KR20180118220A - Gitr 항체, 방법, 및 용도 - Google Patents

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Abstract

GITR에 특이적으로 결합하는 항체가 본 명세서에 제공된다. 또한, 제공된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는 세포뿐만 아니라 관련 벡터 및 검출가능하게 표지화된 항체 또는 항원-결합 단편도 기재된다. 게다가, 제공된 항체의 사용 방법이 기재된다. 예를 들어, 제공된 항체는 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

Description

GITR 항체, 방법, 및 용도
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/305,270호 및 2016년 10월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/407,106호의 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 전체 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2017년 2월 21일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI5082USNP_SL.txt이며, 크기가 92,231 바이트이다.
기술분야
본 명세서에 제공된 개시는 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR: glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 기재된 항체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
TNFR 수퍼패밀리의 구성원인 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질(GITR; 또한 AITR, TNFRSF18, 또는 CD357)은 선천 및 적응 면역 시스템의 여러 성분에서 발현되며, 획득 및 선천 면역 둘 모두를 자극한다(문헌[Nocentini G et al., (1994) PNAS 94: 6216-6221]; 문헌[Hanabuchi S et al., (2006) Blood 107:3617-3623]; 문헌[Nocentini G & Riccardi C (2005) Eur J Immunol 35: 1016-1022]; 문헌[Nocentini G et al., (2007) Eur J Immunol 37: 1165-1169]). 그것은 T, B, 수지상(DC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 몇몇 세포 및 조직에서 발현되며, 항원 제시 세포(APC: Antigen Presenting Cell) 상에서, 내피 세포 상에서, 그리고 또한 종양 세포에서 주로 발현되는 그의 리간드인 GITR-L에 의해 활성화된다.
GITR-GITRL 시스템은 자가면역/염증성 반응의 발생에 참여하며 감염 및 종양에 대한 반응을 강화한다. 예를 들어, GITR-Fc 융합 단백질로 동물을 치료하는 것은 자가면역/염증성 질환을 개선하는 한편, GITR 촉발은 바이러스, 세균, 및 기생충 감염에 효과적일뿐만 아니라 종양에 대해 면역 반응을 부스팅하는 데에도 효과적이다(문헌[Nocentini G et al., (2012) Br J Pharmacol 165: 2089-99]). 이들 효과는 이펙터 T-세포의 동시-활성화, 조절 T(Treg) 세포의 저해, NK 및 수지상 세포 작용의 조절, 대식세포의 활성화, 및 혈관외 유출 과정의 조절을 포함하는 몇몇 병행 메카니즘으로 인한 것이다. GITR의 막 발현은 T 세포 활성화 후에 증가한다(문헌[Hanabuchi S et al, (2006) supra]; 문헌[Nocentini G & Riccardi C supra]). 그의 촉발은 이펙터 T 림프구를 동시활성화한다(문헌[McHugh RS et al, (2002) Immunity 16: 311-323]; 문헌[Shimizu J et al, (2002) Nat Immunol 3: 135-142]; 문헌[Roncheti S et al, (2004) Eur J Immunol 34: 613-622]; 문헌[Tone M et al, (2003) PNAS 100: 15059-15064]). GITR 활성화는 종양 및 바이러스 감염에 대한 저항성을 증가시키며, 자가면역/염증성 과정에 수반되고, 백혈구 혈관외 유출을 조절한다(문헌[Nocentini G & Riccardi C (2005) supra]; 문헌[Cuzzocrea S et al, (2004) J Leukoc Biol 76: 933-940]; 문헌[Shevach EM & Stephens GL (2006) Nat Rev Immunol 6: 613-618]; 문헌[Cuzzocrea S et al, (2006) J Immunol 177: 631-641]; 문헌[Cuzzocrea S et al, (2007) FASEB J 21 : 117-129]).
인간 GITR은 말초(비-활성화) T 세포에서 매우 낮은 수준으로 발현된다. T 세포 활성화 후에, GITR은 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 모두에서 며칠 동안 강력하게 상향 조절되며(문헌[Kwon B et al, (1999) J Biol Chem 274: 6056-6061]; 문헌[Gurney AL et al, (1999) Curr Biol 9: 215-218]; 문헌[Ronchetti S et al, (2004) supra]; 문헌[Shimizu J et al, (2002) supra]; 문헌[Ji HB et al, (2004) supra]; 문헌[Ronchetti S et al, (2002) Blood 100: 350-352]; 문헌[Li Z et al, (2003) J Autoimmun 21 : 83- 92]), CD4+ 세포가 CD8+ 세포보다 더 높은 GITR 발현을 갖는다(문헌[Kober J et al, (2008) Eur J Immunol 38(10): 2678-88]; 문헌[Bianchini R et al, (2011) Eur J Immunol 41(8): 2269-78]).
면역 반응의 조절에 있어서 인간 GITR의 역할은, 그것이 암과 같은 질환에 대한 항체-기반 요법을 위한 적합한 표적이 될 수 있음을 시사한다. GITR에 대한 항체가 기재되어 있으나(예를 들어, 제WO200610502호, 제WO2011028683호, 제WO2015031667호, 제WO20150353637호, 제WO2015187835호, 제WO2015184099호, 제US9255151호, 및 제US9255152호), 암과 같은 질환에 대해 GITR 활성을 조절하는 신규 약제 및 방법에 대한 계속되는 필요성이 존재한다.
GITR에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 또한, 제공된 GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체 및 항원-결합 단편을 발현하는 세포뿐만 아니라 관련 벡터 및 검출가능하게 표지화된 항체 및 항원-결합 단편도 기재된다. 게다가, 제공된 항체 및 항원-결합 단편의 사용 방법이 기재된다. 예를 들어, 면역 반응의 조절에서 GITR이 담당하는 역할을 고려하여, GITR-특이적 항체는 면역 반응을 조절하는 것이 바람직한 다양한 GITR-관련 질환 또는 장애의 치료에 있어서 유용성을 갖는다. 예를 들어, GITR 특이적 항체는 다양한 암의 치료와 같은 다양한 면역요법 응용에 사용될 수 있다.
GITR-특이적 항체
GITR에 대해 특이적인 단리된 항체 및 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 GITR에 결합한다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 인간 GITR 및 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 GITR에 결합한다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 59에 정의된 바와 같은 GITR 세포외 도메인(ECD)으로부터의 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 결합 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다.
표 1은 본 명세서에 기재된 일부 GITR-특이적 항체의 예의 요약을 제공한다:
[표 1]
Figure pct00001
일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
IgG 부류는 인간에서 하기의 4가지 동종형으로 분류된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 이들은 Fc 영역의 아미노산 서열에서 95% 초과의 상동성을 공유하지만, 힌지 영역의 아미노산 조성 및 구조에서 큰 차이를 나타낸다. Fc 영역은 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 매개한다. ADCC 및 ADCP에서는, 항체의 Fc 영역이 자연 살해세포 및 대식세포와 같은 면역 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체(FcgR)에 결합하여, 표적화된 세포의 용해 또는 식세포작용으로 이어진다. CDC에서는, 항체가 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발시킴으로써 표적화된 세포를 사멸시킨다. 본 명세서에 기재된 항체는, 상이한 이펙터 기능들을 달성하도록 Fc 서열이 변형되어 있는 변형된 버전을 포함한, IgG 동종형들 중 임의의 것과 조합된 가변 도메인의 기재된 특징을 갖는 항체를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 상기 표 1에 제시된 항체들의 CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기재된 항체는 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 측정될 때 30 nM 이하의 해리 상수로 GITR에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 항체는 NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 항체는 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다.
기재된 GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편에 더하여, 기재된 항체 및 항원-결합 단편을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 본 명세서에 제공된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는 세포도 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 또한 기재된다. 이러한 세포는 포유류 세포(예컨대, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf7 세포), 효모 세포, 식물 세포 또는 세균 세포(예컨대, 대장균)일 수 있다. 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 공정이 또한 제공된다.
GITR-특이적 항체의 사용 방법
기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 사용 방법이 또한 개시된다. 이 섹션에서 논의되는 방법에 사용하기 위한 특정 항체는 표 1에서의 항체들에 대해 기재된 CDR들의 세트를 갖는 것들을 포함한다. 예를 들어, 면역 반응에서 GITR이 담당하는 핵심 역할은, 원하는 종양 항원 또는 병원성 항원(예를 들어, 바이러스 및 다른 병원성 유기체)에 대한 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 것을 포함하는 면역요법에 있어서 그것이 매력적인 표적이 되게 한다. 그러므로, GITR-특이적 항체는 다양한 암 및 감염성 질환의 치료에서 유용성을 갖는다.
상기 언급된 바와 같이, GITR 활성화는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 동시-활성화 신호를 보내며 조절 T 세포에 의한 면역 반응의 억제를 방지한다. 따라서, 일 실시 형태에서는, GITR-특이적 항체를 투여하여 조절 T 세포에 의한 이펙터 T 세포 활성의 억제를 저해한다. 예를 들어, T 세포 증식, 활성화의 알려진 마커의 발현, 또는 사이토카인 분비의 모니터링에 의한 것을 포함하는, 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 이러한 저해를 검정할 수 있다. 다른 실시 형태에서는, GITR-특이적 항체를 대상체에게 투여하여 조절 T 세포의 수준, 예를 들어 종양 조절 T 세포의 수준을 감소시킨다. 또 다른 실시 형태에서는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 GITR-특이적 항체를 투여함으로써 이펙터 T 세포의 활성을 유도하거나 향상시킨다. 이들 방법 각각에 대한 특이적 검정은 실시예에 제공된다.
GITR-특이적 항체 키트
개시된 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트가 본 명세서에 기재된다. 기재된 키트는 본 명세서에 제공된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 사용 방법, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 실행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 및 생물학적 샘플에서 GITR의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편(들), 및 사용 중이 아닐 때 항체 또는 단편을 담기 위한 용기, 항체 또는 단편, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 단편, 및/또는 항체 또는 단편의 검출가능하게 표지화된 형태의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다.
도 1a 내지 도 1c. 전통적인 스크린 패널로부터 항-GITR mAb에 의해 나타난 작용제 활성. 나타낸 데이터는 NF-kB 루시페라제 리포터 유전자 단독으로(Luc), 또는 GITR 발현 벡터 및 NF-kB 루시페라제 리포터 유전자 둘 모두로(GITR-Luc) 형질감염된 후에 표시된 시약으로 처리한 세포로부터의 Cell-Titer Glo 신호이다. PBS 처리에 의해 확인된 것보다 더 큰 신호를 생성한 항체를 작용제로 예비 분류하였다.
도 2a 내지 도 2e. 차세대 서열분석 패널(next-generation sequencing panel)로부터 항-GITR mAb에 의해 나타난 작용제 활성. 나타낸 데이터는 NF-kB 루시페라제 리포터 유전자 단독으로, 또는 GITR 발현 벡터 및 NF-kB 루시페라제 리포터 유전자 둘 모두로 형질감염된 후에 표시된 시약으로 처리한 세포로부터의 Cell-Titer Glo 신호이다.
도 3a 내지 도 3d. NF-κB 활성에 대한 항-GITR 항체 라이게이션의 효과. 나타낸 결과는 GITR에 의해 안정적으로 형질감염된 HEK-Blue NF-κB 세포에서 NF-κB 활성화의 척도로서 SEAP 활성을 나타낸다. 25 ng/mL의 가용성 GITR 리간드의 부재(3a, 3b) 또는 존재(3c, 3d) 하에 변화하는 농도의 항-GITR 항체로 세포를 처리하였다. 무항체 및 동종형 항체 대조군으로 배지 및 CNTO3930을 사용하였다.
도 4a 및 도 4b. CMV 및 TT에 대한 기억 T 세포 반응에 대한 항-GITR 항체의 효과. 항-GITR 항체, CNTO3930 동종형 대조군 항체, 또는 무항체의 부재 또는 존재 하에 혈청 반응성(sero-reactive) PBMC를 CMV 및 TT 항원으로 펄스 처리하였다. 상등액을 수집하고 IFNγ의 존재에 대해 측정하였다.
도 5a 및 도 5b. 동계 MC38 결장 암종 모델에서 대리 항-GITR 항체(DTA-1)의 단일 약제 항-종양 활성. 종양 부피가 100 ㎣에 도달했을 때에 시작하여 흑색 화살표로 표시한 날에 DTA-1 또는 동종형 랫트 IgG2b를 200 ug/마우스로 동물에게 투여하였다(군당 n=10). DTA-1 치료는 5/10 마리의 동물에서 완전한 종양 퇴행을 유발했다.
도 6a 내지 도 6c. 대리 항-GITR 항체(DTA-1)와 항-PD-1 항체(RMP1-14)의 조합은 동계 MC38 결장 암종 모델에서 상승적인 항-종양 활성으로 이어진다. 종양 부피가 200 ㎣에 도달했을 때에 시작하여 흑색 화살표로 표시한 날에 동종형 랫트 IgG2b(6a), DTA-1(6b), 또는 DTA-1 + RMP1-14(6c)를 100 ug/항체/마우스로 동물에게 투여하였다(군당 n=10). 조합 치료는 5/10 마리의 동물에서 종양 퇴행을 유발했다.
도 7a 내지 도 7c. 대리 항-GITR 항체(DTA-1)와 항-CTLA-4 항체(9D9)의 조합은 동계 MC38 결장 암종 모델에서 상승적인 항-종양 활성으로 이어진다. 종양 부피가 200 ㎣에 도달했을 때에 시작하여 흑색 화살표로 표시한 날에 동종형 랫트 IgG2b(7a), DTA-1(7b), 또는 DTA-1 + 9D9(7c)를 100 ug/항체/마우스로 동물에게 투여하였다(군당 n=10). 조합 치료는 3/10 마리의 동물에서 종양 퇴행을 유발했다.
도 8a 내지 도 8d. 대리 항-GITR 항체(DTA-1)와 항-OX-40 항체(OX-86)의 조합은 동계 MC38 결장 암종 모델에서 OX-86 단독보다 더 양호하다. 종양 부피가 200 ㎣에 도달했을 때에 시작하여 흑색 화살표로 표시한 날에 3회 주사의 동종형 랫트 IgG2b(8a), 또는 DTA-1(8b)를 100 ug/항체/마우스로 동물에게 투여하였다(군당 n=10). DTA-1(d1) 후의 OX-86(d5, d9, 도 7d)의 순서가 동종형 Ab 후의 OX-86(도 7c)보다 더 양호했다.
도 9a 내지 도 9f. 백신 접종을 동반하는 조합 항-GITR/항-PD-1 요법은 Ag-특이적 CD8+ T 세포의 증폭(expansion), 작용, 및 분화를 부스팅한다. 무경험(
Figure pct00002
) B6 비-종양 보유 마우스(n = 5/군)를 하기 단일 요법 또는 조합 요법과 함께 OVA257-264 펩티드(제0일)로 1회 면역화하였다: 제0일, 제3일, 및 제6일에 200 ㎍의 항-GITR 또는 대조군 랫트 IgG, 및 제3일, 제6일, 제9일, 및 제12일에 200 ㎍의 항-PD-1. 제7일(d7) 및 제14일(d14)에 혈액 및/또는 비장에서 원하는 면역 반응을 모니터링하였다. a, OVA257-264-특이적 펩티드로 자극한 마우스의 비장으로부터의 IFNγ-분비 T 세포의 ELISpot 분석(d7). b, 막대 그래프는 비장에서 OVA257-264 자극에 대해 이펙터 사이토카인 IFNγ, TNFα, 및 IL-2를 방출하는 단일-, 이중-, 및 삼중-양성 CD8+ T 세포의 다작용성 하위집단을 나타낸다(d7). c, 세포용해 표현형의 프로파일(d7). d, 말초 혈액 중의 OVA-특이적 CD8+ T 세포(d7). 점 도표, d에 나타낸 5 마리의 마우스를 나타낸다. e, d14에 말초 혈액 중의 OVA-특이적 CD8+ T 세포. e 내지 f, 면역화 후 d14에 치료한 마우스로부터의 혈액 중의 OVA 사량체-특이적 CD8+ 기억 T 세포의 분화. 상기 실험 각각은 2회 이상 유사한 결과로 반복되었다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. 오차 막대는 SEM을 표시한다. EM: 이펙터 기억; CM: 중심 기억.
도 10a 내지 도 10d. 백신 접종을 동반하는 생체내 조합 요법은 마우스에서 B16-OVA 종양 거부를 촉진한다. a, B16-OVA 확립된 종양(~30 내지 40 ㎣)을 표시된 치료로 치료하였다. b, 시간 경과에 따라 개별적 종양 반응, 군 종양 측정값(평균 +/- SEM, c), 및 생존(d)을 모니터링하였다. 그래프는 연구한 동물의 군당 평균 종양 부피를 나타내고, 차트는 무종양의 수/총합을 표시한다(c). 그래프는 3회의 독립적인 실험 중 1회의 대표적인 결과이다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 11a 내지 도 11d. 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 상승작용하여 CD8+ TIL의 백신-유도 항원-특이적 반응의 빈도 및 작용을 향상시켰다. 종양 이식 후 12 내지 15일의 OVA257-264 한정(CD8) 펩티드 자극(a 내지 b) 또는 PMA/ION 자극(d) 후의 CD8+ TIL 내의 IFNγ, TNFα, INFγ/TNFα, 및 CD107a/IFNγ에 대한 세포내 사이토카인 염색의 요약 데이터를 나타낸다. c, 막대 그래프는 종양 내의 총 CD45+ 세포 중 H2-Kb-SIINFEKL-한정 OVA 사량체-특이적 CD8+ TIL의 백분율을 나타낸다. 실험은 2회 이상 유사한 결과로 반복되었다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. 오차 막대는 n = 4 내지 5/군의 SEM을 표시한다.
도 12a 내지 도 12d. 조합 요법은 B16-OVA 종양에서 CD8+ T 세포 침윤을 향상시키고 Treg의 빈도를 감소시킨다. a, 도 9b 내지 도 9d로부터의 비-종양 보유 마우스의 비장으로부터 평가된 Treg의 백분율, B16-OVA 종양-보유 마우스의 코호트를 Vax, 항-GITR, 및/또는 PD-1 조합으로 치료하였다(도 10에서와 같음). b, 종양 이식 후 15일의 총 CD45+ 세포의 백분율로서의 CD8+ TIL. c 및 d. 대표적인 흐름 점 도표(flow dot plot) 및 요약 데이터는 종양 이식 후 15일의 치료한 마우스의 종양 내의 CD45+ TIL 중 Treg의 백분율 및 CD8+ 이펙터 T 세포 대 Treg의 비를 나타낸다. 통계적 분석은 Vax/항-GITR/항-PD-1과 비교한다. 결과는 군당 4 내지 5 마리의 마우스를 가진 2 내지 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. 오차 막대는 SEM을 표시한다.
도 13a 내지 도 13d. Vax/항-GITR/항-PD-1 효능은 CD8+ T 세포에 의존하며 치료는 장기 기억을 유도한다. a. 치료적 고갈 연구(therapeutic depletion study)를 위한 투여 일정. B6 마우스(n = 10/군)에 4x105개의 B16-OVA 종양 세포를 s.c. 주사하고, 종양 직경이 ~40 ㎣에 도달했을 때 제7일, 제8일, 제9일, 제11일, 제14일, 제17일에 각각 200 ㎍/마우스 mAb의 투여에 의해 그들의 CD8 세포, CD4 세포, 또는 NK 세포를 고갈시켰으며; 제8일은 Vax/항-GITR/항-PD-1 또는 IgG를 이용한 치료가 시작된 날이다. 백신은 종양 이식 후 제8일에 투여되었고; 항-GITR은 제8일 및 제14일에 투여되었으며; 항-PD-1은 제10일, 제13일, 제16일, 및 제19일에 투여되었다. b, 종양 부피는 주 2회 모니터링하였다(평균 +/- SEM). c 내지 d, 조합 치료 후의 무종양 마우스(군당 n = 6 내지 9)를 1차 종양 거부 후 6개월에 동일한 옆구리에서 B16-OVA(2x105; c) 또는 B16.F10(1.5x105; d) 세포로 재-유발시켰다. 연령-일치 마우스를 재-유발 대조군으로 사용하였다. 결과는 2 내지 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14d. 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 종양-특이적 CD8+ TIL을 증폭시키고 KLRG1+ 이펙터-기억 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 종양 제거를 유도한다. a, 대표적인 산포도 그래프는 종양 접종 후 15일의 H2-Kb-SIINFEKL-한정 OVA-특이적 CD8+ T-세포의 백분율, (b) KLRG1+CD8+ TIL의 백분율, 및 (c) 사량체-결합 KLRG1+CD8+ TIL의 백분율을 나타낸다(4 내지 5 마리 마우스/군). d, B6 마우스(군당 10 마리)에 4x105개의 B16-OVA 종양 세포를 s.c. 주사하고 종양 직경이 ~50 ㎣에 도달한 제8일에 도 13에서와 같이 요법을 개시하였다. 제7일, 제8일, 제9일, 제11일, 제14일, 제17일, 제20일에 200 ㎍의 aKLRG1 mAb를 투여하였으며; 제8일이 치료가 시작된 날이다. 종양 부피 및 생존을 주 2회 모니터링하였다. 전체 그래프는 2회 이상의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 15a 및 도 15b. 이중 항-GITR/항-PD-1 조합은 TRP2-기반 펩티드 백신과 상승작용하여 확립된 B16-OVA 종양의 퇴행을 유도한다. B6 마우스(군당 10 마리)에 4x105개의 B16-OVA 종양 세포를 s.c. 주사하고; 종양이 ~50 ㎣에 도달했을 때 치료를 개시하였다. a, B16-OVA 종양-보유 마우스에서의 TRP2 펩티드 백신 접종 단독 또는 항-GITR/항-PD-1 요법(또는 일치 동종형 IgG)과의 조합의 일정의 개략적 예시. b, 군으로(평균 +/- SEM), 그리고 개체별로, 시간 경과에 따라 종양 성장을 모니터링하였다. 실험은 2회 이상 유사한 결과로 수행되었다. **P<0.01
도 16. 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법에 의한 CD25+ 세포의 고갈은 종양 효능을 폐지하거나 향상시키지 않는다. 도 5a에 예시된 바와 같이 200 ㎍의 항-CD25의 투여 및 조합 치료를 전달하였다. 종양 부피는 주 2회 모니터링하였다(평균 +/- SEM을 플로팅함). 결과는 군당 10 마리의 마우스를 가진 2회의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c. 항-KLRG1 항체는 KLRG1+CD8+ 표적 집단을 고갈시킨다. a 및 b, 도 9에서와 같이 무경험 무종양 마우스에 Vax/항-GITR/항-PD-1 조합 및 동종형을 투여하였다. 백신 접종 후 제2일, 제4일, 및 제6일에 항-KLRG1-치료 마우스에 100 ㎍의 항-KLRG1 mAb를 투여하였다. 백신 접종 후 제7일에 마우스를 희생시키고 혈액 및 비장 둘 모두로부터 림프구를 수집하여 CD8, KLRG1, 및 CD44의 발현을 평가하였다. a, 항-KLRG-1 항체에 의한 치료 후의 비장 내의 CD8+ T 세포의 백분율. b, 혈액 및 비장 내의 KLRG1+CD8+의 백분율을 나타내는 대표적인 흐름 도표 및 (c) 혈액 및 비장 내의 KLRG1+CD8+CD44+ 및 KLRG1+CD8+Tet+ 세포(각각 좌측 및 우측 패널)의 빈도 및/또는 총 세포 수의 컴파일링된 데이터. 결과는 군당 5 마리의 마우스를 가진 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. 오차 막대는 SEM을 표시한다.
도 18a 및 도 18b는 B16-OVA 세포(400,000개)를 이식한 후, 표시된 바와 같이 이식 후 제7일에 항-CD122 mAb 5H4(2 내지 3일 간격으로 5회 투여함), 또는 펩티드 백신 복합체(1 용량), 또는 조합으로 치료한 마우스(군당 n = 10)의 종양 성장(도 12a) 및 생존(도 12b)을 예시한다.
도 19a 내지 도 19d. B16-OVA 이식(400,000개의 세포) 후 제16일에 수확한 TIL의 빈도, 및 종양 침윤 G-MDSC(CD11b+Ly6G+Ly6C-)(도 13a), OVA257-264 펩티드에 의한 생체외 자극시의 종양-침윤 IFNγ+TNFα+ 사이토카인 분비 CD8+ T 세포(도 13b), H2-Kb-SIINFEKL OVA-특이적 CD8+ TIL(도 13c), 및 종양-침윤 Treg(CD4+CD44+FOXP3+CD25+)(도 13d)의 백분율을 예시한다. aCD122: 항-CD122 단일클론 항체. *P<0.05; **P<0.01; *** P<0.001; ****P<0.0001.
도 20a 내지 도 20c. 항-CD122 요법이 비-종양 보유 마우스의 말초에서 백신-유도 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 향상시킴을 예시한다: H2-Kb-SIINFEKL-한정 OVA-특이적 CD8+ T-세포의 백분율(도 31a); 비-종양 보유 마우스의 혈액에서 항-CD122 치료 후의 CD8+CD122+ T 세포 집단의 백분율(도 31b), 종양-보유 마우스의 종양에서 요법 치료 후의 CD8+CD122+ T 세포 집단의 백분율(도 31c). aCD122: 항-CD122 단일클론 항체; Vax: 백신. *P<0.05; **P<0.01; *** P<0.001; ****P<0.0001. 오차 막대는 SEM을 표시한다.
도 21a 및 도 21b. B16-OVA 세포(400,000개)를 이식한 후, 펩티드 백신 접종(3 용량)과 조합하여 항-CD122로 치료한 마우스의 생존을 예시한다(도 32a). 도 32a에서 백신/항-CD122로 치료한, 무종양 생존한 마우스를 B16-ova 세포로 재유발시켰으며; 그래프는 제2 종양 유발을 거부하는 마우스의 백분율을 나타낸다(도 32b).
도 22a 및 도 22b. B16-OVA 세포(400,000개) 이식을 받은 후, 표시된 바와 같이 이식 후 제4일에 항-CD122, 또는 항-GITR, 또는 항-CD122 및 항-GITR의 조합으로 치료한 무경험 마우스(군당 n = 10)의 종양 성장 및 생존을 예시한다. *P<0.05; **P<0.01; *** P<0.001; ****P<0.0001.
도 23. TRGB191.CLF의 존재 및 부재 하의 GITR-CED의 각각의 세그먼트에 대한 중수소화 수준의 차이. 각각의 블록은 맵핑될 수 있는 펩티드 및 60, 600, 3,600, 및 14,400초에 대조군에 대한 교환의 정도를 나타낸다. 회색: 중수소 보호가 없음; 어두운 회색: mAb 결합시에 강력한 보호; 밝은 회색: mAb 결합시에 보통의 보호.
도 24. TRGB191 에피토프가 흑색으로 강조된 GITR ECD 단량체의 공간-충전 모델.
도 25a 및 도 25b. 1차 휴지 및 활성화 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 TRGB191.CLF의 ADCC 활성. TRGB191.CLF 및 CNTO3930(동종형 대조군 항체)을 휴지 CD4+(a, 좌측 패널) 및 휴지 CD8+ T 세포(b, 좌측 패널) 또는 활성화 CD4+(a, 우측 패널) 및 CD8+ T 세포(b, 우측 패널) 상의 ADCC 활성에 대해 평가하였다. 백분율 특이적 용해를 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. E:T 비는 범례에 표시된다. N=3 반복 실험, 데이터 점당 n=12. [Ab] = 항체 농도
도 26. JJN-3 세포주 상의 TRGB191.CLF의 ADCC 활성. JJN-3 표적 세포 및 NK-92 158 V/V 이펙터 세포를 사용하여 TRGB191.CLF 및 CNTO3930(동종형 대조군 항체)을 ADCC 활성에 대해 평가하였다. 백분율 특이적 용해를 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. N=6 반복 실험, 데이터 점당 n=12 내지 24. [Ab] = 항체 농도.
도 27. NK-92 158 V/V 이펙터 세포를 사용하여 TRGB191.CLF 및 CNTO3930 동종형 대조군 항체를 표적 세포로서 JJN-3 표적 세포 및 시험관내 분화된 Treg 상의 ADCC 활성에 대해 시험하였다. 백분율 특이적 용해를 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. N=3 반복 실험, 데이터 점당 n=12. [Ab] = 항체 농도, EC50 = 반수 최대 유효 농도, Bmax = 최대 용해.
도 28a 및 도 28b. 고친화도 및 저친화도 FcγRIIIA 다형을 가진 이펙터 세포를 사용하는 TRGB191.CLF의 ADCC 활성. (a) 158V/V 고친화도 변이체 또는 (b) 158F/F 저친화도 변이체를 발현하는 NK-92 이펙터 세포를 사용하여, TRGB191.CLF 및 CNTO3930을 JJN-3 표적 세포 상의 ADCC 활성에 대해 시험하였다. 백분율 특이적 용해를 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. N=3 반복 실험, 데이터 점당 n=12. [Ab] = 항체 농도, EC50 = 반수 최대 유효 농도, Bmax = 최대 용해.
도 29. 100 ㎣ 종양 부피로 시작하는 MC38 모델에서 DTA-1 + FGK4.5 치료는 더 완전한 종양 퇴행으로 이어진다.
도 30. 230 ㎣ 종양 부피로 시작하는 MC38 모델에서 DTA-1 + FGK4.5 치료는 더 완전한 종양 퇴행으로 이어진다.
도 31. 100 ㎣ 종양 부피로 시작하는 MC38 모델에서 DTA-1 + OX86 치료는 더 완전한 종양 퇴행으로 이어진다.
도 32. 100 ㎣ 종양 부피로 시작하는 MC38 모델에서 DTA-1 + RMP1-14 치료는 더 완전한 종양 퇴행으로 이어진다.
정의
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 측면과 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어는 본 기술 분야에서의 이의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등을 지칭할 때 용어 "약"은 지정된 값으로부터 최대 ±10%의 변동을 포함함을 의미하는데, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 근사치로, 이는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변동될 수 있다. 적어도, 그리고 청구범위의 범주와 동등한 원칙의 응용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 개수를 고려하여 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범주를 나타내는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 기재된 수치들은 가능한 한 정확하게 기록하였다. 그러나, 임의의 수치는 그들 각자의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 유래하는 소정의 오차를 본질적으로 포함한다.
"단리된"은 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이, 그러한 성분이 천연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들, 즉 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 따로 생성되거나, 또는 따로 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 항체 또는 항원-결합 단편은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항원-결합 단편이 실질적으로 없는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭하고자 한다(예를 들어, GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 GITR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, GITR의 에피토프, 아이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원(예컨대, GITR 종 상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질" 및 "GITR"은, 예를 들어 GenBank 수탁 번호 AF241229, NCBI 기준 서열: NP_004186.1 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 Q9Y5U5에 기재된 바와 같은 인간 GITR 단백질을 특이적으로 포함한다(또한 문헌[Kwon et al. 1999, J. Biol. Chem. 274, 6056-6061] 참조). GITR은 또한 AITR, CD357, TNFRSF18, 및 GITR-D로 과학 문헌에 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "GITR 리간드", "GITRL", 및 "GITR-L"은 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질 리간드를 지칭한다. GITRL은 달리 활성화-유도 TNF-관련 리간드(AITRL) 및 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 18(TNFSF18)로 알려져 있다. GenBank 수탁 번호 AF125303은 예시적인 인간 GITRL 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁 번호 NP 005083 및 Swiss-Prot 수탁 번호 Q9UNG2는 예시적인 인간 GITRL 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시 형태에서, GITRL은 서열 번호 65의 인간 GITRL이다.
달리 명시되지 않는 한, "항체"는 다양한 단량체 형태, 중합체 형태 및 키메라 형태를 포함하는 면역글로불린의 모든 동종형(IgG, IgA, IgE, IgM, IgD 및 IgY)을 지칭한다. 구체적으로, 용어 "항체"에는 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb) 및 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다.
"항원-결합 단편"은 특정 항원에 대해 결합 친화성을 나타낼 수 있는 임의의 단백질성 구조(proteinaceous structure)이다. 항원-결합 단편에는 임의의 알려진 기법, 예컨대 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기법에 의해 제공된 것들이 포함된다. 일부 항원-결합 단편은 모 항체 분자의 항원-결합 특이성을 보유하는 손상되지 않은(intact) 항체의 일부분으로 구성된다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 특정 항원과 결합하는 것으로 알려진 항체의 적어도 하나의 가변 영역(중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 적합한 항원-결합 단편의 예에는, 제한 없이, 이중항체(diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라, Fab, F(ab')2, Fc, Fabc 및 Fv 분자, 단일쇄(Sc) 항체, 개별 항체 경쇄, 개별 항체 중쇄, 항체 쇄 또는 CDR과 다른 단백질, 단백질 스캐폴드 사이의 키메라 융합, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 이량체, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 제WO2007059782호에 기재된 바와 같은 1가 항체, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, V.sub.H 및 C.sub.H1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]) - 이는 VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 도메인 항체로도 불림(문헌[Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90]); 낙타과(camelid) 또는 나노바디(nanobody)(문헌[Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24]);
단리된 상보성 결정 영역(CDR) 등이 포함된다. 모든 항체 동종형이 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 항원-결합 단편은 주어진 관심 항원에 대해 친화성을 부여하는 배향으로 폴리펩티드 세그먼트를 성공적으로 도입할 수 있는 비항체 단백질성 프레임워크, 예컨대 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합적으로 생성되거나 손상되지 않은 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 어구 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 주어진 항원-결합 단편이 이 어구에 언급된 항체의 하나 이상의 아미노산 세그먼트를 포함함을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
용어 "CDR", 및 그의 복수형 "CDRs"는 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭하며, 그 중의 3개는 경쇄 가변 영역(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)의 결합 특징을 이루고 3개는 중쇄 가변 영역(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)의 결합 특징을 이룬다. CDR은 항체 분자의 작용 활성에 기여하며, 스캐폴드 영역 또는 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산 서열에 의해 분리된다. 정확한 정의상의 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 번호화 시스템에 따른다. 그러므로 CDR은 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 접촉 또는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 상이한 경계에도 불구하고, 이들 시스템 각각은 어느 정도의 중첩을 가지며, 그 안에는 가변 서열 내에 소위 "초가변 영역"이 구성된다. 그러므로 이들 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역에 대한 및 경계 구역 및 길이가 상이할 수 있다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publication No. 91-3242 (1991)]; 문헌[Chothia et al., "Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]; 및 문헌[MacCallum et al., "Antibody-Antigen Interactions: Contact Analysis and Binding Site Topography," J. Mol. Biol. 262:732 (1996)]을 참조한다.
전형적으로, CDR은 정준 구조로 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "정준 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주쇄 입체배좌를 지칭한다. 비교 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개가 제한된 레퍼토리의 이용가능한 입체배좌만 갖는다는 것이 확인되었다. 각각의 정준 구조는 폴리펩티드 골격의 비틀림 각(torsion angle)에 의해 특성화될 수 있다. 그러므로 항체들 사이의 상응하는 루프는, 루프의 대부분 내의 높은 아미노산 가변성에도 불구하고, 매우 유사한 3 차원 구조를 가질 수 있다(문헌[Chothia et al., "Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]; 문헌[Chothia et al., "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions," I 342:877 (1989)]; 문헌[Martin and Thornton, "Structural Families in Loops of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling and Application to Antibodies," J. Mol. Biol. 263:800 (1996)], 이들 각각은 전체적으로 참고로 포함됨). 추가로, 채택된 루프 구조와 그것을 둘러싼 아미노산 서열 사이에는 관계가 있다. 특정 정준 부류의 입체배좌는 루프의 길이 및 루프 내의 핵심 위치뿐만 아니라 보존된 프레임워크(즉, 루프의 외부) 내에 있는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 그러므로 특정 정준 부류로의 배정은 이들 핵심 아미노산 잔기의 존재를 기반으로 이루어질 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 용어 "단백질"과 호환적으로 사용되며, 그의 가장 넓은 의미로 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 펩티드 모방체의 화합물을 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성체 둘 모두, 아미노산 유사체, 및 펩티드 모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 펩티드 쇄가 짧은 경우, 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 통상적으로 올리고펩티드라고 불린다. 펩티드 쇄가 긴 경우, 펩티드는 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질이라고 불린다. 항체 또는 항체 단편과 관련하여 사용될 때, "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적 결합" 또는 이들의 파생어는, 혼합된 분자 집단을 함유하는 샘플 중의 다른 분자에 우선적으로 결합하지 않으면서, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 인코딩된 도메인을 통한 관심 단백질의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정될 때 약 1x10-8 M 미만의 Kd로 동종 항원에 결합한다. "[항원]-특이적" 항체(예를 들어, GITR-특이적 항체)와 같은 어구는 언급된 항체가 언급된 항원에 특이적으로 결합함을 나타내고자 한다.
"폴리뉴클레오티드" - 동의어로 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 지칭됨 - 는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하거나 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하는 혼성(hybrid) 분자를 포함한다. 게다가, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상이 아닌 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있으므로; "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 쇄를 또한 포함한다.
"벡터"는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드, 또는 바이러스이며, 이것 내에 다른 핵산 절편이 작동가능하게 삽입되어 절편의 복제 또는 발현을 일으키도록 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어, 1차 세포, 배양 중의 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 특이적 실시 형태에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 예를 들어, 다음 세대 또는 숙주 세포 유전체 내로의 핵산 분자의 통합에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해, 이러한 세포의 자손은 핵산 분자로 형질감염된 모세포와 동일하지 않을 수 있다. 용어 "발현" 및 "생성"은 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이들 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이들 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA의 번역을 포함하고, 모든 천연 발생 전사 후 및 번역 후 변형을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현 또는 생성은 세포의 세포질 내에서 행해지거나, 또는 세포외 환경, 예컨대 세포 배양의 성장 배지 내로 행해질 수 있다. "실질적으로 동일한"이라는 의미는 그 용어가 사용되는 문맥에 따라 상이할 수 있다. 중쇄 및 경쇄, 그리고 그들을 인코딩하는 유전자 중에서 존재할 가능성이 높은 천연 서열 변이로 인해, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 아미노산 서열 또는 유전자 내에는 약간의 수준의 변이가 발견될 것으로 예측될 것인데, 이때 이러한 변이는 그들의 고유 결합 특성(예를 들어, 특이성 및 친화도)에 대해 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 그러한 예측은 유전자 코드의 축퇴성뿐만 아니라, 보존적 아미노산 서열 변이의 진화적 성공에도 부분적으로 기인되는데, 이때 이는 인코딩된 단백질의 성질을 크게 변경시키지 않는다. 따라서, 핵산 서열과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 65% 동일성을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 70% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 91% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 93% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 94% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 96% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 그리고 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성을 지칭한다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 × 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, PAM120 가중치 잔기표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 기능에 대해 실질적인 영향을 주지 않고서 단백질의 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있는 변이의 정도는 핵산 서열의 변이의 정도보다 훨씬 더 낮은데, 동일한 축퇴성 원리가 아미노산 서열에는 적용되지 않기 때문이다. 따라서, 항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 기재된 항체 또는 항원-결합 단편과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 다른 실시 형태는, 프레임워크, 스캐폴드, 또는 본 명세서에 기재된 항체 및 항원-결합 단편과 유의적인 동일성을 공유하지 않지만, 본 명세서에 기재된 이러한 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 결합을 부여하기 위해 필요한 하나 이상의 CDR 또는 다른 서열을 포함하는 다른 비결합 영역을 갖는 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 나타낼 수 있다. 평형 해리 상수(KD) 및 평형 회합 상수(KA)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 알려진 다수의 방식으로 친화도를 측정 및/또는 표현할 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되는 반면에, KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 회합 속도 상수를 지칭하고, koff는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 표면 플라즈몬 공명과 같은 당업자에게 알려진 기법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 지칭하며, 비인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다. 기재된 방법의 많은 실시 형태에서, 대상은 인간이다.
GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편
GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 항체 분자의 일반적 구조는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항원 결합 도메인, 및 보체 결합(complement fixation) 및 항체 수용체에 대한 결합을 포함한 다양한 기능을 제공하는 Fc 도메인을 포함한다.
기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 모든 동종형, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 4쇄 면역글로불린 구조의 합성 다량체를 포함한다. 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 암탉 또는 터키 혈청 및 암탉 또는 터키 난황에서 대체로 발견되는 IgY 동종형을 포함한다.
GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 재조합 수단에 의해 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 마우스, 래트, 염소, 말, 돼지, 소, 닭, 토끼, 낙타과, 당나귀, 인간, 또는 이들의 키메라 버전일 수 있다. 인간에 대한 투여에 사용하기 위하여, 비인간 유래 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 환자에게 투여 시 더 적은 항원성을 나타내도록 유전자적으로 또는 구조적으로 변경될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항체 또는 항원-결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라"는 인간 이외의 포유동물, 설치류 또는 파충류의 항체 아미노산 서열로부터 유래되는 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 일부분을 가지면서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 나머지 부분은 인간으로부터 유래되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 인간 이외의 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)일 수 있다. 대부분, 인간화 항체는, 수령자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력(capacity)을 갖는 비인간 종(공여 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수령 항체)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 인간 이외의 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 다양한 형태로 존재할 수 있지만, 표 1에 나타낸 항체 CDR들 중 하나 이상을 포함할 것이다.
GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 및 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IgG 또는 이의 유도체이다. 본 명세서에 예시된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 항원-결합 단편이지만, 예시된 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라화될(chimerized) 수 있다.
일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 39와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 2를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 13을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 29를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 36을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 40과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 56과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 1을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 6을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 30을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 33을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 41과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 57과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 15를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 42와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 43과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 4를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 8을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 44와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 4를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 45와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 4를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 46과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 47과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 58과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 48과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 58과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 22를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 49와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 23을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 50과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 24를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 51과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 25를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 52와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 27을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 53과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 54와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 63과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 27을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 30 nM 이하의 친화도로 GITR에 결합할 수 있으며, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도할 수 있고, 시험관 내에서 67 ng/mL 이하의 EC50으로 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 서열 번호 64와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄는 하나의 아암이 항-GITR 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.
GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 또한 개시된다. 본 명세서에 제공된 가변 도메인 절편을 인코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 벡터 상에 포함되어 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다.
재조합 항원-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 폴리뉴클레오티드(및 이것이 인코딩하는 펩티드)는 리더(leader) 서열을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 리더 서열은 제한 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 생물학적 특성(예를 들어, 결합 친화도 또는 면역 이펙터 활성)을 보유하는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 이들 변이체는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드에 부가되거나 그로부터 결실된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체, 및 (d) 폴리펩티드가, 그 폴리펩티드에 유용한 특성을 부여할 수 있는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 융합 파트너, 단백질 태그, 또는 다른 화학적 모이어티(moiety), 예컨대 항체에 대한 에피토프, 폴리히스티딘 서열, 비오틴 모이어티 등과 융합된 변이체. 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은, 하나의 종으로부터의 아미노산 잔기가, 보존 또는 비보존된 위치에서, 다른 종에서의 상응하는 잔기 대신 치환된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 비보존된 위치에서의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존된 잔기로 치환된다. 유전자적(결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기법을 포함한 이들 변이체를 얻기 위한 기법은 당업자에게 알려져 있다.
본 명세서에 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 몇몇 항체 동종형, 예컨대 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE를 구현할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형, 바람직하게는 IgG1 동종형이다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편 특이성은 CDR의 아미노산 서열, 및 배열에 의해 대체로 결정된다. 따라서, 하나의 동종형의 CDR은 항원 특이성을 변경시키지 않고서 다른 동종형으로 전달될 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마가 항원 특이성을 변경시키지 않고서 하나의 항체 동종형을 생성하는 것으로부터 다른 항체 동종형으로 전환(동종형 전환)되게 하기 위한 기법이 확립되어 왔다. 따라서, 그러한 항체 동종형들은 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 범주 내에 있다.
본 명세서에 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 GITR에 대한 결합 친화도는 약 30 nM 미만의 해리 상수(KD)를 포함한다. 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 친화도는 당업계에 알려진 다양한 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 또는 ELISA-기반 방법에 의해 결정될 수 있다. SPR에 의해 친화도를 측정하기 위한 검정은 BIAcore 3000 기계를 사용하여 수행되는 검정을 포함하며, 여기서 검정은 실온에서(예를 들어, 25℃ 또는 그 부근에서) 수행되고, 여기서 GITR에 결합할 수 있는 항체를 항-Fc 항체(예를 들어, 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체, Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)에 의해 BIAcore 센서 칩 상에 약 75 RU의 수준까지 포획한 후, 40 μl/min의 유속으로 회합 및 해리 데이터를 수집한다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 발현 벡터는 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선택 마커, 및 폴리아데닐화 신호와 같은 그러나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 서열을 함유할 수 있다. 매우 다양한 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 벡터는 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 배큘로바이러스, 박미드(bacmid), 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC)뿐만 아니라, 다른 세균, 효모 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 범주 내의 재조합 발현 벡터는 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 인코딩하는 합성, 게놈, 또는 cDNA-유래 핵산 단편을 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터는 또한 하나 이상의 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.
척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터가 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)]에 의해 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체- 또는 항원-결합 단편-코딩 서열은 강력한 구성적 프로모터, 예컨대 하기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓여 있다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 기타. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)(EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 코딩 서열은 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 독시사이클린-유도성 프로모터, 하나 이상의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)를 함유하는 프로모터, 예컨대 단백질 키나제 R 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제, Mx 유전자, ADAR1 등의 제어 하에 놓여 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커, 예를 들어 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자), 글루타메이트 신타제 유전자, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK, HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸퓨린 선택을 위한 세균성 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 다양한 세포를 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편-생성 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양은 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재되고 예시된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 특징으로 한다.
세포 내로의 외래 유전자의 도입을 위한 다수의 기법이 당업계에 알려져 있고, 본 명세서에 기재되고 예시된 다양한 실시 형태에 따라, 기재된 방법을 수행하려는 목적을 위하여 재조합 세포를 작제하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 기법은 숙주 세포로의 이종 유전자 서열의 안정한 전달을 제공하여, 이종 유전자 서열이 세포의 자손에 의해 상속가능하고 발현가능하도록, 그리고 수령 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 파괴되지 않도록 해야 한다. 사용될 수 있는 기법에는 염색체 전달(예를 들어, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로 세포 매개 유전자 전달), 물리적 방법(예를 들어, 형질감염, 스페로플라스트 융합, 현미주사(microinjection), 전기천공, 리포솜 담체), 바이러스 벡터 전달(예를 들어, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스) 등(문헌[Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)]에 기재됨)이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 인산칼슘 침전 및 세균 프로토플라스트(bacterial protoplast)와 포유류 세포의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-유도 융합이 또한 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 발현에 사용하기에 적합한 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더 바람직하게는 식물, 설치류, 또는 인간 기원의 세포, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 특히 NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 세포, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L 세포, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 골수종 세포, 및 BHK 세포주이다. 게다가, 항체의 발현은 하이브리도마 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 하이브리도마를 생성하기 위한 방법이 당업계에 잘 확립되어 있다.
본 명세서에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합-양성 세포는 원하는 표현형, 예컨대 고수준 발현, 향상된 성장 특성, 또는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해 원하는 생화학적 특성을 갖는 단백질을 산출하는 능력을 나타내는 하위클론을 위해 증폭 및 스크리닝된다. 이들 표현형은 주어진 하위클론의 고유 특성에 기인하거나 돌연변이에 기인할 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 불일치 수복의 억제, 또는 그러한 방법들의 조합의 사용을 통해 달성될 수 있다.
치료를 위한 GITR-특이적 항체의 사용 방법
요법에 사용하기 위한 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 특히, 이들 항체 또는 항원-결합 단편은 암의 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 예컨대 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. GITR 생물학의 2개의 측면이 그것을 다양한 암의 치료를 위한 잠재적 표적이 되게 한다. 첫째는 GITR 활성화가, 상기 상세하게 기재된 바와 같이, 면역 시스템을 활성화한다는 것이다. 추가적으로, GITR-발현 이펙터 T 세포 및 조절 T 세포는 다수의 종양 유형을 침윤하지만, 비-조혈 세포 상에는 GITR의 발현이 없거나 거의 없다. 이 분포 프로파일은 GITR-발현 세포가 종양에 농축될 수 있음을 의미한다. 활성과 분포의 이 조합은 종합적으로 GITR 표적화를 다양한 암의 치료를 위한 매력적인 접근법이 되게 한다. 항원 결합 단백질은 고형 종양뿐만 아니라 백혈병을 포함하는 혈액암 둘 모두를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
이들 방법에 사용하기 위한 항체는 본 명세서에서 상기 기재된 것들, 예를 들어 표 1에 기술된 특징부, 예를 들어 CDR 또는 가변 도메인 서열을 가진 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 및 이들 항체의 추가의 논의에 기술된 것들을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체의 면역 이펙터 특성은 당업자에게 알려진 기법에 의한 Fc 변형을 통해 조절될 수 있다. 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써, 예를 들어, Clq 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 항체-의존성 세포-매개 식작용(ADCP: antibody-dependent cell-mediated phagocytosis), 세포 표면 수용체의 하향 조절(예를 들어, B 세포 수용체(BCR: B cell receptor) 등과 같은 Fc 효과 작용을 제공하고/하거나 제어할 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 천연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다.
ADCC를 유도하는 단일클론 항체의 능력은 그의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 글리칸의 대부분에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합형(complex-type) 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 이러한 mAb는, 바이안테나리 복합체-유형의 Fc 올리고당을 보유하는 비교적 높은 탈푸코실화 항체의 성공적인 발현으로 이어지는 것으로 보고된 상이한 방법, 예컨대 배양 삼투압의 제어(문헌[Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ahead of print; PMID:20562582]), 숙주 세포주로서의 랫트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003]), 특이적으로 알파 1,6-푸코실트랜스페라제(FUT8) 유전자에 대한 작은 간섭 RNA의 도입(문헌[Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004]), 또는 베타-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 III 및 골지 알파-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 저해제, 키푸넨신의 동시발현(문헌[Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006], 문헌[Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006]; 문헌[Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008])을 사용하여 달성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, GITR 항체에 의해 유발되는 ADCC는 또한 항체 Fc 내에서의 소정의 치환에 의해 향상될 수 있다. 예시적인 치환은, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 바와 같은 아미노산 위치 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)에서의 치환이다.
약제학적 조성물 및 투여
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은, a) 본 발명의 GITR-특이적 항체 또는 항체 단편의 유효량, 및 b) 불활성이거나 생리학적으로 활성일 수 있는, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항세균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라, 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예컨대 당류, 다가알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 특히, 적합한 담체의 관련 예에는 (1) 약 1 mg/mL 내지 25 mg/mL의 인간 혈청 알부민을 함유하거나 함유하지 않는 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 식염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v 염화나트륨(NaCl)), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스가 포함되고; 또한 산화방지제, 예컨대 트립타민 및 안정제, 예컨대 Tween 20®을 함유할 수 있다.
본 발명에서의 조성물은 또한, 필요하다면 치료되는 특정 장애를 위하여, 추가의 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, GITR-특이적 항체 또는 항체 단편과 보충적 활성 화합물은 서로에게 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 가질 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 항암화학요법제이다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체, 및 고체 투여형을 포함하지만, 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사가능 또는 주입가능 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복막내, 피하) 투여이다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 일정 시간에 걸쳐 연속 주입에 의해 또는 볼루스(bolus)로서 정맥내 투여된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 이들은 국부뿐만 아니라 전신 치료적 효과를 발휘하도록 근육내, 피하, 관절내, 골액낭내, 종양내, 종양 주변, 병변내, 또는 병변 주변 경로에 의해 주사된다.
본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체를 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 후, 미세여과에 의해 멸균함으로써 비경구 투여를 위한 멸균 조성물이 제조될 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합도 사용될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예컨대 당류, 다가알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 조성물은 또한 애쥬번트(adjuvant), 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 비경구 투여용 멸균 조성물은 또한 멸균 고체 조성물 형태로 제조될 수 있는데, 이것은 멸균수 또는 임의의 다른 주사가능한 멸균 매체 중에서 사용 시에 용해될 수 있다.
GITR-특이적 항체 또는 항체 단편은 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 정제, 환제, 분말(젤라틴 캡슐, 샤세(sachet)) 또는 과립이 사용될 수 있다. 이들 조성물에서, 본 발명에 따른 활성 성분은 아르곤 스트림 하에서 하나 이상의 불활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 수크로스, 락토스 또는 실리카와 혼합된다. 이러한 조성물은 또한 희석제 이외의 물질, 예를 들어 하나 이상의 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 활석, 착색제, 코팅(당-코팅된 정제) 또는 글레이즈를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 조성물로서, 불활성 희석제, 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 파라핀유를 함유하는 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭서(elixir)가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들어 습윤, 감미, 증점, 향미 또는 안정화 제품을 포함할 수 있다.
용량은 원하는 효과, 치료의 지속기간, 및 사용되는 투여 경로에 의존하며; 그들은 일반적으로 성인의 경우에 경구로 일당 5 mg 내지 1000 mg이고, 단위 용량은 1 mg 내지 250 mg 범위의 활성 물질이다. 일반적으로, 의사는 치료를 받는 대상체의 연령, 체중 및 그에 특이적인 임의의 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 것이다.
ADCC 활성을 가지며 면역 세포를 동원하여 GITR-발현 Treg 세포를 살해할 수 있는 GITR 특이적 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 Treg 세포를 살해하는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다. 본 발명의 GITR-특이적 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것이 치료적으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 GITR-특이적 항체 또는 항체 단편은 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 더 바람직한 실시 형태에서는, 상기 개시되고 본 발명의 GITR-특이적 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물 중 하나가 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 일 실시 형태에서, 장애는 암이다. 다양한 상이한 암성 종양이 GITR 양성 면역 세포를 함유하는 것으로 입증되었다. 따라서, 이들 종양은 특히 매력적인 표적이다. 이러한 종양은, 예를 들어, 흑색종(III 기 및 IV 기 악성 흑색종을 포함함), 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암―NSCLC), 두경부암, 전립선암, 신세포 암종, 및 결장직장암을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
항원 결합 단백질로 치료할 수 있는 다른 암에는 유방, 전립선, 자궁내막, 방광, 신장, 식도, 고환, 난소, 방광, 편평 세포 암종(예를 들어, 두경부의 편평 세포 암종―SCCHN), 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 자궁경부, 뇌, 췌장, 간, 림프종, 호지킨병, 다발성 골수종, 위암, 및 성상세포암이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
전술한 암 중 임의의 것의 치료에서, 제공되는 치료 방법을 이용하여 종양을 가진 개체에서 추가의 종양 성장을 저해하고/하거나, 종양 퇴행을 유도하고/하거나, 무진행 생존을 증가시키고/시키거나, 전체 생존을 연장할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 또한 전이의 발병을 지연시키거나 예방할 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 치료의 진행을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 저해는 감소된 종양 크기 및/또는 종양 내의 대사 활성의 감소를 유발할 수 있다. 이들 파라미터 둘 모두는, 예를 들어 MRI 또는 PET 스캔에 의해 측정될 수 있다. 저해는 또한, 종양 내의 괴사 수준, 종양 세포 사멸, 및 혈관분포 수준을 확인하기 위한 생검에 의해 모니터링될 수 있다. 전이의 정도는 알려진 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하기를 포함하는(그러나 이로 제한되지 않음) 다양한 암의 전이의 치료 또는 예방에 유용하다: 흑색종, 폐, 두경부, 신세포, 결장직장, 유방, 전립선, 자궁내막, 방광, 신장, 식도, 고환, 난소, 편평 세포 암종(예를 들어, 두경부의 편평 세포 암종―SCCHN), 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 자궁경부, 뇌, 췌장, 간, 림프종, 호지킨병, 다발성 골수종, 위, 및 성상세포.
유사하게, GITR-발현 면역 세포를, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 본 발명의 GITR-특이적 항체 또는 항체 단편의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 선택된 세포 집단의 성장을 저해하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 면역요법, 즉, 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 면역자극제이다. 이러한 약제는, 예를 들어, 1) 수지상 세포의 활성화제, 2) 백신 애쥬번트, 3) T 세포 자극제, 4) 면역 체크포인트의 저해제, 및 5) 억제 세포, 사이토카인, 및/또는 효소의 저해제를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 면역자극제는 암 백신이다. 암-관련 항원으로 이루어진 암 백신에 더하여, GITR-특이적 항체와의 조합으로 유용한 백신에는 GM-CSF DNA 및 세포-기반 백신, 수지상 세포 백신, 재조합 바이러스(예를 들어 우두 바이러스) 백신, 및 열 충격 단백질(HSP) 백신이 제한 없이 포함된다. 유용한 백신은 또한 흑색종 세포로 형성된 것들과 같은 종양 백신을 포함하며; 자가유래 또는 동종이계일 수 있다. 백신은, 예를 들어, 펩티드, DNA, 또는 세포 기반일 수 있다. 일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 CD8/CD4 Ag-특이적 펩티드 백신과 조합하여 투여된다.
임상적 사용을 위하여, GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 유효량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, GITR-특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편은 GITR 양성 면역 세포를 함유하는 암성 종양의 치료에 유용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, GITR-특이적 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 일부 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 멸균성에 대해 시험된 용액으로서 투여될 것이다.
상기의 치료 및 사용 방법에서의 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 제형화할 수 있다.
GITR-특이적 항체 및 단편에 대한 효율적인 투여량 및 투여 계획은 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.001 내지 10 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 5 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001 내지 2 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 1 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001, 약 0.01, 약 0.1, 약 1 또는 약 10 mg/㎏이다.
본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약제학적 조성물에 사용되는 GITR-특이적 항체 또는 단편의 용량을 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 시작해서 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 GITR-특이적 항체의 적합한 일일 용량은 치료적 효과를 생성하기에 유효한 최저 용량인 화합물의 그러한 양일 것이다. 투여는, 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다. 일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 단편은 mg/m2로 계산된 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여량은, 예를 들어, 하기에 따라 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기반으로 할 수 있다: 용량(mg/㎏)x70. 그러한 투여는, 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 단편은 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 단편은 주 1회 제공될 때 최대 8회, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정 용량으로서 계산된 매주 투여량으로 투여될 수 있다. 그러한 계획은, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에, 필요하다면 1회 이상 반복될 수 있다. 이러한 고정 투여량은, 예를 들어, 70 ㎏의 체중 추산치로, 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기반으로 할 수 있다. 투여량은, 투여 시에 혈액 중의 본 발명의 GITR-특이적 항체의 양을 측정함으로써 결정 또는 조정될 수 있는데, 이는, 예를 들어 생물학적 샘플을 취하고, 본 발명의 GITR-특이적 항체의 GITR 항원 결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 사용함으로써 행해진다.
일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 단편은 유지 요법(maintenance therapy)에 의해, 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 주 1회 투여될 수 있다.
GITR-특이적 항체 또는 단편은 또한 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체 및 이의 단편은 또한 조합 요법으로, 즉, 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 관련된 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 항체-함유 약제는 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학치료제와의 조합을 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 다른 치료제는 하기를 포함하는 알킬화제를 포함하는 항-신생물제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 질소 머스터드, 예컨대 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 및 클로람부실; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 및 세무스틴(메틸-CCNU); Temodal™(테모졸아미드), 에틸렌이민/메틸멜라민, 예컨대 트라이에틸렌멜라민(TEM), 트라이에틸렌, 티오포스포라미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판; 트라이아진, 예컨대 다카르바진(DTIC); 엽산 유사체, 예컨대 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트, 피리미딘 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실(5FU), 플루오로데옥시우리딘, 겜시타빈, 사이토신 아라비노사이드(AraC, 사이타라빈), 5-아자사이티딘, 2,2′-다이플루오로데옥시사이티딘, 퓨린 유사체, 예컨대 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2′-데옥시코포르마이신(펜토스타틴), 에리트로하이드록시노닐아데닌(EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)을 포함하는 대사 길항 물질; 파클리탁셀과 같은 항유사분열제를 포함하는 천연 산물, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴, 및 비노렐빈을 포함하는 빈카 알칼로이드, Taxotere, 에스트라무스틴, 및 에스트라무스틴 포스페이트; 피포도필로톡신, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드; 항생제, 예컨대 악티모마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 독소루비신, 미톡산트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신 C, 및 악티노마이신; 효소, 예컨대 L-아스파라기나제; 생물학적 반응 변형제, 예컨대 인터페론-알파, IL-2, G-CSF, 및 GM-CSF; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴, 안트라센다이온, 예컨대 미톡산트론, 치환된 우레아, 예컨대 하이드록시우레아, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카르바진을 포함하는 메틸하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 예컨대 미토탄(o,p-DDD) 및 아미노글루테티미드를 포함하는 기타 약제; 아드레노코르티코스테로이드 길항제, 예컨대 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드를 포함하는 호르몬 및 길항제; Gemzar™(겜시타빈), 프로게스틴, 예컨대 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐, 예컨대 다이에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐; 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체, 및 류프롤리드; 및 비-스테로이드성 항안드로겐, 예컨대 플루타미드. 히스톤 데아세틸라제 저해제, 탈메틸화제(예를 들어, Vidaza), 및 전사 억제 해제(ATRA) 요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 후성유전학적 메커니즘을 표적화하는 요법이 또한 GITR 항체와 조합될 수 있다.
화학요법제의 추가의 특이적 예에는 탁솔, 탁센(예를 들어, 도세탁셀 및 Taxotere), 변형된 파클리탁셀(예를 들어, Abraxane 및 Opaxio) 독소루비신, Avastin®, Sutent, Nexavar, 및 다른 멀티키나제 저해제, 시스플라틴 및 카르보플라틴, 에토포시드, 겜시타빈, 및 빈블라스틴이 포함된다. MAPK 경로 저해제(예를 들어, ERK, JNK, 및 p38의 저해제), PI3키나제/AKT 저해제, 및 Pim 저해제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 키나제의 특이적 저해제가 또한 GITR 항체와 조합되어 사용될 수 있다. 다른 저해제에는 Hsp90 저해제, 프로테아좀 저해제(예를 들어, Velcade), 및 다중 메카니즘의 작용 저해제, 예컨대 Trisenox가 포함된다.
이러한 조합 투여는 동시적이거나 별도이거나 임의의 순서로 순차적일 수 있다. 동시적 투여의 경우, 작용제들은, 필요에 따라, 하나의 조성물로서 또는 개별 조성물들로서 투여될 수 있다.
일 실시 형태에서, GITR-특이적 항체 또는 이의 단편은 다른 면역조절제와 조합되어 투여되며, 면역조절제는, 예를 들어, CD40 리간드 및 항-CD40 작용제 항체와 같은 수지상 세포 활성화제뿐만 아니라, 항원 제시의 인핸서, T-세포 향성의 인핸서, 종양-관련 면역억제 인자의 저해제, 예컨대 TGF-β(전환 성장 인자 베타), 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 방법은 GITR-특이적 항체 또는 이의 단편을 백신 애쥬번트와 함께 투여하는 단계를 수반한다. 이러한 애쥬번트에는, 예를 들어, IL-12, 및 CpG(TLR 9 작용제), 모노포스포릴 지질 A(MPL― TLR4 작용제), PolyI:C 또는 PolyICLC(TLR3 작용제), 및 레시퀴모드 및 852A(TLR 7/8 작용제)를 포함하는 다양한 톨 유사 수용체(TLR: Toll Like Receptor) 작용제가 포함된다.
다른 치료 접근법에서는, GITR-특이적 항체가 T 세포 성장 인자, 예컨대 IL-15 및/또는 IL-17, 또는 이들 분자의 활성화제와 조합되어 투여된다. 관련 방법에서는, T 세포 자극제가 GITR 항체와 조합된다. 이러한 자극제에는 4-1BB의 작용제, 예컨대 작용제 항-4-1BB 항체 및 4-1BBL이 포함된다.
일 실시 형태에서는, GITR-특이적 항체 또는 이의 단편이 T 세포 체크포인트 저해제, 예를 들어, 면역 시스템에 저해 신호를 보내는 분자와 함께 투여된다. 이러한 약제의 예에는 PD-1 또는 PD-L1(B7-H1)의 저해제, 예컨대, 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb) 및 MK-3475(Merck)로도 알려진 펨브롤리주맙, 피딜리주맙(Curetech), AMP-224(Amplimmune)를 포함하는 항-PD-1 항체, 및 MPDL3280A(Roche), MDX-1105(Bristol Myer Squibb), MEDI-4736(AstraZeneca), 및 MSB-0010718C(Merck)를 포함하는 항-PD-L1 항체가 포함된다. 다른 체크포인트 저해제에는 CTLA-4의 길항제, 예컨대 항-CTLA-4 항체가 포함된다. 예시적인 항-CTLA4 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 시판되는 Yervoy®(이필리무맙)이다. 다른 예시적인 CTLA-4 항체에는 트레멜리무맙(Pfizer), 티클리무맙(AstraZeneca), 및 AMGP-224(Glaxo Smith Kline)가 포함된다.
또 다른 방법에서는, GITR 특이적 항체 또는 이의 단편이 면역억제 효과를 갖는 효소의 저해제와 조합되어 투여된다. 일례는 인돌아민 2,3-다이옥시게나제의 소분자 저해제인 1-메틸 트립토판(1MT)이다.
GITR 특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 Amgen에 의한 T-VEC(탈리모겐 라허파렙벡)와 조합되어 사용될 수 있다.
소정의 실시 형태에서는, GITR 특이적 항체 또는 이의 단편이 이중특이성 항체와 조합되어 투여된다. 이중특이성 항체는 숙주의 면역 시스템, 특히 T-세포의 세포독성 활성이 암 세포에 대항하게 할 수 있다.
GITR 특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 다양한 표적화 요법과 조합되어 투여될 수 있다. 표적화 요법의 예에는 치료 항체의 사용이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예시적인 항체에는 세포 표면 단백질 Her2, CDC20, CDC33, 뮤신-유사 당단백질, 및 종양 세포 상에 존재하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR), OX40, PD-1, CD122, CD40, CTLA-4에 결합하고, 임의로 이들 단백질을 디스플레이하는 종양 세포 상에 세포분열억제 효과 및/또는 세포독성 효과를 유도하는 것들이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 예시적인 항체에는 또한, 유방암 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 HERCEPTIN®(트라스투주맙), 및 비-호지킨 림프종 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 RITUXAN®(리툭시맙), ZEVALIN™(이브리투모맙 티욱세탄), 및 LYMPHOCIDE™(에프라투주맙)이 포함된다. 소정의 예시적인 항체에는 또한 파니투무맙(VECTIBIX®), ERBITUX®(IMC-C225); BEXXAR™(요오드 131 토시투모맙); KDR(키나제 도메인 수용체) 저해제; 항 VEGF 항체 및 길항제(예를 들어, Avastin® 및 VEGAF-TRAP); 항 VEGF 수용체 항체 및 항원 결합 영역; 항-Ang-1 및 Ang-2 항체 및 항원 결합 영역; Tie-2 및 다른 Ang-1 및 Ang-2 수용체에 대한 항체; Tie-2 리간드; Tie-2 키나제 저해제에 대한 항체; Hif-1a의 저해제, 및 Campath™(알렘투주맙)가 포함된다. 소정의 실시 형태에서, 암 요법제는 TNF-관련 폴리펩티드 TRAIL을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 종양 세포에서 세포자멸을 선택적으로 유도하는 폴리펩티드이다.
일 실시 형태에서는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 GITR-특이적 항체 또는 이의 단편이 혈관신생을 감소시키는 하나 이상의 혈관신생 억제제와 조합되어 사용된다. 소정의 이러한 약제에는, IL-8 길항제; Campath, B-FGF; FGF 길항제; Tek 길항제(미국 특허 출원 공개 제2003/0162712호(Cerretti et al.); 미국 특허 제6,413,932호(Cerretti et al.), 및 미국 특허 제6,521,424호(Cerretti et al.)); 항-TWEAK 약제(이는 항체 및 항원 결합 영역을 포함하지만 이로 제한되지 않음); 가용성 TWEAK 수용체 길항제(미국 특허 제6,727,225호(Wiley)); 인테그린이 그의 리간드에 결합하는 것을 길항하기 위한 ADAM 디스인테그린 도메인(미국 특허 출원 공개 제2002/0042368호(Fanslow et al.)); 항-eph 수용체 및 항-에프린 항체; 항원 결합 영역, 또는 길항제(미국 특허 제5,981,245호; 제5,728,813호; 제5,969,110호; 제6,596,852호; 제6,232,447호; 제6,057,124호); 항-VEGF 약제(예를 들어, VEGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역, 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 이의 리간드 결합 영역), 예컨대 Avastin® 또는 VEGF-TRAP™, 및 항-VEGF 수용체 약제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), EGFR 저해제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 예컨대 파니투무맙, IRESSA™(게피티닙), TARCEVA™(에를로티닙), 항-Ang-1 및 항-Ang-2 약제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하거나 이들의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역, 예를 들어, Tie-2/TEK), 및 항-Tie-2 키나제 저해제(예를 들어, 특이적으로 결합하여 성장 인자의 활성을 저해하는 항체 또는 항원 결합 영역, 예컨대 간세포 성장 인자(HGF, 분산 인자(Scatter Factor)로도 알려짐)의 길항제, 및 그의 수용체 "c-met"에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역(예를 들어, 릴로투무맙 및 AMG 337, Amgen); 항-PDGF-BB 길항제; PDGF-BB 리간드에 대한 항체 및 항원 결합 영역; 및 PDGFR 키나제 저해제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
GITR-특이적 항체 또는 이의 단편과 조합되어 사용될 수 있는 다른 혈관신생 억제제에는 MMP-2(매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 저해제, MMP-9(매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 저해제, 및 COX-II (사이클로옥시게나제 II) 저해제와 같은 약제가 포함된다. 유용한 COX-II 저해제의 예에는 CELEBREX™(셀레콕십), 발데콕십, 및 로페콕십이 포함된다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 GITR-특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 성장 인자 저해제와 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 약제의 예에는, EGF-R(표피 성장 인자 수용체) 반응을 저해할 수 있는 약제, 예컨대 EGF-R 항체(예를 들어, 파니투무맙(VECTIBIX®)), EGF 항체, 및 EGF-R 저해제인 분자; VEGF(혈관 내피 성장 인자) 저해제, 예컨대 VEGF 수용체 및 VEGF를 저해할 수 있는 분자; 및 erbB2 수용체 저해제, 예컨대 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체, 예를 들어, HERCEPTIN®(Genentech, Inc.)이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. EGF-R 저해제는, 예를 들어 미국 특허 제5,747,498호, 제WO 98/14451호, 제WO 95/19970호, 및 제WO 98/02434호에 기재되어 있다.
일부 치료 응용에서는, 특히 골이 부정적 영향을 받도록 암이 골에 전이된 경우, 추가의 골 손실을 저해하거나 손실된 골의 회복을 지원하는 치료제와 함께 GITR- 특이적 항체 또는 이의 단편을 투여하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, GITR-특이적 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 치료적 유효량의 골 성장 촉진제(동화작용성) 또는 골 흡수 억제제와 함께 투여될 수 있다: BMP-1 내지 BMP-12로 표기되는 골 형성 인자; 전환 성장 인자-β 및 TGF-β 패밀리 구성원; 섬유아세포 성장 인자 FGF-1 내지 FGF-10; 인터류킨-1 저해제(IL-1ra, IL-1에 대한 항체, 및 IL-1 수용체에 대한 항체를 포함함); TNFα 저해제(에타너셉트, 아달리부맙, 및 인플릭시맙을 포함함); RANK 리간드 저해제(가용성 RANK, 오스테오프로테게린, 및 RANK 또는 RANK 리간드에 특이적으로 결합하는 길항 항체, 예컨대 데노수맙(XGEVA®)), Dkk-1 저해제(예를 들어, 항-Dkk-1 항체), 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트, 및 골-증강 무기질, 예컨대 플루오라이드 및 칼슘. GITR 항체 및 이의 작용성 단편과 조합되어 사용될 수 있는 동화작용성 약제에는 부갑상선 호르몬 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF)가 포함되며, 여기서 후자의 약제는 바람직하게는 IGF 결합 단백질과 복합체화된다. 이러한 조합 치료에 적합한 IL-1 수용체 길항제는 제WO89/11540에 기재되어 있고, 적합한 가용성 TNF 수용체-1은 제WO98/01555호에 기재되어 있다. 예시적인 RANK 리간드 길항제는, 예를 들어, 제WO 03/086289호, 제WO 03/002713호, 미국 특허 제6,740,511호 및 제6,479,635호에 개시되어 있다.
일 실시 형태에서, 암의 치료 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 GITR-특이적 항체의 치료적 유효량을 방사선요법과 함께 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방사선요법은 방사선 또는 환자에 대한 방사성 의약품의 관련 투여를 포함할 수 있다. 방사선원은 치료받는 환자에 외부 또는 내부에 있을 수 있다(예를 들어, 방사선 치료는 외부 빔 방사선 요법(EBRT) 또는 근접방사선요법(brachytherapy, BT)의 형태일 수 있음). 그러한 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 방사성 원소는, 예를 들어 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오다이드-123, 요오다이드-131, 및 이리듐-111을 포함한다.
GITR의 검출 방법
샘플을 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 생물학적 샘플에서 GITR을 검출하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 샘플을 본 명세서에 기재된 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 임의의 것과 접촉시킴으로써 생물학적 샘플에서 GITR을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 샘플은 본 명세서에 기재된 하나 초과의 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 제1 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된 후에 제2 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉될 수 있으며, 여기서 제1 항체 또는 항원-결합 단편 및 제2 항체 또는 항원-결합 단편은 동일한 항체 또는 항원-결합 단편이 아니다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 표면, 예컨대 멀티웰 플레이트, 칩, 또는 유사한 기재에 부착될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 어떠한 것에도 전혀 고정 또는 부착되지 않을 수 있다.
기재된 GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 검출가능하게 표지화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지화된 항체 및 항원-결합 단편은 본 명세서에 기재된 방법을 통해 GITR의 검출을 촉진할 수 있다. 많은 그러한 표지가 당업자에게 용이하게 알려져 있다. 예를 들어, 적합한 표지는 방사선 표지, 형광 표지, 에피토프 태그, 비오틴, 발색단 표지, ECL 표지, 또는 효소를 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다. 더 구체적으로는, 기재된 표지는 루테늄, 111In-DOTA, 111In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 폴리-히스티딘(HIS 태그), 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 플루오론 염료, 옥사진 염료, 페난트리딘 염료, 로다민 염료, Alexafluor® 염료 등을 포함한다.
기재된 GITR-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 생물학적 샘플에서 GITR를 검출하기 위한 다양한 검정에 사용될 수 있다. 일부 적합한 검정은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 면역형광측정(immunofluorimetry), 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정을 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다.
GITR을 검출하기 위한 키트
생물학적 샘플에서 GITR을 검출하기 위한 키트가 본 명세서에 제공된다. 이들 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 GITR-특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
제공되는 GITR-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 용액 중에 있거나; 동결건조되거나; 기질, 담체, 또는 플레이트에 부착되거나; 검출가능하게 표지화될 수 있다.
기재된 키트는 또한 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기에 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 대상체로부터 샘플을 획득하기 위한 수단, 대조군 샘플 또는 참조 샘플, 예를 들어 느리게 진행되는 암을 갖는 대상체 및/또는 암을 갖지 않는 대상체로부터의 샘플, 하나 이상의 샘플 구획, 및/또는 본 발명의 방법의 성능 및 조직 특이적 대조물 또는 표준물을 설명한 교육용 자료를 포함할 수 있다.
GITR의 수준을 결정하기 위한 수단은, 예를 들어 완충액 또는 GITR의 수준을 결정하기 위한 검정에서 사용하기 위한 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 설명서는, 예를 들어, 검정을 수행하는 것에 대한 인쇄된 설명서 및/또는 GITR의 발현의 수준을 평가하는 것에 대한 설명서일 수 있다.
기재된 키트는 또한 대상체로부터 샘플을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이들 수단은 대상체로부터 유체 또는 조직을 획득하기 위해 사용될 수 있는 시약 또는 장비 중 하나 이상의 아이템을 포함할 수 있다. 대상체로부터 샘플을 획득하기 위한 수단은 또한 혈액 샘플로부터 혈액 성분, 예컨대 혈청을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 인간 대상체에 대한 사용을 위해 설계된다.
기재된 발명 요지의 예시적인 실시 형태
본 명세서의 발명 요지를 더 잘 그리고 더 완전히 설명하기 위하여, 이 섹션은 제시된 발명 요지의 열거된 예시적인 실시 형태를 제공한다.
열거된 실시 형태:
실시 형태
1. 하기를 포함하는 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
b. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
c. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
d. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
e. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
f. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
g. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
h. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
i. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
j. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
k. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
l. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
m. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
n. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
o. 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 또는
p. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
2. 서열 번호 39 내지 54, 63, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 영역을 포함하는 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 실시 형태 2에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 55 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 영역을 포함하는 항체.
4. 실시 형태 2에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39 내지 54, 63, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 영역 및 서열 번호 55 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 영역을 포함하는 항체.
5. 실시 형태 4에 있어서,
a. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 39를 포함하거나;
b. 중쇄 영역은 서열 번호 56을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 40을 포함하거나;
c. 중쇄 영역은 서열 번호 57을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 41을 포함하거나;
d. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 42를 포함하거나;
e. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 43을 포함하거나;
f. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 44를 포함하거나;
g. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 45를 포함하거나;
h. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 46을 포함하거나;
i. 중쇄 영역은 서열 번호 58을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 47을 포함하거나;
j. 중쇄 영역은 서열 번호 58을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 48을 포함하거나;
k. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 49를 포함하거나;
l. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 50을 포함하거나;
m. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 51을 포함하거나;
n. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 52를 포함하거나;
o. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 53을 포함하거나;
p. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 54를 포함하거나;
q. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 63을 포함하거나;
r. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 64를 포함하는 항체.
6. 실시 형태 5에 있어서, 항체가 GITR(서열 번호 62
아미노산 잔기:
a. 40 내지 45; 및
b. 75 내지 79)과 상호작용함으로써 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
7. 실시 형태 1에 있어서, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
8. 실시 형태 1에 있어서, 실시예 9에 기재된 실험 설계를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 30 nM 이상의 결합 친화도로 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
9. 실시 형태 1에 있어서, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도하는 항체 또는 항원-결합 단편.
10. 실시 형태 1에 있어서, 시험관 내에서 약 67 ng/mL 미만의 EC50으로 ADCC를 유도하는 항체 또는 항원-결합 단편.
11. 실시 형태 1에 있어서, 인간 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
12. 실시 형태 1에 있어서, Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일쇄 항체인 항원-결합 단편.
13. 실시 형태 1에 있어서, 재조합체인 항체 또는 항원-결합 단편.
14. 실시 형태 1에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형인 항체 또는 항원-결합 단편.
15. 실시 형태 1에 있어서, IgG1 동종형인 항체 또는 항원-결합 단편.
16. 실시 형태 1 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 인간 GITR 및 사이노몰거스 원숭이 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
17. 실시 형태 1 중 어느 한 실시 형태의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
18. 실시 형태 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
19. 실시 형태 18의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
20.
항체 또는 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 실시 형태 19에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 공정.
21. 실시 형태 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을, 대상체에서 암 또는 다른 신생물 병태의 증상을 경감시키기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 다른 신생물 병태의 증상을 경감시키는 방법.
22. 실시 형태 21에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
23. 실시 형태 21에 있어서,
a. 화학요법을 투여하는 단계
b. 방사선 요법을 투여하는 단계; 또는
c. 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
24. 실시 형태 23에 있어서, 추가의 치료제는 면역자극제인 방법.
25. 실시 형태 24에 있어서, 면역자극제는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, CD122 항체, CD40 항체, OX40 항체, 및 CD8 Ag-특이적 OVA 펩티드 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
26. 실시 형태 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
27. 실시 형태 1의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 위한 포장을 포함하는 키트.
실시예
하기의 실시예는 앞서의 개시내용을 보충하기 위해 그리고 본 명세서에 기재된 발명 요지에 대한 더 우수한 이해를 주기 위해 제공된다. 이들 실시예는 기재된 발명 요지를 한정하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 명백할 것이고, 이는 본 발명의 진정한 범주 내에 포함되어야 하고 그로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 재료
GITR ECD 분자:
hGITR의 아미노산 26 내지 161(서열 번호 59)에 상응하는 재조합 인간(h) GITR-Fc 융합 단백질(R&D Systems 카탈로그 번호 689-GR). 파지 패닝(phage panning) 연구를 위해 단백질을 비오티닐화하였다. 이 단백질을 또한 결합 및 친화도 측정에 사용하였다.
GITR 세포주
항-GITR 항체 반응성 확인을 위해 형질감염 또는 렌티바이러스 형질도입에 의해 HEK293F 세포에서 GITR을 발현시켜 파지 및 차세대 서열분석 패널을 시험하고 사이노-GITR에 대한 GITR mAb 공격의 교차-반응성을 점검하였다.
형질감염된 세포는 하기 GITR 서열을 제공하였다:
인간 GITR(서열 번호 60)
Figure pct00003
사이노 GITR(서열 번호 61)
Figure pct00004
렌티바이러스로 형질도입된 세포는 하기 GITR 서열을 제공하였다:
인간 GITR(서열 번호 62)
Figure pct00005
사이노 GITR(서열 번호 61)
Figure pct00006
세포를 형질감염 24시간 전에 130 RPM으로 진탕하면서, 125 ml 통기형 캡 진탕 플라스크(vented cap shake flask)에서 30 ml의 부피로 1e6 세포/ml의 밀도로 Freestyle™ 293 배지(Gibco #12338)에 넣음으로써 HEK 293F 세포의 일시적 발현을 수행하였다. 프리스타일 맥스 시약(인비트로겐 #16447)을 사용하여 형질주입을 수행하였다. 단일 30 ml 형질주입에 대해, 하나의 튜브에서 37.5 μl의 프리스타일 맥스 시약을 1 ml의 옵티멤 배지(깁코 #31985)에 희석하였다. 별도의 튜브에서, 37.5 ㎍의 DNA(300 나노그램 표적 및 37.2 ㎍의 무관한 담체 플라스미드)를 1 ml OptiMEM에 혼합하였다. 이어서, 2개의 튜브를 함께 혼합하고, 생물안전작업대에서 1분 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 HEK293F 세포의 플라스크에 직접 첨가하였다. 48시간의 성장 후에, 세포는 표시된 검정에 사용할 준비가 되었다.
Genecopoeia에 의해 생성된 전장 GITR(인간 GITR에 대한 Genecopoeia 카탈로그# LPP-U0202-LV105-200-S 및 사이노 GITR에 대한 Genecopoeia 카탈로그# LPP-U0202-LV105-200-S)을 제공하는 렌티바이러스 입자를 제조자의 프로토콜을 사용하여 세포에 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 안정한 플라스미드 통합에 대해 선택한 후에 BD Biosciences FACS Jazz 세포 분류기를 사용하여 단일 세포를 분류하였다. R&D Systems FAB689P 항-huGITR 항체로 염색하는 유세포분석법에 의해 GITR 표면 발현을 정량화하고 BD Biosciences Accuri C6 상에서 분석하였다.
실시예 2: 파지 디스플레이 기법을 사용하는 GITR 항체의 발견:
Vκ VLK3-20, VLK4-1, VLK3-11, 및 VLK1-39 경쇄 라이브러리와 쌍을 이룬 VH1-69, 3-23, 및 5-51 중쇄 라이브러리로 이루어진 신생 pIX Fab 라이브러리(문헌[Shi, L., et al J Mol Biol, 2010. 397(2):p. 385-396. 제WO 2009/085462호)를 100 nM(라운드 1 내지 3) 또는 10 nM(라운드 4)의 농도로 문헌[Rothe et al, J Mol Biol 376:1182-1200, 2008] 및 문헌[Steidl et al, Mol Immunol. 46: 135-144, 2008]에 기재된 것과 유사한 선택 공정에서 비오티닐화 인간 GITR-ECD Fc 융합에 대해 패닝하였다.
패닝의 제4 라운드 후에 pIX 유전자를 파지미드 DNA로부터 절제하여 가용성 his-태그된 Fab 코딩 영역을 생성하였다. Fab를 대장균에서 발현시키고, ELISA에서 GITR에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 약술하면, 96-웰 Nunc Maxisorp 플레이트(Nunc #437111)를 4℃에서 하룻밤 PBS 중에 5 ㎍/mL의 스트렙타비딘(Promega) 또는 양 항-인간 Fd(결합 부위 #PC075)로 코팅하였다. Fab 발현 벡터를 함유하는 세균 배양물을 탁해질 때까지(OD600 ≒ 0.6) 딥웰(deep-well) 배양 플레이트에서 1 mL의 2xYT(카르베니실린) 중에 성장시켰다. 이어서, IPTG를 1 mM의 농도로 첨가함으로써 Fab 발현을 유도하였다. 배양물을 30℃에서 하룻밤 성장시킨 후, 다음 날에 원심분리에 의해 청징화하였다. 스트렙타비딘-코팅된 플레이트를 TBS, 0.5% Tween-20(Sigma #79039-10PAK)으로 3회 세척하고, 비오티닐화 GITR-Fc로 5 ㎍/mL에서 로딩하고, 30분 동안 실온에서 유지하였다. Biomek Liquid Handling Robot(Beckman Coulter)을 사용하여 항-Fd 코팅된 Maxisorp 플레이트 및 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 둘 모두를 TBS, 0.5% Tween-20(Sigma #79039-10PAK)으로 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 웰당 200 μL의 PBS-Tween(0.5%) + 탈지분유(3%)로 블로킹하였다. 이 단계 및 모든 후속 단계에서, 플레이트를 TBS, 0.5% Tween-20(Sigma #79039-10PAK)으로 3회 세척하였다. 각각의 웰은 50 μL의 Fab 상층액을 받은 후, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척 후에, 50 μL의 염소 항-인간 카파-HRP(Southern Biotech)를 0.3% 우유를 가진 TBST 중의 1:5000 희석으로 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 50 uL의 화학발광 기질, PoD(Roche 번호 121-5829500001)를 제조자의 설명서에 따라 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 EnVision(Perkin Elmer) 플레이트 판독기 상에서 발광에 대해 판독하였다. DNA 서열분석을 위해 fab 발현 ELISA 및 GITR 결합 ELISA 둘 모두에서 양성인 클론을 선택하였다. 이 파지 패닝 공정을 통해 총 50개의 고유 Fab 서열이 발견되었다. 고유 중쇄 V-영역을 인간 IgG1_G1m(17,1) 발현 벡터 내로 클로닝하고, 고유 경쇄를 인간 카파 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 항체를 ELISA에서 결합 활성에 대해 다시 시험하였다.
실시예 3: 파지 디스플레이 기법을 통해 얻어진 GITR 항체의 초기 특성화
인간 GITR 결합 검정
조작된 세포에 대한 GITR 항체의 결합을 FACS를 사용하여 평가하였다. 스크리닝 검정의 목적은 hGITR을 발현하는 세포에 결합한 항체를 확인하는 것이었다.
약술하면, 웰당 300,000개의 세포를 96-웰 플레이트(Greiner bio one cat#651261) 내로 플레이팅하고 세포를 펠렛화하였다. 세포를 100 μL의 FACS 염색 완충액(BD Pharmingen Stain Buffer(BSA) cat #554657)으로 세척하고, 4℃에서 30분 동안 50 μL의 FACS 염색 완충액과 웰당 20 μL의 미정제 항체 상등액의 혼합물과 함께 인큐베이션하고, 200 μL의 FACS 염색 완충액으로 1회 세척하였다. 검출을 위해, FACS 염색 완충액 중의 2 ㎍/mL로 웰당 50 μL의 Alexa Fluor 488 염소 항-인간 IgG(H+L)(Molecular Probes, cat #A11013)와 함께 4℃에서 30분 동안 세포를 인큐베이션하였다 세포를 웰당 200 μL의 FACS 염색 완충액으로 1회 세척하고, 웰당 150 μL의 FACS 염색 완충액 중에 재현탁한 후, 웰당 200 μL의 FACS 염색 완충액을 함유한 FACS 튜브에 이전하였다. 이어서, FACS 분석을 실행하였다. 데이터 일관성을 위해 검정을 반복하였으며, 최고의 바인더들을 추가의 개발을 위해 선택하였다.
NF-κB- 루시페라제 유전자 검정
GITR 항체의 작용제 활성을 평가하기 위해, NF-κB- 루시페라제 유전자 검정을 사용하여 패널을 스크리닝하였다. 약술하면, 인간 GITR 발현 플라스미드와 함께 NF-κB 프로모터의 제어 하에 루시페라제 유전자를 인코딩하는 리포터 플라스미드로 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 4시간 동안 37℃에서 세포가 형질감염으로부터 회복되고 인간 GITR을 발현하도록 하였으며, 이 지점에서 검정을 수행할 수 있었다. 검정이 의도된 바와 같이 작동했음을 확인하기 위해, 재조합 인간 GITR 리간드(R&D Systems 6987-GL/CF)를 양성 대조군 웰에 2.5 마이크로그램/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 시험을 받는 항-GITR 항체를 5 마이크로그램/mL의 최종 농도로 실험 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트들을 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NF-kB 경로를 활성화하는 성공적인 GITR 신호전달이 예상되었고, 루시페라제 발현이 이어졌으며, 이는 제조자(Promega cat #E2550)에 의해 표시된 바와 같이 Steady Glo를 첨가하고 생성된 발광을 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 측정함으로써 검출할 수 있었다.
PBS 단독에 의한 처리에 비교하여 15개의 항체가 루시페라제 발현의 증가를 유도했다(도 1). PBS 단독에 의한 처리에 비교하여 루시페라제 발현의 증가를 생성한 항체는 작용제로서 예비 분류된 반면에, 나머지 항체는 길항제였을 수 있거나 신호전달에 영향을 주지 않으면서 GITR에 단순히 결합했을 수 있다.
실시예 4: 차세대 서열분석을 통한 GITR 항체의 발견
제1 세트의 항-GITR 항체의 발견에 이어서, Roche 454 서열분석 플랫폼을 사용하는 중쇄 V-영역의 차세대 서열분석을 위해, 파지 선택의 최종 라운드의 성과로부터의 DNA 샘플을 Beckman Coulter Genomics에 제공하였다. Beckman Coulter Genomics로부터의 원 데이터를 IMGT에서 초기 분석한 후에 독점 Janssen 소프트웨어 프로그램 3DX를 사용하여 내부적으로 더 면밀하게 조사하였다. 파지 선택 성과를 더 광범위하게 조사하기 위해 차세대 서열분석을 사용하는 아이디어는 발견되는 항체의 수 및 품질을 증가시키기 위한 방법으로서 최근에 개발되었다(문헌[Ravn et al, Methods 60 (2013) pg 99-110]).
IMGT에 의해 제공된 서열을 품질이 불량하거나 종결 코돈을 함유한 샘플에 대해 여과한 후, 나머지 서열을 중쇄 CDR3에 의해 분류하였다. CDR3은 항원에 대한 결합 에너지의 대부분을 공급하는 것으로 예상되고, 파지 라이브러리 내의 다양성의 대부분은 중쇄 CDR3 내에 위치하기 때문에 이 접근법이 선택되었다. DNA 합성 및 인간 IgG1_G1m(17) 벡터 내로의 클로닝을 위해 발생 빈도 및 시스테인, 메티오닌, 또는 고도로 소수성인 서열의 결여 둘 모두를 기반으로 87개의 V-영역이 선택되었다.
합성 후에, 이전에 기재된 바와 같이 추정상의 항-GITR 중쇄를 GITR에 대한 결합에 대해 시험하였다. 차세대 서열분석 데이터세트는 이들 중쇄 V-영역을 위한 적절한 경쇄 파트너에 대한 정보를 함유하지 않았으므로, 파지 라이브러리에서 발견된 하기 4개의 경쇄 생식계열 유전자 각각으로 중쇄를 동시-형질감염시켰다: Vk3-20, Vk4-1, Vk3-11, 및 Vk1-39. 이들 4개의 표준 형질감염으로부터의 미정제 항체 상등액을 ELISA에서 재조합 인간 GITR ECD-Fc 융합 단백질에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 이 검정으로부터의 최고의 바인더를 추가의 개발을 위해 선택하였다.
실시예 5: 차세대 서열분석을 통해 얻어진 GITR 항체의 초기 특성화
차세대 서열분석 데이터세트로부터의 항-GITR mAb가 ELISA에서 GITR ECD-Fc 융합 단백질에 결합하는 것으로 나타난 후에, 실시예 3에 기재된 바와 같이 서브세트를 세포-표면 GITR에 대한 결합에 대해 시험하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 NF-κB- 루시페라제 유전자 검정을 사용하여 양성 바인더를 작용제 활성에 대해 시험하였다. 40 마이크로그램/mL에서, 천연 리간드로 처리시에 관찰되는 배경에 비한 증가의 20% 이상과 동일한 루시페라제 발현의 증가를 유도한 항체는 작용제 활성을 갖는 것으로 간주되었다(도 2).
실시예 6: 사이노 교차 반응성
유세포분석법을 사용하여, 파지 디스플레이 및 차세대 서열분석 둘 모두로부터의 정제된 항체를 사이노몰거스 원숭이 GITR에 대한 결합에 대해 시험하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 0.1 mg/mL의 시험 항체와 함께 2 내지 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, PE-표지화 염소 항-인간 IgG와 함께 2 내지 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고 MACSQuant 유세포분석기 상에서 분석하였다. 양성 바인더로서 확인된 항체는, 공벡터로 형질감염된 세포의 평균 형광 강도에 비교하여 인간 또는 사이노 GITR로 형질감염된 세포의 평균 형광 강도에서 1.5 내지 2 로그 이동을 나타냈다. 결합 결과는 표2에 컴파일링되어 있다.
[표 2]
Figure pct00007
따라서, 전체적으로 16개 GITR 항체의 패널-모두 표 3에 나타냄-은 인간 및 사이노 GITR에 결합하는 것으로 확인되었다.
[표 3]
Figure pct00008
16개 GITR mAb의 VH 및 VL을 하기 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 7: 작용성 세포 살해 검정에서 GITR 항체의 평가
인간 및 사이노 GITR 둘 모두에 결합하는 항체를 ADCC 및 CDC 검정에서 활성에 대해 시험하였다. 비교를 위해 huIgG1 동종형 대조군 항체가 이들 검정에 포함되었다. 고친화도 FcγRIIIa 176V/V 다형을 발현하도록 유전적으로 변형된 NK-92 세포에 의해 실행되는 세포 살해를 검토하기 위해 ADCC 검정을 사용하였다. 하기 3개 유형의 표적 세포를 사용하였다: 인간 GITR을 내인성으로 발현하는 HuT102 세포, 안정한 혼주 HT1080-huGITR 형질감염체, 및 인간 GITR 또는 사이노 GITR로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포. ADCC 검정을 실행하기 위해, 표적 세포를 칼세인 AM으로 표지화하고, 세척하고, 검정 배지 중에 재현탁하고, 50,000개 세포 /50 마이크로리터/웰로 V 바닥 96 웰 플레이트 내에 접종하였다. 항-hGITR 또는 대조군 항체를 다양한 농도로 웰에 첨가하였다(100 마이크로리터/웰). NK-92 176V 이펙터 세포를 세척하고, 검정 배지 중에 재현탁하고, 50,000개 세포/50 마이크로리터/웰 또는 100,000개 세포/50 마이크로리터/웰로 표적 세포 및 항체와 함께 접종하였다. 배지 단독(배경 신호), 표적 세포 단독(자발적 용해 신호), 궁극적으로 Triton X-100으로 처리될 세포(최대 용해 신호), 및 1 마이크로그램/mL의 최종 농도로 동종형 대조군 항체가 대조군으로서 포함되었다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 20 마이크로리터의 2% Triton X-100의 첨가를 통해 최대 신호 웰에서 완전 세포 용해를 유도하고 플레이트를 원심분리하였다. 100 마이크로리터의 상등액을 제거하고 투명 바닥 흑색 플레이트(clear bottom black plate)에 첨가하였다. Molecular Devices SpectraMax5를 사용하여 형광 강도(FI) 단위를 측정하였다. 모든 웰로부터 배지 단독에 의해 관찰된 평균 FI를 감산한 후에 퍼센트 특이적 용해를 계산하였다. 퍼센트 특이적 용해를 결정하기 위한 수학식은 (샘플 ―자발적 용해)/ (최대 용해 ―자발적 용해) *100이었다. Prism에서 각각의 항체에 대해 반수 최대 유효 농도(EC50)의 분석을 실행하였다.
표 5는 상이한 시험 세포주에서의 GITR 항체의 활성을 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00018
실시예 8. 이중 유전자 작제 및 저-푸코오스 분자의 제조
세포주 개발을 위한 준비로, TRGB25, TRGB153, TRGB159, 및 TRGB160에 대해 이중 유전자 작제를 개시하였다. 이 공정 중에 TRGB25의 중쇄는 바람직한 인간 동종이형 IgG1_G1m(17)이 아니라 인간 동종이형 IgG1_G1m(17,1) 내에 있었음이 발견되었다. 이중 유전자 작제 중에 TRGB25로부터 중쇄 V-영역을 인간 IgG1_G1m(17) 동종이형 프레임워크 내로 전환함으로써 새로운 단백질 TRGB190을 생성하였다. 이 지점에서 TRGB160이 중쇄의 아미노 말단에 프레임워크 돌연변이를 가졌음이 또한 주목되었다. 이중 유전자의 작제 중에, TRGB160 중쇄의 아미노 말단 잔기를 Q로부터 E로 전환함으로써, 새로운 단백질 TRGB191을 생성하였다. 게다가, TRGB191의 저-푸코오스 버전, 즉, TRGB191.CLF를 제조하기로 결정하였다. 표 6에는 이 변형된 항-GITR 항체의 서열이 개관되어 있다.
[표 6]
Figure pct00019
실시예 9: SPR에 의한 친화도 측정.
ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템(BioRad)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 재조합 인간 GITR ECD에 대한 GITR 항체의 친화도를 측정하였다.
GITR ECD 회합 및 해리의 속도를 각각의 변이체에 대하여 측정하였다. 아민-커플링 화학에 대한 제조사의 설명서를 사용하여, 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체를 GLC 칩(BioRad)의 표면에 공유 커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다. 대략 8800 RU(반복 단위)의 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(Jackson ImmunoResearch laboratories 제품 번호 109-005-098)를 고정화하였다. 고정된 RU는 또한 염소 항-마우스 Fc 항체를 포함하였는데, 염소 항-마우스 Fc 항체는 여기에서 기록된 것들에 포함되지 않은 다른 항체들을 포획하기 위해 첨가하였다. 혼합물은 1:1이기 때문에, 고정된 이들 RU의 약 50%는 염소 항-인간 Fc인 것으로 예상된다. 25℃에서 전개 완충액(running buffer)(PBS pH 7.4, 0.005% P20, 3 mM EDTA) 중에 결합 속도론 실험(kinetic experiment)을 수행하였다. 100 nM에서 시작하여 인간 GITR ECD 또는 사이노 GITR ECD의 4-배(1:3) 연속 희석물을 전개 완충액 중에 제조하였다. 평균 300 RU의 mAb(174 내지 600)를 센서 칩의 각각의 채널 상에 포획하였다. 포획된 후보를 함유하지 않는 참조 스폿(염소 항-인간 IgG(Fc)-변형된 표면)을 참조 표면으로서 사용하였다. mAb를 포획한 후, 40 μL/min으로 항원을 3분 주입하고(회합 단계), 이후에 10분간 완충액을 유동시켰다(해리 단계). 100 μL/min으로 0.85% 인산을 주입함으로써 칩 표면을 재생시켰다. 데이터를 기기 소프트웨어에서 처리하였다. 분석물 주입에 대한 참조물질-감산된 곡선으로부터 완충액 주입에 의해 생성된 곡선을 감산함으로써, 데이터의 이중 참조 감산을 수행하였다. 군 적합도(group fit)와 함께 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 데이터의 속도론 분석을 수행하였다. 각각의 mAb에 대한 결과를 kon 또는 결합-속도(on-rate), koff 또는 해리-속도(off-rate), 및 KD(평형 해리 상수)의 형식으로 보고하였다(표 7).
[표 7]
Figure pct00020
결과는, 인간 GITR ECD에 대한 결합의 5-배 이내의 친화도로 사이노 GITR ECD에 결합하는 목적을 충족한 항체가 거의 없음을 시사했다. 이 결과는, 대부분의 항체가 인간 GITR 단백질을 발현한 세포에 대해 나타난 것보다 단지 약간 덜한 효능으로 사이노 GITR을 발현한 세포를 살해한 실시예 7에 논의된 세포 살해 데이터와 상충되는 것으로 보였다. 곤충 세포에서 과발현된 절단된 GITR 세포외 도메인이 적절하게 폴딩되지 않았을 수 있으며, 이는 세포 살해와 친화도 분석 실험 사이의 불일치를 유발했을 가능성이 있다. 추가로, 인간 세포에서 발현된 전장 GITR은 아마도 적절하게 폴딩되었고, GITR-발현 세포에 대한 결합 친화도의 측정은 아마도 관찰된 세포 살해 활성과 일치할 가능성이 있다. 이들 가능성을 시험하기 위해 인간 또는 사이노 GITR을 발현하는 세포에 대한 이들 항체의 친화도를 평가해야 한다.
실시예 10: MSD에 의한 친화도 측정.
인간 및 사이노 GITR 형질감염 HEK293 세포주와 항-GITR 항체의 결합을 평가하기 위해, MSD-세포 친화도 기법(MSD-CAT: MSD-Cell Affinity Technology)을 사용하여 세포-기반 친화도 실험을 수행하였다. MSD-CAT는 고처리량 포맷으로 온전한 세포를 사용하여 친화도를 결정하기 위한 무표지 방법으로서 사내에서 개발하였다. 임의의 발현된 GITR이 없는 모 HEK293 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다.
이 기법에 의해 상호작용의 친화도를 측정하기 위해, 고정 농도의 항-GITR 항체(300, 60, 12, 2.4 pM) 및 변화하는 농도의 인간 또는 사이노 GITR 발현 세포(2.0 x107 내지 1.0 × 103개 세포/mL)를 가진 용액의 시리즈를 제조하고, 4℃에서 18시간 동안 플레이트를 회전시킴으로써 평형에 도달하게 하였다. 이들 샘플을 0.05% 아지드, 1% BSA, 3 mM EDTA를 가진 DMEM Glutamax 배지(Invitrogen, Prod# 10569-044) 중에 제조하였다. 평형 후에, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하고, 상등액에서 유리 항-GITR mAb를 검출하였다. MSD 판독기 기기를 사용하여 전기화학발광(ECL)에 의해 혼합물 중의 유리 항-GITR mAb를 검출하였다. 검출을 위해, MSD-스트렙타비딘 플레이트(MesoScale Discovery, Prod# L11SA-1)를 검정 완충액 중의 0.1 ㎍/mL의 비오티닐화 인간-GITR 항원으로 50 μL/웰에서 코팅하고 하룻밤(4℃에서 ~16시간) 평형시켰다. 평형 후에, 코팅 항원의 제거 없이 150 μL/웰의 검정 완충액을 첨가함으로써 플레이트를 블로킹하고, 주위 온도에서 ~1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 원심분리한 플레이트로부터의 상등액을 항원-코팅된 플레이트에 이전하고(50 μL/웰), 60분 동안 인큐베이션한 후, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후에, 50 μL/웰의 0.7 ㎍/mL 루테늄-접합 F(ab')2 당나귀 항-인간 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch; Prod# 709-006-149)를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후에, 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척하고 웰당 150 μL의 MSD 판독 완충액(MesoScale Discovery Cat# R92TC-1; d. 저장액을 H2O에 1:3 희석함으로써 제조함)을 첨가하였다. 플레이트를 발광 수준에 대해 MSD Sector Imager 6000 판독기 상에서 즉시 판독하였다. MSD에 의해 검출된 ECL 신호는 혼합물 중의 % 유리 항체로 표현하였으며, Prism 소프트웨어에 소개된 (질량 작용의 법칙으로부터 도출된) 사용자 지정 식(user defined equation)을 사용하여 데이터를 분석하여 친화도를 결정하였다. 수용체 농도의 함수로서의 유리 mAb 농도에 1:1 결합 모델로 비-선형 최소 제곱 분석을 적용하여 결합 친화도를 결정한다. 표 8은 모든 시험 분자에 대한 세포 결합 친화도를 요약한다.
[표 8]
Figure pct00021
TRGB25, TRGB190, TRGB160, TRGB191.CLF, 및 TRGB153에 대하여, MSD-CAT에 의해 세포-표면 발현 GITR에 대한 친화도를 측정하였다. 4개의 연구를 수행하였으며, 여기서 최초 연구는 예비 데이터로 간주되었고 단 하나의 반복실험으로 이루어졌다. 더 많은 수의 반복으로 추가의 연구를 수행하였다(연구 2 및 연구 3). 연구 2 및 연구 3은 TRGB190의 경우에 사이노 GITR에 대한 mAb 친화도가 인간 GITR에 대한 것보다 1.5-배 내지 1.6-배 더 약함을 시사한다. 연구 2 및 연구 3은 또한 TRGB191.CLF의 경우에 사이노 GITR에 대한 mAb 친화도가 인간 GITR에 대한 것보다 1.5-배 내지 3.2-배 더 약함을 시사한다. 추후에 연구 4를 실행하여 이전의 연구로부터의 TRGB191.CLF 데이터를 확인하였다. 연구 4에서의 데이터는 TRGB191.CLF의 경우에 사이노 GITR에 대한 mAb 친화도가 인간 GITR에 대한 것보다 2.0-배 더 약함을 시사한다.
실시예 11: NF-kB를 통한 GITR 신호 및 신호전달에 대한 GITRL 차단의 효과
적응 면역을 촉진하기 위해서는 항원 프라이밍된 T 림프구가 증폭되고 지속될 필요가 있다. 활성화된 T 세포에서 NF-κB 경로는 필요한 성장 및 생존 신호에 크게 기여한다. NF-kB 전사 인자의 잘 알려진 표적 유전자인 인터페론 감마(IFNγ)는 외래 병원체에 대한 면역에 있어서 결정적인 사이토카인이며, 일단 항원-특이적 면역이 발생하면 Th1 CD4 및 CD8 세포독성 T 림프구(CTL) 이펙터 T 세포에 의해 생성된다(문헌[Schoenborn JR, Wilson CB. Adv Immunol. 2007;96:41-101]).
GITR이 그의 구성원인, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원들은 T 세포에 동시-자극 신호를 제공할 수 있다. 이는 그들 각각의 리간드에 대한 결합에 의해, 그리고 TRAF(TNF 수용체 관련 인자)로 알려진 어댑터 단백질의 동원을 통해 개시되며, 이는 NF-κB 경로를 통해 신호를 전달할 수 있다. 게다가, 동시-자극 신호전달의 강도는 수용체 올리고머화에 의존하며, 이는 삼량체 또는 육량체 가용성 리간드로, 또는 항체-매개 가교-결합을 통해 달성될 수 있다.
NF-κB 활성에 대한 항-GITR 항체 라이게이션의 효과를 검출하기 위해, HEK-Blue NF-κB 시스템(Invivogen)의 변형된 버전을 이용하였다. 이들 세포는 5개의 NF-κB 및 AP-1 결합 부위에 융합된 최소 프로모터의 제어 하에 SEAP(분비된 태아 알칼리성 포스파타제(Secreted Embroyonic Alkaline Phosphatase)) 리포터 유전자를 발현한다. 그들을 안정적으로 형질감염시켜 인간 GITR을 발현시켰다. 이 시스템에서 GITR 수용체 가교결합은 NF-κB 활성을 추진하며, 이는 상등액 중의 SEAP 분비에 의해 검출될 수 있다. 삼량체 가용성 GITR 리간드 키메라 단백질(R&D Systems)을 양성 대조군으로 사용하였다.
"작용제" 시험을 위해 16 내지 20시간 동안 5X 과량의 가교결합제 항체(각각 항-HA 또는 항-Fc)의 존재 하에 25,000개의 HEK-Blue-NF-κB-GITR 세포를 가용성 GITRL(100 ng/mL에서 시작함) 또는 항-GITR 항체(1 ug/mL에서 시작함)의 1:2 연속 희석액으로 처리하였다. 상등액(40 uL)을 제거하고 160 uL의 Quanti-Blue™ 시약과 혼합하였다. 발색 반응물을 37℃에서 최대 1시간 동안 인큐베이션한 후에 분광광도계에서 OD650 nm로 판독하였다.
"길항제" 모드에서 항체를 시험하기 위해, 25 ng/mL 일정 농도의 가용성 GITRL의 존재 하에 항-GITR 항체의 1:2 연속 희석액(2 ug/mL에서 시작함)으로 세포를 처리하였다. 길항제는 가용성 GITRL의 결합 및 NF-κB 활성을 50% 초과만큼 차단한 항체로서 정의되었다. 대표적인 그래프가 하기 제공되며, 이는 실험 가변성을 예시하는 역할을 한다.
작용제 모드에서, 항-GITR 항체는 HEK-Blue-NF-κB-GITR 세포 상의 GITR을 가교-결합시켜 동종형 대조군 항체 CNTO3930에 비교하여 NF-κB 활성의 용량-의존적 증가를 야기할 수 있다(도 3). sGITRL의 존재 하에, 일부 항-GITR 항체는 sGITR-의존성 NF-κB 활성화의 수준을 감소시키는 것으로 관찰되는 반면에, 다른 항체는 심지어 400X의 농도에서 사용되는 경우에도 그렇지 않다. TRGB191.CLF, GTRB45, 및 GTRB49는 GITRL:GITR 상호작용을 검정 가변성에 의한 것으로 볼 수 있는 30%를 초과하여 차단하는 것으로 나타나지 않는다. GTRB45 및 GTRB49는 특성화되지 않은 항체이며, 이 또한 GITR에 결합한다.
실시예 12. GITR 항체는 CMV 및 TT 항원에 대한 기억 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다
면역의 특질은, 후속의 노출시에 면역 반응이 더 신속하게 시작될 수 있도록 하는 외래 항원에 대한 기억 T 세포의 생성이다.
거대세포바이러스(CMV)는 헤르페스바이러스이며, 건강한 성인 및 아동에서는 통상적으로 무증상인 통상의 감염이다. 50 내지 80%의 성인이 그들이 40세에 도달할 때까지 CMV로 감염되는 것으로 추산된다. 파상풍 독소(TT: tetanus toxin)는 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)라고 불리는 세균에 의해 생성된다. 미국에서 대부분의 성인은 파상풍에 대해 6세 전에 5회 백신 접종을 하고 이후에 매 10년마다 부스터를 받는다.
혈청-양성 개체를 그들의 각각의 항원에 노출시킴으로써, 리콜 반응(recall response)을 시작하도록 기억 T 세포를 재활성화할 수 있다. GITR 발현은 T 세포 상에서 상향조절되는 것으로 나타났고 GITRL은 항원 제시 세포 상에서 상향조절되는 것으로 나타났다. 작용제 GITR 항체는 GITR을 통해 신호를 전달하고 항원 특이적 면역 반응을 추가로 향상시킴으로써 T 세포 활성화를 강화할 수 있었다.
인터페론 감마(IFNγ)는 외래 병원체에 대한 면역에 있어서 결정적인 사이토카인이며, 일단 항원-특이적 면역이 발생하면 Th1 CD4 및 CD8 세포독성 T 림프구(CTL) 이펙터 T 세포에 의해 생성된다(문헌[Schoenborn JR, Wilson CB. Adv Immunol. 2007;96:41-101]).
여기서 본 발명자들은, IFNγ 분비에 의해 측정될 때 T 세포 활성화를 향상시키는 그들의 능력에 대해 본 발명자들의 항-GITR 항체를 특성화하기 위한 CMV 및 TT 리콜 검정을 개발하였다. 약술하면, CMV 및 TT에 대한 혈청-양성 공여자로부터 얻어진 150,000개의 PBMC를 0.1 ug/mL의 CMV 항원 또는 TT 항원(CMV 전체 항원, Astarte #1004; TT 항원, Astarte #1002)의 존재 하에 5 ug/mL에서 시작하여 156 ng/mL까지의 시험 항체의 1:2 연속 희석액(x-축 상에서 좌측으로부터 우측으로)으로 사전-코팅된 웰 내에서 인큐베이션하였다. 4 내지 6일 후에 상등액을 수확하고 IFNγ 수준을 MSD에 의해 정량화하였다. 공여자의 반응성을 평가하기 위해 항원 단독 대조군을 사용하였고 CNTO3930이 항체 동종형 대조군이었다. 각각의 항체 농도를 반복실험으로 실행하였다(n=6).
IFNγ 분비에 의해 측정될 때, TRGB191.CLF는 CMV-의존성 기억 T 세포 활성화를 용량 의존적 방식으로 증대시키며, [Ab]=5 ug/mL에서 피크를 나타낸다(도 4a). TT-리콜 검정에서, 피크 T 세포 동시-활성화는 [Ab]=625 ng/mL에서 관찰되었다(도 4b).
실시예 13. 항-GITR 단일 약제 면역요법은 강건한 항-종양 면역을 유도한다
항-종양 면역에 대한 항-GITR의 효능은 숙주가 온전한 면역 시스템을 갖는 종양 모델에서만 연구할 수 있다. 이러한 이유로, GITR 마우스 대리 항체, DTA-1은 각각 Balb/C 또는 C57/BL6 마우스에서 확립된 동계 결장 암종 모델, CT26 및 MC38에서 연구하였다.
마우스에 5 × 105개의 CT26 또는 MC38 종양 세포를 우측 옆구리 상에 피하(sc) 이식하였다. 종양 세포 이식 후 제7일에, 각각 대략 85 ㎣ 또는 120 ㎣의 평균 종양 크기를 가진 실험군으로 마우스를 무작위 배정하였다.
마우스에 DTA-1(BioXcell #BE0063) 또는 랫트 IgG2b 동종형 대조군(클론 LTF-2, BioXcell #BE0090)을 제7일, 제11일, 및 제14일에 200 ㎍/동물로 총 3 용량에 대해 q3d 내지 q4d 복막내 투여하였다(n=10/군). 연구의 종료까지 주 2회 종양을 캘리퍼 측정하였다. 종양 부피는 수학식: 종양 부피(㎣) = (l × w2/2)를 사용하여 계산하였으며; 여기서, 캘리퍼 측정에 의해 결정될 때, 'l'은 종양의 길이를 나타내고, 'w'는 종양의 폭을 나타내며, 연구 전체에 걸쳐 주 2회 모니터링하였다. 퍼센트 종양 성장 저해(%TGI)는 치료군 대 대조군의 평균 종양 부피 사이의 차이로서 정의되었고, %TGI = [(TVc-TVt)/TVc)*100]으로 계산되었으며, 여기서 TVc는 주어진 대조군의 평균 종양 부피이고, TVt는 치료군의 평균 종양 부피이다. NCI 기준에 의해 정의된 바와 같이, ≥ 60% TGI가 생물학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.
MC38 모델에서, 통계적으로 유의적인 종양 성장 저해가 DTA-1 치료에 의해 달성되었으며(제21일에 동종형 대조군에 비해 80% TGI, p <0.0001), 종양 퇴행은 DTA-1 치료 후 제14일에 이미 관찰되었고, 5/10마리 동물에서의 완전한 반응(CR)은 제28일까지 달성되었다. CR은 지속적인 것으로 나타나며, 최종 치료 용량 후 최대 35일까지 재-성장이 관찰되지 않는다.
CT26 모델에서는, 동종형 치료 대조군 동물에 비교하여 통계적으로 유의적인 종양 성장 저해가 DTA-1 치료에 의해 달성되었으며(제27일에 >65% TGI, p < 0.0001), 종양 퇴행은 군의 반수에서(5/10마리 동물) 제14일에 이미 관찰되었고, 완전한 반응(CR)은 제31일까지 관찰되었다(도 5). CR은 지속적인 것으로 나타나며, 최종 치료 용량 후 최대 42일까지 재-성장이 관찰되지 않는다.
실시예 14. 면역 체크포인트 항체 및 T 세포 작용제 항체를 이용한 항-GITR 조합 요법은 항-종양 면역을 증대시킨다
MC38 동계 결장 암종 모델을 사용하여 항-PD-1, 항-CTLA-4 체크포인트 차단, 또는 항 OX-40 항체와 조합된 조합 항-GITR 요법을 평가하였다.
마우스에 5 × 105개의 MC38 종양 세포를 우측 옆구리 상에 피하(sc) 이식하였다. 종양 세포 이식 후 제14일 내지 제21일에, 대략 200 ㎣의 평균 종양 크기를 가진 실험군으로 마우스를 무작위 배정하였다. 마우스에 대리 항-GITR(DTA-1, BioXcell #BE0063), 항-PD-1(RMP1-14, BioXcell #BE0146), 항-CTLA-4(9D9, BioXcell # BP0164), 항-OX40(OX-86, BioXcell # BE0031), 또는 랫트 IgG2b 동종형 대조군(LTF-2, BioXcell #BE0090)을 무작위 배정 후 제1일, 제5일, 및 제9일에 100 ㎍/동물로 총 3 용량에 대해 q4d 복막내 투여하였다(n=10/군). 연구의 종료까지 주 2회 종양을 캘리퍼 측정하였다. 종양 부피는 수학식: 종양 부피(㎣) = (l × w2/2)를 사용하여 계산하였으며; 여기서, 캘리퍼 측정에 의해 결정될 때, 'l'은 종양의 길이를 나타내고, 'w'는 종양의 폭을 나타내며, 연구 전체에 걸쳐 주 2회 모니터링하였다. 퍼센트 종양 성장 저해(%TGI)는 치료군 대 대조군의 평균 종양 부피 사이의 차이로서 정의되었고, %TGI = [(TVc-TVt)/TVc)*100]으로 계산되었으며, 여기서 TVc는 주어진 대조군의 평균 종양 부피이고, TVt는 치료군의 평균 종양 부피이다. NCI 기준에 의해 정의된 바와 같이, ≥ 60% TGI가 생물학적으로 유의적인 것으로 간주되었다.
종양이 더 컸을 때 치료를 개시하였고 투여량이 200 ㎍/마우스로부터 100 ug/마우스로 감소되었음에도 불구하고, 동종형 대조군 코호트에 비교하여 통계적으로 유의적인 종양 성장 저해가 항-GITR 치료에 의해 달성되었다. 항-GITR + 항-PD-1 조합군에서, 5/10마리 동물에서의 종양 퇴행은 무작위 배정 후 제26일까지 관찰되었다(도 6). 항-GITR + 항-CTLA-4 조합군에서, 3/10마리의 동물에서는 종양 퇴행이 관찰되었고 2/10마리의 동물에서는 지연된 종양 진행이 관찰되었다(도 7). 마지막으로, 항-GITR(d1) + 항-OX40(d5, d9)의 조합은 항-GITR 요법 단독(d1, d5, d9) 및 항-OX40 단독(d5, d9)보다 더 양호했다(도 8).
실시예 15. 백신 접종을 동반하는 조합된 항-GITR 및 항-PD1 요법은 비-종양 보유 마우스에서 강건한 항원-특이적 CD8 + T 세포 증폭, 작용, 및 분화를 유도한다.
PD-1 차단과 함께 GITR을 표적화하는 조합 요법이 백신 세팅에서 Ag-특이적 CD8+ T 세포 반응을 증대시키는 메카니즘을 평가하였다. 이를 다루기 위해, 비-종양 보유 마우스를 OVA 면역우성 CTL 에피토프 OVA257-264 펩티드 백신(이하 Vax라고 지칭함)으로 1회 면역화하고, 제0일, 제3일, 및 제6일에 200 ㎍의 항-GITR로 치료하고, 제3일, 제6일, 제9일, 및 제12일에 200 ㎍의 항-PD-1로 치료하였다. 세포용해 활성을 입증하는 증가된 수준의 비장 Ag-특이적 IFNγ ELISpot 반응, 다작용성 CD8+ T 세포 반응, 및 증가된 수준의 CD107a/IFNγ CD8+ T 세포(각각 도 9a, 도 9b, 및 도 9c)에 의해 증명되는 바와 같이, 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 대조군에 비해 CD8+ 이펙터 작용을 증대시켰다. 다른 치료 및 대조군과 비교하여, 삼중 요법은 단일 IFNγ, 이중 IFNγ/TNFα, 및 삼중 IFNγ/TNFα/IL-2를 발현하는 다작용성 이펙터 CD8+ T 세포의 유의적으로 더 높은 빈도를 유발했다(도 9b). OVA267-264 H-2Kb-SIINFEKL 사량체를 이용한 직접 염색에 의해, Vax/항-GITR/항PD-1은 제7일 및 제14일에 말초 혈액 중의 OVA 사량체-특이적 CD8+ T 세포 반응의 빈도를 유의적으로 증폭하였으며(도 9d 및 도 9e), 이는 표적-특이적 CD8+ T 세포의 수송을 제시한다. Th1 염증성 사이토카인을 분비하는 이펙터 세포의 높은 빈도는 항-GITR/항-PD-1의 생체내 조합이 백신-유도 Ag-특이적 CD8+ T 세포 반응을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
백신 프라이밍 후 14일에, CD44 및 CD62L의 표면 발현에 의해, 조합 요법이 Ag-특이적 CD8+ T 세포 분화를 기억 표현형에 비해 이펙터를 향해 편향시킨 정도를 결정하였다. 중심 기억(CM)에 대한 표현형 프로파일은 전형적으로 CD44+ 및 CD62L+이고, 이펙터 기억(EM) 세포는 CD44+ 및 CD62L-이다. 다른 군에 비교하여 삼중 조합 요법이 제공된 마우스에서는 사량체 OVA-특이적 EM 및 CM CD8+ T 세포 집단의 유의적인 증가가 관찰되었다(도 9e). 추가로, KLRG1+CD8+ T 세포의 우세한 집단은 방어 면역을 위한 최적의 이펙터 서브세트이고(25-27), 아마도 암 면역요법의 효능과 상관관계가 있는 필수 서브세트임이(23,28-29) 강조되었다. 그러므로, 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G, 구성원 1(KLRG1)의 세포 표면 발현을 발현하기 위한 Ag-특이적 CD8+ T 세포 집단의 표현형이 상관관계로서 특성화되었다. 도 9f에 나타낸 바와 같이, 사량체-특이적 KLRG1+ 이펙터 기억 CD8+ T 세포의 백분율은 대조군과 비교하여 삼중 조합군에서 유의적으로 더 높았다 종합하면, 이들 결과는 백신 접종을 동반하는 항-GITR/항-PD-1 조합이 생체내에서 강력한 Ag-특이적 기억 CD8+ T 세포의 증폭 및 작용을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 16. 백신 접종을 동반하는 조합 요법은 종양-보유 마우스에서 종양 퇴행을 유도하고 생존을 향상시켰다.
비-종양 보유 세팅에서 삼중 조합 요법에 의해 유도된 Ag-특이적 이펙터 CD8+ T 세포 반응의 증가를 고려하여, 다음 질문은 면역원성이 불량한 B16-OVA 흑색종 모델을 사용하여 조합이 항종양 반응을 유도할 수 있을 것인지 여부였다. 무경험 수용자 B6 마우스의 코호트(n = 10/군) 내로 B16-OVA 종양 세포를 이식하였다. 이식 후 7일에 종양이 ~30 내지 40 ㎣의 평균 크기에 도달했을 때, 마우스를 무작위 배정하고 도 10a에 개관된 바와 같은 요법으로 치료하였다. 백신이 없는 항체 계획은 종양을 보통으로 지연시켰으나, 아마도 Ag-특이적 T 세포의 약한 유도로 인해 종양 제거로 이어지지는 않았다. 유사하게, Vax 단독 또는 항 GITR 또는 항 PD-1 mAb와의 조합은 10 내지 20% 초과의 생존을 유발하지 않았다. 그러나, Vax/항-GITR/항-PD-1로 치료한 마우스에서의 종양은 다른 모든 군보다 유의적으로 더 느리게 성장했다(도 10b 내지 도 10c). 흥미롭게도, 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 다른 조합 요법 또는 백신 단독에 비해 대략 50%의 마우스에서 종양 퇴행 및 생존을 유의적으로 향상시켰다(도 10c 내지 도 10d). 종합하면, 데이터는 항-GITR 표적화 및 항-PD-1 차단 조합이 백신과 상승작용하여 전체 생존을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 17. 조합된 Vax/항-GITR/항-PD-1 면역요법은 Ag-특이적 다작용성 CD8 + T 세포를 유도하고 종양에서 Treg 집단을 감소시킨다.
조합 요법의 작용 메카니즘을 이해하기 위해, 다양한 면역요법 후에 종양으로부터 단리된 CD8+ 이펙터 및 CD4+ Treg의 Ag-특이적 표현형 및 작용성 반응을 특성화하였다. 항-종양 면역에서의 다작용성 이펙터 CD8+ T 세포 면역의 중요성(문헌[Villarreal DO, et al. Cancer Res 2014;74:1789-800]; 문헌[Slaney CY, et al. Cancer Res 2014;74:7168-7174])을 고려하여, 종양 이식 후 15일에 생체외 OVA257-264 SIINFEKL 펩티드 자극에 반응하는 Ag-특이적 CD8+ T 세포 집단 및 그의 IFNγ 및 TNFα의 발현을 측정하였다(도 11a). Vax/항-GITR/항-PD-1 조합 요법은 다른 모든 군에 비교하여 종양에서 이펙터 CD8+ T 세포로부터의 IFNγ 및 TNFα 생성을 유의적으로 증가시켰다(도 11a). 또한, 종양 내의 OVA-특이적 IFNγ/TNFα 이중-양성 CD8+ T 세포의 더 높은 빈도에 의해 예시되는 바와 같이, Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 상승적인 효과를 나타냈다(도 11a). 세포용해 CD8+ CTL이 종양에 대한 보호에 있어서 결정적 성분임을 고려하여(문헌[Villarreal DO, et al. Cancer Res 2014;74:1789-800]; 문헌[Slaney CY, et al. Cancer Res 2014;74:7168-7174]), 세포가 탈과립화를 겪는 세포용해 잠재력을 발현 마커 CD107a에 의해 결정하였다. 결과는 Vax/항-GITR/항-PD-1로 치료한 종양-보유 마우스로부터 단리된 CD8+ 종양 침윤 림프구(TIL)가 대조군에 비교하여 OVA257-264에 대한 용해 활성을 가진 CD8+ T 세포의 유의적으로 더 높은 빈도를 가졌음을 나타내며, 이는 이들 T 세포가 종양 세포를 표적화하기 위한 더 큰 잠재력을 가짐을 제시한다(도 11b). 삼중 조합은 또한 종양 내로의 사량체 OVA-특이적 CD8+ T 세포 수송의 더 높은 빈도를 유도했다(도 11c). 추가로, PMA/ION으로 자극할 경우에 IFNγ, TNFα를 분비하고/하거나 CD107a를 발현하는 CD8+ T 세포의 빈도에서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 이는 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1이 전체적으로 더 많은 작용성 CD8+ T 세포 반응을 유도했음을 시사한다(도 11d). PMA/ION으로 자극한 Vax/항-GITR/항-PD-1 치료 TIL은 CD107a+IFNγ+를 동시발현하는 세포용해 CD8+ T 세포의 더 높은 빈도를 가졌다. 이는 세포용해 활성의 실질적인 증가를 그의 마우스에서 확립된 종양의 유의적인 제어 및/또는 퇴행과 관련시킨다.
항-GITR mAb의 일 메카니즘이 종양 내의 CD4+ Treg를 감소시키는 것임을 고려하여(문헌[Cohen AD, et al. PloS one 2010;5:e10436]; 문헌[Schaer DA, et al. Curr Opin Immunol 2012;24:217-224]; 문헌[Schaer DA, et al. Immunother Cancer 2014:15:2-7]), 종양 내의 이들 세포에 대한 조합된 Vax/항-GITR/항-PD-1 면역요법의 효과를 평가하였다. 그러나, 종양 내의 Treg 집단을 평가하기 전에, 도 10의 계획을 사용하지만 무경험 보유 마우스에서, 제14일에 비-종양 보유 마우스에서 비장 Treg 집단을 모니터링하였다. 다른 면역치료군에 비교하여 Vax/항-GITR/항-PD-1 치료군에서 Treg의 유의적인 감소가 관찰되었다(도 12a). 그러므로, 이들 결과를 기반으로, 삼중 조합 요법은 종양 내의 Treg의 감소로 이어질 것임이 예측되었다. 종양 이식 후 제15일에 Treg 집단을 모니터링한 경우, 항-GITR/항-PD-1 및 Vax/항-GITR/항-PD-1 면역요법 둘 모두는 유사하게, 그리고 대폭으로, 종양 내의 침윤 Treg를 감소시켰으며(도 12c 내지 도 12d), 이는 둘 모두의 세팅에서 조합 항-GITR이 종양 침윤 Treg를 감소시킬 수 있음을 시사한다. 전체적으로 삼중 조합은 모든 치료군에 비교하여 종양 내의 Treg의 더 양호한 감소를 나타냈다. 백신 접종한 군의 대부분에서의 Treg 집단의 전체 감소는 잠재적으로 TME를 억제성으로부터 염증성으로 이동시키는 TME 내의 바람직한 Th1 반응으로 인한 것이었다(문헌[Tatsumi T, et al. J Exp Med 2002;196:619-628]; 문헌[Fridman WH, et al. Nat Rev Cancer 2012;12:298-306]). 도 9 및 도 11a에서 입증된 바와 같이 아마도 펩티드 백신에 의해 유도된 Ag-특이적 CTL 반응의 유도로 인해, 항-GITR/항-PD1을 제외한 모든 면역요법은 종양 내로의 CD8+ T 세포 침윤을 강력하게 증가시켰다(도 12b). 결과로서, 임의의 다른 Ab 조합 요법에 비해 통계적으로 우월한 삼중 조합 요법에 의해, 종양 내의 CD8/Treg 비가 현저하게 증가했으며(도 12d), 이는 흑색종 모델에서의 치료 효능에 대한 상관관계로서 기재된 반응이다(문헌[Quezada SA, et al. J Clin Invest 2006;116:1935-1945]). 종합적으로, 종양-반응성 CTL 반응을 향상시키고, Treg을 감소시키고, 종양 내의 Treg에 대한 이펙터 T 세포의 더 높은 비를 추진하는 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1의 상승적인 효과는, 종양 제거를 더 매개할 수 있는 더 Ag-특이적인 염증성 미세환경을 나타낼 수 있다.
실시예 18. 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 CD8 + T 세포에 의해 매개된 B16-OVA 종양 거부를 유도하고 장기 기억을 유발했다.
종양-침윤 CD8+ T 세포는 Vax/항-GITR/항-PD-1 조합 요법에서 면역화 펩티드에 대한 상승적인 향상을 나타냈으며, 이는 강력한 CTL 반응의 우월한 유도가 조합 요법의 효능에 결정적이었을 가능성이 매우 높음을 시사한다. 그러므로, 조합 요법에 의해 유도된 종양 거부에 대한 이펙터 집단의 적합성을 조사하였다. 치료 세팅에서, 도 13a에 예시된 바와 같이 종양-보유 마우스에서 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 NK 세포가 고갈되었다. 이식 후 22일을 지나 생존한 마우스가 없었으므로, 결과는 CD8 고갈이 Vax/항-GITR/항-PD-1에 의해 제공된 유익한 효과를 완전히 폐지했음을 나타낸다(도 13b). 반면에, CD4 및 NK 세포의 고갈은 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법의 항종양 활성에 영향을 주지 않았으며(도 13b), 이는 관찰된 효능에서 이들 세포가 역할을 담당하지 않았음을 시사한다. 전체적으로, 대조군 마우스 또는 항-CD8 단독 및 항-NK1.1 단독으로 치료한 마우스로부터 종양의 통계적 차이가 없었다. 이전의 연구(문헌[Fujiwara S, et al. J Invest Dermatol 2014;134:1884-92])에 따라, 본 발명자들은 항-CD4 단독으로 치료한 군에 대해 종양 성장의 지연 및 관찰된 생존의 유의적인 차이(p=0.0037; CD4-고갈 대 동종형)를 관찰했다(도 13b). 그러나, 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법과 함께 aCD4(도 13b) 또는 aCD25(도 16)를 투여하는 것의 부가 이익은 없었으며, 이는 조합이 헬퍼 T 세포 또는 조절 CD4+ T 세포의 고갈에 독립적으로 작용할 수 있음을 제시한다. 전체적으로, 결과는 CD8+ T 세포가 생존을 연장하고 종양 거부를 유발하는 것을 담당하는 주요 이펙터 집단임을 입증한다.
암에 대한 활성 면역요법 및 백신 접종 둘 모두의 궁극적인 목표는 후속의 Ag 노출에 신속하게 반응할 수 있는 장기-지속 기억 T 세포의 생성이다. 기억 반응을 평가하기 위해, 치료 완료 후 6개월에 무종양 생존 동물에서 재-유발 실험을 실행하였다. Vax/항-GITR/항-PD-1 치료에 의해 제1 종양 유발에서 생존한 모든 마우스는 6개월 후에 동일한 종양에 대한 제2 종양 유발에서 생존했으며(도 13c), 이는 지속적인 항종양 면역 및 장기 기억 반응의 유도를 시사한다. 게다가, Vax/항-GITR/항-PD-1에 의한 치료 후에 치유된 마우스를 OVA를 발현하지 않는 모 B16.F10 종양 변종으로 재유발시켰을 때, ~80%의 마우스가 재-유발시에 종양을 거부하면서 무종양으로 유지되었다(도 13d). 전체적으로, 이들 데이터는 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법이 장기 기억 반응뿐만 아니라, 종양 세포에 의해 발현되는 다른 항원에 대한 에피토프 확산을 유도할 수 있음을 제시한다.
실시예 19. 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1은 종양 제어 및 제거에 결정적인 강력한 Ag-특이적 종양 침윤 KLRG1 + 이펙터 CD8 + T 세포를 유발한다
본 분야의 광범위한 연구는 CTL이 종양 거부에서 주요 역할을 담당하며, 종양-침윤 이펙터 CD8+ T 세포의 수는 종종 양호한 예후와 상관관계가 있음을 입증하였다(문헌[Blohm, U., et al. Eur. J. Immunol. 2006;36:468-477]; 문헌[Boissonnas, A. et al. J. Exp. Med. 2007;204:345-356]; 문헌[Steer, H. J., et al. Oncogene 2010;29:6301-6313]). 더 최근에는, KLRG1+ 이펙터 기억 CD8+ T 세포의 서브세트가 병원체 및 종양에 대한 치료 효능을 예측할 수 있다는 가설을 지지하기 위해 몇몇 연구가 시작되었다(문헌[Villarreal DO, et al. Molecular Therapy 2015;10:1653-1662]; 문헌[Olson JA, et al. Immunity 2013;38:1250―60]; 문헌[Cush SS, Flano E. J Immunol 2011;186:4051-8]; 문헌[Ye F, et al. J Immunol 2012;189:5206―11]; 문헌[van Duikeren S, et al. J Immunol 2012;189:3397―403]; 문헌[Villarreal DO, et al. Cancer Res 2014;74:1789-800]; 문헌[Slaney CY, et al. Cancer Res 2014;74:7168-7174]; 문헌[Brunner SM, et al. Hepatology 2015;61:1957-67]). 도 9f에서 비-종양 보유 마우스의 말초 혈액 중의 KLRG1+CD8+ T 세포의 증가는 이들 세포가 삼중 조합 요법에 의해 유발된 완전한 종양 퇴행에 대한 면역 상관관계일 수 있음을 제시했다(도 10). 따라서, 종양 퇴행이 강건한 종양 침윤 KLRG1+ 이펙터 기억 Ag-특이적 CD8+ T 세포 반응을 추진하는 그의 능력과 관련되는지 여부를 조사하였다. 종양 이식 후 12일(요법의 시작 후 5일; 도 10a)에, 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법이 종양에서 사량체-특이적 CD8+ T 세포 반응의 최고 증가를 가졌음이 주목되었다(도 14a). 이어서, 발현 마커 KLRG1을 기반으로 이펙터 기억 CD8+ T 세포 서브세트를 평가하였다. 흥미롭게도, Vax/항-GITR/항-PD-1 요법은 다른 모든 군에 비교하여 종양-침윤 KLRG1+CD8+ 이펙터 세포 및 KLRG1+CD8+Tet+ 세포의 빈도의 ~2-배 증가를 유발했으며(도 14b 내지 도 14c), 이는 Ag-특이적 KLRG1+CD8+ 이펙터 세포가 종양 부위로 수송되어 신속한 이펙터 작용을 유발할 수 있음을 암시한다. 전체적으로, 본 발명자들은 더 높은 KLRG1+CD8+ 이펙터 T 세포를 생성하는 것은 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법에서 관찰된 확립된 종양의 퇴행과 상관관계가 있음을 입증하였다.
KLRG1+CD8+ 서브세트 집단의 증폭이 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법에서 더 양호한 종양 성장 제어/퇴행을 확립하는 것을 보조한 일 메카니즘일 경우, KLRG1+CD8+CD44+ 이펙터 T 세포 하위집단의 고갈이 종양 성장 제어의 손실로 이어질 것인지 여부를 결정하는 것이 중요했다. 먼저, 표적 집단을 고갈시키는 항-KLRG1(aKLRG1) 항체의 능력을 결정하였다. 이를 조사하기 위해, 2개 군의 비-종양 보유 마우스를 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 요법과 함께 백신 접종하고, 백신 접종 후 제0일, 제2일, 제4일, 및 제6일에 하나의 군을 200 ㎍의 항-KLRG1 mAb(200 ㎍)로 치료하고, 요법 개시 후 제7일에 혈액 및 비장으로부터의 CD8+ T 세포 상에서 KLRG1의 발현을 모니터링하였다(도 17). 항-KLRG1 mAb가 CD8+ T 세포의 백분율을 감소시키고(도 17a) 표적 KLRG1+CD8+CD44+ 집단을 고갈시켰음(도 17b 내지 도 17c)이 관찰되었다. Vax/항-GITR/항-PD-1 치료 항-KLRG1 마우스는 비-치료 KLRG1 대조군에 비교하여 혈액 및 비장에서 KLRG1+CD8+CD44+ 및 KLRG1+CD8+Tet+ 집단의 빈도 및/또는 절대 총수의 유의적인 감소를 유발했다(도 17b 내지 도 17c). 그 다음에, 종양-보유 마우스에서 KLRG1+CD8+CD44+ 세포를 고갈시킴으로써 삼중 조합 요법에 의해 유도된 종양 거부를 촉진함에 있어서 KLRG1+CD8+CD44+ 집단의 기여를 평가하였다. KLRG1 Ab가 고갈된 마우스가 KLRG1 고갈 없이 치료한 조합보다 더 빠른 종양 성장을 나타냈으므로, 결과는 KLRG1 고갈이 보호를 유의적으로 감소시켰음을 규명한다(도 14d). 더 현저하게는, αKLRG1 고갈을 동반하는 조합 요법은 aKLRG1 치료가 없는 조합 요법에 비해 더 이상 종양 퇴행 및 장기 생존을 확립하지 않았다(0% 대 40% 종양 거부). 종합하면, 이들 결과는 삼중 조합에 의해 유도된 Ag-특이적 KLRG1+ 이펙터 CD8+ T 세포의 증가는 그것이 이 흑색종 치료 모델에서 종양 성장 제어, 퇴행, 및 장기 생존을 촉진하는 메카니즘이었음을 제시한다. 따라서, 이러한 이펙터 CD8+ T 세포 하위집단의 증폭은 미래의 암 면역치료 전략에 있어서 주요 이익이 될 수 있을 것이다.
실시예 20. 조합 항-GITR/항-PD-1 요법은 자가-항원 종양 관련 항원 백신과 상승작용하여 항-종양 효능을 향상시킨다.
효과적인 암 면역요법의 개발에 있어서 주요 난제는 면역원성이 불량한 종양 관련 항원(TAA: tumor associated antigen), 예컨대 자가-항원에 대한 강력한 항종양 반응을 추진하는 것이다. 도 13d의 결과는 조합 Vax/항-GITR/항-PD-1 치료가 아마도 OVA를 넘어 다른 흑색종 TAA로의 에피토프 확산을 유도했음을 제시했다. 따라서, 이는 조합 항-GITR/항-PD-1 요법이 자가-종양 관련 항원을 인코딩하는 백신의 효능을 향상시킬 수 있을 것인지 여부에 관한 질문을 제기했다. 흑색종 종양 항원 티로시나제-관련 단백질-2(TRP-2)을 선택하였는데, 이는 그것이 가장 잘 연구된 면역원성이 약한 흑색종 종양 항원 중 하나이기 때문이다. B16 흑색종 마우스 모델에서의 예방 세팅에서 단일-약제 TRP2 백신 접종은 강력한 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났다(문헌[Avogadri F, et al. Cancer Immuno Res 2014;2:448-458]; 문헌[Pedersen SR, et al. J Immunol 2013;191:3955-3967]). 그러나, 치료 세팅에서의 종양 제어에서 이 활성은 유의적으로 감소되고 제한된다. 마찬가지로, 항-GITR/항-PD-1 항체 요법 단독은 제한된 효능을 갖는다(도 10). 그러므로, 도 15a에 나타낸 바와 같이 항-GITR/항-PD-1의 조합 요법을 사용하고 부수적으로 마우스를 TRP2 펩티드 백신으로 3회 면역화하여 8-일 종양(평균 종양 직경이 ~50 ㎣임)에 엄격한 치료 중재를 적용하였다. 확립된 종양의 조합 치료는 대조군에 비교하여 종양 성장의 유의적인 억제를 나타냈으며(도 15b), 이는 치료가 자가-항원에 대한 관용을 파괴할 수 있음을 제시한다. 더 중요하게는, 3x TRP2/항-GITR6/항-PD-1 조합 요법은 ~20%의 마우스에서 완전하고 지속적인 퇴행으로 이어진 반면에, 단일요법은 완전한 퇴행을 유발하지 않았다(도 15b). 이 관찰사항은 항-GITR/항-PD-1이 펩티드 백신과 상승작용하여 항종양 면역을 증대시킬 수 있음을 재확인한다. 전체적으로, 이들 결과는 항-GITR/항-PD-1 조합이 자가-종양 항원 및 비-자가-종양 항원에 대한 백신-유도 반응 둘 모두를 증대시키기 위한 유용한 면역요법일 수 있다는 개념을 지지한다.
실시예 21. 항-CD122 치료는 종양 백신 및 항-GITR mAb와 상승작용하여 최적의 치료 효능을 달성한다.
항-CD122가 단일요법으로서 종양 진행을 지연시켰지만, 그것은 시험 조건 하에 7-일 종양(평균 종양 직경이 ~30 ㎣임)에 대한 더 엄격한 치료 중재에서 치유적이지 않았다(도 18a 내지 도 18b). 그러므로, 종양-특이적 면역 반응의 크기를 향상시키기 위한 시도로, 신-종양 항원으로서 OVA(SIINFEKL)를 표적화하는 펩티드-기반 암 백신을 항-CD122 요법과 조합하여 사용하였다. 항-CD122 및 단일 용량의 펩티드 백신을 사용하는 7-일 확립된 종양의 치료 중재는 ~10% 장기 생존으로 이어지는 종양 성장의 유의적인 억제를 나타낸 반면에, 어느 하나의 단일요법은 효과가 없거나 거의 없었다(도 18a 내지 도 18b). TIL의 분석은, 항-CD122을 백신과 조합한 경우에, 각각의 약제 단독에 비해 G-MDSC의 빈도의 유의적인 감소가 있었음을 나타냈다(도 19a 내지 도 19d). 게다가, 조합 요법은 또한 이펙터 CD8+ TIL로부터의 이중 IFNγ/TNFα 생성을 유의적으로 증가시켰고 종양 내의 OVA-사량체-특이적 CD44+CD8+ 기억 T 세포를 상승적으로 향상시켰다(도 19a 내지 도 19d). 조합 백신 및 항-CD122 요법으로 치료한 비-종양 보유 마우스의 말초에서 OVA-사량체-특이적 CD8+ T 세포의 증가 또한 주목되었다(도 20a 내지 도 20c). 조합 요법은 각각의 약제 단독에 비해 CD4+ Treg의 비율을 현저하게 감소시켰으며(도 19d), 이는 조합군에서 관찰된 전체적으로 개선된 보호가 (1) 증가된 Ag-특이적 CD8+ T 세포 반응, (2) 감소된 G-MDSC, 및 (3) 종양 내의 CD4+ Treg 집단의 감소와 관련되었음을 제시한다. 이들 변화는 종양 거부를 위해 더 지원적인 환경을 유발할 수 있을 것이다.
7-일 확립된 종양의 치료를 위해 제7일, 제10일, 및 제14일에 프라임-부스트(prime-boost) 백신 접종 전략을 적용하였으며, 이 치료 세팅에서의 단일 백신 용량보다 더 큰 장기 생존(30%)을 나타냈다(도 21a). CD8+CD122+ T 세포가 기억 CD8+ T 세포 특성을 갖는 것으로 기재되었음을 고려하여(문헌[Li S et al., Cell Mol Immunol 2014;11:326-31]; 문헌[Liu J et al., Front Immunol 2015;6:494]), 본 발명자들은 이러한 집단을 표적화하는 것이 장기-지속 기억 T 세포의 생성에 영향을 줄 수 있는 가능성이 있는지를 조사하였다. 치료 후 제80일의 프라임-부스트 생존자의 제2 종양 유발은 종양 성장을 나타내지 않았으며, 이는 조합 요법 중에 T-세포 기억의 수준이 발생하고 유지되었음을 시사한다(도 21b).
최종적으로, Vax/항-CD122 조합 및 항-CD4/항-CD122 조합 연구에서 Treg 감소의 상가적 이익에 의해 개선된 효능을 고려하여, 본 발명자들은 항-CD122 단독이 종양에서 CD4+ Treg의 수를 감소시킬 수 있는 면역요법인 항-GITR mAb와 상승작용할 수 있는지를 결정하였다(문헌[Schaer DA et al., Curr Opin Immunol 2012;24:217-224]). 항-CD122 및 항-GITR 표적화 mAb의 조합 요법을 사용하는 4-일 종양에 대한 치료 중재는, 항-CD122 단일요법에 비교하여 ~40% 장기 생존을 산출한 종양 성장의 유의적인 억제를 나타내는 상승작용을 입증했다(도. 22a 내지 도 22b). 이들 연구는 추가의 암 면역요법과 조합하여 GITR-표적화 접근법을 설계하기 위한 장을 추가로 마련한다.
실시예 22. TRGB191 결합 에피토프의 맵핑
인간 GITR 세포외 도메인 상의 TRGB191에 대한 결합 에피토프를 확인하기 위하여, 용액 수소/중수소 교환-질량 분석법(HDX-MS)을 수행하였다.
펩신/프로테아제 XIII 분해 및 LC-MS
펩신/프로테아제 XIII 분해를 위해, 135 μL의 4 M 구아니딘 염산, 0.85 M TCEP 완충액(최종 pH는 2.5임)을 첨가하고 혼합물을 3분 동안 25℃에서 인큐베이션함으로써, 133 μL 대조 완충액(pH 7.4에서 100 mM 염화나트륨, 50 mM 인산염) 중의 3.2 ㎍의 인간 GITR을 변성시켰다. 이어서, 혼합물에 온라인 펩신/프로테아제 XIII 분해를 적용하고, 생성된 펩티드를 Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo)에 커플링된 Waters Acquity UPLC로 구성된 UPLC-MS 시스템을 사용하여 분석하였다. 인간 GITR을 함유하는 샘플에 대해 50 mm × 1 mm C8 컬럼 상에서 2 내지 28% 용매 B(아세토니트릴 중의 0.2% 포름산)의 19분 구배로 펩티드를 분리하였다. 용매 A는 물 중의 0.2% 포름산이다. 주입 밸브 및 펩신/프로테아제 XIII 컬럼 및 그들의 관련 연결 튜빙은 11℃로 유지되는 냉각 박스 내부에 있다. 그리고 제2 전환 밸브, C8 컬럼, 및 그들의 관련 연결 스테인리스강 튜빙은 0℃로 유지되는 다른 냉각 순환 박스 내부에 있다. 펩티드 확인은 Mascot를 이용하는 인간 GITR 서열에 대한 MS/MS 데이터의 검색을 통해 실행된다. 전구체 및 생성물 이온에 대한 질량 허용오차는 각각 10 ppm 및 0.05 Da이다.
글리칸 질량 확인
1 μL의 PNGase F와 함께 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션함으로써 10 ㎍의 인간 GITR을 탈글리코실화하였다. 이어서, 샘플을 건조시키고 글리칸을 재구성하고 5 μL의 400 mM 프로카인아미드(3:7 비의 아세트산:DMSO(v/v) 및 1 M 나트륨 시아노보로하이드라이드 중에 제조됨)와 함께 65℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 표지화 시약을 제거하기 위해, 샘플을 90% ACN 중에 총 500 μL 용액으로 재구성하였다. 200 μL의 물 및 200 μL의 90% ACN으로 HILIC-SPE 플레이트를 조건화한 후에, 샘플을 HILIC-SPE 플레이트에 로딩하고, 200 μL의 90% ACN으로 세척하고, 50 μL의 20% ACN으로 용출시켰다. 추가의 분석 전에 75 μL의 ACN을 첨가하였다. Waters ACQUITY UPLC 및 Bruker MicroTOF QII로 구성된 UPLC-MS를 사용하여 글리칸 질량을 측정하였다.
HDX
8 μL의 인간 GITR(3.2 ㎍) 또는 8 μL의 인간 GITR과 mAb 혼합물(3.2 ㎍: 24 ㎍)을 125 μL의 산화중수소 표지화 완충액(pH 7.4에서 50 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨)과 함께 0초, 60초, 300초, 1800초, 7200초, 및 14400초 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 135 μL의 4 M 구아니딘 염산, 0.85 M TCEP 완충액(최종 pH는 2.5임)을 첨가함으로써 수소/중수소 교환을 켄칭(quenching)하였다. 후속적으로, 켄칭된 샘플에 상기 기재된 바와 같이 컬럼 상의 펩신/프로테아제 XIII 분해 및 LC-MS 분석을 적용하였다. MS 전용 방식(MS only mode)으로 질량 스펙트럼을 기록하였다.
H/D 교환 MS 데이터 분석용 소프트웨어인 HDX WorkBench를 사용하여 원 MS 데이터를 처리하였다(문헌[J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23(9): 1512-1521]). 중수소화된 펩티드와 그의 천연 형태(t0) 사이의 평균 질량 차이를 사용하여 중수소 수준을 계산하였다.
결과
확인된 펩티드에서의 중수소 수준을 LC-MS 상에서의 질량 시프트로부터 모니터링하였다. 천연 인간 GITR-ECD는 서열 번호 62의 잔기 28 내지 50 및 70 내지 79에서 mAb TRGB191.CLF에 결합시에 중수소 흡수의 유의적인 감소를 나타낸다. 따라서 mAb에 결합시에 중수소 흡수의 유의적인 감소를 가진 이들 영역은 에피토프 펩티드로서 배정되며, 이는 도 23에서 어두운 회색 또는 밝은 회색으로 강조된다.
GITR 구조에 대한 에피토프의 모델링
인간 GITR ECD에 대한 mAb TRGB191 결합의 HDX-MS 측정은 결합 에피토프가 불연속적이고 하기 GITR의 2개 펩티드 영역 내에 위치함을 시사한다:
영역 1(서열 번호 62의 잔기 28 내지 50)
영역 2(서열 번호 62의 잔기 70 내지 79):
TRGB159 Fab와의 복합체에서 GITR ECD의 결정 구조로부터 얻어진 GITR의 3D 모델에 대한 HDX 데이터를 맵핑함으로써 mAb TRGB191의 결합 에피토프를 추가로 개량하였다. 구조에 따르면, 2개 펩티드의 대부분이 용매에 대해 접근가능하지 않다. 펩티드의 노출된 부분은 공간적으로 근접하며 서열 번호 62의 잔기 40 내지 45 및 75 내지 79를 포함한다(도 24에 강조됨).
구조는 하기와 같이 결정되었다. GITR:20 mM 트리스, pH 8.5, 250 mM NaCl 중에 Fab를 25% 몰 과량의 GITR ECD와 혼합함으로써 TRGB159 복합체를 제조하고 4 ®C에서 하룻밤 인큐베이션하였다. Superdex 200 컬럼 상에서 복합체의 형성을 모니터링하였다. 20℃에서 시팅 드롭(sitting drop)에서의 증기-확산 방법에 의해 복합체의 결정화를 실행하였다. 0.1 M HEPES 완충액, pH 7.5 중의 14% PEG 3350 및 0.2 M 포름산나트륨으로부터 X-선 분석에 적합한 결정을 얻었다. X-선 데이터 수집을 위하여, 24% 글리세롤로 보충된 모액을 함유하는 동결보호 용액 중에 수초 동안 하나의 결정을 액침하고 액체 질소 중에 급속 냉각시켰다. Mar225 검출기를 사용하여 Advanced Photon Source(Argonne, IL)에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 회절 강도를 2.8 옹스트롬 해상도로 검출하고 프로그램 XDS로 처리하였다(문헌[Kabsch, W. (2010). XDS. Acta Cryst. D66, 125-132]). Protein Data Bank로부터의 구조 5I16을 검색 모델로 사용하여 프로그램 Phaser를 이용한 분자 치환법(molecular replacement)에 의해 구조를 해석하였다(문헌[McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C. & Read, R.J. (2007). J. Appl. Cryst. 40, 658-674]). Fab가 단위 세포 내에 위치한 경우, 프로그램 Coot를 사용하여 GITR 분자를 전자 밀도 내에 수동으로 구축하였다(문헌[Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010). Acta Cryst. D66, 486-501]).
실시예 23. 1차 활성화 T 세포 및 JJN-3 세포주 상의 TRGB191.CLF의 ADCC 활성
FcγRIIIA 유전자 내의 다형(rs396991)은 위치 158에서 발린으로부터 페닐알라닌으로의 아미노산 치환 변화(V158F)를 유발하며, 158V 동종이형은 인간 IgG1에 대한 더 높은 친화도 및 증가된 ADCC를 디스플레이하고; 이 다형은 문헌에서 간혹 V176F로 표기된다(문헌[Wu J, Edberg JC, Redecha PB, Bansal V, Guyre PM, Coleman K, Salmon JE, Kimberly RP. J Clin Invest; 1997; 100(5):1059-70]). 카트론(Cartron) 등은 동형접합 FcγRIIIA-158V 유전자형이, 그의 작용 메카니즘이 종양 세포의 ADCC를 포함하는 항체인 리툭시맙에 대한 양성 임상 반응과 관련된 단일 파라미터임을 확인했다(문헌[Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H. Blood; 2002; 99(3):754-8]).
TRGB191.CLF는 저-푸코오스 항체로서 제조되며, 후속적으로 동일한 mAb의 "정규" 푸코실화 버전(RFV)에 비교하여, NK 세포 상에 존재하는 Fc 수용체인 FcγRIIIA에 대해 대략 10-배 향상된 친화도를 갖는다(KD는 각각 고친화도 FcγRIIIA-158V 변이체에 대해 ~37 nM 대 ~370 nM, 및 저친화도 FcγRIIIA-158F 변이체에 대해 ~180 nM 대 1,750 nM이었음).
FcγRIIIA에 대해 향상된 친화도를 가진 항체는 증가된 ADCC 활성을 보유하는 것으로 입증되었다(문헌[Strohl W, Strohl L. Therapeutic Antibody Engineering - Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry. 1st ed. Sawston: Woodhead Publishing; 2012]). 변화하는 수준의 hGITR을 발현하는 몇몇 표적 세포 또는 세포주에 대해 TRGB191.CLF의 ADCC 활성을 평가하였다. 예를 들어, 휴지 말초 T 세포는 최소 수준의 GITR을 발현하지만, 시험관 내에서 활성화될 경우에는 이들 세포 상에서 GITR 발현이 상향조절된다. JJN-3 세포주는 HuT102 세포에 비교하여 더 생리학적인 수준으로, 그리고 활성화 T 세포 및 시험관내 분화된 Treg 상에서 관찰되는 것들과 더 유사한 수준으로 내인성 hGITR을 발현하는 인간 백혈병 형질 세포주(human plasma cell leukemia line)이다.
NK-92 158V/V 이펙터 세포를 사용하여, 1차 휴지 또는 활성화 T 세포(도 25 참조) 및 JJN-3 세포(도 26 참조) 상에서 TRGB191.CLF의 ADCC 활성을 넓은 범위의 E:T 세포비에 걸쳐 특성화하였다.
TRGB191.CLF는 휴지, 비활성화 CD4+ T 세포(도 25a, 좌측 패널 참조) 및 비활성화 CD8+ T 세포(도 25b, 좌측 패널 참조) 상에서 최소 ADCC 활성을 가졌다. GITR을 발현하는 활성화 1차 T 세포 상에서, JNJ-64164711은 5:1의 최고 E:T 비에서 11 ng/mL 내지 32 ng/mL 범위의 EC50 값으로 강력한 ADCC 활성을 유발했으며; 값은 E:T 비에 따라 변화하였다(표 9 참조). Bmax 값 또한 E:T 세포비에 의존하였으며, 더 많은 이펙터 세포가 시스템 내에 존재함에 따라 증가하였다. 동종형 대조군 항체(CNTO3930)는 ADCC를 유도하지 않았다.
JJN-3 세포는 HuT102 세포보다 더 낮은 수준의 GITR을, 그리고 활성화 1차 T 세포 및 시험관내 생성된 Treg와 더 유사한 범위 내에서 발현하는 것으로 이전에 특성화되었지만, 수준은 몇배 더 높았다. NK-92 158V 고친화도 이펙터 세포를 사용하여 JJN-3 세포를 넓은 범위의 E:T 비에 걸쳐 시험한 경우(도 26 참조), TRGB191.CLF는 활성화 1차 T 세포를 이용한 ADCC 검정에서 얻어진 것들과 매우 유사한 Bmax 값으로 50 ng/mL 내지 130 ng/mL 범위의 ADCC 활성을 유도했다(표 9 참조). 동종형 대조군(CNTO3930)은 효과가 없었다.
[표 9]
Figure pct00022
실시예 24. 시험관내 분화된 TREG 상의 TRGB191.CLF의 ADCC 활성
최근에 공개된 내부 데이터는, 마우스 및 인간 둘 모두에서 종양 미세환경 내에 존재하는 종양-침윤 림프구 상에서 GITR이 발현되며, 발현의 최고 수준은 고형 종양 내의 CD4+ Treg 상에서 관찰됨을 입증하였다.
CD4+CD25+FOXP3+로서 정의되는 작용적으로 억제성인 Treg가 되도록, 말초 CD4+ T 세포를 분화시키고 증폭하였다. 이들 Treg는 활성화 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 비교하여 유사한 수준의 GITR을 발현한다. TRGB191.CLF는 JJN-3 세포로 관찰된 효능과 유사한 항체-의존성 Treg 세포 살해를 유도했다(도 27 참조). 동종형 대조군(CNTO3930)은 효과가 없었다.
실시예 25. 고친화도 및 저친화도 FCγRIIA 다형을 가진 이펙터 세포를 사용하는 TRGB191.CLF의 ADCC 활성
TRGB191.CLF는 동일한 mAb의 RFV에 비교하여 FcγRIIIA-158V/V 및 FcγRIIIA-158F/F 둘 모두에 대해 대략 10-배 향상된 친화도를 가지며; 저친화도 FcγRIIIA-158F/F 변이체에 대한 그의 KD 값은 ~180 nM과 동일했고, 이는 고친화도 변이체 수용체에 대한 RFV의 친화도(370 nM)의 약 2-배이다.
고친화도 FcγRIIIA-158V/V 또는 저친화도 FcγRIIIA-158F/F 변이체를 발현하는 NK-92 이펙터 세포를 사용하는 경우, JJN-3 세포에 대한 TRGB191.CLF의 ADCC 활성은 ~2-배(각각 40.01 ng/mL 및 87.44 ng/mL) 변화하는 EC50 값으로 유사했다(도 28 참조).
실시예 26. 항-CD40, 항-OX40, 또는 항-PDL-1과의 조합 항-GITR은 더 양호한 종양 성장 지연으로 이어진다
더 작은 시작 종양 부피(~100 ㎣)를 가진 동종형 대조군 항체로 치료한 동물은 대략 19일의 종점까지의 시간 중앙값(MTE: median time-to-endpoint)에 도달했다. 제1일에 10 mg/㎏의 단일로 투여된 DTA-1은 2개의 지속적인 완전한 퇴행(CR) 및 29.3일까지의 MTE의 지연으로 이어졌다. 제1일, 제5일, 및 제9일에 2 mg/㎏으로 투여된 FGK4.5, 항-CD40은 6개의 CR 및 60일의 MTE의 측정가능한 지연을 유발했다. FGK4.5(q4dx3)와 함께 제1일의 10 mg/㎏의 DTA-1의 단일 주사의 조합은 제40일까지 8개의 CR을 유발했으며, 이 지점에 1개의 진행이 있는 것으로 나타난다(도 29).
더 큰 시작 종양 부피(~230 ㎣)를 가진 동종형 대조군 항체로 치료한 동물은 대략 10.5일의 종점까지의 시간 중앙값(MTE)에 도달했다. 제1일, 제5일, 및 제9일에 10 mg/㎏으로 투여된 FGK4.5는 1개의 완전한 반응(CR), 및 33일의 MTE의 측정가능한 지연을 유발했다. FGK4.5(q4dx3)와 함께 제1일의 10 mg/㎏의 DTA-1의 단일 주사의 조합은 4개의 지속적인 CR을 유발했다(도 30).
DTA-1(10 mg/㎏, q1, 제1일)과 OX86(항-OX40, 10 mg/㎏, 제1일에 시작하여 q4dx3) 항체의 병행 조합 또한, DTA-1에 의한 2개의 CR로부터 DTA-1 + OX86 조합에 의한 5개의 CR로의 증가를 동반하는 더 양호한 항-종양 성장 반응을 유발했다. OX86은 단일 약제로서 종양 진행을 저해하지 않았다(도 31).
DTA-1(10 mg/㎏, q1, 제1일)과 RMP1-14(항-PD-1, 10 mg/㎏, q4dx3)의 병행 조합은 또한, 제1 약제 후에 요법 중 하나에 2일을 제공함으로써 그것을 지연시키는 것보다 더 효과적이었다. 항-PD-1 단일 약제는 3개의 CR로 이어졌고, 항-GITR 단일 약제는 2개의 CR로 이어졌으며, 병행하여 제공된 조합 항-GITR 및 항-PD-1 요법은 8개의 CR을 유발했다. 항-PD-1 또는 항-GITR이 먼저 배열된 용량인 경우, 이 효능은 각각 4개 또는 5개의 CR로 감소되었다(도 32).
서열 목록의 간단한 설명
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SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. HOLLAND, CAM KEHOE, JOHN VILLAREAL, DANIEL SEPULVEDA, MANUEL ALEJANDRO SNYDER, LINDA <120> GITR ANTIBODIES, METHODS, AND USES <130> JBI5082WOPCT <140> To Be Assigned <141> 2017-03-08 <150> 62/407,106 <151> 2016-10-12 <150> 62/305,270 <151> 2016-03-08 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr 1 5 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Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Phe Tyr Trp Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 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Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Asn Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Val Tyr Lys Arg Gly Val Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 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<210> 55 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 56 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Asn Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 57 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Arg Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 58 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 59 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys 20 25 30 Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met 35 40 45 Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys 50 55 60 Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys 65 70 75 80 Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser 85 90 95 Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys 115 120 125 Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu 130 135 <210> 60 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys 20 25 30 Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met 35 40 45 Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys 50 55 60 Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys 65 70 75 80 Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser 85 90 95 Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys 115 120 125 Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val 130 135 140 Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu 145 150 155 160 Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu 165 170 175 Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser 180 185 190 Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys 195 200 205 Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val 210 215 <210> 61 <211> 216 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 61 Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Gly Lys Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Pro Thr Arg Cys 20 25 30 Cys Arg Asp Tyr Gln Ser Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Val 35 40 45 Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asn Pro Cys Cys Thr Thr Cys 50 55 60 Gln His His Pro Cys Pro Ser Gly Gln Gly Val Gln Pro Gln Gly Lys 65 70 75 80 Phe Ser Phe Gly Phe Arg Cys Val Asp Cys Ala Leu Gly Thr Phe Ser 85 90 95 Arg Gly His Asp Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys 115 120 125 Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Pro Gly Trp Leu Thr Ile Val 130 135 140 Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu 145 150 155 160 Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Gly Ser Gln Pro Thr Gly Pro Arg Glu 165 170 175 Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Ser Ser 180 185 190 Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Leu Ala Glu Glu Lys 195 200 205 Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val 210 215 <210> 62 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg 35 40 45 Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu 50 55 60 Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His 65 70 75 80 Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys 100 105 110 Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys 115 120 125 Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro 130 135 140 Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala 145 150 155 160 Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys 165 170 175 Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu 180 185 190 Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val 195 200 205 Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu 210 215 220 Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp 225 230 235 240 Val <210> 63 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Arg Phe Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 64 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Phe Tyr Trp Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 65 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr 1 5 10 15 Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro 20 25 30 Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu 35 40 45 Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser 50 55 60 Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys 65 70 75 80 Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser 85 90 95 Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu 100 105 110 Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn 115 120 125 Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp 130 135 140 Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly 145 150 155 160 Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser 165 170 175 Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu 180 185 190 Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser 195 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 66 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (27)

  1. 하기를 포함하는 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    b. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    c. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    d. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    e. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    f. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    g. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    h. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    i. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    j. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 38의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    k. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    l. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    m. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    n. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    o. 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 또는
    p. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
  2. 서열 번호 39 내지 54, 63, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 영역을 포함하는 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 55 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 영역을 포함하는 항체.
  4. 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 39 내지 54, 63, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 영역 및 서열 번호 55 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 영역을 포함하는 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    a. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 39를 포함하거나;
    b. 중쇄 영역은 서열 번호 56을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 40을 포함하거나;
    c. 중쇄 영역은 서열 번호 57을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 41을 포함하거나;
    d. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 42를 포함하거나;
    e. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 43을 포함하거나;
    f. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 44를 포함하거나;
    g. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 45를 포함하거나;
    h. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 46을 포함하거나;
    i. 중쇄 영역은 서열 번호 58을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 47을 포함하거나;
    j. 중쇄 영역은 서열 번호 58을 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 48을 포함하거나;
    k. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 49를 포함하거나;
    l. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 50을 포함하거나;
    m. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 51을 포함하거나;
    n. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 52를 포함하거나;
    o. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 53을 포함하거나;
    p. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 54를 포함하거나;
    q. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 63을 포함하거나;
    r. 중쇄 영역은 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 64를 포함하는 항체.
  6. 제5항에 있어서, 항체가 GITR(서열 번호 62
    아미노산 잔기:
    c. 40 내지 45; 및
    d. 75 내지 79과 상호작용함으로써 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 실시예 9에 기재된 실험 설계를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정될 때 30 nM 이상의 결합 친화도로 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, NF-κB 루시페라제 유전자 검정에서 루시페라제 발현의 증가를 유도하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 시험관 내에서 약 67 ng/mL 미만의 EC50으로 ADCC를 유도하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, 인간 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, Fab 단편, Fab2 단편, 또는 단일쇄 항체인 항원-결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, 재조합체인 항체 또는 항원-결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항에 있어서, IgG1 동종형인 항체 또는 항원-결합 단편.
  16. 제1항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 GITR 및 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 GITR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제1항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 제18항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 항체 또는 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 제19항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 공정.
  21. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을, 대상체에서 암 또는 다른 신생물 병태의 증상을 경감시키기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 다른 신생물 병태의 증상을 경감시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    a. 화학요법을 투여하는 단계
    b. 방사선 요법을 투여하는 단계; 또는
    c. 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 추가의 치료제는 면역자극제인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 면역자극제는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, CD122 항체, CD40 항체, OX40 항체, 및 CD8 Ag-특이적 OVA 펩티드 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 위한 포장을 포함하는 키트.
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