KR20190025735A

KR20190025735A - 혈장중 아미노산 분석용 표준액

Info

Publication number: KR20190025735A
Application number: KR1020197005499A
Authority: KR
Inventors: 마사코 하야카와; 카즈타카 신보; 히로 요시다
Original assignee: 후지필름 와코 준야꾸 가부시키가이샤; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2019-03-11
Also published as: JP2016191721A; KR102002770B1; JP6190928B2; US20170261524A1; US9638706B2; KR101968485B1; US9952235B2; KR20140056217A; CN103688166B; CN106226527B; CN103688166A; US20150064792A1; CN106226527A; JP6072686B2; JPWO2013012028A1; WO2013012028A1

Abstract

(1) 하기 A성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 0.0007M~0.49M, 및 (2) 하기 B성분으로부터 선택되고, 적어도 이소류신을 포함하는 하나 이상의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.2~0.9배 농도, 및 (3) 하기 C성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.1~0.4배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또는 (4) 하기 D성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.05~0.2배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액；［A성분］발린, 글리신, 알라닌 및 글루타민［B성분］세린, 프롤린, 스레오닌, 타우린, 류신, 이소류신, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 티로신 ［C성분］아스파라긴, 오르니틴, 아르기닌 및 트립토판［D성분］글루탐산, 메티오닌, 시트룰린 및 시스틴.

Description

혈장중 아미노산 분석용 표준액{STANDARD SOLUTION FOR USE IN ANALYSIS OF AMINO ACID IN PLASMA}

본 발명은, 아미노산 분석용 표준액, 특히 외부 또는 내부표준물질 용도의 표준액, 및 그것들을 이용한 아미노산의 정량방법에 관한다.

최근, 생체내의 대사물은 유전적인 요인뿐만이 아니라 환경적인 요인도 많이 받고있는 것이 판명되었고, 유전자나 단백질의 분석과 마찬가지로 이들 대사물의 분석은 병의 진단이나 건강상태의 지침으로서 주목되고 있다. 그 중에서도, 아미노산이나 아민 등의 아미노산 관련 화합물은 가장 많이 존재하는 대사물군(群)의 하나이고(예를 들면, 비특허문헌 1), 그 정량분석은 예로부터 행하여졌으며, 여러 가지 분석방법이 개발되어 왔다.

한편, 정량분석에서는 통상, 분석대상 화합물의 측정점을 사이에 두고 복수의 농도의 표준물질을 분석하여 검량선(檢量線)을 제작하는 검량선법이 일반적으로 이용된다. 이러한 검량선법에 의한 정량분석으로는, 기지(旣知) 농도의 외부표준을 이용하여 농도와 시그널(신호, 구체적으로는 피크 면적이나 피크 높이 등을 나타낸다)과의 상관(相關)을 미리 구하고, 거기에서 얻어진 정보(즉, 검량선)에 근거하여 검체시료 중의 농도를 구한다. 따라서, 검량선법을 이용하는 정량분석에서는, 외부표준(기준)으로부터 얻어지는 검량선이 기준이 되므로, 고정밀도 해석을 위해서는 정량용의 표준품이 매우 중요하게 된다. 그리고 검량선법에 의한 정량분석을 고정밀도로 실시하기 위해서는, 몇 개의 다른 농도계열의 표준품을 준비하고, 실제로 그것들을 측정함으로써 검량선을 제작하며, 또한 검체시료중의 측정대상의 농도가 검량선 제작에 사용한 표준품의 농도 사이에 들어가 있는 것이 정밀도가 좋은 정량을 하는데 중요해진다. 구체적으로는, 검체시료중의 대상의 농도가 50μM(μmol/l)인 검체이면, 25μM에서 75μM의 표준품을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 이때 표준품의 검량점(측정점)의 범위는, 좁은 편이 농도와 시그널의 직선성이 확보되기 쉽기 때문에 바람직하다. 보다 구체적으로 말하면, 1μM에서 100μM로 검량점을 얻는 것보다도, 25μM에서 75μM로 검량점을 얻는 것이 바람직하다.

그러나 생체내의 아미노산(아미노산 관련 화합물)은 종류가 많다. 예를 들면, 주식회사 에스알엘의 아미노산 분석 검사항목에서는, 39종류의 아미노산 관련 화합물을 분석대상으로서 예를 들고 있다(예를 들면, 비특허문헌 2). 그리고 생체내의 아미노산 농도는 아미노산의 종류에 따라서 크게 다르고, 농도가 높은 아미노산과 농도가 낮은 아미노산에서는, 100배 정도(2자리수)의 농도차이가 있는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 기존의 혼합표준액［예를 들면, 아미노산 혼합표준액 AN-II형(코드번호：015-14461, 011-14463), B형(코드번호：016-08641, 012-08643), H형(코드번호：013-08391, 019-08393) 등(모두 와코쥰야꾸공업 주식회사에서 판매)］을 이용하여 분석할 때에는, 각 아미노산 관련 화합물의 농도범위에 의존하고, 표준물질 또는 검체시료의 희석이 필요하게 되는 등, 준비에 시간을 필요로 한다고 하는 과제가 있었다.

한편, 인간 혈장중 아미노산에 대한 참조 표준물질에 대하여 보고되어 있지만(비특허문헌 3), 당해 보고에서의 표준물질은 불특정 다수의 미국인 남녀 100명으로부터 얻은 혈장을 혼합시킨 혈장풀(plasma pool)이기 때문에, 로트간 농도치의 편차를 피할 수 없었다. 또한, 이것을 표준액으로 이용하여 아미노산의 측정을 실시한 경우, 당해 표준물질에 포함되는 각종 아미노산의 농도는 100명의 평균치로 되어있기 때문에, 검체의 아미노산 농도가 평균치를 넘는 것일 경우에는, 그 농도는 검량선의 범위에서 벗어나서 측정 정밀도에서 신뢰성을 결여하고 있었다. 또한, 당해 표준물질은 아미노산 이외의 여러 가지 생체물질을 포함하는 것이기 때문에, 이들 물질에 의하여 측정치에 영향을 미칠 가능성을 부정할 수 없고, 고정밀도 정량분석을 실시하기 위한 표준물질로서 이용하기에는 과제를 가지고 있었다.

따라서, 측정하는 아미노산의 종류에 따라서 농도를 조정할 필요가 없고, 1개의 용액을 적당히 희석한 것을 이용하면, 생체 유래의 검체중의 각종 아미노산에 대해 고정밀도로 정량 가능한 검량선을 제작할 수 있는 표준물질의 개발이 요구되고 있었다.

또한, 검량선법을 이용하는 정량분석법에는, 이른바 외부표준법과 내부표준법 등이 있지만, 내부표준물질에 대해서도 외부 표준물질과 마찬가지로, 검체시료의 특성에 맞추어 표준물질을 설계함으로써, 정량 정밀도를 높이는 것이 가능해진다. 특히 질량 분석계를 검출기로 한 경우, 시료중의 매트릭스 효과의 영향은 크고, 내부표준물질을 사용하는 것은 정밀도 좋게 측정하는데 있어서 매우 중요한 것이다.

이 내부표준법을 이용한 아미노산의 측정에 대해서는, 몇 개의 연구가 보고되어 있지만(예를 들면, 비특허문헌 4, 5), 종래의 내부표준물질은, 농도와 시그널의 직선성이 나쁘기도 하고, 이들을 이용하였을 경우에 아미노산 측정의 정밀도가 좋지않은 등의 문제가 있었다. 그 때문에, 이러한 문제를 해소한 내부표준물질의 개발이 요구되고 있었다.

WO 2003/069328

B. D. Bennett, E. H. Kimball, M. Gao, R. Osterhout, S. J. Van Dien and J. D. Rabinowitz, Nat. Chem. Biol., 5, 593-599 (2009). http://www.srl.info/srlinfo/kensa_ref_CD/KENSA/SRL6354.htm http://www.nist.gov/cstl/analytical/organic/metabolitesinserum.cfm Kazutaka Shimbo, Takashi Oonuki, Akihisa Yahashi, Kazuo Hirayama and Hiroshi Miyano, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009; 23: 1483-1492. E. A. McGaw, K. W. Phinney and M. S. Lowenthal. J Chromatogr A. 2010; 1217: 5822-5831.

본 발명은 상술한 상황을 감안하여 이루어진 것이고, 해결하고자 하는 과제는 아미노산의 정량을 간편하며, 정밀도 좋게 실시하는 것에 있다. 보다 상세하게는, 혈장중에 존재하는 아미노산의 정량분석을 간편, 고정밀도로 분석하기 위한, 외부표준액, 외부표준물질, 내부표준액, 및 내부표준물질, 및 그것들을 이용한 혈장중 아미노산 정량방법의 제공을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여, 먼저 6469 검체의 인간 혈장 검체중의 각각의 아미노산 농도를 분석함으로써 기준이 되는 인간 혈장중 각 아미노산의 농도 분포를 통계학적으로 구하였다. 그리고 당해 농도분포를 바탕으로 외부표준액을 조제하였다. 그 결과, 당해 외부표준액은, 종래의 것과 달리 외부표준액과 이것을 적절하게 희석한 것을 이용하여 검량선을 제작하면 대부분의 검체중의 각종 아미노산 농도는 이들을 이용한 검량선 내에 들어가게 되기 때문에, 정밀도 좋게 검체중 아미노산 농도를 측정할 수 있는 점을 발견하였고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 본 발명자들은, 예를 들면 질량분석계를 검출기로 한 액체 크로마토그래피를 이용하는 경우에, 안정동위체로 표지한 특정 아미노산을 내부표준물질로서 이용함에 따라, 내부표준물질의 농도와 시그널의 관계가 직선이 되어, 고정밀도의 아미노산 분석이 가능해지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액(이하, 간단하게 본 발명의 외부표준액으로 약기하는 경우가 있다)은, 6469 검체의 검체 데이터로부터 얻은 혈장중의 각종 아미노산 농도분포에 근거하여, 각종 아미노산을 실제 혈장중의 농도 밸런스로 함유하는 것이고, 당해 표준액을 아미노산 정량분석의 검량선 제작용으로 이용함으로써, 실제 혈장중 아미노산 농도의 최소 농도로부터 최대 농도의 대부분을 커버하는 것 같은 농도차로 검량선을 제작할 수가 있고, 그 결과 종래보다 간편하며 정밀도 좋게 아미노산 분석을 실시할 수 있는 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 외부표준액은, 예를 들면 액체 크로마토그래피법, 가스 크로마토그래피법, 초임계 유체 크로마토그래피법, 전기 영동법, 유도 결합 플라즈마법 등과 질량분석을 조합한 각종 분리 분석 방법에 적합하고, 특히 질량 분석을 조합한 크로마토그래피법에 의한 각종 아미노산의 분리 분석 측정에 적합한 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명의 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「(1)하기 A성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 0.0007M(mol/l)~0.49M, 및 (2)(i) 하기 B성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.2~0.9배 농도, (ii) 하기 C성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.1~0.4배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는, 그 중에서 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또는, (iii) 하기 D성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.05~0.2배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는, 그 중에서 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분을 포함하는 경우에는, 그 중에서 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유하는, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액；

［A성분］

발린, 글리신, 알라닌 및 글루타민

［B성분］

세린, 프롤린, 스레오닌, 타우린, 류신, 이소류신, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 티로신

［C성분］

아스파라긴, 오르니틴, 아르기닌 및 트립토판

［D성분］

글루탐산, 메티오닌, 시트룰린 및 시스틴인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「(1) A성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 0.0007M~0.49M, 및

(2) B성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.2~0.9배 농도 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「상기 외부표준액에, C성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.1~0.4배 농도, 또한, B성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「상기 외부표준액에, D성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 하나당, A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.05~0.2배 농도, B성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「발린과 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘, 트립토판, 및 시트룰린 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고, 발린을 0.0003M~0.49M, 류신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~1배 미만 농도, 이소류신을 포함하는 경우에는 발린의 0.05~0.7배 농도, 페닐알라닌을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 티로신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.7배 농도, 히스티딘을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.8배 농도, 트립토판을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 또한, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 히스티딘을 포함하는 경우에는, 이들의 1배 미만 농도, 시트룰린을 포함한 경우에는 발린의 0.01~0.3배 농도, 또한, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판을 포함하는 경우에는, 이들의 1배 미만 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

게다가 본 발명의 다른 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「발린, 류신 및 이소류신 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고, 발린을 0.0003M~0.49M 함유하며, 류신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~1배 미만 농도, 이소류신을 포함하는 경우에는 발린의 0.05~0.7배 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「상기 표준액에, 페닐알라닌 및 티로신 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고, 페닐알라닌을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 티로신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.7배 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「상기 표준액에, 히스티딘 및 트립토판 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고, 히스티딘을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.8배 농도, 트립토판을 포함하는 경우에는, 발린의 0.1~0.6배 농도, 또한, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 히스티딘을 포함하는 경우에는, 이들의 1배 미만 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 한 형태에서, 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액은, 「상기 표준액에, 시트룰린을 포함하여 이루어지고, 시트룰린을 발린의 0.01~0.3배 농도, 또한, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판을 포함하는 경우에는, 이들의 1배 미만 농도를 함유한다」인 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명은, 종래 시판된 거의 일률적인 농도의 아미노산을 혼합하여 조제한 외부표준물질과는 달리, 실제 인간 혈장중의 아미노산 존재농도의 비율(아미노산 밸런스)에 맞추어 조제한 외부표준액을 제공할 수가 있고, 당해 외부표준액으로부터 수 개~10개 정도의 희석액을 조제하며, 이것들을 이용하면, 인간 혈장중 아미노산의 정량분석을 위한 각종 아미노산의 검량선을 제작할 수가 있고, 당해 외부표준액을 아미노산 정량방법의 표준액으로 이용함으로써, 생체 내 아미노산의 정량을, 종래의 표준물질을 이용한 경우와 비교하여, 간편하고 정밀도 좋게 분석할 수가 있다.

또한, 본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 내부표준액(이하, 단순히 본 발명의 내부표준액으로 약기하는 경우가 있다)은, 농도와 시그널의 사이에서 양호한 직선성을 나타내므로, 고정밀도의 아미노산 측정을 가능하게 하고, 또한, 크로마토그래피법에서 이용한 경우, 내부표준액중의 아미노산과 측정대상이 되는 아미노산의 유지 시간에 거의 차이가 없기 때문에, 측정을 가능하게 하는 효과를 나타내는 것이다.

본 발명의 내부표준액은, 「1개 이상의 안정동위체로 표지된, 프롤린, 글리신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 티로신 및 타우린을 포함할 것」을 특징으로 한다.

게다가 본 발명의 내부표준액은, 「1개 이상의 안정동위체로 표지된, 프롤린, 글리신, 발린, 트립토판, 티로신, 타우린, 이소류신, 페닐알라닌 및 아스파라긴을 포함할 것」을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 내부표준액은, 「1개 이상의 안정동위체로 표지된, 프롤린, 글리신, 발린, 트립토판, 티로신, 타우린, 이소류신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 오르니틴, 에탄올아민, 글루탐산, 3-메틸히스티딘, 세린, 히스티딘, 및 아르기닌을 포함할 것」을 특징으로 한다.

본 발명은, 혈장중 아미노산의 특성에 맞춘, 예를 들면, 크로마토그래피법에서 유지 시간의 차이가 거의 없고, 또한 농도와 시그널의 관계가 직선으로 유지되는 효과를 나타내는 내부표준액을 제공하는 것이며, 상기와 같은 본 발명의 내부표준액을 아미노산의 정량방법에 이용하면, 생체 내 아미노산의 정량을 간편하고 고정밀도로 분석하는 것이 가능해진다.

본 발명의 또 다른 시점에서, 본 발명의 아미노산 정량방법은,「상기 외부표준액 혹은 외부표준물질을 이용할 것」을 특징으로 하고, 또한,「상기 외부표준액 혹은 외부표준물질에, 내부표준액 또는 내부표준물질을 이용할 것」을 특징으로 하며, 또한,「상기 내부표준액 또는 내부표준물질을 이용할 것」을 특징으로 한다. 이와 같이 함으로써, 혈장중 아미노산의 정량을 간편하면서 정밀도 좋게 분석할 수가 있다. 또한, 본 발명의 정량방법에서는, 특히, 질량 분석계로 측정하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 아미노산 정량방법은, 종래의 외부표준물질 또는/및 내부표준물질을 이용한 경우와 비교하여, 혈장중 아미노산의 정량을 간편하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 현격히 뛰어난 정밀도로 분석할 수가 있다.

본 발명의 표준액은, 6469 검체의 인간 혈장 검체를 각각 분석한 데이터를 바탕으로 인간 혈장중의 각종 아미노산의 농도 분포를 통계학적으로 구하고, 그것에 준하여 각종 아미노산 농도를 설정하고 있다. 따라서, 인간 혈장중 아미노산의 표준오차가 매우 작고, 당해 표준액 및 이를 적절하게 희석한 것을 아미노산의 정량분석용 검량선 제작을 위하여 이용함으로써 정밀도 높은 측정을 가능하게 한다. 또한, 종래의 표준액은, 거의 동일한 농도의 아미노산을 혼합한 혼합용액이었기 때문에, 각종 아미노산의 측정농도범위가 제작하는 검량선의 범위 내에 들어가도록 하기 위해서는, 매우 많은 검량점에서 측정을 실시할 필요가 있었다. 그러나 본 발명의 표준액에 있어서는, 상기와 같이 다량의 인간 혈장 검체를 분석한 데이터를 바탕으로 아미노산 농도를 설정하고 있기 때문에, 이를 특정한 복수의 희석 배율로 희석하는 일련의 조작(수 개에서 10개 이내의 희석 계열의 제작)을 일단 실시하면, 분석대상으로 하는 혈장중의 각종 아미노산 농도에 맞춘 검량선용 표준액을 간편하게 제공할 수가 있다. 그 결과, 검량점을 줄이고, 간편한 측정을 가능하게 하며, 또한, 정밀도가 높은 정량분석을 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 내부표준액은, 종래 아미노산의 내부표준액과 비교하여, 이것을 적절히 희석하여 이용하면 농도와 시그널의 관계가 직선성으로 되기 때문에, 고정밀도의 아미노산 측정을 가능하게 한다. 특히 크로마토그래피법에서 이용한 경우, 내부표준액중 아미노산과 측정대상이 되는 아미노산의 유지 시간에 거의 차이가 없기 때문에, 고정밀도의 측정을 가능하게 한다.

또한, 본 발명의 혈장중 아미노산의 측정방법에서는, 상기 본 발명의 외부표준액과 본 발명의 내부표준액을 조합하여 이용함으로써, 보다 정밀도 높은 정량분석을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 혈장중 아미노산의 정량분석에서 매우 유용한 것이다.

[도 1] 실험예 1에서 측정한 각종 아미노산의 평균농도, 최대농도, 최소농도, 평균농도＋2SD(표준편차) 및 평균농도-2SD(표준편차), 실시예 1에서 조제한 본 발명의 외부표준액(농도 1 및 농도 5), 및 비교예 1에서 조제한 종래의 아미노산 혼합표준액(농도 1＇ 및 농도 5＇)의 농도 분포에 대하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액(본 발명의 외부표준액)

본 발명의 외부표준액은, 검량선법을 이용하는 정량분석법에서 채용하는, 이른바 외부표준을 위하여 이용되는 것이고, 구체적으로는 측정대상 인간의 생체 시료중의 각종 아미노산의 존재농도 비율에 맞추어, 표준물질(기준)로서의 복수의 아미노산 제품(시판품)을 조제하여 혼합한 용액이며, 외부혼합표준액이라고도 한다.

본 발명의 외부표준액을 이용하여 측정하는 아미노산으로서는, 예를 들면, 발린(Val), 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 글루타민(Glu), 세린(Ser), 프롤린(Pro), 스레오닌(Thr), 타우린(Tau), 류신(Ler), 이소류신(Ile), 리신(Lys), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn), 오르니틴(Orn), 아르기닌(Arg), 트립토판(Trp), 글루탐산(Glu), 메티오닌(Met), 시트룰린(Cit), 시스틴(Cys), α-아미노낙산(ABA), 에탄올아민(EtOHNH₂), 사르코신(Sar), γ아미노낙산(GABA), β-아미노이소부틸산(β-AiBA), 히드록시프롤린(HyPro), 아스파라긴산(Asp), α-아미노아디핀산(α-AAA), 히드록시리신(HyLys), 1-메틸히스티딘(1MeHis), 3-메틸히스티딘(3MeHis), 카르노신(Car), 안세린(Ans) 등을 들 수 있지만, 특히, 발린(Val), 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 글루타민(Glu), 세린(Ser), 프롤린(Pro), 스레오닌(Thr), 타우린(Tau), 류신(Ler), 이소류신(Ile), 리신(Lys), 히스티딘(His), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn), 오르니틴(Orn), 아르기닌(Arg), 트립토판(Trp), 글루탐산(Glu), 메티오닌(Met), 시트룰린(Cit), 시스틴(Cys) 등이 바람직하다.

본 발명의 외부표준액은, 측정하는 아미노산에 따라서, 상기 아미노산으로부터 적절하게 선택되지만, 하기 A성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하고,또한, 하기 B~D성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하는 것이다. 구체적으로는, A성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하고, 또한, B성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하는 것이 바람직하고, 게다가, C성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하는 것이 바람직하고, 더욱이 D성분에 포함되는 아미노산을 적어도 1개 포함하는 것이 바람직하다.

［A성분］

발린, 글리신, 알라닌 및 글루타민

［B성분］

［C성분］

아스파라긴, 오르니틴, 아르기닌 및 트립토판

［D성분］

글루탐산, 메티오닌, 시트룰린 및 시스틴

상기 A성분 중에서도, 발린이 바람직하다.

상기 B성분 중에서도, 세린, 프롤린, 스레오닌, 류신, 이소류신, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 티로신이 바람직하고, 류신, 이소류신, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신이 보다 바람직하다.

상기 C성분 중에서도 트립토판, 아스파라긴이 바람직하고, 트립토판이 보다 바람직하다.

상기 D성분 중에서도 시트룰린, 메티오닌이 바람직하고, 시트룰린이 보다 바람직하다.

또한, 본원발명의 외부표준액은, 상기 A~D성분 이외의 아미노산으로서 에탄올아민, 사르코신, γ아미노낙산, β-아미노이소부틸산, 히드록시프롤린, 아스파라긴산, α-아미노아디핀산, 히드록시리신, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 카르노신, 안세린 또는α-아미노부틸산(이하, E성분으로 약기한다)을 포함하고 있어도 좋다.

상기 A~D의 성분은, 인간의 혈장중에 존재하는 아미노산 존재농도의 비율에 맞추어 분류한 것이고, A성분, B성분, C성분, D성분의 순서로 인간 혈장중의 아미노산의 존재농도가 낮아진다. 이 그룹 분류는, 인간 생체 시료중의 아미노산의 존재농도의 비율에 맞춘 것이지만, 보다 구체적으로는, 단순히 평균존재농도의 비율에 맞추는 것뿐만 아니고, (1) 존재농도의 중간치, 최대치 및 최소치 등을 고려하여, 존재농도의 최대치가 높은 아미노산에 대해서는 평균존재농도의 비율보다 높게 설정하고, 존재농도의 최소치가 낮은 아미노산에 대해서는 평균 존재농도의 비율보다 낮게 설정하며, (2) 아미노산의 농도 분포를 고려하여, 평균 존재농도보다 높은 농도에 많이 분포하고 있는 경우는 평균 존재농도의 비율보다 높게 설정하고, 평균 존재농도보다 낮은 농도에 많이 분포하고 있는 경우는 평균 존재농도의 비율보다 낮게 설정하며, 또는, (3) 이들 복수의 요소를 종합적으로 고려하여 설정하는 등에 의해 이루어진다. 구체적으로는, 예를 들면, 타우린의 경우, 단순히 평균 존재농도의 비율에 맞추면 그룹 C에 속하지만, 존재농도의 최대치가 높기 때문에, 그룹 C가 아닌 고농도의 그룹 B로 설정되는 것이 바람직하다. 또한, 이소류신의 경우, 단순히 평균 존재농도의 비율에 맞추면 그룹 C에 속하지만, 아미노산 분포에 의하면, 평균 존재농도보다 높은 농도에서 존재하는 경우가 많기 때문에, 그룹 C보다도 고농도의 그룹 B로 설정되는 것이 바람직하다.

또한, 인간의 혈장중에 존재하는 아미노산의 존재농도는, 다수의 검체를 이용하여 얻은 데이터를 바탕으로 구하면 좋지만, 검체수가 많으면 많을수록 높은 정밀도로, 보다 실제 인간 혈장중 농도를 반영한 바람직한 외부표준액이 된다. 본 발명의 외부표준액에서의 아미노산 농도비는, 6469 검체를 이용하여 산출된 것이고, 표준오차가 작은 뛰어난 것이다. 또한, 일반적으로, 표준 편차 σ, 요소(要素)수 N의 모집단으로부터 n개의 표본을 추출할 때, 표본 평균의 표준오차는,√((N-n)/(N-1))*(σ/√n)에 의해 추정되고, N이 충분히 큰 경우에는,σ/√n 에 의해 추정된다. 6469 검체로부터 농도 데이터를 산출했을 경우, 예를 들면 300 검체로부터 농도 데이터를 산출했을 경우와 비교하여, 표본 평균의 표준오차는 약 0.22배가 되고, 보다 표준오차가 작은 데이터를 얻을 수 있는 것으로 판명된다.

상기 A~D성분의 아미노산군의 구체적인 몰 농도비, 및 바람직한 몰 농도는, 이하의 표와 같이 된다. 또한, 표 중, 그룹 A를 1로 하였을 때의 몰 농도비 및 바람직한 몰 농도비에 대해서는, A성분이 1개인 경우에는, 그 아미노산을 1로 하였을 때의 몰 농도비이고, A성분이 복수 있는 경우에는 가장 저농도인 아미노산을 1로 하였을 때의 몰 농도비를 나타낸다. 또한, C성분의“단, 그룹 B의 1배 미만”이란, 본 발명의 외부표준액이 B성분을 포함하고, B성분이 1개인 경우에는 그 아미노산 농도의 1배 미만 농도, B성분이 복수인 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도가 되는 것을 나타낸다. D성분의“단, 그룹 B의 1배 미만이고 그룹 C의 1배 미만”이란, 본 발명의 외부표준액이 B성분을 포함하고, B성분이 1개인 경우에는 그 아미노산 농도의 1배 미만 농도, B성분이 복수인 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도이며, 또한, 본 발명의 외부표준액이 C성분을 포함하고, C성분이 1개인 경우에는 그 아미노산 농도의 1배 미만 농도, C성분이 복수인 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도가 되는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명의 외부표준액중 그룹A 성분의 농도는, 통상 0.0007M~0.49M이다. 하한은, 그룹A 성분 중에서 평균 농도+2SD가 가장 높은 글루타민인 767.7μM보다 농도가 높은 0.0008M 이상이 바람직하고, 그룹A 성분 중에서 최대 농도가 가장 높은 글루타민인 1276.9μM보다도 농도가 높은 0.0013M 이상이 보다 바람직하다. 상한은 0.1M 이하가 바람직하고, 0.05M 이하가 보다 바람직하다. 그룹 B~C는 그룹 A에 대한 몰 농도비가 상기 표의 범위가 되도록 설정되면 좋다.

또한, 본 발명의 외부표준액이 상기 E성분을 포함하는 경우, E성분의 농도는, 본 발명의 외부표준액이 B성분을 포함하는 경우에는, 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분을 포함하는 경우에는, 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, D성분을 포함하는 경우에는, 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도가 되도록 하여 설정되면 좋다.

본 발명의 외부표준액은, 보존시에는 A성분 및 B성분과, D성분 또는/및 E성분을 공존시키지 않는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 외부표준액으로서 A~E성분 모두를 포함하는 것을 사용하는 경우, A성분, B성분 및 C성분과 D성분 및 E성분으로 나누어 보존하고, 사용시에 필요량을 혼합하여 A~E성분 모두를 포함하는 외부표준액으로 조제하여 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 외부표준액에 포함되는 아미노산의 바람직한 구체적인 예로서는, 예를 들면, 발린과 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘, 트립토판 및 시트룰린 중 적어도 어느 1개를 포함하는 것을 들 수 있다. 그 중에서도, 발린과 류신 및 이소류신 중 적어도 1개를 포함하는 것이 바람직하고, 발린과 류신 및 이소류신 중 적어도 1개와, 페닐알라닌 및 티로신 중 적어도 1개를 포함하는 것이 보다 바람직하며, 발린과 류신 및 이소류신 중 적어도 1개와, 페닐알라닌 및 티로신 중 적어도 1개와, 히스티딘 및 트립토판 중 적어도 1개를 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 발린과 류신 및 이소류신 중 적어도 1개와, 페닐알라닌 및 티로신 중 적어도 1개와, 히스티딘 및 트립토판 중 적어도 1개와, 시트룰린을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

발린과 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘, 트립토판 및 시트룰린 중 적어도 어느 1개로부터 아미노산을 선택하여 외부표준액으로 하는 경우, 각각의 농도비 및 바람직한 농도비는 이하와 같다.

또한, 본 발명의 외부표준액이 적어도 발린을 포함하고, 또한, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘, 트립토판 및 시트룰린 중 적어도 어느 1개를 포함하는 것인 경우, 발린의 농도는 통상 0.0003M~0.49M이다. 하한은, 발린의 평균 농도+2SD인 341.4μM보다 농도가 높은 0.0004M 이상이 바람직하고, 발린의 최대 농도인 469.9μM보다 농도가 높은 0.0005M 이상이 보다 바람직하다. 상한은 0.1M 이하가 바람직하고, 0.05M 이하가 보다 바람직하다. 그 외의 아미노산에 대해서는, 상기 아미노산비가 되는 범위에서 적절하게 설정되면 좋다.

본 발명의 외부표준액의 조제방법

본 발명의 외부표준액은, 상기 아미노산을 상기 농도 범위내에서 상기의 농도비가 되도록, 물 또는 완충액 등에 용해하여 조제하면 좋다. 이러한 완충액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면 인산 완충액, 구연산 완충액, 붕산 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액 등의 트리스 완충액, N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신(Bicine) 완충액, 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄설폰산(HEPES) 완충액, 3-모르폴리노프로판설폰산(MOPS) 완충액, 초산 완충액, 탄산 완충액 등의 굿 완충액 등을 들 수 있다.

본 발명의 외부표준액은, 어느 특정의 아미노산 농도를 기준으로 하여 각 아미노산과의 농도 비율을 조제함으로써, 인간 혈장 시료중의 실제 아미노산 농도 밸런스에 맞추어 조제된다. 예를 들면, 인간 혈장 6469 검체를 종래의 표준물질을 이용하여 구한, 하기 실시예 1의 표 3에 나타나는 아미노산 농도의 기준치에 근거하여 조제할 수가 있다. 구체적으로는, 예를 들면 각 아미노산을 이용하여, 하기 표 1에 나타나는 것 같은 5단계의 농도 1~5의 외부표준물질을 조제하면 좋다. 또한, 하기 표 1에 나타내는 농도 1~5에서, 농도 3이 가장 혈장중의 평균 농도에 가까운 것이지만, 본 발명의 외부표준액으로서는, 표 1의 농도 1의 것만을 제공하여, 사용시에 이것을 적절히 희석하여 표 1의 농도 2~5의 것을 조제해서 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 외부표준액의 조제에서는, 표준액 보존시의 항에서 기재하듯이, 상기 A성분 및 B성분과, D성분 또는/및 E성분을 공존시키지 않는 것이 바람직하고, 미리 2개의 아미노산 혼합액으로서 조제하는 것이 바람직하다.

또한, 미리 조제한 2개의 아미노산 혼합액(1 및 2)과, 사전에 준비한 용액중에서 안정성이 낮은 아미노산을 혼합하고 조제하여, 최종적인 외부표준물질을 조제하는 것이 보다 바람직하다. 즉, 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 외부표준물질 용액은, 2개의 아미노산 혼합액 1 및 2와 사전 준비용 아미노산을 포함하여 이루어지는 키트에 의해 조제되는 것이 바람직하다. 보다 상세하게는, 아미노산 혼합액 1은, 혈장중에서 비교적 존재농도가 낮은 아미노산을 포함하는 것이고, 이들 아미노산의 구체적인 예는, β-AiBA, HyPro, Asp, α-AAA, Sar, δ-HyLys, EtOHNH₂, 3MeHis, 1MeHis, Ans, Car, GABA, α-ABA, Cit, Cys₂, Glu, Met 등이다. 아미노산 혼합액 2는, 혈장중에서 비교적 존재농도가 높은 아미노산을 포함하는 것이고, 아미노산의 구체적인 예는 Arg, Orn, Ile, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, Tau, His, Lys, Gly, Ala, Val 등이다. 또한, 사전 준비용 아미노산은 용액중에서 비교적 안정성이 낮은 아미노산이고, 구체적인 예로서는, Asn, Gln, Trp 등이다.

따라서, 본 발명의 외부표준물질은 이들 시약(즉, 아미노산 혼합액 1 및 2, 사전 준비용 아미노산)을 혼합하여 조제된다. 조제된 본 발명의 바람직한 외부표준물질의 조성은, 예를 들면, Asp, 3MeHis, EtONH₂, 1MeHis, HyPro, Sar, α-AAA, β-AiBA, δ-HyLys, GABA, Ans, Car 등을 각 0.02M, 예를 들면 α-ABA를 0.05M, Met, Cit, Glu, Cys₂를 각 0.1M, 예를 들면 Trp, Orn, Asn, Arg 등을 각 0.25M, 예를 들면, Phe, Tyr, Tau, His, Ile, Ser, Leu, Thr, Pro, Lys 등을 각 0.50M, 예를 들면, Val, Gly, Ala, Gln 등을 각 1.0M을 포함하여 이루어지는 것이다.

본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 외부표준물질

본원발명의 외부표준물질은, 일정량의 물 또는 완충액에 일정량을 용해함으로써, 상기 본 발명의 외부표준액이 되도록 각종 아미노산을 혼합한 것이면 좋고, 당해 아미노산은, 상기 외부표준액에서 설명한 것과 동일한 것을 들 수 있다. 또한, 당해 외부표준물질은, 본 발명의 외부표준액을 동결건조한 것 등이 바람직하다.

본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 내부표준액

본 발명의 내부표준액은, 검량선법을 이용하는 정량분석법에서 사용하는, 이른바 내부 표준이고, 구체적으로는, 주로 측정대상의 생체 시료중의 아미노산 존재농도의 비율과 검출감도 등을 고려하여, 표준물질(기준)로서의 복수의 아미노산 제품을 조제하여 혼합한 용액이며, 내부혼합표준액이라고도 한다.

본 발명의 내부표준액은, 1개 이상의 안정동위체로 표지(標識)된 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하지만, 생체 시료중의 아미노산의 특성에 맞추어 조제되는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들면, 아미노산의 존재농도, 협잡 성분의 존재, 검출 감도(특히, 액체 크로마토그래피-질량 분석계에 대한 검출 감도), 아미노산과 내부표준물질 피크의 겹침 상태, 또는, 이들 복수의 요소를 종합적으로 고려하여 내부표준물질에 첨가하는 아미노산의 종류, 내부표준물질의 농도, 및 안정동위체로 표지되는 원소를 결정하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 액체 크로마토그래피-질량 분석계에 대한 검출 감도가 좋은 프롤린에 대해서는, 인간 혈장 밸런스 아미노산 농도와 비교하여 내부표준농도를 낮게 설정하는 것이 바람직하고, 본 발명의 내부표준액에서 가장 저농도로 하는 것이 보다 바람직하다. 한편, 액체 크로마토그래피-질량 분석계에 대한 검출 감도가 나쁘고, 또한, 협잡 성분의 영향을 받기 쉬운 타우린과, 액체 크로마토그래피-질량 분석계에 대한 검출 감도가 나쁘며, 또한, 정점이 분열하여 측정 안정성이 좋지 않은 시스틴에 대해서는, 인간 혈장 밸런스 아미노산 농도와 비교하여 내부표준농도를 높게 설정하는 것이 바람직하고, 본 발명의 내부표준액에서 타우린의 내부표준농도를 가장 고농도로 하는 것이 보다 바람직하며, 타우린의 내부표준농도를 가장 고농도 및 시스틴의 내부표준농도를 타우린 다음으로 고농도로 하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 내부표준액에 있어서의, 1개 이상의 안정동위체로 표지된 아미노산으로서는, 프롤린, 글리신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 타우린, 이소류신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 오르니틴, 에탄올아민, 글루탐산, 3-메틸히스티딘, 세린, 히스티딘 및 아르기닌, 사르코신, 알라닌, γ아미노낙산, β-아미노이소부틸산, α-아미노부틸산, 스레오닌, 히드록시프롤린, 류신, 아스파라긴산, 글루타민, 리신, α-아미노아디핀산, δ-히드록시리신, 1-메틸히스티딘, 시트룰린, 카르노신, 안세린, 시스틴 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 적어도 프롤린, 글리신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 티로신 및 타우린을 포함하는 것이 바람직하고, 적어도 프롤린, 글리신, 발린, 메티오닌, 트립토판, 티로신, 타우린, 이소류신, 페닐알라닌 및 아스파라긴을 포함하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 내부표준액에 있어서의 안정동위체로서는, 예를 들면 ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O 등을 들 수 있고, ¹³C, ¹⁵N 등이 바람직하다.

1개 이상의 안정동위체로 표지된 아미노산은, 비표지체 아미노산과의 질량차이가 3이상인 것이 바람직하다. 비표지체 아미노산에 대하여, 안정동위체에 의해 3개 이상의 질량차이가 되도록 표지함으로써, 비표지체중의 동위체의 천연존재비에 의한 영향이 적어지고, 보다 고정밀도의 분석을 얻을 수 있다. 예를 들면, 알라닌(분자식；C₃H₇NO₂, 분자량 88)에 있어서의 천연동위체의 분포는 분자량 88(95.8%), 89(3.74%), 90(0.34%), 91(0.02%)이고, 질량차이를 3이상으로 함으로써 천연동위체의 영향은 거의 없어진다.

1개 이상의 안정동위체로 표지된 아미노산의 구체적인 예로서는, 예를 들면 Pro-U¹³C₅, ¹⁵N, Gly-U¹³C₂, ¹⁵N, Val-U¹³C₅, ¹⁵N, Met-U¹³C₅, ¹⁵N, Trp-U¹³C₁₁, ¹⁵N₂ _, Tyr-Ring-¹³C₆, Tau-U¹³C₂, Ile-U¹³C₆, ¹⁵N, Phe-U¹³C₉, ¹⁵N, Asn-U¹³C₄, ¹⁵N₂, Orn-U¹³C₅ _, EtONH₂-1, 1, 2, 2-d₄, Glu-U¹³C₅, 3MeHis-methyl-d_3, Ser-U¹³C₃, ¹⁵N, His-U¹³C₆, ¹⁵N₃, Arg-U¹⁵N₄ 등을 들 수 있다.

본 발명의 내부표준액에 있어서의, 1개 이상의 안정동위체로 표지된 아미노산의 농도는 통상 10~300μM이다. 각 아미노산의 농도에 대해서는, 프롤린은 모든 아미노산 농도보다도 낮게 하는 것이 바람직하고, 타우린은 모든 아미노산 농도보다도 높게 하며 또한, 프롤린은 모든 아미노산 농도보다 낮게 하는 것이 보다 바람직하다. 보다 구체적으로는, 타우린＞에탄올아민, 글루탐산, 3-메틸히스티딘, 세린, 히스티딘, 아르기닌, 티로신＞아스파라긴＞이소류신, 오르니틴, 페닐알라닌, 트립토판＞글리신, 발린, 메티오닌＞프롤린의 순서로 농도가 낮아지도록 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 내부표준액의 조제방법

본 발명의 내부표준물질은, 생체시료중의 아미노산 특성에 맞추어, 상기와 같이 1개 이상의 안정동위체로 표지된 아미노산을 상기 농도 범위가 되도록, 물 또는 완충액 등에 용해하여 조제된다. 구체적으로는, 하기 실시예 표3의 아미노산 농도에 관한 기준치 등에 근거하여 조제할 수가 있다. 또한, 상기 완충액은 상기 본 발명의 외부표준액과 같은 것을 들 수 있다.

본 발명의 혈장중 아미노산 분석용 내부표준물질

본원 발명의 내부표준물질은, 일정량의 물 또는 완충액에 일정량을 용해함으로써, 상기 본 발명의 내부표준액이 되도록 각종 아미노산을 혼합한 것이면 좋고, 당해 아미노산은 상기 내부표준액에서 말한 것과 같은 것을 들 수 있다. 또한, 당해 내부표준물질은 본 발명의 내부표준액을 동결건조한 것 등이 바람직하다.

본 발명의 혈장중 아미노산의 정량방법

일반적으로, 검량선법을 이용하는 정량분석법에는, 외부표준법(즉, 본 발명의 외부표준액 또는 외부표준물질을 이용하는 방법)과 내부표준법 등이 있다. 본 발명의 정량방법에서는, 외부표준만이 아니고, 검체내에서 검체와 같이 움직이는 표준물질(즉, 본 발명의 내부표준액 또는 내부표준물질)을 미리 검체시료에 첨가해 두면, 정량의 정밀도를 높이는 것이 가능해진다. 즉, 본원 발명에서는, 외부표준액 또는 외부표준물질을 이용한 방법, 또는, 내부표준액 또는 내부표준물질을 이용한 방법만으로 실시하는 것도 가능하지만, 양쪽 모두를 합쳐 이용함으로써, 보다 정밀도 높은 정량분석을 실시할 수가 있다.

본 발명에 있어서의, 외부표준액 또는 외부표준물질을 이용하는 아미노산의 정량방법으로서는, 자체 공지의 검량선법에 따라 행하여지면 좋지만, 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 외부표준액(혹은 외부표준물질을 물 등에 용해한 것)의 2배 희석액, 4배 희석액, 10배 희석액 및 20배 희석액을 조제하고, 원액과 이들 희석액을 적당한 분석법으로 측정하여, 정점의 면적 또는 정점의 높이와 농도의 관계를 나타낸 검량선을 제작한다. 그 후, 예를 들면 인간 혈장을 이용하여 측정대상인 아미노산을 측정하고, 얻어진 정점의 면적 또는 정점의 높이를, 상기 검량선에 적용시켜 농도를 산출함으로써 행하여진다. 상기 분석 방법으로서는, 통상 이 분야 에서 이루어지는 분석 방법이면 좋지만, 구체적으로는 예를 들면, 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS), 액체 크로마토그래피-질량분석-질량분석(LC-MS-MS), 액체 크로마토그래피-형광분석, 액체 크로마토그래피-UV검출 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 질량 분석계를 이용한 LC-MS, LC-MS-MS 등이 바람직하다. 이들 분석의 조건에 대해서는, 자체 공지의 방법에 준하여 이루어지면 좋다.

또한, 대부분의 아미노산은 흡수, 형광성 및 전기 화학적 응답이 매우 약하기 때문에, 분석 조건에 따라서 아미노산의 아미노기를 표지하고 분석을 실시하는 것이 바람직하다. 이 경우, 보다 고감도이고 높은 선택성을 발휘할 수 있는 표지 시약을 이용하는 것이 바람직하고, 당해 표지 시약으로서는, 구체적으로 예를 들면, 특허문헌 1에 기재된 카바메이트 화합물을 들 수 있으며, 그 중에서도 3－아미노피리딜-N－히드록시숙신이미딜카바메이트(APDS)가 바람직하다.

본 발명에 있어서의, 내부표준액 또는 내부표준물질을 이용하는 아미노산의 정량방법으로서는, 자체 공지의 내부표준을 이용하는 방법에 따라 행하여지면 좋지만, 구체적으로는 예를 들면, 내부표준액(혹은 내부표준물질을 물 등에 용해한 것)을 검체, 예를 들면 인간 혈장중에 첨가하고, 이것을 이용하여 측정대상인 아미노산과 내부표준액중의 안정동위체로 표지된 아미노산을, 상기 외부표준액을 이용하는 정량방법으로 기재되어 있는 방법 등으로 측정한다. 얻어진 측정대상인 아미노산의 정점의 면적 또는 정점의 높이와, 안정동위체로 표지된 아미노산의 정점의 면적 또는 정점의 높이로부터 그 비를 구하고, 그 값을 바탕으로 조제시나 시료 주입시의 오차 등을 보정하며, 측정대상인 아미노산 농도를 산출하여 행하여진다.

이하에, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 예시로 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실험예 1 혈장 밸런스 아미노산 농도의 결정

(1) 검체

혈장 밸런스 아미노산 농도를 구하기 위한 검체로서, 6469 인간 혈장 검체를 사용하였다.

(2) 외부표준액

시판품인 아미노산 혼합 표준 용액 H형과 B형(와코쥰야꾸공업(주) 제)에, 하기 표 중의 농도가 되도록, 하기 표 중의 각종 아미노산을 더하고, 상기 인간 혈장 검체에 첨가하기 위한 외부표준액 7종을 조제하였다. 표 중의 농도는 조제 후의 농도를 나타낸다.

(3) 내부표준액

하기의 안정동위체로 표지한 아미노산을, 아지노모토(주) 및 Cambridge Isotope Laboratories, Isotec로부터 입수하고, Gln-U¹³C₅, ¹⁵N₂(100μM), Arg-U¹⁵N₄(100μM), His-U¹⁵N₃(100μM)(일부는 His-U¹³C₆, ¹⁵N₃(100μM)), Glu-U¹³C₅, ¹⁵N(200μM), Ser-U¹³C₃, ¹⁵N(100μM), Gly-2,2-d2₂(50μM), Ala-3,3,3-d₃(80μM), Leu-5,5,5-d₃(80μM), Lys-4,4,5,5-d₄(100μM), Val-2,3,4,4,4,5,5,5-d₅(25μM), Met-methyl-d₃(25μM), Pro-d₇(100μM), Trp-U¹³C₁₁, ¹⁵N₂(100μM), Phe-phenyl-d₅(100μM), Orn-U¹³C₅(80μM) 및 Cit-4,4,5,5-d₄(100μM)를 함유하는 내부표준액을 조제하였다.

(4) 검체의 사전 처리

상기 내부표준액 50μL에 상기 검체 50μL를 더하여 잘 섞은 후, 아세토니트릴 100μL를 더하여 더욱 잘 섞었다. 당해 용액을 미량 고속 냉각 원심기로 원심분리한 후, 상청 획분을 추출하였다.

(5) 전치칼럼(pre-column) 유도체화

얻어진 상청 획분, 표지 시약(3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약)을 이용하여, 전치칼럼 유도체화를 실시하였다. 구체적으로는, 200mM 붕산 완충액(pH8.8) 12μL에 상청 획분 4μL를 첨가하여 잘 섞고, 또한 3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약(20mg을 아세트니트릴 1mL에 용해한 것) 4μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 55℃에서 5분간 가온하였다. 그 다음, 당해 용액에 25mM 개미산 암모니아 수용액(pH6.0) 60μL와 0.1% 개미산 수용액 20μL를 더하여 잘 혼합한 것을, 고속 액체 크로마토그래피-질량 분석의 분석용 시료로 하였다.

(6) 고속 액체 크로마토그래피-질량 분석 장치에서의 분석

하기 조건으로 분석을 실시하였다.

고속 액체 크로마토그래피：L-2100 시리즈(히타치 하이테크노로지즈)

분석 컬럼　　：Wakosil-II 3C8-100HG(와코쥰야꾸공업)

가드 컬럼　　：Wakosil-II 3C8-100HG(와코쥰야꾸공업)

이동상：이동상A：25mM 개미산(pH를 암모니아수에서 6.0으로 조제)

　　　　이동상B：아세트니트릴/물(6：4(v/v))

컬럼 온도　　　：40℃

시료 주입량　　：5μL

질량분석장치 ： Thermo Scientific Surveyor MSQ Plus (Thermo Fisher Scientific)

모니터 이온：

EtONH2：182,　Gly：196,　Ala：210,　Sar：210,　GABA：224,　β-AiBA：224, α-ABA：224,　Ser：226,　Pro：236,　Val：238,　Thr：240,　Tau：246,　HyPro：252,　Ile：252,　Leu：252,　Asn：253,　Asp：254,　Gln：267,　Glu：268,　Met：270,　His：276,　α-AAA：282, Phe：286,　1MeHis：290,　3MeHis：290,　Arg：295,　Cit：296,　Tyr：302,　Trp：325,　Car：347,　Ans：361,　Orn：373,　Lys：387,　δ-HyLys：403, Cys₂：481

(7) 검량선의 제작

외부표준액에 대해서는 표2의 농도 1~7의 7점 중 5점 이상(정확성이 ±15%(하한은 ±20%)의 범위내에서 벗어나는 점에 대해서는 제외)을 이용하며, 원점을 지나지 않고, 중요도를 평가하는 데에는 1/x를 이용하였다.

이상으로부터, 고속 액체 크로마토그래피-질량분석장치의 결과를, 검량선에 적용시켜 6469 검체의 아미노산 농도(혈장 밸런스 아미노산 농도)를 산출하였다. 그 평균 농도, 최대 농도, 최소 농도, 표준 편차를 하기 표 3에 나타낸다. 또한, 그 그래프를 도 1에 나타낸다.

실시예 1 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합물질 함유용액)의 조제

각종 아미노산 제품(EtONH₂, Gly, Sar, Ala, GABA, β-AiBA, α-ABA, Ser, Pro, Val, Thr, Tau, Hypro, Leu, Ile, Orn, Asp, Lys, Glu, Met, His, α-AAA, δ-HyLys, Phe, 1MeHis, 3MeHis, Arg, Cit, Tyr, Car, Ans, Cys₂, 이상, 와코쥰야꾸공업(주) 제)을 이용하여, 혈장중의 아미노산 농도 비율［즉, 실험예 1에서 결정한 인간 혈장 밸런스 아미노산 농도(표 3 및 도 1 참조)］및 아미노산의 안정성을 가미하고, 하기 아미노산 혼합액 1 및 2를 조제하였다.

아미노산 혼합액 1：

β-AiBA, HyPro, Asp, α-AAA, Sar, δ-HyLys, EtONH₂, 3MeHis, 1MeHis, Ans, Car 및 GABA를 200μM, α-ABA를 500μM, Cit, Cys₂, Glu 및 Met를 1000μM 함유하는 수용액

아미노산 혼합액 2：

Arg 및 Orn를 2500μM, Ile, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, Tau, His 및 Lys를 5000μM, Gly, Ala, 및 Val를 10000μM 함유하는 수용액

그 후, 아미노산 혼합용액 1, 2 및 사전 준비한 Asn, Gln 및 Trp(시그마사제)를 혼합하고, 이하에 나타내는 조성으로 아미노산을 혼합한 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)을 조제하였다.

Asp, 3MeHis, EtONH2, 1MeHis, HyPro, Sar, α-AAA, β-AiBA, δ-HyLys, GABA, Ans 및 Car를 20μM, α-ABA를 50μM, Met, Cit, Glu 및 Cys₂를 100μM, Trp, Orn, Asn 및 Arg를 250μM, Phe, Tyr, Tau, His, Ile, Ser, Leu, Thr, Pro 및 Lys를 500μM, Val, Gly, Ala 및 Gln를 1000μM 함유.

하기의 표 4는, 상기 결과로부터 조제한 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)의 내용을 나타낸다. 또한, 농도 1과 농도 5에 대한 그래프를 도 1에 나타낸다.

비교예 1 종래품으로서의 외부표준액

실시예 1의 본 발명의 외부표준액의 비교 대조로서, 상기 아미노산 혼합액 1 및 2 대신, 아미노산 혼합표준액 Type B(와코쥰야꾸공업(주) 제) 및 아미노산 혼합표준액 Type ANII(와코쥰야꾸공업(주) 제)를 이용하여, 아미노산 혼합표준액을 조제하였다.

하기 표 4에는, 상기 본 발명의 외부표준액과 더불어, 당해 아미노산 혼합표준액의 내용을 나타낸다. 또한, 농도 1＇과 농도 5＇에 대한 그래프를 도 1에 나타낸다.

실시예 2 본 발명의 내부표준액의 조제

하기 안정동위체로 표지한 아미노산을, 아지노모토(주), Cambridge Isotope Laboratories, Isotec로부터 입수하여, Gln-U¹³C₅, ¹⁵N₂(100μM), Arg-U¹⁵N₄(100μM), His-U¹³C₆, ¹⁵N₃(100μM), Glu-U¹³C₅, ¹⁵N(100μM), Ser-U¹³C₃, ¹⁵N(100μM), Gly-U¹³C₂, ¹⁵N(50μM), Ala-3,3,3-d₃(100μM), Leu-5,5,5-d₃(80μM), Lys-U¹³C₆, ¹⁵N₂(130μM), Val-U¹³C₅, ¹⁵N(50μM), Met-U¹³C₅, ¹⁵N(50μM), Pro-U¹³C₅, ¹⁵N(25μM), Trp-U¹³C₁₁, ¹⁵N₂(80μM), Phe-U¹³C₉, ¹⁵N(80μM), Orn-U¹³C₅(80μM), Cit-4,4,5,5-d₄(100μM), Thr-U¹³C₄(100μM), Tyr-Ring-¹³C₆(100μM), Tau-U¹³C₂(250μM), Ile-U¹³C₆, ¹⁵N(80μM), Asn-U¹³C₄, ¹⁵N₂(90μM), 3MeHis-methyl-d₃(100μM), Asp-2,3,3-d₃(100μM), Cys₂-3, 3,3',3'-d₄(200μM) 및 EtONH₂-1,1,2,2-d₄(100μM)를 함유하는 내부표준액을 조제하였다.

비교 대조로서 비특허문헌 4에 기재된 내부표준액을 조정하여, 실시예 2에 대한 비교예로서의 내부표준액(종래의 내부표준액)으로 하였다.

하기 표 5는, 상기 내부표준액(본 발명의 내부표준액) 또는 비교예의 내부표준액(종래의 내부표준액)을 이용하여 인간 혈장중의 각종 아미노산 농도를 측정할 때의, 각종 아미노산에 대한 내부표준액을 나타낸다. 표 중, 테두리 내에 회색을 칠한 것은 내부표준액으로서, 그것 자체의 안정동위체가 이용되지 않는 아미노산임을 나타낸다. 이들 회색을 칠한 테두리 내의 아미노산에 대해서는, 안정동위체로 표지되지 않은 아미노산과의 유지시간의 근접, 화합물의 물성, 첨가회수(回收)시험의 결과 등을 고려하여, 여러 가지 안정동위체로 표지된 아미노산 중에서 최적인 것을 선정하였다.

실시예 3 본 발명의 외부표준액을 이용한 아미노산의 정량분석

(1) 생체시료의 조제

생체시료로서 정상인 자원봉사자 5명의 채혈을 실시하고, 혈장 분리 후에 혈장을 혼합하여, 혼주혈장(pooled plasma)으로 하였다.

(2) 기지 농도 아미노산 첨가 혈장 및 표준혈장(control plasma)의 조제

얻어진 혼주혈장과 하기 표 6에 기재된 기지 농도의 아미노산 혼합 용액을 1：1로 혼합한 검체를 기지 농도 아미노산 첨가 혈장으로 하고, 얻어진 혼주혈장과 물을 1：1로 혼합한 검체를 표준혈장으로 하였다.

(3) 검체의 사전 처리

상기 기지 농도의 아미노산 첨가 혈장 또는 표준혈장 50μL에, 실시예 2의 내부표준액 50μL를 첨가한 후, 잘 섞어서 아세트니트릴 100μL를 더하여 잘 섞었다.

그 다음, 각각을 미량 고속냉각원심기로 원심분리한 후, 얻어진 상청 획분을 분석에 이용하였다.

(4) 전치칼럼 유도체화

얻어진 상청 획분, 표지시약(3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약)을 이용하여, 전치칼럼 유도체화를 실시하였다. 구체적으로는, 200mM 붕산 완충액(pH8.8) 60μL에, 상청 획분 20μL를 첨가하여 잘 섞었다. 또한, 3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약(20mg을 아세트니트릴 1mL에 용해한 것) 20μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 55℃에서 10분간 가온하였다. 그 다음, 당해 용액을 실온에서 방랭한 후, 0.1% 개미산 수용액을 100μL 첨가하고 잘 혼합한 것을, 고속 액체 크로마토그래피-질량 분석의 분석용 시료로 하였다.

(5) 고속 액체 크로마토그래피-질량분석장치에서의 분석

하기 조건으로 분석을 실시하였다.

고속 액체 크로마토그래피：10 Avp 시리즈(시마즈 제작소)

분석 컬럼：Inartsil C8-3(디엘사이언스)

가드 컬럼：Inartsil ODS-3(디엘사이언스)

　　　　이동상B：아세트니트릴/물(6：4(v/v))

컬럼 온도：40℃

시료 주입량：3μL

질량분석장치：API3000 LC/MS/MS 시스템(AB SCIEX)

모니터 이온(Q1/Q3)：

EtONH₂：182/121,　Gly：196/121,　Ala：210/121,　Sar：210/121,　GABA：224/121,　β-AiBA：224/121, α-ABA：224/121, Ser：226/121,　Pro：236/121,　Val：238/121, Thr：240/121,　Tau：246/121,　HyPro：252/121, Ile：252/121,　Leu：252/121,　Asn：253/121,　Asp：254/121,　Gln：267/121,　Glu：268/121, Met：270/121,　His：276/121,　α-AAA：282/121,　Phe：286/121, 1MeHis：290/121,　3MeHis：290/121,　Arg：295/121,　Cit：296/121,　Tyr：302/121,　Trp：325/121, Car：347/121,　Ans：361/121,　Orn：373/121,　Lys：387/121,　δ-HyLys：403/121,　Cys₂：481/121

(6) 검량선의 제작

실시예 1의 외부표준액을 이용하여, 상기 기지 농도의 아미노산 첨가 혈장과 마찬가지로, 상기(4)의 유도체화 처리를 실시하여 (5)의 분석을 실시하였다. 그 분석결과로부터, 상한 농도와 하한 농도의 차이를 20배로 한 검량선을 제작하였다. 외부표준액으로서는, 표 4의 농도 1~5(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)의 5점을 이용하여, 원점을 지나지 않고, 중요도의 평가에는 1/x를 이용하였다.

(7) 혈장중으로의 아미노산 첨가 회수

기지 농도의 아미노산 첨가 혈장의 측정결과로부터, 첨가 회수율을 구하였다. 첨가 회수율은 이하와 같이 산출하였다.

첨가 회수율=｛(기지 농도의 아미노산 첨가 혈장중 아미노산 농도)-(표준혈장중 아미노산 농도)｝×2÷첨가 기지 농도의 아미노산(%)

또한, 각 농도는 피크 면적비｛(각 성분의 피크 면적)÷(내부표준액의 피크 면적)｝를 구하고, 상술한 검량선을 이용하여 산출하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 여기서, 실시예의 첨가 회수율은, 실시예 1의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)을 이용하여 제작한 검량선을 바탕으로 계산한 값이다.

비교예 2 비교예 1의 외부표준액을 이용한 아미노산의 정량분석

실시예 3의 (6)에서, 외부표준액으로서 표 4의 농도 1＇~5＇(종래의 아미노산 혼합표준액)의 5점을 이용한 것 외에는, 실시예 3과 같은 방법으로, 인간 혈장중에 아미노산을 첨가했을 때의 첨가 회수율을 구하였다. 그 결과를 실시예 3의 결과와 함께 표 6에 나타낸다. 표 중, 비교예의 첨가 회수율은, 비교 대조로서 조제한 외부표준액(종래의 아미노산 혼합표준액)을 이용하여 제작한 검량선을 바탕으로 계산한 값이다.

실시예 1에서 조제한 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)을 이용한 경우, 표준품으로서 이용한 35종 화합물의 회수율은, 80~111%이었지만, 비교예의 외부표준액(종래품인 아미노산 혼합표준액)을 이용한 경우, 0~392%ㅇ였. 즉, 비교예의 외부표준액(종래품인 아미노산 혼합표준액)을 이용하여, 하한 농도가 상한 농도의 20배 희석이 되는 범위에서 5점의 검량점으로 검량선을 제작한 경우에는, 정량치가 검량선 범위 외인 화합물도 많고 정밀도가 부족한 결과였다. 바꾸어 말하면, 비교예의 외부표준액(종래품인 아미노산 혼합표준액)을 이용하여, 각종 아미노산을 검량선의 범위 내로 하기 위해서는, 상한 농도에 대한 하한 농도의 희석 배율을 늘림과 동시에 검량점을 늘릴(예를 들면 1000배 농도에서 10검량점 등) 필요가 있다는 것을 알았다.

한편, 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)을 이용하여 검량선을 제작한 경우, 최저 농도가 최고 농도의 20배 희석이 되는 범위이고, 또한 검량점이 5점 있어도, 각종 아미노산 농도는 검량선의 범위내에 들어가기 때문에, 각종 아미노산을 정밀도 좋게 측정할 수 있다는 것을 알았다. 따라서, 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)은 생체시료중의 아미노산 측정에서 매우 유용하다는 것을 알았다.

실시예 4 본 발명의 내부표준액을 이용한 외부표준액중의 아미노산 정량분석

(1) 본 발명의 내부표준액 및 외부표준액

실시예 2에서 조제한 본 발명의 내부표준액(표 5 중 실시예 2)을 내부표준으로 하여 이용하였다. 또한, 비교예로서 실시예 2에서 조제한 종래의 내부표준액(표 5 중 비교예)을 내부표준으로 하여 이용하였다.

또한, 실시예 1에서 얻어진 표 4 농도 1의 본 발명의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액)을, 차례대로 5/4배, 5/3배, 2배, 5/2배, 10/3배, 5배, 10배, 20배, 40배까지 단계적으로 희석하고, 측정용 아미노산으로서 10 농도를 조제하였다.

실시예 1의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액) 75μL에 대해서, 실시예 2의 본 발명의 내부표준액 75μL를 첨가한 후에 잘 섞고, 아세트니트릴 150μL를 더하여 잘 섞었다. 마찬가지로, 실시예 1의 외부표준액(혈장 밸런스 아미노산 혼합표준액) 75μL에 대해서, 실시예 2의 종래의 내부표준액 75μL를 첨가한 후에 잘 섞고, 아세트니트릴 150μL를 더하여 잘 섞었다.

(2) 전치칼럼 유도체

3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약을 이용하여 전치칼럼 유도체화를 실시하였다. 200mM 붕산 완충액(pH8.8) 185μL에, 상기(1)의 본 발명의 내부표준액을 포함하는 용액 중에서 10μL를 첨가하여 잘 섞었다. 또한, 3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약(20mg을 아세트니트릴 1mL에 용해한 것) 5μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 60℃에서 5분간 가온한 것을 분석용 시료로 하였다. 마찬가지로, 200mM 붕산 완충액(pH8.8) 185μL에, 상기(1)의 종래의 내부표준액을 포함한 용액 중에서 10μL를 첨가하여 잘 섞었다. 또한, 3-아미노피리딜-N-히드록시숙신이미딜카바메이트 시약 5μL를 첨가하여 잘 혼합한 후, 60℃에서 5분간 가온하고, 이것을 비교예로서의 분석용 시료로 하였다.

(3) 고속 액체 크로마토그래피-질량분석장치에서의 분석

상기 분석용 시료를 각각 하기 조건으로 분석하였다.

고속 액체 크로마토그래피：20A 시리즈(시마즈 제작소)

분석 컬럼：Inertsil ODS-3(디엘사이언스)

전치필터：0.5μm 디스크, 전치필터용(시마즈 제작소)

이동상：이동상A ：25mM 개미산(pH를 암모니아수에서 6.0으로 조제)

　　　　이동상B ：아세트니트릴

컬럼 온도：40℃

시료 주입량：5μL

질량분석장치：LCMS2020(시마즈 제작소)

모니터 이온：

EtONH₂：182, Gly：196, Ala：210, Sar：210, GABA：224, β-AiBA：224, α-ABA：224, Ser：226, Pro：236, Val：238, Thr：240, Tau：246, HyPro：252, Ile：252, Leu：252, Asn：253, Asp：254, Gln：267, Glu：268, Met：270, His：276, α-AAA：282, Phe：286, 1MeHis：290, 3MeHis：290, Arg：295, Cit：296, Tyr：302, Trp：325, Car：347, Ans：361, Orn：373, Lys：387, δ-HyLys：403, Cys₂：481

측정 후, 얻어진 측정 결과를 이용하여, 규격화한 응답 계수를 산출하였다. 즉, 정점의 면적비를 농도치로 나누어 응답 계수를 산출하고, 농도 8의 응답 계수를 1.0으로 하여 규격화하였다.

하기 표 7은, 본 발명의 내부표준액을 이용한 결과로부터 얻은 응답 계수를, 표 8은 종래의 내부표준액을 이용한 결과로부터 얻은 응답 계수를 나타낸다. 또한, 표 7 및 표 8은 내부표준액이 다른 아미노산에 대해서만 기재한다.

또한, 상기 결과에 근거하여, 실시예와 비교예에서 직선성에 차이가 보인 것에 대해서는, 표 중 테두리 내에 회색을 칠하였고(회색：표 3에 나타낸 인간 혈장중 아미노산의 최소 농도~최대 농도에 해당하는 농도 범위), 아미노산 약호의 옆에, 각각 ◎：회색 부분에서 실시예와 비교예의 차이가 0.3보다 큰 것, ○：차이가 0.2~0.3인 것, △：차이가 0.1~0.2인 것, ▲：차이가 0.1 미만인 것을 표현하였다. 또한, 이러한 차이가 보이는 것 중에서, 표지된 원소가 다른 것을 나타내고, **에 대해서는 차이가 보이는 것 중에서, 다른 아미노산의 안정동위체를 사용하고 있는 것을 나타낸다.

본 발명의 내부표준액을 이용하면, 종래의 내부표준액과 비교하여 Asn, Gly, Tau, Pro, Tyr, Val, Met, Ile, Phe, Trp의 직선성은 개선되고 있음을 알았다. 즉, 본 발명의 내부표준액은 넓은 농도범위에서 정량성을 담보할 수 있고, 생체시료중의 아미노산 측정에서 매우 유용하다는 것이 시사되었다. 또한, 인간 혈장중 아미노산의 농도 범위(표 중 회색 부분)에서는, 종래의 내부표준액과 비교하여 특히, Gly, Tau, Pro, Tyr, Val, Met, Trp에서 직선성이 개선되고, 그 중에서도 특히, Tau, Pro에서 직선성이 개선되고 있음을 알았다.

상기 각 실시형태를 조합하여, 또는 당업자에게 공지의 방법으로 여러 가지의 변경을 가한 그 외의 실시형태 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은, 혈장중 아미노산의 정량분석에서, 분석대상으로 하는 아미노산 존재농도의 비율에 맞춘 외부표준액, 및 당해 외부표준액을 이용한 아미노산의 정량방법을 제공하는 것이다. 이에 따라, 검량선 제작의 검량점을 줄일 수 있음과 동시에, 분석대상으로 하는 아미노산의 농도 범위를 좁힐 수가 있고, 보다 정밀도 좋은 아미노산의 정량분석이 가능해진다. 따라서, 본 발명은 종래 기술과 비교하여 현저한 효과를 나타내고 매우 유용한 것이다.

도 1중, －□－은 실험예 1에서 측정한 6469 검체의 각종 아미노산의 평균 농도를 나타내고, --◆--는 실험예 1에서 측정한 각종 아미노산의 평균 농도＋2SD(표준편차)를 나타내며, --▲--는 실험예 1에서 측정한 각종 아미노산의 평균 농도-2SD(표준편차)를 나타내고, －◇－는 실시예 1에서 조제한 본 발명의 외부표준액(농도 1)을 나타내며, －△－는 실시예 1에서 조제한 본 발명의 외부표준액(농도 5)을 나타내고, －*－는 비교예 1에서 조제한 종래의 아미노산 혼합표준액(농도 1＇)을 나타내며, －○－는 비교예 1에서 조제한 종래의 아미노산 혼합표준액(농도 5＇)을 각각 나타낸다. 또한, 상하로 연장되는 막대는 6469 검체의 아미노산을 측정했을 때의 최대치와 최소치를 나타낸다.

Claims

(1) 하기 A성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 0.0007M~0.49M, 및
(2) 하기 B성분으로부터 선택되고, 적어도 이소류신을 포함하는 하나 이상의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.2~0.9배 농도, 및
(3) 하기 C성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.1~0.4배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또는
(4) 하기 D성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.05~0.2배 농도, 또한, B성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분을 포함하는 경우에는 그 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액；
［A성분］
발린, 글리신, 알라닌 및 글루타민
［B성분］
세린, 프롤린, 스레오닌, 타우린, 류신, 이소류신, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌 및 티로신
［C성분］아스파라긴, 오르니틴, 아르기닌 및 트립토판
［D성분］글루탐산, 메티오닌, 시트룰린 및 시스틴.
제1항에 있어서,
(1) A성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 0.0007M~0.49M,
(2) B성분으로부터 선택되고, 적어도 이소류신을 포함하는 하나 이상의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.2~0.9배 농도, 및
(3) C성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.1~0.4배 농도, 또한, B성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제2항에 있어서,
추가적으로 (4) D성분으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을, 하나당 A성분으로부터 선택되는 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 0.05~0.2배 농도, B성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도, 또한, C성분의 아미노산 중 가장 저농도인 아미노산의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
발린 및 이소류신과, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘, 트립토판, 및 시트룰린 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고,
발린을 0.0003M~0.49M, 이소류신을 발린의 0.05~0.7배 농도, 류신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~1배 미만 농도, 페닐알라닌을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 티로신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.7배 농도, 히스티딘을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.8배 농도, 트립토판을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 또한, 류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 히스티딘을 포함하는 경우에는 이들의 1배 미만 농도, 시트룰린을 포함하는 경우에는 발린의 0.01~0.3배 농도, 또한, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판을 포함하는 경우에는 이들의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제4항에 있어서,
발린, 류신 및 이소류신을 포함하여 이루어지고,
발린을 0.0003M~0.49M 함유하며, 류신을 발린의 0.1~1배 미만 농도, 이소류신을 발린의 0.05~0.7배 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제5항에 있어서,
추가적으로 페닐알라닌 및 티로신 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고,
페닐알라닌을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 티로신을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.7배 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제6항에 있어서,
추가적으로 히스티딘 및 트립토판 중 적어도 1개를 포함하여 이루어지고,
히스티딘을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.8배 농도, 트립토판을 포함하는 경우에는 발린의 0.1~0.6배 농도, 또한, 류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 히스티딘을 포함하는 경우에는 이들의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제7항에 있어서,
추가적으로 시트룰린을 포함하여 이루어지고,
시트룰린을 발린의 0.01~0.3배 농도, 또한, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판을 포함하는 경우에는 이들의 1배 미만 농도를 함유하는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
혈장중 아미노산 분석용 외부표준액이 혈장중 아미노산의 분리분석 측정법용인 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제9항에 있어서,
상기 분리분석 측정법이 액체 크로마토그래피 질량 분석계를 이용하는 분석 방법인 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액.
제1항에 기재된 혈장중 아미노산 분석용 외부표준액을 동결건조하여 얻어지는 혈장중 아미노산 분석용 외부표준물질.
제1항에 기재된 외부표준액을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈장중 아미노산의 정량방법.
제12항에 있어서,
질량 분석계에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 혈장중 아미노산의 정량방법.