CN106456813B - 在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法、装置和系统 - Google Patents

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Abstract

提供在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法。所述方法包括以下步骤：(1)合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物，(2)确认所述组合物表现出预定特性，(3)将所述处理组合物转移至包括入口、出口和静态混合器的处理容器，转移发生在入口处，(4)在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度流动并与静态混合器接触，以及(5)在出口处从处理容器收集处理组合物，其中步骤(1)‑(5)连续进行。还提供包括这样的处理容器的装置和系统。

Description

在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法、装置和系统
发明领域
本发明一般涉及在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法、装置和系统，并且更特别地，涉及这样的方法，其包括以下步骤：(1)合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物，(2)确认所述组合物表现出所述特性，(3)将所述处理组合物转移至包括入口、出口和静态混合器的处理容器，转移发生在入口处，(4)在预定温度下于所述处理容器中温育所述处理组合物，同时所述处理组合物以预定速度流动并与静态混合器接触，以及(5)在出口处从所述处理容器收集所述处理组合物，其中步骤(1)-(5)连续进行，以及涉及包括这样的处理容器的装置和系统。
发明背景
准备用于生物制药产品如治疗药物或疫苗的包括生物制品的组合物中可能存在的病毒的灭活是确保生物制药产品会按照预期工作且不会无意中引起疾病或其他危害的质量控制的重要方面。病毒污染可以在制造生物制品期间通过外源或内源来源发生。鉴于它们的结构和基因组，病毒可能难以检测，并且，一旦存在，由于它们体积小而可能难以物理移除。为了消除病毒污染的可能性，制造生物制品的工业过程通常包括灭活潜在的病毒污染物的一个或多个步骤。
来自现有技术的典型方法包括将病毒灭活试剂如酸或去污剂添加至包括生物制品的组合物中，彻底混合，温育特定时间，然后中和或去除病毒灭活试剂，全部以不连续模式进行，即分批模式，以便完成包括生物制品的组合物中可能存在的病毒的灭活，例如Ristol Debart et al.,U.S.Pat.No.6,875,848,Shadle et al.,U.S.Pat.No.5,429,746,和Latham et al,U.S.Pub.No.2013/0236358教导的。按照这类方法，可能存在的病毒的灭活需要多个不连续步骤和/或延长的温育时间(尽管，在该时间期间包括生物制品的组合物通常不另外加工)，可能增加大量时间至制造生物制品的总过程。
其他方法包括以连续模式用一剂量的光如单色或多色的光处理包括生物制品的组合物，例如所述组合物流过薄层辐照器，任选混合以缩小停留时间分布并增加灭活率，以便完成所述组合物中可能存在的微生物的灭活，例如Anderle et al.,U.S.Pat.No.7,993,580教导的。然而光剂量的控制可能是困难的，因为剂量可以随组合物变化，取决于因素如吸收中的微观异质性和辐照期间组合物的流速，并且可以随时间变化，取决于相应光源的老化和光发射的波动。
其他方法包括在从第一单元操作流至第二单元操作期间例如利用一个或多个串联的静态混合器连续混合包括生物制品的组合物与病毒灭活试剂如酸或去污剂，以便灭活所述组合物中可能存在的病毒，通过在每个静态混合器之后和pH探针之前具有适当直径和长度的管来改变病毒灭活的停留时间，例如Xenopoulos,WO2014/004103教导的。基于改变每个静态混合器之后和pH探针之前的管的直径和长度来改变病毒灭活的停留时间可能需要大量的经验分析和/或生物制品长时间有害地暴露于病毒灭活试剂，虽然，考虑到组合物在管中流动的模式可以以复杂且难以预测的方式变化(取决于组合物的特定性质和管的尺寸)，并且尽管在组合物流过管之前完全混合组合物，组合物在管中流动的方式仍然可以表现出异质性，特别是在为了制造的目的放大方法的背景下。
因此，需要在制造生物制品期间连续灭活病毒的改良方法，以及提供特定用于这类方法的处理容器的装置。
发明概述
在本公开的第一方面，提供一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法。所述方法包括步骤(1)，合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物。所述方法还包括步骤(2)，确认所述处理组合物表现出预定特性。所述方法还包括步骤(3)，将所述处理组合物转移至处理容器，所述处理容器包括入口、出口和静态混合器，并且具有内部容积，所述入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端，所述静态混合器沿长轴在处理容器的内部，并且转移发生在入口处。所述方法还包括步骤(4)，在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。所述方法还包括步骤(5)，在出口处从处理容器收集处理组合物。按照所述方法，步骤(1)-(5)连续进行。
不希望被这个理论束缚，据推测特别是静态混合器布置为处理容器的内部部分允许改善的病毒灭活试剂与包括生物制品的组合物的相互作用，因此提高用于病毒灭活的试剂的活性。
在第一方面的一个实例中，处理组合物的预定特性包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个。
在第一方面的另一实例中，病毒灭活试剂包括以下至少一种：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)具有发色基团的非离子去污剂，其具有230nm-600nm的吸收峰。
例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的酸，选自具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸，乳酸，甲酸，抗坏血酸，具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸，甘氨酸，或者它们的组合。
例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸、甘氨酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有发色基团的非离子去污剂，其具有230nm-600nm的吸收峰，选自具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂以及它们的组合。
例如，病毒灭活试剂可以是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度。按照这个实例，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度。可选地或额外地，步骤(2)的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。
在第一方面的另一实例中，预定温度和预定速度的组合足以导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数(factor)通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。
在第一方面的另一实例中，预定温度为17-40℃，并且预定速度为0.3-3乘以处理容器的内部容积/小时。
在第一方面的另一实例中，处理容器的内部容积足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中具有比导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。
在第一方面的另一实例中，步骤(1)-(5)连续进行至少1小时。
在第一方面的另一实例中，如果在步骤(2)中不能确认处理组合物表现出预定特性，则将相应部分的处理组合物转走(divert)，因此在步骤(3)期间不转移。
在第一方面的另一实例中，如果在步骤(2)中不能确认处理组合物表现出预定特性，则将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)期间不收集。
在第一方面的另一实例中，生物制品为感兴趣的蛋白。例如，感兴趣的蛋白可以包含抗体、抗体片段或抗体衍生物。还例如，抗体、抗体片段或抗体衍生物可以选自抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、哺乳动物抗体、小鼠抗体、灵长类抗体、人抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链、抗体片段、抗体衍生物、Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fc-Fc融合蛋白、Fv片段、单链Fv片段、单结构域Fv片段、四价单链Fv片段、二硫键连接的Fv片段、双抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabody)、五抗体(pentabody)、微抗体、微型抗体、免疫球蛋白单可变结构域、免疫球蛋白单可变重链结构域、免疫球蛋白单可变轻链结构域、VHH结构域、人源化的VHH结构域、单结构域抗体、包含以模块形式与另一免疫球蛋白单可变结构域或功能结构域连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白、包含以模块形式连接在一起的两个或更多个相同的免疫球蛋白单可变结构域的多价蛋白、包含以模板形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双异位(biparatopic)蛋白、包含以模块形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双特异性蛋白、包含以模块形式连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域和功能结构域的双功能蛋白、结构域缺失的抗体、抗体片段与另一肽或多肽的融合多肽、Fc-肽融合物、Fc-毒素融合物、以及抗体片段与支架蛋白的融合物。
在第一方面的另一实例中，根据在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法制备感兴趣的蛋白。例如，感兴趣的蛋白可以如上文所述。
在本公开的第二方面，提供一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的装置。所述装置包括初始混合容器、预处理检测室、预处理容纳库(hold reservoir)、排水阀和处理容器。处理容器包括入口、出口和静态混合器。入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端。静态混合器沿长轴在处理容器的内部。初始混合容器、预处理检测室、预处理容纳库和处理容器各自具有内部容积，并且流体串联连接。排水阀连接至预处理容纳库和处理容器的入口且位于预处理容纳库和处理容器的入口之间，或者连接至处理容器的出口。预处理容纳库的内部容积比处理容器的内部容积的比例为0.003-0.06。
在第二方面的一个实例中，预处理容纳库的内部容积为25mL-14L，并且处理容器的内部容积为8L-250L。
在第二方面的另一实例中，预处理容纳库的内部容积为0.63mL-1.4L，并且处理容器的内部容积为200mL-25L。
在本公开的第三方面，提供一种在制造生物制品期间使用连续灭活病毒的装置的方法。所述方法包括步骤(1)，在初始混合容器中合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物。所述方法还包括步骤(2)，在处理组合物通过预处理检测室时，确认处理组合物表现出预定特性。所述方法还包括步骤(3)，经由预处理容纳库将处理组合物转移至处理容器，转移发生在入口处。所述方法还包括步骤(4)，在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致处理组合物中的病毒灭活。所述方法还包括步骤(5)，在出口处从处理容器收集处理组合物。按照所述方法，步骤(1)-(5)连续进行。
上文公开的关于第一方面的每个实例也适用于第三方面。因此，例如，在第三方面的一个实例中，处理组合物的预定特性包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个，如第一方面的相应实例。
在本公开的第四方面，提供一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的系统。所述系统包括灌注生物反应器和在制造生物制品期间连续灭活病毒的装置。
按照所述系统，所述装置包括初始混合容器、预处理检测室、预处理容纳库、排水阀和处理容器。处理容器包括入口、出口和静态混合器。入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端。静态混合器沿长轴在处理容器的内部。初始混合容器、预处理检测室、预处理容纳库和处理容器各自具有内部容积，并且流体串联连接。排水阀连接至预处理容纳库和处理容器的入口且位于预处理容纳库和处理容器的入口之间，或者连接至处理容器的出口。预处理容纳库的内部容积比处理容器的内部容积的比例为0.003-0.06。
还按照所述系统，灌注生物反应器和所述装置经由初始混合容器连接。灌注生物反应器具有比处理容器的内部容积大5-2400倍的内部容积。
在本公开的第五方面，提供一种在制造生物制品期间使用连续灭活病毒的系统的方法。所述方法包括步骤(0)，通过初始混合容器将包括生物制品的组合物从灌注生物反应器转移至所述装置。所述方法包括步骤(1)，在初始混合容器中合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物。所述方法还包括步骤(2)，在处理组合物通过预处理检测室时，确认处理组合物表现出预定特性。所述方法还包括步骤(3)，经由预处理容纳库将处理组合物转移至处理容器，转移发生在入口处。所述方法还包括步骤(4)，在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。所述方法还包括步骤(5)，在出口处从处理容器收集处理组合物。按照所述方法，步骤(0)-(5)连续进行。
上文公开的关于第一方面的每个实例也适用于第五方面。因此，例如，在第五方面的一个实例中，处理组合物的预定特性包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个，如第一方面的相应实例。
在第六方面，提供一种制备感兴趣的蛋白的方法。所述方法包括步骤(I)，在培养基中培养宿主细胞，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白。所述方法还包括至少一个步骤(II)，在制备感兴趣的蛋白期间连续灭活病毒。所述方法还包括步骤(III)，从培养基回收感兴趣的蛋白。
按照第六方面，步骤(II)包括步骤(1)，合并(a)包括感兴趣的蛋白的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物。步骤(II)还包括步骤(2)，确认所述处理组合物表现出预定特性。步骤(II)还包括步骤(3)，将处理组合物转移至处理容器，所述处理容器包括入口、出口和静态混合器，并且具有内部容积，所述入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端，所述静态混合器沿长轴在处理容器的内部，并且转移发生在入口处。步骤(II)还包括步骤(4)，在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。步骤(II)还包括步骤(5)，在出口处从处理容器收集处理组合物。按照所述方法，步骤(1)-(5)连续进行。
上文公开的关于第一方面的每个实例也适用于第六方面。因此，例如，在第六方面的一个实例中，处理组合物的预定特性包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个，如第一方面的相应实例。还例如，感兴趣的蛋白可以包括抗体、抗体片段或抗体衍生物，如第一方面的相应实例。
附图说明
当参考附图阅读以下详细描述时会更好地理解要求保护的方法、装置和系统的这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1是在制造生物制品期间连续灭活病毒的优选方法的流程图，其包括：步骤(1)110，合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物；步骤(2)120，确认处理组合物表现出预定特性；步骤(3)130，将处理组合物转移至包括入口、出口和静态混合器的处理容器，转移发生在入口处；步骤(4)140，在预定温度下于处理容器中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度流动并与静态混合器接触；以及步骤(5)150，在出口处从处理容器收集处理组合物；以及任选存在的步骤(0)610，通过初始混合容器将包括生物制品的组合物从灌注生物反应器例如直接或间接转移至在制造生物制品期间连续灭活病毒的装置。
图2是用于在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法的实例处理容器210的示意图，其中处理容器210具有线性形状；
图3是用于在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法的实例处理容器210的示意图，其中处理容器210具有曲线形状；
图4是用于在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法的实例处理容器210的示意图，其中处理容器210具有螺旋形状；
图5是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例装置310的示意图，包括图2的处理容器210，其中排水阀350连接至处理容器210的预处理容纳库340和入口220且位于处理容器210的预处理容纳库340和入口220之间；
图6是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例装置310的示意图，包括图2的处理容器210，其中排水阀350连接至处理容器210的出口230；
图7是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统410的示意图，包括灌注生物反应器420和图5的装置310；
图8是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统410的示意图，包括灌注生物反应器420、色谱柱520和图5的装置310；
图9是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统410的示意图，包括灌注生物反应器420和图5的装置310，并且还包括初始混合前容器432和罐434，所述罐434用于将包括化合物的组合物供应至初始混合前容器432，所述化合物包括pH敏感基团；
图10是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统410的示意图，包括灌注生物反应器420、色谱柱520和图5的装置310，并且还包括初始混合前容器432和罐434，所述罐434用于将包括化合物的组合物供应至初始混合前容器432，所述化合物包括pH敏感基团；
图11是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统410的示意图，包括两个图5的装置310，第一个通过使用有机酸来提供病毒灭活，而第二个通过使用去污剂来提供病毒灭活；
图12是在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统710的示意图(细节：见实施例1)；
图13是在制造生物制品期间于低pH下连续灭活病毒的方法的过程流程图，包括测量内在发色化合物的光谱信号以测量pH(细节：见实施例2)；
图14是预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括7个样品的“模型pH”(实心圆)、“交叉验证pH”(空心圆)和“靶线”(实线)，基于荧光发射和多变量数据分析(细节：见实施例2中的表1)；
图15是在制造生物制品期间于低pH下连续灭活病毒的方法的过程流程图，包括测量外在发色化合物的光谱信号以测量pH(细节：见实施例2)；
图16是预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括10个样品的“模型pH”(实心圆)和“靶线”(实线)，基于UV/可见吸收光谱和多变量数据分析(细节：见实施例2中的表2)；以及
图17是预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括10个样品的“模型pH”(实心圆)和“靶线”(实线)，基于UV/可见吸收光谱和多变量数据分析(细节：见实施例2中的表3)。
发明详述
参考其中示出实例实施方案的附图，此后会更详细地描述要求保护的方法、装置和系统的方面。只要可能，相同的参考数字在整个图中用来指相同或相似部分。但是，要求保护的方法、装置和系统可以以许多不同形式体现，并且不应当理解为受限于本文所示的实施方案。提供这些实例实施方案以使本公开充分且完整，并且这些实施方案会向本领域技术人员充分传达要求保护的方法、装置和系统的范围。
如图1所示，在本公开的第一方面，提供一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法。如上文提到的，准备用于生物制药产品的包括生物制品的组合物中可能存在的病毒的灭活是质量控制的一个重要方面。生物制品可以是例如蛋白、核酸、碳水化合物、脂质或生物材料等。蛋白可以是例如治疗性蛋白，如抗体、抗体片段、抗体衍生物、细胞因子、生长因子、激素、酶或凝血因子等，或者疫苗蛋白，如抗原蛋白等。生物制品可以通过生命系统如细胞、组织或生物体制备，例如通过哺乳动物细胞、植物细胞或细菌细胞等制备。生物制品可以通过均质方法制备，例如基于使用搅拌槽式生物反应器、气升式生物反应器或波浪式生物反应器的悬浮培养，或者通过异质方法制备，例如基于微载体系统、填充床生物反应器或中空纤维生物反应器的贴壁培养，以不连续模式进行，例如分批培养或补料分批培养，或者以连续模式进行，例如灌注连续培养，并且以任何合适的规模进行，例如实验室、试验或生产规模。病毒可以是可以感染细菌的病毒(即“细菌噬菌体”，也称作“噬菌体”)，或者可以感染人和/或动物，例如准备施用生物制品的个体人或动物，等等。病毒可以从外源性来源引入包括生物制品的组合物，例如通过疏忽未能保持无菌，或者从内源性来源(例如用来制备生物制品的生命系统)引入包括生物制品的组合物。
所述方法可以用来确保灭活在制造生物制品期间例如基于病毒污染可能已存在的病毒。就可能存在多种不同类型的病毒和/或给定类型病毒的多种活性颗粒而言，所述方法可以用来灭活多种不同类型和/或给定类型的多种活性颗粒。因此，例如，所述方法可以用来确保最终包括生物制品的生物制药制品不会包括可接受限度以上的任何量的任何类型的病毒活性颗粒，例如生物制药制品将不含病毒活性颗粒。
如图1所示，所述方法包括步骤(1)110，合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物。
用于灭活病毒的处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH或0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个。3.0-3.8的pH可以引起病毒灭活，0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度也可以。可以开发足以完成处理组合物中的病毒灭活至期望程度的整体过程，在这个意义上可以预先确定预定特性，基于制备具有灭活病毒的特定特性的处理组合物并测试各种条件以确定和证实充分性，然后一般在制造生物制品期间应用所述过程。这样的应用可以包括合并包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物以获得具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物，即所述方法可以按照特定计划进行以确保灭活可能存在的病毒。因此，在一些实例中，处理组合物的预定特性包括3.0-3.8的pH，例如3.3-3.8或3.5-3.8。在一些实例中，处理组合物的预定特性包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度，例如0.05％-5.0％(v/v)或0.05％-2.0％(v/v)。在一些实例中，处理组合物的预定特性包括3.0-3.8的pH和0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度，例如3.3-3.8的pH和0.05％-5.0％(v/v)的去污剂浓度，或者3.3-3.8的pH和0.05％-2.0％(v/v)的去污剂浓度，或者3.5-3.8的pH和0.05％-5.0％(v/v)和0.05％-5.0％(v/v)的去污剂浓度，或者3.5-3.8的pH和0.05％-2.0％(v/v)的去污剂浓度。
包括生物制品的组合物可以是例如直接源自生物反应器的组合物，例如用于通过生命系统如哺乳动物细胞培养制备生物制品的生物反应器。包括生物制品的组合物可以是例如获得自以连续模式(例如灌注连续培养)操作的生物反应器的组合物，因此可以包括细胞培养基(已经被哺乳动物细胞培养物的细胞在一定程度上利用)和分泌自细胞的生物制品。包括生物制品的组合物还可以是例如间接源自生物反应器的组合物，例如在一个或多个加工步骤之后，如过滤、沉淀和/或色谱分离等其他步骤，以便在使包括生物制品的组合物进行连续灭活病毒的方法之前去除一些或所有不需要的碎片、化合物和其他物质。
病毒灭活试剂可以包括例如以下至少一种：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)具有发色基团的非离子去污剂，所述发色基团具有230nm-600nm的吸收峰。
具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的酸表示酸，其具有至少一个pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且可以具有pKa低于2.3或高于8.5的额外的可滴定基团，但是没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，每个pKa在约20-25℃下确定。
具有2.3-4.2的pKa且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸如羧酸或氨基酸是这样的酸。这类有机酸包括例如乳酸，其具有在25℃下pKa为3.86的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团。甲酸也是这样的有机酸，其具有在20℃下pKa为约3.74的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团。抗坏血酸也是这样的有机酸，其具有在约20-25℃下pKa为4.17的可滴定基团以及也在约20-25℃下pKa为11.6的额外的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团。甘氨酸也是这样的有机酸，其具有在约20-25℃下pKa为约2.34的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团。因此，例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的酸，选自具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸，乳酸，甲酸，抗坏血酸，具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸，甘氨酸，或者它们的组合。
至少为了以下原因，具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的酸可以用于所述方法。首先，通过具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，酸可以将处理组合物充分缓冲在3.0-3.8的pH下而不需要包括大量的酸，例如酸可以以100mM或低于100mM存在于处理组合物中，并且仍提供足够的缓冲能力。这可以确保处理组合物维持在3.0-3.8的pH下，pH足够低以使得能够灭活病毒，但是足够高以避免对生物制品的危害，例如蛋白的酸变性。第二，通过没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，后来可以将包括酸的处理组合物中和而不需要滴定另一可滴定基团，因此不需要添加在另一可滴定基团不存在下不需要添加的额外离子。这可以促进病毒灭活之后可能进行的任何离子交换步骤的有效性。
某些具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的特定酸还可以用于额外的原因。例如，乳酸是额外有用的，因为其天然存在于细胞中，因此在制备生物制品的过程中，它是FDA的公认安全(也称作“GRAS”)的物质，并且它是廉价的。
具有发色基团(具有230nm-600nm的吸收峰)的非离子去污剂包括例如具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂，等等，其包括例如Triton-X 100去污剂，等等。因此，例如，病毒灭活试剂可以是具有发色基团的非离子去污剂，其具有230nm-600nm的吸收峰，选自具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂以及它们的组合。
至少为了以下原因，具有发色基团(具有230nm-600nm的吸收峰)的非离子去污剂可以用于所述方法。首先，如果非离子去污剂以合适的浓度存在于处理组合物中，非离子去污剂的不带电荷的亲水基团可以用来灭活病毒而不危害生物制品。第二，非离子去污剂的具有230nm-600nm的吸收峰的发色基团可以用于测量处理组合物内的去污剂浓度，例如基于发色基团的紫外吸收，这是浓度依赖性特征。
因此，包括病毒灭活试剂的组合物可以是包括以下至少一个的组合物：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)非离子去污剂，其具有发色基团，所述发色基团具有230nm-600nm的吸收峰，例如所述组合物可以包括记载的一种或多种酸，记载的一种或多种非离子去污剂，或者它们的组合。
如上文提到的，所述方法包括步骤(1)110，合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物。应当理解，用于灭活可能存在的病毒的病毒灭活试剂的有效性取决于处理组合物中病毒灭活试剂的浓度等。还应当理解，灭活病毒至给定程度所必需的病毒灭活试剂的浓度可以在实际条件下凭经验确定，基于先前在相似条件下的经验估计，和/或基于理论预测。还应当理解，这个浓度还可以用来确保病毒灭活试剂以合适的浓度包括在包括病毒灭活试剂的组合物中以确保，考虑到包括病毒灭活试剂的组合物对处理组合物体积的比例贡献，病毒灭活试剂以有效灭活病毒的浓度存在于处理组合物中。例如，考虑使用对应于列举的酸之一的病毒灭活试剂，例如乳酸，如果确定酸应当以约100mM包括在处理组合物中，并且通过合并约1体积的包括病毒灭活试剂的组合物每9体积的包括生物制品的组合物来制备处理组合物，则可以制备包括病毒灭活试剂的组合物，其包括约1M浓度的酸。还例如，考虑使用对应于列举的非离子去污剂之一的病毒灭活试剂，例如Triton-X 100去污剂，如果确定非离子去污剂应当以约1.0％(v/v)包括在处理组合物中，并且通过合并约1体积的包括病毒灭活试剂的组合物每9体积的包括生物制品的组合物来制备处理组合物，则可以制备包括病毒灭活试剂的组合物，其包括约10％(v/v)浓度的非离子去污剂。
对于包括对应于记载的一种或多种酸的病毒灭活试剂的组合物，所述组合物可以进一步具有例如3.0-3.8的pH，例如约3.0的pH、约3.3的pH或约3.5的pH。使用这样的具有3.0-3.8的pH的组合物代替例如具有低于或高于这个范围的pH的组合物，可以确保由合并包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物所致的处理组合物不会具有低于3.0的pH，这可能危害生物制品，并且不会具有高于3.8的pH，这可能导致很少或没有病毒灭活。
如上文提到的，按照步骤(1)110，将包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物合并以获得具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物。合并可以例如在包括一个或多个混合器的容器内进行，从而将包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物例如单独和同时添加至所述容器，例如在压力下流过所述容器，并且通过所述一个或多个混合器在流动时混合。混合可以发生例如一段时间，例如1-5分钟，其足够长以确保处理组合物混合均匀，但是不太长，只要病毒灭活在很大程度上进行。还可以使用其他方法。
还如图1所示，所述方法还包括步骤(2)120，确认处理组合物表现出预定特性。确认可以通过使用可以用来测量处理组合物的特征如pH、电导率、温度、分光光度特征或光谱特征的检测器进行，例如pH计、电导率计、温度计、分光光度装置或光谱装置。
在这方面，确认可以通过直接测量预定特性来进行。例如，对于对应于3.0-3.8的pH的预定特性，确认可以通过在其混合之后测量处理组合物的pH来进行。这可以例如通过使用pH计来完成。还例如，对于对应于0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度的预定特性，确认可以通过测量去污剂浓度来进行，例如通过测量由于去污剂的发色基团的紫外吸收，例如通过使用分光光度装置。
确认可以通过间接测量预定特性来进行。
这可以这样进行，例如，如果另一化合物以已知浓度包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，其浓度可以测量，例如基于包括盐并测量其浓度，例如，通过使用电导率计。
这还可以这样进行，例如，如果包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物在合并时具有不同温度，从而所得的处理组合物具有初始温度，在混合之后但是处理之前，它是其之间的中间值，并且是处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例的指示，例如基于测量处理组合物的初始温度，例如，通过使用温度计。例如，如果Ttc＝处理组合物的温度，Tbp＝包括生物制品的组合物的温度，并且Tvir＝包括病毒灭活试剂的组合物的温度，则处理组合物中包括病毒灭活试剂的组合物的分数可以计算为(Ttc-Tbp)/(Tvir-Tbp)。
这还可以这样进行，例如，如果包括pH敏感基团的化合物包括在提供的包括生物制品的组合物中，可以测量其光谱特征，例如，通过使用光谱装置。这样的包括pH敏感基团的化合物可以是例如包括生物制品的组合物中包括的生物制品和/或缓冲液，和/或可以是发色化合物。按照这类实例，pH敏感基团的光谱特征可以用来间接确认预定特性。还按照这类实例，因为包括pH敏感基团的化合物包括在提供的包括生物制品的组合物中，所以可以认为所述化合物关于包括生物制品的组合物是内在的，例如内在发色化合物。
这还可以这样进行，例如，如果将提供的包括生物制品的组合物中不包括的包括pH敏感基团的化合物随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，同样可以测量其光谱特征，例如，通过使用光谱装置。这类包括pH敏感基团的化合物可以是例如列为FDA批准的GRAS物质的包括pH敏感基团的化学品和/或FDA批准的包括pH敏感基团的非活性成分，和/或可以是发色化合物。再次，按照这类实例，pH敏感基团的光谱特征可以用来间接确认预定特性。还按照这类实例，因为包括pH敏感基团的化合物不包括在提供的包括生物制品的组合物中，所以可以认为所述化合物关于包括生物制品的组合物是外在的，例如外在发色化合物。
例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。
按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。例如，如果包括生物制品的组合物具有约10mS/cm的电导率，正如直接获得自用于灌注连续培养的生物反应器的典型制品进料，则可以包括浓度为1M或更高的氯化钠作为包括病毒灭活试剂的组合物中的盐，并且可以通过合并约1体积的包括病毒灭活试剂的组合物每9体积的包括生物制品的组合物来制备处理组合物。这种方法会导致盐增加处理组合物的电导率约10％或更多，即至约11mS/cm或更多，这在检测的阈值之上，因此允许确认盐已经以预期的量添加至处理组合物中，并且因此推断病毒灭活试剂也已经以预期的量添加至处理组合物中。还例如，如果包括生物制品的组合物具有低于10mS/cm的电导率，例如约2mS/cm，这可以是一个或多个加工步骤之后的典型制品进料，则可以在包括病毒灭活试剂的组合物中包括比例较低浓度的氯化钠，并且在合并之后仍增加处理组合物的电导率约10％或更多，同样在检测的阈值之上。还可以使用除氯化钠以外的盐，考虑到盐之间电导率的任何差异。
可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。例如，在混合时，包括生物制品的组合物可以具有比包括病毒灭活试剂的组合物的温度低(或者，高)的温度，从而所得的处理组合物具有在它们中间的初始温度。按照这个实例，处理组合物的初始温度是处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例的指示。这转而可以用来确定处理组合物中病毒灭活试剂的浓度。
可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。例如，可以使用具有pKa为约2.5-5.0的可滴定基团的发色化合物，如各种羧酸化合物和磺酸盐化合物。
可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。例如，生物制品本身可以包括在荧光光谱中表现出pH敏感变化的pH敏感基团，可以用来测量处理组合物的pH。还例如，包括生物制品的组合物中包括的缓冲液可以包括在荧光光谱中表现出pH敏感变化的pH敏感基团，可以用来测量处理组合物的pH。还例如，包括生物制品的组合物中存在的一种或多种其他化合物可以包括在紫外光谱、可见光谱、红外光谱和/或拉曼光谱中表现出pH敏感变化的pH敏感基团，可以用来测量处理组合物的pH。因此，包括pH敏感基团的相应化合物可以是例如内在发色化合物。这样的pH敏感基团，例如内在发色化合物的pH敏感基团的使用可以是有利的，因为可以光谱测量包括生物制品的组合物和/或处理组合物的pH而不需要向其添加任何外来化合物。
可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。例如，包括pH敏感基团的化合物可以是例如列为FDA批准的GRAS物质的化学品和/或FDA批准的非活性成分，和/或外在发色化合物。这样的pH敏感基团，例如外在发色化合物的pH敏感基团的使用可以是有利的，因为可以将pH敏感基团以选择的浓度添加至包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物中，以便确保制备处理组合物包括恒定浓度的pH敏感基团，因此限制由于pH敏感基团的浓度变化可能出现的处理组合物光谱特征的可变性。此外，基于最小化向其给药包括生物制品的最终药物制品的患者的风险，使用是FDA批准的GRAS物质和/或FDA批准的非活性成分的相应外在发色化合物也可以是有利的，因为即使最终药物制品可能包含痕量的外在发色化合物，但是最终药物制品对于患者仍然是安全的。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸、甘氨酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。这转而可以用来确定处理组合物的去污剂浓度。
如上文提到的，确认可以通过使用可以用来测量处理组合物特征的检测器来进行，例如pH计、电导率计、温度计、分光光度装置或光谱装置。例如，确认可以在组合物流过检测室时进行，例如其中pH计的pH探针、电导率计的电导率探针或温度计的温度探针与处理组合物接触的室，或者其中处理组合物可以进行分光光度或光谱装置的分光光度或光谱分析的室。处理组合物可以到达检测室，例如，基于在压力下从其中如上文所述制备处理组合物的容器流至检测室，两者流体连接，即连接从而流体可以内部流动，并且至少从其中制备处理组合物的容器单向流至检测室。
还如图1所示，参考图2，所述方法还包括步骤(3)130，将处理组合物转移至包括入口220、出口230和静态混合器240且具有内部容积212的处理容器210，入口220和出口230位于处理容器210的长轴270的相对末端，即入口端250和出口端260，而静态混合器240沿长轴270在处理容器210的内部，并且转移发生在入口220处。
如图2所示，处理容器210可以是例如柱或管等的形式。分别如图2、图3和图4所示，处理容器210可以具有例如线性、曲线或螺旋等的形状，因此可以具有也是例如线性、曲线或螺旋等类型的长轴270。处理容器210可以由例如金属、塑料或它们的组合等材料制成。如下文讨论的，处理容器可以适当地包括一个静态混合器240或多个静态混合器240，例如2、3、4或更多个，以便确保有效混合。静态混合器可以是包括例如挡板、孔、冲击板和/或其他串联突出物的一类静态混合器。静态混合器可以由与生物制药加工相容的一种或多种金属制成，例如与生物制药加工相容的一种或多种金属、塑料、橡胶和/或玻璃。
在入口220处处理组合物转移至处理容器210可以，例如，如上文所述，基于处理组合物在压力下从检测室流至处理容器210而发生，检测室和处理容器210流体连接，即连接使得流体可以内部流动，并且至少从检测室单向流至处理容器210。转移的速度可以例如通过泵控制，处理组合物通过流体连接至检测室和处理容器210且位于其之间的库，以便确保在步骤(2)120中未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以离开处理容器210，而不是到达处理容器210。
还如图1所示，参考图2，所述方法还包括步骤(4)140，在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴270流动并与静态混合器240接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。因此，如果在步骤(4)140之前病毒存在于处理组合物中，例如作为多种不同类型的病毒和/或给定类型病毒的多种活性颗粒，基于在步骤(4)140期间于处理容器210中温育，会至少在一定程度上灭活病毒。
例如，通过使用加热元件，可以将处理容器210维持在预定温度下，并且例如，通过使用泵，可以将处理组合物的流动维持在预定速度下。
可以开发足以完成病毒灭活至期望程度的整体过程，在这个意义上可以预先确定预定温度和预定速度，基于在处理容器210中于特定温度下温育处理组合物特定时间并测试各种条件以确定和证实充分性，然后一般在制造生物制品期间应用所述过程，包括控制处理容器210的温度和控制处理组合物流过处理容器210的速度以确保处理组合物处理充分，完成病毒灭活至期望程度。同样，所述方法可以按照特定计划进行以确保灭活可能存在的病毒。
预定温度和预定速度的组合可以足够导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。例如，预定温度和预定速度的组合可以足够导致在步骤(4)140期间以至少1×102、至少1×103、至少1×104、至少1×105或至少1×106的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。按照这个实例，在实际病毒污染的条件下，以及在病毒污染可能存在的条件下(无论病毒污染是否实际存在)，预定温度和预定速度的组合可以足够导致通过病毒灭活试剂至少灭活处理组合物中的病毒至所示程度。此外，预定温度和预定速度的组合导致病毒灭活的充分性可以涉及灭活一种特定类型的病毒、多种特定类型的病毒和/或一般或不同范围的病毒。此外，预定温度和预定速度的组合导致病毒灭活的充分性可以涉及灭活仅在步骤(4)140期间进行温育的一部分处理组合物，例如进行所述方法的一部分时间中在处理容器210中温育的一部分处理组合物，或者在步骤(4)140期间进行温育的所有处理组合物，例如从开始至结束，在进行所述方法的整个时间中这样温育的所有处理组合物。
预定温度可以是17-40℃，而预定速度可以是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时。一般来说，随着预定温度增加，预定速度也可以增加，反之亦然。相反地，随着预定温度降低，预定速度可能需要降低，反之亦然。这是因为病毒灭活试剂在较高温度下通常可以更快地灭活处理组合物中的病毒，因此处理组合物可以在处理容器210中温育较短时间，但是仍然完成病毒灭活至期望程度。例如，预定温度可以是18-25℃，而预定速度可以是0.5-1.5乘以处理容器210的内部容积212每小时。还例如，预定温度可以是30-39℃，而预定速度可以是0.8-2.0乘以处理容器210的内部容积212每小时。
处理容器210的内部容积212可以足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中210具有比导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。在这方面，可以基于具有足够大的内部容积212来制备或选择处理容器210，以便负责在处理组合物流过处理容器210时处理组合物的轴向分散，即处理组合物沿处理容器210的长轴分散，以便控制并最小化可以以少于导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的时间流过处理容器的处理组合物的比例。例如，可以基于具有这样的内部容积212制备或选择处理容器210，其包括除理论塞流容积以外的额外容积以负责轴向分散。容器的理论塞流容积Vh*可以计算为容器内组合物的临界保持时间Tr和容积流量Q的乘积。负责轴向分散所必需的额外体积可以估算，例如，通过利用层流或活塞流的Taylor分散模型、涡流的Gaussian模型或者为给定静态混合器240特别开发的模型等其他方法。因此，例如，处理容器210的内部容积212可以足够大以确保不超过百万分之一的处理组合物，例如不超过千万分之一、亿分之一或十亿分之一，在处理容器210中具有比导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数(例如以至少1×102、至少1×103、至少1×104、至少1×105或至少1×106的系数)通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。还例如，处理容器210的内部容积212可以足够大以确保不超过百万分之一的处理组合物中的病毒活性颗粒，例如不超过千万分之一、亿分之一或十亿分之一，在处理容器210中具有比导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数(例如以至少1×102、至少1×103、至少1×104、至少1×105或至少1×106的系数)通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。
如上文提到的，在处理组合物沿处理容器210的长轴270流动时，处理组合物接触静态混合器240，例如包括接触包括多个静态混合器240的处理容器210的多个静态混合器240。在处理组合物流过处理容器210时，这种接触提供处理组合物的连续混合，因此最小化处理组合物的轴向分散。
还如图1所示，所述方法还包括步骤(5)150，在出口230处从处理容器210收集处理组合物。收集可以对应于，例如，允许处理组合物继续流至另一容器，例如用于中和或去除病毒灭活试剂，用于进一步加工，如色谱分离，或者用于进一步灭活病毒，例如通过首先使用如上文列举的有机酸进行病毒灭活，然后使用如上文列举的去污剂进行病毒灭活，或者通过首先使用如上文列举的氨基酸进行病毒灭活，然后使用如上文列举的去污剂进行病毒灭活，等等。收集还可以对应于允许处理组合物流入容器用于储存，例如用于以后加工，等等。
按照所述方法，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150连续进行，即每个步骤对包括生物制品的组合物、包括病毒灭活试剂的组合物和处理组合物的不同部分同时进行至少一段时间。例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行至少1小时、至少4小时、至少12小时、至少24小时、至少3天、至少10或至少30天等其他时间。还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行，不仅在生物制品的整个制造期间，而且与制造生物制品期间通过生命系统实际产生生物制品同时且连续。
按照所述方法，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，从而不会将其加工完成。在这方面，在进行所述方法的某些情况下，可能确定一部分的处理组合物未表现出灭活病毒的预定特性，例如由于与包括生物制品的组合物、包括病毒灭活试剂的组合物和/或将两者合并和混合以获得处理组合物的比例相关的变化或缺陷，等等其他变量和缺陷。在这类情况下，可以认为或确定相应部分的处理组合物是不合格的，从而病毒灭活可能不会发生至预期程度。此外，在这类情况下，可以优选转走相应部分的处理组合物而不是完成其加工，例如以便避免最终制备自处理组合物的药物制品可能污染病毒的不当风险。一旦相应部分的处理组合物已转走，所述方法可以继续，连续进行步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150，并且这个循环可以按照需要经常重复，例如一次、两次、三次或更多次，例如在至少24小时、至少3天，至少10天或至少30天的时间中，和/或直至生物制品的制备完成。
因此，例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(3)130期间不转移。相应部分的处理组合物可以包括一些、大多数或所有部分的在步骤(2)120未表现出预定特性的处理组合物。此外，相应部分的处理组合物还可以包括在步骤(2)120表现出预定特性的部分处理组合物，例如在步骤(2)120未表现出预定特性的部分处理组合物之前和之后的一些部分的处理组合物。这样，所述方法可以用来确保在步骤(2)120期间未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以丢弃而不是最终包括在包括生物制品的生物制药产品中。例如，如上文提到的，步骤(3)130的转移速度可以例如通过泵控制，处理组合物通过流体连接至检测室和处理容器210且位于其之间的库，以便确保在步骤(2)120期间未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以离开处理容器210，而不是到达处理容器210。
还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)150期间不收集。这样，所述方法可以用来确保在步骤(2)120期间未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以丢弃而不是最终包括在包括生物制品的生物制药产品中。例如，步骤(3)130的转移速度和步骤(4)140的流动的预定速度可以例如再次通过泵控制，如上文所述，处理组合物通过库，然后通过处理容器210，以便确保在步骤(2)120期间未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以离开步骤(4)140下游的进一步加工，例如在所述部分的处理组合物从处理容器210的出口230出现之后，而不是在步骤(5)150期间在出口230处从处理容器210收集处理组合物。
在本公开的第二方面，如图5所示，提供在制造生物制品期间连续灭活病毒的装置310。装置310包括初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340、排水阀350和处理容器210。处理容器210包括入口220、出口230和静态混合器240。入口220和出口230位于处理容器210的长轴270的相对末端，即入口端250和出口端260。静态混合器240沿长轴270在处理容器210的内部。初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340和处理容器210各自具有内部容积，即分别为内部容积322、332、342和212，并且流体串联连接，例如直接或间接，从而流体可以内部流动，并且至少从初始混合容器320单向流至预处理检测室330，然后流至预处理容纳库340，然后流至处理容器210。分别如图5和图6所示，排水阀350连接至预处理容纳库340和处理容器210的入口220且位于预处理容纳库340和处理容器210的入口220之间，或者连接至处理容器210的出口230。预处理容纳库340的内部容积342比处理容器210的内部容积212的比例为0.003-0.06。
更详细地考虑装置310，如图5所示，如上文讨论的，初始混合容器320可以是适合合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物的容器。初始混合容器320可以包括一个或多个初始混合器324，从而在将包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物例如分别但同时添加至初始混合容器320之后，并且其例如在压力下流过初始混合容器320，组合物可以接触一个或多个初始混合器324，导致组合物混合在一起，因此合并。
预处理检测室330可以是例如其中pH探针、电导率探针或温度探针与处理组合物接触的室，或者其中处理组合物可以进行分光光度或光谱分析的室。处理组合物可以到达预处理检测室330，例如，基于在压力下从如上所述其中制备处理组合物的初始混合容器320流至预处理检测室330，如上文提到的，基于两者例如直接或间接流体串联连接。
预处理容纳库340可以是库，例如罐或管，适合允许在入口220处将处理组合物转移至处理容器210，例如，基于处理组合物在压力下从如上文所述的预处理检测室330流至处理容器210，如上文提到的，预处理容纳库340例如直接或间接流体连接至预处理检测室330和处理容器210，并且位于其之间。可以配置装置310，例如，以便允许转移的速度例如通过泵控制，以便确保在通过预处理检测室320期间未确认表现出预定特性的任何特定部分的处理组合物可以离开处理容器210，而不是到达处理容器210，或者可以在流过处理容器210之后转走，而不是收集。
处理容器210可以如上文所述。因此，如图2所示，处理容器210可以是例如柱或管等其他形式，分别如图2、图3和图4所示，处理容器210可以具有例如线性、曲线或螺旋等其他形状，因此可以具有也是例如线性、曲线或螺旋等其他类型的长轴270，并且处理容器210可以由例如金属、塑料或它们的组合等其他材料制成。此外，如图5所示，处理容器210可以用来在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物沿长轴270以预定速度流动并接触静态混合器240，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。此外，可以在出口230处从处理容器210收集处理组合物。
如上文提到的，分别如图5和图6所示，排水阀350连接至预处理容纳库340和处理容器210的入口220且位于预处理容纳库340和处理容器210的入口220之间，或者连接至处理容器210的出口230。排水阀350可以用来转走处理组合物，例如如上文讨论的，如果不能确认处理组合物表现出预定特性。
还如上文提到的，预处理容纳库340的内部容积342比处理容器210的内部容积212的比例为0.003-0.06。按照这个比例，当处理容器210用来导致灭活处理组合物中的病毒时，使得预定温度为17-40℃，并且预定速度是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时，则处理组合物在预处理容纳库340中的停留时间为约1-5分钟。
如图7和图8所示，参考图5，可以配置装置310用于在制造生物制品期间连续灭活病毒，例如基于连接至灌注生物反应器420，例如与细胞分离装置一起配置用于灌注连续培养的生物反应器。灌注生物反应器420可以具有工作容积422，即在制造生物制品期间操作灌注生物反应器420时可以被细胞培养物成功占据的容积，对应于灌注生物反应器420的内部容积减去灌注生物反应器420的头部空间。可以基于灌注生物反应器420的设计确定工作容积422。在一些实例中，工作容积422可以是灌注生物反应器420的内部容积的约60％-100％、约70％-90％、约75％-85％或约80％。
例如，如图7所示，在操作灌注生物反应器420期间，可以将装置310通过初始混合容器320例如直接或间接连接至灌注生物反应器420，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至初始混合容器320而不首先进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离。
还例如，如图8所示，在其操作期间，可以将装置310通过初始混合容器320间接连接至灌注生物反应器420，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至至少一个加工设备，例如具有内部容积522且包括色谱基质524的色谱柱520，进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离，然后流至初始混合容器320。在一些实例中，在灌注生物反应器420和初始混合容器320之间有一个加工设备，例如一个色谱柱520。而且，在一些实例中，在灌注生物反应器420和初始混合容器320之间有2、3、4或更多个加工设备，例如2、3、4或更多个色谱柱520。色谱基质524可以是例如蛋白A抗体亲和色谱基质或阴离子交换色谱基质等其他合适的基质。
可以制备或选择预处理容纳库340和处理容器210，从而它们各自的内部容积342和212与装置310连接的灌注生物反应器420和操作灌注生物反应器420的灌注速度在尺寸上成比例。这样的尺寸可以促进连续使用装置310，不仅在生物制品的整个制造期间，而且与在灌注生物反应器420中通过生命系统实际产生生物制品同时且连续。
例如，回到图7，考虑在操作灌注生物反应器420期间通过初始混合容器320例如直接或间接连接至灌注生物反应器420的装置310，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至初始混合容器320而不首先进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离，其中灌注生物反应器420具有在100L-2000L的范围中的工作容积422，并且以2L-160L/小时的速度操作，预处理容纳库340的内部容积342可以为25mL-14L，而处理容器210的内部容积212可以为8L-250L。此外，在其中灌注生物反应器420具有100L的工作容积422且以2L-8L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为25mL-700mL，例如30mL-140mL，并且处理容器210的内部容积212可以为8L-20L，例如9L-15L。此外，在其中灌注生物反应器420具有500L的工作容积422且以10L-40L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为160mL-3.5L，例如180mL-700mL，并且处理容器210的内部容积212可以为10L-60L，例如11L-46L。此外，在其中灌注生物反应器420具有2000L的工作容积422且以40L-160L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为600mL-14L，例如700mL-2.8L，并且处理容器210的内部容积212可以为44L-250L，例如46L-180L。
还例如，回到图8，考虑在其操作期间通过初始混合容器320间接连接至灌注生物反应器420的装置310，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至包括色谱基质524的色谱柱520，进行色谱分离，然后流至初始混合容器320，色谱柱520的内部容积522可以比灌注生物反应器420的工作容积422少约100倍。此外，预处理容纳库340的内部容积342和处理容器210的内部容积212可以缩小10倍-40倍，只要将生物制品更高度浓缩。因此，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有在100L-2000L的范围中的工作容积422且以2L-160L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有1L-20L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为0.63mL-1.4L，并且处理容器210的内部容积212可以为200mL-25L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有100L的工作容积422且以2L-8L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有1L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为0.63mL-70mL，例如0.75mL-14mL，并且处理容器210的内部容积212可以为200mL-2L，例如230mL-1.5L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有500L的工作容积422且以10L-40L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有5L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为4mL-350mL，例如4.5mL-70mL，并且处理容器210的内部容积212可以为250mL-6L，例如280mL-4.6L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有2000L的工作容积422且以40L-160L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有20L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为15mL-1.4L，例如17.5mL-280mL，并且处理容器210的内部容积212可以为1.1L-25L，例如1.2L-18L。
如上文提到的，预处理检测室330可以是例如其中pH探针、电导率探针或温度探针与处理组合物接触的室，或者其中处理组合物可以进行分光光度或光谱分析的室。如图5所示，装置310可以进一步包括附加至它的预处理检测器335，例如附加至预处理检测室330。预处理检测器335可以是例如pH计、电导率计、温度计、分光光度装置、光谱装置，其可以用来在组合物流过预处理检测室330时测量处理组合物的特征。如上文讨论的，这可以用来例如确定处理组合物的特征，如pH、电导率、温度、分光光度特征、光谱特征，有助于确认处理组合物具有预定特性。
如图5所示，装置310可以进一步包括合并前检测室360，例如直接或间接流体连接至初始混合容器320，包括生物制品的组合物在添加至初始混合容器320之前流过它。合并前检测室360可以是例如其中pH探针、电导率探针或温度探针与包括生物制品的组合物接触的室，或者其中包括生物制品的组合物可以进行分光光度或光谱分析的室。此外，装置310可以进一步包括附加至它的合并前检测器365，例如附加至合并前检测室360。合并前检测器365可以是例如pH计、电导率计、温度计、分光光度装置、光谱装置，其可以用来在组合物流过合并前检测室360时测量包括生物制品的组合物的特征。如上文讨论的，这可以是有用的，例如，以便提供基线用于与通过预处理检测器335确定的相应部分的处理组合物的特征进行比较。
在本公开的第三方面，如图1所示，参考图5，提供一种在制造生物制品期间使用装置310连续灭活病毒的方法。所述方法包括步骤(1)110，在初始混合容器320中合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物。所述方法还包括步骤(2)120，在处理组合物通过预处理检测室时330，确认处理组合物表现出预定特性。所述方法还包括步骤(3)130，通过预处理容纳库340将处理组合物转移至处理容器210，转移发生在入口220处。所述方法还包括步骤(4)140，在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴270流动并与静态混合器240接触，预定温度和预定速度的组合足基于预定特性以导致在处理组合物中的病毒灭活。所述方法还包括步骤(5)150，在出口220处从处理容器210收集处理组合物。按照所述方法，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150连续进行。
在制造生物制品期间使用装置310连续灭活病毒的方法可以如上文对在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法一般描述的进行。因此，例如，处理组合物的预定特性可以包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个。还例如，病毒灭活试剂可以包括以下至少一种：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)具有发色基团的非离子去污剂，所述发色基团具有230nm-600nm的吸收峰。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸、甘氨酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。
还例如，预定温度和预定速度的组合可以足够导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。还例如，预定温度可以是17-40℃，而预定速度可以是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时。还例如，处理容器210的内部容积212可以足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中具有比导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。
还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行至少1小时。还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行，不仅在生物制品的整个制造期间，而且与制造生物制品期间通过生命系统实际产生生物制品(例如在灌注生物反应器420中连续培养期间)同时且连续。还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(3)130期间不转移。还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)150期间不收集。
在本公开的第四方面，如图7所示，提供一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的系统410。系统410包括灌注生物反应器420和在制造生物制品期间连续灭活病毒的装置310。
按照系统410，装置310包括初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340、排水阀350和处理容器210。处理容器210包括入口220、出口230和静态混合器240。入口220和出口230位于处理容器210的长轴270的相对末端，即入口端250和出口端260。静态混合器240沿长轴270在处理容器210的内部。初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340和处理容器210各自具有内部容积，即分别为内部容积322、332、342和212，并且流体串联连接，例如直接或间接，从而流体可以内部流动，并且至少从初始混合容器320单向流至预处理检测室330，然后流至预处理容纳库340，然后流至处理容器210。分别如图5和图6所示，排水阀350连接至预处理容纳库340和处理容器210的入口220且位于预处理容纳库340和处理容器210的入口220之间，或者连接至处理容器210的出口230。预处理容纳库340的内部容积342比处理容器210的内部容积212的比例为0.003-0.06。
如上文提到的，分别如图5和图6所示，排水阀350连接至预处理容纳库340和处理容器210的入口220且位于预处理容纳库340和处理容器210的入口220之间，或者连接至处理容器210的出口230。同样，排水阀350可以用来转走处理组合物，例如如果不能确认处理组合物表现出预定特性。
还如上文提到的，预处理容纳库340的内部容积342比处理容器210的内部容积212的比例为0.003-0.06。同样，按照这个比例，当处理容器210用来导致灭活处理组合物中的病毒时，使得预定温度为17-40℃，并且预定速度是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时，然后处理组合物在预处理容纳库340中的停留时间为约1-5分钟。
还按照系统410，灌注生物反应器420和装置310通过初始混合容器320例如直接或间接连接。而且，灌注生物反应器420具有比处理容器的内部容积大5-2400倍的工作容积422。
例如，如图7所示且如上文讨论的，在操作灌注生物反应器420期间，可以将装置310通过初始混合容器320例如直接或间接连接至灌注生物反应器420，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至初始混合容器320而不首先进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离。按照这个实例，灌注生物反应器420可以具有比处理容器的内部容积大5-60倍的工作容积422。
还例如，如图8所示且如上文讨论的，在其操作期间，可以将装置310通过初始混合容器320间接连接至灌注生物反应器420，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至至少一个加工设备，例如具有内部容积522且包括色谱基质524的色谱柱520，进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离，然后流至初始混合容器320。按照这个实例，灌注生物反应器420可以具有比处理容器的内部容积大50-2400倍的工作容积422。同样，色谱基质524可以是例如蛋白A抗体亲和色谱基质或阴离子交换色谱基质等其他合适的基质。
如图7和图8所示，系统410还可以进一步包括罐430，用于将包括病毒灭活试剂的组合物供应至初始混合容器320。罐430可以连接至初始混合容器320。系统410还可以进一步包括一个或多个泵440，例如位于灌注生物反应器420和/或色谱柱520和初始混合容器320之间，以便控制包括生物制品的组合物流至装置310，和/或位于罐430和初始混合容器320之间，以便控制包括病毒灭活试剂的组合物流至初始混合容器320，等等其他位置。一个或多个泵440可以用来控制包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物至初始混合容器320的相对流速，因此控制用来制备处理组合物的每个的相对比例，此外可以用来控制处理组合物通过装置310的流速，以便协调在灌注生物反应器420中产生生物制品和通过使用装置310灭活病毒。
如图9和图10所示，系统410还可以进一步包括初始混合前容器432和罐434，用于将包括化合物的组合物供应至初始混合前容器432，所述化合物包括pH敏感基团。包括pH敏感基团的化合物可以是不包括在提供的包括生物制品的组合物中的化合物，而是随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，用于测量处理组合物的光谱特征，例如外在发色化合物，其中光谱特征指示处理组合物的pH。罐434可以连接至初始混合前容器432。系统410还可以进一步包括一个或多个泵440，例如位于灌注生物反应器420和/或色谱柱520和初始混合前容器432之间，以便控制包括生物制品的组合物流至装置310，和/或位于罐434和初始混合前容器432之间，以便控制包括化合物(包括pH敏感基团)的组合物流至初始混合前容器432，等等其他位置。一个或多个泵440可以用来控制包括生物制品的组合物和包括化合物(包括pH敏感基团)的组合物至初始混合前容器432的相对流速，因此控制用来制备处理组合物的每个的相对比例。例如，对于随后添加至包括生物制品的组合物中以及包括在包括病毒灭活试剂的组合物中的包括pH敏感基团的化合物，一个或多个泵440可以用来确保制备处理组合物包括恒定浓度的pH敏感基团，因此限制由于pH敏感基团的浓度变化可能出现的处理组合物光谱特征的可变性。
系统410的装置310及其初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340、排水阀350和处理容器210可以像上文一般描述的装置310及其初始混合容器320、预处理检测室330、预处理容纳库340、排水阀350和处理容器210。因此，例如，如上文讨论的，初始混合容器320可以是适合合并包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物以获得具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物的容器，并且如上文所述，可以包括一个或多个初始混合器324。还例如，预处理检测室330可以是例如其中pH探针、电导率探针或温度探针与处理组合物接触的室，或者其中处理组合物可以进行分光光度或光谱分析的室。还例如，预处理容纳库340可以是适合允许在入口220处将处理组合物转移至处理容器210的库，例如，基于处理组合物在压力下从如上文所述的预处理检测室330流至处理容器210，如上文提到的，预处理容纳库340例如直接或间接流体连接至预处理检测室330和处理容器210，并且位于其之间。还例如，如图2所示，处理容器210可以是例如柱或管等其他形式，分别如图2、图3和图4所示，处理容器210可以具有例如线性、曲线或螺旋等其他形状，因此可以具有也是例如线性、曲线或螺旋等其他类型的长轴270，并且处理容器210可以由例如金属、塑料或它们的组合等其他材料制成。还例如，如图5所示，处理容器210可以用来在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物沿长轴270以预定速度流动并接触静态混合器240，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。还例如，可以在出口230处从处理容器210收集处理组合物。
如上文讨论的，可以配置装置310用于在制造生物制品期间连续灭活病毒，例如基于连接至灌注生物反应器420。此外，可以制备或选择预处理容纳库340和处理容器210，从而它们各自的内部容积342和212与装置310连接的灌注生物反应器420和操作灌注生物反应器420的灌注速度在尺寸上成比例。
例如，回到图7且如上文讨论的，考虑在操作灌注生物反应器420期间通过初始混合容器320例如直接或间接连接至灌注生物反应器420的装置310，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至初始混合容器320而不首先进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离，其中灌注生物反应器420具有在100L-2000L的范围中的工作容积422，并且以2L-160L/小时的速度操作，预处理容纳库340的内部容积342可以为25mL-14L，而处理容器210的内部容积212可以为8L-250L。此外，在其中灌注生物反应器420具有100L的工作容积422且以2L-8L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为25mL-700mL，例如30mL-140mL，并且处理容器210的内部容积212可以为8L-20L，例如9L-15L。此外，在其中灌注生物反应器420具有500L的工作容积422且以10L-40L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为160mL-3.5L，例如180mL-700mL，并且处理容器210的内部容积212可以为10L-60L，例如11L-46L。此外，在其中灌注生物反应器420具有2000L的工作容积422且以40L-160L/小时的速度操作的一些实例中，预处理容纳库340的内部容积342可以为600mL-14L，例如700mL-2.8L，并且处理容器210的内部容积212可以为44L-250L，例如46L-180L。
还例如，回到图8且如上文讨论的，考虑在其操作期间通过初始混合容器320间接连接至灌注生物反应器420的装置310，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至包括色谱基质524的色谱柱520，进行色谱分离，然后流至初始混合容器320，色谱柱520的内部容积522可以比灌注生物反应器420的工作容积422少约100倍。此外，预处理容纳库340的内部容积342和处理容器210的内部容积212可以缩小10倍-40倍，只要将生物制品更高度浓缩。因此，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有在100L-2000L的范围中的工作容积422且以2L-160L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有1L-20L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为0.63mL-1.4L，并且处理容器210的内部容器212可以为200mL-25L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有100L的工作容积422且以2L-8L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有1L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为0.63mL-70mL，例如0.75mL-14mL，并且处理容器210的内部容器212可以为200mL-2L，例如230mL-1.5L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有500L的工作容积422且以10L-40L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有5L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为4mL-350mL，例如4.5mL-70mL，并且处理容器210的内部容积212可以为250mL-6L，例如280mL-4.6L。此外，在一些实例中，其中灌注生物反应器420具有2000L的工作容积422且以40L-160L/小时的速度操作，并且进一步地其中色谱柱520具有20L的内部容积522，预处理容纳库340的内部容积342可以为15mL-1.4L，例如17.5mL-280mL，并且处理容器210的内部容积212可以为1.1L-25L，例如1.2L-18L。
系统410可以包括一个以上的装置310，例如2个装置310、3个装置310或3个以上的装置310。例如，如图11所示，系统410可以包括两个装置310，例如第一装置310，其病毒灭活试剂是如上文讨论的有机酸和/或氨基酸，以及第二装置310，其病毒灭活试剂是也如上文讨论的去污剂。因此，系统410可以用来进行两轮病毒灭活，第一轮对应于用有机酸和/或氨基酸灭活，而第二轮对应于用去污剂灭活。当以这个顺序进行时，两轮病毒灭活可以独立验证，特别是如果在第一轮之后和第二轮之前中和处理组合物，或者如果用于第二轮的包括病毒灭活试剂的组合物，即包括去污剂的组合物也补充了碱以中和处理组合物。此外，当以这个顺序进行时，在第二轮中使用的去污剂在第一轮中不会存在，因此不会干扰在第一轮中通过有机酸灭活的验证。还例如，系统410还可以包括两个装置310，例如第一装置310，其病毒灭活试剂为去污剂，以及第二装置310，其病毒灭活试剂为有机酸和/或氨基酸。因此，系统410也可以用来进行两轮病毒灭活，第一轮对应于用去污剂灭活，而第二轮对应于用有机酸和/或氨基酸灭活。
回到图8，如上文提到的，在其操作期间，可以将装置310通过初始混合容器320间接连接至灌注生物反应器420，从而包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420流至至少一个加工设备，例如具有内部容积522且包括色谱基质524的色谱柱520，进行加工步骤，如过滤、沉淀和/或色谱分离，然后流至初始混合容器320。在其中系统410包括一个以上的装置310的一些实例中，在灌注生物反应器420和初始混合容器320之间有一个或多个加工设备，例如一个或多个色谱柱520。可选地或额外地，在其中系统410包括一个以上的装置310的一些实例中，在两个或更多个装置310之间有一个或多个加工设备，例如一个或多个色谱柱520。
在本公开的第五方面，如图1所示，参考图7和图8，提供一种在制造生物制品期间使用系统410连续灭活病毒的方法。所述方法包括步骤(0)610，通过初始混合容器320将包括生物制品的组合物从灌注生物反应器420例如直接或间接转移至装置310。所述方法还包括步骤(1)110，在初始混合容器320中合并(a)包括生物制品的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物。所述方法还包括步骤(2)120，在处理组合物通过预处理检测室时330，确认处理组合物表现出预定特性。所述方法还包括步骤(3)130，通过预处理容纳库340将处理组合物转移至处理容器210，转移发生在入口220处。所述方法还包括步骤(4)140，在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴270流动并与静态混合器240接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。所述方法还包括步骤(5)150，在出口220处从处理容器210收集处理组合物。按照所述方法，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150连续进行。
在制造生物制品期间使用系统410连续灭活病毒的方法可以如上文对在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法一般描述的进行。因此，例如，处理组合物的预定特性可以包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个。还例如，病毒灭活试剂可以包括以下至少一种：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)具有发色基团的非离子去污剂，所述发色基团具有230nm-600nm的吸收峰。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸、甘氨酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括生物制品的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括生物制品的组合物中)，随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。
还例如，预定温度和预定速度的组合可以足够导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。还例如，预定温度可以是17-40℃，而预定速度可以是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时。还例如，处理容器210的内部容积212可以足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中具有比导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。
还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行至少1小时。还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行，不仅在生物制品的整个制造期间，而且与制造生物制品期间通过生命系统实际产生生物制品(例如在灌注生物反应器420中连续培养期间)同时且连续。还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(3)130期间不转移。还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)150期间不收集。
在第六方面，提供一种制备感兴趣的蛋白的方法。所述方法包括步骤(I)，在培养基中培养宿主细胞，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白。
感兴趣的蛋白可以是例如上文提到的任何蛋白，例如治疗性蛋白，如抗体、抗体片段、抗体衍生物、细胞因子、生长因子、激素、酶或凝血因子等，或者疫苗蛋白，如抗原蛋白等。
例如，感兴趣的蛋白可以是抗体、抗体片段或抗体衍生物。还例如，抗体、抗体片段或抗体衍生物可以选自抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、哺乳动物抗体、小鼠抗体、灵长类抗体、人抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链、抗体片段、抗体衍生物、Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fc-Fc融合蛋白、Fv片段、单链Fv片段、单结构域Fv片段、四价单链Fv片段、二硫键连接的Fv片段、双抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabody)、pentabody、微抗体、微型抗体、免疫球蛋白单可变结构域、免疫球蛋白单可变重链结构域、免疫球蛋白单可变轻链结构域、VHH结构域、人源化的VHH结构域、单结构域抗体、包括以模块形式与另一免疫球蛋白单可变结构域或功能结构域连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白、包括以模块形式连接在一起的两个或更多个相同的免疫球蛋白单可变结构域的多价蛋白、包括以模板形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双异位蛋白、包括以模块形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双特异性蛋白、包括以模块形式连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域和功能结构域的双功能蛋白、结构域缺失的抗体、抗体片段与另一肽或多肽的融合多肽、Fc-肽融合物、Fc-毒素融合物、以及抗体片段与支架蛋白的融合物。
如本领域公知的，抗体是特异性地结合至特定底物，即它们的底物的的蛋白，抗体一般享有相似的整体结构，即免疫球蛋白结构，并且每个特定抗体分子具有独特的结构，允许特定抗体特异性地结合至其相应抗原。示例性抗体例如由Murphy et al.,Janeway’sImmunobiology,7th edition,Garland Science,New York(2008)描述。还如公知的，抗体可以对应于单克隆抗体或多克隆抗体，取决于抗体是怎样产生的，可以对应于哺乳动物抗体、小鼠抗体、灵长类抗体或人抗体，取决于衍生或可以衍生抗体的生物体，可以对应于嵌合抗体、灵长类化抗体或人源化抗体，取决于抗体是否已修饰以使抗体更适合用于特定生物体，并且可以对应于免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链或者免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链等，取决于抗体的结构，例如Tamashiro et al.,Monoclonal Antibodies,pp.409-433,in Animal Cell Technology:From Biopharmaceuticals to Gene Therapy(eds.Castilho et al.),Taylor&Francis Group,New York(2008)等所述。
还如公知的，抗体片段和抗体衍生物可以制备自抗体。例如，Fab片段(也称作抗原结合片段)由通过相邻恒定区维持在一起的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链各自的可变区组成。Fab片段可以通过蛋白酶消化，例如用木瓜蛋白酶形成自常规抗体，或者可以通过遗传工程形成。相似地，F(ab')2片段包括也通过相邻恒定区维持在一起的两条重链和两条轻链各自的可变区。F(ab')2片段可以通过胃蛋白酶进行蛋白酶切割来制备。
此外，利用遗传工程方法，可以产生仅由重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成的缩短的抗体片段，称作Fv片段(也称作可变片段)。因为Fv片段缺少免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的恒定区而因此缺少其半胱氨酸之间的共价键合，所以Fv片段常常会被稳定化。例如，使用短肽连接重链和轻链的可变区以稳定Fv片段是有利的。短肽可以包括例如10-30个氨基酸，优选15个氨基酸。这样，获得由通过肽接头连接的VH和VL组成的单肽。这种抗体蛋白已知为单链Fv(也称作scFv)。示例性的这种scFv-抗体蛋白由Huston et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85:5879-5883(1988)描述。
此外，最近几年已开发各种策略将scFv制备为多聚体衍生物。特别地，这是为了导致具有改进的药物动力学和生物分布特性以及增加的结合活性的重组抗体。为了实现scFv的多聚化，将scFv制备为与多聚化结构域的融合蛋白。多聚化结构域可以是例如免疫球蛋白G(也称作IgG)的CH3区或者卷曲结构(螺旋结构)如亮氨酸拉链结构域。还有这样的策略，其中将scFv的VH/VL区之间的相互作用用于多聚化，例如双抗体、三链抗体和五抗体(pentabody)等。
因此，例如，双抗体是二价同源二聚scFv衍生物。将scFv分子中的接头缩短至5-10个氨基酸导致形成同源二聚体，其中发生链间VH/VL-叠加。可以通过并入二硫键额外地稳定双抗体。示例性双抗体例如由Perisic et al.,Structure 2:1217-1226(1994)描述。
还例如，三链抗体是三价同源三聚scFv衍生物。其中VH-VL直接融合没有接头序列的ScFv衍生物导致三聚体的形成。示例性三链抗体例如由Kortt et al.,ProteinEngineering 10:423-433(1997)描述。
还例如，微抗体是二价同源二聚scFv衍生物。微抗体由融合蛋白组成，其包含免疫球蛋白，优选IgG，最优选IgG1的CH3区，作为通过铰链区(例如也来自IgG1)和接头区连接至scFv的多聚化区。示例性微抗体抗体蛋白由Hu et al.,Cancer Research 56:3055-3061(1996)描述。
还例如，微型抗体是具有二价、三价或四价结构的scFv衍生物。微型抗体多聚化通过二聚、三聚或四聚卷曲结构进行，例如Lovejoy et al.,Science 259:1288-1293(1993),Pack et al.,Biotechnology 11:1271-1277(1993)和Pack et al.,Journal ofMolecular Biology 246:28-34(1995)公开的。
抗体片段和抗体衍生物还包括例如免疫球蛋白单可变结构域。免疫球蛋白单可变结构域可以是例如免疫球蛋白单可变重链结构域(也称作VH结构域)或免疫球蛋白单可变轻链结构域(也称作VL结构域)，如Ward et al.,Nature 341:544-546(1989)描述的。免疫球蛋白单可变结构域还可以是例如VHH结构域，衍生自骆驼重链抗体，如Hamers-Castermanet al.,Nature 363:446-448(1993)描述的，优选人源化VHH结构域。免疫球蛋白单可变结构域还可以是例如单结构域抗体。免疫球蛋白单可变结构域还可以是例如包括一个免疫球蛋白单可变结构域的NANOBODY(R)(Ablynx N.V.拥有的商标)治疗性蛋白。
抗体片段和抗体衍生物还包括例如以模块形式与另一免疫球蛋白单可变结构域或功能结构域连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域。这类蛋白的实例包括：多价蛋白，其包括以模块形式连接在一起的两个或更多个相同的免疫球蛋白单可变结构域，例如两个或更多个相同的VHH结构域；双异位蛋白，其包括以模块形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单结构域，例如两个不同的VHH结构域，各自识别相同抗原上的不同表位；以及双特异性蛋白，其包括以模块形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域，例如两个不同的VHH结构域，各自识别不同的抗原。这类蛋白的实例还包括双功能蛋白，其包括以模块形式连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域和功能结构域。实例还包括NANOBODY(R)多价、双异位、双特异性和双功能治疗性蛋白，
抗体片段和抗体衍生物还包括例如抗体片段和支架蛋白的融合物，即包括融合形成单多肽链的抗体片段和支架蛋白的蛋白。在这种情况下，支架蛋白可以是例如通过基因克隆或通过共翻译加工与抗体片段偶联的另一蛋白的任何功能结构域。
考虑其他类型的蛋白，感兴趣的蛋白可以是例如胰岛素，胰岛素样生长因子，hGH，tPA，细胞因子，如白介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ，肿瘤坏死因子(TNF)，如TNFα和TNFβ、TNFγ，TRAIL，或者G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1或VEGF。感兴趣的蛋白还可以是例如促红细胞生成素或任何其他激素生长因子。感兴趣的蛋白还可以是例如DARPin。
宿主细胞可以是例如上文提到的任何细胞，例如哺乳动物细胞、植物细胞或细菌细胞等。宿主细胞可以是例如仓鼠细胞，如BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1或CHO-DG44细胞或者这样的细胞系的衍生物/子代。宿主细胞还可以是例如小鼠骨髓瘤细胞细胞，例如NSO和Sp2/0细胞或者这样的细胞系的衍生物/子代。宿主细胞还可以是例如这些细胞的衍生物/子代，其他哺乳动物细胞，包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿动物细胞系，或者其他真核细胞，包括但不限于酵母细胞和昆虫细胞。示例性宿主细胞由Léo et al.,Animal Cells:Basic Concepts,pp.13-37,in Animal Cell Technology:FromBiopharmaceuticals to Gene Therapy(eds.Castilho et al.),Taylor&Francis Group,New York(2008)等描述。
培养基可以是例如可商购的培养基，如Ham's F12(Sigma,Deisenhofen,Germany)、RPMI-1640(Sigma)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Sigma)、最低必需培养基(MEM；Sigma)、Iscove's改良达尔伯克培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、CHO-S-Invitrogen)、不含血清的CHO培养基(Sigma)以及不含蛋白的CHO培养基(Sigma)。任何培养基可以在需要时补充各种化合物，其实例包括激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效的能源、抗生素、痕量元素。还可以以适当浓度包括任何其他必需的补充物。示例性培养基例如由Moraes et al.,Culture Media for Animal Cells,pp.111-128,in Animal CellTechnology:From Biopharmaceuticals to Gene Therapy(eds.Castilho et al.),Taylor&Francis Group,New York(2008)等描述。
通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白可以包括在宿主细胞内转录和/或翻译编码感兴趣的蛋白的核酸序列。感兴趣的蛋白的表达水平可以例如在宿主细胞中存在的编码感兴趣的蛋白的相应mRNA的量、宿主细胞中存在的感兴趣的蛋白的量或者从宿主细胞分泌的感兴趣的蛋白的量等的基础上确定。例如，相应mRNA可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、原位杂交至细胞RNA或RT-PCR等其他方法定量，如Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2d edition,New York,Cold Spring Laboratory Press(1989)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,(1987-2014)等描述的。还例如，宿主细胞中存在或从其分泌的感兴趣的蛋白的量可以通过各种方法定量，例如通过ELISA、、蛋白印迹、放射免疫测定、免疫沉淀、测定蛋白的生物活性、蛋白免疫染色然后FACS分析或均相时间分辨荧光(HTRF)测定等其他方法，同样如Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1987-2014)等描述的。
按照步骤(I)，在培养基中培养宿主细胞，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白，可以通过上文提到的用于制备生物制品的任何方法进行，例如均质方法，例如基于使用搅拌槽式生物反应器、气升式生物反应器或波浪式生物反应器的悬浮培养，或者异质方法，例如基于微载体系统、填充床生物反应器或中空纤维生物反应器的贴壁培养，以不连续模式进行，例如分批培养或补料分批培养，或者以连续模式进行，例如灌注连续培养，并且以任何合适的规模进行，例如实验室、试验或生产规模。示例性方法例如由Véliz et al.,Bioreactorsfor Animal Cells,pp.221-258,in Animal Cell Technology:From Biopharmaceuticalsto Gene Therapy(eds.Castilho et al.),Taylor&Francis Group,New York(2008)等描述。
所述方法还包括至少一个步骤(II)，在制备感兴趣的蛋白期间连续灭活病毒。
回到图1和图2，如上文所述，步骤(II)包括步骤(1)110，合并(a)包括感兴趣的蛋白的组合物和(b)包括病毒灭活试剂的组合物，以便获得(c)具有用于灭活病毒的预定特性的处理组合物，生物制品是感兴趣的蛋白。步骤(II)还包括步骤(2)120，确认所述处理组合物表现出预定特性。步骤(II)还包括步骤(3)130，将处理组合物转移至包括入口220、出口230和静态混合器240且具有内部容积212的处理容器210，入口220和出口230位于处理容器210的长轴270的相对末端，即入口端250和出口端260，而静态混合器240沿长轴270在处理容器210的内部，并且转移发生在入口220处。步骤(II)还包括步骤(4)140，在预定温度下于处理容器210中温育处理组合物，同时处理组合物以预定速度沿长轴270流动并与静态混合器240接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活。步骤(II)还包括步骤(5)150，在出口230处从处理容器210收集处理组合物。
按照所述方法，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150连续进行，即每个步骤对包括感兴趣的蛋白的组合物、包括病毒灭活试剂的组合物和处理组合物的不同部分同时进行至少一段时间。例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行至少1小时、至少4小时、至少12小时、至少24小时、至少3天、至少10或至少30天等其他时间。还例如，步骤(1)110、步骤(2)120、步骤(3)130、步骤(4)140和步骤(5)150可以连续进行，不仅在感兴趣的蛋白的整个制造期间，而且与步骤(I)的培养同时且连续，即在培养基中培养宿主细胞，通过宿主细胞表达所灌注的蛋白。
步骤(II)可以如上文对在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法一般描述的进行。因此，例如，处理组合物的预定特性可以包括(a)3.0-3.8的pH或(b)0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度中的至少一个。还例如，病毒灭活试剂可以包括以下至少一种：(a)酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团，或者(b)具有发色基团的非离子去污剂，所述发色基团具有230nm-600nm的吸收峰。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的有机酸、乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括感兴趣的蛋白的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括感兴趣的蛋白的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括感兴趣的蛋白的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括感兴趣的蛋白的组合物中)，随后添加至包括感兴趣的蛋白的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团的氨基酸、甘氨酸或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括3.0-3.8的pH。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的电导率，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括感兴趣的蛋白的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括感兴趣的蛋白的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的分光光度特征，其中包括病毒灭活试剂的组合物还包括与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包括感兴趣的蛋白的组合物包括pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物(不包括在提供的包括感兴趣的蛋白的组合物中)，随后添加至包括感兴趣的蛋白的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
还例如，病毒灭活试剂可以是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合，并且处理组合物的预定特性可以包括0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度。按照这个实例，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度。可选地或额外地，步骤(2)120的确认可以包括测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括感兴趣的蛋白的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括感兴趣的蛋白的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。
还例如，预定温度和预定速度的组合可以足够导致在步骤(4)140期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。还例如，预定温度可以是17-40℃，而预定速度可以是0.3-3乘以处理容器210的内部容积212每小时。还例如，处理容器210的内部容积212可以足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中具有比导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的短的停留时间。
还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(3)130期间不转移。还例如，如果在步骤(2)120不能确认处理组合物表现出预定特性，则可以将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)150期间不收集。
所述方法还包括步骤(III)，从培养基回收感兴趣的蛋白。步骤(III)的回收可以例如通过使培养基进行加工步骤来进行，也如上文讨论的，如过滤、沉淀和/或色谱分离等其他方法，从而获得包括如回收的感兴趣的蛋白的组合物。如理解的，在从培养基回收感兴趣的蛋白之前获得在宿主细胞外形式的感兴趣的蛋白一般是可取的。这可以例如通过以分泌自宿主细胞的形式表达感兴趣的蛋白来完成，从而在步骤(I)表达感兴趣的蛋白之后包括宿主细胞的一部分培养基已包括分泌形式的感兴趣的蛋白，因此在步骤(III)的回收之前，感兴趣的蛋白在宿主细胞外。这还可以例如通过在步骤(III)期间破坏一部分培养基中存在的宿主细胞来完成，例如基于通过酶促降解、化学溶解或自溶的进行细胞裂解，和/或通过使用桨式匀浆器进行物理破坏等其他方法，导致从一部分培养基中的宿主细胞释放感兴趣的蛋白，同样感兴趣的蛋白因此在宿主细胞外。
如上文提到的，所述方法包括至少一个步骤(II)，在制备感兴趣的蛋白期间连续灭活病毒。例如，步骤(II)可以在步骤(I)和步骤(III)之间进行和/或在步骤(III)之后进行。还例如，步骤(II)可以进行1次、2次、3次、4次或更多次。
因此，在一些实例中，步骤(II)仅在步骤(I)和步骤(III)之间进行。例如，可以将宿主细胞在培养基中培养，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白并将感兴趣的蛋白分泌入培养基。然后包括感兴趣的蛋白的一部分培养基可以连续进行病毒灭活，例如在培养继续时，之后从培养基回收感兴趣的蛋白，例如通过柱色谱，从而获得包括如回收的感兴趣的蛋白的组合物。按照这些实例，步骤(II)可以在步骤(I)和步骤(III)之间进行1次、2次、3次、4次或更多次。如上文讨论的，这可以基于例如由于在步骤(2)不能确认处理组合物表现出预定特性而转走处理组合物期间中止步骤(II)，然后重新开始步骤(II)。也如上文讨论的，这还可以基于例如包括两轮病毒灭活的方法，第一轮对应于用有机酸灭活，而第二轮对应于用去污剂灭活，两轮均在步骤(I)和步骤(III)之间进行。
还在一些实例中，步骤(II)仅在步骤(III)之后进行。例如，可以将宿主细胞在培养基中培养，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白并将感兴趣的蛋白分泌入培养基。然后可以例如通过柱色谱从一部分培养基回收感兴趣的蛋白，从而获得包括如回收的感兴趣的蛋白的组合物，之后使包括如回收的感兴趣的蛋白的组合物连续进行病毒灭活，例如在培养继续时。按照这些实例，步骤(II)还可以在步骤(III)之后进行1次、2次、3次、4次或更多次。同样，这可以基于例如由于在步骤(2)不能确认处理组合物表现出预定特性而转走处理组合物期间中止步骤(II)，然后重新开始步骤(II)。这还可以基于例如包括两轮病毒灭活的方法，第一轮对应于用有机酸灭活，而第二轮对应于用去污剂灭活，两轮均在步骤(III)之后进行。
还在一些实例中，步骤(II)在步骤(I)和步骤(III)之间以及步骤(III)之后进行。例如，可以将宿主细胞在培养基中培养，通过宿主细胞表达感兴趣的蛋白并将感兴趣的蛋白分泌入培养基，进行病毒灭活，然后回收，然后进一步灭活病毒，在回收蛋白之前和之后灭活病毒同样连续进行，例如在培养继续时。按照这些实例，如上文讨论的，如果需要，步骤(II)还可以在步骤(I)和步骤(III)之间进行1次、2次、3次、4次或更多次，并且如果需要，还可以在步骤(III)之后进行1次、2次、3次、4次或更多次。
实施例1
在制造生物制品期间连续灭活病毒的实例系统710如图12所示。系统710包括串联的100L灌注生物反应器715(也称作“100L BRX”)、如上文所述通过使用去污剂连续灭活病毒的装置720(也称作“Detergnt Inactvn”或“去污剂灭活”)、用于1L蛋白A抗体亲和色谱的设备725(也称作“1L PrA”)、缓冲袋(surge bag)设备730(也称作“缓冲袋”)、用于1L阴离子交换色谱的设备735(也称作“1L AEX”)、病毒过滤设备740(也称作“VRF”)、超滤设备745(也称作“UF”)和渗滤设备750(也称作“DF”)，其之间分布有泵和阀设备。系统710由溶液库(solution farm)755供应，并且位于滑道760上。系统710可以用来产生约30-80kg的生物制品765/年。通过使用去污剂连续灭活病毒的装置720可以如上文所述使用。还可以修改系统710以进一步包括通过使用有机酸连续灭活病毒的装置(“酸灭活”)，也如上文所述，该装置与其他元件串联，并且位于(i)100L灌注生物反应器和去污剂灭活装置之间，(ii)用于1L蛋白A抗体亲和色谱的设备之后，(iii)病毒过滤设备之前，或者(iv)病毒过滤设备之后。
在制备生物制品的常规方法中，酸灭活作为分批步骤以不连续模式进行，在也是作为分批步骤以不连续模式进行的蛋白A抗体亲和色谱步骤之后。相比之下，对于如本文公开的连续加工，优选酸灭活接近连续步骤进行，即与连续步骤结合进行。因此，例如，因为从灌注生物反应器收获培养物连续进行，所以接近收获进行病毒的酸灭活是有利的，因此在灌注收获之后和任何不连续步骤之前。此外，病毒过滤、超滤和渗滤也可以连续进行，并且如果这样做，接近病毒过滤、超滤或渗滤进行酸灭活也是有利的。
在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法、装置和系统可以用来协调在生物反应器中生物制品的产生和包括生物制品的组合物中的病毒的灭活。按照所述方法使用处理容器确保使具有灭活病毒的预定特性的处理组合物进行充分处理以完成病毒灭活至期望程度，包括负责并最小化轴向分散。此外，装置和系统的整体配置允许不同方法用于确认处理组合物具有预定特性，以及如果未确认处理组合物具有预定特性，用于转走相应部分的处理组合物。此外，使用所述有机酸用于病毒灭活允许充分缓冲处理组合物而不需要包括大量的有机酸，并且允许中和处理组合物而不需要额外的离子(否则将不需要)。此外，进行两轮病毒的灭活，第一对应于用有机酸灭活，而第二步对应于用去污剂灭活，允许独立验证两轮灭活。
实施例2
背景
在制造生物制品期间于低pH下连续灭活病毒的方法期间需要准确测量对应于产品流的处理组合物的pH，最初是为了确保产品流的pH降至足够低，一般至3.0-3.8的pH，以便灭活病毒，然后是为了确保处理组合物的pH升至足够高，一般至5.0-8.5的pH，以便中和产品流准备随后的纯化步骤。特别地关于测量较低范围中的pH的准确性，例如，约0.05-0.15pH单位或约0.10pH单位的准确性是合适的。
测量产品流的pH的一种方式是使用普通的电位pH探针。这类探针倾向于校准漂移并且随时间反应速度缓慢，然而，两者导致pH测量的误差。每日适当校准探针可以克服校准漂移，同时维持下游操作的无菌性，但是其需要劳动、时间，可以是机械复杂的，并且是潜在的误差来源。差的反应速度不容易克服。因此，普通的电位pH探针并不适合用于连续下游加工的系统。
测量产品流的pH的一种可选方式是测量产品流中pH敏感的光谱信号。如果光谱信号来自产品流中已存在的发色化合物，例如在如提供的包括生物制品的组合物中，例如生物制品或缓冲液，则可以认为化合物是内在发色化合物。使用内在发色化合物可以是有利的，因为可以光谱测量产品流的pH而不需要向产品流添加任何无关化合物。可选地或额外地，如果光谱信号来自特别添加至产品流以提供光谱信号的发色化合物，例如化合物不包括的如提供的包括生物制品的组合物中，而是随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，则可以认为化合物是外在发色化合物。特别地关于外在发色化合物，合适的外在发色化合物可以是例如列为FDA批准的GRAS物质和/或FDA批准的非活性成分的化学品。使用是FDA批准的GRAS物质和/或FDA批准的非活性成分的外在发色化合物可以是有利的，基于最小化向其给药最终药物制品的患者的风险。这是因为即使最终药物制品可能包含痕量的外在发色化合物，但是最终药物制品对于患者仍然是安全的。
实验证据确认利用内在发色化合物的光谱PH测量的可行性
图13示出在制造生物制品期间于低pH下连续灭活病毒的方法的过程流程图805(也称作“PFD”)，包括测量内在发色化合物的光谱信号以测量pH。如图所示，过程流程图805包括步骤810，提供包括来自生物反应器或纯化柱的生物制品的产品流；步骤815，在添加灭活酸之前使用光谱探针测量pH；步骤820，添加灭活酸；步骤822，混合；步骤825，使用光谱探针验证范围中的pH；步骤830，如果pH不正确，则转走包括生物制品的产品流；步骤835，在处理容器中处理；步骤840，添加碱用于中和；步骤842，混合；步骤845，使用光谱探针验证中和；步骤850，如果pH不正确，则转走包括生物制品的产品流；一个或多个步骤855，进一步加工，期间基于计算pH的步骤860(基于使用具有多变量模型的计算机)进行步骤815、
步骤825和步骤845。
在表1和图14中提供确认在这个背景下使用内在发色化合物用于测量pH的可行性的证据。
表1.制备用于测试使用内在发色化合物用于测量pH的可行性的样品。
Figure BDA0001179954120000511
具体地，如表1所述，离开蛋白A抗体亲和色谱柱的组合物典型的单克隆抗体的缓冲溶液的7个样品(每个10mL)是用1M乙酸和1M tris碱调整pH的，然后通过添加水来补偿样品的体积。特别地补偿样品体积以归一化单克隆抗体浓度，从而样品之间的任何光谱差异不是由于单克隆抗体浓度的差异。
然后在200-375nm激发(22℃)中于380nm下测量每个样品的荧光发射。然后将可获得自Camo(Oslo,Norway)的UNSCRAMBLER(R)多变量数据分析软件用来通过偏最小二乘的方法(也称作“PLS”)测试荧光光谱和样品pH之间的相关性。结果在图14中示出，其为预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括“模型pH”(实心圆)、“交叉验证pH”(空心圆)和“靶线”(实线)。按照图14，模型pH测量模型拟合实验数据怎样(R2＝0.997)，交叉验证pH测量模型预测实验数据怎样(R2＝0.861)，而靶线标记实际pH和预测pH之间完全一致的点。交叉验证pH的0.861的R2表明模型可以相当好地预测pH。
实验证据确认利用外在发色化合物的光谱PH测量的可行性
图15示出在制造生物制品期间于低pH下连续灭活病毒的方法的过程流程图905，包括测量外在发色化合物的光谱信号以测量pH。如图所示，过程流程图905包括步骤910，提供包括来自生物反应器或纯化柱的生物制品的产品流；步骤911，添加外在发色化合物；步骤912，混合；步骤915，在添加灭活酸之前使用光谱探针测量pH；步骤920，添加灭活酸，如果需要，组合外在发色化合物；步骤922，混合；步骤925，使用光谱探针验证范围中的pH；步骤930，如果pH不正确，则转走包括生物制品的产品流；步骤935，在处理容器中处理；步骤940，添加碱用于组合外在发色化合物中和；步骤942，混合；步骤945，使用光谱探针验证中和；步骤950，如果pH不正确，则转走包括生物制品的产品流；一个或多个步骤955，进一步加工，期间基于计算pH的步骤960(基于使用具有多变量模型的计算机)进行步骤915、步骤925和步骤945。
按照这个过程流程图，测量产品流的初始pH。如果产品流的初始pH对于病毒灭活太高，则添加灭活酸。或者，如果产品流的初始pH对于病毒灭活足够低，则不添加灭活酸。添加灭活酸之后，如果产品流的pH不适合，即太高或太低，则将产品流转至废物。如果产品流的pH适当，则将产品流送至处理容器。在产品流离开处理容器之后，添加中和溶液以将pH提高至适合下游加工中的随后步骤的水平。添加中和溶液之后，如果产品流的pH不适合，即太高或太低，则将产品流转至废物。如果产品流的pH适当，则使产品流进行进一步加工的一个或多个步骤。
如讨论的，在步骤911中，将外在发色化合物添加至产品流中。此外，将外在发色化合物包括在灭活酸的本体溶液中，用于在步骤920中添加。此外，将外在发色化合物包括在用于中和的本体溶液中，用于在步骤940中添加。
在步骤911、步骤920和步骤940中添加的外在发色化合物可以在一个或多个步骤中相同和/或可以在一个或多个步骤中不同。例如，按照一实施方案，在步骤911、步骤920和步骤940中添加的外在发色化合物可以全部相同。还例如，按照另一实施方案，在步骤911和步骤920中添加的外在发色化合物可以是第一发色化合物，即在两步中相同的外在发色化合物，如表现出这样的光谱信号的外在发色化合物，所述光谱信号可用于提供准确测量用于在低pH下灭活病毒的范围内的pH。按照这个实施方案，在步骤940中添加的外在发色化合物可以是第二外在发色化合物，即与第一外在发色化合物不同，如表现出这样的光谱信号的外在发色化合物，所述光谱信号可用于提供准确测量在低pH下灭活病毒之后和进一步加工之前中和的范围内的pH。
外在发色化合物的浓度可以在整个过程流程图中补偿。例如，在步骤920中添加的包括在灭活酸的本体溶液中的外在发色化合物可以浓度为等于或约等于产品流中存在的外在发色化合物的浓度。相似地，在步骤940中添加的包括在中和的本体溶液中的外在发色化合物可以浓度为等于或约等于产品流中存在的外在发色化合物的浓度。通过这样补偿外在发色化合物的浓度，可以实现用来从光谱测量推断产品流的pH的多变量模型的准确性增加。
在表2和图16中提供确认在这个背景下使用外在发色化合物，特别是对应于抗坏血酸和硫胺素的外在发色化合物用于测量pH的可行性的证据。
表2.测试使用外在发色化合物用于测量pH的可行性的结果。
样品# pH
1 3.32
2 3.43
3 3.55
4 3.66
5 3.82
6 3.91
7 4.06
8 4.17
9 4.26
10 4.61
特别地，向离开蛋白A抗体亲和色谱柱的组合物典型的单克隆抗体的缓冲溶液的10个样品(每个8mL)补充了浓缩的抗坏血酸和硫胺素溶液。制备浓缩的抗坏血酸和硫胺素溶液，其包括与单克隆抗体的缓冲溶液相同的缓冲组合物，从而所得的包括抗坏血酸和硫胺素的样品会包括相似的缓冲组合物。对于每个样品，通过添加灭活组合物，特别是2M甘氨酸(pH 2.7)来调整pH，然后通过添加与单克隆抗体的缓冲溶液相同的缓冲组合物来补偿样品的体积，如表2所述。因此，全部10个样品具有等浓度的单克隆抗体、抗坏血酸和硫胺素，以及相似的缓冲组合物，从而样品之间的任何光谱差异不是由于单克隆抗体、抗坏血酸、硫胺素或缓冲组合物的浓度差异。
然后获得每个样品的UV/可见吸收光谱。多变量数据分析软件程序用来通过自助重采样的方法测试光谱和样品pH之间的相关性。结果在图16中示出，其为预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括“模型pH”(实心圆)和“靶线”(实线)。模型pH显示模型拟合实验数据怎样(R2＝0.991)，而靶线标记实际pH和预测pH之间完全一致的点。以95％置信，模型可以预测3.3-4.5的模型范围内的0.104pH单位内的pH。
在表3和图17中提供确认使用外在发色化合物，同样是对应于抗坏血酸和硫胺素的外在发色化合物用于测量pH的可行性的进一步证据。
表3.测试使用外在发色化合物用于测量pH的可行性的进一步结果。
样品# 第1组pH 第2组pH 第3组pH 第4组pH
1 3.33 3.26 3.26 3.31
2 3.43 3.39 3.38 3.49
3 3.56 3.44 3.54 3.60
4 3.64 3.66 3.90 3.70
5 3.78 3.74 3.96 3.81
6 3.90 3.82 4.20 3.90
7 4.06 3.92 4.12 3.98
8 4.12 4.10 4.36 4.04
9 4.26 4.23 4.42 4.35
10 4.63 4.46 4.51 4.42
特别地，向4个样品组补充了浓缩的抗坏血酸和硫胺素溶液，每组包括离开蛋白A抗体亲和色谱柱的组合物典型的单克隆抗体的缓冲溶液的10个样品(每个8mL)，如上文所述制备。同样，所有样品具有等浓度的单克隆抗体、抗坏血酸和硫胺素，以及相似的缓冲组合物，从而样品之间的任何光谱差异不是由于单克隆抗体、抗坏血酸、硫胺素或缓冲组合物的浓度差异。
然后获得每个样品的UV/可见吸收光谱。多变量数据分析软件程序用来通过自助重采样的方法测试第1-3组的光谱和样品pH之间的相关性。结果在图17中示出，其为预测pH(Y-轴)对实际pH(X-轴)的图，包括“模型pH”(实心圆)和“靶线”(实线)。形成6属性模型，显示预测和实际pH之间的良好相关性(R2＝0.994)。如图17所示，该模型用来预测第4样品组的pH，具有在95％置信水平的±0.07pH单位的准确性。不用来产生模型的第4组样品的预测pH是模型质量的最严格测试，并且称作外部验证。
本领域技术人员会清楚可以对所述实施方案进行各种修改和变化而不背离要求保护的方法、装置和系统的精神和范围。因此，目前要求保护的方法、装置和系统覆盖本文所述实施方案的修改和变化，只要它们在所附权利要求和它们的等同物的范围中。
工业实用性
本文公开的方法、装置和系统可用于在制造生物制品期间连续灭活病毒，因此用于改进制造生物制品的工业方法。

Claims (42)

1.一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)合并：
(a)包含生物制品的组合物；以及
(b)包含病毒灭活试剂的组合物，
以获得：
(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物；
(2)确认所述处理组合物表现出所述预定特性；
(3)将所述处理组合物转移至处理容器，所述处理容器包含入口、出口和静态混合器，并且具有内部容积，所述入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端，所述静态混合器沿长轴在处理容器的内部，并且转移发生在入口处；
(4)在预定温度下于处理容器中温育处理混合物，同时处理混合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活；以及
(5)在出口处从处理容器收集处理组合物；
其中步骤(1)-(5)连续进行，
其中所述处理组合物的预定特性包含3.0-3.8的pH，和
其中所述病毒灭活试剂包含：酸，其具有pKa为2.3-4.2的可滴定基团，并且没有pKa为4.2-8.5的另一可滴定基团。
2.一种如权利要求1所述的方法，其中：
所述病毒灭活试剂是有机酸；并且
其中步骤(2)的确认包含以下至少一个：
(a)测量处理组合物的电导率，其中包含病毒灭活试剂的组合物还包含与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度；
(b)测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例；
(c)测量处理组合物的分光光度特征，其中包含病毒灭活试剂的组合物还包含与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度；
(d)测量处理组合物的光谱特征，其中如提供的，包含生物制品的组合物包含pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH；或者
(e)测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，所述包括pH敏感基团的化合物不包括在提供的包括生物制品的组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
3.一种如权利要求2所述的方法，其中所述有机酸选自乳酸、甲酸、抗坏血酸或它们的组合。
4.一种如权利要求1所述的方法，其中：
所述病毒灭活试剂是氨基酸；并且
其中步骤(2)的确认包含以下至少一个：
(a)测量处理组合物的电导率，其中包含病毒灭活试剂的组合物还包含与病毒灭活试剂成预定比例的盐，并且电导率指示处理组合物中盐的浓度；
(b)测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例；
(c)测量处理组合物的分光光度特征，其中包含病毒灭活试剂的组合物还包含与病毒灭活试剂成预定比例的发色化合物，并且分光光度特征指示处理组合物中发色化合物的浓度；
(d)测量处理组合物的光谱特征，其中提供的，包含生物制品的组合物包含pH敏感基团，并且光谱特征指示处理组合物的pH；或者
(e)测量处理组合物的光谱特征，其中将包括pH敏感基团的化合物随后添加至包括生物制品的组合物中，包括在包括病毒灭活试剂的组合物中，和/或另外添加至处理组合物中，所述包括pH敏感基团的化合物不包括在提供的包括生物制品的组合物中，并且光谱特征指示处理组合物的pH。
5.一种如权利要求4所述的方法，其中：所述氨基酸为甘氨酸。
6.一种在制造生物制品期间连续灭活病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)合并：
(a)包含生物制品的组合物；以及
(b)包含病毒灭活试剂的组合物，
以获得：
(c)具有用于病毒灭活的预定特性的处理组合物；
(2)确认所述处理组合物表现出所述预定特性；
(3)将所述处理组合物转移至处理容器，所述处理容器包含入口、出口和静态混合器，并且具有内部容积，所述入口和出口位于处理容器的长轴的相对末端，所述静态混合器沿长轴在处理容器的内部，并且转移发生在入口处；
(4)在预定温度下于处理容器中温育处理混合物，同时处理混合物以预定速度沿长轴流动并与静态混合器接触，预定温度和预定速度的组合基于预定特性足以导致在处理组合物中的病毒灭活；以及
(5)在出口处从处理容器收集处理组合物；
其中步骤(1)-(5)连续进行，
其中所述处理组合物的预定特性包含0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度，
所述病毒灭活试剂是具有发色基团的非离子去污剂，其具有230nm-600nm的吸收峰，选自具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂以及它们的组合，
其中：
所述病毒灭活试剂是具有芳香基团的聚环氧乙烷去污剂、Triton-X 100去污剂或它们的组合；并且
所述处理组合物的预定特性包含0.05％-10％(v/v)的去污剂浓度，
其中步骤(2)的确认包含以下至少一个：
(a)测量处理组合物的紫外吸收，其中紫外吸收指示处理组合物中去污剂的浓度；或者
(b)测量处理组合物的初始温度，其中处理组合物的初始温度通过包括生物制品的组合物的温度和包括病毒灭活试剂的组合物的温度之间的差异确定，并且指示处理组合物中包括生物制品的组合物和包括病毒灭活试剂的组合物的相对比例。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述预定温度和预定速度的组合足以导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒。
8.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述预定温度为17-40℃，并且所述预定速度为0.3-3乘以处理容器的内部容积/小时。
9.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述处理容器的内部容积足够大，以便确保不超过百万分之一的处理组合物在处理容器中具有比导致在步骤(4)期间以至少1×101的系数通过病毒灭活试剂灭活处理组合物中的病毒所需要的时间短的停留时间。
10.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(1)-(5)连续进行至少1小时。
11.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，如果在步骤(2)不能确认处理组合物表现出预定特性，则将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(3)期间不转移，或者将相应部分的处理组合物转走，因此在步骤(5)期间不收集。
12.一种如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述生物制品是感兴趣的蛋白。
13.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是抗体。
14.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是抗体片段或抗体衍生物。
15.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是单克隆抗体或多克隆抗体。
16.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是哺乳动物抗体。
17.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白为小鼠抗体或人抗体。
18.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白为人源化抗体。
19.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是灵长类抗体。
20.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是灵长类化抗体。
21.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是嵌合抗体。
22.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链、Fab片段、Fc片段、或Fv片段。
23.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是F(ab')2片段、Fc-Fc融合蛋白或单链Fv片段。
24.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是单结构域Fv片段、四价单链Fv片段或二硫键连接的Fv片段。
25.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是双抗体、三链抗体、四链抗体或五抗体。
26.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是微抗体。
27.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是微型抗体。
28.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是免疫球蛋白单可变结构域。
29.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是免疫球蛋白单可变重链结构域或免疫球蛋白单可变轻链结构域。
30.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是VHH结构域。
31.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是人源化的VHH结构域。
32.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是单结构域抗体。
33.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是包含以模块形式与另一免疫球蛋白单可变结构域或功能结构域连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域的蛋白。
34.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是包含以模块形式连接在一起的两个或更多个相同的免疫球蛋白单可变结构域的多价蛋白。
35.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是包含以模板形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双异位蛋白。
36.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是包含以模块形式连接在一起的两个不同的免疫球蛋白单可变结构域的双特异性蛋白。
37.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是包含以模块形式连接在一起的免疫球蛋白单可变结构域和功能结构域的双功能蛋白。
38.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是结构域缺失的抗体。
39.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是抗体片段与另一肽或多肽的融合多肽。
40.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是Fc-肽融合物。
41.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是Fc-毒素融合物。
42.一种如权利要求12所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是抗体片段与支架蛋白的融合物。
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