KR20190051657A - 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20190051657A
KR20190051657A KR1020170147533A KR20170147533A KR20190051657A KR 20190051657 A KR20190051657 A KR 20190051657A KR 1020170147533 A KR1020170147533 A KR 1020170147533A KR 20170147533 A KR20170147533 A KR 20170147533A KR 20190051657 A KR20190051657 A KR 20190051657A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
disease
pharmaceutical composition
degenerative brain
brain diseases
Prior art date
Application number
KR1020170147533A
Other languages
English (en)
Inventor
최봉근
이동령
이성권
이해진
Original Assignee
주식회사 뉴트라팜텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 뉴트라팜텍 filed Critical 주식회사 뉴트라팜텍
Priority to KR1020170147533A priority Critical patent/KR20190051657A/ko
Publication of KR20190051657A publication Critical patent/KR20190051657A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/75—Rutaceae (Rue family)
    • A61K36/752—Citrus, e.g. lime, orange or lemon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/322—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the nervous system or on mental function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 이산화탄소 용매를 이용한 초임계 지각 추출물의 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 초임계 추출방법을 통해 제조된 지각 추출물은 다른 추출방법을 통해 제조된 지각 추출물과 비교하여 신경세포 보호 효과가 크며, 알츠하이머를 유발시킨 동물모델에서 아세틸콜린에스테라제(AchE) 억제 효과 및 대뇌피질/해마조직에서의 항산화 효과를 확인하였다.

Description

지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE BRAIN DISEASES COMPRISING A CITRUS AURANTIUM SUPERCRITICAL EXTRACT AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 지각(Citrus aurantium) 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
치매(dementia)는 일상생활에 장애를 주는 기억과 인지 능력의 점차적인 악화로 정의되며, 크게 혈관성 치매와 알츠하이머형 치매로 나눌 수 있다. 혈관성 치매는 주로 혈관 내에 형성된 혈전에 의해 뇌경색 또는 뇌졸중 등 이 발생하는 경우에 해당되며 발병 주변의 뇌세포가 손상을 입어 기억력 상실 등의 증상이 유발되는 것으로 알려져 있다. 반면, 혈관성 치매보다 훨씬 더 많은 비중을 차지하고 있는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's Diseases: AD)는 서서히 진행되는 뇌질환으로서 처음에는 기억력 감퇴, 성격의 변화 그리고 사고력이 감소하는 질병으로서 대부분의 환자는 8 내지 10년 내에 폐렴 등으로 사망한다. 전 세계적으로 65세 이상의 노인 중 3.5 내지 10%가량이 이 질환을 앓고 있으며 미국에서만 400만 명의 환자가 있는 것으로 추정된다. 이 질환을 치료하기 위하여 소요되는 사회적 비용만도 미국에서만 연 1000억불이 지출되고 있는 노인의 대표적인 질병이다. 알츠하이머형 치매의 특징적인 병변으로 뇌조직 중에 베타-아밀로이드가 포함된 아밀로이드 플라크(amyloid plaques), 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangles) 등이 형성되어 면역세포에 염증반응을 일으키고, Ca2 + 채널을 파괴할 뿐 아니라, 신경전달물질인 아세틸콜린의 양을 감소시킴으로써 기억력, 인지기능의 감퇴증상이 서서히 나타나는 것으로 보고되고 있으나 아직 정확한 병인이나 치료법은 알려지지 않고 있는 실정이다. 또한, 최근의 역학연구에 의하면 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 심장질환 등 뇌혈관 질환의 위험인자들이 혈관성 치매뿐만 아니라 알츠하이머형 치매의 발병율을 증가시킨다는 보고도 있다.
알츠하이머형 치매(AD)로 인한 인지기능저하현상에 대한 현대 의학적 관점은 대부분 뇌 콜린성 신경세포의 광범위한 변성 및 소실을 인지기능감퇴의 가장 주요한 원인으로 간주하고 있으며, 이를 극복하기 위한 방편으로 손상되지 않고 남아있는 콜린성 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지기능을 부분적으로 회복시킬 수 있는 약물들을 개발하고자 하는 연구가 주종을 이루고 있다. 현재 미국 식품의약국(FDA)으로부터 알츠하이머형 치매의 치료제로 공인받은 네 가지 약물(타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민) 모두 아세틸콜린 분해 효소의 활성을 저해함으로써 인지기능을 항진시키고자 하는 일명 아세틸콜린에스테라제 저해제(acetylcholinesterase inhibitors)들이다.
아울러, 파킨슨병, 알츠하이머 치매, 뇌졸중 등으로 대표되는 퇴행성 신경계 뇌질환은 신경세포 손상과 소실로 이어지는 세포죽음이 그 궁극적 원인인 것으로 알려져 있다. 퇴행성 신경계 뇌질환의 신경 세포 죽음의 주요 원인으로 활성산소가 지적되고 있다. 활성산소란 호흡과정에서 체내로 들어간 산소가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 생체조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소를 말한다. 이러한 활성산소는 생체 세포 내 DNA, 세포 구성 단백질, 지질 등에 비가역적인 손상을 준다(Valko et al., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39(2007), 44-84). 특히 뇌세포에서 활성산소가 다량 생성되면 그로 인한 산화적 스트레스가 세포 내 미토콘드리아의 구조와 기능에 변화를 일으킴으로써 파킨슨병, 알츠하이머 등의 신경계 뇌질환을 일으키게 된다(Knott et al., Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nat Rev Neurosci., 9(2008), 505-18).
한편, 지각(Aurantii Fructus Immaturus)은 탱자나무(Poncirus trifoliata), 광귤나무(Citrus aurantium), 여름 귤나무(Citrus natsudaidai) 또는 운향과(Rutaceae)의 재배 변종의 성숙한 과실로서, 점액질, 휘발성 정유 등을 포함하고 있고 약간 차가운 성질을 지니고 있으며, 쓰고 약간 신맛이 있다. 초록색을 띠는 탱자의 미성숙 과실인 지실보다 작용이 완만하고 기울체(기가 퍼지지 못하고 한 곳에 머물러 있는 것)로 인해 배가 더부룩할 때, 위염으로 소화가 안되어 통증을 호소할 때 쓴다. 또한, 기침을 멎게 하고 수종(水腫)과 담음(痰飮), 옆구리 통증, 흉격 부위에 막힌 기운을 없애준다. 또 대장운동을 원활하게 해주고 반진(斑疹)과 열리(熱痢), 치질 등을 치료하는 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 지각의 약리 작용에 기초하여 다양한 용도가 연구되어 왔는데, 한국특허공개 제2001-37063호에는 전염성 급성설사 및 장염을 일으키는 주된 원인체인 로타바이러스에 대해 감염 억제활성을 갖는 지각 추출물에 관하여 기재되어 있다. 또한, 한국특허공개 제2004-10854호 및 한국특허공개 제2004-31491호에는 카스카라 사그라다(Cascara sagrada) 분말에 지각과, 당귀, 우슬을 배합하여 된 생약소재 배합물을 사용하여 변비 및 배변 증상을 개선하는 생약소재에 의한 변비 개선용 농축액 및 그 제조방법과 용도에 관하여 기재되어 있다.
또 한편, 초임계(Supercritical fluid) 추출법은 물질의 기체 상태와 액체 상태의 상경계 지점 이상의 압력과 온도를 설정해 줌으로써 액체 상태에서의 용해력과 기체 상태에서의 확산계수 및 점도의 특성을 지니게 하여 신속하면서도 선택적인 추출을 가능하게 하는 방법으로, 추출 용매는 임계 온도와 임계 압력 이상의 상태인 초임계 유체를 사용한다. 초임계 이산화탄소는 실온 부근의 조건에서 주로 사용되어 열 변성을 일으킬 염려가 적기 때문에 추출 공정에 적용되며, 다른 기체에 비해 초임계 유체를 만들 수 있고, 무색, 무취, 무독성, 비폭발성, 그리고 용질과의 비반응성 등 고유한 특성이 있다. 또한, 액화 이산화탄소, 액화 프로판, 액화 부탄 등의 초임계 유체를 이용하기 때문에 저온 추출이 가능하여 열에 약한 성분이 파괴되지 않고 추출이 가능할 뿐만 아니라 정유 성분도 얻을 수 있다.
본 발명자들은 지각 추출물이 신경세포 보호 및 기억력 개선 효과를 가지는 것을 바탕으로 예의 연구한 결과, 다른 추출법과 비교하여 특히 초임계 유체 추출법을 통해 제조된 지각 추출물이 더욱 효율적인 기억력 및 인지 기능 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 알츠하이머를 유발시킨 동물모델에서 아세틸콜린에스테라제(AchE) 억제 및 대뇌피질/해마조직에서 항산화 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지각(Citrus aurantium) 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계로 제조되는 지각(Citrus aurantium) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품을 제공한다:
1) 지각 과피를 세절하여 건조시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 건조된 지각 과피를 주정에 침지한 후 여과 및 농축하여 주정 추출물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 주정 추출물을 초임계 이산화탄소를 용매로 하여 초임계 유체 추출물을 수득하는 단계.
본 발명의 이산화탄소 용매를 이용한 초임계 지각(Citrus aurantium) 과피 추출물은 다른 추출방법을 통해 제조된 지각 추출물과 비교하여 신경세포 보호 효과가 크며, 알츠하이머를 유발시킨 동물모델에서 아세틸콜린에스테라제(AchE) 억제 효과 및 대뇌피질/해마조직에서 항산화 효과를 확인하였다.
도 1은, 마우스 해마 유래 세포에서 본 발명의 지각 추출물의 농도별(12.5, 25 및 50 ㎍/ml) 처리를 통해, 베타아밀로이드(β-amyloid, sigma)로 유발시킨 세포독성으로부터 세포 생존율(Cell viability, %)을 확인한 도이다:
CON: 무처리 세포;
Ab: 베타아밀로이드만을 처리한 세포;
12.5: 베타아밀로이드 및 비교예 또는 실시예 추출물을 12.5 ㎍/ml 처리한 세포;
25: 베타아밀로이드 및 비교예 또는 실시예 추출물을 25 ㎍/ml 처리한 세포;
50: 베타아밀로이드 및 비교예 또는 실시예 추출물을 50 ㎍/ml 처리한 세포; 및
100: 베타아밀로이드 및 비교예 또는 실시예 추출물을 100 ㎍/ml 처리한 세포.
도 2는, 알츠하이머 동물모델에서 본 발명의 지각 추출물의 처리를 통해 수중 미로 학습에서 공간 기억력 증진 효과를 확인한 도이다:
Normal: 모의시술군(무처리군);
Control: 베타아밀로이드 투여군;
비교예 1: 베타아밀로이드 + 비교예 1의 추출물 투여군(100 mg/kg);
비교예 2: 베타아밀로이드 + 비교예 2의 추출물 투여군(100 mg/kg);
비교예 3: 베타아밀로이드 + 비교예 3의 추출물 투여군(100 mg/kg);
실시예 1: 베타아밀로이드 + 실시예 1의 추출물 투여군(50 mg/kg); 및
실시예 1: 베타아밀로이드 + 실시예 1의 추출물 투여군(100 mg/kg).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계로 제조되는 지각 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
1) 지각(Citrus aurantium) 과피를 세절하여 건조시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 건조된 지각 과피를 주정에 침지한 후 여과 및 농축하여 주정 추출물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 주정 추출물을 초임계 이산화탄소를 용매로 하여 초임계 유체 추출물을 수득하는 단계.
상기 지각은 탱자나무(Poncirus trifoliata), 광귤나무(Citrus aurantium), 여름 귤나무(Citrus natsudaidai) 또는 운향과(Rutaceae)의 재배 변종 과실일 수 있으며, 구체적으로는 광귤나무의 과실일 수 있다. 상기 지각은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 단계 2)의 주정은 건조된 지각 과피 중량의 10 내지 30배의 양일 수 있으며, 구체적으로 10 내지 20배의 양일 수 있다. 상기 주정은 60 내지 80 중량%의 에탄올일 수 있다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있으나, 구체적으로는 주정에서 20 내지 30시간 동안 침지한 후 불순물을 제거하여 감압 농축한다. 상기 감압농축은 감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조일 수 있다.
상기 단계 3)의 초임계 유체 추출물은 10 내지 50℃의 온도 조건 하에서 추출될 수 있고, 500 내지 900 bar의 압력 조건 하에서 추출될 수 있다. 상기 압력이 900 bar 이상인 경우 추출 수율 및 노빌레틴 함량이 급격히 감소하고, 압력이 500 bar 이하인 경우에는 추출 수율이 낮다.
상기 추출 방법으로 추출된 지각 추출물은 아세틸콜린 분해 효소(acetylcholinesterase) 활성을 억제하는 효과를 가진다.
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머 치매(노인성 치매), 뇌졸중, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 외상후 스트레스 장애 및 기억상실증으로 이루어진 군에서 선택된 질환일 수 있으며, 구체적으로는 알츠하이머이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 실시예 1의 추출물이 베타아밀로이드로 유발된 세포독성으로부터 세포를 보호하는 효과를 확인하였고(도 1 참조), 베타아밀로이드의 투여로 제작한 알츠하이머 동물모델을 통해 인지능력 및 기억력 개선 효과를 확인하고자 모리스 인지능력 평가 및 기억력 개선 평가를 실시한 결과, 비교예 추출물 투여군과 비교하여 실시예 1 추출물 투여군은 학습수행에 따른 인지 능력 및 공간기억력의 유의한 증진효과를 확인하였다(표 3, 표 4 및 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 비교예 추출물 투여군과 비교하여 실시예 1 추출물 투여군은 베타아밀로이드의 투여로 제작한 알츠하이머 동물모델의 대뇌피질 및 해마에서 아세틸콜린 분해 효소(AchE)의 활성이 감소한 것을 확인하였으며(표 5 참조), 대뇌피질 및 해마 내 산화형 Glutathion(GSSG)의 비율이 줄어들었음을 확인하였다(표 6 및 표 7 참조).
따라서, 본 발명의 이산화탄소 용매를 이용한 초임계 지각 추출물은 다른 추출방법을 통해 제조된 지각 추출물과 비교하여 신경세포 보호 효과가 크며, 알츠하이머 동물모델의 기억력 및 인지능력을 더욱 효과적으로 개선시키고, 아세틸콜린 분해 효소를 억제, 항산화 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 초임계 지각 추출물은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 담체, 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 본 발명의 치료용 조성물은 당해기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물은 추출물의 양을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.02 내지 200mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량과 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 치료용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 알츠하이머 질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물은 추출물 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 조성물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.
아울러, 본 발명은 하기 단계로 제조되는 지각 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품을 제공한다:
1) 지각(Citrus aurantium) 과피를 세절하여 건조시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 건조된 지각 과피를 주정에 침지한 후 여과 및 농축하여 주정 추출물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 주정 추출물을 초임계 이산화탄소를 용매로 하여 초임계 유체 추출물을 수득하는 단계.
본 발명의 추출물이 상기와 같은 퇴행성 뇌질환 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
상기 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의도이다. 본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 퇴행성 뇌질환 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 퇴행성 뇌질환 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 퇴행성 뇌질환 개선 효과를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
지각( Citrus aurantium ) 과피의 초임계 추출물 제조
지각 과피의 건조 분쇄물로부터 신경세포 보호 및 기억력개선 활성이 높은 지각 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 초임계 유체 추출 방법을 이용하였다.
구체적으로, 지각 과피를 세절하고 세척하여 회수한 다음 건조시키는 사전처리를 통하여 추출원료를 준비하였다. 건조된 지각 과피는 건조 중량의 10 내지 20배의 주정에 24시간 침지한 후 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축한 후 다시 건조하였다. 이후, 초임계 유체 추출을 위해 상기 지각 과피 분말 200 g을 초임계 CO2 추출기(RTI, Korea) 안에 넣고, 격막식 압축기를 이용하여 원하는 압력까지 CO2를 압축하였다. CO2 압력은 100 내지 1100 bar, 온도는 0 내지 90℃의 조건하에서 추출을 수행하였고 수득된 추출물을 감압 건조하였다.
상기 건조된 지각 초임계 추출물을 DMSO에 용해하여 12.5, 25, 50 또는 100 ㎍/ml의 농도로 제조한 후 하기 실험예에 사용하였다.
< 비교예 1> 지각( Citrus aurantium ) 과피의 주정 추출물 제조
지각 과피 분말 200 g에 함수 에탄올(에탄올: 70 중량%) 2000 ml을 첨가하고 실온(약 20±5℃)에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하고, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 추출액에 농축된 추출액 약 5배에 해당하는 중량의 물을 첨가하고 약 24시간 동안 정치하여 추출물을 침전시켰다. 이후, 3000 rpm에서 약 3분간 원심분리하여 침전물의 형태의 추출물을 수득하였고, 침전물의 형태의 추출물을 건조하여 지각 주정 추출물을 수득하였다.
상기 건조된 지각 과피 주정 추출물을 DMSO에 용해하여 12.5, 25, 50 또는 100 ㎍/ml의 농도로 제조한 후 하기 실험예에 사용하였다.
< 비교예 2> 진귤 ( Citrus sunki ) 과피의 주정 추출물 제조
감귤류 중 진귤 과피(진귤박) 20 g에 200 내지 400 ml의 1% 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 처리하고 실온에서 20시간 이상 정치하여 과피의 조직을 약화시켰다. 이후 여과하여 회수한 후 증류수로 세척하고, 50 내지 100% EtOH 수용액에 실온에서 24시간 이상 동안 추출하였으며, 불용성 성분을 여과하고 여과된 추출물을 실온에서 정치하여 농축한 후 증류수를 첨가하고 침전물을 3000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 원심분리한 침전물을 여과한 후, 다시 여과한 농축물에 증류수 또는 20% 에탄올 수용액을 가한 후 정치하고 원심분리하여 침전물을 획득한 후 건조시켜 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
상기 건조된 진귤 과피 주정 추출물을 DMSO에 용해하여 12.5, 25, 50 또는 100 ㎍/ml의 농도로 제조한 후 하기 실험예에 사용하였다.
<비교예 3> 시퀘샤( Citrus depressa ) 과피 추출물의 제조
감귤류 시퀘샤(Citrus depressa) 과피 500 g을 세척 후, 약 70℃의 증류수 1800 ml을 가하고, 약 70℃의 뜨거운 물에 넣고 3시간 가열 처리하였다. 얻어진 가열 처리물을 보류 입자 지름 3 ㎛의 여과지를 깐 흡인 여과기를 이용하여 흡인 여과하고 잔류물을 얻었다. 잔류물을 압착기로 착즙하여 착즙 잔사 300 g을 정량하고, 드라이어를 사용하여 약 60℃에서 30분간 건조시켜, 건조 껍질 150 g을 얻었다. 상기 착즙 잔사에 2배 무게의 30%(v/v) 에탄올을 첨가하여 실온에서 3일간 에탄올 추출하였다.
이후, 3 ㎛의 여과지를 깐 흡인 여과기를 이용하여 흡인 여과하고, 여액을 얻었다. 얻어진 여액을 회전식 감압 농축기로 농축하여 농축액을 10 배의 1%(w/v) 수산화나트륨 수용액을 가하여 교반기에서 1일 동안 실온에서 교반하였다. 얻어진 불용성 성분을 2배의 물로 세척하였고, 남은 불용성 성분을 5 내지 10배의 100%(v/v) 에탄올로 용출시켰다. 이어서 에탄올 용출 성분을 흡인 여과기를 이용하여 침전물을 여과 분리하였다. 얻어진 여액의 농축 건조물을 시험에 이용하였다.
상기 건조된 시퀘샤 과피 추출물을 DMSO에 용해하여 12.5, 25, 50 또는 100 ㎍/ml의 농도로 제조한 후 하기 실험예에 사용하였다.
초임계 추출 조건에 따른 지각 추출물의 성분 변화 확인
상기 실시예 1의 지각 추출물은 노란색을 띠며, 약간의 점성이 있는 추출물의 특징을 나타내었다. 본 발명자들은 초임계 유체 추출 조건에 따른 추출 수율 및 노빌레틴(Nobiletin) 함량을 확인하고자, 유체 CO2 압력은 100 내지 1100 bar, 온도는 0 내지 90℃로 설정하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 압력이 500 bar 이상인 경우 추출 수율 및 노빌레틴 함량이 급격히 증가하다가 1100 bar에서 감소하는 양상을 나타내었고, 압력이 500 bar 이하인 경우에는 추출되는 함량이 낮은 것을 확인하였다(표 1). 따라서, 수율 및 노빌레틴 함량 증대에는 초임계 이산화탄소 압력이 500 내지 900 bar의 범위가 적합함을 알 수 있었다.
또한, 표 2에 나타낸 바와 같이 10 내지 50℃의 온도에서는 추출 수율 및 노빌레틴 함량에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(표 2). 오히려 50℃ 이상에서는 감소하는데, 이는 온도상승에 따라 성분의 안정성이 감소하였을 것으로 판단하였다.
함량/추출조건 초임계 이산화탄소 압력조건(Bar)
100 300 500 700 900 1100
수율 10 19 53 56 60 42
노빌레틴 9.4 12.3 25.6 27.4 28.4 19.8
함량/추출조건 초임계 이산화탄소 온도조건(℃)
0 10 30 50 70 90
수율 12 49 48 50 12 10
노빌레틴 4.8 29.5 30.7 30.4 5.2 5.8
알츠하이머 동물 모델의 제작
6주령의 SD-rat(Male)을 구입한 후 1주일 동안 동물사육실의 환경 안에서 순화시킨 후, 건강한 개체를 선별하여 실험에 사용하였다. 온도(22±3℃), 상대습도(50±20%), 환기횟수 10~15회/시간, 조명주기 12시간(8:00~20:00)의 사육환경으로 설정된 사육실에서 사료와 음용수를 급여하였으며, 순화 및 시험기간 동안 격리사육을 실시하였다.
알츠하이머 유발을 위해 SD-rat에 50 mg/kg의 펜토바비탈(pentobarbital, 한림제약)을 복강주사하여 마취시켰다. 정위(atereotaxic) 수술대에 고정시킨 다음 약물을 주입할 부위의 두피를 절개하고 현미경을 이용하여 시옷점(lambda)과 정수리점(bregma)을 찾아 측뇌실(lateral ventricle)에 베타아밀로이드(β-amyloid, sigma)를 매일 5 ㎕(15 nmole)씩 2주 동안 주입하였다. 베타아밀로이드는 주사기 펌프(syringe pump)를 이용하여 1 ㎕/min의 유속으로 주입하였으며 주입 5분 후 주사기를 제거하였다. 대조군에서는 베타아밀로이드 대신 5 ㎕의 생리식염수를 주입하였다.
알츠하이머 유발 2주 후, 14일 동안 시험물질을 경구투여하였으며, 실험군으로는 무처리군(Normal), 베타아밀로이드만을 투여한 대조군(Control), 비교예 1의 추출물 처리군(100 mg/kg), 비교예 2의 추출물 처리군(100 mg/kg), 비교예 3의 추출물 처리군(100 mg/kg) 또는 실시예 1의 추출물 처리군(50 또는 100 mg/kg)으로 구성하였다.
< 실험예 1> 지각 추출물의 신경세포 보호효과 확인
상기 실시예 1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물이 베타아밀로이드로 유발된 생쥐 유래 해마세포의 세포독성에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기와 같이 MTT 방법을 통하여 세포생존율을 평가하였다.
구체적으로, 생쥐 해마 유래 HT22 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였으며, 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum), 페니실린(Penicillin) 및 스트렙토마이신(Streptomycin)을 함유한 DMEM 배지에서 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 생존률 측정을 위해, HT22 세포를 5×104cells/well 씩 96 well plate에 분주하고, 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시킨 후, 배양액을 제거하고 소태아 혈청이 포함되지 않은 배양액을 분주하였으며, 200 μM의 베타아밀로이드(Aβ1-42)와 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 얻은 분말 형태의 농도별(12.5, 25, 50, 100 ㎍/ml) 지각 추출물을 동시에 처리하였다. 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 동안 배양한 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; sigma-aldrich Co.) 분석을 통해 세포독성을 계산하였다. 세포 생존률은 MTT 시약(5 mg/ml)을 20 ㎕/well 첨가하고 2시간 동안 배양한 후, 배양 상등액을 제거하고 생성된 formazan crystal을 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Wako)로 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 베타아밀로이드(Aβ1-42) 처리시 세포 생존률이 59%까지 감소하였고, 비교예 1 내지 3의 지각 추출물 100 ug/ml을 함께 처리하였을 때에는 80.5%, 79.3%, 81.5%로 세포 생존률이 증가하였으나, 통계적인 유의성이 없었다. 반면, 실시예 1의 지각 추출물의 경우 베타아밀로이드(Aβ1-42) 처리에 의해 감소하였던 세포 생존률을 92%까지 유의적으로 증가시켰으며, 이를 통해 실시예 1의 방법으로 추출된 지각 추출물의 세포 보호효과를 확인할 수 있었다(도 1).
< 실험예 2> 지각 추출물의 인지능력 및 기억력 개선 효과 확인
<2-1> 모리스 인지능력 평가(Morris water maze test)
베타아밀로이드(Aβ1-42)의 투여로 인한 기억력 감퇴에 있어서 상기 실시예 1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물의 투여를 통해 인지능력 개선 효과를 확인하고자 모리스 인지능력 평가를 실시하였다.
구체적으로, 지름 180 cm 및 높이 50 cm의 수중 미로 장치에서 탈출 플랫폼(white platform)의 지름은 6 cm로 구성되었다. 온도가 22±2℃ 되는 물이 30 cm 높이로 채워지게 하였으며, 미로 주변은 비디오카메라, 실험대 그리고 수조 주위 벽면에 걸려 있는 각종 도형 모양의 공간단서(Cue)들을 일정하게 유지하였다. 미로에 물의 높이가 30 cm가 되도록 물을 채우고 마우스가 플랫폼을 볼 수 없도록 플랫폼을 물 높이의 1 cm 밑에 설치하였다. 수중 미로는 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)의 사분면으로 구분되고, 이중 북동 사분원의 중심부에 도피대가 놓여지며, 나머지 중 하나가 출발 위치로 사용되었다. 실험동물은 하루에 180초간 4행씩 4일간 훈련을 받으며(Acquisition test), 4일째 마지막 시행이 끝나면 자유수영 검사가 시행되는데(Retention test) 이때 동물들은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게 하였다. 모든 동물들의 행동은 비디오 카메라로 녹화하였으며, 훈련 시행에서는 출발에서부터 도피대에 올라가는데 걸린 시간을 S-MART 프로그램(Pab Lab, spain) 이용하여 측정하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 4일 동안 180초 내 플랫폼에 도달하기까지 시간을 측정하는 획득시행 제1일째에서는, 모의시술군(Normal)은 48.1초, 기억력 손상군(Control)은 45.3초, 비교예 1 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 45.2초, 비교예 2 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 48.3초, 비교예 3 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 46.4초, 실시예 1 지각 추출물 50 mg/kg 투여군은 48.5초, 실시예 1 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 49.7초로 유의성 없이 비슷하게 나타내었으나, 학습이 진행된 시점인 제4일째에는 도피대에 도달하는데 소요되는 시간이 모의시술군(Normal)은 군은 29.7초로 나타났으며, 기억력 손상군(Control)은 41.9초로 비교예 1, 2, 3 지각 추출물 100 mg/kg 투여군과 유의성 없이 비슷한 결과를 보였으나, 실시예 1 지각 추출물 50 mg/kg 투여군은 31.7초, 실시예 1 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 23.1 초로 학습수행에 우수한 증진효과가 관찰되었다(P<0.05).
시험물질 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
무처리군(Normal) 48.1 36.9 35.7 29.7
대조군(Control) 45.3 46.5 45.24 41.9
비교예 1 추출물 100mg/kg 45.2 39.6 35.1 37.4
비교예 2 추출물 100 mg/kg 48.3 41.7 39.4 38.1
비교예 3 추출물 100 mg/kg 46.4 39.2 41.3 39.7
실시예 1 추출물 50 mg/kg 48.5 37.8 33.5 31.7
실시예 1 추출물 100 mg/kg 49.7 38.2 26.1 23.1
또한, 수중 미로 학습에서 마지막 날인 4일째에 도피대를 제거하고 도피대가 있었던 사분면이 머무르는 정도를 측정하여 도피대의 위치에 대한 기억을 보유하고 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 모의시술군(Normal)은 25±3.75%, 기억력 손상군(Control)은 9.5±9.7%, 비교예 1 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 25.8±11.1%, 비교예 2 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 22.4±12.3%, 비교예 3 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 29.4±5.9%, 실시예 1 지각 추출물 50 mg/kg 투여군은 32.3±4.9%, 실시예 2 지각 추출물 100 mg/kg 투여군은 37.4±2.2%로, 비교예 1 내지 3 지각 추출물 투여군이 손상군에 비해 플랫폼이 있었던 곳에 머무르는 정도의 유의한 차이는 나타나지 않았으나, 실시예 1 지각 추출물 투여군에서 공간 기억력에 대한 증진 경향성이 나타났다(P<0.05).
<2-2> 수동적 회피반응 실험(Passive avoidance test)
베타아밀로이드(Aβ1-42)의 투여로 인한 기억력 감퇴에 있어서 상기 실시예 1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물로 인한 기억력 개선 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 본 실험 8시간 전 밝은 불빛이 드는 챔버(chamber)와 어두운 챔버가 작은 통로로 연결되어 있는 상황에서, 밝은 불빛이 드는 챔버에 실험동물을 놓아두었다. 실험동물은 본능적으로 어두운 챔버로 들어가게 되지만, 어두운 챔버에서는 전기쇼크(Electric shock)와 같은 혐오자극을 주어 공포학습을 시켰다. 학습 8시간 후, 밝은 빛의 챔버에 실험동물을 두었을 때, 어두운 암소의 챔버에 들어갈 때까지의 시간, 즉 수동회피반응시간(Step latency; sec)을 측정하여 이를 수치화하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 베타아밀로이드만을 처리할 경우(control) 문이 열린 후 어두운 구획으로 들어가는 시간, 즉 수동회피반응시간(Step latency; sec)이 감소하였다. 반면, 실시예 1의 방법으로 추출된 지각 추출물을 함께 투여할 경우 농도 의존적으로 수동회피반응시간이 증가하여 무처리군(Normal)과 유사하게 개선되었음을 확인하였다. 이는 비교예 1 내지 3의 방법으로 추출된 지각 추출물에 비해 유의적으로 개선되었음을 확인하였다(P<0.05).
시험물질 수동회피 반응시간 (sec) 개선률 ( % )
무처리군(Normal) 173.4 -
대조군(Control) 22.3 0
비교예 1 추출물 100 mg/kg 48.9 55
비교예 2 추출물 100 mg/kg 31.7 29.7
비교예 3 추출물 100 mg/kg 49.8 55.3
실시예 1 추출물 50 mg/kg 55.5 59.9
실시예 1 추출물 100 mg/kg 72 70
< 실험예 3> 지각 추출물의 아세틸콜린 에스테라제 ( acetylcholinesterase ) 억제 활성 확인
베타아밀로이드(Aβ1-42)의 투여로 인해 증가된 아세틸콜린 분해 효소의 활성이 상기 실시예 1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물로 인해 억제되는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 알츠하이머 동물모델인 마우스를 안락사시키고 뇌를 제거하여 대뇌피질과 해마를 분리하였다. 두 조직은 인산나트륨 완충액(0.1 mM, pH7.4)에서 균질화하였으며, 각각은 0.1 mM tetraisopropyl pyrophosphoramide(TPPA)와 함께 37℃에서 5분간 배양하였다. 아세틸콜린 에스터라아제 활성 측정을 위해 470 ㎕의 인산나트륨(0.1 mM, pH 8.0), 4% 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB) 167 ㎕ 및 균질액 331 ㎕를 37℃에서 5분간 처리하였다. 그 다음 1 mM acetylcholine iodide solution 280 ㎕를 혼합물에 첨가하였다. 37℃에서 3분간 배양한 후, 2 mM neostigmine 50 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 베타아밀로이드만을 처리할 경우(Control) 아세틸콜린을 분해하여 기억력을 감퇴시키는 효소인 아세틸콜린 에스터라아제(AchE)의 활성이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 실시예 1의 지각 추출물을 함께 투여할 경우 AchE의 활성이 감소한 것을 확인하였다. 이는, 비교예 1 내지 3의 방법으로 추출된 지각 추출물에 비해 유의적으로 개선되었음을 확인하였다(P<0.05).
시험물질 U/mg protein
Cortex Hippocampus
무처리군(Normal) 0.357±0.15 0.289±0.01
대조군(Control) 0.654±0.02 0.495±0.03
비교예 1 추출물 100 mg/kg 0.631±0.03 0.462±0.17
비교예 2 추출물 100 mg/kg 0.644±0.18 0.496±0.07
비교예 3 추출물 100 mg/kg 0.649±0.12 0.489±0.28
실시예 1 추출물 50 mg/kg 0.455±0.01 0.327±0.12
실시예 1 추출물 100 mg/kg 0.433±0.03 0.326±0.05
< 실험예 4> 지각 추출물의 항산화 활성 확인
상기 실시예 1의 추출물 및 비교예 1 내지 3의 추출물의 처리를 통해 베타아밀로이드로 유도된 알츠하이머 동물모델에서 항산화 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 알츠하이머 동물모델 마우스를 안락사시키고 4℃ 조건에서 대뇌피질과 해마를 해부하고 0.1M phosphate buffer (pH 7.4)에서 균질화하였다. 균질액을 4℃에서 3000 X g로 30분 동안 원심분리하고 상등액을 수집하였다. 단백질 농도는 bicinochoninic acid (BCA) 키트를 사용하여 측정하였다.
항산화물질인 Glutathione은 환원형 Glutathione(GSH)과 산화형 Glutathione(GSSG)의 형태로 존재하는데, 체내 환원형 Glutathione 수준이 높을 때 항산화 작용이 원활하게 수행될 수 있다. Glutathione reductase(GR)은 산화형 Glutathione을 환원형 Glutathion으로 변환시키는 반응을 촉매함으로써 Glutathione의 항산화 작용을 돕는다.
그 결과, 표 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 베타아밀로이드만을 처리할 경우(Control) 대뇌피질 및 해마 부위에서 Glutathione peroxidase 활성이 증가하였으며, Glutathione reductase 활성은 감소하였다. 또한, 산화형 Glutathione 생성은 증가하였으나, 환원형 Glutathione 수준이 감소하였음을 확인하였다. 반면, 실시예 1의 지각추출물을 함께 투여할 경우 대뇌피질 및 해마 내 산화형 Glutathion(GSSG)의 비율이 줄어들었음을 확인하였다. 이는, 비교예 1 내지 3의 지각 추출물에 비해 유의적으로 개선되었음을 확인하였다(P<0.05).
시험물질
피질(Cortex) 해마( Hippocampus)
Glutathione peroxidase Glutathione reductase Glutathione peroxidase Glutathione reductase
무처리군(Normal) 0.505 11.268 0.498 5.403
대조군(Control) 0.685 8.193 0.549 3.989
비교예 1 추출물 100 mg/kg 0.668 7.098 0.524 4.995
비교예 2 추출물 100 mg/kg 0.679 8.566 0.537 5.049
비교예 3 추출물 100 mg/kg 0.688 8.948 0.541 5.108
실시예 1 추출물 50 mg/kg 0.617 13.46 0.544 6.138
실시예 1 추출물 100 mg/kg 0.628 13.204 0.516 5.865
시험물질 피질(Cortex) 해마( Hippocampus )
GSSG/Total GSH ratio GSSG/Total GSH ratio
무처리군(Normal) 0.029 0.048
대조군(Control) 0.087 0.21
비교예 1 추출물 100 mg/kg 0.083 0.113
비교예 2 추출물 100 mg/kg 0.084 0.151
비교예 3 추출물 100 mg/kg 0.086 0.108
실시예 1 추출물 50 mg/kg 0.079 0.05
실시예 1 추출물 100 mg/kg 0.075 0.051
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
실시예 1의 지각 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
실시예 1의 지각 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
실시예 1의 지각 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 주사액제의 제조
실시예 1의 지각 추출물 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 다중치환 벤즈옥사졸로 치환된 피리딘 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

Claims (10)

  1. 지각(Citrus aurantium) 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써,
    상기 추출물은,
    1) 지각 과피를 세절하여 건조시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 건조된 지각 과피를 주정에 침지한 후 여과 및 농축하여 주정 추출물을 수득하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 주정 추출물을 초임계 이산화탄소를 용매로 하여 초임계 유체 추출물을 수득하는 단계로 제조되는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 주정은 건조된 지각 과피 중량의 10 내지 30배의 양인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 주정은 60 내지 80 중량%의 에탄올인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 초임계 유체 추출물은 10 내지 50℃의 온도 조건 하에서 추출되는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 초임계 유체 추출물은 500 내지 900 bar의 압력 조건 하에서 추출되는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 지각 과피 추출물은 아세틸콜린 분해 효소(acetylcholinesterase) 활성을 억제하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머 치매(노인성 치매), 뇌졸중, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 외상후 스트레스 장애 및 기억상실증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 지각(Citrus aurantium) 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품으로써,
    상기 추출물은,
    1) 지각 과피를 세절하여 건조시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 건조된 지각 과피를 주정에 침지한 후 여과 및 농축하여 주정 추출물을 수득하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 주정 추출물을 초임계 이산화탄소를 용매로 하여 초임계 유체 추출물을 수득하는 단계로 제조되는, 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 알츠하이머 치매(노인성 치매), 뇌졸중, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 외상후 스트레스 장애 및 기억상실증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인, 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 지각 과피 추출물은 아세틸콜린 분해 효소(acetylcholinesterase) 활성을 억제하는, 퇴행성 뇌질환 개선용 건강기능식품.
KR1020170147533A 2017-11-07 2017-11-07 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR20190051657A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170147533A KR20190051657A (ko) 2017-11-07 2017-11-07 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170147533A KR20190051657A (ko) 2017-11-07 2017-11-07 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190051657A true KR20190051657A (ko) 2019-05-15

Family

ID=66579761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170147533A KR20190051657A (ko) 2017-11-07 2017-11-07 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20190051657A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101501433B1 (ko) 비알코올성 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물
CN113543793A (zh) 螺旋藻提取物的制备方法、和包含螺旋藻提取物的用于改善认知能力的药学组合物及保健功能食品
KR101341693B1 (ko) 생약추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 치료 및 예방을 위한 조성물
KR20160144791A (ko) 여성 갱년기 증상 개선용 조성물
KR101734896B1 (ko) 감나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 각막 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101729003B1 (ko) 황칠 추출물 또는 황칠액 발효대사체를 포함하는 통풍 예방 또는 치료용 조성물
EP3865142A1 (en) Pharmaceutical composition and health food for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising fermented steam-dried ginseng berry
KR101345653B1 (ko) 산두근 추출물을 포함하는 아세틸콜린에스터라제 활성 저해용 조성물
KR101045025B1 (ko) 천식 치료 또는 예방용 약학조성물
KR101420135B1 (ko) 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물
WO2005094858A1 (ja) 抗糖尿病用組成物
KR20130029284A (ko) 치매 개선용 건강식품 조성물
KR101748301B1 (ko) 질경이 추출물 및 인삼 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물
WO2018052171A1 (ko) 율무 추출물을 포함하는 위암 치료용 조성물과 그 추출방법
KR101694617B1 (ko) 오미자 추출 원액의 제조 방법 또는 상기 방법으로 제조된 오미자 추출 원액
KR101584513B1 (ko) 뇌신경세포 보호 기능이 있는 모시잎 발효물과 그를 이용한 모시잎 발효차
KR101894491B1 (ko) 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 또는 인지 기능 개선용 조성물
KR20120086262A (ko) 진피 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물
KR20190051657A (ko) 지각 초임계 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101131719B1 (ko) 백두옹 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물
KR101793145B1 (ko) 가시박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101221623B1 (ko) 포도근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 완화, 피로회복 또는 운동수행능력 증강용 식품조성물
KR100640094B1 (ko) 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 녹차씨유를 포함하는 조성물
KR20150085215A (ko) 흑마늘 및 천마 추출물을 포함하는 항산화 조성물 및 그 제조 방법
KR20200061285A (ko) 가랑갈 추출물을 포함하는 혈액순환 및 혈관질환 예방용 식품 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application