KR20180099150A - 식품 중 게 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 게 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식품 원료로 사용되는 게 종(species)의 진위여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 원료의 진위여부를 판별하는 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트에 대한 것으로, 게의 종간에 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서 식품 내의 게 원료의 종 판별을 간단하고 용이하게 할 수 있는 장점이 있다.

Description

식품 중 게 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 게 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트{Primer set for determining identity of crap material in food, method of determining identity of crap material in food using the same and kit comprising the same}

본 발명은 식재료로 사용되는 게 4종의 품종을 판별하기 위한 것으로, 특히 4종 게의 종간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 식재료로 사용되는 게에 대한 유전자형을 분석하고, 식품 중 게 원료 판별용 프라이머 세트, 이를 이용하여 간단하고 신속하게 원료를 판별할 수 있는 방법 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

게는 절지동물 중 갑각류에 속하는 수산물로, 전 세계에는 4,500여종이, 우리나라에는 약 183종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 또한 우리 식생활에 주요하게 쓰이는 해양자원 중 하나로, 찌거나 삶는 것 외에도 맛살, 소시지 등 가공식품의 원료로도 흔히 이용된다.

우리나라에서 주로 소비되는 게는 붉은 대게로도 불리는 홍게로, 해양수산부에 따르면 2016년 전체 갑각류 생산량 중 약 29%를 차지한다는 통계가 발표된 바 있다.

일반적으로, 게를 포함한 갑각류는 색이나 집게발, 부속지 등 외형을 분석해 종을 판별해왔다. 하지만 게는 종간 표현형이 유사할뿐더러 가공시 집게발과 부속지 등을 제거하기 때문에 기존의 구별법을 적용하기 어렵다 (Food Control, 25(1), 239-244 (2012)).

이러한 특징들 때문에 우리나라에서는 홍게가 상대적으로 값이 비싼 대게로 판매되고, 외국에서는 게가 포함되지 않거나, 명시된 것과 다른 게가 포함된 크랩 케이크가 판매되는 사례가 발생한 바 있다.

이와 같이 게를 식재료로 이용함에 있어서, 고가의 재료를 유사한 저가의 재료로 고의적으로 대체하거나 원재료 표기에 대한 오류가 발생할 수 있다. 따라서 외적인 특징을 간직하고 있는 원물이나, 그렇지 않은 가공식품 모두에서 신속정확하게 게의 함유여부 및 종을 판별할 수 있는 방법이 필요하다 (Oceana. Retrieved from (2015)http://usa.oceana.org/publications/reports/oceana-reveals-mislabeling-iconic-chesapeake-bluecrab).

형태적인 종 판별법 이외에도 기존에는 주로 단백질을 이용한 방법이 갑각류의 종을 판별하기 위해 사용되었다. 등전점 전기영동(Isoelectric focusing; IEF), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis; CE), 면역 시스템(Immunoassay system) 등 단백질을 이용한 방법들은 주로 신선하거나 급속 동결된 조직을 분석하는 방법으로, 조직이 고열로 가공되거나 건조되면 단백질의 생화학적 특성이나 구조가 변형되어 분석할 수 없다는 단점이 있다.

또한, 단백질의 발현은 같은 생물이라도 조직에 따라 다르며, 상업적으로 쓰이는 방법은 대부분 혈장단백질을 검출하기 때문에 다른 종과 혼합되는 제품의 경우에는 오염될 가능성이 있어 분석이 어렵다.

효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)같은 방법은 열가공된 제품도 분석하는 것이 가능하지만, 근연종인 경우 항체가 교차반응을 일으킬 수 있다. 또한 특정 단백질에 따라 특이적인 항체를 개발해야 하며, 상업적으로 이용되는 항체는 종을 판별하는데 적용하기 어렵다는 단점이 있다 (Trends in Food Science & Technology, 11(2), 67-77 (2000); Comprehensive reviews in food science and food safety, 7(3), 280-295 (2008); Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(4), 1350-1355 (1999)).

DNA는 단백질에 비하여 대체로 더 안정하고, 열가공 시 분해될 가능성도 더 낮다. 또한 모든 생물 조직에 존재하며 소량의 샘플만 있어도 분석이 가능하다는 장점이 있다.

미토콘드리아 DNA의 경우 일반적으로 핵 DNA보다 진화 속도가 빨라 근연종을 분석하는데 유리하고, 한 세포당 다수의 DNA가 존재하므로 증폭이 용이하여 종 판별을 위한 유전자 마커로 자주 사용된다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 특정 유전자의 원하는 부분을 한 쌍의 프라이머를 이용해 증폭하는 방법으로, 실험 방법이 간단하면서도 신속 정확하여 널리 사용되고 있다.

또한, 종 특이적인 유전자 마커를 증폭할 수 있는 종 특이 프라이머와 함께 사용하면 여러 종이 혼합된 가공식품에서도 원하는 종의 함유 여부를 손쉽게 확인할 수 있다 (Erlich, H. (2015). PCR technology: principles and applications for DNA amplification, Springer; Food additives and contaminants, 25(5), 527-533 (2008); PLoS One, 5(9), e12620 (2010); Gene, 311 129-135 (2003).

수산물 가공식품 시장이 커지고 있어, 수산물 가공식품에 대한 관심이 증가하고 있다. 하지만 수산물의 경제적 가치가 종에 따라 차이가 나는 점을 이용하여 국내에서는 홍게가 대게로 판매되는 사례가, 해외에서도 크랩 케이크에 명시된 것과 다른 게를 사용하거나, 게를 저가의 생선으로 대체하는 사례가 보고된 바 있다.

따라서, 외형적인 특징을 간직하고 있는 원물이나, 그렇지 않은 가공식품 모두에서 신속 정확하게 게의 함유 여부 및 종을 정확히 확인하기 위한 방법의 필요성이 증대되고 있다.

게의 종 판별법은 신속하면서도 간편하게 사용할 수 있어야 하고, 원물은 물론 다른 종과 섞여있는 샘플 및 가공식품에서도 종을 판별할 수 있어야 하기 때문에, 단백질보다 상대적으로 더 안정한 DNA를 이용해 종에 따라 특이적으로 증폭되는 종 특이 프라이머를 설계하여 쉽게 게의 종을 확인할 수 있는 판별법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 식품원료 내에 존재하는 게의 유전자형에 따라, 게의 종을 구별하여, 간단하고 신속하게 상기 게의 종을 판별할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식품원료 내에 존재하는 게의 유전자형에 따라, 게의 종을 구별하여, 간단하고 신속하게 상기 게의 종을 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식품원료 내에 존재하는 게의 유전자형에 따라, 게의 종을 구별하여, 간단하고 신속하게 상기 게의 종을 판별할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 쌍을 더 포함하는 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 게 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함하는 식품 중 게 원료의 진위여부 판별방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 식품 원료로 주로 사용되는 다양한 게의 종 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로 대상 게의 유전자형에 따라, 간단하고 신속, 정확하며 저농도의 검출한계로 종을 판별할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 DNA 칩이나 키트로 제작되어, 육안으로는 판별이 힘든 조미 가공물 또는 분말가루 등에 대해서도, 하나의 키트에 시료를 넣는 것만으로도 식품 중 게 원료의 진위여부를 판별할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간이 크게 단축되어, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.

도 1a는 대게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1b는 홍게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1c는 킹크랩의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1d는 꽃게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 대게의 사이토크롬 C 옥시다제 서브유니트 I(COI)의 유전자를 나타낸 것이다 (서열번호 9).
도 3a 및 도 3b는 홍게 Internal transcribed spacer(ITS)의 유전자를 나타낸 것이다 (서열번호 10).
도 4a 및 도 4b는 킹크랩 사이토크롬 B(CYTB)의 유전자를 나타낸 것이다 (서열번호 11).
도 5는 꽃게의 사이토크롬 C 옥시다제 서브유니트 I(COI)의 유전자를 나타낸 것이다 (서열번호 12).
도 6a는 대게 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 대게, 레인 2 ; 홍게, 레인 3 ; 킹크랩, 레인 4 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 6b는 홍게 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 홍게, 레인 2 ; 대게, 레인 3 ; 킹크랩, 레인 4 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 6c는 킹크랩 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 킹크랩, 레인 2 ; 대게, 레인 3 ; 홍게, 레인 4 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 6d는 꽃게 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 꽃게, 레인 2 ; 대게, 레인 3 ; 홍게, 레인 4 ; 킹크랩, 레인 N ; 음성 대조군).
도 7a는 대게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 5 ng, 레인 2 ; 0.5 ng, 레인 3 ; 0.05 ng, 레인 4 ; 0.005 ng, 레인 5 ; 0.0005 ng, 레인 N ; 음성 대조군).
도 7b는 홍게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 5 ng, 레인 2 ; 0.5 ng, 레인 3 ; 0.05 ng, 레인 4 ; 0.005 ng, 레인 5 ; 0.0005 ng, 레인 N ; 음성 대조군).
도 7c는 킹크랩 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 5 ng, 레인 2 ; 0.5 ng, 레인 3 ; 0.05 ng, 레인 4 ; 0.005 ng, 레인 5 ; 0.0005 ng, 레인 N ; 음성 대조군).
도 7d는 꽃게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 1 ; 5 ng, 레인 2 ; 0.5 ng, 레인 3 ; 0.05 ng, 레인 4 ; 0.005 ng, 레인 5 ; 0.0005 ng, 레인 N ; 음성 대조군).
도 8a는 대게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 P ; 양성 대조군(대게), 레인 1∼5 ; 게 가공식품 1∼5, 레인 6 ; 홍게, 레인 7; 킹크랩, 레인 8 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 8b는 홍게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 P ; 양성 대조군(홍게), 레인 1∼5 ; 게 가공식품 1∼5, 레인 6 ; 대게, 레인 7; 킹크랩, 레인 8 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 8c는 킹크랩 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 P ; 양성 대조군(킹크랩), 레인 1∼5 ; 게 가공식품 1∼5, 레인 6 ; 대게, 레인 7; 홍게, 레인 8 ; 꽃게, 레인 N ; 음성 대조군).
도 8d는 꽃게 특이 PCR 결과를 나타낸 것이다 (레인 P ; 양성 대조군(꽃게), 레인 1∼5 ; 게 가공식품 1∼5, 레인 6 ; 대게, 레인 7; 홍게, 레인 8 ; 킹크랩, 레인 N ; 음성 대조군).

본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서, "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

본 발명에서, 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명자들은 가공식품에서는 열처리로 인한 DNA의 손상도가 분석에 있어 문제가 될 수 있기 때문에 증폭산물의 크기를 되도록 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하여 이를 해결하고자 하였다 (Trends in biotechnology, 22(5), 222-226 ( 2004)).

본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 대게 판별용일 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 홍게 판별용일 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 킹크랩 판별용일 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 꽃게 판별용일 수 있다.

본 발명자들은 게의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자 군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome C oxidase subunit I) 유전자(대게, 꽃게), ITS 유전자(홍게) 및 사이토크롬 b 유전자(킹크랩)을 선택하였고, 종 특이 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 게에서 종에 따라 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서, 종 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.

특히, 본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에, 식품 원료로 많이 사용되는 게 4종의 미토콘드리아 DNA 중 COI, ITS 또는 사이토크롬 b 유전자에서 서열번호 1 내지 서열번호 8에 해당하는 DNA서열이 각 생물종을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 이를 사용하면 종래의 다른 어떤 방법보다 종 특이적이고 민감도가 현저하게 우수하게 각 해당 생물종을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

도 1a 내지 도 1d는 각각 주요 식품 원료인 대게 또는 꽃게의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자, 홍게의 ITS 유전자 및 킹크랩의 사이토크롬 b 유전자 부위의 염기서열과 그 위치를 연속적으로 나타내고 있는 것이다.

이를 바탕으로 본 발명자들은 게 4종간에 서로 구별이 가능한 임의의 DNA 서열을 도출하였고 (하기 표 1의 서열번호 1 내지 서열번호 8), 이러한 임의의 DNA 서열은 각각 다양한 종의 게를 검출하기 위한 마커(marker)로 사용될 수 있다.

상기 마커는 게의 종 판별을 위한 정방향 프라이머(forward primer) 또는 역방향 프라이머(reverse primer)로 이용될 수 있고, 도 1a 내지 도 1d에는 상기 마커가 결합될 수 있는 유전자 상의 위치를 표시하였다.

본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에 게 DNA의 COI 유전자, ITS 유전자 또는 사이토크롬 b 유전자 중에서 종간에 서로 구분되는 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 게의 종을 구별하기에 가장 적합한 임의의 DNA 서열을 합성하였으며, 이러한 DNA 서열을 포함하는 프로브를 이용하여 게의 종을 구별할 수 있다는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명은 후술하는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나, 그에 상보적인 염기서열을 프로브로 이용한 것이다.

이러한 프로브는 게가 속하는 종에 따라 다른 DNA 서열을 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 게에 속하는 PCR 증폭 산물과는 결합하지만, 이외에 다른 종에 속하는 게의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식품 중 게 원료의 진위여부를 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 식품 중 게 원료의 진위여부를 판별하는 방법은 (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 게 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이므로, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지, 어떤 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.

상기 추출한 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘리기 위한 것이므로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속함은 명백하다.

예컨대, 상기 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있다.

중합효소연쇄반응에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.

바람직하게는, 상기 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

한편, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.

Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다.

따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성 (pre-denaturation) 과정, (ⅱ) 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 신장(elongation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행할 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나, 그에 상보적인 염기서열을 각각 포함하도록 다수의 프로브를 제작할 수 있고, 이러한 프로브 중 적어도 하나 이상을 PCR 산물과 결합시킴으로서, 그 결합 여부에 따라 게의 종을 판별할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 프로브는 게의 미토콘드리아 DNA 중 COI, ITS, CYTB 유전자 또는 미토콘드리아 유전자 부위에 존재하는 서열번호 1 내지 8의 각 DNA 서열과 결합하고, 상기 결합은 상기 게의 종에 따라 다르게 이루어지는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나, 그에 상보적인 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 이용하는 것이 특징이고, 이에 따라 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 키트일 수 있다. 상기 칩 및 키트에는 프로브와의 결합 및 검출의 정확성을 높이기 위하여 특정한 염기서열로 표시되는 별도의 위치 마커가 추가되는 것도 가능하다.

본 발명의 상기 식품 중 게 원료의 진위 여부 판별용 키트는 중합효소 연쇄반응에 통상적으로 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

이러한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수 게의 종을 동시에 판별할 수도 있고, 각 튜브에 각각의 프라이머를 독립적으로 사용하여 식품 내 게 원료의 진위여부를 판별할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> (게 시료의 확보)

종 특이 PCR 조건을 최적화하기 위하여 사용된 DNA를 추출하기 위해, 대게, 홍게, 킹크랩 및 꽃게는 현지 시장에서 구매하였다.

<실시예 2> (게 시료로부터 DNA 추출)

모든 게 시료의 유전자 추출은 DNA Blood and Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 이용하였으며, 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 아래와 같이 수행하였다.

약 100 mg의 시료에 ATL 버퍼 360 μL 및 Proteinase K 40 μL를 넣어 혼합한 후 56℃에서 시료가 버퍼에 의해 모두 용해될 때까지 충분히 반응시켰다. 이후 반응액에 AL 버퍼 400 μL를 넣고 혼합한 뒤, 에탄올(96-100%) 400 μL를 넣고 혼합하였다.

섞인 혼합물은 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 6,000 x g로 1분간 원심분리하였다. 원심분리 후 하층액을 제거한 뒤, AW1 버퍼 500 μL를 컬럼에 넣고, 6,000 x g에서 1분간 원심분리하여 DNeasy Mini spin 컬럼을 세척하였다.

하층액을 제거한 뒤, AW2 버퍼 500 μL를 컬럼에 넣고 20,000 x g으로 3분간 원심분리하여 DNeasy Mini spin 컬럼을 다시 한 번 세척하였다. AE 버퍼 100 μL를 컬럼에 넣고 5분간 방치한 후, 6,000 x g로 1분간 원심 분리하여 용출하였다.

추출한 DNA의 농도 및 순도는 NANODROP 2000(Thermo Scientific)을 사용하여 확인했으며, 종 특이 프라이머를 이용한 마커 유전자 증폭에 주형 DNA로 사용하였다.

<실시예 3> (목적 유전자의 선택과 프라이머 설계)

특정 종의 유전자를 종 특이적으로 증폭하기 위해서는 유전자의 카피수, 증폭할 부분의 크기나 다른 종과의 특이성 등을 고려해야 한다.

미토콘드리아는 세포질에 존재하는 소기관으로, 미토콘드리아 DNA는 핵 DNA에 비해 세포당 카피수가 높고, 진화속도가 더 빨라 근연관계가 밀접한 종을 판별하는데 효율적으로 이용할 수 있는 분자 지표이다 (Meat Science, 83(2), 165-174 (2009)).

본 발명에서는 프라이머 설계를 위하여, 미국 국립생물정보센터의 유전자 은행에 등록되어 있는 대게(GenBank Accession No. HQ322669.1), 홍게(GenBank Accession No. AB501212.1), 킹크랩(GenBank Accession No. JX944381.1) 및 꽃게(GenBank Accession No.FJ919808.1)의 미토콘드리아 유전정보를 확인하여 염기서열을 확보한 후 프라이머를 설계하였고, 비교종의 염기서열을 확보할 수 없는 경우에는 실험을 통해 특이성을 확인하였다.

프라이머를 설계할 때는 길이는 20~30 bp가 되고, G+C%가 45~60%로 구성되도록, 한 쌍의 프라이머가 부분적으로 서로 상보적이지 않도록 위치를 선정하고, 프라이머의 3’말단에 G+C 가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 하여, 헤어핀 루프(hair pin loop)의 형성을 피하였다.

또한, 두 프라이머의 녹는 온도(Tm) 값이 동일하도록 했다. 다른 종과의 특이성이 높아야 하므로 종 특이적이면서 위의 조건을 최대한 충족하도록 하였고, 가공식품에도 적용할 수 있도록 증폭산물의 크기는 되도록 200 bp 이하가 되도록 하였으며, NCBI Primer-BLAST 검색 기능을 이용하여 비교종과의 교차 여부를 확인하였다 (Trends in biotechnology, 22(5), 222-226 (2004)).

도 1a는 대게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1b는 홍게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1c는 킹크랩의 염기서열 비교 및 프라이머 위치, 도 1d는 꽃게의 염기서열 비교 및 프라이머 위치를 나타낸 것이다.

상기와 같이 설계된 프라이머 세트의 염기서열 및 그 정보를 하기 표 1에 나타내었다.

<실시예 4> (유전자 증폭 및 염기서열 분석)

PCR 반응은 10 ng의 주형 DNA와 각각 1 μM의 프라이머, 1x PCR 버퍼, 0.2 mM dNTPs, 2.0 mM MgCl₂, 1 U rTaq 폴리머라제와 멸균 증류수를 포함하여 총 20.0 μL 로 수행되었다.

또한, 결합 최적 온도(annealing temperature)를 찾기 위한 온도별 실험, 최적 PCR 싸이클을 결정하기 위한 싸이클 실험, 최소 검출한계를 확인하기 위한 검출한계 실험을 진행하여, 종 특이 프라이머의 PCR 최적조건을 하기 표 2와 같이 확립하였다.

게 표준시료 4종으로부터 추출한 DNA를 이용해 상기 표 2의 최적화된 조건으로 PCR을 수행한 결과, 도 6a 내지 도 6d에서 보는 바와 같이, 4종류의 게(대게, 홍게, 킹크랩, 꽃게)를 대상으로 교차반응에 의한 비특이적 밴드는 생성되지 않았음을 알 수 있다.

또한, 도 6a 내지 도 6d에서 보는 바와 같이, 각 프라이머 세트는 해당 DNA를 대상으로 예상한 크기의 PCR 산물을 생성하였으며, 대게 특이 프라이머의 크기는 105 bp, 홍게 특이 프라이머의 크기는 140 bp, 킹크랩 특이 프라이머의 크기는137 bp, 꽃게 특이 프라이머의 크기는 174 bp이었다.

개발된 종 특이 프라이머를 이용해 증폭된 짧은 길이의 단편들은 염기서열을 확인하기 위하여, 증폭산물을 아가로오스 겔에서 순수하게 분리하여 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하였다.

플라스미드 DNA는 정제한 뒤, Bioneer Corp(Seoul, South Korea)로 보내 염기서열을 분석하였으며, 분석된 염기서열은 BLAST search 기능을 이용하여 NCBI 데이터베이스 내의 염기서열 정보와 비교하였다.

게 4종 모두 BLAST search를 통해 얻은 억세션 넘버(accession number)가 프라이머를 디자인할 때 사용했던 유전 정보의 억세션 넘버와 일치하며, 증폭된 부분의 염기서열도 100% 일치하는 것으로 나타났다.

또한, NCBI의 Primer-BLAST 기능을 이용하여 프라이머 부위의 염기서열 및 증폭산물의 크기가 동일한 종의 유무를 검색하여, 해당 프라이머로 분석이 가능한 종을 추가로 확인하였다.

꽃게 특이 프라이머의 경우에는 꽃게 이외에도 민꽃게(Charybdis japonica)와 황갈색 줄풍뎅이(Sophrops striata)를 추가로 분석 가능한 것으로 나타났다.

<실시예 5> (각 종 특이 프라이머의 검출 한계 분석)

각 종의 검출 한계는 표준 시료에서 추출한 주형 DNA를 단계적으로 10배씩 희석하여, 5~0.00005 ng/uL 범위에서 실험을 수행한 결과를 도 7a 내지 도 7d에 나타내었다.

도 7a 내지 도 7d에서 보는 바와 같이, 대게 특이 프라이머의 검출 한계는 0.005 ng/μL이고, 홍게 특이 프라이머의 검출 한계는 0.05 ng/μL이며, 킹크랩 특이 프라이머의 검출 한계는 0.05 ng/μL이고, 꽃게 특이 프라이머의 검출 한계는 0.5ng/μL이었다.

<실시예 6> (종특이적 프라이머를 이용한 게 가공식품의 종 판별)

국내 대형 마트에서 시판중인 게살이 포함되었다고 표기된 어묵, 맛살, 소스, 소시지 등의 가공식품 5종과 게 원물 4종을 대상으로 개발한 종 특이 프라이머를 이용하여 제품 중 포함된 식품원료의 진위를 판별한 결과를 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의하면, 종 특이 프라이머를 이용하여 시료 원물 뿐 만 아니라, 육안 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 간단하고 정확하게 사용 원료의 진위 여부를 확인할 수 있으며, 종래 프라이머가 가지고 있는 식품 적용 한계를 극복할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

<110> Republic of Korea (Ministry of Food and Drug Safety) <120> Primer set for determining identity of crap material in food, method of determining identity of crap material in food using the same and kit comprising the same <130> 10728 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Chionoecetes opilio <400> 1 gtataagcct agatcaaata cca 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Chionoecetes opilio <400> 2 aaagtatggt aattgctcca gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Chionoecetes japonicus pacificus <400> 3 acgaaggtgt gcccttaaga 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Chionoecetes japonicus pacificus <400> 4 cacaactagt aacgcgtcaa c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Paralithodes camtschaticus <400> 5 cctgggtatt tctagacaag taga 24 <210> 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Claims (8)

1. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 쌍을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 대게 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
4. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 홍게 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
5. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 킹크랩 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
6. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향으로 이루어진 프라이머 쌍은 꽃게 판별용인 것을 특징으로 하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 프라이머 세트.
7. (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
   (b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출한 게놈 DNA를 중합효소연쇄반응 시켜 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 식품 중 게 품종의 진위여부를 확인하는 단계를 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 식품 중 게 원료의 진위여부 판별용 키트.

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