KR20190006003A - 3차원 조직체 - Google Patents

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아이노 하세가와
나츠코 헤미
사토시 이즈미
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Abstract

본 발명은, 3차원 조직체로서, 제1 유형의 세포를 포함하는 제1 세포 영역, 및 제1 유형의 세포와 상이한 제2 유형의 세포를 포함하는 제2 세포 영역을 포함하고, 여기서 제1 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포인 3차원 조직체를 제공한다.

Description

3차원 조직체
본 발명은 세포를 포함하는 3차원 조직체에 관한 것이다.
근년에, 줄기 세포 연구와 조직 공학의 진전에 따라, 복수의 세포로 이루어진 조직을 인공적으로 구성하는 기술이 개발되고 있다.
특히, 예를 들어 의약, 화장료 및 화학 물질의 안전성 및 효능을 평가할 때의 주요 과제는 살아 있는 동물을 이용하는 일 없이 시험관내에서 수행되는 시험 방법(동물 시험 대체 방법)을 개발하는 것이다. 그러나, 생체내에서와 같은 세포 기능 및 약물 반응 기작을 시험관내에서 완전 재생하는 것은 어렵다. 이에 관하여, 일반적인 2차원 배양(단층 배양)을 이용하는 것보다도, 3차원 배양을 이용하는 것이 생리학적 조건을 모방하는데 더 효과적이라는 점은, 예를 들면 피부, 간 및 암 종양의 연구로부터 이미 공지되어 있다.
세포내에서 일어나는 다양한 현상을 분석하는 수단으로서, 다양한 분자 프로브를 사용하는 측정 방법 및 바이오 이미징 기술이 개발되고 있다. 대표적인 예로서는 세포내로 도입된 리포터 유전자의 발현을 광 검출함으로써 유전자 전사 활성의 분석을 허용하는 것으로 공지되어 있는 리포터 유전자 어세(reporter gene assay)이가 있다. 외부 자극에 대한 반응을 광 검출하는 그러한 방법은, 예를 들면 약물에 대한 스크리닝 도구로서 사용될 수 있는 것으로 또한 공지되어 있다.
3차원 배양된 피부 세포를 시험 물질에 노출시키는 단계; 세포에서 특정 단백질 및 이 특정 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 측정하는 단계; 및 측정된 발현에 기초하여 시험 화합물의 피부 감작화 특성을 평가하는 단계를 포함하는, 물질의 피부 감작화 특성을 평가하는 방법이 제안되어 있다(예를 들면, PTL 1 참조).
또한, 2 이상의 상이한 표현형의 포유동물 세포의 3차원 집합체; 및 액체 증식 배지를 함유하는, 포유동물 조직의 시험관내 모델이 제안되어 있다(예를 들면, PTL 2 참조). 또한, PTL 2에는 하나 이상의 표현형의 세포가 3차원 집합체를 형성하기 전에 형광 염색에 의해 표지화되어 있는 포유동물 조직의 시험관내 모델을 이용하여, 세포의 증식을 억제하는 항암 약물과 같은 물질을 스크리닝하는 방법도 개시되어 있다.
인용 목록
특허 문헌
[PTL 1] 일본 (미심사) 특허 출원 공개 번호 2012-179020
[PTL 2] 국제 공개 번호 WO 2000/75286
본 발명의 목적은 외부 자극에 대한 3차원 조직의 특정 영역으로부터의 반응의 비파괴적 평가를 가능하게 하는 세포를 포함하는 3차원 조직체를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 3차원 조직체는 제1 유형의 세포를 포함하는 제1 세포 영역 및 제1 유형의 세포와는 상이한 제2 유형의 세포를 포함하는 제2 세포 영역을 포함한다.
제1 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학형광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포이다.
본 발명은 외부 자극에 대한 3차원 조직체의 특정 영역으로부터의 반응의 비파괴적 평가를 가능하게 하는 세포를 포함하는 3차원 조직체를 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수직 방향에서 취한 것이다.
도 1b는 본 발명의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수평 방향에서 취한 것이다.
도 2a는 실시예 1의 3차원 조직체를 제조하는 방법의 일례를 예시하는 도면으로서, 마이크로피펫을 사용하여 배양 용기 내로 NHDF 세포를 분배하는 상태를 도시하는 설명도이다.
도 2b는 실시예 1의 3차원 조직체를 제조하는 방법의 일례를 예시하는 도면으로서, 배열되는 NFkB-luc 세포를 고정하기 위해, 마이크로피펫으로 고정 인자를 첨가하여 박막을 형성하는 상태를 도시하는 설명도이다.
도 2c는 실시예 1의 3차원 조직체를 제조하는 방법의 일례를 예시하는 도면으로서, 잉크젯 바이오프린터(P)를 사용하여, 세포가 층으로 배열되고 그 층의 두께가 단일 세포의 높이를 갖도록 하는 방식으로, NFkB-luc 세포를 토출하는 상태를 도시하는 설명도이다.
도 2d는 실시예 1의 3차원 조직체를 제조하는 방법의 일례를 예시하는 도면으로서, NFkB-luc 세포의 층 상에, 콜라겐 용액 중에 현탁된 NHDF 세포를 마이크로피펫(M)으로 첨가하고, 세포 층이 고화될 때까지 정치하는 상태를 도시하는 설명도이다.
도 2e는 실시예 1의 3차원 조직체를 제조하는 방법의 일례를 예시하는 도면으로서, DMEM 배지를 첨가하고 배양에 의해 3차원 조직체를 생성시키는 상태를 도시하는 설명도이다.
도 3은 실시예 1의 3차원 조직체의 일례를 예시하는 현미경적 Z-스택 화상이다.
도 4는 실시예 2의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 단면도이다.
도 5는 실시예 3의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 단면도이다.
도 6은 대조예 1의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 단면도이다.
도 7은 비교예 1의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이다.
도 8은 비교예 2의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이다.
도 9a는 발광 강도 측정 동안 대조예 1의 3차원 조직체의 상태를 예시하는 도면이다.
도 9b는 발광 강도 측정 동안 실시예 2의 3차원 조직체의 상태를 예시하는 도면이다.
도 9c는 발광 강도 측정 동안 실시예 3의 3차원 조직체의 상태를 예시하는 도면이다.
도 10은 실시예 2, 실시예 3 및 대조예 1의 3차원 조직체의 평균 발광 강도 및 표준 편차를 작도하는 그래프이다.
도 11a는 실시예 4의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수평 방향에서 취한 것이다.
도 11b는 실시예 4의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수직 방향에서 취한 것이다.
도 12a는 실시예 5의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수평 방향에서 취한 것이다.
도 12b는 실시예 5의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이고, 여기서 개략 단면도는 수직 방향에서 취한 것이다.
도 13은 실시예 6의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시하는 개략 단면도이다.
(3차원 조직체)
본 발명의 3차원 조직체는 제1 유형의 세포를 포함하는 제1 세포 영역, 및 제1 유형의 새포와는 상이한 제2 유형의 세포를 포함하는 제2 세포 영역을 포함한다. 제1 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포이다(이러한 세포는 이후에는 "발광 세포"라고 칭할수도 있다.)
본 발명의 3차원 조직체는 후술하는 관찰들을 기초로 한다. 세포의 배치 또는 분포는 조직체를 파괴한 후 벌크로서의 조직체의 평균 반응의 측정을 오로지 허용하는 현행 세포 반응 평가 시스템의 3차원 조직체에서 제어되지 않는다. 그러므로, 현행 시스템을 이용하면, 복수 유형의 세포 간이 상호작용, 개별 세포가 배치되는 미소환경에서의 변화로 인한 반응 차이, 또는 자극원으로부터의 거리 및 그의 투과성 또는 전파성의 영향과 같은 3차원 조직체의 특정 영역으로부터의 반응을 비파괴적으로 평가하는 것이 곤란하다.
3차원 조직체는 시험관내에서 형성된다. 예를 들어, 형상, 기능 발현 및 세포 생존을 유지하는데 요구되는 배양 용기, 배지 또는 다른 공지의 재료가 의도된 용도에 따라 3차원 조직체에 적절히 사용된다.
3차원 조직체는 3차원 방향 각각에서 적어도 2개 세포의 두께를 갖도록 배열된다.
세포의 밀도는 구체적으로 제한되지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다.
3차원 조직체에서, 세포는 서로 직접 결합될 수 있거나, 또는 세포 간의 갭은 세포외 기질(ECM), 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸, 히알루로산, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 피브릴린, 키틴, 및 셀룰로즈, 스캐폴드, 또는 하기 기술된 고정제에 의해 충전될 수 있다.
제1 유형의 세포로서 정의된 발광 세포를 포함하는 영역(제1 세포 영역)은 발광 세포의 농후한 존재에 의해 확인되는 영역이다. 농후한 존재란 발광 세포가 영역 체적의 50% 이상(바람직하게는 영역 체적의 70% 이상)을 점유한다는 것을 의미한다. 제1 세포 영역으로부터 방출된 광의 검출은 발광 세포가 존재하지 않은 역역으로부터 제1 세포 영역을 구별하고, 자극-반응 평가의 표적인 영역의 경계를 정의하는 것을 가능하게 한다.
발광 세포와는 상이한 세포(제2 유형의 세포)를 포함하는 영역(제2 세포 영역)은 발광 세포의 비존재에 의해 확인된 영역이다.
발광 세포를 포함하는 영역 및 발광 세포와는 상이한 세포를 포함하는 영역은 서로 인접하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 2개의 영역 사이에는, 발광 세포가 소량(체적의 50% 미만)으로 산재하는 영역이 존재할 수 있다.
외부 자극은, 구체적으로 제한되지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 외부 자극의 예로는 자극 물질에 대한 노출, 자극 물질의 도입, 물리적 변화, 예컨대 온도 및 압력 변화, 저산소 조건 및 산화 조건 또는 자외선 조사와 같은 스트레스 요인에 대한 노출, 배양 조건의 변화, 및 배양 용기 또는 스캐폴드 재료와의 접촉과 같은 세포 주위의 미소환경에 현저한 변화를 야기하는 인자가 포함된다.
3차원 조직체 내의 특정 위치에 존재하는 세포는, 예를 들어 주변 조직의 구조 차이 또는 자극원으로부터의 거리 차이로 인하여, 다른 영역에 존재하는 세포가 외부 자극에 반응하는 방식과 상이한 방식으로, 외부 자극에 대하여 반응할 수 있는 가능성이 있다. 예를 들어, 외부 자극이 특정 방향으로부터 3차원 조직체에 가해질 때, 자극의 정도, 즉 세포의 반응은 자극이 가해지는 계면에 수직인 축 상에서의 거리에 따라 변화할 수 있는 가능성이 있다. 이에 따라, 발광 세포를 포함하는 영역은 그 변화의 평가를 가능하게 하기에 적합한 거리로 배열되는 것이 바람직하다.
3차원 조직체는 자극 물질의 안전성 또는 효능의 평가에 또는 약물 스크리닝에 사용될 수 있다. 게다가, 약물동태 연구 또는 재생 의약의 개발을 위해, 3차원 조직체는 살아 있는 동물에 이식되어 조직 또는 기관 재생의 과정을 관찰할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 3차원 조직체의 전체 구성의 일례를 예시한 것이다. 도 1a는 xz 평면에 있어서 수직 방향으로 취한 개략 단면도이다. 도 1b는 도 1a의 X-X' 방향을 따른 (xy 평면에 있어서) 수평 방향으로 취한 개략 단면도이다.
3차원 조직체(10)는 배양 용기(14) 내에 순차적으로 적층된, 세포 A를 포함하는 영역(11), 세포 B를 포함하는 영역(12), 및 배지(13)로 구성된다.
제1 유형의 세포로서 정의된 세포 B는 발광 세포이다.
제2 유형의 세포로서 정의된 세포 A는 세포 B와 상이한 발광 세포일 수 있거나, 또는 발광 세포가 아닐 수 있다.
세포 B를 포함하는 영역(12)의 표면은, 배양 용기의 존재로 인한 인위적 결과를 피하기 위해, 배양 용기(14)의 원주 벽(circumferential wall)과 접촉하지 않는 것이 바람직하다. 구체적으로, 세포 B를 포함하는 영역(12)은 3차원 조직(10)의 중심부에 배열되는 것이 바람직하다. 이는 세포 B를 포함하는 영역(12)과 배양 용기(14) 간의 계면 영향을 제거하는 것을 가능하게 한다.
세포 B를 포함하는 영역(제1 세포 영역) 및 세포 A를 포함하는 영역(제2 세포 영역) 둘 다를 포함하는 전체 영역에 대하여, 제1 세포 영역의 비율은 제2 세포 영역의 비율보다 더 작은 것이 바람직하고, 전체 영역에 대한 제1 세포 영역의 체적비는 0.5 미만인 것이 바람직하며, 0.3 이하인 것이 더욱 더 바람직하다. 이러한 방식으로, 세포 B를 포함하는 영역은 제한되며, 전체 조직체로부터 별도로 평가될 수 있다.
세포 B를 포함하는 영역(12)은 자극이 가해지는 계면에 수직인 축 상에서의 특정 거리에 존재하는 것이 바람직하다. 이는 자극원으로부터의 거리 또는 자극 물질의 투과성의 영향을 평가하는 것을 가능하게 한다.
3차원 조직체는 세포 B를 포함하는 영역이 세포 A를 포함하는 영역 내에 존재하는 것만을 필요로 하고, 세포 B를 포함하는 영역은 층 형태를 가질 필요가 없다.
3차원 조직체는 세포 A 및 세포 B와 상이한 세포를 포함하는 영역을 더 포함할 수 있다. 이러한 경우, 세포 A 및 세포 B와 상이한 세포는 발광 세포일 수 있거나, 발광 세포가 아닐 수 있다.
<세포 A 및 세포 B를 배열하는 방법>
세포를 배열하는 방법은 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 공지의 방법이 적절히 이용될 수 있다. 그 방법의 예로는 피펫 분배 기법, 미세조작장치(micromanipulator), 잉크젯 기법, 겔 압출 기법, 전사 방법, 예컨대 스크린 인쇄 기법, 및 광 트위저(tweezer) 기법이 포함된다. 이들 방법 중, 수십 제곱 마이크로미터 내지 수 제곱 밀리미터의 좁은 영역에서 세포를 얇고 균일하게 효율적으로 배열한다는 측면에서, 잉크젯 기법이 바람직하다. 잉크젯 기법이 수 피코리터의 액적의 토출을 허용하기 때문에, 잉크젯 기법은 1개 내지 10개의 세포를 정밀하게 배열할 수 있다.
<세포 A 및 세포 B>
세포 A 및 세포 B는, 이 세포 A 및 세포 B가 3차원 조직체를 형성할 수 있는 한, 구체적으로 제한되어 있지 않다. 임의 유형의 세포, 예컨대 진핵 세포, 원핵 세포, 다세포 생물의 세포, 및 단세포 생물의 세포가 사용될 수 있다. 이들 세포 중에서도, 포유동물 또는 인간으로부터 유래되며, 그리고 세포가 물리화학적 처리 없이는 단리되지 않을 정도의 세포 접착능을 갖는 응집성 세포가 바람직하다.
<발광 세포>
발광 세포는 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출한다. 이는 외부 자극에 반응하여 세포 내에 일어나는 다양한 분자 기작을 분석하는 것을 가능하게 한다.
화학발광은 화학 반응을 수반하는 발광 현상이다. 화학발광의 예로는 퍼옥시다제가 과산화수소를 분해할 때 일어나는 루미놀 반응이 포함된다.
생물발광은 생물체에 의해 방출된 화학발광이며, 예를 들어 루시페라제의 작용에 반응하여 광의 형태로 에너지가 방출되는 현상을 언급한 것이다. 생물발광의 예로는 반딧불 루시페라제(효소)가 루시페린(기질)을 산화시킬 때 일어나는 광의 방출이 포함된다.
형광은 여기 상태의 물질이 바닥 상태로 되돌아갈 때 전자 전이를 따라 방출된 광이다. 생물체에 의한 형광의 예로는 해파리 에쿼리아 빅토리아(jellyfish Aequorea victoria)로부터의 녹색 형광 단백질(GFP)이 적당한 여기 광에 노출될 때 일어나는 녹색 광의 빙출이 포함된다.
리포터 유전자가 발광 세포 내로 도입되는 것이 바람직하다. 이는 반응에 대하여 모니터링되어야 하는 표적 유전자의 전사 활성을 기초로 한 발현 수준을 측정하는 것을 가능하게 한다.
이 경우, 리포터 유전자는 발현 수준에 대하여 측정되어야 하는 표적 유전자의 프로모터의 하류에 연결되어 있다.
리포터 유전자는 구체적으로 제한되지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 리포터 유전자의 예로는 루시페라제 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 및 이들 유전자의 유도체가 포함된다.
발광 세포에 관해서는, 루시페라제 유전자에 의해 형질전환된 포유동물 세포가 바람직한데, 그 이유는 그 세포가 장기간 동안 유전자 전사 활성의 정량적 측정 및 안정한 모니터링을 허용하기 때문이다, 예를 들면, 일본 (미심사) 특허 출원 공개 번호 2005-119643에 개시된 바와 같이, 루시페라제 유전자 구성물을 함유하는 인공 염색체 벡터를 도입하는 방법이 이용될 수 있다.
세포로 하여금 광을 방출시키는 다른 방법의 예로는 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 공지된 방법, 예컨대 다양한 세포내 분자들 간의 상호작용을 평가하는 형광/생물발광 공명 에너지 전이(FRET/BRET), 및 예를 들어, 효소 또는 결합 인자의 활성 또는 유주의 지표로서 작용을 하는 형광/발광 기질의 도입(예를 들면, 형광 칼슘 인디케이터, Aldefluor 어세이, 글루코즈 흡수 이미징, 형광 나노입자 프로프)이 포함된다.
세포 A 및 세포 B가 둘 다 발광 세포일 때, 세포 A 및 세포 B는, 예를 들어 상이한 조건 하에 또는 상이한 타이밍에서 광을 방출하는 발광 세포, 또는 상이한 파장의 광을 방출하는 발광 세포를 사용하여, 서로 구별될 수 있다. 예를 들면, 상이한 파장의 광을 방출하는 발광 세포는 3차원 조직에서 상이한 깊이에 배열될 수 있다. 게다가, 상이한 조건 하에 광을 방출하는 질환 세포 및 정상 세포는 공배양을 위해 배열될 수 있으며, 이들 유형의 세포의 반응은 서로 비교될 수 있다.
<배양 용기>
배양 용기는 3차원 조직체를 형성 및 유지시키는데 필요한 베이스 또는 지지체로서 작용하는 재료로 이루어져 있다.
베이스 재료의 구성성분은 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 베이스 재료의 구성성분의 예로는 수지, 유리 및 금속이 포함된다.
베이스 재료의 구조는 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 베이스 재료의 구조의 예로는 평면 구조, 다공성 또는 스폰지폼 구조, 메쉬, 조잡하거나 패턴화된 토포그래피를 지닌 구조, 및 허니쿰이 포함된다.
배양 용기로서, 세포의 접착 및 증식에 적합한 베이스 재료로 이루어지고, 높은 광 투명성을 가지며, 그리고 자기 발광하지 않은 다벽 유형 배양 플레이트 또는 인서트를 사용하는 것이 바람직하다.
3차원 조직체(10)에서, 세포 A를 포함하는 영역(11)은 배양 용기(14)와 접촉한다. 그러나, 세포 A를 포함하는 영역(11)은 배양 용기(14)와 상시 접촉해 있을 필요가 없다. 게다가, 3차원 조직체(10)는, 배지(13), 안전성 또는 효능에 대하여 평가되어야 하는 물질, 또는 스크리닝되어야 하는 약물을 유입 또는 유출하기 위한 개방 시스템이다. 그러나, 3차원 조직체(10)는 관류 배양을 허용하는 폐쇄 시스템일 수 있거나, 마이크로유로를 포함하는 칩 유형일 수 있다.
<배지>
배지는 3차원 조직체를 형성 및 유지하는데 필요한 성분들을 함유하고, 건조를 방지하며, 그리고 삼투압과 같은 외부 환경을 조건화하는 용액이다.
배지는 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 의도된 목적에 따라 공지된 배지로부터 적절히 선택될 수 있다.
3차원 조직체가 배지 중에 상시 침지될 필요가 없을 때, 예컨대 3차원 조직체가 공기에 폭로된 피부(air-lifted skin)일 때, 배지는 적절히 제거될 수 있다.
<고정제>
일부 경우에는, 세포 B를 특정 위치에 고정하여 3차원 조직체의 구조를 유지하기 위해서, 고정제가 필요할 수 있다. 세포 B가 고정되는 시간은 일시적일 수 있거나, 영구적일 수 있지만, 3차원 조직체가 세포 배양 동안 그리고 사용 동안 붕괴되지 않는다는 것을 적어도 보장하는 시간일 필요가 있다. 생체 적합성을 기지며 그리고 세포에 부정적인 영향을 미치지 않는 고정제가 바람직하다. 고정제는 세포와 혼합될 수 있거나, 세포와 별도로 배치될 수 있다.
고정제는 구체적으로 제한되어 있지 않으며, 의도된 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 고정제의 화합물의 예로는 생체고분자(예를 들면, 콜라겐, 엘라스틴, 겔라틴, 및 피브로인), 응고 인자(예를 들면, 피브리노겐/트롬빈), 접착 인자(예를 들면, 피브로넥틴, 라미닌, 및 재조합 펩티드), 합성 고분자, 예컨대 폴리락트산, 및 폴리사카라이드/다가 금속 염, 예컨대 알긴산 및 젤란 검이 포함된다.
세포를 배열하는 방법에 따라, 고정제는 2 이상의 액체의 혼합에 반응하여 점증되는 상 변화 물질인 것이 바람직할 수 있다.
2 이상의 액체의 혼합에 반응하여 점증되는 상 변화 물질이 고정제로서 사용될 때, 액체 중 하나가 세포 현탁액과 미리 혼합될 수 있거나, 또는 액적이 별도로 적합한 위치에 배치될 수 있다. 고정제가 사용될 때, 고정제는 3차원 조직체 내에 잔류할 수 있거나 잔류하지 않을 수 있다.
실시예
이하, 본 발명은 실시예에 의해 예시될 것이다. 그러나, 본 발명은 그러한 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
(실시예 1)
- 세포의 제조 -
세포 A로서, 정상 인간 피부 섬유아세포(Lonza Japan, Ltd.로부터 구입 가능한 것)(이후에는 "NHDF 세포"라고 칭함)을 사용하였다.
세포 B로서, NF-kB 전사 인자에 대한 반응 요소의 프로모터의 하류에 연결된 루시페라제 유전자 서열을 포함하는 상업적으로 구입 가능한 마우스 섬유아세포 NFkB-루시페라제 NIH3T3 리포터 안정성 세포주(Panomics Inc.로부터 구입 가능한 것)(이후에는 "NFkB-luc 세포"라고 칭함)을 사용하였다.
우선, NHDF 세포 및 NFkB-luc 세포를 제조업자에 의해 권장되는 절차에 따라 예비 배양하였다.
이어서, 세포를 트립신화에 의해 단리한 후, 발광 반응과는 독립적으로 공초점 형광 현미경에 의해 세포를 식별하기 위해, NHDF 세포 및 NFkB-luc 세포를, 각자 CellTracker Green 및 CellTracker Orange(둘 다 Thermo Fisher Scientific Inc.로부터 구입 가능한 것임)로 염색하였다.
- 3차원 조직체의 제조 -
도 2a 내지 도 2e에서 예시되어 있는 바와 같이, 3차원 조직체는 염색된 NFkB-luc 세포 및 NHDF 세포를 사용하여 제조하였다.
우선, 0.2%(w/v) 콜라겐 용액 중에 1 × 107 세포/mL의 밀도로 현탁된 NHDF 세포 20 마이크로리터를, 배양 용기(14)로서 정의된 96-웰 플레이트의 웰(0.3 cm2) 내에, 마이크로피펫(M)으로 분배하였고, 세포 층이 고화될 때까지 37℃의 CO2 인큐베이터에서 정치하였다(도 2a 참조).
이어서, 배열되는 NFkB-luc 세포를 고정하기 위해서, 고정 인자(21)로서 정의된 피브리노겐의 25 mg/mL 수용액의 수 마이크로리터를 마이크로피펫(M)으로 첨가하였다. 이어서, 박막만 잔류하도록 성청액을 제거하였다(도 2b 참조).
이어서, NFkB-luc 세포가 하나의 NFkB-luc 세포에 상응하는 두께를 갖는 층으로 배열되는 방식으로, 응고 인자인 트롬빈 20 U/mL를 함유하는 DMEM 배지 중에 현탁된 NFkB-luc 세포를, 1 내지 10개 세포를 포함하는 액적을 수십 피코리터로 토출하도록 구성된 잉크젯 바이오프린터(P)(자사에서 개발된 잉크젯 바이오프린터의 프로토타입)로부터 약 100 세포/mm2의 밀도로 토출하였다(도 2c 참조).
이어서, 0.2%(w/v) 콜라겐 용액 중에 1×107 세포/mL의 밀도로 현탁된 NHDF 세포 20 마이크로미터를 NFkB-luc 세포의 층 상에 마이크로피펫(M)으로 첨가하였고, 세포 층이 고화될 때까지 37℃의 CO2 인큐베이터에서 정치하였다(도 2d 참조).
이어서, 배지(13)로서 정의된 DMEM 배지 100 마이크로리터를 마이크로피펫(M)으로 첨가하고, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 밤새 정치하여, 3차원 조직체(10)을 얻었다(도 2e 참조).
이어서, 제조된 3차원 조직체(10)를 공초점 형광 현미경 FV10i-LIV(Olympus Corporation로부터 구입 가능한 것)으로 관찰하였다.
도 3은 3차원 조직체(10)의 Z-스택 촬영한 화상을 예시한 것이다. 도 3으로부터, 세포 A(NHDF 세포)와는 상이한 색상을 갖는 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)은 세포 A(NHDF 세포)를 포함하고 약 180 마이크로미터의 두께를 갖는 영역(11)의 중심부에서 하나의 세포 B(NFkB-luc 세포)에 상응하는 두께를 갖도록 배열되었다는 점을 확인하였다.
(실시예 2)
실시예 1에서와 같이 동일한 방식으로 3차원 조직체를 얻었으며, 단 실시예 1과는 달리, 세포 A(NHDF 세포)를 포함하고 1.6 mm의 두께를 갖는 영역(11)의 저부에, 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)을 배열하였다는 점을 예외로 하였다(도 4 참조).
(실시예 3)
실시예 1에서와 같이 동일한 방식으로 3차원 조직체를 얻었으며, 단 실시예 1과는 달리, 세포 A(NHDF 세포)를 포함하고 1.6 mm의 두께를 갖는 영역(11)의 상부에, 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)을 배열하였다는 점을 예외로 하였다(도 5 참조).
(대조예 1)
실시예 2에서와 같이 동일한 방식으로 3차원 조직체를 얻었으며, 단 실시예 2와는 달리, 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11) 대신에, DMEM 배지를 분배하였다는 점을 예외로 하였다(도 6 참조).
(비교예 1)
도 7은 비교예 1의 3차원 조직체를 예시한 것이다.
일본 (미심사) 특허 출원 공개 번호 2012-179020의 실시예 1 및 2에서 사용된 "3D 배양 피부 모델 Epiderm TM(MatTek Corporation으로부터 구입 가능한 것)"에서와 같이 관찰 영역의 식별을 가능하게 하기 위한 발광 세포가 포함되지 않는 경우, 또는 도 7에 예시되어 있는 바와 같이, 발광 세포가 포함되어 있지만, 3차원 조직체의 전체 체적에 무작위로 분산되어 있는 경우, 벌크로서의 3차원 조직체의 전체 체적으로부터의 평균적인 반응만을 측정하는 것이 가능하였고, 3차원 조직체 중의 어느 특정 영역이 다른 영역과 상이하게 반응하는지를 비파괴적으로 평가하기 위해, 발광 세포를 표적 영역에 배열하는 기법을 이용할 필요성이 있었다.
(비교예 2)
도 8은 국제 출원 공개 번호 WO 2000/75286의 실시예 2(도 3)를 재현하는 비교예 2의 3차원 조직체를 예시한 것이다.
도 8에 예시되어 있는 바와 같이, 발광 세포 및 다른 세포를 전체적으로 혼합하는 경우, 벌크로서 3차원 조직체의 전체 체적으로부터의 평균적인 반응만을 측정하는 것이 가능하였고, 3차원 조직체 중의 어느 특정 영역이 다른 영역과 상이하게 반응하는지를 비파괴적으로 평가하기 위해, 발광 세포를 관심 대상의 영역에 배열하는 기법을 이용할 필요성이 있었다.
이어서, 실시예 2, 실시예 3 및 대조예 1의 3차원 조직체의 발광 강도를 측정하였다. 도 9a는 발광 강도를 측정하는 동안 대조예 1의 3차원 조직체의 상태를 예시한 것이다. 도 9b는 발광 강도를 측정하는 동안 실시예 2의 3차원 조직체의 상태를 예시한 것이다. 도 9c는 발광 강도를 측정하는 동안 실시예 3의 3차원 조직체의 상태를 예시한 것이다.
<발광 강도>
NFkB-luc 세포의 발광을 유도하기 위해서, 자극 물질(71)로서 정의된 TNF-α의 수용액 50 ng/mL 및 발광 기질인 D-루시페린 수용액 200 ｕM을 3차원 조직체에 첨가하고, 이어서 37℃의 CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 정치하였다.
이어서, 플레이트 판독기 Cytation 5(BioTek Instruments Inc.로부터 구입 가능한 것)을 사용하여, 게인 175 및 적분 시간 3초로 설정하고, 3차원 조직체(각 8개)의 발광 강도를 측정하였다.
여기서, 블랭크로서, DMEM 배지를 사용하였다. 표 1은 3차원 조직체의 발광 강도의 측정 결과를 나타낸 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
이어서, 3차원 조직체의 발광 강도로부터 블랭크의 발광 강도를 차감한 후, 평균 발광 강도 및 표준 편차를 계산하였다.
도 10은 실시예 2, 실시예 3 및 대조예 1의 평균 발광 강도 및 표준 편차를 작도한 것이다.
도 9a 및 도 10은 대조예 1에 관한 것이다.
도 9c 및 도 10으로부터, 실시예 3에서는 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)이 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11)의 상부에 배열되었기 때문에, 그 상부에 첨가된 자극 물질(TNF-α)(71)에 반응하여, 실시예 3의 3차원 조직체으로부터 대조예 1의 발광 강도와 유사한 발광 강도가 검출되는 것으로 나타났다.
다른 한편으로는, 도 9b 및 도 10으로부터, 실시예 2에서는 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)이 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11)의 저부에 배열되었기 때문에, 실시예 2의 3차원 조직체의 발광 강도가 저하되는 것으로 나타났다.
이 결과로부터, 자극 물질(TNF-α)(71)은 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11)의 두께의 영향에 기인하여 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)을 투과하지 않는다는 것을 보여주었다.
세포 B(NFkB-luc 세포)(예를 들면, 구성적으로 발현된 티미딘 키나제 프로모터의 하류에 연결된 루시페라제 유전자 서열을 포함하는 TK-luc 세포) 대신에, 자극 물질과는 무관하게 광을 방출하는 세포를 사용함으로써, 단순히 광이 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11)에 의해 흡수되기 때문에, 발광 강도가 저하되었다는 가능성을 배제하는 것이 가능하다. 이들 결과는 발광 강도, 즉 특정 영역으로부터의 자극 물질에 대한 반응의 비파괴적 평가가 실시예 2 및 3의 3차원 조직체에 의해 가능하였다는 점을 보여준다. 게다가, 실시예 2 및 실시예 3을 서로 비교함으로써, 자극 물질에 대한 반응이 3차원 조직 내의 영역 위치에 따라 변화하는지를 평가하는 것이 가능하였다.
(실시예 4)
세포 B를 포함하는 영역(12)의 형상은 층일 필요가 없다. 도 11a 및 도 11b에서 예시된 예에서는, 저 흡착 배양 플레이트(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.로부터 구입 가능한 것)을 사용하여, 세포 B(NFkB-luc 세포)로 이루어지고 약 300 마이크로미터의 직경을 갖는 구형 집합체(화전타원체)를 제조하였다.
이어서, 실시예 1에서와 같이 동일한 방식으로, 0.2%(w/v) 콜라겐 용액 중에 현탁된 세포 A(NHDF 세포)를 배양 용기(14) 내에 배열하였다. 여기서, 오로지 상부에만 자극 물질을 첨가할 수 있었던 배양 플레이트 대신에, 0.4 마이크로미터의 크기를 갖는 Falcon 배양 인서트(Corning Incorporated로부터 구입 가능한 것)을 배양 용기(14)로서 사용하였다. 이러한 배양 용기를 사용하면, 다공성 멤브레인으로 형성된 저부(81)에서도 배양 배지 중에 그리고 자극 물질 중에 전체 3차원 조직체를 침지하는 것이 가능하였다.
마지막으로, 미세조작장치를 사용하여, 세포 B(NFkB-luc 세포)의 회전타원체를, 세포 A(NHDF 세포)를 포함하는 영역(11)의 중심부에 배열하고, 0.2%(w/v) 콜라겐 용액 중에 현탁된 세포 A를, 그 회전타원체가 완전 임베딩되는 방식으로, 추가로 첨가하였다. 실시예 4를 이용하는 경우, 그 중심 영역에서의 발광 강도, 즉 3차원 조직체의 외부로부터 그 3차원 조직체의 내부로 침투하는 자극에 대한 반응을 평가하는 것이 가능하였다.
또한, 이러한 형태의 용기를 사용하는 경우, 상부의 배지(13) 및 저부의 배양 배지(41) 내에 상이한 자극 물질을 포함하는 것도 가능하였다. 그러므로, 예를 들면, 단지 2가지 상이한 자극 물질이 동시적으로 세포 B를 포함하는 중심 영역(12)에 도달하는 경우에만, 반응을 평가하는 것이 가능하였다.
(실시예 5)
세포 B를 포함하는 영역(12)이 일체화될 필요가 없지만, 도 12a 및 도 12b에서 예시되어 있는 바와 같이, 세포 B를 포함하는 복수의 영역이 특정 X, Y 및 Z 좌표에서 동일 3차원 조직체 내에 배열될 수 있다. 실시예 5의 3개 3차원 조직체는 실시예 1에서와 같이 동일한 방식으로 제조하였으며, 단 실시예 1에서 사용된 바와 같은 동일 잉크젯 바이오프린터(P)를 사용하여, 세포 B(NFkB-luc 세포)를 포함하는 영역(12)을, 3.5 mm의 크기를 갖는 배양 접시인 배양 용기(14)에서 미리 설정된 좌표에서의 9개 단리된 영역에 배열하였다는 점을 예외로 하였다.
실시예 5를 이용하는 경우, 깊이 방향에서 자극 물질의 투과뿐만 아니라 넓은 범위의 반응 전파 속도를 평가하는 것이 가능하였다.
(실시예 6)
세포 B를 포함하는 영역(12)은, 도 13에 예시되어 있는 바와 같이, 세포 A를 포함하는 영역(11)을 봉입하는 형태일 수 있다. 실시예 1에서와 같이 동일한 잉크젯 바이오프린터(P)를 사용하면, 세포 A를 포함하는 세포 시트와 세포 B를 포함하는 세포 시트를 미리 구성하고, 2층 구조의 형태로 적층하였다. 이 수득된 생성물을 관 형상으로 롤링하고, 배양액에서 그 내부를 관류시켰다. 이러한 경우, 자극에 대한 반응이 관의 내부에서 외부로 향하여 방사상으로 변화하는지를 평가하는 것이 가능하였다.
본 발명의 양태는 예를 들면 다음과 같다.
<1> 3차원 조직체로서,
제1 유형의 세포를 포함하는 제1 세포 영역, 및
제1 유형의 세포와 상이한 제2 유형의 세포를 포함하는 제2 세포 영역
을 포함하고, 여기서 제1 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포인 3차원 조직체.
<2> 상기 <1>에 있어서,
제1 유형의 세포는 제2 세포 영역 내에 존재하지 않고,
제1 유형의 세포는 제1 세포 영역 내에 농후하게 존재하는 것인 3차원 조직체.
<3> 상기 <1> 또는 <2>에 있어서,
제1 세포 영역 및 제2 세포 영역을 둘 다 포함하는 전체 영역에 대하여, 제1 세포 영역의 비율이 제2 세포 영역의 비율보다 더 작은 것인 3차원 조직체.
<4> 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 있어서,
제1 세포 영역의 표면이, 자극을 가한 계면에 수직인 축 상에서의 특정 거리에 존재하는 것인 3차원 조직체.
<5> 상기 <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 있어서,
제1 세포 영역 및 제2 세포 영역은 배양 용기의 내부에 배열되는 것인 3차원 조직체.
<6> 상기 <5>에 있어서,
제1 세포 영역은 배양 용기의 원주 벽과 접촉하지 않은 것인 3차원 조직체.
<7> 상기 <1> 내지 <6> 중 어느 하나에 있어서,
리포터 유전자가 제1 유형의 세포 내에 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
<8> 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 있어서,
제2 유형의 세포는 광을 방출하는 세포가 아닌 것인 3차원 조직체.
<9> 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 있어서,
제2 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포인 3차원 조직체.
<10> 상기 <9>에 있어서,
리포터 유전자가 제2 유형의 세포 내로 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
<11> 상기 <9> 또는 <10>에 있어서,
제1 유형의 세포 내로 도입된 리포터 유전자와는 상이한 리포터 유전자가 제2 유형의 세포 내로 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
<12> 상기 <9> 내지 <11> 중 어느 하나에 있어서,
제2 유형의 세포는 제1 유형의 세포와는 생리학적으로 상이한 것인 3차원 조직체.
<13> 상기 <1> 내지 <12> 중 어느 하나에 있어서,
제1 유형의 세포 및 제2 유형의 세포와는 상이한 세포를 1종 이상 추가로 포함하는 3차원 조직체.
<14> 상기 <1> 내지 <13> 중 어느 하나에 있어서,
제1 세포 영역은 고정제에 의해 임의의 위치에서 유지되는 것인 3차원 조직체.
<15> 상기 <1> 내지 <14> 중 어느 하나에 있어서,
3차원 조직체는 물질의 안전성 평가, 물질의 효능 평가, 또는 약물의 스크리닝에 사용되는 것인 3차원 조직체.
10: 3차원 조직체
11: 세포 A를 포함하는 영역
12: 세포 B를 포함하는 영역
13: 배지
14: 배양 용기
21: 응고 인자
41: 배양액
71: 자극 물질
81: 저부
M: 마이크로피펫
P: 잉크젯 바이오프린터

Claims (15)

  1. 3차원 조직체로서,
    제1 유형의 세포를 포함하는 제1 세포 영역, 및
    제1 유형의 세포와 상이한 제2 유형의 세포를 포함하는 제2 세포 영역
    을 포함하고, 여기서 제1 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포인 3차원 조직체.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 유형의 세포는 제2 세포 영역 내에 존재하지 않고,
    제1 유형의 세포는 제1 세포 영역 내에 농후하게 존재하는 것인 3차원 조직체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 세포 영역 및 제2 세포 영역을 둘 다 포함하는 전체 영역에 대하여, 제1 세포 영역의 비율이 제2 세포 영역의 비율보다 더 작은 것인 3차원 조직체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 세포 영역의 표면이, 자극을 가한 계면에 수직인 축 상에서의 특정 거리에 존재하는 것인 3차원 조직체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 세포 영역 및 제2 세포 영역은 배양 용기의 내부에 배열되는 것인 3차원 조직체.
  6. 제5항에 있어서,
    제1 세포 영역은 배양 용기의 원주 벽과 접촉하지 않은 것인 3차원 조직체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 유전자가 제1 유형의 세포 내에 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 유형의 세포는 광을 방출하는 세포가 아닌 것인 3차원 조직체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 유형의 세포는 외부 자극에 반응하여 화학발광, 생물발광, 또는 형광에 의해 광을 방출하는 세포인 3차원 조직체.
  10. 제9항에 있어서,
    리포터 유전자가 제2 유형의 세포 내로 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    제1 유형의 세포 내로 도입된 리포터 유전자와는 상이한 리포터 유전자가 제2 유형의 세포 내로 도입되어 있는 것인 3차원 조직체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 유형의 세포는 제1 유형의 세포와는 생리학적으로 상이한 것인 3차원 조직체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 유형의 세포 및 제2 유형의 세포와는 상이한 세포를 1종 이상 추가로 포함하는 3차원 조직체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 세포 영역은 고정제에 의해 임의의 위치에서 유지되는 것인 3차원 조직체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    3차원 조직체는 물질의 안전성 평가, 물질의 효능 평가, 또는 약물의 스크리닝에 사용되는 것인 3차원 조직체.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210017731A (ko) * 2019-08-09 2021-02-17 주식회사 티앤알바이오팹 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7316745B2 (ja) 2016-05-20 2023-07-28 株式会社リコー 三次元組織体
US11486830B2 (en) * 2017-12-28 2022-11-01 Kao Corporation Method for determining ultraviolet light sensitivity
US10780706B2 (en) 2018-03-16 2020-09-22 Ricoh Company, Ltd. Discharging device and discharging method
EP3712243A1 (en) 2019-03-20 2020-09-23 Ricoh Company, Ltd. Liquid set for droplet discharging apparatus
AU2020240750B2 (en) 2019-03-20 2023-07-06 Ricoh Company, Ltd. Cell culture carrier, and method and device for producing same
EP3712253A1 (en) 2019-03-20 2020-09-23 Ricoh Company, Ltd. Method of in vitro cellular assay, cell circuit board, and method of manufacturing cell circuit board

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69837221T2 (de) 1997-12-17 2007-12-20 The General Hospital Corp., Boston Methode zur bewertung von verbindungen in bezug auf ihres effektes auf die haut
US6439713B1 (en) 1998-07-24 2002-08-27 Ricoh Company, Ltd. Powder composition and process of forming liquid ink image using same
IL146892A0 (en) * 1999-06-03 2002-08-14 Ca Nat Research Council 3-dimensional in vitro models of mammalian tissue
IL147793A0 (en) * 1999-08-05 2002-08-14 Cellomics Inc Optical system analysis of cells
US20060003311A1 (en) * 2002-06-13 2006-01-05 Fulde Fabienne A In vitro screening of cellular events using 3d cell culture systems
JP4303643B2 (ja) 2004-06-01 2009-07-29 育男 森田 人工組織体およびその製造方法
US20090208466A1 (en) 2006-04-21 2009-08-20 James Yoo Ink-jet printing of tissues
US8592139B2 (en) * 2006-11-10 2013-11-26 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Test method using cells and test kit therefor
WO2008095165A2 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell co-culture systems and uses thereof
JP5564813B2 (ja) * 2009-03-25 2014-08-06 住友ベークライト株式会社 細胞積層方法
US8348790B2 (en) 2009-04-02 2013-01-08 Keith Ray York Shuttlecock-type game ball and method of manufacturing same
US20110143960A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 Labarbera Daniel V 3d-models for high-throughput screening drug discovery and development
JP6031221B2 (ja) 2011-03-02 2016-11-24 花王株式会社 皮膚感作性物質の評価方法
CN103087912A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片及细胞共培养方法
CH706326A2 (de) * 2012-03-14 2013-09-30 Tecan Trading Ag Verfahren und Mikroplatten-Reader zum Untersuchung von biologischen Zellen oder Zellkulturen.
JP2014159539A (ja) 2013-01-28 2014-09-04 Ricoh Co Ltd ポリマー製造装置
CN103146650B (zh) * 2013-02-23 2015-06-10 大连理工大学 基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法
CN104274864A (zh) * 2013-07-11 2015-01-14 上海市第六人民医院 一种体外构建三维立体组织的方法
JP2015120872A (ja) 2013-11-21 2015-07-02 株式会社リコー ポリマーの製造方法
JP6223157B2 (ja) 2013-12-04 2017-11-01 オリンパス株式会社 三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システム
JP2015119643A (ja) 2013-12-20 2015-07-02 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工染色体ベクター及び形質転換哺乳類細胞
JP2017163931A (ja) 2016-03-17 2017-09-21 株式会社リコー 三次元細胞集合体及びその製造方法
JP7316745B2 (ja) 2016-05-20 2023-07-28 株式会社リコー 三次元組織体
JP7031138B2 (ja) * 2017-05-11 2022-03-08 株式会社リコー 脱細胞化組織の製造方法、及び脱細胞化組織の製造装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210017731A (ko) * 2019-08-09 2021-02-17 주식회사 티앤알바이오팹 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치
WO2021029567A1 (ko) * 2019-08-09 2021-02-18 주식회사 티앤알바이오팹 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치

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