KR20180086195A - 면역 매개 암 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

면역 매개 암 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 일부 구체예에서, 방법은 (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA)를 피험자에게 투여하는 단계; (b) (i) 저산소증 유도제를 피험자에게 투여하거나 또는 (ii) 고형 종양에 공급되는 하나 이상의 혈관을 색전시킴으로써 저산소증을 유도하는 단계; 및 (c) 면역 체크포인트 억제제의 부재 하에서의 면역 반응과 비교할 때, 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키기에 효과적인 양으로 단계 (b) 이전에, 단계 (b)와 동시에 또는 단계 (b) 이후에 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 개시된 방법에 사용하기 위한 키트가 또한 제공된다.

Description

면역 매개 암 치료를 위한 조성물 및 방법
상호 참조
본 PCT 출원은 미국 가특허출원 번호 62/244,457(2015년 10월 21일 출원)을 우선권으로 주장하며, 사실상 그 전문이 본원에 참고 인용된다.
본 발명의 배경
일부 환자가 종양 특이적 세포독성 T 세포의 검출에 기초하여 암에 대한 면역성을 나타내는 것으로 밝혀졌지만, 이러한 T 세포는 치료적 또는 보호적 이득이 있다고 하더라도 이를 많이 부여하지 않으면서 종양으로부터 차폐되는 것으로 보인다. 일부는 종양이 면역 공격을 피하기 위해 다양한 메카니즘을 진화시킨다는 이론과의 불일치를 설명한다. 정상적인 면역 반응을 일으키기 위해, APC는 종양 유도 항원을 섭취하고, 항원을 운반하는 종양 세포에 대해 세포독성을 발달시키는 T 세포를 프라이밍하도록 처리 후 이를 T 세포에 제시한다. 종양 연관 항원을 인식하고 보조활성인자 CD28 및 MHC 분자와의 복합체를 형성하는 T 세포 수용체(TCR)를 비롯하여, APC와 T 세포 사이의 상호작용은 다양한 리간드-수용체 상호작용에 의해 조절된다. CTLA4는 T 세포의 음성 조절제로서 작용하고, CD40은 APC에 대한 양성 조절제로서 작용한다. PD-1은 세포독성 T 세포의 또다른 음성 조절제이고, 면역 체크포인트로서 작용한다. 종양 세포는 PD-L1로 지칭되는 PD-1 리간드를 발현할 수 있고, PD-L1은 PD-1을 활성화시키고 이에 따라 T 세포의 항종양 활성을 억제한다. 종양은 또한 조절 T 세포를 동원할 수 있고, 이는 면역 공격으로부터 종양을 보호하기 위해 세포독성 T 세포 활성을 억제할 수 있다. 암 치료를 위한 면역 신호전달 반응을 조작하려는 노력이 있었지만, 무진행 생존시 반응 비율과 효과에는 개선의 여지가 많이 남아 있다. 게다가, 면역 억제를 약화시키는 화합물에 너무 많이 의존하게 되면 면역계의 균형이 자가면역 질환으로 향하게 될 수 있다. 예를 들면, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 관찰된 부작용은 다양한 면역 관련 간염, 폐렴, 뇌하수체염, 대장염 등을 포함하며, 이는 일반적인 면역성의 추가적인 증대가 잠재적 위험을 부를 수 있다는 것을 가리킨다.
전술한 내용을 고려하여, 특히 피험자의 면역 반응을 이용하는 암 치료를 위한 개선된 조성물 및 전략이 필요하다. 본 개시내용은 이러한 요구를 다루며, 다른 이점도 제공한다. 본원에 개시된 구체예 중 일부에서, 면역 체크포인트 억제제의 투여와 (종양 항원에 면역계 노출을 증가시키는) 종양 내 괴사 유도를 조합하여 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법이 제공된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법으로서, (a) 피험자에게 저산소증-활성화 생환원제(HABA; hypoxia-activated bioreductive agent)를 투여하는 단계; (b) (i) 피험자에게 저산소증 유도제를 투여하거나 또는 (ii) 고형 종양에 공급되는 하나 이상의 혈관을 색전시킴으로써 저산소증을 유도하는 단계; 및 (c) 면역 체크포인트 억제제의 부재 하에서의 면역 반응과 비교할 때, 고형 종양에 대한 면역 반응을 증대시키기에 효과적인 양으로 단계 (b) 이전에, 단계 (b)와 동시에 또는 단계 (b) 이후에 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 저산소증-활성화 생환원제는 티라파자민이다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 혈관 차단제(vascular disrupting agent)인 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 혈관 차단제는 DMXAA, 스틸벤 또는 스틸벤 유도체이다. 일부 구체예에서, 스틸벤 유도체는 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 유도체, 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 5c), 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-히드록시스틸벤(스틸벤 6c) 및 스틸벤 5c의 프로드러그 모르폴리노-카르바메이트 유도체로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 항혈관형성제인 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 저산소증 활성화제 및 저산소증 유도제는 고형 종양의 적어도 75%의 괴사를 유도하기에 효과적인 양을 투여된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 색전제를 투여함으로써 하나 이상의 혈관을 색전시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4의 억제제이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 단클론 항체이다. 일부 구체예에서, 단클론 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, MEDI4736 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 고형 종양은 간세포 암종, 담관암종, 간에서의 전이성 결장직장암, 폐암, 유방암, 결장직장암, 방광암, 두경부암, 난소암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 종양이다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 경동맥 색전술을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 수행된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (c)는 단계 (b) 후 2회 이상 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 조절제의 투여는 적어도 6개월 동안 전처리 크기의 50% 미만인 크기에서 고형 종양을 유지하는데 효과적이다. 일부 구체예에서, HABA 투여, 저산소증 유도 및 면역 체크포인트 억제제 투여의 조합은 피험자에서 증식성 질환의 치료에 상승적 효과를 나타낸다.
일 측면에서, 본 개시내용은 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA); (b) 저산소증 유도제 또는 색전제; 및 (c) 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, HABA는 티라파자민이다. 일부 구체예에서, (b) 부분은 혈관 차단제인 저산소증 유도제이다. 일부 구체예에서, 혈관 차단제는 DMXAA, 스틸벤 또는 스틸벤 유도체이다. 일부 구체예에서, 스틸벤 유도체는 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 유도체, 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 5c), 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-히드록시스틸벤(스틸벤 6c) 및 스틸벤 5c의 프로드러그 모르폴리노-카르바메이트 유도체로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, (b) 부분은 항혈관형성제인 저산소증 유도제이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4의 억제제이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 단클론 항체이다. 일부 구체예에서, 단클론 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, MEDI4736 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택된다.
참고 인용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고 인용되도록 하는 것과 동일한 범위로 본원에 참고 인용된다.
본 출원의 신규 특징은 첨부된 청구범위에서 특정하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 나은 이해는 본 발명의 원리가 사용되는 예시적 구체예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어지게 된다:
도 1에는 종양 세포, 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포(APC) 및 조절 T 세포 사이의 상호작용 및 조절을 예시하는 예시 다이어그램을 제공한다. 다이어그램은 체크포인트 PD-1, PD-L1 또는 CTLA4의 차단이 어떻게 종양 내 면역 억제 효과를 조절할 수 있는 지를 예시한다.
도 2에는 HBx 트랜스제닉 마우스 모델에서 식염수, 독소루비신 또는 티라파자민과 좌간동맥 결찰(HAL)의 조합의 비교에 대한 예시 결과를 제공한다. 종양 보유 HBx 트랜스제닉 마우스에 생리식염수, 티라파자민(3 mg/kg, 꼬리 정맥으로부터의 IV 주사) 또는 독소루비신(10 mg/kg)을 처리 후 40분 동안 좌간동맥 결찰을 시켰다. 처리 후 다양한 일수에 마우스 체중, 빌리루빈 및 ALT를 측정하였다. 마우스는 간세포 암종(HCC) 종양의 조직학적 분석을 위해 7일째에 희생되었다.
도 3에는 티라파자민 및 간동맥 결찰에 의한 HCC 처리 후의 종양 괴사 유도 및 염증 반응 촉발의 효과를 예시하는 조직 이미지를 제공한다. 종양 보유 HBx 트랜스제닉 마우스에 티라파자민(3 mg/kg 꼬리 정맥으로부터의 IV 주사)을 처리 후 40분 동안 좌간동맥 결찰을 시켰다. 마우스는 HCC 종양의 조직학적 분석을 위해 7일째에 희생되었다. 거의 완전한(99%) 종양 괴사가 있는 여러 조직 절편으로 조립된 전체 종양의 복합 사진이 도시된다. 또한 괴사성 종양의 끝에는 고도의 염증 세포 침윤(모두 확대된 배율의 삽입물)을 갖는다는 것을 유념한다.
도 4에는 완전 반응(CR)을 달성한 2명의 환자의 조영 증강 MRI 스캔의 대표 사진을 제공한다. 이 환자들은 경동맥 색전술 이전에 각각 5 및 10 mg/m2 티라파자민을 투여받았다. 후속 MRI 스캔은 색전술 절차 후 6주째에 실시하였다. 화살표로 강조표시된 어두운 영역은 종양이며, 이는 조영 증강의 증거를 갖지 않고 완전 종양 괴사 또는 CR로서 평가된다.
도 5에는 티라파자민 및 혈관 차단제에 의한 종양 괴사 유도 및 염증 반응 촉발의 효과를 예시하는 조직 이미지를 제공한다. NCI-H460 세포를 BALB/c 누드 마우스에 피하 주사하여 종양 이종이식을 형성시켰다. 종양의 크기가 직경 10 mm로 성장하면, 마우스를 티라파자민(30 mg/kg IP) 및 (A) 콤브레타스타틴 A4(10 mg/kg IV) 또는 (B) DMXAA(20 mg/kg IV)(Chaplin DJ, 2006)로 처리하였다. 제1 처리 3주 후 마우스를 희생시키고 H&E 염색을 위해 종양을 해부하였다. 조직학의 대표 사진이 도시된다. 종양 괴사 및 주변 염증성 침윤의 영역이 표시된다.
도 6에는 C57BL/6 마우스에서 피하 3LL 폐 동계 암 모델의 처리에서의 항-mPD-1, 티라파자민(TPZ), 콤브레타스타틴 A4 포스페이트, 5, 6-디메틸크산테오논-4-아세트산(DMXAA) 및 이의 다양한 조합의 투여의 병리학 및 면역조직화학을 평가하는 연구의 실험 디자인을 기술하는 표를 제공한다.
도 7에는 C57BL/6 마우스에서 피하 3LL 폐 동계 암 모델의 처리에 있어서 항-mPD-1, 티라파자민(TPZ), 콤브레타스타틴 A4 포스페이트, 5, 6-디메틸크산테오논-4-아세트산(DMXAA 및 다양한 이의 조합의 투여 후 포르말린 고정 파라핀 내포된 조직의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 기초로 한 종양 괴사율의 결과를 제공한다. 별표(*)는 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트에 의해 결정되는 바와 같이 비히클 군과 비교하였을 때 통계적 유의성(P<0.05)을 나타낸다.
도 8은 도 7에 설명된 H&E 염색 3LL 종양 조직 절편에서의 종양 괴사율을 제공하는 표이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들면, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 표준 편차 이상 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 값의 5배 이내, 더욱 바람직하게는 값의 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기술되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.
용어 "피험자" "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하는 것으로 본원에서 상호 혼용된다. 포유류는, 비제한적으로, 쥐과동물, 유인원, 인간, 농장 동물, 경주 동물 및 애완 동물을 포함한다. 생체 내에서 수득된 또는 시험관 내 배양된 생물학적 실재의 조직, 세포 및 이의 자손이 또한 포괄된다.
용어 "치료제", "치료 가능제" 또는 "치료 약제"는 상호 혼용되며 피험자에게 투여시 다소 유리한 효과를 주는 분자 또는 화합물을 나타낸다. 유리한 효과는 진단 결정의 가능화; 질병, 증상, 질환 또는 병리학적 병태의 개선; 질병, 증상, 질환 또는 병태의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 질환 또는 병리학적 병태의 중화를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"이 상호 혼용된다. 상기 용어는 비제한적으로 치료 이점 및/또는 예방 효과를 포함하는 유리하거나 바람직한 결과를 얻는 접근법을 나타낸다. 치료적 이득이란 치료시 하나 이상의 질병, 병태 또는 증상에 대한 임의의 치료학적으로 관련된 향상 또는 효과를 의미한다. 예방적 이득의 경우, 조성물은 특정 질병, 병태 또는 증상이 발병할 위험이 있는 피험자에게, 또는 질병, 병태 또는 증상이 아직 나타나지 않았더라도 질병의 생리학적 증상 중 하나 이상이 보고되는 피험자에게 투여될 수 있다. 통상, 예방적 이득은 (예, 치료 및 미치료된 집단 사이에서, 또는 피험자의 치료 및 미치료된 상태 사이에서) 치료 하에 하나 이상의 질병, 병태 또는 증상의 발생 및/또는 악화를 감소시키는 것을 포함한다.
용어 "동시투여", "와 함께 투여된" 및 이의 문법적 등가물은, 둘 이상의 약제를 동물에게 투여하는 것을 포함하여 모든 약제 및/또는 이의 대사산물이 동시에 동물에 존재하도록 한다. 동시투여는 별도의 조성물의 통시 투여, 별도의 조성물의 상이한 시간에 투여(예, 별도의 조성물의 순차 투여) 또는 모든 약제가 존재하는 조성물의 투여를 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리하거나 바람직한 결과를 유도하기에 충분한 약제의 양을 나타낸다. 치료적 유효량은 치료하고자 하는 피험자 및 질병 병태, 피험자의 체중 및 연령, 질병 병태의 중증도, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 다양할 수 있다. 유효량의 활성제는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 성분은, 본원에 기술된 바와 같은 특정 목표 또는 목적과 관련된 것에 적어도 효과적인 양 또는 적어도 유효량을 갖는 것으로 본원에 기술될 수 있다.
"상승적" 또는 "상승된" 효과는 조합 조성물의 하나 이상의 효과가 각 성분 단독의 하나 이상의 효과보다 클 수 있거나 또는 각 성분 단독의 하나 이상의 효과의 합계보다 클 수 있다. 상승 효과는 성분 중 하나를 단독 투여한 피험자에 대한 효과보다 또는 개별적으로 투여된 경우 각각의 성분의 부가 효과보다 약 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 100%, 110%, 120%, 150%, 200%, 250%, 350% 이상 또는 500% 이상일 수 있다. 효과는 본원에 기술된 임의의 측정가능한 효과일 수 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 방법은 (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA)를 피험자에게 투여하는 단계; (i) 저산소증 유도제를 피험자에게 투여함으로써 또는 (ii) 고형 종양에 공급되는 하나 이상의 혈관을 색전시킴으로써 단계 (a) 후 저산소증을 유도하는 단계로서, HABA 및 저산소증은 고형 종양의 괴사 유도에 효과적인 것인 단계; 및 (c) 면역 체크포인트 억제제의 부재 하에서의 면역 반응과 비교할 때, 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키기에 효과적인 양으로 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 저산소증-활성화 생환원제(HABA)는 산소의 존재 하에서 비활성 프로드러그이고, 저 산소 환경(예, 저산소증)에서 프로드러그 형태에 대하여 증가된 활성을 갖는 활성 형태로 전환되는 화합물이다. 일부 구체예에서, 저 산소 환경에서의 증가된 활성은, 본원에 기술된 방법에 의해 저산소증 영역이 발생되지 않았지만 고형 종양 또는 고형 종양 함유 영역에 동일한 양의 저산소증-활성화 생환원제를 투여하였을 때보다, (예, 본원에 기술된 방법에 의해 저산소증 국소 영역이 종양에 또는 종양을 함유하는 영역에 발생되는 경우) 본원에 기술된 방법에 따라 투여가 수행되었을 때 더 큰 고형 종양 내 종양 세포 사멸의 수준에 의해 입증된다. 일부 구체예에서, 활성 증가는 적어도 약 10배 이상이고, 증가는, 예를 들어 약 20-200배, 또는 약 50-200배, 또는 100-200배, 또는 그 이상 더 높을 수 있다. HABA의 예는, 비제한적으로, 티라파자민, 바녹산트론(AQ4N), 포피로마이신, 아파지쿠온(EO9), 1,2-비스(메틸설포닐)-1-(2-클로로에틸)-2-[[1-(4-니트로페닐)에톡시]카르보닐]히드라진(KS119), 디니트로벤즈아미드 머스타드 유도체(예, PR 104) 및 4-[3-(2-니트로-1-이미다졸릴)-프로필아미노]-7-클로로퀴놀린 히드로클로라이드(NLCQ-1, NSC 709257)를 포함한다. 추가예는, 비제한적으로, 니트로이미다졸 미소니다졸, 에타니다졸, 및 니모라졸, TG-302, SN30000, 미토마이신 C(MMC), 포피로마이신, RH1, 및 EO9(아파지쿠온)를 포함한다. 일부 구체예에서, HABA는 티라파자민이다. 일부 구체예에서, 티라파자민은 하기 구조를 갖는다:
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일부 구체예에서, 저산소 영역은 산소 수준이 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만인 영역이다. 일부 구체예에서, 저산소 영역의 산소 수준은 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%이다. 일부 구체예에서, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 산소 수준은, 저산소증-활성화 생환원제, 예컨대 티라파자민을 프로드러그 형태보다 적어도 10배 더 활성인 수준으로 활성시키기에 충분하다. 당업자라면 생물학적 시스템에서의 산소 수준의 측정에 익숙하며, 또한 산소 측정치가 "mm Hg"으로 표시될 수 있음을 인지하고 있으며, 예를 들면, 10% O2는 약 76 mmHg이고 1% O2는 약 7.6 mmHg이다.
HABA는 HABA 투여 후 유리하게 수행되는 저산소증을 유도함으로써 활성화될 수 있다. 생환원제가 활성화되는 국소 저산소 영역을 유도하기 위해 임의의 다양한 전략이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이는, 목표 영역에 공급되는 하나 이상의 혈관의 기계적 색전술에 의해, 예를 들어 혈관을 기계적으로 폐색시키기 위해 중재 방사선전문의에 의해 배치된 카테터를 통한 색전제 또는 디바이스의 투여에 의해 달성된다. 일부 구체예에서, 저산소증은 경동맥 색전술에 의해 유도된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 저산소증 유도제, 예컨대 혈관 차단제(VDA) 및/또는 항혈관형성제(AAA)는 사전 투여된 또는 동시 투여된 HABA가 활성화되는 국소 저산소 영역에 국소 또는 전신 투여된다.
일부 구체예에서, 혈관 차단제(VDA)는 DMXAA, 스틸벤 또는 스틸벤 유도체이다. 스틸벤 유도체의 비제한적 예는 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 유도체, 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 5c), 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-히드록시스틸벤(스틸벤 6c), 및 스틸벤 5c의 프로드러그 모르폴리노-카르바메이트 유도체를 포함한다. 추가의 VDA는 비제한적으로 (5S)-5-(아세틸아미노)-9,10,11-트리메톡시-6,7-디히드로-5H-디벤조[a,c]시클로헵텐-3-일 디히드로젠포스페이트(ZD6126), (N-[2-[4-히드록시페닐)아미노]-3-피리디닐]-4-메톡시벤젠설폰아미드)(E7010 또는 ABT-751)를 포함한다. 이러한 화합물은 전신 투여된 경우에도 종양에서 극심한 저산소증을 선택적으로 유도한다. VDA의 투여는 표준 색전술에서의 혈관의 직접적인 폐색과 대조적으로 종양 함유 영역에서 선택적으로 색전술의 동일한 목표를 실현하기 위한 화학 약제를 사용하는 것인 화학적 색전술의 한 유형으로 간주될 수 있다. VDA 및 저산소증-활성화 생환원제, 예컨대 티라파자민의 조합은 놀랍게도 고형 악성 종양의 치료에서 단독 약제의 활성을 기초로 예측되는 것보다 더 효과적이다. 이의 활성은 상승적이다. 예를 들면, 티라파자민 후 제공된 VDA는 티라파자민의 활성을 허용하고 약제 단독에 의한 종양 세포 사멸 수준과 비교하여 적어도 10배 이상까지 후속 종양 세포 사멸을 증가시킨다. 이러한 전략은 또한 하기 기술된 색전술과 조합되어 종양 저산소증 및 티라파자민 활성을 유도하는데 더욱 더 효과적일 수 있다.
일부 구체예에서, 저산소증 유도제는 항혈관형성제(AAA)이다. AAA의 비제한적 예는 베바시주맙, 이트라코나졸, 카르복시아미도트리아졸, TNP-470, CM101, IFNα, IL-12, 혈소판 인자-4, 수라민, SU5416, 트롬보스폰딘, VEGFR 길항제, 안지오스타틴, 앤도스타틴, 2-메톡시에스트라디올, 테코갈란, 테트라티오몰리브데이트, 탈리도미드, 트롬보스폰딘, 프로락틴, αvβ3 억제제, 리노미드, 타스퀴니모드, 라니비주맙, 소라페닙, 수니티닙, 파조파닙 및 에베롤리무스를 포함한다. 추가의 AAA는 비제한적으로 아플리베르셉트, IMC-1C11, 바탈라닙(PTK-87), N-(2,3-디히드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리디네카르복사미드(AMG 706), 3-(4-브로모-2,6-디플루오로-벤질옥시)-5-[3-(4-피롤리딘-1-일-부틸)-우레이도]-이소티아졸-4-카르복실산 아미드(CP-547,632), N-(4-(3-아미노-1H-인다졸-4-일)페닐)-N'-(2-플루오로-5-메틸페닐)우레아(ABT-869) 및 세디라닙(AXD-2171)을 포함한다. 단클론 항체, 예컨대 베바시주맙은 7일 이상의 반감기를 갖고 혈관형성 인자 VEGF의 중화에 의해 작용한다. VEGF의 결핍은 결국 종양의 새로운 혈관 형성을 막고 종양 내 산소 소비로 인한 종양 저산소증을 유도한다. 소분자 화합물, 예컨대 소라페닙 및 수니티닙은 24시간 미만의 반감기를 갖고 VEGF 수용체의 키나아제 활성을 직접 억제함으로써 작용한다.
일부 구체예에서, VDA 및 AAA의 조합은 종양 저산소증을 유도하는 데 사용된다. 일부 구체예에서, VDA는 종양 혈류의 즉각적인 억제를 유도하여 저산소증 및 HABA의 활성을 유도한다. 종양 저산소증의 유도와 관련된 일부 구체예에서, AAA는 종양에 의한 보상성 저산소 반응, 예컨대 골수로부터 내피 전구 세포를 이동시켜 손상된 종양 혈관구조를 수복하는 VEGF 또는 다른 혈관형성 인자의 생성을 억제하는 데 사용된다. 베바시주맙과 같은 AAA와 VDA의 조합은 VEGF의 보상 효과를 방지하고 종양 혈관의 수복 과정을 억제하여 종양을 저산소 상태로 유지시킴에 있어 VDA의 효과를 증진시키도록 돕는다.
일부 구체예에서, 이러한 방법의 다양한 조합이 또한 고려되고(예, 색전술 및 하나 이상의 저산소증 유도제), 전체 효과는, 활성화된 생환원제의 표적화된, 국소 제공, 및 생환원제에 대한 전신 노출로 인한 통상적인 부작용없이 표적 부위 내 또는 표적 부위에서의 종양 세포의 효과적 사멸이다. 이러한 증진은 또한 적절하고 효과적인 수준의 종양 세포 사멸을 유지하면서 더 적은 용량의 약제의 사용을 허용하여 독성을 더욱 감소시킬 수도 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 조합 종양 요법의 성분은 하나 이상의 항혈관형성제(AAA), 및 하나 이상의 혈관 차단제(VDA), 및 저산소증-활성화 생환원제(HABA)를 포함한다. AAA 및 VDA의 조합은 함께 투여하였을 때 종양 세포에서 연장된 저산소증을 유도하고, 종양 세포 스스로 사멸에 일부 효능을 나타낸다. 하지만, 이의 활성은 저산소증-활성화 생환원제(HABA)와 조합하여 본원엔 기술된 바와 같이 투여되는 경우 상승적 방식으로 유의적으로 증진된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 HABA를 동시 투여함으로써 AAA 및/또는 VDA의 항암 활성을 증진시키는 방법이다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 AAA 및/또는 VDA를 동시투여함으로써 HABA의 항암 활성을 증진시키는 방법이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제의 투여에 의해 효능이 더 증진된다.
색전술 절차의 일례에서, 색전술은, 종양 함유 영역에 공급된 동맥의 분지의 폐색을 유도하고 이에 종양 세포가 충분한 혈류를 얻지 못해 사멸되도록 하는 물질(예, 리피오돌, 젤폼, 응혈, 특정 비드 등)을 주사함으로써, 간세포 암종에 공급된 간동맥과 같이 식별가능한 동맥 분지에 의해 공급되는 종양 또는 종양 함유 영역에 사용되는 국소 요법을 포함한다. 영역의 혈액 공급과 주변 정상 기관 또는 조직의 해부학은 주변 기관/조직이 색전 후 혈액 공급 부족으로 인한 유의적 손상을 입을 수 있는지 여부를 결정한다. 예를 들면, 정상적인 간은 이중 혈관인 간동맥과 간문맥에 의해 공급되고, 이에 따라 정상적인 간에 유의적인 손상의 결과 없이 간동맥 또는 이의 분지의 폐색을 허용한다. 이러한 절차는 일반적으로 사타구니의 대퇴동맥으로부터 카테터를 배치하고 형광투시경 X선 안내 하에 종양에 공급되는 간동맥의 분지에 카테터의 끝을 진전시키는 중재 방사선전문의에 의해 수행된다. 일단 종양에 공급된 동맥 분지는 조영재의 주사에 의해 확인되고, 색전제, 예컨대 리피오돌 또는 젤폼이 주사되어 분지를 폐색시킨다.
리피오돌 이외에, 다른 색전제는 비제한적으로 젤폼, 응혈, 나노입자 또는 혈관 폐색의 목적을 실현할 수 있는 임의의 임상 입증된 기계적 약제를 포함한다. 색전제 및 저산소증-활성화 생환원제(HABA)의 투여는 임의의 적당한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, HABA는 색전제의 투여 전(예, 약 1-120분 전)에 투여될 수 있고, 색전제의 후속 투여는 영역의 HABA를 "차단한다". 대안적으로, 두 약제는 (예를 들어 혼합물에서 두 약제를 포함하는 제제를 사용하여) 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여되는 HABA의 투여량은 상기 방법에 의해 치료하고자 하는 환자에 대해 약 1 mg 내지 약 200 mg(예, 티라파자민), 바람직하게는 약 5-약 80 mg의 범위이고; 투여될 색전제의 용량은, 예를 들어 리피오돌 약 5-40 ml, 바람직하게는 약 20-30 ml의 범위이다. 충분한 색전제를 투여하여 형광투시경 X선 검사 하에 혈관의 의도한 분지의 완전한 폐색을 실현함으로써 폐색 지역에서의 저산소 영역 또는 상태의 생성을 보장한다. 색전제의 투여는 통상 동맥내 주사에 의해 수행된다. 대안적으로, 색전술은 폐색을 유도하는 특정 비드와 같은 다른 수단에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, HABA 및 저산소증 유도의 조합은 고형 종양의 괴사를 유도한다. 일부 구체예에서, 조합은 하나 이상의 종양의 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 95%, 또는 그 이상의 괴사를 유도한다. 괴사 정도의 유도는 치료 후 특정 시간 후에 도달되는 정도일 수 있다. 예를 들면, 적어도 50%의 종양 괴사는 치료 후 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 주, 또는 치료 후 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 개월 내에 실현될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료에 의해 유도되는 종양 괴사의 정도는 출발 종양 크기에 비해 치료 후 관찰되는 최대 수준의 괴사이다.
일부 구체예에서, 종양의 괴사는 종양에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 대한 피험자의 면역 반응을 유도한다. 예를 들면, 종양 항원은 비제한적으로 알파페토프로테인(AFP), 태아성암 항원(CEA), CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원(ETA), 티로시나아제, 흑색종-관련 항원(MAGE), BCR-abl, p53, 미성숙 라미닌 수용체, TAG-72, HPV E6, HPV E7, BING-4, 칼슘-활성화된 클로라이드 채널 2, 사이클린-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA3, Her2/neu, 텔로머라아제, 메소텔린, SAP-1, 서바이빈, BAGE, CAGE, GAGE, SAGE, XAGE, NY-ESO-1/LAGE, PRAME, SSX-2, Melan-A/MART-1, Gp100/pmel17, TRP-1, TRP-2, P. 폴리펩티드, MC1R, 전립샘 특이적 항원(PSA), b-카테닌, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, MART-2 또는 TGRbRII를 포함한다.
HABA의 투여, 저산소증의 유도, 및 면역 체크포인트 억제제의 투여는 순차적으로 또는 동시에 될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제의 투여는 HABA의 투여 및/또는 저산소증 유도와 순차적으로 할 수 있다. 예를 들면, 면역 체크포인트 억제제는 HABA 투여 또는 저산소증 유도 또는 둘다 이전에 단독으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제가 투여되고, 그 후에 HABA가 투여된 후 저산소증이 유도될 수 있다. 면역 체크포인트 억제제의 투여는 HABA 투여 및/또는 저산소증 유도 후에 단독으로 될 수 있다. 대안적으로, 면역 체크포인트 억제제의 투여는 HABA의 투여 및/또는 저산소증 유도와 함께 될 수 있다.
일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증 유도 이전에, 동시에 또는 이후에 투여된다. 저산소증을 유도하기 이전에 투여되는 경우, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 약 5분 내지 약 24시간 이상 전에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 또는 60분 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 18, 24시간 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28일 이상 전에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 전에 1회 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도하기 전에 다회(예, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25회 또는 그 이상) 투여된다. 동시 투여되는 경우, 2개의 약제는 조합 조성물(예, 단일 액체 현탁액)로 투여될 수 있거나, 동일한 또는 상이한 투여 경로를 통해 거의 동시에 투여되는 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 저산소증을 유도한 후에 투여되는 경우, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한지 약 5분 내지 약 24시간 또는 그 이상 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한지 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 또는 60분 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한지 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 18, 24시간 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28일 또는 그 이상 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한 후 1회 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한 후 다회(예, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25회 또는 그 이상) 투여된다.
면역 체크포인트 억제제의 투여는 목표 치료 결과와 같은 특정 종료점이 얻어질 때까지 설정된 투약 스케줄을 따를 수 있다. 투약 스케줄의 예는 면역 체크포인트 억제제를 1일 1회 이상(예, 1, 2, 3회 또는 그 이상); 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일마다 또는 그 이상 1회 이상; 매 1, 2, 3, 4주마다 또는 그 이상 1회 이상; 매 1, 2, 3, 4, 5, 6개월마다 또는 그 이상 1회 이상; 또는 (예, 테이퍼형 투약 스케줄과 같이) 이의 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 저산소증을 유도한 후 몇주에 걸쳐 다회, 예를 들어 저산소증을 유도한 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 20, 24 또는 52주에 걸쳐 1일 1, 2, 3, 4회 또는 그 이상 투여된다.
일반적으로, 면역 체크포인트 억제제는 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질을 전부 또는 일부 감소, 억제, 방해 또는 조절하는 약제이다. 면역 체크포인트 단백질은 T 세포 활성 또는 기능을 조절한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 비제한적으로 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포를 포함한 T 세포의 활성 또는 기능을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 헬퍼 T 세포는 비제한적으로 Th1 세포, Th2 세포, 및 Th17 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 조절 T 세포의 활성을 감소시키면서 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포의 활성을 증가시켜, 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 종양 항원에 대한 T 세포의 증식을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는, 비제한적으로 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL22, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL9, CCL17, CCL19, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL12, CXCL13, CXCL16, G-CSF, GM-CSF, IFNb, IFNg, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-23, IL-27, MIF, TGFb, TNFa, VEGF, 또는 온코스타틴 M을 포함한, 종양 항원에 대한 T 세포에 의해 사이토카인의 분비를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 비제한적으로 퍼포린, 그랜자임 및 그라울리신(graulysin)을 비롯한 세포독소의 방출에 의해 세포독성 T 세포 활성, 또는 종양 세포 사멸을 증가시킨다. 면역 체크포인트 단백질 표적의 예는, 비제한적으로 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276로도 공지됨), B7-H4(VTCN1로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠조절인자(BTLA, CD272로도 공지됨), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 살생 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 림프구 활성 유전자-3(LAG3), 예정사-1(PD-1), 예정사-1 리간드(PD-L1 및 PD-L2)T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), T 세포 활성 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA), IL-10 또는 TGF-베타를 포함한다.
도 1은 종양 세포, 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포(APC) 및 조절 T 세포 사이의 상호 작용 및 다양한 항체를 사용한 면역 체크포인트의 조절을 도시하는 예시 다이어그램을 제공한다. 예를 들면, 도 1에 도시된 것은 CTLA4, PD-1 및 PD-L1을 포함한 면역 체크포인트 수용체에 대한 항체이다. 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체는 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용을 차단함으로써 세포독성 T 세포 활성을 증진시킬 수 있다. 종양 세포에 대한 항-PD-L1 또는 항-PD-1의 투여는 면역 회피를 예방하고 면역 매개 항종양 활성을 증가시킬 수 있다. 항-CTLA4 항체는, 또한 설명된 바와 같이, CTLA4 결합의 면역억제 효과를 차단함으로써 활성 세포독성 T 세포의 면역 매개 세포독성을 증진시켜, 잠재적으로 T 세포 증식을 증진시킬 수 있다. 이러한 항체는 조절 T 세포의 활성을 감소시킬 수 있다.
임의의 다양한 면역 체크포인트 억제제는 유리하게 사용될 수 있다. 억제제는 소분자, 억제 폴리펩티드(예, 천연 또는 절두 리간드 또는 수용체에서와 같이), 압타머 또는 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 억제제는 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 서열을 포함하는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgM, IgG, IgE, IgA 또는 IgD 이소형이다. 일부 구체예에서, 항체는, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형의 IgG 아형이다. 일부 구체예에서, 항체는 중쇄, 경쇄, 또는 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄이다. 일부 구체예에서, 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab' 또는 Fab'2, Fv, Fd, 단쇄 Fv(scFv), 디설피드 연결 Fv(ddFv), VL, VH, Camel Ig, V-NAR, VHH, 삼중특이적(Fab3), 이중특이적(Fab2), 디아바디((VL-VH)2 또는 (VH-VL)2), 트리바디(3가), 테트라바디(4가), 미니바디((scFv-CH3)2), 이중특이적 단쇄 Fv(비스-scFv), IgG델타CH2, scFv-Fc 또는 (scFv)2-Fc, 단편, 또는 단쇄 항체이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, MEDI4736, 람브롤리주맙, MPDL3280A, BMS-936559, BMS-936558/MDX-1106, CT-011, 피딜리주맙, 갈릭시맙, AMP-514, MEDI4736, MK-3475, MPDL3280A, IMP321, BMS-986016, IPH2101, MSB0010718C, AUNP 12, 트레멜리무맙 및 이필리무맙에서 선택된다.
일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 인간 또는 인간외 동물(예, 마우스 또는 래트)에서 유래된 단클론 항체이고, 여기서 단클론 항체는 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 단클론 항체를 제조하는 데에 다양한 방법론이 이용가능하다. 일반적으로, 단클론 항체는 임의의 진핵세포, 원핵세포 또는 파지 클론을 비롯하여 단일 클론으로부터 수득 또는 유래된다. 일부 구체예에서, (예, 키메라 또는 인간화 항체에서와 같이) 인간외 항체 원천으로부터 유래되지 않은 부분 이외의 인간외 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체는 (a) 결합을 위해 경쟁을 할 수 있고; (b) 기능적 특징을 유지하고; (c) 동일 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 상응한 인간외 모 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다.
일부 측면에서, 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 단클론 항체를 제공한다. 인간 항체는 완전 인간 아미노산 서열, 예컨대 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간외 항체인 항체는 인간외 아미노산 잔기를 인간 항체에 존재하는 아미노산 잔기로 치환함으로써 완전 인간을 제조할 수 있다. 인간 항체는, 이에 따라, 하나 이상의 인간 또는 인간외 아미노산 잔기가 임의의 다른 인간 항체에 존재하는 하나 이상의 아미노산으로 치환된 항체를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간외 동물로부터 수득한 항체는 인간화될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는, CDR에 측접하는 아미노산 잔기인, Fv 골격 영역(FR) 내 억셉터 면역글로불린 분자 및 하나 이상의 인간 아미노산 잔기에서 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에서의 인간외 아미노산 잔기, 예컨대 마우스, 래트, 염소, 토끼를 갖는다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 인간외 항체로부터의 적절한 CDR 분절을 인간 항체 스캐폴드에 삽입함으로써 생성되되, 인간화된 항체는 면역 체크포인트 억제제에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 인간화된 단클론 항체는 제2 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 도메인을 대체하는 데 사용되는 제1 인간외 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 항체는 인간외 동물로부터 수득되고, 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 제1 항체로부터의 CDR 도메인은 제2 인간 항체의 CDR 도메인으로 대체되고, 여기서 제2 인간 항체는 면역 체크포인트 단백질에 대한 결합 특이성이 결핍된다. 이러한 과정은, 제1 항체로부터의 CDR 도메인의 첨가로 인해 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 잔여 항체 도메인이 인간 항체로부터 유래되기 때문에 면역계에 의해 외래물로 인식되지 않는 인간화된 단클론 항체를 생성한다. 일부 구체예에서, 제1 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 도메인을 포함하는 인간화된 항체는 (a) 결합을 위해 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특징을 유지하고; (c) 동일 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 상응한 제1 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다.
저산소증-활성화 생환원제, 저산소증 유도제 및 면역 체크포인트 억제제는 임의의 적당한 투여 경로에 의해 피험자에게 투여를 위한 약학 조성물로서 조제될 수 있다. 투여 경로의 예는, 비제한적으로 비경구(피하, 정맥내, 동맥내, 골수내, 대뇌내, 뇌실내, 척추강내, 척수내, 관절내, 근육내 또는 복강내 주사 포함), 직장, 국부, 경피 또는 경구(예, 캡슐, 현탁제 또는 정제)를 포함한다. 약학 조성물은 일반적으로 약학 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달에 맞는 하나 이상의 활성제, 및 비제한적으로 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀션(예, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 분산 및 현탁 매질, 코팅제, 등장제 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예, 보존제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
공용매의 비제한적 예는 히드록실 기 또는 다른 극성 기, 예컨대 알콜, 예컨대 이소프로필 알콜; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다. 공용매의 비제한적 예는 히드록실 기 또는 다른 극성 기, 예컨대 알콜, 예컨대 이소프로필 알콜; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다.
보충 화합물(예, 보존제, 산화방지제, 살생물제 및 바이오스타트(biostat), 예컨대 항균제, 항바이러스제 및 항진균제를 포함한 항미생물제)은 또한 조성물에 포함될 수도 있다. 약학 조성물은 따라서 보존제, 산화방지제 및 항미생물제를 포함할 수 있다. 보존제는 미생물 성장을 억제하거나 구성성분의 안정성을 증가시켜 약학 제제의 저장 수명을 연장시키는 데 사용될 수 있다. 적당한 보존제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면 EDTA, EGTA, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤조산 또는 벤조에이트, 예컨대 나트륨 벤조에이트를 포함한다. 산화방지제는, 예를 들면 아스코르브산, 비타민 A, 비타민 E, 토코페롤, 및 유사 비타민 또는 프로비타민을 포함한다. 항미생물제 또는 항미생물 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 병원성 또는 비-병원성 미생물 유기체의 성장, 전염력, 복제, 증식, 생식에 의한 오염을 억제, 감소, 지연, 중단, 제거, 정지, 진압 또는 방지한다. 항미생물제의 부류는 항균성, 항바이러스성, 항진균성 및 항기생충성을 포함한다. 항미생물제는 미생물 유기체의 성장, 전염력, 복제, 증식, 생식에 의한 오염을 사멸 또는 파괴(죽이는 힘이 있는) 또는 억제(정지 상태의)하는 약제 및 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 치료 단계 중 하나 이상은 반복될 수 있다. 예를 들면, HABA의 투여 단계, 저산소증의 유도 단계 및 면역 체크포인트 억제제의 투여 단계는 치료 과정에 걸쳐 1회 이상 함께 반복될 수 있다. 일부 구체예에서, 한 단계는 나머지 단계의 부재 하에 반복된다. 예를 들면, HABA 투여 및 저산소증 유도 후, 면역 체크포인트 억제제는 치료 과정에 걸쳐 투약 스케줄에 따라 2회 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료 과정에 걸쳐 투약 스케줄에 따라 HABA 투여 및 저산소증 유도 후 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20회 이상 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료 과정에 걸쳐 투약 스케줄에 따라 HABA 투여 및 저산소증 유도 전에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20회 이상 투여된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 치료 과정에 걸쳐 투약 스케줄에 따라 HABA 투여 및 저산소증 유도 1시간, 1일, 1주 또는 1개월 후에 투여된다.
일부 구체예에서, 본 개시내용의 방법, 조성물 및 키트는 피험자의 증식성 질환, 특히 하나 이상의 고형 종양을 포함하는 것의 치료에 유용하다. 증식성 질환의 예는, 비제한적으로 극세포종, 세엽세포암종, 청신경초종, 말단흑자흑색종, 선단한선종, 급성 호산구성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 거핵모구 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 성숙에 따른 급성 골수모구 백혈병, 급성 골수성수상세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구 백혈병, 에나멜상피종, 선암종, 선낭암종, 선종, 샘종모양치원성종양, 부신피질암종, 성인 T 세포 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 봉와성연부육종, 사기질모세포섬유종, 항문암, 역형성 큰 세포 림프종, 역형성 갑상선암, 혈관면역모구 T 세포 림프종, 혈관근육지방종, 혈관육종, 충수암, 성상세포종, 비정형 유기형 간상 종양, 기저 세포 암종, 기저 유사 암종, B 세포 백혈병, B 세포 림프종, 벨리니관 암종, 담도암, 방광암, 모세포종, 골암, 골 종양, 뇌줄기 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 브레너 종양, 기관지내 종양, 기관지폐포암종, 브라운 종양, 버킷 림프종, 원발부위 불명암, 카르시노이드 종양, 암종, 상피내 암종, 음경 암종, 원발부위 불명암종, 암육종, 캐슬만병, 중추신경계 배아성 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종, 자궁경부암, 담관암종, 연골종, 연골육종, 척색종, 융모막암종, 맥락총 유두종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 단핵구백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 만성 호중성 백혈병, 투명 세포 종양, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T 세포 림프종, 디고스병, 융기성 피부섬유육종, 피부모양기형낭종, 결체조직 작은원형세포 종양, 미만성 큰 B 세포 림프종, 배야이형성 신경상피 종양, 배아성 암종, 내배엽굴 종양, 자궁내막암, 자궁내막 자궁암, 자궁내막유사 종양, 장질환 관련 T 세포 림프종, 뇌실막모세포종, 상의세포종, 상피모양육종, 적백혈병, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 패밀리 종양, 유잉 패밀리 육종, 유잉 육종, 두개외 배아 세포 종양, 성선외 배아 세포 종양, 간외담관암, 유방외 파제트병, 나팔관암, 태아 내 태아, 섬유종, 섬유육종, 여포성 림프종, 여포성 갑상선암, 쓸개 암, 쓸개암, 신경절교종, 신경절신경종, 위암, 위림프종, 소화관암, 소화관 카르시노이드 종양, 소화관 기질 종양, 소화관 기질 종양, 배아 세포 종양, 배아세포종, 임신성 융모막암종, 임신성 영양막 종양, 골 거대 세포 종양, 다형성 교모세포종, 신경교종, 대뇌신경교종, 글로무스 종양, 글루카곤종, 생식샘모세포종, 과립막세포 종양, 모발 세포 백혈병, 모발세포 백혈병, 두경부암, 두경부 암, 심장암, 혈관모세포종, 혈관주위세포종, 혈관내피육종, 혈액학적 악성종양, 간세포 암종, 간비장 T 세포 림프종, 유전성 유방-난소암 증후군, 호지킨림프종, 호지킨 림프종, 하인두암, 시상하부교종, 염증성 유방암, 안내 흑색종, 섬세포 암종, 섬세포 종양, 연소성 골수단핵구백혈병, 카포시육종, 카포시 육종, 신장암, 간문낵담관 종양, 크루켄버그 종양, 후두 암, 후두암, 악성흑점자흑색종, 백혈병, 백혈병, 구순구강암, 지방육종, 폐암, 황체종, 림프관종, 림프관혈관육종, 림프상피종, 림프관 백혈병, 림프종, 매크로글로불린혈증, 악성 섬유조직 구종, 악성섬유조직구종, 골 악성 섬유조직 구종, 악성 뇌교종, 악성 가슴막중피종, 악성 말초신경 시스 종양, 악성 간상 종양, 악성 트리톤 종양, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 비만 세포 백혈병, 종격 배아 세포 종양, 종격동 종양, 수질 갑상선암, 수모세포종, 수모세포종, 속질상피종, 흑색종, 흑색종, 뇌수막종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 중피종, 잠복 원발성 전이성 편평 폭 암, 전이성 요로상피세포암종, 전이성 결장직장암, 혼합 뮬레 종양, 단핵구백혈병, 구강암, 뮤신성 종양, 다발성 내분비 샘종양 증후군, 다발성 골수종, 다발성골수종, 균상식 육종, 균상식육종, 골수이형성 질병, 골수이형성이상 증후군, 골수성백혈병, 골수성 육종, 골수증식성 질환, 점액종, 비강암, 비인두암, 비인두 암종, 신생물, 신경근종, 신경모세포종, 신경모세포종, 신경섬유종, 신경종, 결정성 흑색종, 비호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 비흑색종 피부암, 소세포 폐암, 안구 종양학, 희소성상세포종, 희소돌기아교세포종, 호산과립세포종, 시신경 시스 수막종, 구강 암, 구강암, 구인두암, 골육종, 골육종, 난소암, 난소암, 난소 상피암, 난소 배아 세포 종양, 난소 저악성 잠재 종양, 유방 파제트병, 판코스트 종양, 췌장암, 췌장암, 유두갑상선암, 유두종증, 곁신경절종, 부비동암, 부갑상선암, 음경종암, 혈관주위 유상피세포 종양, 인두암, 갈색세포종, 중간 분화 송과체 종양, 송과체모세포종, 과립세포종, 뇌하수체 선종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물, 흉막폐모세포종, 다배아종, 전구체 T-림프모구 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출 림프종, 원발성 간세포 암, 원발성 간암, 원발성 복막암, 원시신경외배엽 종양, 전립샘암, 복막가점액종, 직장암, 직장암 암종, 염색체 15 상 NUT 유전자 연루 기도 암종, 망막모세포종, 횡문근종, 횡문근육종, 릭터 형질전환, 천미부기형종, 침샘암, 육종, 신경초종증, 피지선 암종, 이차 신생물, 정상피종, 장액성 종양, 세르톨리-라이디 세포 종양, 성기삭-기질 종양, 시자리 증후군, 인환 세포 암종, 피부암, 작은 청색 원형 세포 종양, 소세포 암종, 소세포 폐암, 소세포 림프종, 작은 창자암, 연조직 육종, 소마토스틴종, 매연성 사마귀, 척수 종양, 척추 종양, 비장변연 림프종, 편평세포 암종, 위암, 표재 확장성 흑색종, 천막상 원시신경외배엽 종양, 표면 상피-기질 종양, 활막육종, T 세포 급성 림프모구백혈병, T 세포 큰 과립 림프구 백혈병, T 세포 백혈병, T 세포 림프종, T 세포 전림프구 백혈병, 테라토마, 말단 림프암, 고환암, 협막세포종, 인후암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 이행 세포 암종, 요막관암, 요도암, 비뇨생식기 신생물, 자궁 육종, 포도막 흑색종, 질암, 베르너 모리슨 증후군, 사마귀모양 암종, 시각 경로 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 와르틴 종양, 윌름즈 종양, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 고형 종양이 치료된다. 고형 종양의 예는, 비제한적으로 폐암, 유방암, 결장직장암, 방광암, 두경부암, 난소암 및 췌장암을 포함한다. 일부 구체예에서, HABA의 투여, 저산소증 유도, 및 면역 체크포인트 억제제의 투여의 조합은 피험자에서 증식성 질환을 치료하는 데에 상승 효과를 나타낸다.
특히 암 치료의 효능은 임의의 적당한 측정기준에 의해 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 효능은 증식성 질환, 예컨대 암을 치료하는 효과를 기초로 측정된다. 일반적으로, 증식성 질환(예, 암, 양성 또는 악성 여부)의 치료와 관련하여 본 발명의 방법 및 조성물의 치료 효능은, 인간이 증식성 질환에 대해 치료되도록 방법 및 조성물이 종양 세포 증식 억제, 종양 혈관형성 억제, 종양 세포 근절, 및/또는 적어도 하나의 종양 크기의 감소를 촉진하는 정도에 의해 측정될 수 있다. 치료 효능의 결정에 있어 고려되는 여러가지 파라미터가 본원에서 논의된다. 특정 상황에 대한 파라미터의 적절한 조합은 임상의에 의해 달성될 수 있다. 암 치료(예, 종양 크기 감소 또는 암성 세포 근절)에 있어 본 발명의 방법의 진전은 임의의 적당한 방법, 예컨대 종양 크기 및 암 진행을 추적하는데 임상에서 최근 사용되는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 암 치료를 평가하는 데 사용되는 주요 효능 파라미터는 바람직하게는 종양 크기의 감소이다. 종양 크기는 임의의 적당한 기법, 예컨대 치수 측정, 또는 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 종양 부피의 정확한 판단이 가능한 웨이크 포레스트 유니버시티에서 개발된 프리플라이트 소프트웨어를 사용한 종양 부피 판단을 이용하여 결정될 수 있다. 종양 크기는, 예컨대 CT, 초음파, SPECT, 나선형 CT, MRI, 사진 등을 사용하여 종양 시각화에 의해 결정될 수 있다. 치료 주기의 완료 후 종양이 외과적으로 절제되는 구체예에서, 종양 조직 및 종양 크기의 존재는 절제하고자 하는 조직의 전체 분석에 의해, 및/또는 절제된 조직의 병리학적 분석에 의해 결정될 수 있다.
바람직하게도, 종양의 성장은 치료의 결과로서 안정화된다(즉, 하나 이상의 종양의 크기가 1%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이상 증가하지 않고/않거나 전이되지 않는다). 일부 구체예에서, 종양은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 또는 그 이상 동안 안정화된다. 일부 구체예에서, 종양은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상 동안 안정화된다. 일부 구체예에서, 종양은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상 동안 안정화된다. 바람직하게는, 종양의 크기는 적어도 약 5%(예, 적어도 약 10%, 15%, 20% 또는 25%) 감소된다. 더욱 바람직하게는, 종양 크기는 적어도 약 30%(예, 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%) 감소된다. 더욱 더 바람직하게는, 종양 크기는 적어도 약 70%(예, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%) 감소된다. 가장 바람직하게는, 종양은 완전히 제거되거나, 또는 검출 수준 미만으로 감소된다. 일부 구체예에서, 피험자는 치료 후 (예, 차도 중) 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 또는 그 이상 동안 종양이 없는 상태이다. 일부 구체예에서, 피험자는 치료 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상 동안 종양이 없는 상태이다. 일부 구체예에서, 피험자는 치료 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 이상 동안 종양이 없는 상태이다.
종양에 치료 주기 완료 후 외과적 절제를 실시하는 경우, 종양 크기 감소에 있어 본 발명의 효능은 괴사성(즉, 사멸)인 절제 조직의 비율을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 치료는 절제된 조직의 괴사 비율이 약 20% 이상(예, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%), 더욱 바람직하게는 약 90% 이상(예, 약 90%, 95% 또는 100%)인 경우 치료적으로 효과적이다. 가장 바람직하게는, 절제된 조직의 괴사 비율이 약 100%인 것이고, 즉 종양 조직이 존재하지 않거나 검출되지 않는 것이다.
다수의 이차 파라미터는 본 발명의 방법의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이차 파라미터의 예는, 비제한적으로 신규 종양의 검출, 종양 항원 또는 마커(예, CEA, PSA 또는 CA-125)의 검출, 생검, 외과적 다운스테이징(즉, 절제불가능에서 절제가능한 종양으로의 수술 단계의 전환), PET 스캔, 생존, 질병 진행 불포함 생존, 질병 진행까지의 시간, 삶의 질 평가, 예컨대 임상 이득 반응 평가 등을 포함하고, 이의 전부는 인간에서 암의 전반적 진행 (또는 회귀)로 점수를 매길 수 있다. 생검은 조직 내 암성 세포의 근절을 검출하는 데 특히 유용하다. 방사능면역검출(RAID)은 종양에 의해 생성되고/되거나 종양과 관련된 마커(항원)("종양 마커" 또는 "종양 연관 항원")의 혈청 수준을 사용하여 종양을 위치하게 하는데 사용되고, 사전치료 진단 예측, 재발의 치료후 진단 지표, 및 치료 효능의 치료후 지표로서 유용할 수 있다. 치료 효능의 지표로서 평가될 수 있는 종양 마커 또는 종양 연관 항원의 예는, 비제한적으로 암배아 항원(CEA) 전립샘-특이적 항원(PSA), CA-125, CA19-9, 강글리오시드 분자(예, GM2, GD2 및 GD3), MART-1, 열 충격 단백질(예, gp96), 시알릴 Tn(STn), 티로시나아제, MUC-1, HER-2/neu, c-erb-B2, KSA, PSMA, p53, RAS, EGF-R, VEGF, MAGE 및 gp100을 포함한다. 다른 종양 연관 항원이 당업계에 공지되어 있다. 내시경 검출 시스템과 조합된 RAID 기술은 또한 주변 조직으로부터 작은 종양을 효과적으로 별한다(예, 미국 특허 번호 4,932,412 참조).
일부 구체예에서, 인간 환자의 암 치료는 하기 결과 중 하나 이상에 의해 입증된다: (a) 종양의 완전한 소멸(즉, 완전 반응), (b) 치료 전 종양 크기와 비교하여 치료 주기의 완료 후 적어도 4주 동안 종양 크기의 약 25% 내지 약 50% 감소, (c) 치료 주기 전 종양 크기와 비교하여 치료 주기 완료 후 적어도 4주 동안 종양 크기의 적어도 약 50% 감소, 및 (d) 치료 주기 전 종양 연관 항원 수준과 비교하여 치료 주기 완료 후 약 4-12주에 특이적 종양 연관 항원 수준에 있어서의 적어도 2% 감소(예, 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소). 종양 연관 항원 수준에 있어서 적어도 2%의 감소가 바람직하지만, 종양 연관 항원 수준의 임의의 감소는 환자의 암 치료의 증거이다. 예를 들면, 절제불가능한, 국소 진척된 췌장암과 관련하여, 치료 주기 전 CA19-9 수준과 비교하여 치료 주기 완료 후 4-12주에 CA19-9 종양 연관 항원 수준에 있어 적어도 10%의 감소에 의해 치료가 입증될 수 있다. 유사하게, 국소 진척된 직장암과 관련하여, 치료 주기 전 CEA 수준과 비교하여 치료 주기 완료 후 4-12주에 CEA 종양 연관 항원 수준에 있어 적어도 10%의 감소에 의해 치료가 입증될 수 있다.
삶의 질 평가, 예컨대 임상 이득 반응 기준과 관련하여, 본 발명에 따른 치료의 치료 이득은 통증 강도, 진통 소모, 및/또는 카노프스키 수행 척도 점수의 측면에서 입증될 수 있다. 카노프스키 수행 척도는 환자의 기능 장애에 따라 분류될 수 있다. 카노프스키 수행 척도의 점수는 0-100이다. 일반적으로, 낮은 카노프스키 점수는 생존에 안좋은 예후를 예측한다. 따라서, 인간 환자의 암 치료는 대안적으로 또는 추가적으로 (a) 예를 들어 치료 전 환자에 의해 보고된 통증 강도와 비교하여 치료 완료 후 12주에서 임의의 연속 4주의 기간 동안 환자에 의해 보고된 통증 강도의 적어도 50% 감소(예, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소), (b) 예를 들어 치료 전 환자에 의해 보고된 진통 소모와 비교하여 치료 완료 후 12주에서 임의의 연속 4주 기간 동안 환자에 의해 보고된 진통 소모에 있어서 적어도 50% 감소(예, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소), 및/또는 (c) 예를 들어 치료 기간 전 환자에 의해 보고된 카노프스키 수행 척도 점수와 비교하여 치료 주기 완료 후 12주에서 임의의 연속 4주 기간 동안 환자에 의해 보고된 카노프스키 수행 척도 점수에 있어서 적어도 20점 증가(예, 적어도 30점, 50점, 70점 또는 90점 증가)에 의해 입증된다.
참조 테스트 및/또는 다른 테스트의 대안적 또는 추가적 결과가 치료 효능을 입증할 수 있지만 인간 환자에서 증식성 질환(예, 암, 양성 또는 악성 여부)의 치료는 바람직하게는 상기 결과 중 하나 이상(임의의 조합)에 의해 증명된다.
일부 구체예에서, 종양 크기는 바람직하게는 피험자에서 유의적 이상 반응(adverse event) 없이 감소된다. 이상 반응은 국립 암 연구소(NCI)의 암 치료 평가 프로그램(CTEP)에 의해 분류되거나 "등급이 매겨지며", 등급 0은 최소의 부작용 효과를 나타내고 등급 4는 가장 극심한 이상 반응을 나타낸다. NCI 독성 척도(1999년 4월 발행) 및 일반 독성 기준 메뉴얼(1999년 8월 업데이트)은 www.ctep.info.nih.gov의 NCI 인터넷 웹사이트와 같은 NCI를 통해 또는 암 치료 및 진단 부문, NCI(1998년 3월 업데이트)에 의해 후원된 연구 요원의 임상 실험 참가자를 위한 연구원 핸드북에서 이용가능하다. 바람직하게도, 본원에 기술된 방법은 CTEP/NCI에 의해 등급화된 바와 같이 최소의 이상 반응, 예컨대 등급 0, 등급 1 또는 등급 2의 이상 반응과 연관된다. 하지만, 종양 크기 감소는, 바람직하다 하더라도, 종양 세포의 근절(예, 괴사)에도 불구하고 종양의 실제 크기가 수축될 수 없다는 점에서 요구되지 않는다. 암성 세포의 근절은 치료 효과를 실현하기에 충분하다. 마찬가지로, 종양 크기의 임의의 감소는 치료 효과를 실현하기에 충분하다.
인간에서 다양한 암의 검출, 모니터링 및 평점화는 문헌[Cancer Facts and Figures 2001, American Cancer Society, New York, N.Y.], 및 국제 특허 출원 WO 01/24684에 더 기술되어 있다. 따라서, 임상의는 표준 테스트를 사용하여 암을 치료하는 본 발명의 방법의 다양한 구체예의 효능을 결정할 수 있다. 하지만, 종양 크기 및 전개 이외에, 임상의는 또한 치료의 효능을 평가함에 있어 환자의 생존 및 삶의 질을 고려할 수 있다.
일부 구체예에서, HABA의 투여, 저산소증 유도, 및 면역 체크포인트 억제제의 투여는, 단독 약제에 의한 치료, 동시에 전달된 두 약제에 의한 치료, 및/또는 역순으로 두 약제에 의한 치료에 대하여 향산된 치료 효능을 제공한다. 향상된 효능은 비제한적으로 본원에 기술된 방법을 포함한 임의의 적당한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 향상된 치료 효능은, 적절한 척도(예, 종양 크기 감소, 종양 크기 안정화 지속, 전이성 사건이 없는 기간의 지속, 질병 없는 생존의 지속)를 사용한, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 1000%, 10000% 또는 그 이상의 향상이다. 향상된 효능은 또한 적절한 척도(예, 종양 크기 감소, 종양 크기 안정화 지속, 전이성 사건이 없는 기간의 지속, 질병 없는 생존의 지속)를 사용한 배수 향상, 예컨대 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 1000배, 10000배, 또는 그 이상으로 표시될 수도 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 용도에 따라 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 키트를 제공한다. 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA); (b) 저산소증 유도제 또는 색전제; 및 (c) 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. HABA, 저산소증 유도제, 색전제 및 면역 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 예를 들어 본 개시내용의 다양한 방법과 관련하여 상기 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 임상의, 건강관리 제공자 또는 환자에 의해 사용되는 설명서, 예컨대 인쇄물 또는 포장물을 추가로 포함한다. 키트내 약학 조성물 및 다른 물질은 임의의 적당한 용기에 함유될 수 있고, 즉시 사용가능한 형태이거나 키트 내 다른 시약 또는 사용자에 의해 공급되는 시약과의 조합이 필요할 수 있다(예, 농축 조성물의 희석 또는 동결건조된 조성물의 재구성).
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 예시하기 위한 목적으로 제시되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 제한을 의미하지 않는다. 본원에 기술된 방법과 함께 본 발명의 실시예는 바람직한 구체예의 현재 대표예이고, 예시이며, 본 발명의 범위의 제한으로서 의도한 것이 아니다. 청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 취지 내에서 포괄되는 본원의 변경 및 다른 용도가 당업자에게 자명하다.
실시예 1. 간세포 암종 모델에서 티라파자민 및 간동맥 결찰의 조합.
재료 및 방법: 모든 HBx 트랜스제닉 마우스를 특정 병원체 불포함 시설에서 기르고 추적조사하였다; 이어서 3주령에 이유기 상의 유전자형 과정을 위해 개별 마우스의 꼬리를 수집하였다. 17-18개월령에 수컷 HBx 트랜스제닉 마우스의 > 95%에서 간세포 암종(HCC)이 자발적으로 발생하였다. 종양 직경 0.5-2 cm인 트랜스제닉 마우스를 연구에 사용하였다.
티라파자민 및 간동맥 결찰에 의한 종양 보유 HBx 마우스의 처리: HBx 트랜스제닉 마우스에 40분 동안 좌간동맥 결찰을 실시한 후 실크 결찰을 풀었다. 약물 효과에 대한 연구 동안, 0.9% 식염수, 독소루비신(10 mg/kg), 또는 TPZ(3 mg/kg)를, 간동맥 결찰 전 7분 동안 각각의 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 주사 완료 후, 중선 개복술을 실시하여 간 및 간문 좌엽을 노출시켜 일시적 결찰을 위해 좌측 또는 공통 간동맥을 해부하였다. 실험 동안 400 mg/kg 아베르틴(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 복강내 주사로 마취시켰다. 첫 주 내에 ARKRAY 스포트켐 EZ 화학 분석기 SP-4430(Arkray, Inc., 일본 교토 소재)를 사용하여 ALT 및 전체 빌리루빈을 평가하기 위한 일련의 혈청 샘플을 수집하였다. 1일 또는 7일 후, HE 염색을 위해 간 조직을 수집하였다.
종양 괴사의 조직학 및 형태 분석: 각 마우스에 대해, 전체 종양 및 인접 비종양성 영역을 함유한 간 조직을 10% 포름알데히드 중에 밤새 고정시키고 파라핀에 내포시켰다. 전체 종양을 가로지르는 간 조직 절편(3 μm 두께)에 조직학적 분석을 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 실시하였다. ImageJ 소프트웨어(버전 1.46r, 미국 국립보건원, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 사용하여 전체 종양을 커버하는 5개의 횡단면에서 전체 종양 영역에 의해 괴사성 영역을 나누어 각 종양의 괴사 비율을 정량하였다. 상세한 결과는 하기 더 논의된다.
실시예 2: 폐암 모델에서 티라파자민 및 콤브레타스타틴 A4 및 DMXAA의 조합.
재료 및 방법: ATCC에서 인간 폐암 NCI-H460 세포를 구매하고 연구에 사용하였다. 마우스에 접종 전 5 계대 내에서 세포를 계대배양하였다. 동물의 순응 기간 후, 200 μL의 혈청 불포함 배지/매트리겔(50:50 v/v) 중 대략 1.5 × 106 NCI-H460 세포를, 3 - 4% 이소플루란에 의한 마취 하에 각 마우스에 피하 주사하였다. 약 4-5주령 및 체중 18-20 g인 수컷 BALB/c 누드 마우스를 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.(중국 소재)에서 구매하고 처리 군에 의해 케이지당 3-5마리의 마우스로 사육장에서 사육하였다. 마우스는 사료(조사됨, Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. 중국 소재) 및 물(Mol Ultrapure Water System에 의해 여과된 자체 수돗물)이 자유롭게 허용되었다.
각 군의 마우스를 CO2 질식으로 안락사 후 제1 투여 후 18일째에 자궁경부 탈구를 시키고, 종양을 수집하고, 칭량하고, 이의 사진을 취하였다. 포르말린 고정 종양을 조직병리학 작업에 사용하였다. 포르말린 고정 후, 종양을 파라핀 내포시켜 FFPE 블록을 얻었다. 하나의 마우스에서 각 종양 덩어리에 대한 하나의 블록을 만들었다. FFPE 블록을 약 4 μm 두께로 절편화하고, H&E 염색, 조직병리학적 조사, 및 종양 괴사 정량화에 대해 처리하였다. 자세한 결과는 하기 더 논의된다.
실시예 3: 종양 괴사 유도 및 종양의 생체내 암 백신으로의 전환.
종양 이종성 및 유전자 불안정성의 문제를 해결하기 위해, 이상적인 암 백신은 각 환자의 자가 종양이다. 하지만, 종양 그 자체는 통상 매우 면역성이 아니고, 항-종양 면역성의 정도는 일반적으로 면역 체크포인트 억제제 단독의 존재 하에서도 충분하지 않다. 면역 반응은, T 세포에 대한 종양 연관 항원의 제시를 유도하고 종양-특이적 T 세포의 집단을 증가시키는 강한 염증 반응과 연관되는 종양 괴사를 유도함으로써 증진될 수 있다. 종양 괴사 유도의 한가지 접근법은, 예를 들어 정상 간에 대한 유의적 손상 없이 종양-공급 간동맥을 색전시킬 수 있는 간문맥 및 간동맥으로부터 이중으로 혈액 공급되는 기관인 간 내 암에 적용 가능하다. 종양 괴사를 유도하는 전략은 티라파자민, 저산소증 활성화제, 및 티라파자민을 활성화시켜 종양 괴사를 유도하는 종양 저산소증을 생성하는 간암 색전술(TAE)의 조합이다. 조합의 효능은 HBx 트랜스제닉 마우스 모델에서 확인되었다.
연구에 사용된 동물 모델은 HBx, 즉 종양 내에 간 세포 형질전환을 유도할 수 있는 것으로 확인된 간염 B 바이러스의 종양유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스이다. HBx 트랜스제닉 마우스는 대략 18개월령에 자발적으로 간세포 암종을 발생시킨다. 종양 병소는 기선 종양 괴사를 갖지 않지만, 티라파자민 및 간동맥 결찰(HAL)의 조합에 의해 유도된 종양 괴사의 정도의 조사에 사용하기에 유용하다. 일시적 HAL과 조합된 HBx 트랜스제닉 마우스 모델에서 티라파자민의 효과적인 용량은 첫 적정 연구에서 3 mg/kg으로 확립되었다. 다음으로, HAL과 조합된 티라파자민의 효능을 조사하고 TACE에서 흔히 사용되는 화학요법제, 독소루비신과 비교하였다. 소형 군을 우선 테스트하여 식염수(n=1), 독소루비신(10 mg/kg, n=1) 및 티라파자민(3 mg/kg, n=1)의 효과를 비교함으로써 일시적 좌측 HAL과 함께 감지가능한 HCC를 가진 HBx 트랜스제닉 마우스를 처리하였다. 티라파자민 및 일시적 좌측 HAL로 처리한지 1일 후에 마우스를 희생시켰다. ALT 수준은 독소루비신 처리된 마우스보다 티라파자민 처리된 마우스에서 훨씬 더 높은 상승이 있었다. 처리후 1일째 조직병리학적 조사는 독소루비신 처리된 HCC에서 단지 약 5% 괴사만 있었던 반면 티라파자민은 HAL 영역 내 HCC에서 99% 이상의 괴사를 유도한 것을 나타내었다. 이러한 결과는 HAL과 함께 조합하여 종양 괴사를 유도하였을 때 독소루비신보다 티라파자민이 훨씬 더 효과적이었음을 나타내었다.
동일 연구를 수행하여 처리후 7일째에 조직병리학적 변화를 조사하였다. 각 군에 대해 사용된 마우스의 숫자는 식염수(n=2), 독소루비신(10 mg/kg, n=2) 및 티라파자민(3 mg/kg, n=3)이었다. 종양 혈류를 oxyFlo 센서로 모니터링하고, 종양 저산소증을 유도하기에 충분한 티라파자민 또는 독소루비신으로 처리된 HCC에 대해 HAL에 의해 30%로 혈류가 떨어졌음을 확인하였다.
마우스 체중의 분석은 통계학적으로 유의적 변화는 보여주지 못했지만, 독소루비신 처리된 마우스에서의 평균 체중은 약간 낮아진 것으로 보였다(도 2a). 혈청 내 전체 빌리루빈의 수준은 7일에 걸쳐 3개 군 중에서 모두 정상 범위 내에 있었다(도 2b). 혈청 ALT 수준은 티라파자민 및 일시적 좌측 HAL이 처리된 군에서 1일째에 피크에 도달하였다(도 2c). 이어서, ALT 수준은 감소하였고 대략 3일째에 정상으로 돌아왔다. 독소루비신 및 일시적 HAL은 또한 1일째에 ALT 상승 및 티라파자민 및 좌측 HAL 하락을 유도하고, 양 군에서 ALT는 2일까지 정상 수준으로 회복하였다. 7일째 절제 동안, 티라파자민 및 일시적 HAL 처리된 HCC에서 창백한 색상에 의해 종양 괴사가 일어나지만, 식염수 또는 독소루비신이 처리된 마우스로부터의 HCC에서는 그렇지 않다는 것이 분명하였다(도 2d). H&E 염색에 의한 조직병리학적 분석은 좌측 HAL의 영역에서 HCC가 티라파자민 및 좌측 HAL의 조합 처리 후 90-99% 괴사를 가졌음을 확인하였다. 좌측 HAL과 조합되어 식염수 또는 독소루비신이 처리된 HCC에서는 병리학적 변화가 거의 관찰되지 않거나 관찰되지 않았다(도 2e). 이러한 마우스가 복수의 HCC를 종종 가졌기 때문에, 내부 대조군으로 작용하는 우엽에 존재하는 종양 결절이 존재하였다. 어떤 동물에서도 우엽에 종양 괴사가 일어나지 않았다. 간 우엽의 종양 불포함 부분에서, 괴사의 증거는 명확하지 않았고, 이는 티라파자민 및 좌측 HAL의 조합이 7일째까지 정상 간의 동일한 엽에서 유의적인 손상을 일으키지 않았다는 것을 가리킨다. ALT의 상승에 의해 제시되는 바와 같이 1일째에 일시적 손상이 있었을지라도, 7일째에는 완전히 회복되었다.
연구 결과는 종양 괴사 유도에 있어 티라파자민 및 TAE의 조합이 TAE 단독 또는 독소루비신과 TAE의 조합보다 우수하다는 것을 나타낸다. 독소루비신은 중간 단계 HCC의 처리를 위해 TACE(경동맥 화학색전술)의 화학요법 성분으로서 현재 사용된다. 상기 기술된 데이타는 HCC에 대한 면역성을 촉발시키기 위해 최대 종양 괴사를 실현하는 것은 독소루비신에 의한 TACE보다 TAE와 함께 티라파자민을 사용하는 것이 더 우수하다는 것을 나타낸다.
이후 동일 모델은, 처리 후 종양 괴사 정도, 및 이 접근법에 의해 유도된 종양 괴사가, 항원 제시 세포로서 작용하는 대식세포/수지상 세포에 의해 괴사성 잔사물의 식균작용을 용이하게 하는 유의적인 염증 반응과 관련되었는지 여부를 조사하는 데 사용되었다. 더 높은 배율로(도 3), 종양 괴사의 비율은 티라파자민 및 HAL로 처리한 후 종양 괴사의 전체 비율을 평가하기 위해 여러 조각의 조직 절편을 조립함으로써 결정되었다. 전체 종양의 99% 이상이 괴사성이 된 것을 관찰하였다.괴사성 종양의 주변 영역을 세밀하게 조사하여 염증 세포 침윤을 조사하였다. 도 3의 삽입부는, 괴사성 종양의 주변 영역이 매우 강한 염증성 침윤을 가지며, 괴사가 염증 반응을 촉발한다는 이론과 일치한다는 것을 보여준다.
실시예 4: 티라파자민 및 경동맥 색전술(TAE)의 조합을 사용하는 색전술에 적합한 간세포 암종을 가진 환자에서의 종양 괴사 유도.
인간에서 TAE와 조합된 티라파자민의 임상 내약성 및 효능을 테스트하기 위해, I단계 용량 규정 연구가 US 주요 의료 센터에서 개시되어 내약성, 예비 효능을 조사하고 TAE와 조합되었을 때의 티라파자민의 권장 2단계 용량(RP2D)을 결정하였다. 등록된 HCC 환자는 차일드-퍼(Child-Pugh) 클래스 A이고, 외과수술 후보가 아니며 10 cm보다 큰 종양 크기 병소를 갖지 않은 최대 4개의 종양 병소를 갖고 색전술에 적당하였다. 첫 12명의 평가가능한 환자의 결과가 분석에 이용가능하였다.
첫 두 코호트에, 티라파자민을 5 및 10 mg/m2로 전신 IV 주입에 의해 투여하였고, 이는 250-330 mg/m2의 3단계 연구 이전에 사용되는 용량보다 유의적으로 적었다. 용량은, 티라파자민 및 좌간동맥 결찰의 마우스 연구로부터 추정된 독성 용량의 1/10의 등가물, 및 동물 모델 연구(실시예 1)에서 입증된 유효한 결과를 기초로 선택하였다. 3명의 환자가 코호트로 등록되었다. 모두에서 독성 또는 독성 제한 용량(DLT)이 관찰되지 않아 처리가 용인되었다. 이어서, IA 투여에 잘 용인된 프로파일을 기초로 간동맥을 통해 동맥내(IA)로 투여 경로를 바꾼 후 래트 독물학 연구에서 간동맥을 결찰시켰다. IA 경로의 출발 임상 용량은 5 mg/m2이며, 용인된 것으로 확인된 IV 용량의 50%이다. 이후 코호트에서 3명의 환자에 IA 코호트의 용량을 10 mg/m2로 상향 적정하였다. 모든 환자에서 독성 또는 독성 제한 용량(DLT)이 관찰되지 않아 처리가 용인되었다.
첫 12명의 환자의 예비 효능을 분석하고 도 4를 예시하였다. 효능 결과는 수정 고형 종양의 반응 평가 기준(RECIST)의 기준을 기초로 조영 MRI에 의해 판독되어 생존 종양의 크기만을 측정하였다. 예비 효능 분석은, 6/12 평가가능한 환자가 (도 4)에서와 같이 조영 증강된 병소가 없는 견고한 활성을 나타내며, 이는 모든 종양 조직이 괴사성이 되었고, 즉 TAE와 티라파자민의 단일 처리 후 수정 RECIST에 의해 완전 반응(CR)을 실현하였음을 나타낸다. 3명의 추가 환자는 30% 이상의 괴사 또는 부분 반응(PR)을 가졌다. 전체 반응비(CR+PR)는 83%였다. 이러한 결과는 과거에 경동맥 화학색전술(TACE)을 받은 10,000명 이상의 환자의 메타 분석으로 보고된 50%에서 CR+PR의 히스토릭 대조군과 비교하여 유의적으로 우수하였다.
실시예 5. 티라파자민 및 경동맥 색전술로 처리된 다른 종양 병소를 가진 환자에서의 미처리된 병소의 종양 크기 수축.
I단계 임상 연구에서 처리된 12명의 환자에서, 여러 환자들은 복수의 종양 병소를 가졌고, 하나의 단일 절차로 처리될 수 없었다. 한 환자는 가장 큰 직경에 있어서 각각 15, 26, 10 mm의 크기의 3개의 병소를 가졌다. 혈관 공급으로 인해, 서로 근접하여 위치하였기 때문에 중재 방사선전문의가 선택되어 26 및 10 mm 병소를 처리하였다. 15 mm의 제3 병소는 제1 절차에서 미처리되었다. 6주째 후속 MRI가 수행되었을 때, 2개의 처리된 병소가 CR을 실현하였음을 발견하였는데; 기선에서 15 mm인 제3 병소는 가장 큰 직경에 있어서 단지 9 mm로 수축하였다. 이러한 발견과 일치하는 한가지 잠재적 설명은 2개의 병소의 처리가 미처리된 병소가 더 작아지도록 하는 항-종양 면역성을 유도한다는 것이다. 다시 말해, 2개의 처리된 병소는 잔여 종양 병소를 조절하는 환자의 면역계를 증진시켜 잠재적으로 암 백신으로서 작용한다.
실시예 6: 비-간 조직에서 티라파자민 및 혈관 차단제를 사용한 종양 괴사 유도.
종양 괴사를 유도하는 또다른 접근법은 색전술 절차에 대해 덜 보정가능한 다양한 고형 종양에서의 적용예를 위한 것이다. 본 실시예에서 고형 종양에 저산소증을 유도하는 접근법은 혈관 차단제, 예컨대 DMXAA(5,6-디메틸크잔텐온-4-아세트산, 소위 ASA404 또는 바디메잔), 또는 콤브레타스타틴 A4, 콤브레타스타틴 A4포스페이트, 또는 시스-3, 4', 5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 4a)을 포함한 스틸벤 유도체의 사용을 통한 것이다. 이러한 화합물은 종양 혈류를 차단하고 종양 저산소증을 유도할 수 있는 것으로 입증된 바 있다(Chaplin DJ, 2006)(Tozer GM, 2005). 본 실시예에서, 예시로서 폐암 이종이식 모델에서 티라파자민 및 콤브레타스타틴 A4 또는 DMXAA의 조합을 조사하여 종양 괴사를 유도하는 능력을 테스트하였다.
BALB/c 누드 마우스에서 NCI-H460 인간 폐암 세포를 피하 주사하여 종양 이종이식을 형성함으로써 폐암 마우스 모델을 생성하고 티라파자민 및 2종의 혈관 차단제, 즉 콤브레타스타틴 A4 또는 DMXAA의 조합을 테스트하였다. 평균 종양 부피가 약 480-550 mm3(대략 1 cm 직경)에 도달하고 종양이 고형이고 크기가 증가하는 경우, 종양 보유 마우스에 2회 용량을 위한 티라파자민(30 mg/kg i.p.), 및 콤브레타스타틴 A4(10 mg/kg i.v.), 또는 DMXAA(20 mg/kg i.v.)를 주 1회 투여함으로써 조합이 종양 괴사를 유도할 수 있도록 보증하였다. 티라파자민을 우선 제공하고, 이후 3-5분 후에 콤브레타스타틴 A4 또는 DMXAA를 주사하였다. 두 혈관 차단제는 종양 혈관구조의 거의 즉각적인 차단을 유발하였다. 첫 투약 후 최대 3주 동안 임의의 이상이 있는지 동물을 관찰하였다.
처리된 마우스를 3주차 말미에 희생시키고 H&E 염색에 의한 조직학 조사를 위해 종양을 수확하였다. 대부분의 종양은 약 50-70%의 종양 괴사를 나타낸 반면, 생리식염수가 처리된 대조군 종양은 20% 미만의 괴사를 가졌다. 대표 조직병리학적 사진을 도 5에 도시하였다. 주요 발견은 처리 후 대면적의 종양 괴사이며, 괴사성 종양 주변에 강한 염증성 침윤이 존재하는 것이다. 이 결과는 종양 괴사가 강한 염증 반응과 관련되고 이에 항-종양 면역성을 신장시킬 수 있는 HCC에서의 앞선 발견과 일치한다.
일단 자가 종양 "백신접종"이 TAE 또는 혈관 차단제와 티라파자민의 조합에 의해 유도되는 괴사성 종양에 의해 달성되면, 유도된 T 세포 집단은 종양 미세환경의 면역 억제 효과로 인해 장기간 종양을 궁극적으로 제어하는 것에 여전히 비효과적일 수 있다. 따라서, 종양 내 면역 억제 효과를 제거하는 유지 요법으로서 체크포인트 억제제를 사용하는 조합이 제안되었다.
실시예 7: 폐암 모델에 투여되는 HABA, 저산소증 유도제, 및 면역 체크포인트 억제제의 조합.
저산소증-활성화 생환원제 및 저산소증 유도제와 조합되는 면역 체크포인트 억제제를 투여한 효과를 조사하는 연구에서, C57BL/6 마우스의 피하 3LL 폐 동계 암 모델의 처리시 항-mPD-1, 티라파자민(TPZ), 콤브레타스타틴 A4 포스페이트, 5, 6-디메틸크산테오논-4-아세트산(DMXAA) 및 이의 다양한 조합을 투여하였다.
수컷 C57BL/6 마우스를 상하이 라보라토리 애니멀 센터(SLAC, (Shanghai, China, SCXK 2012-0002); 연령: 6-8주령; 체중: 18-22 g)에서 구입하였다. 각 케이지에 4마리의 동물이 있도록 일정한 온도 및 습도의 SPF 룸에서 마우스를 유지하였다. 온도는 20.5-24.5℃였다. 습도는 40%-75%에서 유지하였다. 빛 주기는 12시간의 광 및 12시간의 어둠을 포함하였다. 폴리카르보네이트 케이지(325 mm x 210 mm x 180 mm)에서 마우스를 유지시켰다. 케이지에 깔아준 재료는 옥수숫대이며, 주 2회로 갈아주었다. 마우스에게는 전체 연구 주기 동안 조사 멸균된 건조 과립 사료가 자유 허용되고 멸균 식수가 자유 허용되었다.
37℃, 공기 중 5% CO2의 분위기에서 10% 열 비활성화된 우태 혈청 및 L-글루타민(2 mM)이 보충된 DMEM 배지에서 단층 배양으로서 시험관 내에 3LL 종양 세포를 유지시켰다. 트립신-EDTA 처리에 의해 종양 세포를 일상적으로 주 2회 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 3LL 종양 세포를 수확하고 접종을 위해 계수하였다.
종양 발달을 위해 C57BL/6 마우스의 우측에 0.05 mL의 인산 완충 식염수(PBS) 중 3LL 종양 세포(2 x 105 세포)를 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 455.64 mm3에 도달하였을 때 접종 9일 후 처리를 시작하였다. 각 연구 군에서의 처리 투여는 도 6에서 도시된다("N"은 동물 숫자를 나타냄; "i.v."는 정맥내 주사를 나타냄, "i.p."는 복강내 주사를 나타냄). 투약 부피는 체중을 기준으로 조정되었다(0.1 mg/10 g). 3LL 동계 모델의 종양 크기가 테스트 물품 처리 11일 후 대략 4000 mm3에 도달하는 경우, 종양을 외과 수술로 절제하고 F4/80에 의한 H&E 염색 및 면역 마커 염색을 위해 10% 포르말린으로 고정하였다.
가능한 한 빨리 손질한 후 10% 중성 완충 포르말린에 전체 종양 조직을 배치하였다. 고정된 조직을 탈수, 클리어링, 침윤을 통해 블록(들)으로 처리하였다. 자동화된 조직 프로세서에 의해 절차를 실시할 수 있다. 포르말린 고정 파라핀 내포된 샘플을 제조하기 위해, 하기 단계가 이어졌다. 용융된 파라핀을 내포 몰드에 부었다. 처리된 조직을 (기포 발생을 피하게 위해) 적용가능한 내포 표면이 아래로 향하게 하여 몰드에 배치하였다. 조직을 포함하는 파라핀 몰드를 극저온 스테이지에 놓았다. 이후 파라핀 블록을 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께를 갖는 슬라이스로 절편화하였다. 적절한 절편을 45℃ 증류수조에 넣었다. 슬라이드를 통해 펼쳐진 절편을 수조로부터 꺼낸 후, 슬라이드를 공기 건조하였다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해, 약 2시간 동안 60℃ 오븐에 파라핀 슬라이드를 배치한 후 실온에 냉각시켰다. 이후 파라핀 슬라이드를 탈랍시키고, H&E 염색하고, 탈수시키고, 클리어링하고, 마운팅하였다. 영구 마운팅 매질을 사용하여 커버슬립을 적용하였다. 마지막으로, 슬라이드를 현미경 조사하고 사진을 취하였다. 총 종양 슬라이드 면적에 의해 종양 괴사 면적을 나누어서 종양 괴사 비율(%)의 계산을 결정하였다.
도 7에는 항-mPD-1, 티라파자민(TPZ), 콤브레타스타틴 A4 포스페이트, 5, 6-디메틸크산테오논-4-아세트산(DMXAA), 및 이의 다양한 조합을 포함한 테스트 물품에 의한 처리 후의 H&E 염색에 의해 제시되는 종양 괴사율이 도시된다. 별표(*)는 만-휘트니 테스트에 의해, 비히클 군과 비교되어 통계적 유의성(P<0.05)을 나타낸다. TPZ, 콤브레타스타틴 A4 포스페이트 및 항-m PD-1의 조합은 비히클 군과 비교하여 종양 괴사율에 있어서 유의적 증가를 나타내었다. 도 8에는 도 7에 도시된 데이타를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에 제시되고 기술되었지만, 그러한 구체예가 단지 예로서 제공되었다는 것은 당업자에게 명백하다. 다양한 변형예, 변화예 및 대체예는 이하 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에 의해 실시된다. 당업자라면 본원에 기술된 본 발명의 구체예에 대한 다양한 대체예가 본 발명을 실시하는 것에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 규정하며 상기 청구범위 및 이의 등가물의 범위 내 방법 및 구조는 이에 의해 포괄되는 것으로 이해된다.

Claims (27)

  1. 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법으로서,
    (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA; hypoxia-activated bioreductive agent)를 피험자에게 투여하는 단계;
    (b) (i) 저산소증 유도제를 피험자에게 투여하거나 또는 (ii) 고형 종양에 공급되는 하나 이상의 혈관을 색전시킴으로써 저산소증을 유도하는 단계; 및
    (c) 면역 체크포인트 억제제의 부재 하에서의 면역 반응과 비교할 때, 고형 종양에 대한 면역 반응을 증진시키기에 효과적인 양으로 단계 (b) 이전에, 단계 (b)와 동시에 또는 단계 (b) 이후에 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 저산소증-활성화 생환원제는 티라파자민인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 혈관 차단제(vascular disrupting agent)인 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 혈관 차단제는 DMXAA, 스틸벤 또는 스틸벤 유도체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 스틸벤 유도체는 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 유도체, 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 5c), 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-히드록시스틸벤(스틸벤 6c) 및 스틸벤 5c의 프로드러그 모르폴리노-카르바메이트 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 항혈관형성제인 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 저산소증 활성화제 및 저산소증 유도제는 고형 종양의 적어도 75%의 괴사를 유도하기에 효과적인 양으로 투여되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 색전제를 투여함으로써 하나 이상의 혈관을 색전시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4의 억제제인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 단클론 항체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단클론 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, MEDI4736 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 고형 종양은 간세포 암종, 담관암종, 간 전이성 결장직장암, 폐암, 유방암, 결장직장암, 방광암, 두경부암, 난소암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 종양인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (b)는 경동맥 색전술을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (a) 후에 수행되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (b)는 저산소증 유도제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (c)는 단계 (b) 후에 면역 체크포인트 억제제를 2회 이상 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제의 투여 단계는 전처리 크기의 50% 미만인 크기에서 고형 종양을 적어도 6개월 동안 유지하기에 효과적인 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, HABA의 투여 단계, 저산소증의 유도 단계 및 면역 체크포인트 억제제의 투여 단계의 조합은 피험자에서 증식성 질환의 치료에 상승 효과를 나타내는 것인 방법.
  19. 피험자에서 고형 종양에 대한 면역 반응의 증진에 사용하기 위한 키트로서,
    (a) 저산소증-활성화 생환원제(HABA);
    (b) 저산소증 유도제 또는 색전제; 및
    (c) 면역 체크포인트 억제제
    를 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, HABA는 티라파자민인 키트.
  21. 제19항에 있어서, (b) 부분은 혈관 차단제인 저산소증 유도제인 키트.
  22. 제21항에 있어서, 혈관 차단제는 DMXAA, 스틸벤 또는 스틸벤 유도체인 키트.
  23. 제22항에 있어서, 스틸벤 유도체는 콤브레타스타틴, 콤브레타스타틴 유도체, 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-아미노스틸벤(스틸벤 5c), 시스-3,4',5-트리메톡시-3'-히드록시스틸벤(스틸벤 6c) 및 스틸벤 5c의 프로드러그 모르폴리노-카르바메이트 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키트.
  24. 제19항에 있어서, (b) 부분은 항혈관형성제인 저산소증 유도제인 키트.
  25. 제19항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4의 억제제인 키트.
  26. 제25항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제는 단클론 항체인 키트.
  27. 제26항에 있어서, 단클론 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, MEDI4736 및 이필리무맙으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키트.
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