KR20190050626A - 피부 미백용 흑삼 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부 미백용 흑삼 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 흑삼 추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 흑삼 추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 미백용 흑삼 추출물 및 이의 제조방법{Black ginseng extract for skin whitening and manufacturing method thereof}
본 발명은 피부 미백용 흑삼 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 흑삼 추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 흑삼 추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 피부 미백에 대한 관심이 급증하고 있다. 피부 미백 화장품에 대한 선호도가 여름철에서 4계절로 확대됨에 따라, 피부를 보호하고 건강한 상태를 유지하기 위해서 크림류나 로션류, 오일류 등의 각종 미백 화장료가 사용되고 있다.
사람의 피부색은 멜라닌(melanin), 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소로 작용한다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되고, 멜라노사이트에는 다양한 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여 생체 내에 항상 존재하는 특정 아미노산을 기질로 중합화하는 산화반응을 통해 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)로 전이되어 피부색을 나타내게 되며, 표피의 각화 과정(keratinization)을 거치면서 각질과 함께 소실된다.
한편, 멜라닌은 핵 주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하고 피부에서 자외선을 흡수하거나 산란시켜 피부 내부의 세포나 조직들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주지만, 과도한 자외선에 대한 노출, 대기오염, 스트레스 등 외부의 환경변화에 의해 멜라닌이 비정상적으로 과잉생산되거나, 각화작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 현상이 일어나게 되어 피부의 흑화(黑化), 기미, 주근깨 등의 원인이 된다.
이에, 미백효능을 나타낼 수 있는 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있는 물질에 대한 연구가 시급한 실정이다.
KR 10-2009-0032501 A
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 흑삼 추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 흑삼 추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, (1) 인삼을 55℃ ~ 75℃에서 1차 열처리 및 85℃ ~ 105℃에서 2차 열처리하여 증삼시키되, 상기 증삼을 2 ~ 5회 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계; 및 (2) 흑삼을 추출 및 농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계는 (1)-1 인삼을 55℃ ~ 75℃에서 5 ~ 15분 동안 1차 열처리하는 단계; (1)-2 1차 열처리한 인삼을　85℃ ~ 105℃에서 1.5 ~ 5.5시간 동안 2차 열처리하는 단계; 및 (1)-3 상기 (1)-2 단계를 2 ~ 6회 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 (1) 단계 전에 인삼을 세척 및 건조하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 (2) 단계는 (2)-1 흑삼 및 유기용매를 포함하는 혼합액을 30℃ ~ 50℃에서 20 ~ 28시간 동안 2 ~ 5회 반복추출하는 단계; 및 (2)-2 추출한 흑삼을 감압농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유기용매는 농도 90% 이상의 메탄올일 수 있다.
또한, 상기 (2)-1 단계의 혼합액은 흑삼 및 유기용매를 60 : 40 ~ 80 : 20의 중량비로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 흑삼 추출물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 흑삼 추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 흑삼 추출물을 유효성분으로 포함하며, 하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
(a) 흑삼 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 10% 이상
(b) 흑삼 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 13% 이상
(c) 흑삼 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 22% 이상임.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 흑삼 추출물을 분획하여 흑삼 추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 흑삼 추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출분획물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 흑삼 추출물의 분획물은 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
또한, 상기 분리는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 분리된 피부 미백용 흑삼 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 흑삼 추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되, 상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rh3은 농도 50 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rg5는 농도 25 ~ 100μM로 포함될 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 흑삼 추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 흑삼 추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과가 있다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따른 피부 미백용 흑삼 추출물의 제조방법은, (1) 인삼을 증삼시켜서 흑삼을 제조하는 단계; 및 (2) 흑삼을 추출 및 농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계;를 포함한다.
먼저, 흑삼을 제조하는 (1) 단계;에 대하여 설명한다.
상기 (1) 단계는, (1)-1 인삼을 1차 열처리하는 단계, (1)-2 1차 열처리한 인삼을 2차 열처리하는 단계 및 (1)-3 상기 (1)-2 단계를 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (1)-1 단계는 인삼을 1차 열처리하는 단계로써, 인삼을 55℃ ~ 75℃에서 5 ~ 15분 동안 1차 열처리를 수행하고, 바람직하게는 60℃ ~ 70℃에서 6 ~ 13분 동안 1차 열처리를 수행할 수 있다. 만일 상기 1차 열처리의 온도 및 시간 범위를 만족하지 못하면, 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 미백효능이 저하될 수 있다.
또한, 상기 (1)-2 단계는 1차 열처리한 인삼을 2차 열처리하는 단계로써, 1차 열처리한 인삼을 85℃ ~ 105℃에서 1.5 ~ 5.5시간 동안 2차 열처리를 수행하고, 바람직하게는 90℃ ~ 100℃에서 2 ~ 5시간 동안 2차 열처리를 수행할 수 있다. 만일 상기 2차 열처리의 온도 및 시간 범위를 만족하지 못하면, 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 미백효능이 저하될 수 있다.
그리고, 상기 (1)-3 단계는 상기 (1)-2 단계를 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계로써, 상기 (1)-2 단계를 2 ~ 6회 반복수행하고, 바람직하게는 3 ~ 5회 반복수행하여 흑삼을 제조할 수 있다. 만일 상기 (1)-2단계의 반복수행 횟수가 2회 미만이면 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않거나, 미백효능이 저하될 수 있다.
한편 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (1) 단계 전에 인삼을 세척 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척 및 건조하는 단계는 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 방법에 의해 세척 및 건조를 수행할 수 있음에 따라, 본 발명에서는 이를 특별히 한정하지 않는다.
다음으로, 흑삼을 추출 및 농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 (2) 단계를 설명한다.
상기 (2) 단계는, (2)-1 흑삼 및 유기용매를 포함하는 혼합액을 반복추출하는 단계 및 (2)-2 추출한 흑삼을 감압농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (2)-1 단계는 흑삼 및 유기용매를 포함하는 혼합액을 반복추출하는 단계로써, 상기 혼합액을 30℃ ~ 50℃에서 20 ~ 28시간 동안 2 ~ 5회 반복추출할 수 있고, 바람직하게는 40℃ ~ 50℃에서 22 ~ 26시간 동안 2 ~ 4회 반복추출할 수 있다. 만일 상기 반복추출의 온도가 상기 범위를 만족하지 못하면 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 미백효능이 저하될 수 있다.
한편, 상기 유기용매는 통상적으로 추출용매로 사용될 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 발효에탄올 및 에틸아세테테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로 메탄올을 사용하는 경우 상기 유기용매는 농도 90% 이상의 메탄올일 수 있고, 바람직하게는 농도 92% 이상의 메탄올일 수 있으며, 보다 바람직하게는 농고 94% 이상의 메탄올 일 수 있다. 만일 상기 메탄올의 농도가 90% 미만이면 추출되는 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않거나, 추출물 또는 분획물의 미백효능이 저하될 수 있다.
또한, 상기 혼합액은 상기 흑삼 및 유기용매를 60 : 40 ~ 80 : 20의 중량비로, 바람직하게는 65 : 35 ~ 75 : 25의 중량비로 포함할 수 있다. 만일 상기 흑삼 및 유기용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나면 추출되는 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 미백 효능이 저하될 수 있다.
그리고, 상기 (2)-2 단계는 흑삼을 감압농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계로써, 상기 감압농축의 조건은 통상적으로 사용할 수 있는 감압농축의 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있음에 따라, 본 발명에서는 이를 특별히 한정하지 않는다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 흑삼 추출물을 제공한다.
상기 흑삼 추출물은 상술한 제조방법을 통해 제조됨에 따라 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5를 포함할 수 있으며, 종래에 비하여 월등히 높은 함량으로 상기 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 흑삼 추출물을 유효성분으로 포함하여, 하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
조건 (a)로써, 흑삼 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 10% 이상, 바람직하게는 11% 이상일 수 있고, 조건 (b)로써, 흑삼 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 13% 이상, 바람직하게는 14% 이상일 수 있으며, 조건 (c)로써, 흑삼 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 22% 이상, 바람직하게는 24% 이상일 수 있다. 상기 범위를 만족함에 따라 소량으로도 높은 멜라닌 저해율을 나타냄과 동시에 세포독성이 없는 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 흑삼 추출물을 분획하여 흑삼 추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 흑삼 추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출분획물 제조방법을 제공한다.
먼저 상술한 제조방법으로 제조된 흑삼 추출물을 분획하여 흑삼 추출물의 분획물을 제조하는 단계를 설명한다.
상기 분획은 흑삼 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc)/물(H2O)을 이용하여 분배 추출한 다음, 물 층을 수득하여 부탄올(n-BuOH)로 2 ~ 6회, 바람직하게는 3 ~ 5회 분배 추출하고, 상기 에틸아세테이트층, 물층 및 부탄올층을 각각 감압농축을 수행함으로써, n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 수득할 수 있다.
한편, 상기 분획을 수행함에 따라, n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 얻을 수 있으며, 후술하는 분리 단계를 수행함에 따라 목적하는 수준으로 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5를 고수득 하기 위하여, 상기 분획을 통해 얻어진 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획 중 에틸아세테이트 분획을 분획물로 사용할 수 있다.
다음, 상기 흑삼 추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계를 설명한다.
상기 분리는 통상적인 분리방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있고, 보다 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 일련의 공정으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 상기 분리하는 단계 뒤에 분리한 분리물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 분리된 피부 미백용 흑삼 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 흑삼 추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되, 상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 바람직하게는 농도 30 ~ 90μM로, 진세노사이드 Rh3는 농도 50 ~ 100μM로, 바람직하게는 농도 60 ~ 90μM로, 진세노사이드 Rg5는 농도 25 ~ 100μM로, 바람직하게는 농도 30 ~ 90μM로 포함될 수 있다. 상기 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5가 상기 농도 범위를 만족하도록 유효성분으로 포함됨에 따라, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 피부 미백용 흑삼 추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 흑삼 추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 흑삼추출물의 제조
(1) 흑삼의 제조
6년생의 인삼을 수세 및 건조하고, 증삼기에 투입하여 65℃에서 10분 동안 1차 열처리를 수행하고, 1차 열처리를 수행한 인삼을 94℃에서 3.5 시간 동안 2차 열처리를 4회 반복수행하여 흑삼을 제조하였다.
(2) 흑삼 추출물의 제조
제조한 흑삼을 농도 100%의 메탄올과 70 : 30의 중량비로 혼합한 혼합액을 35℃에서 24시간 동안 3회 반복추출하고, 온도 45℃에서 45 psi의 압력으로 5 시간 동안 감압농축을 수행하여 흑삼 추출물을 제조하였다.
실시예 2 ~ 20 및 비교예 1 ~ 7
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1차 열처리 온도와 시간, 2차 열처리 온도와 시간 및 2차 열처리의 반복횟수, 혼합액 추출온도, 흑삼과 유기용매의 중량비, 유기용매의 농도 및 증삼 여부 등을 달리하여 표 1 내지 표 4와 같이 흑삼 추출물을 제조하였다.
<실험예 1>
상기 실시예 1 ~ 20 및 비교예 1 ~ 7에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 1 내지 표 4에 나타내었다.
1. 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 정량분석
상기 실시예 및 비교예에 따라 제조한 흑삼 추출물에 대하여, 고분해능 액체그래마토그래피/질량분석기(UPLC-QTOF/MS, 워터스)를 통해 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 양을 정량분석 하였다.
2. 멜라닌 저해효능 평가
상기 실시예 및 비교예에 따라 제조한 흑삼 추출물에 대하여, 멜라닌 저해효능을 평가하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 200μM 농도로 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
구분 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7
1차 열처리 온도(℃) 65 65 65 65 65 65 65
시간(min) 10 3 18 10 10 10 10
2차 열처리 온도(℃) 94 94 94 90 100 94 94
시간(hr) 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 1 2
반복횟수
(회)		 4 4 4 4 4 4 4
혼합액 추출온도(℃) 35 35 35 35 35 35 35
흑삼과 유기용매 중량비 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30
유기용매 농도(%) 100 100 100 100 100 100 100
증삼여부　 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Rk1(mg/g) 37.5 30.6 30.2 36.3 35.8 30.7 35.6
Rh3(mg/g) 23.9 19.1 18.9 21.7 22.1 19.4 21.3
Rg5(mg/g) 0.18 0.11 0.12 0.15 0.16 0.1 0.14
멜라닌 저해율(%) 25.7 21 21.7 24.5 24.8 21.3 24.1
구분 실시예8 실시예9 실시예10 실시예11 실시예12 실시예13 실시예14
1차 열처리 온도(℃) 65 65 65 65 65 65 65
시간(min) 10 10 10 10 10 10 10
2차 열처리 온도(℃) 94 94 94 94 94 94 94
시간(hr) 5 6 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
반복횟수
(회)		 4 4 3 5 4 4 4
혼합액 추출온도(℃) 35 35 35 35 20 40 55
흑삼과 유기용매 중량비 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30
유기용매 농도(%) 100 100 100 100 100 100 100
증삼여부　 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Rk1(mg/g) 34.8 29.4 35.1 35.5 27.6 36.9 24.1
Rh3(mg/g) 22 18.8 22.6 23.1 18.4 23.7 16.2
Rg5(mg/g) 0.15 0.11 0.15 0.15 0.12 0.17 0.7
멜라닌 저해율(%) 24.6 21.7 24.3 24.5 18.4 25.2 20.9
구분 실시예15 실시예16 실시예17 실시예18 실시예19 실시예20
1차 열처리 온도(℃) 65 65 65 65 65 65
시간(min) 10 10 10 10 10 10
2차 열처리 온도(℃) 94 94 94 94 94 94
시간(hr) 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
반복횟수
(회)		 4 4 4 4 4 4
혼합액 추출온도(℃) 35 35 35 35 35 35
흑삼과 유기용매 중량비 55:45 65:35 75:25 85:15 70:30 70:30
유기용매 농도(%) 100 100 100 100 92 85
증삼여부　 ○ ○ ○ ○ ○ ○
Rk1(mg/g) 31 36.3 36.8 31.1 36.2 31.3
Rh3(mg/g) 19.3 23.4 23.2 18.8 23.1 18.6
Rg5(mg/g) 0.12 0.16 0.16 0.11 0.15 0.1
멜라닌 저해율(%) 20.7 25.4 25.1 21.2 24.8 19.7
구분 비교예1 비교예2 비교예3 비교예4 비교예5 비교예6 비교예7
1차 열처리 온도(℃) 50 80 65 65 65 65 65
시간(min) 10 10 10 10 10 10 10
2차 열처리 온도(℃) 94 94 80 110 94 94 94
시간(hr) 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
반복횟수
(회)		 4 4 4 4 1 7 4
혼합액 추출온도(℃) 35 35 35 35 35 35 35
흑삼과 유기용매 중량비 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30 70:30
유기용매 농도(%) 100 100 100 100 100 100 100
증삼여부　 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ×
Rk1(mg/g) 31.9 32.2 27.5 27.1 25.3 26.4 17.9
Rh3(mg/g) 19.4 19.1 18.2 18.6 17 17.8 7.3
Rg5(mg/g) 0.11 0.10 0.7 0.9 0.6 0.9 0.2
멜라닌 저해율(%) 20.4 21.4 21.6 20.8 16.3 19.2 12.7
상기 표 1 내지 표 4에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 1차 열처리 온도와 시간, 2차 열처리 온도와 시간 및 2차 열처리의 반복횟수, 혼합액 추출온도, 흑삼과 유기용매의 중량비, 유기용매의 농도 및 증삼 여부 등을 모두 만족하는 실시예 1, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 16, 17 및 19가, 이 중에서 하나라도 누락된, 실시예 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15, 18, 20 및 비교예 1 ~ 7에 비하여 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 수율이 우수한 동시에 멜라닌 저해율이 우수하였다.
제조예 1: 피부 미백용 화장료 조성물의 제조
상기 실시예 1에 따라 제조된 흑삼 추출물을 하기와 같은 함량으로 혼합하여 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
흑삼 추출물 100mg/10㎖
모노스테아린산글리세린 4㎖
세테아릴알콜 4.5㎖
스테아린산 3㎖
밀납 1.5㎖
글리세린 3㎖
스쿠알란 8㎖
베타인 6㎖
소듐히아루로네이트 0.5㎖
경화식물유 2㎖
폴리솔베이트60 3㎖
증류수 100㎖가 되도록 혼합함.
제조예 2 ~ 20 비교제조예 1 ~ 7
상기 제조예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1에 따라 제조된 흑삼 추출물을, 각각 실시예 2 ~ 20 및 비교예 1 ~ 7에 따라 제조된 흑삼 추출물로 변경하여 표 5 및 표 6와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
<실험예 2>
상기 제조예 1 ~ 20 및 비교제조예 1 ~ 7에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 5 및 6에 나타내었다.
1. 농도별 멜라닌 저해율 측정
상기 제조예 및 비교제조예에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 흑삼 추출물의 농도 50μM, 100μM 및 200μM 에서 멜라닌 저해율을 측정하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 각각 흑삼 추출물의 농도가 50μM, 100μM 및 200μM이 되도록 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
2. 세포독성 평가
상기 제조예 및 비교제조예에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 흑삼 추출물이 농도 200 μM일 때, 세포독성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 농도별 멜라닌 저해율 측정방법과 동일하게 실시하여 수행하되, 하기 수학식에 따라 대조군(비처리군)과의 세포생존의 비율로써 측정하였으며, 세포생존 비율이 95% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 평가하였다.
[수학식]
세포 생존률(%) =[(화합물 처리 세포수 OD 값- blank 웰 OD 값)/(대조군 OD 값 - blank 웰 OD 값)] × 100(%)
구분 흑삼추출물 종류 흑삼 추출물 농도에 따른 멜라닌 저해율(%) 세포독성
50μM 100μM 200μM
제조예1 실시예1 13.3 15.7 25.7 없음
제조예2 실시예2 9.6 12.2 21　 없음
제조예3 실시예3 9.7 12.4 21.7 없음
제조예4 실시예4 12.4 14.7 24.5 없음
제조예5 실시예5 12.6 14.8 24.8 없음
제조예6 실시예6 9.6 12.5 21.3 없음
제조예7 실시예7 12.2 14.1 24.1 없음
제조예8 실시예8 12.5 14.3 24.6 없음
제조예9 실시예9 9.5 12.5 21.7 없음
제조예10 실시예10 12.2 14.1 24.3 없음
제조예11 실시예11 12.6 14.4 24.5 없음
제조예12 실시예12 7.8 11.3 18.4 없음
제조예13 실시예13 12.8 15.1 25.2 없음
제조예14 실시예14 9.4 11.6 20.9 없음
구분 흑삼추출물 종류 흑삼 추출물 농도에 따른 멜라닌 저해율(%) 세포독성
50μM 100μM 200μM
제조예15 실시예15 9.3 12.1 20.7 없음
제조예16 실시예16 13 15.1 25.4 없음
제조예17 실시예17 12.6 14.7 25.1 없음
제조예18 실시예18 9.7 12 21.2 없음
제조예19 실시예19 12.4 14.4 24.8 없음
제조예20 실시예20 8.2 11.2 19.7 없음
비교예1 비교예1 9.3 11.5 20.4 없음
비교예2 비교예2 9.6 12.1 21.4 없음
비교예3 비교예3 9.6 11.7 21.6 없음
비교예4 비교예4 9.4 12.2 20.8 없음
비교예5 비교예5 6.9 9.8 16.3 없음
비교예6 비교예6 8 10.6 19.2 없음
비교예7 비교예7 4.5 7.3 12.7 없음
상기 표 5 및 표 6에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 1차 열처리 온도와 시간, 2차 열처리 온도와 시간 및 2차 열처리의 반복횟수, 혼합액 추출온도, 흑삼과 유기용매의 중량비, 유기용매의 농도 및 증삼 여부 등을 모두 만족하는 실시예 1, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 16, 17 및 19에 따른 흑삼 추출물을 포함하여 제조한 제조예 1, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 16, 17 및 19이, 이 중에서 하나라도 누락된, 실시예 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15, 18, 20 및 비교예 1 ~ 7에 따른 흑삼 추출물을 포함하여 제조한 제조예 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15, 18, 20 및 비교제조예 1 ~ 7에 비하여 농도별 멜라닌 저해율이 월등히 우수한 동시에 세포독성이 없었다.
실시예 21: 흑삼 추출분획물의 제조
상기 실시예 1에 따라 제조한 흑삼 추출물 1.44kg을 에틸아세테이트(EtOAc) 3L /물(H2O) 3L을 이용하여 4회 분배 추출한 다음, 물 층을 수득하여 부탄올(n-BuOH) 2.7L로 4회 분배 추출하고, 상기 에틸아세테이트층, 물층 및 부탄올층을 각각 감압농축하여 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 얻었으며, 이 중에서 흑삼 추출물의 분획물로 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를순차적으로 수행함에 따라 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하여 흑삼 추출분획물을 제조하였다.
<실험예 3>
상기 실시예 21에 대해 하기의 사항을 측정 및/또는 평가하여 하기 표 7에 나타내었다.
1. 흑삼 추출분획물의 Rk1, Rh3 및 Rg5 수득 평가
상기 실시예 21 따라 제조한 흑삼 추출분획물에 대하여 고분해능 액체그래마토그래피/질량분석기(UPLC-QTOF/MS, 워터스)를 통해 정량분석하여 흑삼 추출분획물의 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 수득을 평가하였으며, 실시예 1을 기준으로 실시예 21의 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획의 상대적인 비율을 나타내었다.
구분 실시예1 실시예21
에틸
아세테이트		 부탄올 물
화합물 수득평가(%) 진세노사이드 Rk1 100 780 10 0
진세노사이드 Rh3 100 368 55 0
진세노사이드 Rg5 100 850 100 0
상기 표 7에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 흑삼 추출물의 분획물 종류인 에틸아세테이트 분획을 포함하는 실시예 21이, 실시예 1에 비하여 월등히 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5가 수득되었음을 알 수 있고, n-부탄올 분획 및 H2O분획에 비하여도 월등히 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5가 수득되었음을 알 수 있다.
이에 따라, 분획을 수행함으로써 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5의 수득량을 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있고, 부탄올 분획 및 물 분획에 비하여 에틸 아세테이트 분획이 월등이 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rh3 및 Rg5을 수득할 수 있음을 알 수 있다.
제조예 21
상기 실시예 21에 따라 제조한 흑삼 추출분획물에서 수득된 진세노사이드 Rk1을 농도 80μM로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
제조예 22 ~ 제조예 32
상기 제조예 21와 동일하게 실시하여 제조하되, 진세노사이드 Rk1의 농도, 진세노사이드 유도체의 종류 및 농도를 하기 표 8과 같이 변경하여 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
<실험예 4>
상기 제조예 21 ~ 32에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 8에 나타내었다.
1. 멜라닌 저해율 측정
상기 제조예 21 ~ 32에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM에서, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM에서, Rg5의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM에서 멜라닌 저해율 측정을 측정하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 각각 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM, Rg5의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM이 되도록 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
2. 세포독성 평가
상기 제조예 21 ~ 32에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 각각 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM일 때, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM일 때, Rg5의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM일 때, 세포독성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 농도별 멜라닌 저해율 측정방법과 동일하게 실시하여 수행하되, 하기 수학식에 따라 대조군(비처리군)과의 세포생존의 비율로써 측정하였으며, 세포생존 비율이 95% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 평가하였다.
[수학식]
세포 생존률(%) =[(화합물 처리 세포수 OD 값- blank 웰 OD 값)/(대조군 OD 값 - blank 웰 OD 값)] × 100(%)
구분 진세노사이드 유도체 종류 농도(μM) 멜라닌 저해율(%) 세포독성
제조예21 Rk1 80 38 ×
제조예22 Rk1 20 9 ×
제조예23 Rk1 40 23 ×
제조예24 Rk1 120 41 ○(83%)
제조예25 Rh3 40 8 ×
제조예26 Rh3 60 25 ×
제조예27 Rh3 80 34 ×
제조예28 Rh3 110 38 ○(86%)
제조예29 Rg5 20 9 ×
제조예30 Rg5 40 22 ×
제조예31 Rg5 80 21 ×
제조예32 Rg5 120 22 ○(84%)
상기 표 8에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 진세노사이드 유도체의 농도 범위를 만족하는 제조예 21, 23, 26, 27, 30 및 31은, 이를 만족하지 못하는 제조예 22, 24, 25, 28, 29, 32에 비하여 멜라닌 저해율이 우수한 동시에 세포독성이 없는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. (1) 인삼을 55℃ ~ 75℃에서 1차 열처리 및 85℃ ~ 105℃에서 2차 열처리하여 증삼시키되, 상기 증삼을 2 ~ 5회 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계; 및
    (2) 흑삼을 추출 및 농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는
    (1)-1 인삼을 55℃ ~ 75℃에서 5 ~ 15분 동안 1차 열처리하는 단계;
    (1)-2 1차 열처리한 인삼을　85℃ ~ 105℃에서 1.5 ~ 5.5시간 동안 2차 열처리하는 단계; 및
    (1)-3 상기 (1)-2 단계를 2 ~ 6회 반복수행하여 흑삼을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계 전에
    인삼을 세척 및 건조하는 단계;를 더 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는
    (2)-1 흑삼 및 유기용매를 포함하는 혼합액을 30℃ ~ 50℃에서 20 ~ 28시간 동안 2 ~ 5회 반복추출하는 단계; 및
    (2)-2 추출한 흑삼을 감압농축하여 흑삼 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유기용매는 농도 90% 이상의 메탄올인 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (2)-1 단계의 혼합액은 흑삼 및 유기용매를 60 : 40 ~ 80 : 20의 중량비로 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 흑삼 추출물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 흑삼 추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출물.
  9. 제7항에 따른 흑삼 추출물을 유효성분으로 포함하며,
    하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물:
    (a) 흑삼 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 10% 이상
    (b) 흑삼 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 13% 이상
    (c) 흑삼 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 22% 이상임.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 흑삼 추출물을 분획하여 흑삼 추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및
    상기 흑삼 추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 흑삼 추출분획물 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 흑삼 추출물의 분획물은 에틸아세테이트 분획물인 피부 미백용 흑삼 추출분획물 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 분리는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행하는 피부 미백용 흑삼 추출분획물 제조방법.
  13. 제10항에 따른 제조방법으로 분리된 피부 미백용 흑삼 추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 흑삼 추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rg5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되,
    상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rh3은 농도 50 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rg5는 농도 25 ~ 100μM로 포함되는 피부 미백용 화장료 조성물.
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