KR20190049690A - 항-노화 약학 제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제를 제공하는데, 이때 상기 약학 제제는 유기체로부터 수집한 액체를 제공하는 단계로, 이 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기(vessel) 또는 포함 수단(containment means)을 제공하는 단계, 및 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때 (a) 상기 제조 방법은 인큐베이션(incubation) 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며, (b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
Description
본 발명은 노화 분야, 특히 노화 및/또는 노화-관련 장애의 치료시 사용하기 위한 또는 항-노화제로서 사용하기 위한 약학 제제에 관한 것이다.
인간 집단의 노화 및 노화-관련 장애의 관리는 세계적인 도전이다. 많은 선진공업국들이 점점 노화되는 집단을 가지며, 또한 개발도상국에도 노인들 비가 가파르게 상승하는 것으로 예상되고 있다. 생물학적 수준에서, 노화는 유기체 및 그의 개별 세포, 조직 및 기관의 시간에 따른 점진적인 퇴화로서 정의될 수 있다. 이러한 퇴화는 특정 노화-관련 장애를 유도할 수 있다. 2050년 까지, 60세 및 그 이상 연령의 인간들 수가 전세계적으로 11% 근처인 그의 현 상태에 비해 대략 2배가 될 것이라고 예측되었다.
노화 및 관련된 노쇠의 몇몇 이론이 제안되고 있다. 한 이론은 손상의 점진적인 누적에 중점을 둔다. 고령의 장수 및 건강은 다른 요인들중 생체분자(특히 DNA)에 대해 유발되는 손상과 유지 및 복구 시스템 간의 밸런스에 의해 영향을 받는 것으로 나타난다. 따라서, 노화는 DNA 손상과 상관관계가 있는 것으로 제안되었고, 특정 노화-관련 장애는 아마도 과도한 DNA 손상 또는 장애가 있는 DNA 복구에 기인하는 것 같다. 따라서, 상응하는 노화의 동물 모델이 개발되었고, 널리 퍼진 모델은 뉴클레오티드 절단 복구 (Nucleotide Excision Repair)(NER)시 결함을 갖는 마우스를 포함하며, 야생형 마우스에 비하여 조기 노화 현상을 나타낸다. 상기 마우스의 변화 및 수반되는 질환은 마우스뿐만 아니라, 다른 유기체 (예: 인간)에서 정상적인 노화에 영향을 주리라 여겨진다. 세포 및 세포 성분에 대한 산화적 손상이 또한 노화 및 특정 장애와, 이에 따른 충분한 복구의 결여, 예컨대 항산화제 효소의 약화된 발현 또는 활성에 관련되어 왔다. 세포 노화는 또한 분자 시계로서 작용할 수 있는, 텔로미어의 단축과 연결되었고, 이에 따라 노화와 연결된 특정 장애를 유발할 수도 있다. 세포가 충분한 속도의 세포분열을 유지할 수 없는 경우, 조직의 재생이 결여되어 노화-관련 장애를 촉진할 것이다. 과도한 세포사 (예: 아폽토시스(apoptosis))도 또한 노화(ageing), 노쇠(senscence) 및 관련 장애에 기여할 수 있다. 다른 노화 이론은 과도한 (심지어 미세할지라도) 염증에 중점을 두는데, 이는 고령에 유해한 영향을 나타낸다. 면역계도 또한 노화에 적용받으며, 한 특징은 백신접종에 대한 감소된 민감성과 관련된 "면역노쇠(immunosenescence)"이다.
이전에는 노화가 불가피한 자연적 과정으로서 간주되어 왔지만, 이러한 관점은 최근 과학계로 이동되었다. 보다 최근의 생각에 따르면, 노화를 질환으로서 기술하는 것이 공정하다. 또한 종종 노화가 수많은 질환에 대해 가장 통상적인 위험 요인이라고 강조하고 있다. 결과적으로, 노화 또는 그중 하나의 치료 (예방 포함)는 치료적인 것이다. 이는 노화 자체가 오늘날 질환으로서 분류될 수 있기 때문뿐만 아니라, 이미 질환에 대한 위험 요소의 치료가 그 자체로 치료적 목적이기 때문이다.
니콜리(Niccoli) 및 파트리지(Partridge) (2012)는 노화가 암, 심혈관 질환 및 신경변성을 포함한, 쇠약하게 하고 생명을 위협하는 주요 상태에 대한 주 위험 요소이며 (Current Biology 22, R741), 반면에 문헌["[c]urrent therapies target individual diseases in isolation; therapies targeted to the ageing process itself aim to cover many diseases simultaneously". A 2010 article by Kelland (http://www.reuters.com/article/us-ageing-disease-idUSTRE64l6HV20100520)]은 노화가 모든 노화-관련 질환에 대해 통상적인 가장 큰 위험 요소이고, 특정 질환뿐만 아니라, "그들 모두에 대한 통상적인 메카니즘"을 연구하지 않는 것은 실수라는 전문가 의견을 인용하고 있음을 밝히고 있다.
켈란드 (2010)는 또한 노화 전문가는 노화시 새로운 모습을 위한 시간으로, 이는 그것을 조정하고, 치료하고 지연시킬 수 있는 상태로서 인지하는 것이라고 말한 것으로 보고하고 있다. 실제로, 예를 들어, Bulterijs 등 (2015)이 쓴 기사는 제목이 "It is time to classify biological aging as a disease" (Frontiers in Genetics, 6, 205)이다. 저자는 노화가 삶에서 이후에 유해한 영향을 갖는 대립유전자에 대한 선택력이 감소됨으로써 유발되고, 노화는 이에 따라 진화적으로 무시된 결과이며 고의가 아니고, 목적이 없다면, 자연스런 과정으로서의 노화의 개념은 아마도 실수일거라고 주장한다. 저자는 노화가 보편적이고 다계통적 과정인 질환으로이지만, 질환으로서 보여져야 한다고 결론짓고 있다. 인실로 메디신(Insilico Medicine)의 CEO인 닥터 Zhavoronkov는 노화가 질환으로 고려되어야 한다고 믿고, 질환으로서 노화를 기술함은 치료법을 개발하려는 인센티브를 생성하는 것이라 말한다. 이와 관련하여, 2014년에, "팔로 알토 장수 경진대회(Palo Alto Longevity Prize)"가 정립되었고, 이의 주창 목적은 "수명 코드를 핵킹하여 노화를 치료하는 것"임을 주목하는 것이 흥미롭다. 경진대회 위원회의 자문가들중 한 명인 김교수에 따르면, 노화는 단순히 해결책이 발견될 수 있는 의학적 문제이다. 노화가 치료가능하다는 생각의 한 주목할 만한 지지자는 노인학학자이고 저자인, SENS Research Foundation의 CSO인 닥터 de Grey이며, 그는 오늘날 과학자가 노화 자체가 아닌, 노화 질환에 너무 집중하고 있다는 견해를 가지고 있다. 사이언티스트지(The Scientist magazine)의 2016년 11월 1일자 사안에서 Musa의 기사는 노화가 더 이상 필연성으로 고려되지 않는 "단지 다른 질환"이고, 만성 상태 처럼 치료되어야 한다는 언급을 포함한다.
자외선 (UV)이 특히 일광에 존재한다. 그것은 가시광선 미만의 파장을 갖는다. 생물학적으로, UV 스펙트럼의 가장 긴-파장 부분인, UV-A 밴드 (315 내지 400 nm로서 ISO-21348로 정의됨) 및 이웃하는 UV-B 밴드 (280 내지 315 nm)가 가장 중요한 반면에, 가장 짧은 파장인 UV선 (UV-C)은 실제로 오존층 및 지구 대기권에 의해 흡수된다. UV선은 화학 반응을 촉발할 수 있다. 그것은 인체에 특정 유용한 작용을 갖는 반면에, 특히 피부 및 눈에 손상을 유발하므로 또한 위험하다. UV선 (모든 밴드)은 콜라겐 및 엘라스틴 섬유에 손상을 주는 것으로 알려져 있고, 이는 피부 노화 (광노화)를 일으키며, 이의 징후는 늘어진 피부, 건조함 및/또는 주름을 포함할 수 있다.
DNA에서, UV-B선은 직접 DNA 손상으로 또한 알려진 과정인, 피리미딘 이합체 (특히 티민 이합체)의 형성을 유발한다. 형성된 병변은 DNA 구조를 변화시키며, 뉴클레오티드 절단 복구로서 공지된 메카니즘에 의해 복구시킬 수 있다. 복구되지 않으면, 병변은 돌연변이성이다. UV선은 또한 반응성 산소종/유리 라디칼의 생성을 유발하며, 이는 간접 DNA 손상으로 알려진 과정인, 산화적 손상을 일으킨다. 직접 및 간접 DNA 손상은 모두 암의 형성에 기여한다. 따라서, 넓은-스펙트럼의 UV선은 세계보건기구 (World Health Organisation)가 발암물질로서 인식함을 이해할 수 있다.
면역계의 특징중 하나는 T 세포와 대식세포 사이에 상호작용이다. 이와 관련하여, 면역 과정의 두 개의 주요 유형은 통상 타입 1 및 타입 2로 구별된다. 타입 1 과정에서, 타입 1 T 헬퍼 세포 (Th1 세포) 및 타입 1 대식세포 (M1)가 관여되며, 이들 과정은 염증 과정의 세포 면역반응 및 병리생리학에서 주요한 역할을 한다. 타입 2 과정은 타입 2 T 헬퍼 세포 (Th2 세포) 및 타입 2 대식세포 (M2)를 포함하며, 체액 면역반응에서의 그들의 역할 이외에, 상처 치유 및 조직 복구와 같은 항-염증 및/또는 재생 과정에서 작용한다. 타입 1 과정과 연관된 통상적인 사이토킨은 IFN-γ 및 IL-2이다. 타입 1 면역반응은 세포 살해능(cellular killing ability)을 최대화한다. 타입 1 면역 과정의 (만성) 증가인 경우, 예를 들어, 자가항원 제1형 당뇨병에 관련되는 경우 유기체에 대한 손상이 일어날 수 있고, 보다 일반적으로는 과도한 및/또는 만성 염증으로 인하여 노화가 가속화될 수 있다. 타입 1 면역 과정의 증가는, 예를 들어, 타입 2 면역 과정에 비해 타입 1의 증가일 수 있다. 이러한 면역 과정의 불균형은 다른 면역 과정 (예: 타입 2)을 촉진시키거나, 타입 1 면역 과정을 억제함으로써 대응될 수도 있고, 염증의 해결을 용이하게 할 수 있다.
신경변성, 예를 들어, 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병 및 다발성 경화증에서, 대식세포 (예: 미세아교세포)의 역할이 기술되어 왔다.
타입 1 면역반응에서 타입 2 면역반응으로 균형의 이동은 신경계 또는 피부 질환에서 특히 관심있을 수도 있다.
세포 노쇠는 분리된 세포가 끊임없이 분열하는 불가능을 유도하고, 특정 수의 분열 후 그들이 정지하게 만드는 현상이다. 세포 노쇠화의 검출을 위해, 노쇠-관련 β-갈락토시다제 활성을 검출하는 세포 염색법이 통상 사용된다 (참조예: Dimri et al. (1995) PNAS 92, 9363 to 9367). 노쇠화 표현형을 나타내는 세포는 전체 유기체의 생활 기능을 방해할 수 있고, 이에 따라 특정 장애를 유도할 수 있다. 전 유기체의 노쇠화는 특정 장애 (예: 질환, 합병증 및 상태)의 위험 증가를 수반한다. 특정 장애의 발생률은 선형 형태보다 더 크게, 예를 들어, 기하급수적으로 노화에 따라 증가되는 것으로 밝혀졌다. 상기 언급된 바와 같이, 노화는 수많은 주요 질환에 대한 주 위험 요인이다.
노화와 관련된 통상의 특정 장애는 아테롬성경화증, 심혈관 질환, 암, 청각 장애, 시각 장애, 백내장, 망막변성 (예: 황반변성), 골다공증, 제2형 당뇨병, 고혈압, 간질환, 악액질, 후만증, 보행 장애, 진전, 운동실조, 근육긴장이상, 악력 감소, 근육 소모 및 모발 희어짐이다. 노화는 또한 신경변성 및 유사한 장애, 예를 들어, 경도 인지장애, 알쯔하이머병, 뇌혈관 질환, 파킨슨병 및 근위축성측삭경화증을 촉진한다.
수명 및/또는 건강수명, 즉 일반적으로 건강하고 심각한 질환으로부터 자유로운 삶의 기간을 연장시키려는 바램이 확산되고 있다. 몇몇 화합물 또는 조성물이 선행 기술분야에서 이를 위해 또는 상기-언급한 장애의 치료를 위해 제한되어온 반면에, 그들의 효능 및/또는 내약성은 항상 명확치 않다. 따라서, 대안적인 치료법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 과제는 노화 또는 상기 언급한 장애중 하나 이상을 치료, 예방, 억제 또는 경감시키거나, 노화 또는 상기 장애의 생물학적 원인중 하나 이상을 방해하기 위한 신규의 항-노화 수단 또는 수단들을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이러한 항-노화는 피부에 관련되며, 상기 노화는 피부 노화이거나, 상기 장애는 피부 장애, 예를 들어, 흡진 탄성 측정 (예: Cutometer®의 사용에 의해)에 의해 평가될 수 있는 장애이다. 유용하게는, 상기 수단은 제조하기에 신속하고 용이하며, 비용적으로 효과적이다. 또한 유용하게, 상기 수단은 양호한 신체 적합성을 가져야 한다.
상기 언급 및 본원에 예시된 양태의 임의 기술은 특정 양태 또는 특징의 임의 면제를 구성하지 못한다.
이 문제점은 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제에 의해 해결되며, 이때 약학 제제는 유기체로부터 수집한 액체를 제공하는 단계로, 이때 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기 또는 포함 수단(containment means)을 제공하는 단계, 및 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 제조 방법은 3개의 대안 (a), (b) 및 (c)를 가지며, 하기에서 "본 명세서의 조절된 제조 방법"으로서 언급된다.
본 발명은 또한 피부로 약학 제제의 주입에 의해 이러한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서 기술될 수 있는데, 이때 약학 제제는 유기체로부터 수집한 액체를 제공하는 단계로, 이때 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기 또는 포함 수단을 제공하는 단계, 및 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 또한 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제의 제조 방법으로서 기술될 수 있는데, 이때 상기 방법은 유기체로부터 수집한 액체를 제공하는 단계로, 이때 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기 또는 포함 수단을 제공하는 단계, 및 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1 내지 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 실험 결과를 나타낸 것이다.
하기의 언급은 본 발명이 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제로서, 환자의 치료 방법으로서, 또는 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제의 제조 방법으로서 기술되는지와 무관하게 적용된다.
하기에서, "본 명세서의 제조 방법"은 다음: 유기체 및 용기 (vessel 또는 container)로부터 수집한 혈액 샘플을 제공하고, 혈액 샘플과 상기 용기 (vessel 또는 container)를 접촉시키고, 상기 혈액 샘플을 상기 용기 (vessel 또는 container)에서 인큐베이팅시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 혈액 샘플은 (1) 전혈 샘플 또는 (2) 적혈구가 고갈된 전혈 샘플인 제조 방법을 지칭한다.
"노화(ageing)"는 바람직하게는 시간에 따라 유기체에서의 변화의 누적을 지칭하며, 물리적 및 생물학적 노화가 특히 바람직하다.
용어 "항-노화(anti-ageing)"는 바람직하게는 노화 효과 (특히 피부에 대한)를 지연, 방해, 경감, 정지 및/또는 역전시킴을 지칭한다. 이 용어는 또한 생물학적 노화 (특히 피부의)를 지연, 방해, 경감, 정지 및/또는 역전시킴을 지칭할 수 있다.
"주입(injection)"은 약학 제제가 피부 표면을 통해 횡단할 수 있도록 하나 이상의 날카로운 물건 (예: 니들)을 사용하는 임의의 투여를 포함한다. 바람직하게는, 피부 표면은 약학 제제가 투여되는 중공 니들에 의해 침투된다.
"혈액의 세포 구성성분(cellular constituent of blood)"은 다량 또는 소량으로 존재하던지 간에, 전혈의 임의의 세포 구성성분을 의미한다.
바람직하게는, "액체"는 혈액 샘플이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 액체는 (1) 전혈 샘플 또는 (2) 세포가 고갈된 전혈 샘플인 혈액 샘플이다. 이와 관련하여, 고갈된 세포는 바람직하게는 적혈구, 백혈구 (특히, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, B 세포, T 세포, NK 세포 및/또는 단핵구) 및 혈소판으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 고갈된 세포는 적혈구이다.
"포함 수단(Containment means)"은 하나 이상의 포함 수단을 지칭한다. 용기 또는 포함 수단은 상기 액체가 수집된 것/것들과 동일하거나, 수집된 것/것들과 상이할 수 있다. "용기 또는 포함 수단"의 바람직한 의미는 "용기(container)"이다.
용기 또는 포함 수단의 "내부 표면"은 용기 또는 포함 수단 자체의 내부 표면을 지칭한다. 특히, 용기 또는 포함 수단에 함유될 수도 있는 임의의 거시적 입자, 미시적 입자 또는 나노 입자의 표면은 고려되지 않는다.
"인큐베이션(Incubation)" 또는 "인큐베이팅(incubating)"은 바람직하게는 (1) 적어도 2분, 3분, 4분, 5분, 7분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간 또는 6시간의 지속기간에 의한 인큐베이션 및/또는 (2) 그 후 특정 파라미터(예: 사이토킨의 농도, 사이토킨 길항제, 특히 IL-1Ra의 농도, 엑소좀의 농도 및/또는 성장 인자의 농도)의 측정가능한 변화가 그 파라미터의 인큐베이션 전의 값 및/또는 정상값에 대해 일어나는 인큐베이션을 지칭한다.
본 발명의 양태가 특정 주제, 예를 들어, 방법 단계, 구성성분 또는 다른 특징을 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(comprising)" 것으로서 기술되는 경우에, 바람직한 양태는 내용이 달리 구술되는 경우를 제외하고, 상기 주제로 이루어지는 것으로 이해한다.
"치료(treatment)"는 또한 예방을 포함하는 것으로 이해한다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 따라서 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제를 제공하며, 이때 상기 약학 제제는 유기체로부터 수집한 혈액 샘플을 제공하는 단계로, 이 혈액 샘플은 (1) 전혈 샘플 또는 (2) 적혈구가 고갈된 전혈 샘플이며, 내부 표면을 갖는 용기(vessel 또는 container)를 제공하는 단계, 및 상기 혈액 샘플과 상기 용기(vessel 또는 container)를 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기(vessel 또는 container)에서 상기 혈액 샘플을 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 혈액 샘플은 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 혈액 샘플의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기(vessel 또는 container)와 접촉된 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
이 양태는 또한 피부로 약학 제제의 주입에 의해 이러한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서 기술될 수 있는데, 이때 약학 제제는 다음: 유기체로부터 수집한 혈액 샘플을 제공하는 단계로, 이 혈액 샘플은 (1) 전혈 샘플 또는 (2) 적혈구가 고갈된 전혈 샘플이며, 내부 표면을 갖는 용기(vessel 또는 container)를 제공하는 단계, 및 상기 혈액 샘플과 상기 용기(vessel 또는 container)를 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기(vessel 또는 container)에서 상기 혈액 샘플을 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 혈액 샘플은 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 혈액 샘플의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기(vessel 또는 container)와 접촉된 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
부가적으로, 이 양태는 또한 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제의 제조 방법으로서 기술될 수 있는데, 이때 상기 방법은 다음: 유기체로부터 수집한 혈액 샘플을 제공하는 단계로, 이 혈액 샘플은 (1) 전혈 샘플 또는 (2) 적혈구가 고갈된 전혈 샘플이며, 내부 표면을 갖는 용기(vessel 또는 container)를 제공하는 단계, 및 상기 혈액 샘플과 상기 용기(vessel 또는 container)를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기(vessel 또는 container)에서 상기 혈액 샘플을 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 혈액 샘플은 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 혈액 샘플의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기(vessel 또는 container)와 접촉된 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 (1) 노화 치료시 또는 (2) 항-노화제로서 상기 기술한 바와 같은 용도를 위한 약학 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 장애의 치료시 상기 기술한 바와 같은 용도를 위한 약학 제제를 또한 제공한다
(a) 산화적 손상, DNA 손상, 손상된 DNA 복구, 손상된 세포분열, 과도한 염증, 면역 과정의 병원성 분극(pathogenic polarisation) 또는 과도한 세포사에 의해 유발되는 장애, 또는
(b) 뉴클레오티드 절단 복구 경로의 단백질을 인코딩하는 유전자에 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 유전적으로 변화된 마우스의 장애로 모의된 장애 (상기 돌연변이는 상기 돌연변이가 결여된 마우스에 비하여 조기 노화 표현형을 유발한다), 또는
(c) 노화-관련 장애 또는 이의 발병률이 선형 형태보다 더 크게 노화에 따라 증가되는 장애, 또는
(d) 피부의 역학적 파라미터에 대해 영향을 미치는 장애 또는 콜라겐 손상 및/또는 엘라스틴 손상, 노쇠, 텔로미어 단축, 항산화제 효소의 손상된 발현 또는 항산화제 효소의 손상된 활성에 의해 야기되는 장애.
(이는 바람직하게는 노화의 치료시 또는 항-노화제로서의 용도이다).
본 발명은 경화성 위축성 태선(Lichen sclerosus et atrophicus (LSA)), Ehlers-Danklos 증후군, 광선탄력섬유증(Elastosis actinica), 피부결절 낭포성 유층증(Elastoidosis cutanea nodularis et cystica) 및 뱀모양 천공성탄력섬유증(Elastosis perforans serpiginosa)으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애의 치료시 상기 기술한 바와 같이 사용하기 위한 약학 제제를 추가로 제공한다. 이들 장애에서, 피부 및/또는 결합조직의 탄성이 손상된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "장애(Disorder)"는 정상적인 기능 또는 외관의 장애를 지칭하며, 질환, 합병증 및 상태를 포함한다.
피부로 주입에 의한 용도 또는 상기 치료시의 용도는 하기에서 종종 "본 발명에 따르는 용도"로 언급된다. 따라서, 피부로 주입시켜 사용하기 위한 또는 상기 치료시 사용하기 위한 약학 제제는 종종 "본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제"로서 언급된다.
상기 항목 (a)에 관하여, 바람직하게는 상기 산화적 손상은 반응성 산소종에 의한 손상이다. 상기 DNA 손상에 의해 유발되는 장애는 바람직하게는 UV-의존성 DNA 손상에 의해 유발되는 장애이다. 바람직하게는, UV-의존성 DNA 손상에 의해 유발되는 상기 장애는 피리미딘 이합체, 기저-세포 암종, 편평세포 암종 및 흑색종에 의해 유발되는 장애로부터 선택된다. 상기 손상된 DNA 복구에 의해 유발되는 장애는 결핍된 뉴클레오티드 절단 복구에 의해 유발되는 장애임이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 손상된 세포분열에 의해 유발되는 장애는 수핵세포의 손상된 분열과 관련된 (보다 바람직하게는 이에 의해 유발 및/또는 모의되는) 장애이다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 과도한 염증에 의해 유발되는 장애는 비-정형외과적 장애, 신경계를 포함하지 않는 장애 및/또는 눈을 포함하지 않는 장애이다. 상기 과도한 염증에 의해 유발되는 장애는 하기 장애중 1개, 1개 초과 또는 모두와 상이한 것이 바람직하다: 류마티즘, 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 건선 관절염, 베크테레프 관절염 (Bechterew arthritis), 골관절염, 등 증후군, 신경정형외과적 장애, 관절 장애, 추간판 장애, 척추 장애, 신경근 장애, 힘줄 장애, 연골 손실, 습진 및 탈모. 바람직하게는, 상기 면역 과정의 병원성 분극이 타입 1 면역 과정의 증가이다. 바람직하게는, 타입 1 면역 과정은 Th1 및/또는 M1 과정이고, 보다 바람직하게는 그들은 Th1 및 M1 과정이다. "타입 1 면역 과정의 증가"는 의미 "타입 2 면역 과정에 비하여 타입 1의 증가"를 포함하며, 이때 상기 타입 2 면역 과정은 바람직하게는 Th2 및/또는 M2 과정이고, 보다 바람직하게는 그들은 Th2 및 M2 과정이다. "타입 1 면역 과정의 증가"는 또한 의미 "과도한 타입 1 면역 과정" 및 "손상된 다른 면역 과정", 예를 들어 "손상된 타입 2 면역 과정" (상기 제시된 바와 같은 바람직한 양태로)을 포함한다. 상기 세포사는 바람직하게는 아폽토시스이다.
상기 항목 (b)에 관하여, 상기 유전적으로 변화된 마우스의 돌연변이는 바람직하게는 Ercc1 유전자에 존재한다. 보다 바람직하게는, 그것은 Ercc1-/- 또는 Ercc1-/△이다.
상기 항목 (c)에 관하여, 바람직하게는 상기 발병률은 노화에 따라 기하급수적으로 증가한다.
상기 항목 (d)에 관하여, 바람직하게는 상기 콜라겐 손상 및/또는 엘라스틴 손상에 의해 유발되는 장애는 늘어진 피부, 건조 및 주름으로부터 선택된다. 콜라겐 손상 및/또는 엘라스틴 손상에 의해 유발되는 장애는 또한 피부 노화로서 일반적으로 기술될 수 있다.
오늘날 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 제제는 놀랍게도 피부로 주입되는 경우, Cutometer®를 사용하여 흡진 탄성 측정으로 평가될 수 있는 피부 파라미터, 특히 탄성을 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
Cutometer® (예: the Cutometer® Dual MPA580)로 측정된 파라미터는 다음과 같다:
R-파라미터
RO: 힘(견고함)에 대한 피부의 수동적 거동을 나타내고, 최대 진폭을 본다.
R1 : 그의 본래 상태로 돌아가는 피부의 능력.
R2: 총 탄성(Gross elasticity), 그 값이 높을수록, 커브는 더욱 탄성이다.
R3: 반복되는 흡진후 마지막 흡진 커브의 최대 진폭. 피부의 "피곤한 효과(Tiring effects)" (피로)는 진폭이 각각의 새로운 흡진에 따라 증가되는 것으로 관찰된다.
R4: 첫 번째 커브와 비교된 마지막 최소 진폭, 피부의 "피곤한 효과"는 재변형 능력이 각각의 새로운 흡진에 따라 감소되는 것으로 관찰된다.
R5: 순 탄성(Net elasticity), 그 값이 높을수록, 피부는 더욱 탄성이다.
R6: 커브의 탄성 부분에 대한 점-탄성 부분. 그 값이 작을수록, 엘라스틴 섬유의 팽창성은 더 높다.
R7: 완전한 커브와 비교되는 탄성 부분, 그 값이 높을수록, 피부는 더욱 탄성이다.
R8: 피부 회복, 그 값이 R0에 근접할수록, 피부가 그의 본래 상태로 돌아가는 능력은 더욱 우수하다.
R9: 피부의 반복된 흡진 및 방출 후 피부의 피곤 효과를 나타낸다. R9가 작을수록, 피곤 효과는 더 작다.
F-파라미터
F0, F1 : 이들 면적을 총 면적에서 뺀다. 완전 탄성 물질은 면적이 전혀 보이지 않을 것이고, 그 값이 0에 근접할수록, 물질은 더욱 탄성이다.
F2: 반복되는 흡진후 피곤 효과를 나타내는 상부 포락선(envelope-curve) 위의 면적.
F3: 포락선 내의 면적, 피부 피로를 나타낸다.
F4: 상부 포락선 아래의 면적, F4가 작을수록, 피부는 흡진에 더 잘 저항한다 (피부 견고성).
Q-파라미터
Q0: 최대 회복 면적, 피부 견고성이 증가함에 따라 감소될 것이다.
Q1 : 탄성 회복, 피부의 더 큰 탄성에 따라 증가할 것이다.
Q2: 점성 회복
Q3: 점탄성 회복 (전체 탄성), 피부의 더 큰 탄성에 따라 증가할 것이다.
여기서, RO는 가장 중요한 파라미터로 고려된다 (그 값이 낮을수록, 탄성은 더 높다). R5는 두 번째로 가장 중요한 파라미터로 고려된다.
더욱이, 놀랍게도 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 제제는 피부 파라미터의 개선 외에, (생물학적) 노화 과정의 다양한 측면에 관련되는 수많은 다른 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 효과는 모두 시간에 따라 유기체에 누적되는 변화를 지연, 방해, 감소, 정지 및/또는 역전시키기 위해 관련되므로, 상기 제제는 노화 자체에 영향을 주고, 따라서 노화의 치료시 또는 항-노화제로서 유효하다고 결론지을 수 있다. 보다 특히, 상기 제제는 세포에 대한 UV선의 유해한 효과를 없애고, 젊은 환자보다 노인 환자에서 더 강한 항-염증성 효과를 가지며, 젊은 환자보다 노인 환자에서 항-염증 대 염증 성분의 보다 더 유용한 비를 함유하고, 염증성에서 재생 및 항-염증성으로 면역계 기능의 이동을 유도하며, 항-아폽토시스 경로를 자극하고, 세포분열을 증가시키며, 이는 본 발명의 근거로서 작용한다. 본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 제제는 이에 따라 약학 제제이고, 그것은 노화를 치료, 예방, 억제 또는 경감시키거나, 그의 생물학적 원인을 방해하는 신규 수단으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 유기체로부터 수집한 액체를 제공하고, 이 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기 또는 포함 수단(containment means)을 제공하고, 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때 (a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며, (b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키고, 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 (c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 제조 방법은: 유기체로부터 수집한 혈액 샘플을 제공하고, 내부 표면을 갖는 용기(vessel 또는 container)를 제공하며, 상기 혈액 샘플과 상기 용기(vessel 또는 container)를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 (a) 상기 제조 방법은 인큐베이션 시간 동안 상기 용기(vessel 또는 container)에서 상기혈액 샘플을 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며, (b) 상기 혈액 샘플은 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 (c) 상기 제조 방법은 상기 혈액 샘플의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기(vessel 또는 container)와 접촉된 상기 혈액 샘플의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 이들 방법 단계들을 수행한 후, 약학 제제가 존재하고, 그의 효능은 이들 방법 단계의 수행으로부터 생성된다. 그의 대안 (a)에 따라, 상기 방법은 조절된 혈액 샘플을 생성한다. 효능은 상기 인큐베이션 시간과 상기 내부 표면 사이에 관계가 하기 식에 따를 때 특히 유용하다: t = f*A, 여기서 t는 인큐베이션 시간을 나타내고, A는 내부 표면을 나타내며, f는 0.5 h/cm2보다 작거나 이와 같다. 그러나, 효능은 하기에 추가로 설명되는 바와 같이, 인큐베이션에 따라 좌우되지 않는다. 따라서, 대안 (b)에 따라, 인큐베이션은 수행하거나 피할 수 있고, 대안 (c)에 따라, 인큐베이션은 피한다.
예를 들어, 인큐베이션 단계 동안, 특히 그 안의 세포 활성으로 인하여, 효능있는 성분이 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)에 유도된다. 따라서, 바람직하게는 상기 액체는 혈액 샘플이고, 이는 전혈 샘플이다. 그러나, 혈액 샘플은 또한 전혈의 분획일 수 있다. 예를 들어, 핵이 결여되고 이에 따라 유전자 발현 능력이 결여된 세포인, 적혈구가 혈액 샘플에 존재하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 혈액 샘플은 대안적으로 적혈구가 고갈된 (바람직하게는 완전히 또는 실질적으로 완전히, 그러나 대안적으로 적혈구의 단지 일부만이 고갈된 것이 예상된다) 전혈 샘플, 예를 들어, 버피 코트(buffy coat) 또는 PRP (혈소판-풍부 혈장)이다. 임의의 자극체 또는 활성체를 첨가할 필요가 없고, 첨가하지 않는 것이 바람직하다. 제공 단계 전에, 본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법은 상기 유기체로부터 상기 액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)를 조절된집하는 단계를 부가로 포함한다.
상기 유기체는 상기-언급한 장애중 어느 하나로 고생하거나 고생하지 않을 수 있고, 그 유기체의 세포는 상기-언급한 표현형을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.
본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제는 세포에 대한 UV선의 유해한 효과를 없애는 것으로 밝혀졌다. UV-A 및 UV-B 선의 조합으로 조사된 세포의 세포 계수(cell count)는 그의 부재시 보다 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제의 존재시 더 높은 것으로 밝혀졌다. 그 효과의 크기는 인큐베이팅 단계에 따라 좌우되었다. 따라서, 액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)의 인큐베이션은 UV-조사된 세포의 생존 및/또는 증식을 향상시키는데 유효한 성분의 형성을 유도하고, 이는 노화의 한 측면에 관련된다.
이와 관련하여, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제의 효과, 즉 UV에 의해 유발된 DNA 손상 복구는 기능적 뉴클레오티드 절단 복구 시스템의 것과 동일하다. 따라서, 이론으로 제한하지 않고, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 뉴클레오티드 절단 복구를 촉진한다고 결론지을 수 있다. 보다 일반적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 손상된 DNA 복구 또는 DNA 손상의 축적에 의해 유발되는 장애에 대해 효과를 갖는 것으로 결론지을 수 있고, 이는 노화의 다른 측면에 관련된다.
따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 불충분한 뉴클레오티드 절단 복구에 의해 유발되는 장애의 치료시 유용하다고 가정할 수 있다. 뉴클레오티드 절단 복구가 결핍된 몇몇 모델, 예를 들어, Ercc1-/- 마우스가 존재한다. 이 모델은 조기 노화 표현형을 보이고, 마우스 및 다른 유기체 (예: 인간) 모두에서 정상적인 노화에 영향을 주는 것으로 여겨진다. 코트 상태, 후만증, 보행, 진전, 운동실조, 근육긴장이상 및 악력에서 노화 관련 병리학을 나타낸다.
후만증은 골다공증에 대한 추가 합병증을 갖는다. 운동실조, 근육긴장이상 및 진전은 신경변성 장애로, 알쯔하이머병, 경도 인지장애, 뇌혈관 질환, 파킨슨병 및 근위축성측삭경화증과 같은 신경변성 및 관련 장애에 영향을 준다. 보행 및 악력은 근소모에 영향을 준다. 더욱이, 신경변성 및 관련 장애는 대개 신경염증에 연결된다. 노화의 또 다른 측면에 관한 효과인, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제의 항-염증 작용은 신경염증, 신경변성 및 관련 장애의 치료시 또한 유용한 것으로 결론지을 수 있다.
더욱이, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제는 특히 이의 생성물이 아폽토시스를 억제할 수 있는 수많은 유전자 발현의 유도를 통해, 항-아폽토시스 효과를 갖는 것으로 알려진, NF-κB 경로를 자극한다 (참조예: Karin & Lin (2002) Nat Immunol 3, 221). 따라서, 결론은 그것이 노화의 부가적 측면에 관한, 과도한 세포사에 의해 유발되는 장애의 치료시 사용될 수 있음을 유추할 수 있다.
본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제는 또한 세포분열을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 그것은 손상된 세포분열에 의해 유발되는 장애에 대해 효과를 갖는 것으로 결론지을 수 있다. 노쇠 및 노화는 손상된 세포분열에 의해 유발될 수 있으므로, 이러한 발견은 노화 또는 노화-관련 장애시 또는 항-노화제로서의 약학 제제의 일반적인 효과를 설명하는데 기여할 수 있다. 예를 들어, 전반적으로 추간판의 노화-관련 변성시, 추간판 세포의 변성이 관련된다. 추간판 (수핵)의 증가된 세포분열은 추간판을 회복시킬 수 있고, 충분한 세포분열 및 재생의 결여가 작용할 수 있는 추가판 장애, 예를 들어, 미끄러진 디스크의 예방을 도울 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는, 예를 들어, 간단하고, 비용 효과적 및/또는 신속한 제조를 할 수 있다. 특별하거나 복잡한 장비 및 물질에 대한 필요성없이, 최소 단계 및 수 시간내에 제조시 일련의 용이한 단계를 수행함으로써, 즉시 사용가능한 약학 제제가 제조 동안 몸에 임의의 외래 물질 또는 제조시 이후에 다시 분리해야할 다른 물질을 첨가하지 않고도 실현된다. 오로지 몸 자체 물질을 사용함으로써, 이 방법으로, 특히 신체-적합성 제제가 제조된다.
본 명세서의 조절된 제조 방법의 대안 (a)와 관련하여, 상기 인큐베이션 시간 및 상기 내부 표면 사이에 관계가 하기 식에 따르는 것이 바람직하다: t = f*A, 여기서 t는 인큐베이션 시간을 나타내고, A는 내부 표면을 나타내며, f는 0.5 h/cm2보다 작거나 이와 같다. 바람직하게는, f가 0.45 h/cm2보다 작거나 같음, 0.4 h/cm2보다 작거나 같음, 0.35 h/cm2보다 작거나 같음, 0.3 h/cm2보다 작거나 같음, 0.25 h/cm2보다 작거나 같음, 0.24 h/cm2보다 작거나 같음, 0.23 h/cm2보다 작거나 같음, 및 특히 0.22 h/cm2보다 작거나 같음이다. 이는 약학 제제가 바람직하지 못한 염증성 잠재력을 갖지 않음을 보장하는데 유용하다. 0.04 내지 0.25 h/cm2, 0.05 내지 0.24 h/cm2, 0.06 내지 0.23 h/cm2 및 특히 0.07 내지 0.22 h/cm2의 범위인 f 값이 특히 바람직한 반면에, 일부 경우는 0.1 내지 0.22 h/cm2, 0.12 내지 0.22 h/cm2 또는 0.14 내지 0.22 h/cm2의 범위가 또한 사용될 수 있다.
전혈 및 조절된 전혈은 엑소좀을 함유하는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세로포부터 그들의 환경으로 분비된 작은 소포이다. 엑소좀은 예를 들어 생물학적 액체, 예컨대 혈청, 뇨, 침, 복막-, 뇌척수- 및 활막액에 함유된다. 보여지는 대부분의 유형의 세포는 엑소좀을 분비할 수 있다. 분비는 세포의 혈장막을 통한/이로부터의 방출을 통해 일어난다. 그들이 생성되는 세포 유형에 따라, 엑소좀은 특히 가변적 조합의 단백질을 함유한다. 하기에서, 용어 "엑소좀(exosome)"은 바람직하게는 다른 세포외 소포 (EV)를 부가적으로 포함한다.
상기 기술한 바와 같이, 조절(Conditioning)은 엑소좀 및 다른 적용 물질의 부가적 형성을 유도한다. 그러나, 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)를 항상 조절할 필요는 없다. 엑소좀은 놀랍게도 수많은 관련 효과 (예: 배양시 세포 증식, 전신 CRP 수준의 강하)를 억제하는 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌기 때문에, 엑소좀은 조절 후 농축 또는 분리시킬 수 있지만, 대안적으로 혈액에 존재하는 엑소좀은 유용한 효과를 성취하기 위하여 조절없이 농축 또는 분리시킬 수 있다.
따라서, 본 명세서의 조절된 제조 방법의 대안 (b)와 관련하여, 제조 방법은 상기 엑소좀의 농축 또는 분리 단계 전에, 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)를 인큐베이팅시키는 단계, 또는 상기 액체(혈액 샘플)의 인큐베이션을 피하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 농축 또는 분리는 효능을 더 증가시키는데 유용하다.
또한 인큐베이션을 안한 경우, 본 명세의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제는 놀랍게도 수많은 관련 효과 (예: UV 조사후 세포 생존을 향상시킴)를 억제하는 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌기 때문에, 인큐베이션은 특정 양태에서, 본 명세의 조절된 제조 방법의 대안 (c)에 따라 피할 수 있다. 이 대안에서, 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)의 세포 구성성분을 제거하는 단계는 항상 수행한다. 이러한 세포 구성성분의 제거 단계는 종종 본 명세의 조절된 제조 방법의 모든 대안에서 유용하다.
본 명세의 조절된 제조 방법의 모든 대안과 관련하여, 세포 구성성분의 제거 단계는 바람직하게는 적혈구 (특히 혈액의 세포 구성성분을 포함하는 상기 액체가 전혈인 경우), 혈소판 (특히 혈액의 세포 구성성분을 포함하는 상기 액체가 전혈 또는 적혈구가 고갈된 전혈인 경우) 또는 세포 구성성분 전체 (특히 혈액의 세포 구성성분을 포함하는 상기 액체가 전혈 또는 적혈구가 고갈된 전혈인 경우, 세포 구성성분의 제거 단계는 혈액의 세포 구성성분을 포함하는 상기 액체가 전혈인 경우 세포 구성성분 전체의 제거 단계가 가장 바람직하다)의 제거 단계이다. 이러한 분리는 원심분리, 예컨대 비교적 낮은 원심력으로 짧은 원심분리 (예: 1000g에서 약 10분)에 의해 또는 여과에 의해 성취할 수 있다.
본 명세서의 조절된 제조 방법의 대안 (a) 및 (b)에서, 상기 액체의 세포 구성성분의 제거 단계는 선택적이며, 대안적으로, 상기 액체의 세포 구성성분의 제거를 막는 (또는 특정 원하는 기능을 갖는 세포 구성성분의 제거를 막는) 단계를 포함하는 것이 또한 예상된다. 특히, 적혈구, 혈소판 또는 세포 구성성분 전체의 제거를 막는 것이 예상된다.
바람직하게는, 본 명세서의 조절된 제조 방법은 상기 액체의 용적을 감소시키는 단계를 추가로 포함하고/하거나, 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제는 무수 형태 (특히 분말 형태)로 존재한다.
내부 표면에 대한 바람직한 범위는 10 내지 300 cm2, 15 내지 200 cm2, 20 내지 150 cm2, 25 내지 140 cm2, 30 내지 130 cm2, 35 내지 120 cm2 및 특히 40 내지 110 cm2이다.
상기 혈액 샘플은 본 명세서의 조절된 제조 방법의 양태 (1)에 따라, 전혈 샘플인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 주입은 3 mm 미만, 2.5 mm 또는 그 미만, 2 mm 또는 그 미만, 1.5 mm 또는 그 미만 또는 1 mm 또는 그 미만의 깊이로 수행한다. 바람직한 깊이 범위는 0.1 mm 내지 3 mm 미만, 0.5 mm 내지 3 mm 미만, 1 mm 내지 3 mm 미만, 1 내지 2.5 mm, 1 내지 2 mm 또는 1 내지 1.5 mm이다.
피부로 주입은 진피 (즉, 진피내 주사) 또는 피하조직 (즉, 피하 주사)으로의 주입이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 용도/치료법은 하나 이상의 후속 주입을 포함하며, 이때 연속 주입 사이에 시간 간격은 1일 내지 52주, 2일 내지 42주, 3일 내지 30주, 4일 내지 24주, 5일 내지 18주, 6일 내지 12주, 1 내지 8주, 특히 1 내지 6주, 1 내지 4주, 1 내지 3주, 1 내지 2주, 2 내지 3주 또는 2이다. 특히, 가장 바람직하게는 제1 및 제2 주입 사이 및 제2 및 제3 주입 사이에, 또는 바람직하게는 임의의 2회 연속 주입 사이에 2주의 시간 간격으로 총 적어도 3회 주입이 바람직하다.
최대 효과를 성취하기 위하여, 본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조될 수 있는 약학 제제를 사용하기 전에 저장을 피하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제의 내용에서 상기 언급된 유기체는 인간이다. 바람직하게는, 상기 인간은 적어도 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, 60 또는 65세, 또는 30 내지 65, 35 내지 60 또는 40 내지 55세이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 약학 제제에서, (a) IL-6의 수준은 2000 pg/ml 또는 그 미만 (바람직하게는 1500 pg/ml 또는 그 미만, 1000 pg/ml 또는 그 미만, 800 pg/ml 또는 그 미만, 700 pg/ml 또는 그 미만, 600 pg/ml 또는 그 미만 및 특히 500 pg/ml 또는 그 미만)이고, (b) IL-1 Ra 및 IL-6 수준의 비는 (각각 pg/ml로 측정됨) 3 또는 그 이상, 5 또는 그 이상, 7 또는 그 이상, 10 또는 그 이상, 15 또는 그 이상, 20 또는 그 이상, 25 또는 그 이상, 30 또는 그 이상, 40 또는 그 이상 및 특히 50 또는 그 이상이고, (c) IL-1 Ra의 수준은 200 pg/ml 또는 그 이상, 300 pg/ml 또는 그 이상, 400 pg/ml 또는 그 이상, 500 pg/ml 또는 그 이상, 600 pg/ml 또는 그 이상, 800 pg/ml 또는 그 이상, 1000 pg/ml 또는 그 이상, 1200 pg/ml 또는 그 이상, 1400 pg/ml 또는 그 이상, 1600 pg/ml 또는 그 이상, 1800 pg/ml 또는 그 이상 및 특히 2000 pg/ml 또는 그 이상이고, (d) IL-1 Ra 및 IL-1 수준의 비 (각각 pg/ml로 측정됨)는 10 또는 그 이상, 20 또는 그 이상, 30 또는 그 이상, 40 또는 그 이상, 50 또는 그 이상, 60 또는 그 이상, 70 또는 그 이상, 80 또는 그 이상, 90 또는 그 이상, 100 또는 그 이상, 150 또는 그 이상, 200 또는 그 이상, 300 또는 그 이상, 500 또는 그 이상, 700 또는 그 이상 및 특히 1000 또는 그 이상이고, 또는 (e) 약학 제제는 첨가된 히알루론산이 존재하지 않는다. IL-6은 피부, 및 또한 간에 대해 중요한 인자이다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 엑소좀을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제에 함유된 엑소좀은 있다면, 용기 또는 포함 수단의 유기체로부터 수집된 액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)의 상기-언급한 인큐베이션 동안 생성되었다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 엑소좀-함유 약학 제제에서 엑소좀의 평균 직경은 투과전자현미경에 의해 정립된 바와 같이, 바람직하게는 30 내지 200 nm, 특히 50 내지 190 nm, 70 내지 180 nm, 90 내지 160 nm 또는 100 내지 150 nm이다. 이 크기의 엑소좀은 특히 높은 효능을 위한 기준이 되고, 큰 소포 크기는 손상된 엑소좀 및 응집체를 함유하는 집단의 척도일 수 있다. 그러나, 더 큰 엑소좀은 또한 특히 타입 1 면역반응으로부터 타입 2 면역반응으로의 균형 이동에 있어서 작용성일 수 있다. 이는 직경 범위가 200 내지 5000 nm 또는 100 내지 800 nm인 엑소좀에 적용된다. 이들 더 큰 엑소좀은 분별 원심분리(differential centrifugation)에 의해 수득할 수 있다.
본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법은 바람직하게는 있다면 그의 효능을 더 증가시키기 위해 인큐베이션 후 엑소좀을 농축 또는 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.
상기 농축 또는 분리 단계는 본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 두 개 이상의 약학 제제를 유도할 수 있다. 이들 둘 이상의 약학 제제는 상기 농축 또는 분리 단계를 수행한 후 수득된 분획에 상응한다.
엑소좀의 농축 또는 분리는 예를 들어, 이러한 가속화가 그들의 크기에 따라 엑소좀을 원심분리 또는 분리하는데 특히 적합하기 때문에, 2,000 내지 1,000,000 g, 10,000 내지 800,000 g, 20,000 내지 600,000 g, 50,000 내지 400,000 g, 80,000 내지 200,000 g 및 특히 100,000 g에서 원심분리를 통해 실현할 수 있다. 상기 원심분리는 바람직하게는 적어도 10분, 적어도 30분, 특히 적어도 60분 동안 수행한다. 그 다음에, 원심분리에 의해 형성된 펠릿은 엑소좀을 함유한다. 바람직하게는, 농축되거나 분리된 엑소좀은 이어서 유체 (바람직하게는 완충액, 예컨대 PBS, 또는 대안적으로 예를 들어, 혈장 또는 혈청)에 용해시킨다. 그 다음에, 선택적으로, 그들은 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다.
본 발명은 또한 엑소좀을 함유하지 않는 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제를 구상한다. 그러나 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 약학 제제는 엑소좀을 포함하고, 특히 그것은 엑소좀으로 이루어질 수 있다.
혈청 또는 혈장이 본 발명에 따라 사용하기 위한 함유 약학 제제에 함유된 경우에 (이는 특정 경우에 바람직함), 상기 혈청 또는 혈장은 바람직하게는 사이토킨 및/또는 성장 인자를 함유한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 코르티코스테로이드를 포함하지 않는데, 이는 특히 그의 노쇠-감소 효과 및/또는 항-아폽토시스 효과의 억제로 인해 약학 제제의 효능에 손상을 줄 수 있기 때문이다.
액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)의 인큐베이션은 바람직하게는 5분 내지 22시간, 10분 내지 20시간, 15분 내지 18시간, 30분 내지 16시간, 45분 내지 15시간, 1 내지 14시간, 2 내지 13시간, 3 내지 12시간, 4 내지 11시간, 5 내지 10시간 또는 6 내지 9시간의 인큐베이션 시간 동안 수행한다.
인큐베이션은 바람직하게는 0°C 내지 45°C의 온도, 특히 10°C 내지 43°C, 20°C 내지 41°C, 30°C 내지 40°C, 35°C 내지 39°C, 36°C 내지 38°C 또는 37°C의 온도에서 수행한다. 이들 온도는 최상을 효능을 보장한다.
바람직하게는, 인큐베이션은 헤파린의 첨가없이 수행한다. 보다 바람직하게는, 임의의 항응고제의 첨가없이 수행한다.
본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법을 수행하는데 적합한 용기 또는 포함 수단 (바람직하게는 containers)은 예를 들어 피하주사 바늘, 시린지, 튜브 (예: 진공 튜브 또는 시험관), 미세역가판, 시린지 및 수액백(transfusion bag)이다. 용기 또는 포함 수단은 예를 들어, 0.4 내지 5 cm, 0.9 내지 4 cm 또는 1.4 내지 3.5 cm의 직경, 및/또는 3 내지 30 cm, 5 내지 20 cm, 7 내지 15 cm 또는 8 내지 12 cm의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 용기 또는 포함 수단은 원통형이다.
바람직한 용기 또는 포함 수단은 용적이 1 ml 내지 1000 ml, 3 ml 내지 750 ml, 5 ml 내지 500 ml, 7 ml 내지 300 ml, 8 ml 내지 200 ml, 9 ml 내지 150 ml, 10 ml 내지 100 ml, 11 ml 내지 80 ml 및 특히, 12 ml 내지 70 ml이지만, 또한 15 ml 내지 65 ml, 20 ml 내지 60 ml, 25 ml 내지 50 ml 또는 30 내지 40 ml의 용적을 가질 수 있다. 바람직하게는, 내부 표면 및 용적의 비는 0.01 내지 10 cm2/ml이다. 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)의 바람직한 용적은 0.5 ml 내지 900 ml, 1 ml 내지 700 ml, 2 ml 내지 400 ml, 3 ml 내지 300 ml, 6 ml 내지 200 ml, 7 ml 내지 150 ml, 8 ml 내지 100 ml, 9 ml 내지 80 ml 및 특히, 10 ml 내지 60 ml이지만, 또한 11 ml 내지 55 ml, 12 ml 내지 50 ml, 15 ml 내지 40 ml 또는 20 내지 30 ml의 용적을 가질 수 있다.
용기 또는 포함 수단은 바람직하게는 유리, 플라스틱, 강옥 또는 석영이나 이들의 조합을 포함하는 액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)를 접촉시키기 위한 표면을 포함한다. 바람직한 플라스틱은 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 용기 또는 포함 수단의 액체를 접촉시키기 위한 표면은 완전 밀폐된 공간을 생성한다. 바람직한 용기 또는 포함 수단은 하기 특징중 하나 이상을 갖는다: 평면에 대해 대칭, 축에 대해 대칭 및 원통형.
바람직한 양태에 따라, 용기 또는 포함 수단은 거시적 입자, 미시적 입자 또는 나노 입자를 함유하고, 인큐베이션 동안, 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)는 상기 입자와 접하게 된다. 본 출원을 위해, 거시적 입자는 육안으로 보는 경우 보이는 입자로서 정의되고, 미세 입자는 육안으로 보는 경우 너무 작아 보이지 않지만 현미경으로 보는 경우는 보이는 입자로서 정의되며, 나노 입자는 현미경으로 보는 경우 너무 작아 보이지 않는 (및 바람직하게는 1 nm보다 큰) 입자로서 정의된다. 상기 입자들은 액체 (혈액 샘플)를 접촉시키기 위해 표면을 확장시킬 목적으로 작용하며 (예: 또 다른 0.3 내지 90 cm2, 2 내지 80 cm2, 5 내지 70 cm2, 0 내지 60 cm2, 20 내지 50 cm2 또는 30 내지 40 cm2까지), 구, 과립, 분말, 겔 또는 울의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 재료는 유리, 플라스틱, 강옥, 석영, 금 및 점토 무기물 (예: 카올린)이다. 유리 구가 특히 바람직하다. 입자 표면은 선택적으로, 예를 들어, 가성 제제 (예: 50% v/v 크로모황산)와 함께 인큐베이션에 이어 후속되는 반복 세정으로 개질시킬 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 상기 입자 표면은 용기 또는 포함 수단의 "내부 표면'을 계산하는 경우 고려되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 상기 액체 (바람직하게는 혈액 샘플, 보다 바람직하게는 전혈 샘플)가 수집된 동일한 유기체로 주입에 의해 사용하기 위함이다. 이 경우에, 상기-언급한 장애중 하나 이상으로 고생하는 유기체가 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 특히 안전성을 이유로, 바람직하게는 자가 약학 제제이고 동종 제제는 아니다. 상기-언급한 환자 치료방법으로서 본 발명을 기술하는 경우에, 이는 유기체 및 환자가 동일함을 의미한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제는 하나 이상의 다른 유효 제제와 병용 요법으로 사용되는 것이다. 바람직한 다른 유효 제제는 노화 치료시 또는 항-노화제로서 효과적인 제제 (특히 상기 언급한 장애중 하나 이상의 치료시), 히알루론산 또는 보툴리늄 독소, 또는 이들의 조합이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 제제, 히알루론산 및 보툴리늄 독소의 조합이 특히 바람직하다.
실시예
실시예 1: 수핵 기원의 세포 증식
수핵 세포의 증식은 다양한 보충제의 존재하에 시험하였다: 엑소좀의 존재 및 부재하에 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제인, 인간 조절된 혈청(Human conditioned serum)("ACS"); 엑소좀의 존재 및 부재하에 태소 혈청 ("FBS"); 및 ACS 및 FBS로부터 분리된 엑소좀 (참조 도 1).
수핵 기원 세포는 DMEM/F12 배지 및 PenStrep 1%와 함께 96 웰 플레이트 (8000 세포/웰)에 플레이팅시켰다. 세포 배양 배지는 엑소좀을 함유하는 완전 ACS ("ACS+Ex"), 엑소좀이 없는 ACS ("ACS-Ex"), ACS로부터의 엑소좀 ("ExA"), 엑소좀을 함유하는 완전 FBS ("FBS+Ex"), 엑소좀이 없는 FBS ("FBS-Ex") 및 FBS로부터의 엑소좀 ("ExF")으로 보충시켰다. 세포분열은 ELISA 리더에서 XTT 검정법으로 24시간 후 측광적으로 평가하였다. 엑소좀은 100,000 g에서 각각 30 ml ACS 및 30 ml FBS의 2시간 원심분리 및 3 ml PBS에 각각 펠릿의 재현탁에 의해 ACS 및 FBS로부터 분리하였다.
ACS 및 FBS는 모두 세포분열을 촉진시킨 것으로 확인되었다. 세포는 낮은 ACS 농도 (1% 내지 2%)에서 최상으로 분열되었다. 더 높은 ACS 농도에서 (5%, 10%), 엑소좀의 존재 및 부재하에 모두, 세포 수의 겉보기 감소를 관찰하였지만, 이는 세포 배양 배지를 세척한 다음 XTT 염색 배지로 대체했을 때 세포 또는 세포 집단의 분리를 반영할 수 있다. 단지 부착된 세포만이 XTT 검정시 관찰되는 신호에 기여할 수 있기 때문에 이는 틀린 기록을 생성할 수 있다. 최상의 증식은 엑소좀이 있는 ACS의 존재하에 나타났다. PBS는 5% 및 10%와 같은 더 높은 농도에서 견줄만한 세포수의 겉보기 감소를 보이지 않았지만, 세포분열을 촉진시키는데는 전반적으로 덜 효율적이었다. FBS를 사용하여 수행된 실험에서, 엑소좀은 세포 증식에 대해 주요 효과를 갖지 못했다. FBS 기원 및 ACS 기원의 분리된 엑소좀은 용량-의존적으로 세포분열을 촉진시켰다.
결과적으로, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조될 수 있는 약학 제제는 세포분열을 증가시킨다.
실시예 2: 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 경로의 자극
항-아폽토시스 효과를 갖는, NF-κB 경로의 자극은 하기의 샘플을 사용하여 GFP/루시페라제 리포터 시스템을 사용하여 시험하였다: 인큐베이션 동안 생성된 엑소좀을 분리 또는 농축시키는 단계를 포함하지 않은, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제 (여기서, 약학 제제는 혈청이었고, 인큐베이션 시간은 6시간이었다) ("ACS") 및 본 명세서의 제조 방법이 수행되지 않은 대조군 혈청을 사용한 대조군 ("대조군"). NF-κB 경로는 다양한 농도의 IL-1β로 자극시켰다. 이 실험에서, 연골세포 기원의 세포는 루시페라제 유전자를 구동하는 염기성 CMV 프로모터 및 NF-κB 단백질을 위한 앞의 4배 결합 모티프 (TRE)로 이루어진 DNA 작제물을 사용하여 유전적으로 변화시켰다. 따라서, 이들 세포에서 NF-κB 경로의 임의 유도는 정량화될 수 있는 향상된 루시페라제 활성 (relative light unit (RLU))으로서 볼 수 있다.
결과는 하기 표 및 도 2에 제시되어 있다.
도 2에서, 각 그룹의 좌측 바아는 대조군을 나타내고, 우측 바아는 ACS를 나타낸다.
NF-κB 경로는 용량-의존성 방식으로 IL-1β로 자극시켰음이 분명하다. 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제 ("ACS")는 시험된 IL-1β 농도의 전체 범위에 걸쳐 이러한 자극을 향상시켰다.
따라서, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조될 수 있는 약학 제제는 항-아폽토시스 경로를 자극하는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 3: 세포의 UV 방사
처음 일련의 실험에서, 수핵 세포는 혈청의 부재하에 그리고 혈청의 형태로 존재한 ("EOT"), 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제의 존재하에 24 웰 플레이트에 플레이팅시켰다. EOT 농도는 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5% 및 1%였다. EOT 샘플의 한 부분은 인큐베이션시키지 않고 즉시 처리하였다 ("EOT0"). EOT 샘플의 다른 부분은 6시간 동안 인큐베이션시켰다 ("EOT6").
세포를 플레이팅시킨지 6시간 후, 세포는 UV 광으로 조사하였다 (Herolab 투과조명기 FT-28/312, 6개 튜브 cat. nr. 29 84 100, 15 W, 312 nm). 방출 최대는 312 nm였다. 조사 지속시간은 80s였다. 세포는 37°C, 5% C02에서 다시 2일 동안 성장시켰다.
세포는 500 ㎕의 1% 트립신에 의해 분리시켰고, Casy 계수기로 카운팅하였다. ml당 세포수는 다음과 같다:
데이터의 그래프는 도 3a에 제시되어 있다.
UV 조사는 혈청의 부재하에 세포 계수를 강력히 감소시킨 것으로 확인되었다. EOT0의 존재는 큰 효과가 없었다는 것이다. 대조적으로, EOT6의 존재는 0.05%의 최저 농도를 제외하고, 약 10의 팩터까지 세포 계수를 증가시켰다.
본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제는 UV 방사의 유해한 효과를 방지하는 것으로 결론지을 수 있다. 이 효과는 인큐베이션에 대해, 즉 인큐베이션 기간 동안 유효 성분의 형성에 따라 좌우되었다.
두 번째 일련의 실험은 이들 결과를 확인하였다. 이 시리즈에서, 비-조사 대조군이 빠졌다. 결과는 (cells/ml)는 하기 표 및 도 3b에 제시되어 있다.
또한, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제는 UV 방사의 유해한 효과를 방지하고, 이 효과는 인큐베이션 단계에 따라 좌우되었음을 알 수 있었다.
실시예 4: 전신 CRP 수준의 강하
상이한 연령 그룹의 인간 대상 (20 내지 45세, 48 내지 58세, 60 내지 83세)에 분리된 엑소좀을 포함하는, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제를 근육내 또는 관절내 주사로 투여하였다. 엑소좀은 100,000 g에서 2시간 원심분리시켜 조절된 혈액 샘플로부터 분리시켰고, 펠릿은 PBS에 재현탁시켰다. PBS의 용적은 혈청 용적의 1/10이었다. 대상에 각 경우에 1 ml를 근육내 투여하였다. 대상의 총 수는 22명이었다. 대상에 1회 주사를 각각 투여하였고, CRP 수준은 주사 전 및 주사한지 약 2주 후에 측정하였다.
각 경우에, C-반응성 단백질 (CRP)의 수준은 고민감성 CRP ELISA ("hsCRP")로 측정하였고, 치료 전 수준과 비교하였다. 결과를 비교할 수 있도록 하기 위해, CRP 수준의 상대적 강하를 각 경우에 계산하였다. 중간 상대적 강하는 20 내지 45세 그룹에서 최소한 두드러졌고, 48 내지 58세 그룹에서는 더욱 두드러졌으며, 60 내지 83세 그룹에서 가장 두드러진 것으로 확인되었다.
결과는 도 4에 제시되어 있다.
본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제는 CRP 수준으로 제시된 바와 같이, 염증을 감소시키고, 이에 따라 노화의 가능한 원인을 방지하는 것으로 결론지을 수 있다. 젊은 환자보다 더 나이든 환자에서 심지어 더욱 그러하다.
실시예 5: 염증성 성분에 대한 항-염증성 성분 비의 연령-의존성
인간의 연령이 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제 조성물에 영향을 주는 지를 검사하였다.
이를 위해, 일련의 시험관내 실험에서, 혈액 샘플을 인간 대상으로부터 수집하였고, 본 명세서의 제조 방법에 적용시켰다. IL-1β 및 IL-1 Ra의 농도는 인큐베이션 단계 후에 측정하였다.
인큐베이션 후 IL-1β (염증 성분)의 농도는 연령에 따라 통계학적으로 유의하지 않은 것으로 확인되었다. 결과는 5a에 제시되어 있다 (총 대상 수: 165명).
대조적으로, 인큐베이션 후 IL-1Ra (항-염증 성분)의 농도는 젊은 환자보다 더 나이든 환자에서 더 높았다. 결과는 5b에 제시되어 있다 (총 대상 수: 368명).
결론은 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제가 항-염증 효과로서 노화의 가능한 원인을 방지한다는 것이다. 인큐베이션 후 IL-1Ra의 농도가 연령에 따라 증가하지만 IL-1β의 농도는 그렇치 않다는 사실에 의해 제시된 바와 같이, 이 효과는 젊은 환자보다 더 나이든 환자에서 더욱 강하다.
실시예 6: 면역계 기능의 이동
4명의 인간 지원자에게 자가 조절된 혈청의 형태로 존재하는, 본 명세서의 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제 4 ml를 각각 4회 근육내 주사로 투여하였다 (주당 1회).
전혈은 0주, 2주 및 4주째에 대상으로부터 채취하였고, 시험관내 시험에 적용시켰다: 전혈중 IL-2 및 IFN-γ의 생성은 5.7 ㎍/ml PHA로 24시간 자극하에 시험관내에서 시험하였다. 혈액중 CRP 수준은 부가적으로 고민감성 C-반응성 단백질 ELISA ("hsCRP")로 측정하였다.
주사는 하기 표에 제시된 바와 같이, IL-2 및 IFN-γ를 생성하는 전혈 능력의 강한 감소를 유도한 것으로 밝혀졌다. hcCRP가 감소되었다.
타입 1 사이토킨 (IL-2 및 IFN-γ)의 감소는 주사가 염증성에서 재생/항-염증성으로 면역계의 이동을 유도했음을 의미한다. 따라서, 타입 1 면역반응의 증가로 인한 면역 과정의 불균형이 치료될 수 있다.
이로부터, 본 명세서의 제조 방법 또는 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조되는 약학 제제가 노화의 가능한 원인을 방지한다고 결론지을 수 있다.
실시예 7: 얼굴 피부로 주입 후 탄성 측정
얼굴 피부로 주입시킴으로써, 얼굴 피부 및 탄성이 손실된 21명의 환자 (35 내지 55세)를 치료하였다. 환자에 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조된 약학 제제를 주입시켰고, 여기서 혈액 샘플의 세포 구성성분은 혈청 ("ACS")의 형태로, 인큐베이션 후 제거하였다. 인큐베이션 시간 t는 6시간이었고, 내부 표면 A는 41cm2였다. 이에 따라, t/A로서 정의되는, f는 0.146이었다.
총 연구 지속기간은 24주였다. 방문자들은 다음과 같았다: 선별 방문자 (등록 2주 전인, -2주), 등록 방문자 (0주), 2주, 4주, 8주, 12주 및 24주. 하기 표는 방문자의 검토를 나타낸다. 수행된 활동은 "x"로 표시된다:
배제 범위는 심각한 만성 피부 질환, 예를 들어, 건선, 아토피습진 (신경피부염) 또는 다른 자가면역 질환, 기억에는 피부암, 피부 관여가 있는 전신 질환 (SLE), 레이저, 보툴리늄 독소 또는 히알루론산에 의한 전-처리, 임신, 지난 3개월간 심한 식이 또는 24주의 연구 기간 동안 영양 보충제, 급성 감염, 여드름이었다.
환자에 0주, 2주 및 4주째에 ACS의 일련의 3회 주입을 하였다. 4회 주입은 대부분의 환자에 대해 12주째에 제공하였다.
약 2 ml의 ACS를 각각의 세션에서 전체적으로 피부내 (1 내지 3 mm 미만의 깊이로) 주입시켰다. 주입은 이웃하는 주입 부위 사이에 1 cm 거리의 격자로 두 뺨 영역에 (≤ 1 ml/영역) 손으로 수행하였다. 각각의 뺨에 약 4 cm x 5 cm의 면적을 20회 주입으로 처리하였다.
1차 효능 평가를 위해, 흡진 원리가 피부에 사용되었다. Cutometer® MPA 580 (Courage & Khazaka, Cologne, 독일)을 사용하여, 피부의 점탄성 특성을 기술하는 12개 파라미터를 24주에 걸쳐 7회 평가하였다 (-2주, 0주 및 2, 4, 8, 12 및 24주째). 12주에 측정된 비-효능의 경우에, 부가의 ACS 투여가 수행되었다.
1차 효능 변수는 Cutometer®로 측정된 피부 탄성으로 수득되었다. 부가 변수는 피부보습측정기술 (수화 측정), GAIS (Global Aesthetic Improvement Scale) 등급 (개선/변화 없음/악화 정도), 매력의 자체 평가 및 질문지였다.
결과는 다음과 같았다:
SD: 표준편차
차이: 방문 5분 기준
p 값: 대응표본 t-검정 (paired t-test)
심지어 작은 차이도 표준 편차가 작은 경우, 통계학적으로 유의한 결과를 유도할 수 있음을 주목하였다.
12주 및 기준을 비교해 보면, R0 값은 0.34에서 0.24로 약 30%까지 상당히 감소되었다 (유의적). 이는 20년 연령 차이를 나타내는 차이로 고려될 수 있다. R5 값은 약 25%까지 상당히 증가되었다 (유의적).
이론으로 제한하지 않고, 탄성의 유의적 증가는 아마도 섬유아세포의 활성화에 기인할 것이다.
따라서, 효과는 적어도 12주를 지속한다고 결론지을 수 있다.
실시예 8: 수핵 기원의 세포 증식
약학 제제는 혈청 ("ACS")의 형태로 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조되었다. 인큐베이션 시간 t는 6시간이었고, 내부 표면 A는 41cm2였다. 이에 따라, t/A로서 정의되는, f는 0.146이었다.
ACS가 시험관내 세포 증식을 촉진시킬 수 있는 것으로 정립되었다. 여기서, ACS의 상이한 성분은 시험관내에서 수핵(NP) 세포의 증식을 촉진시키는 것에 대해 평가하였다.
수핵 세포는 약 4500 세포/웰의 밀도로 96 웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅시켰다. 그 다음에, 세포에 ACS의 다양한 성분을 공급하였다: ACS는 크기배제 칼럼 (IZON qEV, cf. EV 분리 및 정제를 위한 qEV 크기배제 칼럼 http://www.izon.com/assets/SideColumnPDFs/qEV-Brochure-April-15.pdf)을 통해 분별화하였다. 이 칼럼은 단백질 및 다른 성분으로부터 엑소좀(EV)을 분리할 수 있다. 최대 입자(EV)를 먼저 용출시킨 다음, 점차적으로 더 작은 것을 용출시킨다. 정확한 분획 수는 완충제, 온도 및 적용된 유체 (예: 혈청, 혈장 또는 다른 유체)의 정체성과 같은 요인에 따라 좌우될 수 있다. 그러나, 프로-증식성 활성을 갖는 적어도 2개의 별도 피크가 존재할 것이다.
요약하면, qEV 칼럼은 세포 배양배지 (DMEM, Gibco)로 평형화시켰고; 500 ㎕의 ACS를 칼럼에 적용시켜 다음과 같이 분별화하였다. 처음 1.5 ml는 폐기시켰고, 다음 액체는 350 ㎕ 분획으로 수집하였다. 분획은 세포를 공급하기 위해 사용되었고, 세포수는 CCK-8 ("Cell Counting Kit-8") 검정법으로 측정하였다.
CCK-8은 세포 생존능의 측정을 위해 민감한 비색분석법을 제공한다. 상당히 수용성인 테트라졸륨 염, WST-8은 세포에서 데하이드로게나제 활성에 의해 감소되어 오렌지-색 포르마잔 염료를 제공하는데, 이는 조직 배양 배지에 가용성이다. 450 nm에서 흡수는 세포에서 미토콘드리아를 활성화시키는 것에 비례한다, 참조 http://www.dojindo.eu. com/store/p/456-Cell-Counting-Kit-8.aspx. 세포에서 데하이드로게나제의 활성에 의해 생성되는, 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포 수에 직접 비례한다.
결과는 엑소좀이 NP 세포 증식을 촉진할 수 있다고 제시하고 있다. 기준은 DMEM만으로 세포 증식시킨 것이었다.
처음 CCK-8 검정 (도 6a)에서, 엑소좀은 분획 8 및 9에서 용출되었다. 분획 10을 시작으로 단백질 (ACS로부터의 성장 인자 포함)은 용출되기 시작하여 세포 증식을 유도하는 다른 피크를 형성한다. 16으로부터의 분획은 세포 성장을 자극하지 않은 성분을 함유했다.
두 번째 CCK-8 검정 (도 6b)에서, 엑소좀은 분획 5 내지 8에서 용출되었고, 단백질은 분획 9 내지 11에서 용출되었다. 12로부터의 분획은 세포 성장을 자극하지 않은 성분을 함유했다. 풀링된 분획 5 내지 14는 엑소좀 (EVs) 및 단백질을 합한다.
결론은 ACS로부터의 EV는 세포 증식을 촉진한다는 것이다. ACS로부터의 단백질도 또한 세포 증식을 촉진한다. ACS는 세포 증식을 독립적으로 촉진하는 두 그룹의 성분을 함유한다: EV (엑소좀) 및 단백질 (예: 성장 인자). ACS에서 성분의 제3 그룹은 세포 증식을 감소시키고 작은 성분에 의해 용출된다. 주: 성분의 정확한 분획 수는 다음과 같은 요인에 따라 좌우된다: 칼럼 크기, 완충제 및 온도. 성분 순서는 비-변성 조건하에 변하지 않는다. EV를 함유하는 분획 및 단백질 (예: 성장 인자)을 함유하는 분획의 풀링은 상승적으로 작용할 수 있다.
따라서, ACS는 시험관내에서 세포 증식을 독립적으로 촉진하는 두 그룹의 성분을 함유한다고 결론지을 수 있다.
실시예 9: 시험관내에서 UV 조사 후 세포 생존
약학 제제는 혈청 ("ACS")의 형태로 본 명세서의 조절된 제조 방법에 따라 제조되었다. 인큐베이션 시간 t는 6시간이었고, 내부 표면 A는 41cm2였다. 이에 따라, t/A로서 정의되는, f는 0.146이었다.
ACS는 시험관내에서 세포 증식을 촉진할 수 있다. 이 실험은 UV 조사 후 시험관내에서 수핵 세포의 생존을 촉진함에 대해 ACS 및 다른 혈액 제제를 평가하였다.
요약하면, 수핵 세포는 약 3000 세포/웰의 밀도로 96웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅시켰고, 37°C, 5% C02로 유지하였다. 세포에 각각 10%, 5%, 2.5%, 1.25% 및 0.63%의 태소 혈청 (FBS), ACS, 혈소판-풍부 혈장 (PRP), 혈장 (ACS와 동일하지만, 인큐베이션은 없음) 및 혈소판 용해물 (PL)을 공급하였다.
상기 웰의 반은 30분 동안 고강도 UV 방사로 조사하였다. 각각의 웰의 세포는 IMAGER를 통해 계수하였다.
도 7은 보충제 첨가 및 UV 조사 24시간 후, 비-보충된 대조군과 비교되는 살아있는 세포의 퍼센트를 나타낸다. 데이터는 3개의 96 웰 플레이트의 평균을 기준으로 한다.
UV 조사의 부재시 (좌측 5개 칼럼), 다양한 농도의 보충제는 비-보충된 대조군의 것의 약 50% 내지 150%의 범위로 세포수를 유도하였다.
UV 조사 후, 비-보충된 세포 대부분은 죽었다. 세포사는 UV 조사 없는 것보다 더 높은 정도로 일어났다.
보충제는 그들의 농도에 따라 좌우되는, UV 조사 유도된 세포사로부터 다양한 정도로 세포를 보호했다. 이는 비-보충된 대조군 (우측 5개 칼럼)에 비하여 살아있는 세포의 퍼센트로 제시되고 있고, 이는 확실히 100%를 넘었다. 최대 보호는 2.5% 및 1.25%의 FCS 및 1.25%의 ACS에 의해 성취되었다. PRP 및 혈장의 효과는 덜 두드러졌다. 혈장과 ACS 사이에 비교는 어떤 농도에서 인큐베이션은 확실한 효과를 갖지만, 특정 효과는 인큐베이션의 부재시 또한 성취될 수 있다고 밝혔다. 혈소판 용해물은 이 실험에서 효과적이지 않았다.
결론: UV 조사는 시험관내에서 순 세포사(net cell death)를 유발한다. 혈액 유래 제제에 의한 보충은 확실히 비-보충된 세포에 비하여 생존을 증가시킨다.
Claims (24)
- 피부로 주입시켜 사용하기 위한 약학 제제로, 이때 상기 약학 제제는 유기체로부터 수집한 액체를 제공하는 단계로, 이 액체는 혈액의 세포 구성성분을 포함하며, 내부 표면을 갖는 용기(vessel) 또는 포함 수단(containment means)을 제공하는 단계, 및 상기 액체와 상기 용기 또는 포함 수단을 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있고, 이때
(a) 상기 제조 방법은 인큐베이션(incubation) 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 상기 액체를 인큐베이팅시키고, 선택적으로 상기 인큐베이션 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하며,
(b) 상기 액체는 엑소좀을 포함하고, 상기 제조 방법은 상기 엑소좀을 농축시키는 단계 및 선택적으로 상기 농축 후 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계, 또는 상기 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는
(c) 상기 제조 방법은 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계, 및 상기 용기 또는 포함 수단과 접촉된 상기 액체의 세포 구성성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 약학 제제. - 제 1항에 있어서, 상기 인큐베이션 시간과 상기 내부 표면 사이에 관계가 다음 식: t = f*A를 따르며, 여기서 t는 인큐베이션 시간을 나타내고, A는 내부 표면을 나타내며, f는 0.5 h/cm2보다 작거나 이와 같은, 대안 (a)에 따라 사용하기 위한 약학 제제.
- 제 1항에 있어서, 상기 제조 방법이 상기 엑소좀을 농축 또는 분리시키는 단계 전에, 상기 액체를 인큐베이션 시간 동안 상기 용기 또는 포함 수단에서 인큐베이팅시키는 단계, 또는 상기 액체의 인큐베이션을 피하는 단계를 추가로 포함하는, 대안 (b)에 따라 사용하기 위한 약학 제제.
- 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 액체가 혈액 샘플인, 약학 제제.
- 제 4항에 있어서, (1) 전혈 샘플 또는 (2) 세포가 고갈된 전혈 샘플인, 약학 제제.
- 제 5항에 있어서, 상기 고갈된 세포가 적혈구인, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 구성성분을 제거하는 단계가 적혈구, 혈소판 또는 세포 구성성분 전체를 제거하는 단계인, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 제조 방법이 상기 액체의 용적을 감소시키는 단계를 추가로 포함하고 및/또는
(b) 상기 약학 제제가 무수 형태로 존재하는, 약학 제제. - 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 주입이 3 mm 미만의 깊이로 수행되는, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부로 주입이 진피 또는 피하조직으로의 주입인, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용이 하나 이상의 후속 주입을 포함하고, 연속 주입 사이에 시간 간격은 1일 내지 52주인, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, (1) 노화의 치료시 또는 (2) 항-노화제로서 사용하기 위한, 약학 제제.
- 제 12항에 있어서,
(a) 산화적 손상, DNA 손상, 손상된 DNA 복구, 손상된 세포분열, 과도한 염증, 면역 과정의 병원성 분극(pathogenic polarisation) 또는 과도한 세포사에 의해 유발되는 장애, 또는
(b) 뉴클레오티드 절단 복구 경로의 단백질을 인코딩하는 유전자에 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 유전적으로 변화된 마우스의 장애로 모의된 장애 (상기 돌연변이는 상기 돌연변이가 결여된 마우스에 비하여 조기 노화 표현형을 유발한다), 또는
(c) 노화-관련 장애 또는 이의 발병률이 선형 형태보다 더 크게 노화에 따라 증가되는 장애, 또는
(d) 피부의 역학적 파라미터에 대해 효과를 갖는 장애 또는 콜라겐 손상 및/또는 엘라스틴 손상, 노쇠, 텔로미어 단축, 항산화제 효소의 손상된 발현 또는 항산화제 효소의 손상된 활성에 의해 유발되는 장애의 치료시 사용하기 위한, 약학 제제. - 제 13항에 있어서,
(a) 상기 산화적 손상은 반응성 산소종에 의한 손상이고, 상기 DNA 손상에 의해 유발되는 장애는 UV-의존성 DNA 손상에 의해 유발되는 장애이며, 상기 손상된 DNA 복구에 의해 유발되는 장애는 결핍된 뉴클레오티드 절단 복구에 의해 유발되는 장애이고, 상기 손상된 세포분열에 의해 유발되는 장애는 수핵세포의 손상된 분열과 관련된 장애이며, 상기 과도한 염증에 의해 유발되는 장애는 비-정형외과적 장애, 신경계를 포함하지 않는 장애 및/또는 눈을 포함하지 않는 장애이고, 상기 면역 과정의 병원성 분극은 타입 1 면역 과정의 증가이며, 또는 상기 세포사는 아폽토시스(apoptosis)이거나, 또는
(b) 상기 유전적으로 변화된 마우스의 돌연변이는 Ercc1 유전자에 존재하거나, 또는
(c) 상기 발병률은 노화에 따라 기하급수적으로 증가하거나, 또는
(d) 상기 콜라겐 손상 및/또는 엘라스틴 손상에 의해 유발되는 장애는 늘어진 피부, 건조 및 주름으로부터 선택되는, 약학 제제. - 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체가 인간인, 약학 제제.
- 제 15항에 있어서, 상기 인간이 적어도 30세인, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서,
(a) IL-6의 수준은 2000 pg/ml 또는 그 미만이고,
(b) IL-1Ra 및 IL-6 수준의 비는 (각각 pg/ml로 측정됨) 3 또는 그 이상이고,
(c) IL-1Ra의 수준은 200 pg/ml 또는 그 이상이고,
(d) IL-1Ra 및 IL-1 수준의 비 (각각 pg/ml로 측정됨)는 10 또는 그 이상이고,
(e) 상기 약학 제제는 히알루론산이 첨가되지 않은, 약학 제제. - 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 제제가 엑소좀을 포함하는, 약학 제제.
- 제 18항에 있어서, 엑소좀이 상기 인큐베이션 동안 생성된, 약학 제제.
- 제 18항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조 방법이 상기 인큐베이션 후 상기 엑소좀을 농축 또는 분리시키고, 선택적으로 상기 농축되거나 분리된 엑소좀을 유체에 용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 혈청 또는 혈장을 포함하는, 약학 제제.
- 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션이
(a) 5분 내지 22시간의 인큐베이션 시간 동안,
(b) 0℃ 내지 45℃의 온도에서, 및/또는
(c) 항응고제의 첨가없이 수행되는, 약학 제제. - 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 용기 또는 포함 수단들이
(a) 1 ml 내지 1000 ml의 용적을 갖고,
(b) 유리, 플라스틱, 강옥 또는 석영이나 이들의 조합을 포함하는, 상기 액체, 바람직하게는 혈액 샘플과 접촉시키기 위한 표면을 포함하고, 및/또는
(c) 거시적 입자, 미시적 입자 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택된 입자를 함유하며, 이때 상기 인큐베이션 동안, 상기 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)는 상기 입자와 접하게 되는, 약학 제제. - 상기 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 상기 사용은
(a) 상기 액체 (바람직하게는 혈액 샘플)가 수집된 동일한 유기체로 주입시켜 및/또는
(b) 하나 이상의 다른 유효 제제와 함께 병용 요법으로 이루어지는, 약학 제제.
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