KR20190014344A - 사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이 균주 - Google Patents

사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)에 관한 것으로서, 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주는 수크로스 또는 락토오스 분해능이 우수한 균주로서, 유청 발효능도 우수한 것으로 나타났다.또한 가스생성능이 우수하여 제빵 제조 및 식품 소재 개발을 위한 발효종균으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이 균주{Kazachstania servazzii strain with high sugar degrading activity and gas producing activity isolated from apple pickle solution}
사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)에 관한 것이다.
효모는 일부 병원성 균을 제외하고 대부분이 전통 발효 식품의 제조에 오래 전부터 사용되어오고 있는 GRAS 균이며, 최근 산업용 효소와 다양한 생리기능성 물질생산 및 생명공학분야의 중요한 숙주로 이용되고 있는 유용 미생물이다.
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii)는 처음에는 사카로마이세스 세르바지이(Saccharomyces servazzii)로 명명되었으나, 1971년 카자흐스탄(kazakhstan)에서 발효된 포도로부터 분리된 균인 카자크스타니아 비티콜라(Kazachstania viticola)로 인해 Saccharomycetaceae 과에 속해 있던 Kazachstania 속이 처음으로 단일 종으로 분류된 후, 사카로마이세스 세르바지이(Saccharomyces servazzii)에서 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii)로 균주명이 바뀌었다. 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) 균주는 국내 및 해외에서 김치, 치즈 등으로부터 분리되었으나, 당 이용성이 활발하지는 않은 것으로 보고되었다.
락토오스(lactose)는 갈락토스와 글루코스가 결합된 이당류로 유당(乳糖), 젖당이라고도 불리며, 주로 포유류의 어미 젖에서 생산되고, 구조는 β-D-갈락토실-(1, 4)-D-글루코스의 구조를 갖는다. 형태에 따라 α, β형의 2종류가 있다. 락토오스는 포유류 젖의 성분이기도 하며, 주로 육아용 조제분유의 배합원료와 의료용 영양제로 이용된다. 락토오스는 일부 효모에 의해서만 이용되는 것으로 알려졌다.
한국공개특허 제10-2017-0038555호(2017.04.07)
본 발명의 목적은 사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 유청 발효능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유청 발효 방법을 제공한다.
본 발명은 사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)에 관한 것으로서, 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주는 수크로스 또는 락토오스 분해능이 우수한 균주로서, 유청 발효능도 우수한 것으로 나타났다.또한 가스생성능이 우수하여 제빵 제조 및 식품 소재 개발을 위한 발효종균으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 사과 당절임에서 분리된 효모균 분리의 공정도를 나타낸다.
도 2는 사과 당절임에서 분리된 효모균 분리의 Phylogenetic Tree Neighbor Joining Phylogram 분석 방법에 따른 결과를 나타낸다. apple: 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주.
도 3 및 도 4는 사과 당절임에서 분리된 효모균의 DNA 서열을 나타낸다.
도 5는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 공정도를 나타낸다.
도 6은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 7은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 8은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 생균수 측정 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 9는 빵 효모인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 비교 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 10은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(PDB 배지)에 대한 공정도를 나타낸다.
도 11은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(PDB 배지)에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 12는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(PDB 배지)에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 13은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(PDB 배지)에 대한 생균수 측정 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 14는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(PDB 배지)에 대한 가스 생성 평가 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 15는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(YPD 배지)에 대한 공정도를 나타낸다.
도 16은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(YPD 배지)에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 17은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(YPD 배지)에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 18은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(YPD 배지)에 대한 생균수 측정 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 19는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험(YPD 배지)에 대한 가스 생성능 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 20은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능에 대한 실험 공정도를 나타낸다.
도 21은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 22는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 23은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능에 대한 생균수 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 24는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능에 대한 가스 생성능 비교 결과를 나타낸다. 1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
도 25는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 농도에 따른 분해능에 대한 실험 공정도를 나타낸다.
도 26은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 농도에 따른 분해능에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) lactose 0 mL, 2) lactose 13 mL, 3) lactose 25 mL.
도 27은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 농도에 따른 분해능에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) lactose 0 mL, 2) lactose 13 mL, 3) lactose 25 mL.
도 28은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 농도에 따른 분해능에 대한 생균수 결과를 나타낸다. 1) lactose 0 mL, 2) lactose 13 mL, 3) lactose 25 mL.
도 29는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 농도에 따른 분해능에 대한 가스 생성능 결과를 나타낸다. 1) lactose 0 mL, 2) lactose 13 mL, 3) lactose 25 mL.
도 30은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스 이용능에 대한 실험 공정도를 나타낸다.
도 31은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스 이용능에 대한 pH 및 산도 결과를 나타낸다. 1) 희석 안함(원액), 2) ×2 희석.
도 32는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스 이용능에 대한 당도 결과를 나타낸다. 1) 희석 안함(원액), 2) ×2 희석.
도 33은 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스 이용능에 대한 생균수 결과를 나타낸다. 1) 희석 안함(원액), 2) ×2 희석.
도 34는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스 이용능에 대한 가스 생성능 결과를 나타낸다. 1) 희석 안함(원액), 2) ×2 희석.
본 발명은 KCCM11989P로 수탁되고, 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주를 제공한다.
상세하게는, 상기 당은 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 균주는 사과 당절임에서 분리될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 KCCM11989P로 수탁되고, 유청 발효능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 KCCM11989P로 수탁된 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유청 발효 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 배양은 25 내지 30℃에서, 1 내지 5일 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서 사용된 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM2017 균주는 한국미생물보존센터에 KCCM11989P로 수탁하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 사과 당절임에서 효모 균주 분리
1. 실험 방법
제공 받은 사과 당절임을 이용하여 10배 희석법을 이용하여 104, 105, 106배로 희석된 것을 MRS agar plate에 20 μL 도말한 후 30℃ 항온배양기에서 24~48시간 배양한 후 생균수를 colony forming unit(CFU/mL)로 나타내었다. 이후 계대 배양을 하여 ITS-1, ITS-4 분석 방법을 통하여 미생물 동정을 하였다(도 1).
2. 실험 결과
Phylogenetic Tree는 다양한 생물학적 종 또는 다른 개체, 계통 발생의 유추된 진화적 관계 또는 물리적 또는 유전적 특성의 유사점 및 차이를 확인하는 것이다. 이에 Phylogenetic tree를 이용하여 Neighbor Joining, Maximum Likelihood, Maximum Parsimony 분석 방법에 따라 염기서열 분석한 후에 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 상동성을 비교한 결과 99.8% 신뢰도로 카자크스타니아 세르바지이(Kazacstania servazzii)에 속하는 것으로 나타났다(도 2 내지 도 4).
< 실시예 2> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 가스 생성능 확인
1. 실험 방법
사과 당절임 시료에서 분리된 미생물 동정 결과, 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstnia servazzii)로 결과가 나왔으며, 이에 MRS broth 10 mL에 수크로스(Sucrose) 0.5g을 첨가한 후 빵 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 카자크스타니아 세르바지이(K. servazzii)를 1% 접종한 후 3일간 정치 배양 하면서 pH, 산도, 당도, 생균수 및 가스 생성능을 비교하였다(도 5).
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 pH 및 산도의 결과는 도 6과 같다. 효모는 발효가 되면서 산을 생성하면서 pH는 감소하는 경향을 보이면서 S. cerevisiae가 접종된 시료의 경우 발효 0일차 pH 6.22 로 시작하였다. 이후 발효 1일차 소폭 감소하여 발효 3일차 pH 5.44를 나타내었다. 반면 K. servazzii 가 접종된 시료의 경우 발효 0일차는 S. cerevisiae 와 같은 pH 값을 나타내었다. 그러나 발효 1일차 S. cerevisiae 보다 pH 값은 감소하여 5.82를 나타내었다. 이후 계속 감소하여 발효 마지막 날 pH 5.02를 나타내었다. 산도의 경우 두 개의 균주 모두 발효시간이 지날수록 증가하는 경향을 보였다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 당도의 변화는 도 7에서 나타내었다. 초기 S. cerevisiae의 당도와 K. servazzii의 당도는 5.8 °Brix, 5.9 °Brix를 나타내었다. 이후 S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 1일 차 4.2 °Brix로 감소하였으며, 반면에 K. servazzi를 접종한 시료의 경우 3°Brix를 나타내었다. 이후 당도는 계속 감소하여 발효 5일차 S. cerevisiae를 접종한 시료는 1.2 °Brix, K. servazzi를 접종한 시료의 경우 1° Brix를 나타내었다.
(3) 생균수 측정
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 생균수 측정 결과는 도 8과 같다. S. cerevisiae를 접종한 생균수는 발효 0일 1.53×106 CFU/mL로 시작하였다. 이후 발효 1일차 5.41×108 CFU/mL를 나타내었다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 1.01×109 CFU/mL를 나타났다. 이후 발효 3일차 S. cerevisiae ,K . servazzii를 접종한 시료 모두 생균수가 감소하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 S. cerevisiae 의 생균수는 2.83×107 CFU/mL를 나타냈고 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 5.85×107 CFU/mL를 나타났다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 결과는 도 9와 같다. 이번 실험에서는 발효 30 시간 기준으로 진행하였다. S. cerevisiae 경우 발효 6시간에 아이 혼관에 가스 생성에 따라 형성된 공간의 높이가 1.2 cm, 12시간 후 2.6 cm으로 가스가 생성되었다. 이후 발효 24시간 후 7.2 cm 가스가 생성되었다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 6시간 후 3.5cm 가스가 생성되고 발효 18시간 후 가스 10 cm 로서 S. cerevisiae 보다 가스 생성능이 우수하였다.
< 실시예 3> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 가스 생성능 확인 (PDB 배지)
1. 실험 방법
사과 당절임에서 분리한 미생물 동정 결과 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii)로 결과가 나왔다. 이에 영양성분을 바꾸어 실험을 진행하였다. 기존 MRS broth가 아닌 감자전분 배지(Potato Dextrose Broth)를 이용하여 실험을 진행하였다. 결정 포도당이라고도 일컫으며, 녹말을 산으로 충분히 분해하면 만들어진 당화액에서 결정을 석출 분리하여 결정 포도당을 만든 것이다. 결정 포도당은 상쾌한 단맛을 가지고 결정 그대로에서는 자당과 거의 같은 단맛이 있는데 용액의 단맛은 자당의 60% 정도가 된다. 감자 전분 배지 1L에 용해도는 24 g이었다. 이에 250 g을 만들기 위해 감자 전분 배지 6 g에 증류수 250 g을 첨가한 후 121℃, 15 분간 멸균을 진행하였다. 이후 각각의 균주를 1% 접종하였다(도 10 및 표 1).
A 1) B 2)
Potato dexrose broth 6 g 6 g
Distilled water 250 g 250 g
Yeast S. cerevisiae
2.5 mL (1%)		 K. servazzii
2.5 mL (1%)
1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 pH 및 산도의 결과는 도 11과 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 0일 차 pH 6.16 이었다. 이후 알코올 발효가 진행될수록 pH 가 감소되어 발효 3일차 pH 5.44를 나타내었다. K. servazzii 를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 pH 6.18로 시작하였다. 이후 S. cerevisiae 보다 pH 감소하는 폭이 큰 것을 확인 하였다. 이후 발효 5일차 pH 5.21을 기록하였다. 산도의 경우 S. cerevisiae, K. servazzii를 접종한 시료 모두 발효가 진행될수록 증가하는 경향을 보였다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 당도의 결과는 도 12와 같다. S. cerevisiae, K. servazzii를 접종한 각각의 시료는 5.7 °Brix, 5.9 °Brix를 나타내었다. 이후 발효 1일차 S. cerevisiae의 경우 발효 1일 차 4.3 °Brix를 나타내었다. 이후 당도가 감소하여 발효 3일차 2.5 °Brix를 나타내었다. K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 1일차 3.2 °Brix를 나타내었고 발효 2일차 2.1 °Brix를 나타내었다. 이후 발효 3일차 1.4 °Brix를 나타내었다.
(3) 생균수
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 당도의 결과는 도 13과 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 2.51×106 CFU/mL로 생균수를 나타내었다. 이후 발효 1일차 5.13×103 CFU/mL로 균수가 상승하는 경향을 보였으며 발효 2일차부터 균수는 감소하여 발효 3일차 3.51×107 CFU/mL를 나타내었다. K. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 3.38×106 CFU/mL로 나타내었다. 이후 발효 1일차 균수는 상승하는 경향을 보였으며 발효 2일차 2.80×103 CFU/mL을 나타내었다. 이후 발효 3일차 107 CFU/mL을 유지하였다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 결과는 도 14와 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 12시간 0.2 cm 가스가 생성되었고 발효 18시간 후 2.6 cm 높이로 가스가 생성되었다. K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 12시간의 가스 생성능은 0.6 cm으로 기록이 되었고 발효 24시간 후 6.2 cm 가스 생성능을 확인하였다.
< 실시예 4> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 가스 생성능 확인 (YPD 배지)
1. 실험 방법
이번 실험에서는 진균류와 효모의 배양을 위한 영양 배지로써 YPD 배지를 이용하여 실험을 진행하였다. 다른 실험과 다른 점이 있다면 앞선 MRS, PDB 배지의 경우 당이 첨가되어 있지만 이번 실험은 당이 없는 것이다. 이에 20% 글루코스(glucose)를 기준으로 YPD 배지에 대한 가스 생성능 실험을 진행하였다. 분말 효모 추출물(yeast extract) 5g, 펩톤(Peptone) 10 g을 첨가한 후 20% 글루코스(glucose) 25 mL (5%)를 첨가한다. 이후 121℃, 15분간 멸균 후 각각 균주 1%에 해당하는 4 mL를 접종하여 3일간 정치 배양하였다(도 15 및 표 2).
A 1) B 2)
yeast extract 5 g 5 g
Peptone 10 g 10 g
20% glucose 25mL 25mL
Yeast S. cerevisiae
4 mL (1%)		 K. servazzii
4 mL (1%)
1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 pH 및 산도의 결과는 도 16과 같다. S. cerevisiae, K. servazzii를 접종한 시료 모두 발효 0일차 pH 6.06, 6.10으로 나타냈다. 이후 발효 1일차 K. servazzii 접종한 시료의 경우 S. cerevisiae 보다 pH 감소하는 폭이 큰 것을 확인할 수 있었다. 이후 각각의 시료들은 감소하여 발효 3일차 S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 pH 5.32, K. servazzii를 접종한 시료의 경우 pH 5.22를 나타내었다. 산도의 경우 pH가 감소할수록 두 시료 모두 상승하는 경향을 보였다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 당도는 도 17과 같다. S. cerevisiae의 경우 발효 0일차 6.4 °Brix를 나타냈으며 감소하여 발효 2일차 3.5 °Brix를 나타내었다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 6.3 °Brix를 나타냈으며 발효 1일차 감소하여 발효 2일차 2.9 °Brix를 나타내었다. 이후 발효 3일차 각각의 시료에 대한 당도는 모두 감소하여 2.5 °Brix, 1.1 °Brix를 나타내었다.
(3) 생균수
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 생균수 결과는 도 18과 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 2.68×106 CFU/mL을 나타내었고 발효 1일차 5.04×103 CFU/mL으로 균이 증가하는 경향을 보였다. 발효 2일차 생균수는 감소하는 경향을 보였으며 발효 3일차 2.73×107 CFU/mL으로 나타내었다. K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 0일차 2.87×106 CFU/mL을 나타냈으며 발효 1일차 6.81×103 CFU/mL을 나타내었다. 이후 생균수는 감소하는 경향을 보였다. 이후 발효 3일차 6.10×107 CFU/mL으로 나타내었다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성능 실험에 대한 결과는 도 19와 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효 12시간 후 2.1 cm 가스 생성이 일어났다. 이후 발효 24시간 후 6.8 cm 높이로 가스 생성을 하였다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 6시간 후 2.6 cm 가스가 생성 되었고 발효 24시간 후 10 cm 가스가 생성되었다.
< 실시예 5> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 락토오스(lactose) 이용능 확인
1. 실험 방법
이번 실험에서는 진균류와 효모의 배양을 위한 영양 배지로써 YPD 배지를 이용하여 가스 생성이 우수한다고 확인된 K. servazzii 균의 락토오스(lactose) 분해능 실험을 진행하였다. 락토오스(lactose)는 젖당 또는 유당이라고 불리며, 분자식 C12H22O11이고, β-D-갈락토실-(1, 4)-D-글루코오스의 구조를 갖는다. 젖당은 이름 그대로 포유류의 젖, 특히 초유 속에서 많이 발견되며, 그 양은 모유에 6.7%, 우유에 4.5% 정도 함유되어 있다. 모유 속에서는 이 밖에도 10종 이상의 소당류가 발견되는데, 이들은 모두 락토오스를 골격구조로 가지고 있다. 또한 젖 이외에서는 별로 발견되지 않았으나, 식물의 씨에서 발견되었다는 몇 가지 보고가 있다. α, β 형의 2종류가 있는데, α-락토오스는 약간 단맛이 나며, 1g은 5mℓ의 물과 2.6mℓ의 온수에 녹으나 알코올에는 잘 녹지 않고 클로로포름이나 에테르에는 녹지 않는다. β-락토오스는 93.5℃ 이상의 진한 용액에서 결정시키면 생기는데, α-락토오스보다 더 달다. 묽은 산이나 효소(락타아제)의 작용으로 가수분해 되어 D-글루코오스와 D-갈락토오스로 되며, 또 젖산균의 작용을 받으면 젖산이 된다.
이번 실험에서는 앞선 YPD 가스 실험과 동일하게 분말형 효모 추출물(yeast extract)을 5 g 첨가한 후 펩톤(Peptone) 10 g를 첨가한 후 20% 락토오스(lactose) 25 mL 첨가하였다. 이후 멸균 후 5일간 정치 배양하였다(도 20 및 표 3).
A 1) B 2)
yeast extract 5 g 5 g
Peptone 10 g 10 g
20% lactose 25mL 25mL
Yeast S. cerevisiae
2.5 mL (1%)		 K. servazzii
2.5 mL (1%)
1) S. cerevisiae, 2) K. servazzii.
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 pH 및 산도는 도 21과 같다. S. cerevisiae 균을 접종한 시료의 경우 발효가 진행되어도 pH 및 산도의 변화가 없었다. 반면 K. servazzii 균을 접종한 시료의 경우 발효 1일차 까지 pH 의 변화는 없었다. 그러나 발효 3일차 pH 6.02로 소폭 감소하는 경향을 보였으며 발효 5일차 pH 5.83으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. K servazzii 균을 접종한 시료에서의 산도는 발효 1일 차 까지 큰 변화가 없었으며, 반면에 발효 3일차부터 산도는 소폭 상승하는 경향을 보였다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 당도 변화는 도 22와 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효가 진행되어도 당도는 6.7 °Brix 로서 당도는 떨어지지 않음을 확인할 수 있었다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 3일차 6 °Brix로 소폭 감소하는 경향을 보였고 발효 5일차 4.1 °Brix 로 감소하는 경향을 보였다.
(3) 생균수
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 생균수 변화는 도 23과 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료는 10배 희석법으로 도말을 했으나 균이 확인되지 않았다. K. servazzii 균을 접종한 시료의 경우 발효 0일차 3.26×105 CFU/mL을 나타내었고 발효 1일차 7.4×107 CFU/mL를 나타내었다. 발효 2일차부터 생균수는 유지하는 경향을 보였다. 발효 3일차 K. servazzii 균을 접종한 시료의 생균수는 7.5×107 CFU/mL를 나타내었다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 가스 생성 결과는 도 24와 같다. S. cerevisiae를 접종한 시료의 경우 발효가 진행되어도 가스가 생성되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면 K. servazzii를 접종한 시료의 경우 발효 36시간 후 1.2 cm 높이로 가스가 생성되었고 발효 48시간 후 2.5 cm 으로 가스가 소폭 증가하였다. 발효 60시간 후 6.2 cm 까지 가스가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 락토오스(lactose) 농도별 분해능 확인
1. 실험 방법
진균류 및 효모 영양배지인 YPD 배지에서 락토오스(lactose)를 분해한다고 실험 결과가 나옴에 따라 농도에 따른 가스 생성 및 균수를 확인하기 위해 20% 락토오스(lactose) 0 mL , 13 mL, 25 mL(0%, 2.5%, 5%)을 첨가하여 실험을 진행하였다. 앞선 실험과 같이 당이 첨가되어 있지 않은 YPD 배지를 이용하여 락토오스(lactose) 함량만 다르게 하여 실험을 진행하였다(도 25 및 표 4).
A B C
Yeast extract 5 g 5 g 5 g
Peptone 10 g 10 g 10 g
20% Lactose 0 mL 13 mL 25 mL
D.W 25 mL 10 mL 0 mL
Yeast K. servazzii
0.4 mL		 K. servazzii
0.4 mL		 K. servazzii
0.4 mL
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 pH 및 산도는 도 26과 같다. 20% 락토오스를 넣지 않은 시료의 경우 발효 0일차 pH 6.09로 나타내었고 발효가 진행되어도 pH의 변화는 거의 없었다. 20% 락토오스 13 mL을 넣은 시료의 경우 발효 3일차 pH 6.02로 소폭 감소하는 경향을 보였다. 효모는 발효를 하면서 산을 생성하는데 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose) 보다 발효 진행 속도가 늦지만 락토오스를 이용하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 20% 락토오스 25 mL 첨가한 경우 발효 1일차 pH 6.06, 발효 3일차 pH 5.84, 발효 5일차 pH 5.51로써 20% 글루코스 13 mL 보다 pH 감소하는 폭이 큰 것을 확인할 수 있었다. 산도의 경우 락토오스를 넣지 않은 시료를 제외하고 발효가 진행될수록 산도는 올라가는 경향을 보였다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 당도 실험은 도 27과 같다. 20% 락토오스를 첨가하지 않은 시료의 경우 당도는 6.2°Brix에서 발효기간이 진행되어도 유지되는 경향을 보였다. 반면 20% 락토오스 13 mL, 20% 락토오스 25 mL을 첨가한 시료의 경우 발효 3일차 각각 5.1°Brix, 4.5°Brix 로써 감소하는 경향을 보였다.
(3) 생균수
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 생균수 결과는 도 28과 같다. 20% 락토오스 13 mL을 첨가한 시료의 경우 발효 0일차 4.41×105 CFU/mL을 나타내었고 발효 1일차 5×107 CFU/mL으로 균수가 올라가는 경향을 보였다. 발효 3일차 생균수가 유지되는 경향을 보였고 발효 5일차 균수는 감소하여 1.12×107 CFU/mL으로 나타내었다. 반면 20% 락토오스 25 mL을 넣은 시료의 경우 발효 0일차 7.7×105 CFU/mL을 나타내었다. 이후 발효 1일차 균수가 증가하였고 발효 3일차 균수가 감소하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 균수는 1.6×107 CFU/mL을 나타내었다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 가스 생성 및 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 가스 생성능 결과는 도 29와 같다. 20% 락토오스를 첨가하지 않은 시료의 경우 가스가 생성되지 않았으며 20% 락토오스 13 mL을 첨가한 시료의 경우 발효 42시간 후 약 0.6 cm 가스가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 이후 가스가 발효 90시간 후 약 6.8 cm 가스가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 20% 락토오스 25 mL 첨가한 시료의 경우 발효 36시간 후 약 1 cm 가스가 생성되었다. 이에 락토오스 첨가량에 따라 가스 생성능이 차이가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7> 카자크스타니아 세르바지이 ( Kazachstania servazzii ) KM 2017 균주의 유청 농도별 락토오스(lactose) 이용능 확인
1. 실험 방법
유청의 일반성분 분석 결과 수분 98.24%, 조 지방 0.44%, 조 회분 함량 1.16%으로 나타났고 유청의 단백질 함량은 1.06~1.28% 로 나타났다. 또한 유청의 락토오스(lactose) 함량은 약 4~5%로 나타났다. 이에 유당 분해능이 있다고 확인된 K. servazzii를 이용하여 유청 원액 및 유청 2배 희석을 이용하여 실험을 진행하였다. 유청 원액과 유청 2배 희석한 시료를 준비한 후 121℃, 15분 멸균 후 K. servazzii 균을 접종하여 5일간 정치배양 진행하였다(도 30 및 표 5 내지 표 7).
A B
유청(Whey) 95 mL 50 mL
D.W 0 mL 50 mL
10% yeast extract 5 mL 5 mL
Yeast K. servazzii
0.4 mL		 K. servazzii
0.4 mL
유청(Whey)
수분 98.24 %
조지방 0.44 %
조단백질 1.16 %
citric acid 104.80 mg%
lactic acid 44.64 mg%
glutamic acid 182.73 mg%
유청(Whey)
pH 6.20±0.01
Acidity (%) 0.18±0.03
Soluble solid content (°Brix) 18.2±0.2
Flavonoid(mg/g) 140.21±3.95
Polyphenol (mg/g) 22.43±2.58
2. 실험 결과
(1) pH 및 산도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도에 따른 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 pH 및 산도는 도 31과 같다. 유청 원액의 경우 발효 0일차 pH 6.21로 나타내었다. 이후 발효 1일차 까지 pH는 유지되는 경향을 보였다. 이후 발효 3일차 pH 6.04 로 소폭 감소하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 pH 5.82로 감소하였다. 유청 2배 희석한 시료의 경우 발효 0일차 pH 6.09를 나타내었고 원액 시료와 비슷하게 발효 1일차 까지 유지되는 경향을 보였다. 이후 발효 3일차 pH 5.84를 나타내었다. 이후 감소하여 발효 5일차 pH 5.66을 나타내었다. 산도의 경우 두 시료 각각 발효 3일차 0.20%, 0.23% 로써 소폭 상승하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 각각의 시료는 0.25%, 0.29% 로 나타내었다.
(2) 당도
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도에 따른 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 당도는 도 32와 같다. 유청 원액은 발효 0일차 18.2°Brix 로 시작하여 발효 3일차 16.2 °Brix 로서 소폭 감소하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 13 °Brix를 나타내었다. 유청 2배 희석된 시료의 경우 발효 3일차 8.1 °Brix를 나타내었고 발효 5일차 5.3 °Brix를 나타내었다.
(3) 생균수
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도에 따른 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 생균수는 도 33과 같다. 유청 원액에 대한 발효 0일차 생균수는 2.73×105 CFU/mL로 나타났고 발효 1일차 5.03×107 CFU/mL로 상승하는 경향을 보였다. 이후 107 CFU/mL로 유지되는 경향을 보였으며 발효 5일차 1.52×107 CFU/mL을 나타내었다. 유청 2배 희석한 시료의 경우 3.08×105 CFU/mL으로 시작하였다. 이후 5.51×107 CFU/mL으로 상승하는 경향을 보였고 발효 3일차 생균수는 유지하는 경향을 보였다. 이후 발효 5일차 3.55×107 CFU/mL을 나타내었다.
(4) 가스 생성능 실험
카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 유청 농도에 따른 락토오스(lactose) 분해능 실험에서의 가스 생성능 결과는 도 34와 같다. 각각의 시료는 발효 36시간 후에도 가스 생성이 이루어지지 않았다. 반면 발효 48시간이 지나면서 유청 2배 희석한 시료는 약 0.2 cm 가스가 생성 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이후 발효 60시간이 지나면서 유청 원액에서도 가스가 생성 되는 것을 확인할 수 있었다. 이후 발효가 진행되었고 발효 90시간 후 유청 원액은 2.6 cm 가스가 생성되었고 유청 2배 희석한 시료의 경우 4.1cm 가스가 생성되었다.
즉, 상기 실시예들에서 언급한 바와 같이, 3가지 배지 조건에서 가스 생성 능 실험과 락토오스 분해능 실험을 수행한 결과, 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주의 락토오스 분해능을 확인할 수 있었다. 본 발명에서 사용된 YPD 배지는 당이 없는 배지로 추가적으로 락토오스를 첨가하여 실험을 하였으며, 그 결과 pH가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 발효 3~5일차에 당도가 떨어지는 것을 확인함으로써 락토오스 분해능이 있는 것으로 확인되었다. 또한 유청은 락토오스가 약 3~5% 포함되어 있으며, 이에 분해능 실험을 한 결과 당도가 떨어지고 생균수를 확인해 본 결과, 균이 생육한다는 것을 확인할 수 있었다.
이전의 보고에 따르면, 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) 균주는 락토오스를 이용하지 못하는 것으로 나타났으나, 본 발명의 사과 당절임에서 분리된 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주(KCCM11989P)는 락토오스 뿐만 아니라 수크로스도 발효성 당으로 이용함으로써 당 발효능에서 차별화되는 것을 확인하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11989P 20170316

Claims (6)

  1. KCCM11989P로 수탁되고, 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당은 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose)인 것을 특징으로 하는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사과 당절임에서 분리된 것을 특징으로 하는 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주.
  4. KCCM11989P로 수탁되고, 유청 발효능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주.
  5. KCCM11989P로 수탁된 카자크스타니아 세르바지이(Kazachstania servazzii) KM 2017 균주를 배양하는 단계를 포함하는 유청 발효 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양은 25 내지 30℃에서, 1 내지 5일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 유청 발효 방법.
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