KR20180134942A - 제제 정제의 실시간 모니터링 - Google Patents

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KR20180134942A
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아스트리드 뒤라우어
니콜 왈츠
도미닉 사우어
테레사 샬-이르슈
마이클 멜처
프리드리히 레이슈
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베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
산도즈 게엠베하
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Abstract

본 발명은 공정에 개입하기 위해, 또는 공정 제어 또는 실시간 출하를 위해, 정제 및/또는 농축 공정 중에 생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가의 측정을 실시간으로 허용하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 공정 흐름의 특성은 적어도 2개의 온라인 센서에 의해 그리고 다변량 통계 분석의 도움으로 연속적으로 모니터링되어서, 농도, 순도 및 역가가 실시간으로 측정된다.

Description

제제 정제의 실시간 모니터링
본 발명은 생물학적 제제(biological product)의 정제 및/또는 농축 공정을 모니터링 및 제어하는 방법 및 이들 방법에 사용되는 장치의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 단백질 농도, 순도 및 역가(potency)의 온라인 모니터링 및 제어 방법 그리고 파라미터 기반(parametric) 또는 실시간 출하(release) 방법에 관한 것이다.
다운스트림 공정 중에, 생물학적 제제는 이들의 적용 및 필요에 따라 정제 및 농축된다. 일련의 다른 정제 공정 단계가 일반적으로 수행되어 제제의 원하는 순도, 농도 및 역가를 달성하고, 이들은 오프라인으로 측정된다. 미생물 또는 포유류 세포에서의 과발현은 생물의약품과 같은 생물학적 제제의 재조합 생산에 특히 사용된다. 이러한 화합물은 예를 들어 단백질(예를 들어 항체 및 그 단편), 핵산, 탄수화물, 지질, 유기 소분자, 비-유기 소분자, 바이러스, 리포솜 및 이러한 화합물들의 하이브리드 또는 변형 형태를 포함할 수 있다.
세포 배양으로부터 이렇게 재조합으로 생산된 화합물의 다운스트림 공정은 불순물, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA, 바이러스, 세포 잔해, 지질, 세포 배양 배지 성분 그리고 단편, 응집체(aggregate) 및 유리 경쇄(free light chain)와 같은 제제 관련 불순물이 제제 사양서에 정해진 수준으로 감소되는 상태까지 화합물의 정제를 요구한다. 이 요건은 치료제에 대해 특히 의무적이다.
생물의약품과 같은 용해성의 분비된 생물학적 제제용 정제 공정은 원심분리, 응집, 정밀여과 또는 여과 또는 이러한 열거된 공정의 조합에 의한 세포 제거를 포함한다. 정제는 일반적으로 크로마토그래피 및 막 여과 공정의 조합에 의해 달성된다. 또한, 포유류 세포 발현 시스템의 경우에서, 2개의 직교하는 전용 바이러스 불활성 공정이 포함되어야 한다. 또한, 일부 정제 공정은 침전 및 결정화 단계를 사용한다.
생물학적 제제가 분비되지 않을 경우, 세포는 파괴되어야 하고 파쇄액은 추가 정제를 위해 정화되어야 한다.
봉입체(inclusion bodies)로서 침전된 생물학적 제제의 경우, 리폴딩(refolding)/산화 공정이 추가로 수행되어야 한다.
일반적으로, 생물의약품과 같은 생물학적 제제의 제조에서, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피가 사용되어 생물학적 제제를 정제 및/또는 농축한다. 낮은 생산성으로 인해, 크기 배제 크로마토그래피는 더 적게 사용된다. 크로마토그래피는 결합-용리(bind-elute) 또는 통과(flow through) 모드로 수행된다. 이동상의 고 분해능 구배(high resolution gradient)를 위해, 염 또는 pH와 같은 조절인자(modulator)가 적용된다. 크로마토그래피 칼럼의 조작 파라미터(operation parameter) 및 품질 이외에, 공급 원료(feed stock)의 조성이 크로마토그래피 칼럼에 의한 분리의 성능에 영향을 주는 주요 파라미터이다.
공급 원료의 조성은 배지 성분, 발현 숙주 및 채취 시점을 포함하는 발효 과정에 의해 결정된다. 발효 브로스(broth)는 물(> 80%), 미사용 및 소화된 배지 성분, 세포에 의해 분비된 화합물, 용해된 세포로부터의 모든 세포 성분, 제제 및 제제 변형체(variant), 거품제거 오일, 세포 및 세포 잔해로 구성된다. 업스트림 공정과 비교하여, 크로마토그래피 및/또는 여과 공정 이후에, 생물학적 제제를 함유하는 용액은 거의 투명하지만, 약간 탁한 용액이 특히 포집 단계 중에 존재할 수 있다.
발효 브로스에 존재하는 다양한 성분의 생물물리학적 특성은 제제 자체와 다르거나 매우 유사할 수 있어서, 제제 및 불순물 사이의 판별을 위해, 제제 및 불순물을 정량화하고 제제의 역가를 정량화하기 위해, 칼럼 유출물에 대해 수개의 측정이 사용되어야 한다. 단일 분석 방법은 현시점에서 이 측정 및 판별을 관리할 수 없다.
생물학적 제제는 유럽 의학청(EMEA)의 조화(harmonization) 국제 위원회의 가이드라인(ICH 가이드라인)에 따른 물리화학적 특성, 생물학적 활성(역가), 면역화학적 특성, 순도, 불순물 및 오염물로 특징지어진다. 생물학적 제제의 경우, 물질은 수개의 분자 개체 또는 변형체를 포함할 수 있다. 따라서, 절대 순도 및 상대 순도(제제 mg 당 생물학적 활성의 단위)가 정의되었고 시험 절차뿐만 아니라 허용 기준이 EMEA의 ICH(1999년 9월 공개된 ICH Q6B)에 의해 표준화되었다. ICH 가이드라인에 따르면, 생물학적 물질 및 생물학적 제제의 순도는 분석 절차의 조합에 의해 평가되었고, 정제 공정이 수행된 후에 측정되었다. 생물학적 제제의 비활성(specific activity)은 제제의 역가로도 불리고, 매우 공정 또는 제제 의존적이다.
ICH 가이드라인에 따른 생물학적 제제에서의 오염물은 화학적 및 생화학적 재료, 예를 들어 미생물 단백질 분해효소 및/또는 미생물 종과 같이, 제조 공정의 일부인 것으로 의도되지 않은, 모든 우발적으로 도입된 재료를 포함한다. 오염물은 엄격히 방지되어야 하고 및/또는 약물 또는 약 제제 사양서를 위해 적절한 제조과정의(in-process) 허용 기준 또는 조치 한도(action limit)로 적절히 제어되어야 한다. 바이러스성(viral), 마이코플라스마(mycoplasma) 및 프리온(prion) 오염에 대해, "조치 한도"의 개념은 유효하지 않다. 이러한 경우에서 출발 재료는 바람직하게는 시약(agent)이 없어야 하고, 클리어런스(clearance)를 증명할 스파이킹(spiking) 실험이 수행되어야 하며, 최종 제제는 제어되어야 한다. 이 조치 한도는 ICH 조화 3부작(Harmonized Tripartite) 가이드라인: 즉, 생물공학적/생물학적 제제의 품질: 인간 또는 동물 기원의 세포주로부터 유래한 생물공학 유래 제제의 바이러스성 안전성 평가(Q5A); 생물공학적/생물학적 제제의 품질: 생물공학적/생물학적 제제의 생산에 사용된 세포 기질의 유래 및 특성화(Q5D)에서 정의된다.
ICH 가이드라인에서, 공정 관련 불순물 및 제제 관련 불순물은 구별된다. 생물학적 제제에서의 중요한 불순물은 제제 응집체, 독소 결합체(toxin conjugate)의 분해 산물, 톨-유사(toll-like) 수용체 촉진제, 숙주 세포로부터 방출된 성장 인자 또는 사이토카인과 같이, 환자에게 직접 해를 끼칠 수 있는 화합물로서 정의된다. 제제 관련 불순물은 생물학적 제제에 대한 생물물리학적 특성의 높은 유사성으로 인해 공정 관련 불순물보다 판별하기가 더욱 어려울 수 있다. 통상적인 제제 관련 불순물은 제조 및/또는 저장 중에 생기는 분자 변형체이고, 활성, 효능 및 안전성과 관련하여 원하는 제제의 것과 비슷한 특성을 갖지 못한다. 제제 관련 불순물의 예는 전구체, 특정 분해 산물, 이상 글리코폼(aberrant glycoform) 또는 응집체이다. 따라서, 제제 관련 불순물은 중요한 것 또는 중요하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 이상 글리코폼은 중요한 제제 관련 불순물을 나타낸다[1].
ICH 가이드라인에 따른 생물학적 제제의 모든 특성(역가, 양/농도, 순도/불순물 레벨)의 측정은 현재 오프라인 방법으로 이루어지는데, 여기서 최종 제제의 샘플은 표준에 따르는 제제의 품질을 확보하도록 채취된다.
일반적으로, 생물의약품과 같은 생물학적 제제의 다운스트림 공정 및 최종 출하 중에 생산 공정에서의 결정은 오프라인 분석에 근거한다. UV, pH, 전도도, 압력과 같은 온라인 모니터가 목표 제제와 관계없이 공정의 안정성을 모니터링하는데 사용된다. 따라서 예를 들어, 실시예에서의 크로마토그래피는 Akta Pure 25 시스템(GE Healthcare, Sweden)에서 수행되었는데, 상기 시스템은 장치가 제대로 기능하는지 보장하도록 UV-VIS, 전도도, pH 및 압력용 표준 센서를 구비한다. 그러나 목표 제제의 농도, 순도 또는 역가를 모니터링하기 위해서는, 칼럼 유출물, 막 잔류물(retentate) 또는 리폴딩 용액을 뽑아내야 하고, 이후 양, 순도 및 역가에 대한 분석은 오프라인으로 이루어진다. 일부 통상적인 온라인 모니터링 시스템에서, UV- 및/또는 IR 분광법에 의해 나타난 제제 농도 및 불순물은 pH 및/또는 전도도와 함께 모니터링된다. 이러한 방법은 실시간 출하에 적합하지 않은데, 그 이유는 모든 불순물이 정량화되지 않고 흔히 역가로 불리는 생물학적 활성이 이러한 통상적인 온라인 모니터링 시스템에 의해 측정되지 않기 때문이다[10]. 온라인 모니터링 데이터 및 오프라인 분석은 일반적으로 조합됨으로써, 생물학적 제제의 중간물질이 사양서 한도 내에 있는지 그리고 추가 공정 또는 생물공정의 마지막 단계에서의 출하에 적합한지를 결정한다.
상술한 바와 같이, 종래기술에서, 중간-범위 FTIR과 같은 분광 방법이 크로마토그래피 칼럼의 생물학적 유체 또는 유출물의 조성을 모니터링하는데 사용되었지만, 순도, 역가 및/또는 양의 실시간 측정은 결코 고려되지 않았다[2]. 이것은 가능하지 않은 것으로 판단된다. 또한, 앳라인(atline) 모드에서 분광법을 사용하는 것이 제시되었다[3, 4]. 앳라인 모니터링에서, 샘플은 채취되어 추가로 처리되고 결과는 실시간으로 얻어지지 않는다. 결과는 어느 정도 지연되어 얻어진다. 오프라인 분석에서 샘플은 공정 흐름에서 제거되어 이후 수동으로 분석되고, 공정이 계속되는 동안에, 샘플 포집 및 분석 사이에 시간 지연이 있다. 이들 방법을 이용함으로써, 개별 성분이 정량화될 수 있거나[5] 특정 불순물이 모니터링될 수 있지만[6, 7], 공정 중에 또는 공정 직후에 주어진 시점에서 생물학적 제제의 순도, 역가 및/또는 양과 관련하여 전체론적 그림(holistic picture)은 얻어지지 않는다[2]. 실제로, 온라인 모니터링으로 기술되었던 것은 흔히 앳라인인데, 그 이유는 샘플이 제거되고 샘플 추출 및 샘플 분석의 시간 사이에 시간 지연이 있기 때문이다. 온라인 및 인라인(inline) 방법에서, 공정 또는 재료 특성에 관한 정보가 얻어지는 시간은 이들 특성이 변하는 시간보다 짧다[8]. 흔히 방법들이 앳라인이지만, 온라인으로 불려졌는데, 그 이유는 샘플이 추가로 처리되기 때문이다[9]. 느린 공정의 경우, 앳라인 또는 빠른 오프라인 방법이 실시 공정에서 공정 제어 또는 조정에 여전히 적합할 수 있다. 그러나 빠른 공정에서는 온라인 및 인라인 방법만이 적합하다. 생물학적 제제 및 구체적으로 생물의약품 제조 공정에서, 인라인 또는 원위치(in situ) 모니터링은 비-침습적(non-invasive)이어야 하는데, 그 이유는 공정 흐름 특성이 모니터링 과정에 의해 변경되지 않아야 하기 때문이다. 공정 중에 공정 흐름 특성의 변화는 공정을 모니터링하는데 적합한 모니터링 및 분석 방법의 속도에 영향을 준다. 생물의약품의 정제를 위해, 흔히 매우 빠른 분석 방법이 조정하기 위해 요구된다. 공정 흐름의 특성은 수초의 범위 내에서 변할 수 있다.
이러한 이유로, 재조합으로 생산된 생물의약품과 같은 생물학적 제제의 다운스트림 공정을 온라인 모니터링 및/또는 제어하는 개선된 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 목적은 청구된 주제에 의해 달성된다.
다운스트림 공정 파라미터를 모니터링 및 제어하는 방법 및 장치가 제공된다.
본 발명의 실시형태는 조작 유닛(operation unit)에서 온라인 센서 및 바람직하게는 비-침습적 원위치 및/또는 인라인 센서를 적용하여 공정 데이터를 얻는 단계; 및 정제 및/또는 농축 공정 또는 그 일부의 모니터링 및 제어를 위한 다변량(multivariate) 통계 분석을 실행하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 적어도 하나의 조작 유닛의 이용을 포함하는 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축 공정을 모니터링 및 제어하는 컴퓨터 기반 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 조작 유닛에서 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 포함하는 단계;
b) 상기 센서의 각 출력에 대응하는 복수의 공정 데이터 값을 얻는 단계;
c) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해 온라인 및 오프라인 데이터로부터 얻어진 다변량 통계 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 데이터베이스로 데이터 값을 불러오는(importing) 단계;
d) 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계;
e) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가를 실시간으로 모니터링하는 단계;
f) 선택적으로 단계 e)에서 얻어진 정보에 근거하여, 공정 제어 및/또는 공정 최적화를 수행하는 단계; 및
g) 선택적으로 단계 e)에서 얻어진 정보에 근거한, 생물학적 제제의 파라미터 기반 또는 실시간 출하 단계를 포함한다.
본 발명 방법의 특정 실시형태에서, 온라인 센서 중 적어도 하나는 다-각도 광 산란 센서(MALS), UV-VIS 흡광 센서, 형광 센서, 감쇠(attenuated) 전반사-푸리에(fourier) 변환 적외선(ATR-FTIR) 분광 센서, 굴절률(RI) 센서, pH 센서, 온도 센서, 전도도 센서, 압력 센서, 소각(small angle) X선 산란(SAXS) 센서 및 레독스(redox) 센서로 이루어진 군에서 선택된다. 하나의 실시형태에서, 온라인 센서 중 적어도 하나는 ATR-FTIR, MALS, RI 및 형광 센서로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 온라인 센서 중 적어도 하나는 바람직하게는 ATR-FTIR, SAXS, 온도, pH, 전도도 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 비-침습적 원위치 센서이다.
본 발명의 방법에서, 조작 유닛은 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상의 독립적인 온라인 센서를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 조작 유닛은 적어도 하나의 ATR-FTIR 센서, 하나의 MALS 센서, 하나의 RI 센서 및 하나의 형광 센서 그리고 선택적으로는 적어도 2개의 온도 센서, 적어도 하나의 전도도 센서, 적어도 하나의 pH 센서 및 적어도 하나의 압력 센서를 포함한다. 바람직한 센서는 SAXS 센서, ATR-FTIR 센서, 온도 센서, 전도도 센서, pH 센서 및 압력 센서로 이루어진 군에서 선택되는 비-침습적 원위치 센서이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 조작 유닛은 적어도 하나의 크로마토그래피 유닛 및/또는 여과 유닛을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 유닛은 결합/용리 또는 통과 모드에서 등용매(isocratic), 선형, 분절화(segmented) 및/또는 단계 구배(step gradient) 용리로 작동하는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멀티-모드(multi-modal) 수지 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여과 유닛은 접선 유동(tangential flow) 여과, 전량(dead end) 여과, 절대 기공 크기 막을 통한 여과로 작동하는 한외여과, 정밀여과, 나노여과, 심층(depth) 여과로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 방법은 정제 및/또는 농축 공정이 이에 제한되지 않지만, 리폴딩, 여과 또는 침전 이후 생물학적 제제의 피크 수집(peak collection), 정확한 수집(correct collection), 제제 품질, 경제, 환경적 측면, 에너지 소비 및 공정 설비 보전 중 어느 하나 또는 조합과 관련하여 제어되도록 한다.
본 발명의 방법은 생물의약품, 예를 들어 핵산 분자 또는 이종 단백질과 같은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축 공정에 사용될 수 있다. 바람직한 단백질은 치료 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 탄수화물-단백질 결합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신-유사 단백질 또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인 또는 항체이다.
본 발명 방법의 바람직한 실시형태에서, 생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가는 단계 c)에서 예측되고 방법의 단계 e)에서 모니터링된다.
또한, 본 발명은 생물학적 제제를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 생물학적 제제를 생산 가능한 유기체 또는 세포를 배양하는 단계 및 얻어진 제제를 정제하는 단계를 포함하고, 정제는 적어도 하나의 조작 유닛을 이용하여 모니터링 및 제어되며, 조작 유닛은 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 포함하고, 온라인 센서로부터의 데이터 값은 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해, 온라인 및 오프라인 데이터로부터 얻어진 다변량 통계 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 데이터베이스로 불러오기 되며, 정제의 제어는 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계 및 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가를 실시간으로 모니터링하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축용 조작 유닛을 포함하는 장치를 제공하는데, 상기 조작 유닛은
a) 크로마토그래피 및/또는 여과 유닛을 포함하고,
b) 크로마토그래피 또는 여과 유닛은 적어도 하나의 인라인 및 하나의 비-침습적 원위치 센서를 포함하며,
c) 센서는 컴퓨터에 연결되는데, 여기서 수집된 데이터 값은 데이터베이스에 저장 및/또는 진단될 수 있다.
본 발명의 장치에 사용되는 바람직한 비-침습적 원위치 센서는 온도 센서, SAXS 센서, pH 센서, 전도도 센서, ATR-FTIR 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 장치는 다-각도 광 산란 센서(MALS), UV-VIS 흡광 센서, 형광 센서, 적외선 흡광 센서(IR), 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 분광 센서(ATR-FTIR), 광 굴절률(RI) 센서, pH 센서, 온도 센서, 전도도 센서, 압력 센서, SAXS 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 다른 온라인 센서를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태, 특징 및 이점뿐만 아니라, 다양한 실시형태의 구조 및 조작은 이하에서 상세하게 기술된다.
도 1은 실시간으로 모니터링되는 다운스트림 공정의 도구 및 원리의 개략도이다.
도 2는 직렬로 연결된 UV-VIS 검출기, 전도도 프로브(probe), ATR-FTIR 프로브, 형광, 광 산란 및 굴절률 검출기뿐만 아니라, pH 프로브를 구비한 크로마토그래피 시스템의 흐름도이다. 크로마토그래피 시스템은 모듈(시스템/샘플 펌프, 밸브, 분획 컬렉터 칼럼, 센서(pH, 전도도, UV))로 구성되고 부가적으로 상술한 검출기를 구비한다.
도 3은 펌프, 밸브, 분획 컬렉터 및 센서를 구비한 크로마토그래피 칼럼뿐만 아니라, 데이터 저장, 다변량 데이터 분석, 실시간 모니터링 및 제어용 컴퓨터로 구성되는 온라인 모니터링 장치의 개략도이다. 센서는 정제 유닛(크로마토그래피 칼럼)의 표준 검출기인 압력 센서, UV-VIS 센서, 전도도 센서 및 pH 센서뿐만 아니라, 인라인 측정용 ATR-FTIR 센서, 형광 센서, MALS 센서 및 RI 센서 그리고 비-침습적 원위치 측정을 위해 설치된 온도 센서, 레독스 센서, ATR-FTIR 센서 및 SAXS 센서이다. 파선 화살표는 통계 모델을 기반으로 한 공정의 가능한 실시간 제어를 나타낸다.
도 4는 비-침습적 원위치 센서: 예시적으로 2개의 온도 센서, SAXS 센서, ATR-FTIR 센서 및 레독스 센서를 구비한 크로마토그래피 칼럼의 개략도이다. A)는 외부 도면이고 B)는 내부 도면이다.
도 5는 실시간으로 모니터링되는 다운스트림 공정의 조작 순서도이다. 이 도면에서, 오프라인 데이터가 출하 전에 추가 제어로서 또한 사용된다.
도 6은 mAb Select SuRe® 칼럼(CV: 21.9 ml)의 적용에 의한 항체 포집의 크로마토그램이다. 10 CV의 여과된 상등액이 로딩되었다. 용리는 10 CV에 대해 pH 3.5에서 단계 구배로 수행되었다.
도 7은 CM Sepharose® Fast Flow 칼럼(CV: 12.3 ml)의 적용에 의한 FGF-2 정제의 크로마토그램이다. 10 CV의 정화된 상등액이 로딩되었다. FGF-2의 용리는 5 CV에 대해 0-1M NaCl 구배로 수행되었다.
도 8은 통합(integrated) 온라인 모니터를 구비한 한외여과/투석여과(diafiltration)(UF/DF) 공정의 개략도이다.
도 9는 시간/용리액 부피에 대해 UV280 및 정적 광 산란 센서(SLS)에 의해 모니터링되고, CM Sepharose® Fast Flow 칼럼(CV: 12.3 ml)의 적용에 의한 FGF-2 정제(크로마토그래피)의 크로마토그램이다.
도 10은 용리액 샘플링에 의해 오프라인으로 측정된 역가, 순도 및 양과 상관관계에 있고, UV280 및 정적 광 산란 센서(SLS)에 의해 모니터링된 도 9의 FGF-2 정제의 크로마토그램의 용리 피크이다.
도 11은 FGF-2 정제(크로마토그래피)의 시간/용리액 부피에 대한 ATR-FTIR 스펙트럼으로서: 3D 크로마토그램은 시간/용리액 부피에 대한 ATR-FTIR 스펙트럼의 변화를 나타낸다.
도 12는 도 11의 FGF-2 정제의 3D 크로마토그램을 확대한 것으로서: 3D 크로마토그램은 시간/용리액 부피에 대한 ATR-FTIR 스펙트럼의 변화를 나타낸다.
도 13은 정제(크로마토그래피)의 과정에 대해 2개의 파장(1528 cm-1 및 1622cm-1)의 강도의 ATR-FTIR 스펙트럼 변화이다. 신호는 MIR 스펙트럼의 아미드 밴드 내에 있다.
도 14는 FGF-2 정제(크로마토그래피)의 시차(Differential) 굴절률(dRI) 신호이다. 크로마토그래피 공정의 공정 상(phase)들은 명확하게 구별될 수 있다. 용리 상에서 RI 신호에 대한 용리 단백질의 기여를 볼 수 있다.
도 15는 시간에 대한 FGF-2 정제(크로마토그래피) 공정의 용리 피크의 형광 스펙트럼이다. 7개의 다른 여기 파장이 사용되었고, 236-795 nm에서의 발광 스펙트럼이 기록되었다. 형광 스펙트럼 A: 0%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0). 단백질이 용리되지 않음에 따라 형광 신호가 검출되지 않았다. 형과 스펙트럼 B: 25%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1　M NaCl, pH 7.0). 타깃 단백질이 용리되기 시작함에 따라 형광 신호의 증가가 검출되었다. 형광 스펙트럼 C: 35%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0). 형광 신호의 최대 피크가 검출되었다. 용리액에서 타깃 단백질의 최고 농도이었다. 형광 스펙트럼 D: 45%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0). 형광 신호가 약간 감소하기 시작하였다. 용리액에서 타깃 단백질 농도가 낮아졌다. 형광 스펙트럼 E: 55%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0). 숙주 세포 단백질과 함께 타깃 단백질이 용리됨에 따라, 스펙트럼 A-D와 비교하여, 형광 신호가 신호 강도 및 최대 피크에서 시프트(shift)를 나타냈다. 형광 스펙트럼 F: 70%의 용리 완충액(100 mM Na-포스페이트, 1 M NaCl, pH 7.0). 형광 신호가 숙주 세포 단백질 용리에 의해 유발되었다. 최대 형광 신호는 순수 타깃 단백질의 형광 스펙트럼과 비교하여 높은 파장으로 시프트를 나타냈다.
도 16은 10 ml Heparin-SFF 칼럼에 FGF-2 상등액을 로딩한 경우에 다변량 분석을 이용하여 계산된 파과 곡선(Breakthrough curve)이다. 파과점(C/C0) > 10%일 때, 칼럼의 로딩을 중단하였다. C는 통과액(flow through)에서 타깃 단백질 FGF-2의 농도이고 C0는 공급액(feed load)에서 FGF-2의 농도이다. 10%의 FGF-2가 수지에 의해 보유되지 않고 통과액에 존재하였다.
도 17은 생물학적 제제의 양에 대한 예측 모델의 수행결과이다. 1초의 시간 간격(grid)(곡선) 및 이들의 분획별(fraction-wise) 평균(수평선)에 대한 교차-검증(Cross-validated) 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 양 값(음영 막대)과 비교되어 0.25 mg/ml의 오차를 나타낼 수 있다.
도 18은 RMSE = 44 ng/ml의 오차로 3회 실시(run 3)에 대해 시각화된 숙주 세포 단백질(HCP, ng/ml) 예측 모델의 예측 수행결과이다. 단일 분획(5-6분)의 경우 이용 가능한 오프라인 데이터가 없었다. 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 HCP 값(음영 막대)과 비교되어 44 ng/ml의 오차를 나타낼 수 있다.
도 19는 모델링된 HCP 및 양(quantity) 곡선의 비율에 의해 결정된, 단백질 양 대비 숙주 세포 단백질(HCP)의 농도(단위에서 ppm = mg 단백질 당 ng HCP)이다. (거의) 0 또는 음의 양 추정치를 갖는 분획은 생략되어야 한다. 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대해 조합된 단백질 양 및 HCP를 위한 양쪽 모델의 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
도 20은 3회 실시에 대해 약 41 ng/ml의 예측 오차를 나타내는 dsDNA(이중 가닥 DNA) 모델의 적용 결과이다. 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 dsDNA 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
도 21은 모델링된 dsDNA 및 양 곡선의 비율에 의해 결정된, 단백질 양 대비 3회 실시에 대한 mg 단백질 당 ng dsDNA(ppm과 동일)의 단위에서의 dsDNA 예측 모델의 수행결과이다(단위에서 ppm = mg 단백질 당 ng dsDNA). 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
도 22는 3회 실시에 대해 나타낸 단량체 예측 모델의 결과이다(RMSE = 0.08, 평균 RMSE = 0.055). 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 단량체 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
도 23은 3회 실시에 대해 통계 모델에 의해 예측된 고분자량(HMW) 불순물을 나타낸다. 수행 값은 단량체 분획의 것과 동일한데, 이들 2개의 타깃은 항상 합이 1이기 때문이다. 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 HMW 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
도 24는 수개의 온라인 신호(UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS, RI, 형광 및 ATR-FTIR)를 이용한 역가 예측 모델의 수행결과이다. 1초의 시간 간격(곡선) 및 이들의 분획별 평균(수평선)에 대한 교차-검증 모델 예측치가 오프라인으로 측정된 역가(KD) 값(음영 막대)과 비교될 수 있다.
정의
달리 기재되지 않는 한, 상세한 설명 및 청구범위를 포함하여, 이 문서에서 사용되는 다음의 용어는 이하에서 정해진 정의를 갖는다. 이 분야의 기술자는 통상적인 실험보다 많이 이용하지 않고도, 여기서 기술되는 본 발명의 특정 실시형태에 대해 많은 균등물을 인식 또는 알 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
여기서 사용되는 용어 "생물학적 제제"는 본 발명의 방법을 이용하여 추가로 처리되는 미생물 발효 브로스 또는 세포 배양액과 같이, 생물학적 공정으로부터 생긴 제제를 의미한다. 생물학적 제제는 생물의약품일 수 있다. 생물학적 제제의 예는 핵산 분자 또는 바람직하게는 치료 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 탄수화물-단백질 결합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신-유사 단백질 또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인, 항체 또는 상기 생물학적 제제의 대사물질로부터 선택되는 이종 단백질이다. 생물학적 제제는 다운스트림 공정(정제 및/또는 농축 공정)의 다른 단계에서, 초기 또는 후기 공정 단계인지 여부에 따라 다른 매트릭스를 갖는 유체 또는 현탁액 등에 존재한다. 매트릭스는 숙주 세포 단백질(HCP), 게놈 DNA, RNA, 고분자량(HMW) 불순물, 내독소(endotoxin), 지질, 세포 잔해, 침전 단백질, 제제 변형체 등과 같은 공정, 세포 및 제제 관련 불순물을 포함한다. 생물학적 유체는 또한 공정의 다른 단계에서 다른 농도로 존재하고 다른 역가를 가질 수 있다.
생물학적 제제와 관련하여, 용어 "농도"는 용어 "양"과 대체 가능하게 사용된다. 농도는 mg/ml로 측정된다.
여기서 사용되는 용어 "순도"는 불순물과 관련하여 생물학적 제제에 존재하는 제제 양을 의미한다. 순도는 생물학적 제제의 모든 변형체의 합계 중 생물학적 제제의 원하는 변형체(예를 들어, 자연 발생 단백질의 아미노산 서열 및 N-말단을 갖는 플라스미드 DNA 또는 단백질의 초나선(supercoiled) 형태) %로서, 또는 생물학적 제제의 모든 형태의 합계 중 단량체 형태 %로서 표현될 수 있다.
순도는 또한 생물학적 제제를 포함하는 유체 또는 현탁액 밀리리터 당 불순물 mg 또는 ㎍ 또는 ng(mg 또는 ㎍ 또는 ng/mL)으로서, 또는 유체 또는 현탁액에서 생물학적 제제 밀리그램 당 mg 또는 ㎍ 또는 ng(mg 또는 ㎍ 또는 ng/mL 또는 ppm 또는 ppb(parts per million, parts per billion)로도 표현됨)으로서 표현될 수 있다. 절대 순도 및 상대 순도(제제 mg 당 생물 활성의 단위)가 정의되었고 시험 절차뿐만 아니라 허용 기준이 EMEA의 ICH에 의해 표준화되었다(1999년 9월에 공개된 ICH Q6B). 상술한 바와 같이, ICH 가이드라인에서, 공정 관련 불순물 및 제제 관련 불순물이 구별된다. 실시예와 관련하여, 제제 순도는 단량체 제제의 농도로서 결정되고 숙주 세포 단백질 농도(HCP) 또는 DNA 농도 및 고분자량(HMW) 불순물과 관련된다. 불순물은 숙주/세포 관련 불순물(예를 들어 이에 제한되지 않지만, 숙주 세포 단백질(HCP), 게놈 DNA, RNA, 고분자량(HMW) 불순물, 내독소, 지질, 세포 잔해, 침전 단백질 등), 공정 관련 불순물(예를 들어 이에 제한되지 않지만, 소포제, 항생제, 트윈, 세정제, 사이클로 덱스트린 및 공정에 첨가된 다른 화합물 등) 및 제제 관련 불순물(예를 들어, 제제 변형체, 제제 응집체, 잘린 형태의 제제 등)을 포함한다.
용어 "역가"는 생물학적 제제의 생물학적 활성을 의미하고, 생물학적 활성을 유발하는 수용체 또는 다른 분자에 대한 특정 생물학적 제제의 결합의 평형 해리 상수 KD 값으로서 측정된다. 평형 결합 상수는 바이오센서, 방사능 표지 형광 표지 리간드를 이용한 수용체 결합 시험, 또는 등온 적정 열량 측정과 같은 열량 측정 시험에 의해 결합 동역학을 측정함으로써 얻어질 수 있다. 역가를 얻는 다른 방법은 세포 배양 시험에서 생물학적 제제의 유효 농도의 50%(EC50), 또는 세포 배양에서 50% 억제가 관측되는 억제 농도(IC50)를 측정하는 것이다.
여기서 사용되는 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 상당히 또는 부분적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드(하나 이상의 결합 도메인, 바람직하게는 항원 결합 도메인을 포함)를 포함하는 단백질이다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 여기서 "항체"와 대체 가능하게 사용된다. 여기서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린(또는 온전한 항체)을 의미할 뿐만 아니라, 그 단편도 의미하고, 항원-결합 단편 또는 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 단편은 예를 들어 항원-결합 기능을 보유하는 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH 및 다른 항체 단편이다.
용어 "다운스트림 공정" 또는 정제 및/또는 농축 공정은 생물학적 제제의 실제 생산 공정 이후에 따르는 공정과 관련된다. 생물학적 제제는 숙주 세포의 발효를 통해 생물학적 제제를 생산하는 숙주 세포를 이용하여 통상적으로 생산된다. 생물학적 제제는 숙주 세로로부터 배양 배치로 분비되거나 숙주 세포의 세포기질(cytosol)에 용해성으로 또는 봉입체(IB) 형태로 남아 있을 수 있다. 이후, 생물학적 제제는 다른 정제 및/또는 농축 단계를 포함하는 정제 및/또는 농축 공정인 다운스트림 공정에서 정제된다. 통상적인 정제 및/또는 농축 단계는 세포 붕괴(고압 균질화기 또는 극미립자 또는 역삼투 등을 이용), IB 분리, IB 가용화, 리폴딩, 여과(전량 여과, 심층(deep bed) 여과, 막 여과, 접선 유동 여과, 한외여과/투석여과(UF/DF) 등), 투석, 크로마토그래피, 결정화, 침전(예를 들어, 황산암모늄, 염화칼륨, 열 등을 이용), pH 조절, 염석(salting), 추출(수성 2상 추출 등), 단백질 분해성 절단(proteolytic cleavage)(화학적 또는 효소적 또는 자가 단백질 분해성(autoproteolytic)), RNAse를 이용한 RNA 분해, 한외여과, 나노막을 이용한 나노여과 및 이 분야에서 공지된 다른 정제 및/또는 농축 단계이다.
여기서 사용되는 용어 "조작 유닛"은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축용 시스템이다. 본 발명에서, 용어 "조작 유닛"은 적어도 하나의 정제 유닛 및/또는 농축 유닛을 포함한다. 조작 유닛은 하나 또는 수개의 크로마토그래피 유닛 및/또는 여과 유닛을 포함할 수 있다. 조작 유닛은 실험실 및 산업적 규모의 유닛을 포함하는 것으로 의도된다. 실험실 규모의 조작 유닛에 사용되는 칼럼은 1 ml 내지 100 ml의 규모를 가질 수 있다. 파일럿 및 산업적 규모의 조작 유닛은 약 100 ml부터 약 2000 리터까지의 규모를 가질 수 있다. 다른 조작 유닛은 세포 붕괴(예를 들어, 고압 균질화기 또는 극미립자용 교반 탱크 반응기 또는 역삼투 등), IB 분리(예를 들어, 교반 탱크 반응기 및 원심분리기를 포함하는 유닛), IB 가용화(예를 들어, 교반 탱크 반응기, 펌프 및 스태틱(static) 믹서를 포함하는 유닛), 리폴딩(예를 들어, 교반 탱크 반응기, 펌프 및 스태틱 믹서를 포함하는 유닛), 여과(도 8에 도시된 또는 필터 돔(dome)을 포함하는 유닛), 투석, 크로마토그래피(예를 들어 크로마토그래피 칼럼을 포함하거나 도 3에 도시된 유닛), 결정화(예를 들어, 교반 탱크 반응기 및 필터 누체(nutsche)를 포함하는 유닛), 침전(예를 들어, 열교환기 및/또는 교반 탱크 반응기를 포함하는 유닛), pH 조절(예를 들어, 교반 탱크 반응기를 포함하는 유닛), 염석(예를 들어, 교반 탱크 반응기를 포함하는 유닛), 추출(예를 들어, 향류 추출기를 포함하는 유닛), 단백질 분해성 절단(예를 들어, 교반 탱크 반응기 또는 예를 들어 칼럼에서 고정화된 효소를 갖는 효소 반응기를 포함하는 유닛), RNAse를 이용한 RNA 분해(예를 들어, 교반 탱크 반응기 또는 예를 들어 칼럼에서 고정화된 효소를 갖는 효소 반응기를 포함하는 유닛), 한외여과, 나노막을 이용한 나노여과(양쪽 모두 예를 들어, 도 8에 도시된 유닛)용 유닛 및 이 분야에서 공지된 다른 정제 및/또는 농축 단계용 유닛일 수 있다.
본 발명의 방법과 관련하여 여기서 사용되는 용어 "온라인"은 실시간으로 공정의 직접 컴퓨터 제어를 의미한다. 온라인 모니터링 및 제어는 원위치, 인라인, 또는 특정 경우에서 느린 공정에서는 앳라인으로 배치된 센서에 의해 실행될 수 있다. 이들 센서는 온라인 센서로 불린다. "온라인"으로 고려되는 측정에서는, 공정 또는 재료 특성에 관한 정보가 얻어지고 분석되는 시간은 이들 특성이 변하는 시간보다 짧아야 한다.
여기서 사용되는 용어 "앳라인"은 수동 또는 자동 샘플링에 이은 불연속적 샘플 제조, 측정 및 평가를 특징으로 하는 분석을 의미한다. 재료 특성은 샘플링 및 결과 이용 사이의 시간 중에 변할 수 있어서, 직접 공정 제어는 느린 공정에서만 가능하다. 앳라인 분석은 공정 흐름에 물리적으로 및 시간적으로 아주 가깝게 이루어지고 이후 공정 제어에 사용된다.
여기서 사용되는 용어 "인라인"은 공정 흐름의 특성의 추론을 허용하는 공정 파라미터의 직접 결정을 의미한다. 통상적으로, 인라인 방법은 비-파괴적이다. 측정은 분석되는 공정 흐름, 또는 전체 공정 또는 분할 흐름에서 수행된다.
여기서 사용되는 용어 "오프라인"은 공정 흐름에서 제거되고 시간적으로 및 물리적으로 별개의 방식으로 분석된 샘플의 분석을 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "원위치"는 정제 및/또는 농축 공정이 수행되는 조작 유닛에서, 예를 들어 크로마토그래피 또는 여과 유닛 내에서 수행되는 측정/분석을 의미한다.
용어 "비-침습적"은 방법 또는 장치가 공정 흐름을 바꾸거나 방해하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 비-침습적 원위치 센서는 크로마토그래피 칼럼의 벽에 부착되거나 벽 내에 도입됨으로써 칼럼 자체에서 제제 흐름과의 간섭 없이 측정할 것이다.
용어 "비-파괴적"은 측정되는 생물학적 제제 또는 샘플의 특성을 바꾸지 않는 샘플링 방법을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 단백질 양의 측정은 단백질을 파괴하지 않거나 그 구성을 변경하지 않는다.
용어 "센서"는 예를 들어 제제의 형태, 폴딩 및/또는 변형과 같은 제제의 물리-화학적 및/또는 생물물리적 특성을 포함하여, 하나 이상의 물질의 존재 또는 양을 감지, 검출, 측정, 모니터링, 결정 또는 정량화할 수 있는 장치를 의미하고, 제한 없이, 기계적 센서, 힘 및 질량 센서, 음향 센서, 화학 센서, 바이오센서, 전기화학 센서, 광학 센서, 전자기 센서, 전기 센서, 전자 센서, 광전자 센서 및 광검출기를 포함한다. 본 발명에서 센서는 UV-VIS-흡광 센서, 형광 센서, 적외선 흡광 센서, 광 굴절 센서, (광학 센서 및/또는 형광 센서), 광 산란 센서(정적 및/또는 동적), 온도 센서, SAXS 센서 및/또는 pH, 전도도 센서로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 용어 "센서"는 구체적으로 감쇠 전반사(ATR)-푸리에 변환 적외선 분광(FTIR), 형광 검출, 다각도 광 산란(MALS) 및/또는 굴절률 검출기(RI)를 의미할 수 있다. 이와 관련하여, 형광 센서와 같은 센서는 전체로서 목표 특성을 측정하는 유닛을 의미함을 주목하는 것이 중요하다. 따라서 용어 형광 센서는 제제의 형광을 측정하는데 필요한 모든 발광 및 여기 센서를 포함한다. 온라인 센서는 예를 들어 직접 공정 흐름에서 측정용 최신식 크로마토그래피 시스템에 사용되는 UV/Vis 검출기 또는 pH 센서용, 또는 예를 들어 교반 탱크 반응기에서 리폴딩 용액에서 측정되는 유체에 직접 배치되는 ATR 프로브를 이용한 FTIR 검출기용 플로우 스루 셀(flow through cell)이다. ATR-FTIR 센서용 플로우 스루 셀과 같은 온라인 센서는 크로마토그래피 유닛의 로딩 및 용리액 흐름에 포함될 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "실시간"은 정제 또는 농축이 일어나는 동안에 정제 또는 농축 단계의 측정 파라미터를 의미한다. 오프라인 분석과는 대조적으로, 실시간 측정은 모니터링된, 측정된 또는 관측된 정제 이벤트와 동시에 수행된다. 예를 들어, 실시간 측정은 매트릭스에 결합한 제제의 양에서 증가 또는 감소의 비율의 결정을 포함할 수 있다. "실시간" 측정은 또한 모니터링되는 특성의 변화가 분석의 응답보다 느린 공정을 포함한다. 여기서 사용되는 "실시간"은 관련 이벤트의 발생 시간, 미리 결정된 데이터의 측정 및 수집 시간, 데이터를 처리하는 시간, 및 이벤트와 환경에 대한 시스템 응답 시간 중 적어도 하나가 동시적인 것을 의미한다. 여기서 기술되는 실시형태에서, 이러한 활동 및 이벤트는 실질적으로 순간적으로 일어난다. 이것은 관련 이벤트가 데이터의 측정 및 수집의 10초, 9초, 8초, 7초, 6초, 5초, 4초, 3초, 2초 또는 1초 이내에 일어남을 의미한다.
"실시간 출하"는 최종 제제 시험의 수행 없이 제조 공정에서 얻어진 원료 및/또는 데이터의 시험 결과에 의해, 제조과정 중의 제제, 중간 및/또는 최종 제제의 품질을 평가할 수 있고 품질이 허용가능함을 보장하는 시험 방법론을 의미한다.
용어 "파라미터 기반 출하"는 제제가 예를 들어 농도, 순도 및/또는 역가와 같은 특정의 미리 정해진 파라미터를 충족함을 증명하도록, 제조 공정 중에 수집된 데이터에 근거한 제제의 출하를 의미한다. 부가적으로, 원하는 제제의 제조 공정은 제제의 원하는 품질을 확보하도록 제조 중에 수행되는 공정 모니터링에 근거하여 검증될 수 있다. 얻어진 데이터에 근거하여, 제제는 다른 목표 용도를 위해 즉시 출하될 수 있다.
따라서, 파라미터 기반 또는 실시간 출하는 제제의 품질에 영향을 미치는 제조 공정 중에 얻어진 데이터를 기초로 하여 얻어지는 제제의 품질을 확보하는 품질 시험을 의미한다. 실시간 출하 시험의 사용은 예비-출하(pre-shipment) 품질 시험의 필요성을 제거하고 이에 따라 유리하게는 제조 후 즉시 출하를 허용한다. 실시간 출하에서 최종적으로 얻어지는 제제는 제조 공정 중에 얻어진 데이터가 정해진 사양 범위 내에 있을 경우 목표 품질을 만족하는 것으로 판단된다.
본 발명의 정제 및/또는 농축 공정을 모니터링 및 제어하는 방법과 관련하여, 용어 "제어"는 온라인 센서로부터의 데이터를 진단하는 단계뿐만 아니라, 모니터링되고 있는 공정을 조절 및 최적화하는 단계도 포함한다. 제어는 또한 조치가 필요하지 않을 경우에 공정을 조절 또는 최적화하지 않도록 하는 선택을 의미할 수 있다. 하나의 측면에서, 제어는 예를 들어 생물학적 제제의 실시간 순도 제어를 포함할 수 있다. 제어는 실제 공정 데이터 값의 진단 및 선택적으로 정제 및/또는 농축 공정의 조절을 의미한다.
용어 "조절" 또는 정제 및/또는 농축 공정을 "조절하는"은 특정 출력 공정 파라미터/특정 출력 공정 파라미터들(예를 들어, 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가, 또는 생물학적 제제의 특정 불순물)의 값/값들을 측정하는 것, 측정된 출력 파라미터의 차이/미리 정해진 조작 값에 대한 파라미터/미리 정해진 조작 값들 또는 그 범위들을 평가하는 것, 출력 파라미터가 미리 정해진 조작 값 또는 범위나는 경우에, 미리 정해진 조작 값의 값들 또는 범위/미리 정해진 조작 값들 또는 그 범위들 내에서 다시 작동하도록 하나 이상의 입력 파리미터를 변경하는 것에 의한 공정의 조작을 의미한다. 또한, 조절은 예를 들어 공정의 중단, 공정의 포기, 공정 단계의 중단, 다음 공정 단계로의 시작, 크로마토그래피 공정 중에 용리액 수집의 시작과 중단, 크로마토그래피 공정 중에 크로마토그래피 칼럼 로딩의 중단, 단백질 가수분해 또는 자가 단백질 분해 단계와 같은 효소 공정의 중단, 투석여과 공정 중에 투석여과 완충액의 추가량 첨가, 리폴딩 공정 중에 온도 변화, IB 재가용화 단계의 중단 등과 같이, 특정 출력 공정 파라미터/특정 출력 공정 파라미터들(예를 들어, 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가, 또는 생물학적 제제의 특정 불순물)의 값/값들에 따른 공정 또는 공정 단계의 조작을 의미한다.
용어 "진단하는" 또는 "진단하다"는 상기 실제 값/데이터와 동일 공정의 다른 배치(batch)를 비교하기 위해, 및/또는 상기 실제 값/데이터가 미리 정해진 사양 내에 있는지 확인하기 위해, 및/또는 정제 및/또는 농축 공정 및/또는 공정 단계의 (원하는) 목적이 충족되는지를 평가하기 위해(예를 들어 이에 제한되지 않지만, 특정 불순물이 특정 크로마토그래피 단계에 의해 적절히/원하는 만큼 분리되는지, 또는 생물학적 제제의 원하는 농도가 한외여과 단계 중에 도달하는지, 또는 생물학적 제제가 리폴딩 단계 중에 비-활성 형태로부터 원래의 활성 형태로 리폴딩되는지, 리폴딩 공정의 (예를 들어, 생물학적 제제의 60%가 리폴딩되는) 종료점을 검출하도록, 또는 결정화, 침전, 염석, 단백질 가수분해 또는 자기 단백질 분해 공정의 종료점을 검출하도록, 또는 생물학적 제제 특성이 홀드 시간 중에 변하는지를 평가하기 위해 등), 및/또는 편차의 특별한 원인을 확인 및/또는 제거하기 위해, 및/또는 정제 및/또는 농축 공정을 최적화 및/또는 최종 결과로서 생물학적 제제를 출하하기 위해, 센서의 각 출력 및/또는 다변량 공정 데이터 및/또는 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 실제 예측된 값에 대응하는 얻어진 실제 공정 데이터 값의 평가 및 판단을 의미한다. 이러한 공정 진단은 편차의 흔한 원인을 제거함으로써 결국 공정을 개선한다.
여기서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 명확하게 달리 표시하지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것을 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"은 하나 이상의 이러한 다른 시약을 포함하고, "방법"은 여기서 기술된 방법에 대해 변경 또는 대체될 수 있도록, 이 분야의 기술자에게 공지된 동등한 단계 및 방법을 포함한다.
달리 표시하지 않는 한, 일련의 구성요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 일련의 모든 구성요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이 분야의 기술자는 통상적인 실험보다 많이 이용하지 않고도, 여기서 기술되는 방법 및 용도의 특정 실시형태에 대해 많은 균등물을 인식 또는 알 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
이 명세서 및 그 뒤에 있는 청구범위를 통해, 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 그리고 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 기재된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하고 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 여기서 사용되는 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 때때로 여기서 사용되는 용어 "갖는"과 대체될 수 있다.
여기서 사용되는 "~로 구성되는"은 청구범위 요소에서 특정되지 않은 구성요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 여기서 사용되는 "~로 필수적으로 구성되는"은 청구범위의 기본적인 및 새로운 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 각 경우에서, 용어 "구성되는", "~로 구성되는" 및 "~로 필수적으로 구성되는"은 다른 두 용어와 대체될 수 있다.
여기서 사용되는 바와 같이, 다수로 기재된 구성요소들 사이의 접속사 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 선택 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 구성요소가 "및/또는"으로 결합하는 경우, 첫 번째 선택은 두 번째 없이 첫 번째 구성요소의 적용가능성을 의미한다. 두 번째 선택은 첫 번째 없이 두 번째 구성요소의 적용가능성을 의미한다. 세 번째 선택은 두 번째 없이 첫 번째 및 두 번째 구성요소 모두의 적용가능성을 의미한다. 이들 선택 중 어느 하나는 상기 의미 내에 있는 것으로 이해되고, 따라서 여기서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 만족한다. 선택들 중 하나 이상의 동시 적용가능성도 상기 의미 내에 있는 것으로 이해되고, 따라서 여기서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 만족한다.
여기서 기술되는 "바람직한 실시형태"는 "본 발명의 바람직한 실시형태"를 의미한다. 마찬가지로, 여기서 기술된 "다양한 실시형태" 및 "다른 실시형태"는 "본 발명의 다양한 실시형태" 및 "본 발명의 다른 실시형태"를 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "약"은 이 분야의 기술자에 의해 결정되는 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 값을 의미하며, 상기 값은 부분적으로는 그 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한정에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 이 분야의 관례에 따라 1 또는 1 이상의 표준 편차를 의미할 수 있다. 또한, 용어 "약"은 해당 양 또는 값이 대략 동일한 것으로 지정된 값 또는 일부 다른 값일 수 있음을 나타내는데 사용된다. 상기 용어는 유사 값이 본 발명에 따른 동등한 결과 또는 효과를 촉진함을 의미하는 것으로 의도된다. 여기서 "약"은 10%까지의 이상 및/또는 이하 범위를 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 특정 값 이상 및 이하의 범위, 예를 들어 5%까지, 2%까지, 1%까지, 또는 0.5%까지의 이상 또는 이하 범위를 의미한다. 하나의 실시형태에서, "약"은 주어진 값 이상 및 이하의 1%까지의 범위를 의미한다.
수개의 문헌들이 본 개시의 텍스트를 통해 인용된다. 여기서 인용되는 각 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학적 공개물, 제조사의 사양서, 지시서 등을 포함)은 전술 또는 후술하는 바와 같이 그 전체 내용이 여기서 참고로 도입된다. 참고로 도입되는 자료가 본 명세서와 모순되거나 불일치할 경우, 본 명세서는 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 발명은 이전 발명 때문에 이러한 개시를 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
이하의 상세한 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기서 제공된 정보가 종래기술이거나 현재 청구된 발명과 관련된 것, 또는 명시적으로 또는 암시적으로 참고된 공개물이 종래기술인 것을 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축 공정을 실시간으로 모니터링 및 제어하는 컴퓨터 기반 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 2개의 온라인 센서로부터의 데이터를 진단하고 이 데이터를 온라인 및 오프라인 데이터로부터 사전에 얻어진 예측 모델에 공급함으로써, 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가에 관한 정보를 실시간으로 제공하는 다변량 통계 분석의 사용에 의존한다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 사용되는 장치를 제공한다.
첫째, 제제의 농도, 순도 또는 역가와 같은 특정 특성에 대한 예측 모델을 얻기 위해, 온라인 및 오프라인 데이터 모두가 목표 생물학적 제제에 대해 수집되었다. 도 1의 공정 개략도로부터 알 수 있듯이, 온라인 및 원위치 모니터의 데이터는 모델 생성 및 훈련용 오프라인 데이터와 관련하여 평가될 수 있다. 통계적 방법을 통해, 통계 모델이 구축되어 순도, 역가 및 양의 예측을 가능하게 한다. 지명된 속성의 예측은 파라미터 기반 또는 실시간 출하, 공정 최적화 및 공정 제어를 허용한다.
예측 모델 구축
실시예 7에서 상세하게 기술되듯이, 실시예에 사용된 예측 모델에 대해, UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS 및 RI 장치(전체 p = 14개 변수를 가짐), ATR-FTIR 스펙트럼(분해능 대략 2 cm-1, p = 1427개 예측변수(predictor) 생성)뿐만 아니라, 전체 14366개 형광 변수를 생성하는 7개 여기 파장에서의 형광 발광 스펙트럼(분해능 약 0.3 nm)으로부터의 온라인 데이터가 수집되었다. 예측변수 집합 및 응답에 따라, 7 내지 14개의 크로마토그래피의 실시로부터 변수 데이터가 모델 구축을 위해 사용되었다. 이후, 시간 정렬(alignment) 단계가 수행되었다 - 수개의 장치 사이의 알려진 시간 지연을 고려하여 각 오프라인 분획의 시간 프레임에 대응하는 각 온라인 변수에 대해 평균이 계산되었다. 이후, 변수 선택 기법으로서 부스팅(boosting)(R package mboost)과 조합하여 STAR(structured additive regression) 모델에 의해 결과가 얻어졌다. 파라미터 최적화 및 모델 선택은 교차 검증(각 실시로부터의 데이터는 일단 배제되고 수개의 다른 실시의 데이터에 근거한 모델로 예측된다)을 통해 자동 스케일 조정된(autoscaled) 데이터(즉, 각 예측변수로부터 평균을 빼고 그 표준 편차로 나눈다)로 수행되었다. 모델 품질은 교차-검증된 평균 제곱근 오차(RMSE)로 측정되었다. 이런 식으로, 목표 생물학적 제제의 다른 특성에 대한 모델이 구축될 수 있다.
실시예 7에서, 양(농도), 순도(숙주 세포 단백질(HCP), 이중-가닥 DNA(dsDNA), 단량체 및 고분자량(HMW) 불순물 농도) 및 역가(KD 값)에 대한 모델이 생물학적 제제 FGF2에 대해 구축되었다.
예시적인 모델링 결과 및 후속 목표 변수용 대응 오프라인 값과의 비교가 다음의 도면에 나타난다.
1. 단백질 양(농도)(mg/ml)(도 17)
2. 숙주 세포 단백질 농도(ng/ml) 및 추정된 단백질 양(ppm)과의 대비(도 18 및 19)
3. 이중-가닥 DNA(dsDNA) 농도(ng/ml) 및 추정된 단백질 양(ppm)과의 대비(도 20 및 21)
4. 단량체 및 고분자량 불순물(%)(도 22 및 23)
5. KD 값으로 표현된 역가(도 24)
이들 도면에서, 타깃에 대해 실제로 측정된 오프라인 값은 막대로 나타나고, 1초의 시간 간격에서 온라인 데이터에 근거한 모델 예측치는 곡선으로 나타나며, 각 오프라인 분획에 대해 평균화된 예측치는 수평선으로 나타난다. 결과는 단일 크로마토그래피 실시에 대해 주어지는데, 그 예측 오차는 전체 예측 오차(모든 실시에 대해 평균화됨)와 유사하다. 수평축은 시간(분)을 나타내는데, 그 기준점(origin)은 첫 번째 오프라인 분획의 시작에 위치한다.
모델 구축/다변량 통계를 위해 오프라인 분석이 사용되었다. 이와 관련하여, 생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가를 측정하는 어떠한 오프라인 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 농도(양)의 측정을 위해, 역상-HPLC, 친화성-HPLC 및 ELISA가 사용될 수 있다. 구체적으로, 실시예에서 개발된 예측 모델에서 양/농도의 결정을 위해, 역상 HPLC가 FGF2 농도를 결정하는데 사용되었다. 항체 농도의 결정을 위해, 단백질 A 칼럼이 결합-용리 모드로 사용되어 전체 항체 농도를 나타냈다. 순도의 분석을 위해, 단량체 함량 및 고분자량과 저분자량 불순물을 결정하는 크기 배제 크로마토그래피, LAL 내독소 시험, 숙주 세포 단백질 ELISA, 및 Picogreen 시험을 통한 dsDNA 정량화가 사용될 수 있다. 역가의 분석을 위해, 표면 플라스몬(plasmon) 공명에 근거한 바이오센서, 생물학적 제제의 생물활성을 시험하기 위한 증식 시험 및 세포 배양 역가 시험이 사용될 수 있다.
또한, 주어진 생물학적 제제에 대해 각 개별 실시용 온라인 센서로부터 얻어진 온라인 데이터는 다변량 통계 분석을 이용한 농도, 순도 및 역가의 통합 예측용 오프라인 데이터와 관련하여 평가되었다. 다변량 분석(MVA)은 다변량 통계의 통계 원리에 근거하고, 한번에 하나 이상의 통계 변수의 관측 및 분석을 수반한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 예측 모델 구축에 사용된 다변량 통계 분석은 기계 학습(machine learning) 기법에 근거한다.
기계 학습은 분석 모델 구축을 자동화하는 데이터 분석 방법이다. 기계 학습은 인공 지능에서의 패턴 인식 및 계산 학습 이론의 연구로부터 발달한 컴퓨터 공학의 하위 분야이다. 기계 학습은 데이터로부터 학습하고 예측할 수 있는 알고리즘의 연구 및 구축을 이용한다. 이러한 알고리즘은 정적 프로그램 명령을 엄격히 따르기보다 데이터-구동 예측 또는 결정을 만들기 위해 예제 입력으로부터 모델을 구축함으로써 작동한다. 기계 학습은 계산 통계학과 밀접하게 관련되고 수학적 최적화와 강한 상관관계를 갖는다.
기계 학습은 통계학과 밀접하게 관련되고 흔히 동일한 방법을 이용하며 상당히 중첩된다. 이하에서, 다변량 데이터 분석 및 기계 학습의 다른 방법이 간략하게 요약된다. 랜덤 포레스트(random forest: RF)로도 불리는 결정 트리 집합(Decision tree ensemble)은 효과적인 분류기(classifier)인 것과 함께 특징(feature) 선택에 유용하다. 차원 축소에 대한 하나의 접근은 목표 속성에 대해 트리의 크고 조심스럽게 구축된 집합(set)을 생성한 후 각 속성 이용 통계를 사용하여 특징의 가장 유용한 부분집합(subset)을 찾는 것이다.
통상적으로 "신경망"(NN)으로 불리는 인공 신경망(ANN) 학습 알고리즘은 생물학적 신경망의 구조와 기능 측면에 영감을 받은 학습 알고리즘이다. 계산은 인공 신경의 상호 연결된 그룹, 계산에 대한 연결주의(connectionist) 접근을 이용한 처리 정보의 측면에서 구조화된다.
서포트 벡터 머신(support vector machine: SVM)은 분류 및 회귀에 사용되는 관련 지도(supervised) 학습 방법의 집합이다. 2개의 카테고리 중 하나에 속하는 것으로 각각 표시된 훈련 예제의 집합이 주어지면, SVM 훈련 알고리즘은 새로운 예제가 하나의 카테고리 또는 다른 것에 맞아떨어지는지를 예측하는 모델을 구축한다.
다변량 적응형 회귀 스플라인(adaptive regression spline)(MARS)은 비-파라미터적 회귀 기법이고, 상수, 힌지(hinge) 함수 또는 2개 이상의 힌지 함수의 곱(product)과 같은 기저(basis) 함수의 가중(weighted) 합계로서 회귀 모델을 구축한다. 후자는 예측 변수들 사이의 상호작용의 모델링을 허용한다.
리지(ridge) 회귀, Lasso(least absolute shrinkage and selection operator: 최소 절대 수축 및 선택 연산자) 및 엘라스틱 네트(elastic net)는 해석가능성(interpretability) 및 많은 경우에서 또한 예측 모델의 예측 성능을 향상시키는 자동 변수 선택 및 일반화(regularization)(파라미터 수축)를 수행하는 회귀 기법이다.
최소 각도 회귀(LARS)는 고차원 데이터에 특히 적합한 회귀 방법이고 단계적(stepwise) 회귀와 유사하다.
구조화 가법(structured additive) 회귀(STAR) 모델은 공변량(covariate)의 평활(smooth) 효과뿐만 아니라 예측변수들 사이의 상호작용 효과를 또한 도입하는 선형 모델의 연장이다.
주성분(Principal component) 분석(PCA)은 (잠재적으로 많은) 변수의 집합을 주성분(PC)로 불리는 비상관(uncorrelated) 변수의 작은 집합으로 변환하는 비지도(unsupervised) 다변량 통계 방법이다. 이 변환은 수개의 이전 PC에 직교하는 동안에, 각 PC의 방향이 데이터 집합에서 최고 가능 분산을 설명하는 방식으로 수행된다. 통상적으로, 첫 번째 몇 개의 PC는 오리지널 데이터 집합의 대량의 전체 변산도(variability)(정보)를 커버하고 이에 따라 현저한 데이터 감소에 이른다.
부분 최소 제곱(PLS) 회귀는 독립 및 응답 변수의 시스템의 분석용 다변량 회귀 기법이다. 또한, PLS는 독립 변수의 집합을 다중 종속(응답) 변수의 집합과 연관시킬 수 있다. 부분 최소 제곱 판별(discriminant) 분석(PLS-DA)은 Y가 범주형(categorical)일 때 사용되는 변형이다.
다변량 곡선 해석(curve resolution)(MCR)은 크로마토그래피 데이터와 같은 시간 전개 데이터를 순수 스펙트럼 및 대응 농도, 순도 및 역가 프로파일로 해석한다.
예측 모델 구축에 사용되는 기계 학습 기법은 상술한 바와 같은 부분 최소 제곱 회귀, 주성분 회귀, 랜덤 포레스트, 신경망, 구조화 가법 회귀, 다변량 적응형 회귀 스플라인, 리지 회귀, 라소(lasso), 엘라스틱 네트, 최소 각도 회귀 또는 서포트 벡터 머신 중에서 선택된다.
또한, 공학/기계론적 모델이 모델 구축용 획득 데이터와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 다공성 비드로 충전된 크로마토그래피 칼럼의 로딩은 수개의 수학적 모델로 예측될 수 있다. 평형 결합 용량은 교반 탱크 방법, 얕은 층(shallow bed) 또는 소규모 크로마토그래피 실험과 같은 수개의 방법에 의해 추정될 수 있다. 또한, 유효 확산도(diffusivity)와 같은 결합 동역학 및 다른 파라미터는 이들 실험으로부터 얻어질 수 있다. 이들 파라미터를 추정한 후에, 구형 흡착제 입자에서의 물질 전달의 기술용 속도 식을 이용한 수학적 모델이 파과 곡선 및/또는 로딩의 정도를 예측하기 위해 적용될 수 있다. 이러한 수학적 모델은 기공 확산, 고체 확산, 평행 기공 및 고체 확산, 필름 확산, 평행 필름 및 기공 확산 또는 확산 이중-분산(bi-dispersed) 입자이다. 칼럼 길이 및 시간의 함수로서 로딩으로부터 제제의 이동은 이들 모델을 이용하여 계산된다. 크로마토그래피 칼럼으로부터 피크의 용리에 대해 동일한 것이 수행될 수 있다. 필요할 경우, 예측된 로딩 프론트(loading front) 또는 용리 프로파일이 칼럼 이전 및 이후에 일어나는 영역 확산(zone spreading)과 뒤얽힐 수 있다.
상기 예로부터 알 수 있듯이, 공학/기계론적 모델과 통계 분석의 조합은 예측을 날카롭게 한다.
모델 구축을 위한 다른 선택에서, 통계적 방법은 기공 확산 모델/고체 확산 모델, 필름 확산 모델과 같은 기계론적 모델과 엑스트라 칼럼 밴드 확산(extra column band spreading)을 조합하여 물리적 리얼리티를 충족할 수 있다. 파라미터 추정을 위해 많은 실험을 요구하는 다성분 환경은 모델 훈련으로 해결되었다. 모델은 사용된 특정 조작 유닛에 근거하여 칼럼, 흐름 균일성, 및 흡착/탈착 메커니즘에 의한 밴드 확산을 고려한다. 기공 확산이 지배적인 공정일 경우에, 분석 해법 및 단순한 수치 해법이 공정 흐름의 조성을 예측하는데 사용되었다. 이것은 속도를 향상시키고 조작 범위의 컴퓨터 지원 탐색을 허용한다.
본 발명의 중요한 측면은 모델 훈련을 수행한 후에, 생물학적 제제와 관련하여 추가 교정 단계가 각 센서에 대해 필요하지 않아서, 본 발명의 방법이 설정 변경 없이 목표 생물학적 제제에 적용될 수 있다는 것이다.
주어진 생물학적 제제에 대해 모델이 일단 구축되면, 본 발명의 방법은 예측 모델의 추가 조정 없이 그리고 오프라인 데이터의 획득 없이 사용될 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이, 예측 모델 구축에 사용되었던 온라인 센서는 본 발명의 공정 모니터링 및 제어를 위한 데이터 값을 얻는데에도 사용되고 생물학적 제제와 관련하여 교정될 필요가 없다. 이것은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축 공정의 실시간 모니터링 및 제어뿐만 아니라, 제제의 실시간 또는 파라미터 기반 출하의 모니터링 및 제어를 허용한다.
정제 및/또는 농축 공정의 제어 및 모니터링 방법
생물학적 제제에 대해 예측 모델이 일단 구축되었으면, 본 발명의 방법은 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축을 모니터 및 제어하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 목표 생물학적 제제의 개선된 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 이 분야의 발현 기술에서 통상적인/공지된 방법을 통해 상기 제제를 발현하는 단계; 이 분야에서 또한 원칙적으로 공지된 방법에 의해, 그러나 본 발명의 방법을 부가적으로 적용함으로써 발현 제제를 정제하는 단계; 및 선택적으로 사용 또는 상용화를 준비하는 목표 제제를 얻기 위해, 정제된 발현 제제를 마무리(finishing), 예를 들어 제제화하는(formulating) 단계를 포함한다.
실시간 순도 제어를 구현할 경우, 예를 들어 크로마토그래피 분리, 단백질 리폴딩 단계 또는 막 분리의 설정 및 조작은 통상적인 설정과 비교하여 실질적으로 다르지 않을 것이며, 그 이유는 구축된 시스템에 온라인 검출기의 설치만을 의미할 것이기 때문이다. 가능한 설정의 예가 도 3에 나타나 있다. 도 5로부터 알 수 있듯이, 전처리로 시작하여, 센서/크로마토그래피 시스템의 준비, 크로마토그래피 실시가 시작된다. 예측 모델은 순도, 역가 및 농도(양)의 예측을 가능하게 하고 따라서 즉시 제제 출하를 허용한다.
실시간으로 모니터링되는 다운스트림 공정의 조작 순서는 도 5에서 볼 수 있다. 여기서 볼 수 있듯이, 목표 단백질은 발효 공정 또는 이전의 다운스트림 유닛 조작으로부터 얻어진다. 발현 숙주에 따라, 목표 단백질을 함유하는 공정 용액은 전처리된다(예를 들어, 크로마토그래피 단계 이전에 0.2 ㎛ 전량 여과, 로딩 단계를 위해 공급액의 pH 값 또는 전도도 등 조절, 봉입체의 가용화). 이하의 본 실시예에서, 크로마토그래피 실시는 UV-VIS, 전도도, pH 및 압력용 표준 센서를 구비한 Akta Pure 25 시스템(GE Healthcare, Sweden)에서 수행되었다. 구체적으로, Akta Pure 25 시스템은 다파장 UV 검출기 U9-M(UV-VIS, 280 nm, 260 nm, 214 nm - 190~700 nm 범위에서 동시에 최대 3개 파장), 전도도 프로브 C9 및 pH 프로브 V9-pH(pH 0-14)를 포함한다. 시스템은 UNICORN 소프트웨어 버전 6.4로 제어된다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 실시예에서 사용된 조작 유닛에서, 온라인 센서들은 크로마토그래피 칼럼 이후에 통합된다. 추가적인 온라인 센서를 구비한 크로마토그래피 시스템의 흐름도가 도 2에 나타나 있다. 이 도면의 설정에서, 감쇠 전반사(ATR)에 근거한 중적외선 분광계 MATRIX-FM(Bruker, USA)이 선택되어 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 스펙트럼을 기록하였다. 형광 검출을 위해, 레이저-유도 제논 램프 EQ-99XFC LDLS(Energetiq, USA), 광섬유 멀티플렉서(multiplexer)(Avantes, Netherlands), 플로우 셀(flow cell)(FIAlab Instruments, USA) 및 600 L/mm 그레이팅(grating)을 갖는 분광계 AvaSpec-ULS-TEC(Avantes, Netherlands)를 포함하는 설정이 조립되었다. 이 형광 장치는 7개 파장의 여기 광(Pos. 1-reference, Pos. 2 - 265 nm ± 10 nm, Pos. 3 - 280 nm ± 10 nm, Pos. 4 - 300 nm ± 40 nm, Pos. 5 - 340 nm ± 10 nm, Pos. 6 - 289 nm ± 10 nm, Pos. 7 - 300 nm ± 10 nm, Pos. 8 - 400 nm ± 10 nm) 및 전체 발광 스펙트럼(236 - 795　nm)의 측정을 가능하게 하였다. 부가적으로, 다각도 광 산란(MALS) 검출기 miniDAWN TREOS(Wyatt, USA)뿐만 아니라, 시차 굴절률 검출기 Optilab T-rEX(Wyatt), -0.0047 ~ +0.0047 RIU 범위의 시차 RI가 적용되었다. 모든 검출기는 직렬로 연결되었고, 피크 지연뿐만 아니라 밴드 증대(broadening) 효과도 고려하였다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 조작 유닛을 포함하는, 생물학적으로 생산된 제제의 정제 및/또는 농축 공정 또는 그 일부를 모니터링 및 제어하는 컴퓨터 기반 방법이 제공되며, 상기 방법은:
a) 상기 조작 유닛에 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 적용하는 단계;
b) 공정 데이터를 실시간으로 모니터링하는 단계;
c) 및/또는 원위치 측정 또는 분석으로부터 데이터를 얻는 단계;
d) 상기 센서의 각 출력에 대응하는 복수의 공정 데이터 값을 얻는 단계;
e) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해 상기 공정 데이터 값에 대해 모델 기반 다변량 통계 분석을 수행하는 단계;
f) 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계;
g) 선택적으로 공정 제어 및/또는 공정 최적화를 수행하는 단계; 및
h) 선택적으로 제조과정, 중간 및/또는 최종 제제로서 생물학적 제제의 파라미터 기반 또는 실시간 출하 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 조작 유닛은 정제 유닛이고 크로마토그래피 유닛 및/또는 여과 유닛을 포함한다.
본 발명의 실시형태는 임의 형태의 정제 또는 농축 방법, 바람직하게는 크로마토그래피 및 여과 방법에 여기서 기술되는 방법의 적용을 포함하고, 여기서 조작 유닛은 크로마토그래피 또는 여과 유닛이다.
적합한 크로마토그래피 방법은 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 액체 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피; 초임계 유체 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피; 역상 크로마토그래피; 2-차원 크로마토그래피; 고속 단백질(FPLC) 크로마토그래피; 향류 크로마토그래피; 카이랄(chiral) 크로마토그래피; 수성 순상(ANP) 크로마토그래피; 혼합 모드 크로마토그래피; 유사(pseudo)-친화성 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 멀티-모드 수지 크로마토그래피를 포함한다.
크로마토그래피 유닛은 결합-용리 또는 통과 모드에서 등용매, 선형, 분절화 및/또는 단계 구배 용리로 작동할 수 있다.
여과 방법에서, 조작 유닛은 여과 유닛이고 한외여과, 정밀여과, 나노여과, 심층여과로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여과 유닛은 접선 유동 여과, 전량 여과, 또는 절대 기공 크기 막을 통한 여과로서 작동할 수 있다.
공정 데이터를 모니터링하고 및/또는 복수의 공정 데이터 값을 실시간으로 얻기 위해, 복수의 온라인 센서가 조작 유닛에 설치된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 이상의 온라인 센서가 조작 유닛에 설치된다. 센서는 공정 흐름에 직접 배치될 수 있거나, 상술한 바와 같이 비-침습적 원위치 센서일 수 있다.
센서는 물리적 양을 획득하고 이를 처리에 적합한 (예를 들어, 광학적, 전기적, 기계적, 열적) 신호로 변환한다. 상술한 바와 같이, 센서는 전기 센서, 전기-기계 센서, 전자 센서, 트랜스듀서(transducers), 저항식 센서, 정전용량식 센서, 전자기 센서, 스위치, 광학 센서, 자기 센서, 및/또는 인덕티브(inductive) 센서, 온도 센서일 수 있다. 적합한 센싱 방법은 형광, UV-흡광, 적외선, 전기 또는 전기화학 임피던스, pH, 전도도, 정적 동적 광 산란, 동적 광 산란 굴절률, 온도의 측정을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 센서는 다각도 광 산란(MALS)과 같은 광 산란 센서, UV-VIS-흡광 센서, 형광 여기 및 발광 센서, 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 분광(ATR-FTIR)과 같은 적외선 흡광 센서, 굴절률 센서(RI)와 같은 광 굴절 센서(광학 센서 및/또는 형광 센서), 및 소각 X선 산란 센서(SAXS), 전도도 센서, 온도 센서 및/또는 pH 센서로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 센서는 도 1 및 3에서 볼 수 있는 바와 같이 직렬로 연결된다. 대안적인 실시형태에서, 센서는 조작 유닛에 통합되고 공정 흐름 내에서 측정하는 비-침습적 원위치 센서이다.
본 발명의 일 실시형태에서, UV-VIS 흡광, 전도도 데이터, pH 값, 압력 데이터, 형광 여기 및 발광, 적외선 흡광(ATR-FTIR), 광 굴절(RI), 및 정적 광 산란(MALS)은 공정 흐름으로부터 동시에 획득된다.
또한, 온도, SAXS, ATR-FTIR, pH, 전도도 및 산화-환원(레독스)은 크로마토그래피와 같은 정제 단계 및/또는 다른 정제 단계 중에 원위치에서 측정될 수 있다. 온도 변화는 미미할 수 있는데, 1/10도의 범위에 있다.
특정 알고리즘에 의해, 제제의 양, 순도 및/또는 역가가 이하에서 설명되는 바와 같이 센세로부터 얻어진 데이터 값에 대해 추정된다. 본 방법은 빨라서, 다운스트림 공정에서의 공정 제어 및 생물의약품 제조에서의 치료제의 실시간 또는 파라미터 기반 출하에 적합하다.
데이터의 다변량 통계 분석
본 발명의 방법에 사용되는 다변량 통계 분석을 위해, 주어진 생물학제 제제에 대해 각 개별 실시에서 온라인 센서로부터 얻어진 온라인 데이터는 컴퓨터 데이터베이스로 불러오기 되고, 상술한 바와 같은 예측 모델로 평가되며, 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 실시간 모니터링을 허용하도록 진단된다.
복수의 공정 데이터는 온라인 센서로부터 얻어지고 데이터베이스에 저장된다. 데이터는 통계적으로 및 수학적으로 평가된다. 생물학적으로 생산된 화합물에 대한 데이터 집합이 선택되고, 추출되며, 통계적 계산 환경으로 불러오기 되고, 여기서 이들은 예측 모델을 위한 상술한 바와 같은 다변량 분석을 이용하여 평가된다.
본 발명의 장치
또한, 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축용 조작 유닛을 포함하는 장치가 제공되는데, 조작 유닛은 크로마토그래피 및/또는 여과 유닛을 포함하고, 크로마토그래피 또는 여과 유닛은 적어도 하나의 비-침습적 원위치 센서를 포함하며, 센서는 컴퓨터에 연결되고, 수집된 데이터 값이 데이터베이스에 저장 및/또는 진단될 수 있다.
목표 장치의 개략도가 도 3에 나타나 있다. 개략도는 정제 유닛의 표준 검출기인 압력 센서, UV-VIS 센서, 전도도 센서 및 pH 센서뿐만 아니라, 인라인 측정을 위한 ATR-FTIR 센서, 형광 센서, MALS 센서 및 RI 센서, 그리고 비-침습적 원위치 측정을 위해 설치되는 온도 센서, 레독스 센서, ATR-FTIR 센서 및 소각 X선 산란 센서(SAXS)로 구성되는 온라인 모니터링 장치를 나타낸다. 파선 화살표는 통계 모델을 기반으로 한 공정의 가능한 실시간 제어를 나타낸다.
본 발명의 장치에서, 비-침습적 원위치 센서는 온도 센서, SAXS, pH 센서, 전도도 센서, ATR-FTIR 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 도 4의 더욱 상세한 도면으로부터 알 수 있듯이, 하나 또는 수개의 원위치 온라인 센서는 크로마토그래피 또는 여과 유닛에 통합될 수 있다. 이 개략도에서, 크로마토그래피 칼럼은 비-침습적 원위치 센서: 즉 2개의 온도 센서, SAXS 센서, ATR-FTIR 센서 및 레독스 센서를 예시적으로 구비한다. A)는 외부 도면이고, B)는 내부 도면이다.
또한, 도 3으로부터 알 수 있듯이, 본 장치는 다각도 광 산란 센서(MALS), UV-VIS 흡광 센서, 형광 센서, 적외선 흡광 센서(IR), 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 분광 센서(ATR-FTIR), 광 굴절률(RI) 센서, pH 센서, 온도 센서, 전도도 센서, 압력 센서, 소각 X선 산란(SAXS) 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 온라인 센서를 추가로 포함할 수 있다. 온라인 센서는 도시된 바와 같이 직렬로 연결될 수 있다.
바람직한 장치에서, 장치의 크로마토그래피 또는 여과 유닛은 SAXS, ATR-FTIR, 온도 및 레독스용 비-침습적 원위치 센서뿐만 아니라 형광, RI, MALLS 및 UV-VIS용 추가적인 온라인 센서를 포함한다.
장치의 크로마토그래피 또는 여과 유닛은 실험실 또는 산업적 규모일 수 있다. 실험실 규모 장치에 사용되는 칼럼은 1 ml 내지 100 ml의 규모를 가질 수 있다. 파일럿 및 산업적 규모 장치는 약 100 ml부터 약 2000 리터까지의 규모를 가질 수 있다.
본 발명의 방법 및 장치의 적용
본 발명은 다운스트림 공정의 상당한 경제적인 개선을 제공한다. 예를 들어, 발효 제제의 끝부터 생물의약품과 같은 최종 정제된 생물학적 제제까지 생물공정 시스템의 모든 단계에서 다른 배치(batch)의 비교를 허용한다.
따라서 본 발명의 다른 실시형태는 여기서 기술되는 방법에 관한 것이고, 데이터에서의 편차 패턴의 관측은 정제 단계의 오작동을 나타낸다. 이러한 편차 패턴의 검출 시에, 공정 파라미터는 그에 맞춰 조절될 수 있거나, 공정이 중단된다. 이러한 편차는 제제 응집 또는 목표 단백질의 무-용리, 단백질 절단, 단백질의 복잡성 및 숙주 세포 불순물, 목표 단백질의 침전, 숙주 세포 단백질의 침전 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 여기서 기술되는 방법에 관한 것이고, 모델 예측 및 목표 값 또는 범위 사이의 특정 차이의 검출 시에, 정제 단계의 조절은 상기 측정 및 평가의 결과에 근거하여 실행된다. 예를 들어, 단백질이 크로마토그래피 칼럼에서 용리될 때, 제제의 수집은 순도, 역가 및/또는 농도의 목표 값 또는 범위에 도달할 때에만 시작된다. 목표 값이 충족되지 않을 경우 수집은 중단된다. 결과에 근거하여, 추가 다운스트림 유닛 조작이 채택될 수 있다. 예를 들어, 투석여과 단계에서, 많은 부피가 더 많은 숙주 세포 단백질(HCP) 또는 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 제거하는데 사용될 수 있거나, 목표 농도에 도달하지 않으면 농축 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 여기서 기술되는 방법에 관한 것이고, 정제 공정 또는 그 일부는 리폴링, 여과 또는 침전 이후 생물학적 제제의 피크 수집, 정확한 수집, 제제 품질, 경제, 환경적 측면, 에너지 소비 및 공정 설비 보전 중 어느 하나 또는 조합과 관련하여 최적화된다. 따라서 생물학적 제제에 대해, 순도, 양 및 역가와 관련하여 용리된 피크의 조성은 알려진다. 다음 시험에서, 공정 파라미터가 변경되고 공정은 목표 값이 얻어질 때까지 반복된다.
본 발명은 실시간으로 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 모니터링 및 제어를 제공한다. 예를 들어, 최종 정제 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 결정을 허용한다. 얻어진 데이터 및 출하 기준에 근거하여, 제제는 최종 약물 제형의 제조용 약물로서 추가로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 여기서 기술되는 방법에 관한 것이고, 생물학적 제제는 핵산 분자, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 안티센스(antisense) 핵산, 플라스미드 DNA, mRNA, 마이크로RNA, dsRNA, siRNA; 바람직하게는 치료 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 탄수화물-단백질 결합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신-유사 단백질 또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인, 또는 상기 생물학적 제제의 대사물질로부터 선택되는 이종 단백질이다. 대안적으로, 생물학적으로 생산된 제제는 탄수화물, 지질, 유기 소분자, 비-유기 소분자, 바이러스, 리포솜, 항체 및 이러한 화합물의 하이브리드 또는 변형체이다.
본 발명의 다른 실시형태는 특정 생물학적 제제용 제어 또는 출하 알고리즘을 구축하기 위한, 여기서 기술되는 방법의 용도에 관한 것이다. 얻어진 데이터는 생물학적 제제를 출하할 때를 결정하기 위해 다변량 통계 분석의 대상이 된다.
본 발명은 오리지네이터(originator), 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 화합물의 제조용 생물공정을 잘 이해하는데 도움을 준다. 특히, 최종 정제 제제의 단계에서, 생물학적 제제에 대한 추가적인 정보가 실시간으로 얻어질 수 있다.
생물학적 제제의 모델 기반 제어/출하 알고리즘에 근거하여, 오리지네이터 및 바이오시밀러 또는 바이오베터 치료제 사이의 비교를 위한 방법이 또한 제공된다.
다른 측면에서, 크로마토그래피 및 막 여과 방법론과 같은 중요한 공정 단계를 위해, 본 발명은 재료 성능 및 표면 특성을 예측하는데 도움을 준다. 예를 들어, 불완전한 재생 또는 저장에 의한 재료의 노화는 모니터링될 수 있고 그 파괴가 예측될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 공정 재료의 수명 예측에 관한 것이다.
본 발명은 중요 공정 파라미터에 대한 빠른 접근을 제공하는데 도움을 줄 것이다. 실험 데이터 및 통계 모델의 조합에 의해, 공정 파라미터는 변하고, 농도, 순도 및/또는 역가는 온라인 모니터링에 의해 간접적으로 얻어진다. 바람직한 실시형태에서, 모니터링은 적어도 부분적으로 원위치에서 수행된다. 그래서 관련 조작 범위는 아주 빠르게 개발될 수 있고 아주 상세하게 탐색될 수 있다. 원칙적으로, 적어도 하나의 단계가 범위를 벗어날 경우, 유닛 조작의 순서를 바꾸고 유닛 조작의 직렬연결의 효과를 알아보는 것이 가능하다. 단일 유닛 조작이 범위를 벗어날 경우, 전체 순서가 여전히 허용 가능한 제제를 만들 수 있는 것이 이론적으로 및 실제로 가능하다. 이러한 경우에서, 조작 공간 및 공정의 유연성이 확대된다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 제제 품질 관련 중요 공정 파라미터 및 스트레스 파라미터에 대한 빠른 접근에 관한 것이다, 얻어진 데이터의 분석 시에, 조작자는 오작동을 바로잡기 위해 공정에 개입할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 제제 농도, 순도 및/또는 역가를 실시간으로 제어하는 모델 및 소프트웨어 패키지가 제공된다.
여기서 기술되는 방법은 리폴딩, 여과 또는 침전 이후에 피크 분획의 더욱 정확한 수집, 재료의 정확한 수집에 의해 다운스트림 공정의 수율을 개선하는데 도움을 준다. 이렇게 철저히 제어된 다운스트림 공정은 완충액 소비를 감소시키고 이에 따라 상품 비용을 감소시킨다.
하나의 다른 경제적 개선은 배치(batch) 실패의 감소에 의해 달성된다. 배치 실패는 매우 이른 단계에서 인식될 수 있고, 나타날 경우 공정은 종료됨으로써, 공정의 불필요한 지출을 방지하고 실패된 배치를 분석할 수 있다. 일반적으로, 온라인 모니터링 전략을 이용하여, 공정은 더욱 탄탄해진다.
경제적 개선의 현저한 부분은 공정 제어 및 엔드(end) 제어에서 지출의 근본적인 감소로부터 비롯될 것이다.
경제적 이익은 원위치 모니터링 및 제어를 통한 가속화에 의해 획득되는데, 그 이유는 공급 흐름이 특징화되고 전략이 일반적으로 조정될 수 있기 때문이다.
여기서 기술되는 방법은 또한 발효 공정의 끝부터 최종 정제된 생물학적 제제의 출하까지 생물공정 시스템의 모든 단계에서 다른 배치의 조성을 허용한다.
기존 공정 및 제제와도, 개발된 방법론은 모든 단계에서 공급 흐름, 중간물질 및 제제의 직접 비교를 허용한다. 이 개념은 무균 시험과 같이 출하 후에 수행되는 다른 오프라인 방법론과 관련하여 실시간 출하 또는 파라미터 기반 출하의 기반이 된다. 배치 대 배치 변산도(batch to batch variability)는 쉽게 관측되고 개선된 문서화 및 검증에 추가된다.
본 방법은 공정 편차가 생물학적 제제의 품질에 영향을 주지 않았고 검증 노력 및 공정 파라미터 개발을 용이하게 함을 문서화하는데 도움을 준다.
다음 항목은 본 발명 개시의 특정 측면을 추가로 제공하고, 특정 실시형태는 여기서 제공되는 교시를 실행한다.
1. 적어도 하나의 정제 유닛을 포함하는 생물학적 제제의 정제 공정 또는 그 일부를 모니터링 및/또는 제어하는 컴퓨터 기반 방법으로서,
a) 상기 정제 유닛에 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 적용하는 단계;
b) 공정 데이터를 실시간으로 모니터링하는 단계;
c) 상기 센서의 각 출력에 대응하는 복수의 공정 데이터 값을 얻는 단계;
d) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해 상기 공정 데이터 값에 대해 모델 기반 다변량 통계 분석 및 수학적 모델을 수행하는 단계;
e) 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계;
f) 선택적으로 공정 제어 및/또는 공정 최적화를 수행하는 단계; 및
g) 선택적으로 생물학적 제제의 파라미터 기반 또는 실시간 출하 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 따른 방법에 있어서, 정제 유닛은 크로마토그래피 유닛 및/또는 여과 유닛을 포함하는 방법.
3. 제2항에 따른 방법에 있어서, 크로마토그래피 유닛은 결합/용리 또는 통과 모드에서 등용매, 선형, 분절화 및/또는 단계 구배 용리로 작동하는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멀티-모드 수지 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택되고, 여과 유닛은 접선 유동 여과, 전량 여과, 절대 기공 크기 막을 통한 여과로 작동하는 한외여과, 정밀여과, 나노여과, 심층여과로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 온라인 센서는 광 산란 센서, UV-흡광 센서, 형광 여기 및 발광 센서, 적외선 흡광 센서, 광 굴절 센서, (광학 센서 및/또는 형광 센서), 및/또는 pH, UV-VIS, 전도도 센서의 군에서 선택되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 센서는 직렬로 연결되는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 변화는 정제 공정 중에 원위치에서 측정되는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 공정 데이터 값은 데이터베이스에 저장되는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제에 대한 데이터 집합은 선택되고, 추출되며, 통계적 또는 기술적 계산 환경으로 불러오기 되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수행된 다변량 통계 분석은 기계 학습 기법을 기반으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 기계 학습 기법은 부분 최소 제곱 회귀, 주성분 회귀, 랜덤 포레스트, 신경망, 구조화 가법 회귀, 다변량 적응형 회귀 스플라인, 리지 회귀, 라소, 엘라스틱 네트, 최소 각도 회귀, 서포트 벡터 머신 또는 다른 것으로부터 선택되는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 온라인 파라미터는 오프라인 파라미터와 관련하여 평가되는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 편차 패턴의 관측은 정제 단계의 오작동을 나타내는 방법.
13. 제12항에 있어서, 모델 예측 및 목표 값 또는 범위 사이의 특정 차이의 검출 시에, 정제 단계의 조절은 상기 측정 및 평가의 결과에 근거하여 실행되는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공정은 리폴링, 여과 또는 침전 이후 생물학적 제제의 피크 수집, 정확한 수집, 제제 품질, 경제, 환경적 측면, 에너지 소비 및 공정 설비 보전 중 어느 하나 또는 조합과 관련하여 최적화되는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가는 실시간으로 모니터링 및 제어되는 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 공정은 연속식, 반-연속식 공정 또는 배치식 공정인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 온라인 센서에 대해 교정 단계가 필요 없는 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 제제는 핵산 분자, 바람직하게는 치료 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 탄수화물-단백질 결합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신-유사 단백질 또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인, 또는 상기 생물학적 제제의 대사물질로부터 선택되는 이종 단백질인 방법.
19. 생물학적 제제용 모델 기반 제어/출하 알고리즘을 구축하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
20. 생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가를 실시간으로 모니터링하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
21. 목표 생물학적 제제의 제조방법으로서, 상기 목표 제제를 생산할 수 있는 유기체를 배양하는 단계; 이에 따라 얻어진 상기 목표 제제를 정제하되, 상기 목표 제제의 정제는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 모니터링하는 단계; 및 선택적으로, 얻어진 목표 제제를 추가로 처리, 멸균, 마무리, 제제화 등을 하여 사용 또는 상용화를 준비하는 제제를 얻는 단계를 포함하는 방법.
실시예에서 실시간으로 모니터링되는 정제 공정용 온라인 센서의 일반적인 설정/사양
실시간으로 모니터링되는 다운스트림 공정의 조작 순서는 도 1에서 볼 수 있다.
목표 단백질은 발효 공정 또는 이전의 다운스트림 유닛 조작으로부터 얻어진다. 발현 숙주에 따라, 목표 단백질을 함유하는 공정 용액은 전처리된다(예를 들어, 크로마토그래피 단계 이전에 0.2 ㎛ 전량 여과, 로딩 단계를 위해 공급액의 pH 값 또는 전도도 등 조절, 봉입체의 가용화).
크로마토그래피 실시는 표준 센서를 구비한 Akta Pure 25 시스템(GE Healthcare, Sweden)에서 수행된다. 추가적인 온라인 센서를 구비한 크로마토그래피 시스템의 흐름도가 도 2에 나타나 있다.
이것은 다파장 UV 검출기 U9-M(UV-VIS, 280 nm, 260 nm, 214 nm - 190~700 nm 범위에서 동시에 최대 3개 파장), 전도도 프로브 C9 및 pH 프로브 V9-pH(pH 0-14)를 포함한다. 시스템은 UNICORN 소프트웨어 버전 6.4로 제어된다. 감쇠 전반사(ATR)에 근거한 중적외선 분광계 MATRIX-FM(Bruker, USA)이 선택되어 푸리에 변환 적외선 분광(FTIR) 스펙트럼을 기록한다. 형광 검출을 위해, 레이저-유도 제논 램프 EQ-99XFC LDLS(Energetiq, USA), 광섬유 멀티플렉서(Avantes, Netherlands), 플로우 셀(FIAlab Instruments, USA) 및 600 L/mm 그레이팅을 갖는 분광계 AvaSpec-ULS-TEC(Avantes, Netherlands)를 포함하는 설정이 조립된다. 이 형광 장치는 7개 파장의 여기 광(Pos. 1-reference, Pos. 2 - 265 nm ± 10 nm, Pos. 3 - 280 nm ± 10 nm, Pos. 4 - 300 nm ± 40 nm, Pos. 5 - 340 nm ± 10 nm, Pos. 6 - 289 nm ± 10 nm, Pos. 7 - 300 nm ± 10 nm, Pos. 8 - 400 nm ± 10 nm) 및 전체 발광 스펙트럼(236 - 795　nm)의 측정을 가능하게 한다. 부가적으로, 다각도 광 산란(MALS) 검출기 miniDAWN TREOS(Wyatt, USA)뿐만 아니라, 시차 굴절률 검출기 Optilab T-rEX(Wyatt), -0.0047 ~ +0.0047 RIU 범위의 시차 RI가 적용된다. 모든 검출기는 직렬로 연결되고, 피크 지연뿐만 아니라 밴드 증대 효과도 고려한다.
크로마토그래피 공정을 실시하기 전에, Akta 시스템 및 센서는 준비될 필요가 있다. Akta 펌프는 세척되고 시스템의 모든 라인은 각 완충액으로 준비된다. RI 검출기의 기준 셀은 러닝(running) 완충액으로 충전되고, ATR-FTIR 배경 스펙트럼이 측정되며, MALS 플로우 셀은 통합 COMET 시스템으로 세척되고 레이저 유도 형광 광원은 적어도 15분 동안 데워진다. 준비 작업이 완료될 경우, 크로마토그래피 실시뿐만 아니라 다양한 신호의 기록이 EVON 제어 소프트웨어(evon GmbH)를 통해 시작된다. 3500 to 750 cm-1의 FTIR 스펙트럼은 4 cm-1의 분해능으로 기록된다. 측정 당 16번의 FTIR 스캔이 수행된다. 형광 스펙트럼은 여기 파장 당 1초의 적분(integration) 시간에서 236 - 795　nm의 범위에 걸쳐 검출된다. 광 산란 신호는 43.6°, 90° 및 136.4°의 각도에서 3개의 통합 검출기로부터 얻어진다.
크로마토그래피 공정의 포집 단계는 다음의 단계: 즉, 칼럼 평형화, 목표 단백질을 함유하는 상등액의 로딩, 약하게 결합한 불순물을 처리하기 위한 칼럼 세척, 이후 용리 단계를 포함한다. 목표 단백질이 용리될 경우, 다음 실시를 준비하기 위해 칼럼은 세척되고 재평형된다.
훈련 목적을 위해, 특정 수의 분획이 용리 중에 수집되고, 이후 분석된다. 농도, 순도 및 역가는 다양한 다른 분석 방법으로 측정된다(예를 들어, 양: 역상 HPLC, 친화성 HPLC, ELISA, 역가: 표면 플라스몬 공명 시험, 세포 배양 기반 시험, 순도: 크기 배제 크로마토그래피, LAL 내독소 시험, 숙주 세포 단백질 ELISA, Picogreen 시험을 통한 dsDNA 정량화). 이들 데이터는 얻어진 온라인 신호와 관련하여 평가된다. 통계 평가 및 기계 학습 기법이 상술한 바와 같은 예측 모델 구축을 위해 적용된다.
실시예에서 모델 구축 및 컨트롤로서 사용되는 양, 순도 및 역가를 측정하기 위한 오프라인 방법
양
FGF -2 농도 측정
역상 HPLC용 TSK-GEL Superoctyl 칼럼을 이용한 이 방법론은 인간 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자 2(FGF2)의 정량화를 허용한다. 이것은 RP-HPLC 칼럼의 고상 및 단백질 사이의 소수성 상호작용을 기반으로 한다. FGF2는 특정 아세토니트릴(ACN) 농도에서 용리된다. 이중 파장 흡광도가 214 및 280 nm에서의 검출을 위해 사용된다.
이 방법은 전체 FGF2 농도를 측정하도록 개발되었다. 0.16 ㎍의 정량 한계 및 0.05 ㎍의 검출 한계를 갖는 1.25 ㎍(0.06 mg/mL) 내지 30 ㎍(1.50 mg/mL)의 측정 범위가 통계적으로 결정되었다.
mAb 농도 측정
리간드로서 단백질 A를 갖는 모놀리식(monolithic) 칼럼을 이용한 이 방법은 항체의 빠른 정량화를 허용한다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 강하게 결합하고 따라서 전체 항체(단클론 및 다클론 항체 모두) 또는 항체의 Fc 부분을 함유하는 다른 거대분자의 정량화에 사용될 수 있다. 분석은 결합-및-용리 모드로 수행되고, 용리는 염산 용액으로 pH 값을 낮춤으로써 수행된다. 흡광도는 280 nm의 파장에서 검출된다.
이 방법은 전체 mAb 농도를 측정하도록 개발되었다. 0.06 - 0.85 mg/ml의 측정 범위가 통계적으로 확인되고 성공적으로 검증되었다.
순도
분석적 크기 배제 크로마토그래피 - 단량체 함량 및 고분자량과 저분자량 불순물의 측정
크기 배제 크로마토그래피는 크기에 따른 분자의 분리를 가능하게 한다. 이 기법은 활성 단량체성 목표 단백질 및 용액에 존재할 수 있는 고분자량 또는 저분자량의 불순물 사이를 구별하는데 사용될 수 있다.
SEC 분석은 등용매 모드로 수행되고, 분자와 상호작용하지 않는 고정상을 통해 단백질 혼합물을 이동시킨다. 큰 분자는 고정상의 기공에 들어갈 수 없고, 반면에 작은 분자는 들어갈 수 있어서 칼럼을 통과하는데 시간이 더 필요하다. 결과적으로 분자는 그 크기에 따라 분리되고 UV 흡광도(각각 280 nm 및 214 nm)로 검출된다.
FGF-2 단량체 함량은 ACQUITY UPLC BEH125 SEC 1.7 ㎛, 4.6×150 mm(Waters) 칼럼을 이용하여 측정된다. 이 방법은 0.3 ml/min(15 min 실시)의 유속으로 pH 7.4에서 100 mM 인산나트륨, 500 mM NaCl을 포함하는 완충액으로 실시된다. 주입 부피는 10 ㎕로 설정된다.
mAb 단량체 농도는 TSKgel G3000 SWxl 크기 배제 칼럼(Tosoh Bioscience)을 이용하여 측정된다. 이 방법은 0.4 ml/min(실시 당 40 min)의 유속에서 러닝 완충액으로서 pH 6.5의 150 mM 인산 칼륨을 이용한다. 주입 부피는 20 ㎕로 설정된다.
PicoGreen 시험을 통한 dsDNA의 측정
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA 시약은 용액에서 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 정량하기 위한 초민감성(ultra-sensitive) 형광 핵산 염색제(stain)이다. PicoGreen 시험의 선형 검출 범위는 단일 염료 농도로 1 ng/mL 내지 1000 ng/mL DNA이다.
이 방법은 형성된 결합체의 PicoGreen® 염료에 의한 염색 및 형광 정량화를 기반으로 한다. 표준물질뿐만 아니라 샘플 용액은 96-웰 플레이트(well plate)에서 희석되고 이후 2분 동안 착색 시약으로 배양된다. 이후, 신호 강도는 480 nm의 여기 및 520 nm의 발광 필터를 이용하여 플레이트 리더(plate reader)로 기록된다.
ELISA를 통한 숙주 세포 단백질의 측정
대장균 HCP ELISA 키트
이 키트는 재조합 발현에 의해 제조된 제제에서 대장균 숙주 세포 단백질 오염의 존재를 측정하기 위해, 광범위 반응성 다클론 항체를 이용하여 개발되었다. Cygnus 시험 검증은 이 키트의 LOD가 ~0.2 ng/mL임을 측정하였다.
사용된 항체 및 표준물질:
*포집 항체: 항-대장균 HCP -, 항-대장균 HCP, 친화성 정제(Cygnus AP117)
*검출 항체: 항-대장균: HRP 결합체 농축물; 1 mg/mL(Cygnus F411C)
*표준물질: 대장균 HCP 항원 농축물(Cygnus F413H)
CHO HCP ELISA 키트
CHO ELISA는 CHO에서 발현된 다양한 항체 및 다른 치료 단백질에 대해 10억 당 100부의 범위에서 HCP를 검출할 수 있다.
사용된 항체 및 표준물질:
*포집 항체: 항-CHO HCP, 친화성 정제(Cygnus 3G-0016-AF)
*검출 항체: 항-CHO HCP HRP 결합체 농축액(Cygnus F551C)
*표준물질: CHO HCP 표준물질(20 ㎍/ml)(Cygnus F553H)
NUNC MaxiSorp 플레이트는 "항-HCP(친화성 정제) 항체"로 코팅된다. 첫 번째 특정 반응 단계 중에, 다른 HCP는 고정화된 "항-HCP 항체"에 결합한다. 두 번째 반응 단계 중에, 이차 항체 "항-HCP HRP 결합체 농축물"은 흡착된 것에 결합한다.
과산화수소(H2O2)의 존재하에, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)는 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)에 의해 산화되어 청색으로 변한다. 30분 후에, 반응은 3 M 황산을 이용한 효소의 변성에 의해 중단된다. 색상은 이후 황색으로 변하고 450 nm에서 측정될 수 있다. 염색의 강도는 결합한 HCP의 양과 상관관계를 가질 수 있다.
역가
세포 배양 시험을 통한 FGF -2 항원 결합의 측정
FGF -2의 생물활성 시험용 증식 시험
FGF-2 역가는 NIH-3T3 세포에서 FGF-2 유도 증식의 원리를 이용한 시험에 의해 측정될 것이다. 이 섬유아세포 세포주는 FGF-2와 조합되어 증식 증가를 나타낸다. 세포는 모든 추천 성분을 갖는 배지(DMEM 배지, 10% 송아지(calf) 혈청, 2 mM Na-피루베이트)에 접종된다. 24시간 후에, 송아지 혈청 농도는 10%에서 0.5%로 감소한다. 이후, 세포는 정제된 FGF-2의 농도(10-100 ng/mL)를 증가시켜 처리된다. 상용 FGF-2는 양성 대조군으로 사용되고 항-HER-2 mAb는 음성 대조군으로 사용된다. 교정을 위해 상용 FGF-2(Sinobiological)이 사용된다.
96-웰 플레이트에 NIH -3T3 접종 및 송아지 혈청 감소
NIH-3T3 세포는 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 최대 습도에서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 10% 송아지 혈청, 2 mM Na-피루베이트를 함유하는 배지를 포함하는 25 T-플라스크에서 배양된다. 세포가 일단 ~95% 컨플런시(confluency)에 도달할 경우, 이들은 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 탈착되고 혈구 계수기(hemocytometer)에서 트리판 블루(trypan blue)에 의해 계수된다. 이후, 이들 세포는 5×105 세포/mL의 농도로 재현탁되고 8-채널 피펫으로 96-웰 플레이트(즉, 200 ㎕/웰로서, 웰 당 1.0×105 세포)에 첨가된다.
24시간 후에, 0.5% 송아지 혈청만으로 보충된 200 ㎕의 DMEM이 96 웰 플레이트에 혈청 농도를 감소시키도록 첨가된다. 혈청은 몇몇 성장 인자를 함유한다. 0% 송아지 혈청의 농도는 세포의 응집을 초래할 것이다.
다른 FGF -2 농도로 세포 처리
접종 후 36시간 후에, 20 ㎕ 또는 80 ㎕의 배지가 교환된다. 이후, 배양된 세포는 선택된 샘플(웰 당 20 ㎕ 샘플)로 처리된다. 샘플의 예비 희석은 DMEM 배지로 수행된다.
세포 생존 및 증식의 평가를 위한 MTT 시험
MTT 시험은 샘플 첨가 24시간 후에 수행된다 - 24시간 배양은 사전 실험에서 가장 좋은 결과를 나타낸다. 이 목적을 위해, MTT 용액이 PBS에서 1 mg/mL로 제조되고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과된다. 이후, 20 ㎕의 MTT가 웰에 첨가된다. 세포는 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 최대 습도에서 1시간 동안 배양된다. 배양 후에, MTT 함유 배지가 제거되고 100 ㎕의 DMSO로 대체된다. 플레이트는 실온에서 30분 동안 추가로 배양되고, 웰의 광학 밀도(OD)는 570 nm의 시험 파장 및 690 nm의 기준 파장에서 플레이트 리더를 이용하여 측정된다.
세포 배양 시험을 통한 mAb 항원 결합의 측정
rhTNF -α를 이용한 WEHI -164 세포독성 시험
항-TNF-α scFv 및 mAb 역가는 WEHI-164 세포에서 TNF-α 유도 세포 자멸(apoptosis)의 원리를 이용한 시험에 의해 측정될 것이다. WEHI-164 세포에서 세포 자멸을 유도하는 TNF-α의 IC50 값은 측정되어야 한다. 이후, 세포는 정제된 항-TNF-α mAb의 농도를 증가시켜 TNF-α의 IC50 농도로 처리될 것이다. 상용 항-TNF-α 단클론 항체는 양성 대조군으로 사용되고 비특이적 scFv는 음성 대조군으로 사용될 것이다. IC50 측정을 위해, 상용 TNF-α(Sinobiological)가 사용된다.
96-웰 플레이트에 WEHI164 접종 및 악티노마이신 ( Actinomycine ) D 처리
WEHI164 세포는 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 최대 습도에서 RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), 10% FBS를 함유하는 배지를 포함하는 25 T-플라스크에서 배양되었다. 세포가 일단 ~95% 컨플런시에 도달할 경우, 이들은 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 탈착되었고 혈구 계수기에서 트리판 블루에 의해 계수되었다. 이후, 이들 세포는 7.5×105 세포/mL의 농도로 재현탁되었고 8-채널 피펫으로 96-웰 플레이트(즉, 150 ㎕/웰로서, 웰 당 1.0×106 세포)에 첨가되었다.
24시간 후에, 400 ng/mL 악티노마이신 D로 보충된 50 ㎕의 RPMI가 96 웰 플레이트에 100 ng/mL 악티노마이신 D의 최종 농도에 도달하도록 첨가되었다. TNF-α에 대한 WEHI164의 감도를 증가시키는 악티노마이신 D의 최적 농도는 사전 시험에서 측정되었다 - 데이터 미제시.
IC50을 결정하는 다른 TNF-α 농도로 세포 처리
접종 후 36시간 후에, 배지가 제거되었고 100 ng/mL 악티노마이신 D로 보충된 180 ㎕의 새로운 배지로 대체되었다. 이후, 배양된 세포는 선택된 샘플(웰 당 20 ㎕ 샘플)로 처리되었다. 샘플의 예비 희석은 RPMI 배지로 수행된다.
세포 생존율 평가용 MTT 시험
MTT 시험은 샘플 첨가 24시간 후에 수행되었다 - 24시간 배양은 사전 실험에서 가장 좋은 결과를 나타냈다. 이 목적을 위해, MTT 용액이 PBS에서 1 mg/mL로 제조되었고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과되었다. 이후, 20 ㎕의 MTT가 웰에 첨가되었다. 세포는 37℃, 5% CO2, 95% 공기 및 최대 습도에서 1시간 동안 배양되었다. 배양 후에, MTT 함유 배지가 제거되었고 100 ㎕의 DMSO로 대체되었다. 플레이트는 실온에서 30분 동안 추가로 배양되었고, 웰의 광학 밀도(OD)는 570 nm의 시험 파장 및 690 nm의 기준 파장에서 플레이트 리더를 이용하여 측정되었다.
표면 플라스몬 공명 분광법을 통한 항원 결합의 측정
표면 플라스몬 공명(SPR) 분광법은 리간드 결합 상호작용을 측정하는데 사용되는 방법이다. 이것은 센서 표면에 고정화된 상호작용 파트너와 다른 분자의 결합 친화성 및 동역학을 연구하는 라벨-프리(label-free) 기법이다. 이것은 센서 표면에서 굴절률의 작은 변화를 검출하는 광학 측정 방법을 기반으로 한다.
기술된 방법을 이용하여 단백질의 생물활성은 다음과 같이 측정될 수 있다.
*FcyRIIIa (CD16) - 항체
*TNF-알파 - 항TNFα 항체
*FGFR2 - FGF-2
표면 플라스몬 공명은 편광이 얇은 (금) 금속층으로 피복된 프리즘과 부딪칠 때 일어난다. 특정 파장 및 입사각에서, 바이오칩의 표면에 있는 자유 전자는 광자를 흡수하고 이를 표면 플라스몬 파로 변환시킨다[1]. 바이오칩의 금 표면에 있는 고정화된 리간드 및 피분석물 사이의 상호작용은 공명 조건의 변경을 유도하여 반사율 변화로서 나타나고 측정될 수 있다.
표면 및 그 위로 흐르는 용액 사이의 계면에서 굴절률이 변함에 따라, 반사된 편광의 각도가 변경된다. 센서 표면으로부터 분자의 결합 또는 분리에 의해 유발된 각도 변화는 결합 재료의 질량에 비례하고 센서그램(sensorgram)에 기록된다.
가장 널리 적용 가능한 CM5 칩이 고정화 화학으로서 아민 커플링과 조합된 센서 표면으로 선택된다. 아민 커플링은 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 N-에틸-N'-(디메틸-아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 형성함으로써 수행된다. 이러한 에스테르는 리간드 분자에서 아민기와 공유결합을 형성한다[2].
pH 7.4의 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween 20이 모든 시험에서 러닝 완충액으로 사용된다. 각 시험의 특정 방법 파라미터가 표 1에 나타난다. 표 1은 SPR 결합 시험의 방법 파라미터를 나타낸다.
방법 파라미터 FcRyIIIa TNFα FGFR2 / CD332
고정화 완충액: 10 mM Na-아세테이트, pH 5.5 10 mM Na-아세테이트, pH 5.0 10 mM Na-아세테이트, pH 5.5
수용체 농도: 10 ㎍/mL 10 ㎍/mL 20 ㎍/mL
유속: 5 ㎕/min 5 ㎕/min 5 ㎕/min
고정화 타깃: 약 100 RU 약 100 RU 약 300 RU
동역학 유속: 20 ㎕/min
주입 부피: 12 ㎕(= 6분 접촉시간)
분리 시간: 600 s 600 s 500 s
샘플: 10 / 25 / 50 / 75 / 100 nM 1/2/5 /10/20 nM
재생: H20에서 0.05% SDS
30 ㎕/min의 유속에서 30 ㎕(1분 접촉시간)		 1M MgCl2x6H2O
20 ㎕/min의 유속에서 40 ㎕(2분 접촉시간)
실시예
이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕고자 기재되지만, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 실시예는 통상적인 방법의 상세한 설명을 포함하지 않는다; 이러한 방법은 이 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 오프라인 방법에 관한 일반적인 설정 및 정보는 상기에서 요약되었다. 실시간으로 모니터링되는 다운스트림 공정용 도구 및 원리의 개략도가 도 1에 나타나 있다.
실시예 1 - 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제의 모니터링
CHO-S 세포(Invitrogen)가 2개의 플라스미드의 조합으로 감염되었는데, 하나는 트라스투주맙(Trastuzumab)의 중쇄 유전자 및 네오마이신(neomycin) 내성 유전자를 보유하였고, 다른 하나는 트라스투주맙의 경쇄 유전자 및 감소된 활성을 갖는 DHFR 유전자를 보유하였다. 세포는 전기천공(electroporation)에 의해 감염되었고, 네오마이신 내성을 위해 선택되었으며, 최고 생산성을 위해 분류되었다. 얻어진 풀(pool)은 MTX 선택(400 nM)의 대상이 되었다. 세포는 다시 생산성을 위해 분류되었고, 이후 3개월 동안 배양으로 유지되었으며, 안정한 생산자를 선택하도록 2번 재분류되었다. 최종 분류 중에, 세포는 1 세포/웰에서 분류함으로써 서브클론(subclone) 되었다. 최종 클론은 ~20　pg/세포/일의 특정 생산성을 가졌다.
배지 및 피드
표준 배지는 8　mM 글루타민 및 400　nM MTX를 갖는 CD-CHO(Invitrogen)이었다. 배치 배양은 2×105 세포/ml를 접종함으로써 수행되었고, 140 rpm, 37℃ 및 7% CO2의 진탕 플라스크에서 배양되었다. 생존율이 70% 미만으로 떨어질 때, 통상적으로 10일째에 배양이 종료되었다. 유가(Fed-batch) 배양은 동일한 조건의 진탕 플라스크에서 피드 시에 10%의 배치 부피로 CHO CD Efficient Feed B, 그리고 3.3%의 부피로 Function Max Titer Enhancer를 이용하여 수행되었다.
크로마토그래피 공정
16 mm 내경을 갖는 XK 칼럼(GE Healthcare)은 21.9 ml의 전체 부피로 단백질 A 친화성 배지 mAb Select SuRe(GE Healthcare)로 충전되었다. 전체 공정은 75 cm/h의 유속에서 수행되었다. 칼럼은 pH 7.4의 20 mM Na-포스페이트, 150 mM NaCl을 함유하는 러닝 완충액을 이용하여 5 칼럼 부피(CV)로 평형화되었다. 세포 배양 상등액은 멸균 0.22 ㎛ 필터 유닛(Nalgene)을 통해 여과되었고, 샘플 펌프 S9(GE Healthcare)를 통해 칼럼에 10 CV로 로딩되었다. 로딩 이후에, 5 CV에 대해 pH 7.4의 20　mM Na-포스페이트, 2 M NaCl을 이용한 세척 단계 및 5 CV에 대해 pH 7.4의 20 mM Na-포스페이트, 150 mM NaCl을 이용한 다른 세척 단계를 수행하였다. 목표 단백질의 용리는 평형 완충액에서 pH 3.5의 100% 글리신-HCl을 이용하여 10 CV로 단계 구배를 이용하여 수행되었다. 용리된 분획은 pH 8.0의 0.5 M Na-포스페이트를 포함하는 중화 완충액을 보유하는 컨테이너에서 수집되었다(10%의 분획 부피). 칼럼은 낮은 유속에서 30분에 걸쳐 0.1 M NaOH로 위생처리(sanitized) 되었다.
온라인 센서(MALS, RI, ATR-FTIR, 형광 분광)가 데이터 수집을 위해 준비되었다 - 상기 "실시간으로 모니터링되는 정제 공정용 온라인 센서의 일반적인 설정/사양"을 참고해라.
mAb의 포집 단계의 크로마토그램이 도 6에 나타나 있다.
실시예 2 - 재조합 대장균으로부터의 염기성 섬유아세포 성장 인자( FGF - 2)의 정제의 모니터링
재조합 대장균의 원핵 세포 배양으로부터 얻은 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)의 크로마토그래피 정제를 위한 포집 단계는 일련의 온라인 센서에 의해 기술되고 모니터링된다.
FGF-2의 높은 등전점(isoelectric point)(pI 9.4)은 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 다수의 숙주 세포 유래 불순물의 효과적인 제거 가능성을 제공한다.
재료로서 Carboxy Methyl(CM) Sepharose Fast Flow(약한 양이온 교환 수지)가 용해성 세포 분획으로부터의 FGF-2의 포집 단계에서 흡착제로 사용되었다. 이 원-스텝(one-step) 이온 교환 크로마토그래피 절차의 용리액 분획은 오프라인 방법으로 분석되었다. 오프라인 데이터는 순도, 양 및 역가를 예측하도록 온라인 신호와 관련하여 평가된다.
BL21(DE3)_pET30a(cer)_FGF2_155(ser78,96)의 저밀도 세포(LCD) 발효. 배치는 30 ml 0.9% NaCl에서 1 ml의 마스터 세포 뱅크(master cell bank)로 접종되었다. 배치 배양은 5.63 g/l의 세포 건조 질량(CDM)에 도달할 때까지 37℃에서 수행되었다. 유가 배양은 34　g/l의 이론적 CDM에 도달하도록 4세대 동안 μ = 0.1 h-1의 지수 공급 속도(exponential feed rate)로 30℃에서 수행되었다. 단백질 생산은 2세대 이후 펄스 유도(pulse induction) 당 0.9 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토-피라노시드(IPTG)로 유도되었다. 이 발효 조건을 이용하여, FGF-2가 봉입체로서가 아니라 용해성 단백질으로서만 생산된다. 세포는 유도 14시간 후에 원심분리(15분, 4000 g)로 수집되었다. 세포는 40 g/l 건조 세포 질량의 최종 농도로 균질화 완충액(50 mM TRIS-HCl, 100 mM NaCl, 0.02% (v/v) TWEEN 20, pH 8.0)에 재현탁되었다. 세포 현탁액을 고압 균질화기에 2번 통과시킴으로써 세포가 붕괴되었다. 세포 잔해는 불용성 단백질은 10,000 g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리로 제거되었다. 원심분리 단계 이후 상등액이 여전히 탁함에 따라, 전량 여과(0.22 ㎛)가 수행되었다. 용해성 FGF-2를 함유하는 정화된 상등액은 -70℃에서 보관되었다.
온라인 센서(MALS, RI, ATR-FTIR, 형광 분광)가 데이터 수집을 위해 준비되었다 - 상기 "실시간으로 모니터링되는 정제 공정용 온라인 센서의 일반적인 설정/사양"을 참고해라.
해동 후에, 세포 용해물(lysate)의 상등액 분획이 크로마토그래피 칼럼에 적용되었다. CM Sepharose® Fast Flow 수지(공급사: GE Healthcare)로 충전된 실험용 칼럼(Tricorn, 내경 1 cm, 충전 칼럼 부피 12.3 ml)이 다음 방법에 이용되었다(표 2). 도 7은 정제 실시의 전형적인 크로마토그램을 나타낸다.
표 2는 CM Sepharose® Fast Flow 수지의 적용에 의한 FGF-2 정제용 크로마토그래피 방법을 나타낸다.
평형화 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 5 CV
로딩 0.22 ㎛ 여과된 상등액 10 CV
세척 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 5 CV
용리 용리 완충액 B:
100 mM 인산나트륨, 1M NaCl, pH 7.0
0-100 % B 구배
100 % B 단계
5 CV
5CV
재평형화 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 5 CV
유속: 150 cm/h
흡착제는 5 CV를 이용하여 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 실온에서 평형화되었다. 유속은 150 cm/h(1.93　ml/min)이었다. 주입은 샘플 펌프를 통해 수행되었다. 10 CV의 정화된 상등액(123 ml)이 칼럼으로 로딩되었다. 단백질 용액을 로딩한 후에, UV280 신호의 안정한 베이스라인에 도달할 때까지, 칼럼은 5 CV의 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 세척되었다. FGF-2는 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 0 - 1 M NaCl의 선형 구배(5 CV)를 이용하여 용리되었다. 용리액은 1 ml 부분 표본(aliquot)으로 수집되었고, 오프라인 분석이 수행되어 순도(dsDNA 함량 - Picogreen, 숙주 세포 단백질 함량 - 대장균 HCP ELISA Cygnus), 역가(Biacore 시험, 세포 배양 생물활성 시험) 및 양(RP-HPLC)을 측정하였다. 칼럼은 100 mM 인산나트륨 완충액에서 5 CV의 1 M NaCl로 처리되어 결합 불순물을 제거하였다. CIP는 10 CV의 0.5 M NaOH 용액으로 수행되었다. 칼럼은 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 재평형화되었다. 칼럼의 장시간 저장은 20% 에탄올 및 4℃에서 수행되었다.
실시예 3 - 염기성 섬유아세포 성장 인자- 투석여과의 한외투석여과 ( UFDF ) 및 TFF-한외여과를 이용한 농축의 모니터링
한외여과는 단백질을 농축하는 다른 공정 단계 이전에, 예를 들어 크로마토그래피 단계 이전에, 또는 제제화에 필요한 농도에 이르는 정제 후에 사용된다. 다른 적용은 완충액 교환 또는 불순의 제거이다. 접선 유동 여과는 막에 대한 접선 흐름에 의해 막을 통한 높은 플럭스(flux)를 얻어서, 필터 케이크(cake)를 연속적으로 제거하고 막의 막힘을 방지한다. 원하는 농도에 도달할 때까지, 용액은 막 모듈을 통해 재순환되지만, 막 파울링으로 인한 막 성능의 저하 또는 응집으로 인한 목표 단백질의 생물활성 손실 때문에 공정 단계를 설계할 때 주의해야 한다. 따라서, 온라인 센서 세트(다각도 광 산란, 굴절률, 형광 및 ATR-FTIR 장치)는 TFF 유닛 조작의 막(잔류물 흐름) 이후에 설치된다.
실험실 규모의 접선 유동 여과 유닛(Labscale TFF System Millipore)은 크로마토그래피 포집 단계 이후에 FGF-2 용리액의 투석여과 및 농축에 사용된다. 실험실 규모의 TFF는 펌프 및 압력 센서를 구비한다. 농축 용량 및 플럭스 대 시간의 측면에서 막의 성능이 측정된다. 농축 중에 FGF-2의 응집 레벨 및 투석여과 중에 완충액의 교환에 대한 영향은 일련의 온라인 센서로 모니터링된다. 농축 및 투석여과는 10 kDa 컷오프(cutoff) 막을 이용하여 수행됨으로써, 완충액이 통과하는 동안에, FGF-2가 막에 보유되는 것을 보장할 것이다.
CM-Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 포집 단계 이후에, 정제된 FGF-2 용리액 분획은 모아지고 5 부피의 50 mM Tris, 150 mM NaCl 완충액(pH 7.4)에 대해 투석여과된다. 10 kDa 컷오프보다 작은 불순물은 제거된다. 마지막으로, 한외여과 단계가 수행되어 잔류물을 10배 농축한다.
10 kDa의 컷오프(GE Healthcare)를 구비한 막 카세트(cassette) Kvick start가 시스템에 연결된다. 시스템이 시작되고 트랜스멤브레인(transmembrane) 압력이 막에 인가되는데, 상기 압력은 TFF 막의 사양(10 psi)을 초과하지 않아야 한다. 물을 이용한 한외여과가 수행되고 투과물의 양이 매분마다 기록되어 정규화된(normalized) 물 투과성을 측정한다. 시스템은 투석여과 완충액(50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4)으로 충전되고 완충액의 재순환이 수행된다. 목표 단백질은 저장소에 충전되고 진공이 인가된다. 투석여과가 수행되어 완충액을 5배 교환한다. 진공으로 인해, 투과물이 시스템을 떠나는 만큼, 동일한 양의 완충액이 시스템에 도입된다.
투석여과는 온라인 센서(굴절률)로 모니터링된다. 남아있는 제제는 한외여과 매니폴드를 통해 농축된다. 농축은 열거된 온라인 센서(다각도 광 산란, 형광 및 ATR-FTIR 장치)를 통해 모니터링되고, 목표 농도에 도달하거나 응집 형성이 검출될 경우에 농축 공정이 중단된다. 막은 물 및 0.5 M NaOH로 세척된다. 장시간 저장은 20% 에탄올로 수행된다.
TFF 유닛의 개략도가 도 8에 나타나 있다.
실시예 4 - 데이터 처리
온라인 센서 시스템 및 오프라인 측정으로부터 발생하는 모든 이용 가능한 데이터는 EVON 데이터베이스에 저장된다. 주어진 단백질 및 염색제에 대해 선택된 데이터 집합이 쉼표 구분 값(comma separated value) 파일로 추출되고 통계 계산 환경 R(R Core Team, 2015)로 불러오기 되며, 여기서 모든 데이터 처리가 수행된다. 초기 단계로서, 신호 평활화(signal smoothing)는 가중 반복 중앙값 필터(weighted repeated median filter)[18]를 이용하여 온라인 신호에 대해 수행되고, 스펙트럼 데이터의 배경 보정이 수행된다. 마지막으로, 온라인 데이터는 오프라인 시간 축에 대해 시간 정렬된다.
단백질 농도, 순도 및 역가의 예측을 위해, 수개의 기계 학습 기법, 예를 들어 부분 최소 제곱 회귀(PLS [19]), 주성분 회귀(PCR, 예를 들어 [14]), 랜덤 포레스트(RF [11]), 신경망(NN, 예를 들어 [17]) 및 구조화 가법 회귀(STAR, 예를 들어 [13])가 적용되고, 이 모두는 잠재적으로 다수의 예측변수를 처리할 수 있으며, RF, NN 및 STAR는 비-선형 공정에 특히 적합하다.
랜덤 포레스트는 큰 데이터베이스에서 효율적으로 작동되고, 이전의 변수 선택 없이 수천 개의 입력 변수를 처리할 수 있으며, 어느 변수가 회귀 문제에서 중요한지 추정할 수 있다. 포레스트 구축이 진행됨에 따라, RF는 일반화 오차의 내부 불편 추정치(unbiased estimate)를 발생시킨다. 이것은 결측(missing) 데이터를 추정하는 효과적인 방법이고, 비교 가능하게 큰 비율의 데이터가 결측이더라도 정확도를 유지하며, 변수 상호작용을 검출하는 실험 방법을 제공한다.
구조화 가법 회귀 모델은 예를 들어 비-파라미터적 평활 효과 또는 예측변수 사이의 상호작용의 포함을 허용하는 선형 모델의 강력한 확장자로서 볼 수 있다. 변수 선택 도구로서의 부스팅은 손실-함수를 최소화하고 모델 구조의 가법성(additivity)을 보존함으로써 단계적 공정에서 최종 모델을 구축하며, 예측변수 선택 빈도를 통한 변수 중요도 척도(importance measure)를 제공한다. 일반적으로, 변수 선택 단계는 매우 중요한데, 그 이유는 응답(단백질 농도, 순도 및 역가)의 실시간 예측을 위해 입력의 관련 부분집합을 제공할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 응답의 예측을 위한 추가적인 정보를 제공하지 않는 변수는 최종 모델에 포함되지 않아야 하고 이에 따라 변수 선택 중에 제거되어야 한다.
업스트림 공정의 분야에서 최근 연구[15, 16]로부터, 변수 선택 도구로서 RF 및 모델링 기법으로서 NN뿐만 아니라 부스팅과 조합된 STAR 모델[12]은 매우 좋은 예측 정확도를 나타내는 것으로 알려졌다. 모든 기술된 알고리즘은 다운스트림 공정에서 단백질 농도, 순도 및 역가의 실시간 모니터링에 가장 적합한 기계 학습 기법을 찾도록 시험된다. 모델 검증은 추후 실험에서 예측 오차의 추정을 허용하는 독립적인 시험 집합을 기반으로 하여 수행된다.
모델 기반 제어/출하 알고리즘의 구축을 위해, 공정에 관한 추가 정보가 사용되고, 기계론적 모델이 체류 시간 및 크로마토그램의 일반적인 형상과 같은 사전 정보를 고려하여 생성된다.
로딩 및 재생 모델을 위해, 모델은 단백질 또는 염의 용량, 파과 곡선용 평형 모델, 예를 들어 평형 분산 모델(기계론적이지 않음), 기공 확산 모델, 또는 조합된 필름 및 기공 확산 모델을 고려한다. 용리를 위해, 동일한 모델이 적용될 수 있지만, 이동상 변경장치(modifier)를 이용한 조건 변화의 입력이 필요하다.
실시예 5 - 실시간으로 모니터링되는 FGF -2 정제
재조합 대장균의 원핵 세포 배양으로부터의 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)의 크로마토그래피 정제가 기술되고 온라인 센서(정적 광 산란, 시차 굴절률, UV280nm 흡광도, ATR-FTIR 및 형광 분광)로 모니터링된다. 분획 수집은 실시간으로 모니터링된 데이터를 기반으로 하여 수행된다. 따라서, 온라인 신호는 다변량 통계 분석으로 평가된다. 독립적인 훈련 데이터 집합으로 구축되지 않은 통계 모델은 온라인 신호에 적용되고 순도, 역가 및 농도를 예측하는데 사용된다. 시스템은 EVON 소프트웨어로 제어된다.
이전에 결정된 공정 기준(순도 > 80%, 역가 100% 및 최고 가능한 수율)에 근거하여, 이 원-스텝 이온 교환 크로마토그래피 절차의 분획은 온라인 센서의 예측된 공정 값에 따라 수집된다. 순도는 다음의 정의를 의미한다: 100% 순도는 샘플에서 1 ppm(1 ng/mg FGF-2)의 dsDNA 미만 및 1 ppm 대장균 HCP 미만의 함량으로서 정의된다. 따라서, 이 실시예에서, 80% 순도의 기준은 dsDNA 및 숙주 세포 단백질(HCP)의 불순물 함량이 20 ppm 미만인 것을 의미한다. 100%의 역가는 목표 단백질의 생물활성으로서 정의된다. 생물활성 단백질은 바로 확인되고 응집되지 않아야 한다. 역가는 표면 플라스몬 공명 방법(Biacore) 및 세포 배양 기반 증식 시험을 통해 측정된다.
이전의 온라인 센서(MALS, RI, ATR-FTIR, 형광 분광)가 데이터 수집을 위해 준비된다 - 상기 "실시간으로 모니터링되는 정제 공정용 온라인 센서의 일반적인 설정/사양"을 참고해라.
해동 후에, 용해성 FGF-2를 함유하는 상등액이 0.22 ㎛ 여과된다. 상등액 분획은 크로마토그래피 칼럼에 적용된다. CM Sepharose® Fast Flow 수지(공급사: GE Healthcare)로 충전된 실험용 칼럼(Tricorn, 내경 1 cm, 부피 12.3 ml)은 표 2에 기술된 방법에 이용된다.
흡착제는 5 CV를 이용하여 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 실온에서 평형화된다. 유속은 150 cm/h(1.93　ml/min)이다. 주입은 샘플 펌프를 통해 수행된다. 10 CV의 정화된 상등액(123 ml)이 칼럼으로 로딩된다. 단백질 용액을 로딩한 후에, UV280 신호의 안정한 베이스라인에 도달할 때까지, 칼럼은 5 CV의 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 세척된다. FGF-2는 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 0 - 1 M NaCl의 선형 구배(5 CV)를 이용하여 용리된다.
공정 기준이 충족될 경우, 알고리즘은 분획 수집을 시작한다. 방향족 아미노산을 갖는 모든 단백질이 검출됨에 따라, 흡광도 스펙트럼(UV280nm)이 비특이적이다. 정적 광 산란 신호는 용리 피크의 초기에 숄더(shoulder)를 나타낸다. 이 추가적인 신호 피크는 UV280nm 신호에서 검출되지 않는다(도 9). SLS 크로마토그램에서 115 ml에서의 피크는 목표 단백질 FGF-2의 응집체 및 이량체 때문이다(도 9). 이 단백질 입자는 큰 크기를 갖는다. 큰 크기의 입자는 광의 강한 산란을 초래하고 따라서 이들의 물리화학적 특성의 정보를 준다. 목표 단백질의 역가는 Biacore 방법을 통해 측정된다. 이 오프라인 데이터는 생물활성의 예측용 모델을 훈련하는데 사용된다. 단백질 구조 및 폴딩은 생물활성의 주요 이슈이다. FGF-2의 이량체는 생물활성적이지 않고 역가가 SLS 데이터로부터의 알고리즘을 통해 측정되지 않는다. 모델은 FGF-2의 비-생물활성 이량체가 칼럼으로부터 용리되는 것을 인식한다(도 10). 형광 패턴에서의 변화는 목표 단백질의 형태의 측정을 가능하게 한다. 형태가 생물활성에서 주요한 역할을 함에 따라, 이러한 형광 데이터는 오프라인 데이터와 관련하여 평가된다. 이량체 분획은 추가 공정을 위해 수집되지 않는다. ATR-FTIR 신호는 숙주 세포 단백질 함량 및 이에 따라 용리액의 순도를 모니터링하는데 적용된다(도 10). 단백질은 지문 영역(1500 - 500 cm- 1)으로 불리는 아미드 영역에서 독특한 AFT-FTIR 스펙트럼을 갖는다. ATR-FTIR 패턴의 변화는 숙주 세포 단백질 및 목표 단백질 사이를 구별 가능하게 한다. 용리 피크의 시작과 끝은 주요한 숙주 세포 불순물을 함유한다. 초기에는 약한 결합 불순물이 제거되고, 용리 말미에는 강한 결합 불순물이 염 구배에 의해 제거된다. 적어도 80%의 순도가 추가 공정용 수집 기준으로 정해진다. 목표 단백질 FGF-2의 목표 단백질 함량은 UV280nm 및 ATR-FTIR 신호를 통해 정량화된다. 양은 2개의 직교 방법에서 측정되고, 반면에 ATR-FTIR이 보다 특이적이다. UV280nm는 방향족 아미노산을 정량화하고, 따라서 숙주 세포 단백질도 함께 정량화된다.
다른 방법 블록은 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, ATR-FTIR 스펙트럼에서 명확하게 구별될 수 있다. 로딩 중에, 상승한 신호는 아미드 II 밴드로 알려진 1500 - 1600 cm-1의 범위에서 볼 수 있다. 이것은 상등액에 함유되는 숙주 세포 단백질의 많은 양에 의해 유발된다. 세척 블록은 > 3000 cm-1 영역에서 매우 두드러진 밴드로 나타난다. 그러나 또한 용리 블록은 목표 단백질 FGF-2에 해당하는 뚜렷한 프로파일을 나타낸다. 용리되는 단백질은 1528 cm-1에서 피크를 유발한다. 용리 상에 의해 유발된 ATR-FTIR 신호의 줌은 도 12에서 볼 수 있다. 1500 및 1600 cm-1 사이의 범위에서 다시, 구배는 ATR-FTIR 스펙트럼에서 또한 볼 수 있다. 스펙트럼의 이 부분만이 모델링에 귀중한 정보를 포함하는 것이 아니다. 피크는 오프라인 양 데이터와 관련하여 평가되어 농도 및 숙주 세포 단백질 함량을 결정한다.
도 13은 크로마토그래피 실시 과정에 걸쳐 아미드 밴드의 두 파수(1528 cm-1 및 1622 cm- 1)를 나타내는데, 여기서 다시 다른 방법 블록이 구별될 수 있다. 평형화 완충액은 1622 cm-1에서만 확연하고, 반면에 용리 피크는 두 라인에서 비슷하게 보인다.
굴절률 검출기의 신호는 도 14에 나타나 있다. 다시 개별 방법 블록이 명확하게 구별될 수 있다. 용리 피크에서, 용리되는 목표 단백질의 RI 신호에 대한 추가적인 기여가 검출될 수 있다. 단백질의 고유 형광은 방향족 아미노산(트립토판 및 티로신)에 의해 주로 유발된다. 최고 발광은 295　nm의 여기 파장에서 350 nm 부근에서 일어난다. 형광 패턴의 변화 및 형상에 근거하여, 용리 단백질의 생물활성이 결정될 수 있다.
실시예 6 - Heparin Sepharose Fast Flow 칼럼에서 FGF -2의 로딩 단계의 파 과를 측정하는 실시간 모니터링
재조합 대장균의 원핵 세포 배양으로부터의 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)의 크로마토그래피 정제가 기술되고 온라인 센서(정적 광 산란, 시차 굴절률, UV280nm 흡광도, ATR-FTIR 및 형광 분광)로 모니터링된다. 칼럼으로의 로딩 단계는 실시간으로 모니터링된 데이터를 기반으로 하여 수행된다. 온라인 신호는 다변량 통계 분석에 의해 평가된다. 독립적인 훈련 데이터 집합으로 구축되지 않은 통계 모델은 온라인 신호에 적용되고 목표 단백질의 파과를 예측하는데 사용된다. 시스템은 EVON 소프트웨어로 제어된다.
공정 중단 기준이 정해진다: 통과액에서 FGF-2 농도: C/C0 < 10% - 도 16 참조. C0은 상등액 피드에서 FGF-2의 농도이고, C는 통과액에서 FGF-2의 농도이다. 온라인 센서는 통과액에서 목표 단백질의 증가를 측정하는데 적용된다. 칼럼의 용량에 도달할 경우, 로딩 공정은 EVON 소프트웨어를 통해 중단된다. 공정 기준이 충족될 경우, 알고리즘은 로딩을 중단시킨다. 방향족 아미노산을 포함하는 모든 단백질이 검출됨에 따라, 흡광도 스펙트럼(UV280nm)은 비특이적이다. UV, ATR-FTIR, MALS, RI 및 형광 장치의 조합은 HCP 및 목표 단백질 사이의 구별을 가능하게 한다. 특히, ATR-FTIR은 숙주 세포 단백질 및 목표 단백질 FGF-2 사이의 구별을 허용한다. 신호 패턴 및 시프트는 통과액의 조성이 변할 경우 정보를 제공한다. 목표 단백질이 통과액에서 특정 농도에 도달할 경우, 세척 단계가 제어 소프트웨어를 통해 시작되고 정제 공정은 계속된다. 이 수단에 의한 수지의 로딩 조건 제어는 결합 용량의 이용을 경제적인 방식으로 가능하게 한다.
온라인 센서(MALS, RI, ATR-FTIR, 형광 분광)가 데이터 수집을 위해 준비된다. 해동 후에, 용해성 FGF-2를 함유하는 상등액이 0.22 ㎛ 여과된다. 상등액 분획은 크로마토그래피 칼럼에 적용된다. Heparin Sepharose® Fast Flow 수지(공급사: GE Healthcare)로 충전된 실험용 칼럼(Tricorn, 내경 1 cm, 부피 12.0 ml)이 사용된다.
흡착제는 5 CV를 이용하여 20 mM Tris-HCl 완충액, 400　mM NaCl(pH 7.4)로 실온에서 평형화된다. 유속은 150 cm/h(1.93　ml/min)이다. 주입은 샘플 펌프를 통해 수행된다. 파과 기준이 충족되지 않는 한, 정화된 상등액이 칼럼으로 로딩된다. 단백질 용액을 로딩한 후에, UV280nm 신호의 안정한 베이스라인에 도달할 때까지, 칼럼은 5 CV의 20 mM Tris-HCl 완충액, 400　mM NaCl(pH 7.4)로 세척된다. FGF-2는 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 0.4 - 2 M NaCl의 선형 구배(5 CV)를 이용하여 용리된다.
실시예 7- 하나의 실시에서 데이터 처리, 통계 모델링 및 검증
모델링에 이용 가능한 온라인 데이터는 UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS 및 RI 장치(전체 p = 14개 변수를 가짐), ATR-FTIR 스펙트럼(분해능 대략 2 cm-1, p = 1427개 예측변수 생성)뿐만 아니라, 전체 14366개 형광 변수를 생성하는 7개 여기 파장에서의 형광 발광 스펙트럼(분해능 약 0.3 nm)으로부터의 신호를 포함한다. 예측변수 집합 및 응답 변수(농도와 동일함을 의미하는 양, 숙주 세포 단백질(HCP), 이중-가닥 DNA(dsDNA), 단량체 및 고분자량(HMW) 불순물 농도 또는 수용체 생물학적 제제 상호작용의 KD 값으로 표현되는 역가)에 따라, 7 내지 14개의 크로마토그래피 실시로부터의 데이터가 모델 구축을 위해 이용 가능하다.
적외선 및 형광 스펙트럼은 Savitzky-Golay 필터를 이용하여 평활화되고, 전자는 또한 R 패키지 신호 및 베이스라인으로 구현되는 바와 같이 2차 도함수 제약 가중(2nd derivative constrained weighted) 회귀를 이용하여 보정된 베이스라인이다.
마지막으로, 시간 정렬 단계가 수행된다 - 수개의 장치 사이의 알려진 시간 지연을 고려하여 각 오프라인 분획의 시간 프레임에 대응하는 각 온라인 변수에 대해 평균이 계산된다.
이 섹션에서 나타난 결과는 변수 선택 기법으로서 부스팅(R package mboost)과 조합하여 STAR(구조화 가법 회귀) 모델에 의해 얻어진다. 파라미터 최적화 및 모델 선택은 교차 검증(각 실시로부터의 데이터는 일단 배제되고 수개의 다른 실시의 데이터에 근거한 모델로 예측된다)을 통해 자동 스케일 조정된 데이터(즉, 각 예측변수로부터 평균을 빼고 그 표준 편차로 나눈다)로 수행된다. 모델 품질은 교차-검증된 평균 제곱근 오차(RMSE)로 측정된다.
예시적인 모델링 결과 및 후속 목표 변수용 대응 오프라인 값과의 비교가 다음과 같이 나타난다.
1. 단백질 양(농도)(mg/ml)(도 17)
2. 숙주 세포 단백질 농도(ng/ml) 및 추정된 단백질 양(ppm)과의 대비(도 18 및 19)
3. 이중-가닥 DNA(dsDNA) 농도(ng/ml) 및 추정된 단백질 양(ppm)과의 대비(도 20 및 21)
4. 단량체 및 고분자량 불순물(%)(도 22 및 23)
5. 수용체 FGF2 상호작용의 KD 값으로 표현된 FGF2 역가(도 24)
해당 결과는 도 17(양), 도 18-19(숙주 세포 단백질, 각각 ng/ml 및 ppm), 도 20-21(dsDNA, ng/ml 및 ppm), 도 22-23(단량체 및 고분자량 불순물 분획) 및 도 24(역가 KD 값)에 나타난다. 이들 도면에서, 타깃에 대해 실제로 측정된 오프라인 값은 막대로 나타나고, 1초의 시간 간격에서 온라인 데이터에 근거한 모델 예측치는 곡선으로 나타나며, 각 오프라인 분획에 대해 평균화된 예측치는 수평선으로 나타난다.
결과는 단일 크로마토그래피 실시에 대해 주어지는데, 그 예측 오차는 전체 예측 오차(모든 실시에 대해 평균화됨)와 유사하다. 수평축은 시간(분)을 나타내는데, 그 기준점은 첫 번째 오프라인 분획의 시작에 위치한다.
a) 단백질 양 : RMSE = 0.44 mg/ml의 전체 예측 오차(모든 실시에 대해 평균화됨) - 그 예로서 3회 실시로부터의 결과는 RMSE = 0.25 mg/ml의 성능을 나타낸다(도 17); 모델은 UV-VIS, 압력, 전도도, pH, MALS 및 RI 장치의 예측변수를 기반으로 하고 14회 실시의 데이터를 사용하며, 0.23 내지 0.86 mg/ml의 정확도로 예측된다; STAR 모델은 절편(intercept), 선형 및 비-파라미터적 평활 베이스러너(baselearner)를 이용한다.
b) 숙주 세포 단백질( HCP ): RMSE = 46.4 ng/ml의 평균 예측 오차(그 예로서 주어진 3회 실시는 약 43 ng/ml의 오차를 나타낸다, 도 18). 모델은 UV-VIS, 압력, 전도도, MALS, RI 및 형광 신호(후자는 280 및 400 nm의 여기 파장에서)를 기반으로 한다. 절편, 선형 및 평활 예측변수 함수들 이외에, UV-VIS, 압력, 전도도, pH, MALS 및 RI 예측변수들 사이의 제제 상호작용이 사용된다. 교차-검증 내에서, 실시는 24.0 내지 63.2 ng/ml의 오차로 예측된다.
HCP 및 양 예측 모델 양쪽은 도 19에 나타낸 바와 같이, mg 단백질 당 ng의 단위(ppm)로 숙주 세포 단백질을 예측하는데 또한 사용될 수 있다.
c) 이중-가닥 DNA( dsDNA ): 이 타깃의 결과는 도 20(단위 ng/ml) 및 도 21(단위 ppm, 즉 추정된 단백질 양과의 대비)에 나타난다. 실시는 77.2 ng/ml의 평균 오차로 예측된다. 단일 실시는 약 41 내지 99 ng/ml의 교차-검증된 예측 오차를 나타낸다. 여기서 고려된 모델은 pH, MALS, RI 및 형광 장치로부터의 예측변수를 사용한다. 이전 모델과 유사하게, 절편, 선형, 평활 베이스러너 및 이들의 제제 상호작용은 pH, MALS 및 RI 변수에 대해 사용되고, 반면에 형광 예측변수의 평활 함수만이 모델에 입력된다.
d) 단백질 단량체 및 고분자량 불순물( HMW ): 도 22 및 23은 3회 실시에 대해 단량체 및 고분자량 불순물 분획(양쪽 모두 하나의 분획으로서, 즉 이들의 값은 1까지 가산된다)을 모델링한 결과를 나타낸다. 모델은 UV-VIS, pH, 전도도, MALS, RI 및 형광 장치의 정보를 이용하고, RMSE = 0.056(다양한 실시에 대해 0.025 내지 0.08 범위의 값을 가짐)의 평균 성능을 나타낸다. dsDNA 모델과 동일한 함수 형태의 베이스러너는 이 경우에서 사용된다.
e) 역가 (KD 값): 역가 응답의 평균 예측 오차(그 KD 값을 통해 측정됨)는 RMSE = 0.97이다(도 24에서 나타낸 3회 실시에 대해 측정된 예측 성능은 RMSE = 1.38이다). 수개의 장치(UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS, RI, 형광 및 ATR-FTIR)로부터의 예측변수가 사용된다. 수개의 예측변수의 선형 함수 이외에, UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS, RI 및 형광 신호의 평활 함수뿐만 아니라, UV-VIS, 전도도, 압력, pH, MALS 및 RI 신호 사이의 제제 상호작용이 예측 모델에 도입된다.
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Claims (18)

  1. 적어도 하나의 조작 유닛의 이용을 포함하는 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축 공정을 모니터링 및 제어하는 컴퓨터 기반 방법으로서,
    a) 조작 유닛에서 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 포함하는 단계;
    b) 상기 센서의 각 출력에 대응하는 복수의 공정 데이터 값을 얻는 단계;
    c) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해 온라인 및 오프라인 데이터로부터 얻어진 다변량 통계 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 데이터베이스로 데이터 값을 불러오는 단계;
    d) 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계;
    e) 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가를 실시간으로 모니터링하는 단계;
    f) 선택적으로 단계 e)에서 얻어진 정보에 근거하여, 공정 제어 및/또는 공정 최적화를 수행하는 단계; 및
    g) 선택적으로 단계 e)에서 얻어진 정보에 근거한, 생물학적 제제의 파라미터 기반 또는 실시간 출하 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    온라인 센서 중 적어도 하나는 다-각도 광 산란 센서(MALS), UV-VIS 흡광 센서, 형광 센서, 적외선 흡광 센서(IR), 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 분광 센서(ATR-FTIR), 굴절률(RI) 센서, pH 센서, 온도 센서, 전도도 센서, 압력 센서, 소각 X선 산란(SAXS) 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    온라인 센서 중 적어도 하나는 ATR-FTIR, MALS, RI 및 형광 센서로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    온라인 센서 중 적어도 하나는 비-침습적 원위치 센서인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    비-침습적 원위치 센서는 ATR-FTIR, SAXS, 온도, pH, 전도도 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작 유닛은 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상의 독립적인 온라인 센서를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작 유닛은 적어도 하나의 ATR-FTIR 센서, 하나의 MALS 센서, 하나의 RI 센서 및 하나의 형광 센서를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    조작 유닛은 부가적으로 적어도 하나의 온도 센서, 적어도 하나의 전도도 센서, 적어도 하나의 pH 센서 및 적어도 하나의 압력 센서를 포함하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    센서 중 적어도 하나는 ATR-FTIR 센서, 온도 센서, SAXS 센서, 전도도 센서, pH 센서 및 압력 센서로 이루어진 군에서 선택되는 비-침습적 원위치 센서인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    조작 유닛은 크로마토그래피 유닛 및/또는 여과 유닛을 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    크로마토그래피 유닛은 결합/용리 또는 통과 모드에서 등용매, 선형, 분절화 및/또는 단계 구배 용리로 작동하는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멀티-모드 수지 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택되고; 여과 유닛은 접선 유동 여과, 전량 여과, 절대 기공 크기 막을 통한 여과로 작동하는 한외여과, 정밀여과, 나노여과, 심층 여과로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 f)에서 공정은 리폴딩, 여과 또는 침전 이후 생물학적 제제의 피크 수집, 정확한 수집, 제제 품질, 및 공정 설비 보전 중 어느 하나 또는 조합과 관련하여 제어되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 제제는 생물의약품, 핵산 분자; 또는 바람직하게는 치료 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 융합 단백질, 탄수화물-단백질 결합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신-유사 단백질 또는 입자, 공정 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인, 항체 또는 상기 생물학적 제제의 대사물질로부터 선택되는 이종 단백질인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 제제의 농도, 순도 및 역가는 단계 c)에서 예측되고 방법의 단계 e)에서 모니터링되는 방법.
  15. 생물학적 제제를 생산하는 방법으로서,
    a) 생물학적 제제를 생산 가능한 유기체 또는 세포를 배양하는 단계;
    b) 단계 a)로부터 얻어진 제제를 정제하는 단계를 포함하고,
    정제는 적어도 하나의 조작 유닛을 이용하여 모니터링 및 제어되며, 조작 유닛은 적어도 2개의 독립적인 온라인 센서를 포함하고, 온라인 센서로부터의 데이터 값은 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가의 예측을 위해, 온라인 및 오프라인 데이터로부터 얻어진 다변량 통계 분석을 수행하기 위해 컴퓨터 데이터베이스로 불러오기 되며, 정제의 제어는 실제 공정 데이터 값을 진단하는 단계 및 생물학적 제제의 농도, 순도 및/또는 역가를 실시간으로 모니터링하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 생물학적 제제의 정제 및/또는 농축용 조작 유닛을 포함하는 장치로서,
    조작 유닛은
    a) 크로마토그래피 및/또는 여과 유닛을 포함하고,
    b) 크로마토그래피 또는 여과 유닛은 적어도 하나의 인라인 및/또는 하나의 비-침습적 원위치 센서를 포함하며,
    c) 수집된 데이터 값이 데이터베이스에 저장 및/또는 진단될 수 있는 컴퓨터에 센서가 연결되는 장치.
  17. 제16항에 있어서,
    비-침습적 원위치 센서는 온도 센서, 소각 X선 산란 센서(SAXS), pH 센서, 전도도 센서, ATR-FTIR 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 장치.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    다-각도 광 산란 센서(MALS), UV-VIS 흡광 센서, 형광 센서, 적외선 흡광 센서(IR), 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 분광 센서(ATR-FTIR), 광 굴절률(RI) 센서, pH 센서, 온도 센서, 전도도 센서, 압력 센서, 소각 X선 산란(SAXS) 센서 및 레독스 센서로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 온라인 센서를 추가로 포함하는 장치.
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