KR20130094999A - 생균제제 특성을 갖는 카자크스타니아 에시구아 ｃｃｓｙ27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조 - Google Patents

생균제제 특성을 갖는 카자크스타니아 에시구아 ｃｃｓｙ27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 내산성, 위액 내성 내담즙성, 내당성, 내알코올성 및 알코올 생성능이 우수한 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법이 제공된다.

Description

생균제제 특성을 갖는 카자크스타니아 에시구아 ＣＣＳＹ27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조 {Kazachstania exigua CCSY27 strain having probiotics properties and preparation of makgeolli by using the strain}
본 발명은 생균제제(probiotics) 특성 및 알코올 생성능을 갖는 카자크스타니아 에시구아 (Kazachstania exigua) CCSY27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법에 관한 것으로, 더 상세히는 내산성, 위액 내성 내담즙성, 내당성, 내알코올성 및 알코올 생성능이 우수한 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법에 관한 것이다.
생균제제 (프로바이오틱스; probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물, 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물, 및 그들이 생산해 내는 생산물을 말한다(Fuller, R. J Appl Bacteriol. 66(5):365-378, 1989). 아울러 생균제제는 사람이나 동물에 건조된 세포형태나 발효산물 형태로 공급되어 사람이나 동물 숙주의 장내 균총을 개선함으로서 좋은 영향을 주는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 생균제제가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성, 장으로 가는 동안 살아남아야 한다. 더 나아가서 전달 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지 및 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야 하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야 한다(Mishra, C. et al., Asia Pacific J Clin Nutr. 5:20-24, 1996).
최근 웰빙 및 로하스 트렌드 확산으로 우리민족 고유의 전통주에 관한 관심이 높아지면서 특유의 청량미와 낮은 알코올 함량의 혼탁한 술인 막걸리는 새로운 전환기를 맞이하고 있다.
막걸리는 찹쌀, 멥쌀, 보리쌀, 현미, 옥수수, 고구마, 밀 등의 전분질을 원료로 하고 발효제로서 누룩을 첨가하여 발효시킨 술덧을 혼탁하게 제성한 우리나라 고유의 전통주로, 단맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛과 청량감이 있고 알코올 함량이 2-8%인 술이다. 다른 주류와 달리 막걸리는 각종 영양원이 풍부하게 함유되어 있는데, 인체 신진대사에 관여하는 비타민 B군을 비롯한 라이신, 류신, 아르기닌 등의 필수 아미노산, 풍미물질인 에틸아세테이트, 아밀아세테이트, 에틸카르로에이트 등의 에스테르, 새콤한 맛을 내어 갈증을 해소케 하는 유기산, 그리고 간 기능을 도와주는 아세틸콜린 등이 함유되어 있다. 이와 같이 막걸리는 영양학적 및 기능적 가치가 높을 뿐만 아니라 생효모가 함유되어 있기 때문에 다른 주류와 비교할 수 없는 독특한 맛을 지니고 있다.
현재 통상적으로 막걸리 제조는 2단 혹은 3단 담금법에 의하는데, 누룩, 알코올 발효 효모 및 용수를 이용하여 발효 (1단 담금)하여 밑술을 제조한 후, 밑술에 곡류 원료, 누룩 및 용수를 추가하여 발효시켜 (2단 담금) 막걸리를 완성한다. 이때 사용되는 알코올 발효 효모로는 주로 사카로마이세스 세레비아제 (Saccharomyces cereviase) 종이었다.
이에 사카로마이세스 세레비아제 균주 이외에 전통 발효식품의 토착 미생물 발굴과 막걸리 주조성을 가지면서도 그 외 기능성을 갖는 대체 균주 개발과 더불어 그것을 이용한 막걸리의 제조방법의 개발이 요구되어 왔다.
종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 전통 발효식품 유래 막걸리 주조성 및 생균제제 특성을 갖는 카자크스타니아 에시구아 (Kazachstania exigua) CCSY27 균주를 발견/동정하고 이 균주는 사카로마이세스 세레비아제 균주를 대체하여 우수한 특성의 막걸리를 제조할 수 있게 한다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 막걸리 제조를 위한 효모 균주로 사용될 수 있는 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 이용하여 막걸리를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 막걸리 제조를 위한 효모 균주로 사용될 수 있는 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 제공한다.
본 발명자들은 식초로부터 생균제제 특성 (내산성, 위액 내성, 내답즙성) 및 막걸리 주조성 (내당성, 내알코올성 및 알코올 발효능) 등 우수한 특성을 지닌 균주를 확인/동정하였고, 이 균주를 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 로 명명한 후 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2011년 4월 11일에 수탁번호 KACC93119P를 부여받았다 (실시예 1).
카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주의 26S rDNA 염기서열 (도 1)을 결정하였고 이를 기초로 하여 BLAST 네트워크 서비스와 DNA 서열 데이터베이스를 제공하는 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균종의 26S rDNA 염기서열과 정렬하여 카자크스타니아 속에 속함을 알 수 있었다 (도 2).
카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주는 pH 3.0 조건에서 3 시간 배양후 60% 이상의 생존율을 보이고, 인공위액 조건에서 3 시간 배양후 50% 이상의 생존율을 보이고 담즙 1~4% 조건에서 생육가능하였고, 당 농도 30%에서 OD600nm 4 이상의 생육성, 알코올 농도 10%에서 OD600nm 3.00 이상의 생육성을 나타냈고, 10%(v/v) 의 알코올 발효능을 가졌다 (표 1~ 표 5, 표 7).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 알코올 발효 균주로 사용하는 것을 특징으로 하는 막걸리 제조방법이 제공된다.
본 발명의 막걸리 제조에 사용되는 곡류 원료로는 쌀, 도정밀을 단독으로 또는 두 가지 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 곡류 원료는 물로 세척 후, 물을 부어 실온에서 충분히 침지한 후 물기를 제거하고 95 ~ 100℃에서 30 ~ 60분 동안 증자하여 냉각한 후 사용한다. 특히 쌀과 도정밀을 5 : 5 또는 4 : 6의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한 쌀과 도정밀은 가루로 만들어 사용할 수도 있다.
막걸리 제조는 통상의 방법에 의한다. 예를들면 다음과 같이 2단 단금법으로 제조할 수 있다. 누룩 : 용수를 1 : 1.5의 중량비로 혼합한 후 본 발명의 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주 배양물를 첨가하여 25℃에서 20 ~ 28 시간 발효시켜 밑술을 제조한다 (1단 담금). 이때 본 발명의 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주 배양물의 첨가량은 2 ~ 5 %(v/v)가 바람직하다. 제조된 밑술 18 ~ 20 중량%에 곡류 원료 25 ~ 27 중량% , 누룩 2 ~ 3 중량% 및 용수 52 ~ 53 중량%를 혼합하여 25℃에서 5 ~ 10일 동안 발효한다 (2단 담금).
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 막걸리는 통상의 알코올 발효 효모인 사카로마이세스 세레비아제 균주로 제조한 막걸리에 필적하는 pH, 산도, 당도 및 알코올 함량을 갖는다 (실시예 3). 또한 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 막걸리는 기호성도 우수하였다 (실시예 3 및 4). 또한 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 막걸리는 생균제제를 제공하는 기능성 식품으로서의 역활도 한다.
본 발명의 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주는 막걸리 주조성 및 생균제제 특성을 지녀서 종래의 막걸리 제조용 효모 균주인 사카로마이세스 세레비아제 균주를 대체하여 우수한 특성의 막걸리를 제조할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 막걸리는 생균제제를 제공하는 기능성 식품으로서의 역활도 한다.
본 발명의 막걸리 제조방법은 막걸리 주조성이 우수하여 우리밀과 우리쌀의 활용성을 극대화할 수 있다.
도 1은 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주의 26S 라이보좀 DNA 염기서열이다.
도 2는 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주의 계통발생학적 유연관계도이다.
도 3은 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 이용한 막걸리의 제조의 일례를 보여주는 공정도이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 균주 분리 및 특성 확인
막걸리(진주 탁주 및 고성 하이 막걸리), 식초(감식초 및 포도식초), 와인(포도 와인 및 다래 와인)으로부터 효모 균주를 다음과 같이 순수 분리했다: 각각의 시료를 1 ml 취하여 9 ml의 멸균증류수에 순차적으로 희석하여 10,000배로 희석하고 이를 0.1 ml 취하여 감자한천배지(PDA; potato dextrose agar, Becton & Dicknson사, USA)에 도말하였다. 도말한 배지를 30℃에서 48시간 배양한 후 크고 탁한 전형적인 효모 형태의 클론을 선택하여 다시 PDA에서 순수 분리하여 30℃에서 48시간 배양하였다.
순수 분리된 21개 균주에 대해 CCSY01 ~ CCSY20 및 CCSY27로 칭하여 분류한 후, 내산성, 인공위액 내성, 담즙산 내성, 당 내성, 알코올 내성에 대해 시험하였다. 양성 대조구로서 통상의 막걸리 제조에 사용되어 오던 효모 균주인 사카로마이세스 세레비아제 TJY01 균주 (진주탁주협회에서 분양)를 사용하여 동일하게 시험하였다.
내산성 측정은 각각의 균주를 PDB (potato dextrose broth, Becton & Dicknson사, USA) 액체배지에서 30℃에서 48시간 배양하고 3M 염산으로 pH 3으로 조정된 새로운 PDB 액체배지로 106 CFU/ml로 희석했다. 희석된 균체들을 37℃에서 3시간 및 6시간 배양 후, 배지 산성도를 중화시키기 위해서 포스페이트 버퍼 (0.1 M, pH 6.2)에서 균체를 연속적으로 희석시키고 30℃에서 48시간 배양한 후에 PDA 평판배지 상에서 생균수를 측정했다. 생존율은 초기 균의 농도와 PDA 평판배지 상에 형성된 효모의 콜로니 비율을 비교하여 계산했고, 그 결과를 표 1에 나타냈다.
균주 분리원 생존률 (%) 균주 분리원 생존률 (%)
배양시간 배양시간
3 6 3 6
TJY01 막걸리 16.6 0.6 CCSY11 막걸리 18.1 0.6
CCSY01 식초 73.8 35.0 CCSY12 막걸리 26.1 5.4
CCSY02 식초 69.0 29.5 CCSY13 와인 67.3 32.7
CCSY03 식초 48.6 19.3 CCSY14 와인 25.3 1.4
CCSY04 식초 37.5 14.0 CCSY15 와인 12.1 0
CCSY05 식초 44.4 22.2 CCSY16 식초 52.0 33.6
CCSY06 식초 12.9 1.8 CCSY17 식초 48.6 23.8
CCSY07 막걸리 37.8 6.3 CCSY18 식초 66.6 28.3
CCSY08 막걸리 14.0 0.1 CCSY19 식초 45.7 22.4
CCSY09 막걸리 27.5 5.9 CCSY20 식초 45.5 18.1
CCSY10 막걸리 15.0 0.3 CCSY27 식초 60.8 29.3
PD 액체배지에서 3반복 수행하였음.
<균주의 산(pH 3.0)에서 생존율>
인공위액 내성 측정은 PDB 액체배지에 1% 펩신을 첨가하여 pH 3으로 맞춰 인공위액을 만든 후, 그 외 과정은 위에서 기재된 내산성 측정과 동일하게 실시했고, 그 결과를 표 2에 나타냈다:
균주 분리원 생존률 (%) 균주 분리원 생존률 (%)
배양시간 배양시간
3 6 3 6
TJY01 막걸리 7.1 0.2 CCSY11 막걸리 4.7 0
CCSY01 식초 58.7 25.3 CCSY12 막걸리 13.4 2.3
CCSY02 식초 55.9 20.1 CCSY13 와인 51.7 26.5
CCSY03 식초 40.4 22.9 CCSY14 와인 12.1 0
CCSY04 식초 23.4 3.6 CCSY15 와인 1.4 0
CCSY05 식초 41.0 18.7 CCSY16 식초 43.0 23.6
CCSY06 식초 32.0 9.7 CCSY17 식초 36.7 2.1
CCSY07 막걸리 15.1 0.4 CCSY18 식초 50.3 24.7
CCSY08 막걸리 5.2 0 CCSY19 식초 25.5 2.1
CCSY09 막걸리 17.6 3.2 CCSY20 식초 31.4 15.3
CCSY10 막걸리 9.0 0 CCSY27 식초 52.9 28.6
PD 액체배지에서 3반복 수행하였음.
<균주의 인공위액 산(pH 3.0) 조건에서 생존율>
담즙산 내성은 30℃에서 48시간동안 PDB 액체배지에서 배양한 균체 15㎕(106 CFU/ml과 동일)를 다른 농도(1, 2, 4% w/v)의 황소담즙(oxgall bile)을 함유한 각각의 PDA 평판배지 상에 스폿팅(spotting)한 후, 30℃에서 5일 동안 배양했다. 스폿을 육안 검사하여 균주 생장 여부를 판단하여 그 결과를 표 3에 나타냈다:
분리균주 분리원 생육정도 분리균주 분리원 생육정도
담즙산 농도(%) 담즙산 농도(%)
1 2 3 4 1 2 3 4
TJY01 막걸리 + + + + CCSY11 막걸리 + + + +
CCSY01 식초 + + + + CCSY12 막걸리 + + + +
CCSY02 식초 W W W W CCSY13 와인 + + + +
CCSY03 식초 + + + + CCSY14 와인 + + + +
CCSY04 식초 + + + + CCSY15 와인 + + + +
CCSY05 식초 + + + + CCSY16 식초 + + + +
CCSY06 식초 + + + + CCSY17 식초 + + + +
CCSY07 막걸리 + + + + CCSY18 식초 + + + +
CCSY08 막걸리 + + + + CCSY19 식초 + + + +
CCSY09 막걸리 + + + + CCSY20 식초 + + + +
CCSY10 막걸리 + + + + CCSY27 식초 + + + +
PD 고체배지에서 3반복 수행하였음.
<균주의 담즙 농도별 생육여부; w(week): 생약정도가 약함>
당 내성 측정은 PDB 액체배지에 0 ~ 30% 설탕을 첨가하고 각각의 균주를 5.0%(v/v)로 첨가한 후 37℃에서 48시간 액체배양한 후 흡광도(600nm)를 측정하여 균주 생육정도를 결정하였고 그 결과를 표 4에 나타냈다:
균주 분리원 생육정도 ( OD 600 nm ) 균주 분리원 생육정도 ( OD 600 nm )
설탕 농도(%) 설탕 농도(%)
0 10 20 30 0 10 20 30
TJY01 막걸리 7.15 5.44 4.32 3.21 CCSY11 막걸리 8.19 7.70 6.57 5.15
CCSY01 식초 6.10 5.08 4.21 3.08 CCSY12 막걸리 7.81 6.13 5.09 4.23
CCSY02 식초 5.22 4.11 3.22 2.26 CCSY13 와인 7.69 5.90 4.88 3.46
CCSY03 식초 8.81 6.51 5.65 4.38 CCSY14 와인 3.84 4.25 2.53 2.13
CCSY04 식초 9.75 8.18 6.18 3.51 CCSY15 와인 8.37 5.11 5.85 4.75
CCSY05 식초 8.44 7.02 5.74 5.04 CCSY16 식초 7.85 6.58 5.69 5.23
CCSY06 식초 6.78 6.03 5.25 4.71 CCSY17 식초 7.47 6.53 5.57 4.72
CCSY07 막걸리 7.11 5.02 4.37 3.69 CCSY18 식초 7.79 6.41 5.50 5.46
CCSY08 막걸리 7.22 5.65 4.31 3.30 CCSY19 식초 8.94 6.55 5.29 4.24
CCSY09 막걸리 7.50 6.41 4.83 3.81 CCSY20 식초 7.60 6.24 4.52 4.03
CCSY10 막걸리 7.08 4.39 3.53 2.16 CCSY27 식초 8.69 6.07 5.00 4.44
PD 고체배지에서 3반복 수행하였음.
<균주의 설탕 농도별 생육여부>
알코올 내성 측정은 PDB 액체배지에 0 ~ 15% 알코올을 첨가하고 각각의 균주를 5.0%(v/v) 첨가한 후 37℃에서 48시간 액체배양한 후 흡광도(600 nm)에서 측정하여 균주 생육정도를 결정하였고 그 결과를 표 5에 나타냈다:
균주 분리원 생육정도 ( OD 600 nm ) 균주 분리원 생육정도 ( OD 600 nm )
알코올 농도(%) 알코올 농도(%)
0 5 10 15 0 5 10 15
TJY01 막걸리 7.21 5.18 1.36 0.22 CCSY11 막걸리 7.40 5.87 2.63 0.45
CCSY01 식초 6.46 2.83 0.26 0.20 CCSY12 막걸리 6.64 4.8 2.8 0.33
CCSY02 식초 4.62 4.21 0.24 0.14 CCSY13 와인 6.98 4.27 1.08 0.18
CCSY03 식초 8.29 4.45 2.79 0.29 CCSY14 와인 3.11 2.37 0.13 0.07
CCSY04 식초 9.11 8.73 5.33 0.30 CCSY15 와인 7.49 5.19 3.41 0.31
CCSY05 식초 7.56 6.79 0.26 0.11 CCSY16 식초 7.90 4.82 2.25 0.29
CCSY06 식초 6.07 4.12 2.05 0.23 CCSY17 식초 6.8 3.33 1.73 0.29
CCSY07 막걸리 7.13 4.63 3.65 0.30 CCSY18 식초 7.08 6.13 1.84 0.32
CCSY08 막걸리 7.28 5.34 1.30 0.20 CCSY19 식초 9.27 5.34 3.46 0.57
CCSY09 막걸리 8.18 5.32 2.98 0.40 CCSY20 식초 6.71 4.81 2.35 0.38
CCSY10 막걸리 7.90 6.44 2.89 0.35 CCSY27 식초 7.65 4.86 3.34 0.39
PD 고체배지에서 3반복 수행하였음.
<균주의 알코올 농도별 생육여부>
위와 같은 내산성, 위액 내성, 담즙산 내성, 당 내성 및 알코올 내성의 특성을 모두 고려하여 분리된 균주들 중에서 CCSY27을 선별하게 되었다.
실시예 2: 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주 동정 및 기탁
선별된 CCSY27 균주를 PDB 액체배지 5 ml에 2.5%(0.125 ml, v/v) 접종하고 30℃에서 48시간 배양한 후 1.5 ml 소형 원심분리 튜브를 사용하여(3회) 약 5 ml 정도 취한 후 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 균체를 모집하고 DNAzol kit(Invtrogen사, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리했다. 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 94℃에서 1분간 변성, 52℃에서 30초간 풀림, 72℃에서 30초 신장의 사이클을 30 회 수행하여 26S rDNA (0.6 kb 단편)을 증폭했다. 증폭된 26S rDNA PCR 산물을 1% 아가로스에 전기영동하고 0.6 kb 단편을 회수 및 정제한 후 pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA)를 사용하여 클로닝하고 대장균(Escherichia coli) DH5α에 형질전환 후, 형질전환체를 무작위로 선정하여 순수 분리하고, 순수 분리된 형질전환체를 50 μg의 앰피실린 함유된 LB (Luria-Bertani broth, Becton & Dicknson사, USA) 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양한 후 균체를 모집하고 플라스미드 정제 Kit (Intron, Suwon, Korea)에 기술된 대로 플라스미드를 분리 정제했다. 분리된 플라스미드를 서열 결정 주형가닥으로 사용하였다. 핵산 염기서열은 PRISM Ready Reaction Dye terminator/primer cycle sequencing kit를 사용한 디데옥시 사슬 종결법을 이용하여 분석하여 그 염기서열 639 bp를 결정하였다 (도 1). 이 26S rDNA 염기서열은 BLAST network service와 DNA sequence database를 제공하는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균들의 것과 상동성을 분석하여 최종 동정했다 (도 2).
이와 같이 동정된 균주를 카자크스타니아 에시구아 CCSY27로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 특허균주를 기탁하여 2011년 4월 11일자로 수탁번호 KACC93119P를 부여받았다.
실시예 3: 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 사용하여 막걸리 제조
실시예 2에서 선별된 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주를 밀 당화액(10% 밀당화액, 설탕 2%, 펩톤 1%, 효모 추출물 1%) 50 ml에 2.5%(1.25 ml) 접종하여 30℃ 48시간 배양한 후 그 배양액을 누룩 ((주)오름주가)과 정제수를 다음 표 6과 같은 조성으로 1.2 리터 유리 발효조에 넣고 25℃에서 1일 동안 발효하여 밑술 제조(1단 담금)한 후, 증자된 쌀, 누룩 및 정제수를 표 6와 같이 첨가한 후, 25℃에서 7일 동안 발효 (2단 담금)하여 막걸리를 완성하였다. 양성대조구로서 사카로마이세스 세레비아제 TJY01 균주 (진주탁주협회에서 분양받음)를 사용하여 동일하게 막걸리를 제조하였다.
1담금 효모
누룩
정제수 		4 mL
56 g
80 mL		 0.52%
7.27%
10.39%
2담금 증자 쌀
누룩
정제수 		200 g
20 g
410 mL		 25.97%
2.60%
53.25%
합계 770 mL(g) 100.00%
<막걸리 담금 비율>
제조된 막걸리의 pH, 산도, 당도 및 알코올 함량을 측정하여 그 결과를 표 7에 나타냈다.
하기 실시예에서 제조된 막걸리에 대해서는 pH 및 산도, 브릭스 당도, 알코올 함량, 갈변도, 탁도를 분석하였고 관능평가를 수행하였다. 분석을 위해 막걸리 를 4겹의 거즈로 여과한 시료를 사용하였다.
pH는 여과한 시료 50 mL을 pH 미터 (model 3510, Jenway, UK)를 사용하여 측정하였고, 산도는 여과한 시료 10 mL를 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.3±0.1까지 중화시키데 소요된 0.1N-NaOH의 소비 mL 수를 구한 후 초산(acetic acid)으로 환산하였고, 당도는 여과한 시료를 원심분리기(Hanil micro-12, Korea)로 원심분리한 후 상등액을 취하여 굴절당도계(N-1α, Atago Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였고, 알코올 함량은 여과한 시료 100 mL에 동량의 증류수를 가한 후 증류한 다음 주정계를 이용하여 측정하였으며 Gay Luccac Table을 이용하여 15℃로 보정하였다.
균주 분리원 분석항목
pH 산도
(%, 젖산) 		브릭스
당도(°) 		알코올
(%, v/v)
TJY01 막걸리 3.98 1.61 8.2 10.0
CCSY27 식초 4.04 1.80 8.0 10.0
각각의 균주를 5.0%(v/v) 접종하여 25에서 7일간 막걸리를 발효하였음.
<막걸리의 이화학적 특성>
상기 표로부터, 본 발명의 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 균주로 제조한 막걸리는 사카로마이세스 세레비아제 TJY01 균주로 제조한 막걸리에 필적하는 pH, 산도, 당도를 가지며, 알코올 함량 또한 10%로 높았다.
실시예 4: 카자크스타니아 에시구아 CCSY27 를 이용한 막걸리 제조시 우리밀 -쌀 최적 혼합비 시험
카자크스타니아 에시구아 CCSY27를 이용하여 쌀과 밀의 혼합비를 달리하여 막걸리를 제조하여 최적 혼합비를 구하였다.
쌀을 1 kg 달아 물로 세척한 다음 충분한 물을 부은 후 실온(15-20℃)에서 12시간 침지하였고, 도정밀 1 kg 달아 물로 세척한 다음 충분한 물을 부은 후 실온에서 4시간 침지한 후 30분간 물기를 제거했다. 물기가 제거된 각각의 시료를 100℃에서 1시간 동안 증자하여 냉각했다. 증자된 쌀과 증자된 도정밀을 10 : 0, 8 : 2, 6 : 4, 5 : 5, 4 : 6, 2 : 8 및 0 : 10 중량비로 혼합하여, 표 8과 같은 담금 비율하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3에서와 동일한 과정으로 막걸리를 제조하였다 (도 3).
1담금 효모
누룩
정제수 		40 mL
560 g
800 mL 		0.52%
7.27%
10.39%
2담금 쌀 : 밀 = 4 : 6
누룩
정제수 		2000 g
200 g
4100 mL		 25.97%
2.60%
53.25%
합계 7700 mL (g) 100.00%
제조된 막걸리의 이화학적 특징, 균수, 갈변도, 탁도, 관능평가를 수행하였다.
이화학적 특징은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과를 표 9에 나타냈다.
비율
(쌀 : 밀) 		분석항목
pH 산도
(%, 젖산) 		브릭스 당도(°) 알코올
(%, v/v)
10 : 0 3.86 1.14 7.8 12.0
8 : 2 3.86 1.48 7.8 11.0
6 : 4 3.85 1.50 7.6 11.0
5 : 5 3.88 1.52 7.4 11.0
4 : 6 3.87 1.54 7.2 10.0
2 : 8 3.85 1.72 7.2 9.0
0 : 10 3.88 1.74 7.2 9.0
<밀과 쌀의 혼합비에 따른 막걸리의 이화학적 특징>
젖산균수는 여과한 시료를 멸균생리수로 적당히 희석하여 브로모크레솔 퍼플(bromocresol purple; BCP) 0.02%를 함유한 MRS (lactobacilli MRS broth, Becton & Dicknson사, USA) 평판배지에 도말하고 30℃ 배양기에서 48시간을 배양 후 황색 집락을 계수하여 총 젖산균으로 계산하였고, 효모균수 역시 여과한 시료를 멸균생리수로 적당히 희석하여 크로람페니콜(1.5 mg/mL) 함유된 PDA 배지에 도말한 후 30℃에서 48시간을 배양 후 생성된 집락을 계측하였다. 각 실험은 3회 반복하여 수행하여 평균값으로 나타내었으며 시료 mL당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)로 표시하였다. 그 결과를 표 10에 나타냈다.
비율
(쌀 : 밀) 		생균수( cfu / ml )
총균수 젖산균수 효모균수
10 : 0 3.6×107 1.6×106 2.3×106
8 : 2 4.0×107 2.3×106 2.7×106
6 : 4 4.1×107 2.1×106 2.5×106
5 : 5 4.4×107 2.9×106 2.6×106
4 : 6 4.3×107 3.1×106 2.4×106
2 : 8 4.1×107 2.5×106 2.5×106
0 : 10 4.2×107 2.9×106 2.2×106
<밀과 쌀의 혼합비에 따른 막걸리의 총균수 및 효모균수, 젖산균수>
갈변도는 여과한 시료를 원심분리기(Hanil micro-12, Korea)로 원심분리한 후 상등액을 취하여 분광광도계(Spectronic 2D, Thermo Electron Co., Califonia, USA)를 이용하여 흡광도 (420 nm)를 측정하였고, 탁도는 여과한 시료를 분광광도계(Spectronic 2D)를 이용하여 흡광도 (600 nm)를 측정하여 그 결과를 표 11에 나타냈다.
비율
(쌀 : 밀) 		갈변도( OD420 nm ) 탁도( OD600 nm )
10 : 0 0.127 2.425
8 : 2 0.167 2.430
6 : 4 0.169 2.432
5 : 5 0.190 2.431
4 : 6 0.209 2.447
2 : 8 0.237 2.429
0 : 10 0.300 2.441
<쌀과 밀 혼합비에 따른 막걸리의 갈변도와 탁도>
관능평가는 성인 30명 (20 ~ 30대)을 대상으로 제조된 막걸리의 향, 맛, 색 및 전체적인 기호도에 대해 '매우 좋다 5점, 좋다 4점, 보통이다 3점, 나쁘다 2점, 매우 나쁘다 1점'으로 하는 5점 척도법으로 관능성을 평가하였고 그 결과를 표 12에 나타냈다.
비율
(쌀 : 밀) 		향 맛 색 전체적인
기호도
10 : 0 3.90 4.55 4.25 4.15
8 : 2 3.85 4.50 3.80 4.15
6 : 4 3.95 4.55 3.80 4.20
5 : 5 4.25 4.50 4.20 4.50
4 : 6 4.30 4.70 4.10 4.55
2 : 8 4.15 3.95 4.15 4.10
0 : 10 3.75 3.80 4.00 4.05
<쌀과 밀 혼합비에 따른 막걸리의 관능평가>
상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 제조 방법에서 곡류 원료로서, 쌀과 밀을 단독으로 사용하는 것보다 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 쌀과 밀을 5:5 또는 4:6의 중량비로 혼합하여 사용하는 것임을 알 수 있다.
국립농업과학원농업유전자원센터 KACC93119 20110325

Claims (6)

  1. 막걸리 제조를 위한 효모 균주용 카자크스타니아 에시구아 (Kazachstania exigua) CCSY27 KACC93119P 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 pH 3.0 조건에서 3 시간 배양시 60% 이상의 생존율, 인공위액 조건에서 3 시간 배양후 50% 이상의 생존율, 담즙 1~4% 조건에서 생육성, 당 농도 30%에서 OD600nm 4 이상의 생육성, 알코올 농도 10%에서 OD600nm 3.00 이상의 생육성, 및 10%(v/v) 이상의 알코올 발효능을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 곡류 원료로 막걸리를 제조하는 방법으로,
    카자크스타니아 에시구아 (Kazachstania exigua) CCSY27 KACC93119P 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 곡류 원료는 쌀과 밀을 혼합한 것인 막걸리를 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 쌀과 밀은 5: 5의 중량비로 혼합하는 것인 막걸리를 제조하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 쌀과 밀은 4: 6의 중량비로 혼합하는 것인 막걸리를 제조하는 방법.
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