaatgtttt 420 cttaagtgcc tttgccattt ttttagcctc taaaaataga aaggggattt ctccccttat 480 ggttagttgg tttcttcgat accgctagac atcatattaa agttatatgt atgcccatga 540 gtaatctctc ccaccctact ttctatattt attactctac tacttatcct ctttctcata 600 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Claims (3)

1. 서열번호 1의 서열을 갖는 아시네토박터 바우마니에 대한 융해능을 갖는 박테리오파아지.
2. 제 1 항에 따른 박테리오파아지의 프로지니(progeny)로, 상기 박테리오파아지와 동일한 생물학적 특성을 나타내는, 프로지니 박테리오파아지.
3. 제 1항의 박테리오파아지는 2017년 11월 10일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC11747P로 기탁된 박테리오파아지.

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