KR20170038555A - 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 감소시키기 위한 균주 - Google Patents

아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 감소시키기 위한 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아로니아 추출물에 존재하는 탄닌 성분을 저감시키기 위한 균주 및 이를 이용하여 아로니아 추출물에 존재하는 탄닌 성분을 저감시키는 방법에 관한 것으로, 상기의 균주는 젓갈에서 분리한 균주 중 ß-글루코시다아제 활성을 가지는 균주이다. 또한 본 발명에서는 상기 균주의 배양 방법, 배양 조건을 제공한다.

Description

아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 감소시키기 위한 균주 {Microorganism for reducing tannins in Aronia extract}
본 발명은 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 감소시키기 위한 균주에 관한 것이다.
블랙쵸크베리 (Aronia melanocarpa)는 장미과에 속하는 베리류로 북미의 동부 아메리카 지역에서 자생한다. 학명에 따라 Aronia melanocarpa (black chokeberry), Aronia arbutifolia (red chokeberry)로 구분할 수 있고 더 나아가 Aronia melanocarpa와 Aronia arbutifolia의 혼합물인 Aronia prunifolia (purple chokeberry)로 나뉘어지고, 일반적으로 아로니아라고 부른다.
아로니아의 주요 성분은 안토시아닌 (anthocyanins), 프로안토시아니딘 (proanthocyanidins) 및 클로로겐산(chlorogenic acid)과 네오클로로겐산 (Neochlorogenic acid)을 포함하는 플라보놀 (flavonols)인 페놀 화합물로 구성되며 다양한 생리적 기능을 가지고 있다. 최근에는 아로니아에 함유된 페놀성 구성성분이 항산화 효과와 심장 보호효과에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 아로니아의 구성성분인 안토시아닌은 암세포의 확산을 저해뿐만 아니라 항돌연변이 효과, 간 보호 효과가 있는 것으로 알려졌다.
아로니아의 페놀 화합물중에 대부분은 안토시아닌 및 프로안토시아니딘이다. 안토시아닌은 주로 다음과 같은 4가지 시아니딘 (cyanidin) 배당체로 이루어져 있다: 시아니딘 3-O-갈락토사이드 (cyanidin 3-O-galactoside) (68.9%), 시아니딘-3-O-아라비노사이드 (cyanidin 3-O-arabinoside) (27.5%), 시아니딘 3-O-자일로사이드 (cyanidin 3-O-xyloside) (2.3%) 및 시아니딘 3-O-글루코사이드 (cyanidin 3-O-glucoside) (1.3%). 이들 중에서 시아니딘 3-O-갈락토사이드 (cyanidin 3-O-galactoside)가 가장 높은 함량을 차지한다고 보고된다. 또한 다른 베리보다 월등히 많은 안토시아닌 색소로 인해 자연 식품착색제와 붉은 천연염료를 얻을 수 있다. 아로니아의 프로안토시아니딘의 대부분은 (-)-에피카테킨 ((-)-epicatechin)과 (+)-카테킨 ((+)-catechin)으로 구성되어 있으며 이 두 물질은 부분이성질체이자 가장 많은 단위체이다.
탄닌은 과실의 떫은 맛을 타나내는데 쵸크베리는 다른 베리류보다 많은 탄닌을 함유하 그 특유의 떫은 맛 때문에 사람들이 즐겨멱는 생과로는 선호하지 않는다. 탄닌은 여러 유익한 건강 효과를 내며, 탄닌 중 특히 프로안토시아니딘의 섭취는 암과 심장혈관계 질병 같은 만성병을 예방한다는 많은 역학 자료가 있다 (참고문헌: Lila MA. From beans to berries and beyond: Teamwork between plant chemicals fro protection of optimal human health. Ann NY Acad Sci 2007;1114:372-80; Santos-Buelga C, and Scalbert A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds-nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health. J Sci Food Agric 2000;80:1094-117). 그럼에도 불구하고 다량의 탄닌 섭취는 단백질과 결합하는 능력이 강하여 단백질의 소화를 억제하고 효소 활성을 억제시킬 수 있다. 또한, 과실의 떫은맛에도 관여하며, 이는 아로니아 특유의 떫은맛을 설명해준다. 이에 의해, 아로니아의 유용한 생리적 기능에도 불구하고 생과로의 섭취는 선호되지 않는 실정이.
이에 본 발명자들은 젓갈에서 분리한 효모가 아로니아의 탄닌 성분을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 저감시키는 특성을 지닌 신규한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 상기 균주를 이용하여 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 저감시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다..
또한 본 발명은 상기 신규한 균주를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 식물 추출물, 예를 들어, 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 저감시키기 위한 카자크스타니아 세르바지이 (Kazachstania servazzii) MT-Y-2 균주 (기탁번호: KCCM11742P)를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 탄닌 성분은 카테킨일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 아로니아 추출물을 포함하는 조성물에 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2 균주를 접종하여 아로니아 추출물에 존재하는 탄닌 성분을 저감시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 조성물에는 락토오스 (lactose), 갈락토오스 (galactose), 전분 (starch), 글루코오스 (glucose), 말토오스 (maltose), 만니톨 (mannitol), 프룩토오스 (fructose), 라피노오스 (raffinose) 및 수크로오스 (sucrose)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 탄소원; 맥아 추출물 (malt extract), 트립톤 (tryptone), 폴리펩톤 (polypeptone), 펩톤 (peptone), 효모추출물 (yeast extract), 소이톤 (soytone) 및 카지톤 (casitone)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원; 및 염화 나트륨 (sodium chloride), 이인산 칼륨 (dipotassium phosphate) 및 염화 칼륨 (potassium chloride)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 무기 염류를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 탄소원은 글루코오스고, 상기 배지에 상기 글루코오스가 7 % 내지 13 % 포함되어 있고, 상기 질소원은 트립톤이며, 상기 배지에 상기 트립톤이 1% 내지 4% 포함되어 있으며, 상기 무기염류는 염화 나트륨이고, 상기 배지에 상기 염화 나트륨이 0.01 % 내지 0.3 % 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 아로니아 추출물이 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 아로니아 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 아로니아 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에 따르면, 카자크스타니아 세르바지이 (Kazachstania servazzii ) MT-Y-2를 이용하여 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 효과적으로 저감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, ß-글루코시다아제 활성을 나타내는 효모를 선발하기 위해 응용된 에스큘린 아가법 실험 결과를 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 선택된 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2 균주에서의 카테킨 분해 활성을 확인한 TLC 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 18S rDNA 서열 분석을 통하여 얻어진 계통수이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 성장 및 그에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 배양 온도에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 pH에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 아로니아 추출물의 배지 내 농도에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 탄소원에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 글루코오스 농도에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 질소원에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 트립톤 농도에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 무기 염류 종류에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2의 염화 나트륨 농도에 따른 성장 정도를 비교한 그래프이다.
도 14 및 도 15는 탄닌 저감을 확인하기 위한 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 탄닌 저감화 균주 선발 및 동정
실시예 1.1 미생물 분리
탄닌을 저감화하는 미생물을 선별하기 위해 각 지역별 젓갈의 분포와 종류(Seo HK, 1995. Distribution and kinds of each region Jeotgal. The Korean society of food and cookery science, 11: 418-425)를 바탕으로 전국에서 명란젓과 명태식해, 청어알젓, 오징어젓, 아가미젓, 길치속젓, 멍게젓, 새우젓, 가자미식해, 도루묵식해, 멸치젓, 밴댕이젓, 및 자리돔젓갈을 구입하고, 시료 10 g을 100 mL 멸균 증류수에 넣은 후 믹서기로 파쇄하고 멸균수를 이용하여 10-1배 내지 10-7배 희석하여 YM배지 (Dico Co, USA)에 도말하였다. 30 ℃에서 72시간 배양한 후 최대 20개의 효모를 선별하였으며, YM 아가 (표 1)에 계대배양하여 단일 콜로니를 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주는 20% 탈지유를 사용하여 동결건조한 후 앰플 상태로 실온에서 보관하였다.
성분 함유량 (g/L)
효모 추출물 3.0
맥아 추출물 3.0
펩톤 5.0
덱스트로즈 10.0
아가 1.5
실시예 1.2 균주의 선별
ß-글루코시다아제 활성을 나타내는 효모를 선발하기 위해 에스큘린 아가 (esculin agar) 법을 응용하여 에스큘린 (Sigma-Aldrich, USA)을 첨가한 에스큘린-YM-아가를 제조하였다 (표 2). 에스큘린은 균주의 ß-글루코시다아제 활성에 의해 분해가 이뤄진다. 이때 생성된 에스큘레틴 (esculetin)이 에스큘린-YM-아가 배지에 함유된 시트르산철암모늄 (ferric ammonium citrate) (Sigma-Aldrich, USA)과 결합하여 균주를 접종한 주위에 어두운 영역 (black-zone)을 나타낸다. 그러므로 에스큘린-YM-아가 배지에 균주 접종 후 배지주위에 어두운 영역 (black zone)을 형성하는 효모에서 ß-글루코시다아제 활성이 있다. 상기 에스큘린-YM-아가에 단일 콜로니를 접종하여 어두운 영역 (black-zone)을 형성하는 균주 총 30 종을 1차 선별하였다 (도 1).
성분 함유량 (g/L)
효모 추출물 3.0
맥아 추출물 3.0
펩톤 5.0
덱스트로즈 10.0
에스큘린 1.0
시트르산철암모늄 0.5
아가 1.5
여과지로 여과한 아로니아 (Aronia melanocarpa, 여주 아로니아 농원) 추출물을 5 % (w/v)로 YM 배양액 (Difco, USA)에 첨가하여 멸균한 후 상기 선별한 30 종의 효모의 배양액을 3 % (v/v)로 접종하고 30 ℃에서 135 rpm으로 3일간 배양하였다. 배양액은 8,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 상등액과 동일한 양의 수포화 n-부탄올로 추출하였다. 상기 추출액은 진공농축기를 사용하여 농축시킨 후 메탄올에 녹여 샘플로 사용하였으며 TLC분석을 통해 균주에 의한 탄닌의 저감화를 확인하였다. TLC는 각각의 추출물을 TLC 플레이트 (Silica gel 60 F254 plate, Merck Co., USA)에 점적하여 CHCl3:MeOH (80:20, v/v)용매로 전개한 후 AS 반응액을 TLC 플레이트에 분무하고 5분간 가열건조 후 발색시켜 확인하였다. 그 결과, MT-Y-2에서 가장 큰 변화를 볼 수 있었으며 다른 균주에서는 밴드의 변화를 거의 볼 수 없었기 때문에 MT-Y-2를 최종 균주로 선정하였다 (도 2).
실시예 1.3 최종선발균주의 계통학적 분류 분석
상기 MT-Y-2의 18S 리보좀 DNA 서열 분석은 아래와 같은 방법으로 수행하였다. 균주의 염색체 DNA를 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용해 분리한 후, 분리된 게놈 DNA를 PCR (polymerase chain reaction)하기 위하여 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')와 NS8 (5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3')을 프라이머로 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system (Promega, USA)을 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR 반응산물은 ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 가는 관식 (capillary type))를 통해 염기서열을 분석하였다. DNA 염기서열 분석이 완료된 후 NCBI의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 GenBank 리보좀 DNA 염기서열과 비교하였다. 최종적으로 서열 상동성은 Clustal X와 MEGA 4 (MEGA 2.1 package)를 이용하여 비교 분석한 후 이웃 연결 방법 (neighbor-joining method)으로 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하였다. 최종 선정된 탄닌 저감화 효모의 생화학적 특성은 API 키트 (20C AUX V 4.0) (bioMerieux Ltd., France)를 통해 분석하였다. API 키트 분석은 배양한 효모를 API 배지에 현탁하여 효모 배양액을 만들고 이를 키트에 접종하여 30℃에서 72시간 배양하여 수행하였으며, 배양 후 배지의 혼탁변화를 비교 분석함으로써 당 분해 유무에 따른 생화학적 특성을 확인하였다. 18S rDNA 유전자 염기서열을 분석하고 NCBI에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 18S rDNA 서열과 비교한 결과 Kazachstania 속과 가장 높은 상동성을 나타내었다. Clustal X와 Mega 4를 이용하여 각 Kazachstania 유전자에 속하는 종들과 염기서열의 상동성을 비교분석 하여 계통수를 나타낸 결과는 도 3에 나타내었다. 비교결과 Kazachstania servazzii와 99% 상동성을 나타내어 본 선정균주를 최종적으로 Kazachstania servazzii MT-Y-2라 명명하였다. API 키트에 의한 Kazachstania servazzii MT-Y-2의 19 가지 당에 대한 이용성을 확인한 결과, 단당류인 글루코오스, 갈락토오스, 이당류인 사카로오스, 삼당류인 라피노오스에서 대조군과 비교할 때 당이용에 의한 혼탁도에 차이가 있었으며, Kazachstania servazzii MT-Y-2균주가 당 이용성이 활발하지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2. 최종선발균주의 최적 생장조건
실시예 2.1 배양시간에 따른 Kazachstania servazzii MT-Y-2의 균체생육 및 pH
Kazachstania servazzii MT-Y-2의 배양 시간에 따른 균체 생육과 pH 변화를 확인하기 위해 YM 배양액에 효모 전배양액을 3 % 접종하고 30 ℃에서 135rpm으로 진탕배양하였으며, 일정한 간격으로 균체 생육 및 pH를 측정하였다. 균체의 생육은 UV-vis spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu, Japan)로 660 nm에서 OD (Optical Density) 값을 측정하여 OD660 (Growth)으로 나타내었고, 배양액의 pH는 pH 측정기 (SP-701, Suntex Co., Taiwan)로 측정하였다. 그 결과, Kazachstania servazzii MT-Y-2는 약 3시간의 유도기를 보이다가 3시간 이후부터 대수 성장기를 거쳐 9시간 이후부터는 OD660값의 변화가 미미하였다. 이를 통해 9시간 이후부터 정지기에 들어감을 알 수 있다. 또한 Kazachstania servazzii MT-Y-2 생장곡선에 따른 pH변화로는 유도기부터 대수기까지 pH가 6에서 5로 감소함을 볼 수 있으며 정지기에서는 pH가 5로 유지됨을 알 수 있다 (도 4).
실시예 2.2 배양온도에 따른 Kazachstania servazzii MT-Y-2의 생장률
Kazachstania servazzii MT-Y-2의 배양온도에 의한 영향을 확인하기 위해 YM 배양액에 효모 전배양액을 3 % (v/v) 접종하여 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃ 및 40 ℃, 135 rpm에서 3일간 배양하였다. 배양 후 배양액의 흡광도 (OD660)를 측정하여 배양온도에 따른 생육도를 측정하였다. 그 결과, 20~30℃에서의 균체 생장률이 큰 차이를 보이지 않았고, 35℃부터 균체의 생육이 감소하기 시작하였으며 40℃에서는 생장이 거의 되지 않음을 확인할 수 있다 (도 5).
실시예 2.3 pH에 따른 Kazachstania servazzii MT-Y-2의 생장률
1N-HCL과 1N-NaOH를 이용하여 pH를 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0으로 조절한 YM 배양액에 전 효모 배양액을 3 % (v/v) 접종하여 135 rpm, 30 ℃에서 3일 배양한 후 배양액의 흡광도 (OD660)를 측정하여 pH에 따른 생육도를 측정하였다.
Kazachstania servazzii MT-Y-2 균주는 pH 3에서는 균체의 생육이 미미하게 이루어 졌으며 약산성인 pH 4에서 약염기성인 pH 9까지의 균체 생육은 비슷한 수치로 원만하게 이뤄짐을 알 수 있었고 pH 8에서 OD660값이 다른 pH 보다 약간 높았다 (도 6).
실시예 2.4 Aronia melanocarp a 추출물 첨가에 따른 Kazachstania servazzii MT-Y-2의 생장률
Aronia melanocarpa와 동일한 양의 증류수를 함께 믹서기로 파쇄한 후 여과지로 여과한 아로니아 추출물을 0 %, 5.0 %, 10.0 %, 15.0 %, 20.0 %, 25.0 % 및 30.0% (w/v)에 따라 혼합한 YM 배양액에 효모 배양액을 3 % (v/v) 접종하여 135 rpm, 30 ℃에서 3일 배양하였다. 배양 후 배양액의 흡광도 (OD660)를 측정하여 아로니아 추출물에 따른 균주의 생장률을 측정하였다. 그 결과 아로니아 추출물의 농도가 높아짐에 따라 균체 생장이 점차 감소되는 것으로 나타났다 (도 7).
실시예 3 영양성분에 따른 최적발효조건
실시예 3.1 탄소원에 따른 균체 생육 및 탄닌 저감화
Kazachstania servazzii MT-Y-2의 균체 생육 및 탄닌 저감화를 위한 최적배지조건을 결정하기 위하여 탄소원의 종류 및 농도에 의한 균체 생육과 탄닌 저감화를 조사하였다. 탄소원을 제거한 YM 배양액에 단당류인 글루코오스 (glucose), 갈락토오스 (galactose), 프룩토오스 (fructose), 이당류인 락토오스 (lactose), 말토오스 (maltose), 수크로오스 (sucrose), 삼당류인 라피노오스 (raffinose), 다당류인 전분 (starch) 및 당알코올류인 만니톨 (mannitol)을 각각 1%(w/v)씩 첨가하고 아로니아 추출물을 5% (v/v) 첨가한 후 초기 pH를 5.0으로 조정하였다. 그 결과, 글루코오스 (glucose), 만니톨 (mannitol), 프룩토오스 (fructose), 말토오스 (maltose) 순서로 우수했고, 글루코오스 (glucose) 및 만니톨 (mannitol)은 비슷한 생육을 나타냈으며, 그 중 글루코오스 (glucose)가 가장 우수한 균체생육을 나타냈다 (표3 및 도 8). 따라서 탄소원을 글루코오스 (glucose)로 확정하고 YM 배양액에 글루코오스 (glucose)를 1.0 %, 5.0 %, 10.0 %, 15.0 % 및 20.0 % (w/v) 농도로 첨가하여 Kazachstania servazzii MT-Y-2 전배양액의 3 % (v/v)를 접종하고 135 rpm, 30 ℃에서 2일 배양한 후 균체 생육을 측정한 결과, 글루코오스 (glucose)가 10 %일 때 균체 생육이 가장 우수함을 볼 수 있었다 (도 9).
Carbon source Cell growth (A660)
Lactose 0.355
Galactose 0.353
Starch 0.331
Glucose 0394
Maltose 0.370
Mannitol 0.392
Fructose 0.381
Raffinose 0.340
Sucrose 0.326
실시예 3.2 질소원에 따른 균체 생육 및 탄닌 저감화
질소원을 제거한 YM 배양액에 탄소원인 glucose 10%를 고정시키고 유기태 질소원인 소이톤 (soytone), 카지톤 (casitone), 효모 추출물(yeast extract), 맥아 추출물 (malt extract), 펩톤 (peptone), 트립톤 (tryptone), 폴리펩톤 (polypeptone)과 무기태 질소원인 요소를 각각 1 % (w/v)씩 첨가하고 아로니아 추출물을 5 % (v/v) 첨가한 후 초기 pH를 5.0으로 조정하였다. Kazachstania servazzii MT-Y-2 전배양액을 3 % (v/v) 접종 한 후 135 rpm, 30 ℃에서 2일 배양 후 균체 생육을 측정하였다. 그 결과, 카지톤 (casitone), 트립톤 (tryptone), 소이톤 (soytone) 및 펩톤 (peptone) 순서로 우수함을 알 수 있었다 (도 10). 이 중 트립톤과 카지톤의 균체 생육이 똑같이 나타났으며 경제적인 부분에서 카지톤보다 트립톤이 낫다고 고려되어 트립톤을 질소원으로 확정하였다. 따라서 글루코오스 (glucose)가 10%로 고정된 YM 배양액에 트립톤 (trypone)을 1.0 %, 2.0 %, 3.0 %, 4.0 % 및 5.0 % (w/v) 농도로 첨가하여 효모 전배양액의 3 % (v/v)를 접종하고 135 rpm, 30 ℃에서 2일 배양한 후 균체 생육을 측정한 결과, 트립톤 (tryptone)이 3%일 때 균체 생육이 가장 우수함을 볼 수 있었다 (표 4 및 도 11).
Nitrogen sources Cell growth (A660)
Malt extract 0.340
Tryptone 0.432
Polypeptone 0.391
peptone 0.406
Yeast extract 0.359
Soytone 0.414
Casitone 0.432
실시예 3.3 무기염류에 따른 균체 생육 및 탄닌 저감화
YM broth (Difco, USA)조성에는 무기염류가 없지만 국내 논문 중에 무기염류를 첨가하여 균체 생장을 촉진시킬 수 있으므로 무기염류에 의한 균체 생육 및 탄닌 성분 저감화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 글루코오스 (glucose) 및 트립톤 (tryptone)을 첨가한 YM 배양액에 무기염류인 황산 망간 (manganese sulfate), 염화 나트륨 (sodium chloride), 염화 칼슘 (calcium chloride), 이인산 칼륨 (dipotassium phosphate), 염화 칼륨 (potassium chloride)을 각각 1 % (w/v)씩 첨가하고 아로니아 추출물을 5 % (v/v) 첨가한 후 초기 pH를 5.0으로 조정하였다. Kazachstania servazzii MT-Y-2 전배양액을 3 % (v/v) 접종 한 후 135 rpm, 30 ℃에서 2일 배양 후 균체 생육을 측정하였다. 그 결과, 염화 나트륨 (sodium clhloride), 이인산 칼륨 (dipotassium phosphate), 염화 칼륨 (potassium chloride) 순으로 생육이 우수했으며, 황산 망간 (maganese sulfate)와 염화 칼슘 (calcium chloride) 첨가 시 생육이 거의 이뤄지지 않았다 (도 12). 따라서 염화 나트륨 (sodium chloride)을 무기염류로 확정하고 글루코오스 (glucose) 10 % 및 트립톤 (tryptone) 3 %를 고정으로 한 배양액에 염화 나트륨 (sodium chloride) 의 농도를 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 1.5 % (w/v)로 달리하여 균체의 생육을 측정하였다. 그 결과, 염화 나트륨 (sodium chloride)의 농도가 0.1 %일 때의 생육이 YM 배양액에 아로니아를 첨가하여 균을 배양했을 때 및 탄소원과 질소원을 고정하여 균을 배양했을 때 보다 더 높았으며 일반적인 YM 배양액보다 무기염류를 첨가했을 때 균체의 배양이 더 잘 됨을 알 수 있었다 (표 5).
Inorganic salt sources Cell growth (A660)
Manganese sulfate 0.022
Sodium chloride 0.410
Calcium chloride 0.015
Dipotassium phosphate 0.379
Potassium chloride 0.356
실시예 4. HPLC 분석
본 발명의 균주의 탄닌 저감화 효능을 정성 및 정량적으로 분석하기 위해 HPLC를 수행하였다. HPLC는 영린기기(Seoul, Korea)의 ACME 9000을 사용하였고, 클로로포름, 메탄올, 아세토니트릴은 Mallinckrodt Baker사 (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 탄닌류의 표준물질인 (+)-카테킨과 (-)-에피카테킨은 Sigma-Aldrich사 (USA)에서 구입하였다. 탄닌 성분의 HPLC 표준 피크를 확인하기 위하여 (+)-카테킨, (-)-에피카테킨 표준물질을 HPLC 분석 한 결과, (+)-카테킨은 10분에서 (-)-에피카테킨은 16분에서 나타났다 (도 14). 아로니아 추출물에서 확인된 여러 개의 피크 중 (+)-카테킨 피크가 확인된 10분에는 뚜렷한 피크가 확인되지 않고 8-10분까지 지속적인 피크가 확인됨으로써, (+)-카테킨의 피크가 여러 혼합 물질에 겹쳐서 확인되었다. 또한, (-)-에피카테킨 피크가 나타난 16분에는 피크가 명확하게 확인되었다. 영양성분이 최적 조건으로 함유된 배지에서 배양된 균주의 반응물을 HPLC로 분석한 결과, 글루코오스 10%(w/v) 농도로 배양된 반응물의 경우, 10분에 나타나는 (+)-카테킨은 존재하지만 16분에 나타나는 (-)-에피카티킨은 검출되지 않았다 (도 15). 따라서 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2 균주가 위 조건에서 탄닌을 저감화 하는 것이 확인되었다. 트립톤 (Tryptone) 3%(w/v) 농도로 배양된 반응물의 경우 탄소원과 마찬가지로 질소원에서도 10분에 (+)-카테킨 피크가 확인되었지만, (-)-에피카테킨 피크는 작은 면적으로 검출되었다. 염화 나트륨 (sodium chloride) 0.1%(w/v) 농도로 배양된 반응물의 경우 10분에 (+)-카테킨 피크가 존재하였으며, 트립톤과 마찬가지로 16분에 (-)-에피카테킨 피크가 작은 면적으로 확인되었다.
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는 데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11742P 20150727

Claims (7)

  1. 아로니아 추출물에 포함된 탄닌 성분을 저감시키기 위한 카자크스타니아 세르바지이 (Kazachstania servazzii ) MT-Y-2 균주 (기탁번호: KCCM11742P).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 탄닌 성분은 카테킨인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 아로니아 추출물을 포함하는 조성물에 카자크스타니아 세르바지이 MT-Y-2 균주 (기탁번호: KCCM11742P)를 접종하여, 아로니아 추출물 내 탄닌 성분을 저감시키는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 탄닌 성분은 카테킨인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 조성물에 락토오스 (lactose), 갈락토오스 (galactose), 전분 (starch), 글루코오스 (glucose), 말토오스 (maltose), 만니톨 (mannitol), 프룩토오스 (fructose), 라피노오스 (raffinose) 및 수크로오스 (sucrose)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 탄소원;
    맥아 추출물 (malt extract), 트립톤(tryptone), 폴리펩톤 (polypeptone), 펩톤 (peptone), 효모추출물 (yeast extract), 소이톤 (soytone) 및 카지톤 (casitone)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원; 및
    염화 나트륨 (sodium chloride), 이인산 칼륨 (dipotassium phosphate) 및 염화 칼륨 (potassium chloride)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 무기 염류를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스고, 상기 배지에 상기 글루코오스가 7 % 내지 13 % 포함되고; 상기 질소원은 트립톤이며, 상기 배지에 상기 트립톤이 1% 내지 4% 포함되며; 상기 무기염류는 염화 나트륨이고, 상기 배지에 상기 염화 나트륨이 0.01 % 내지 0.3 % 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항의 방법에 따라 제조된, 탄닌 성분이 저감된 아로니아 추출물.




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KR20190042174A (ko) * 2017-10-16 2019-04-24 전라북도(농업기술원) 떫은 맛이 감소된 아로니아 분말 및 이의 제조방법

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