CN108472366B - 用于免疫介导的癌症疗法的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于增强对受试者中的实体瘤的免疫应答的方法和组合物。在一些实施方案中，方法包括：(a)向受试者施用低氧激活的生物还原剂(HABA)；(b)通过(i)向受试者施用低氧诱导剂或(ii)对供应所述实体瘤的一个或多个血管进行栓塞来诱导低氧；以及(c)在步骤(b)之前、同时或之后，以与不存在免疫检查点抑制剂时的免疫应答相比有效增强对所述实体瘤的免疫应答的量来施用所述免疫检查点抑制剂。本文还提供了在所公开的方法中使用的试剂盒。

Description

用于免疫介导的癌症疗法的组合物和方法

交叉引用

本PCT申请要求2015年10月21日提交的美国临时专利申请号 62/244,457的优先权，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文用于所有目的。

背景技术

尽管根据肿瘤特异性细胞毒性T细胞的检测，已经表明一些患者表现出对癌症的免疫力，但这些T细胞似乎被挡在一边而无法作用于肿瘤，从而不会提供太多的任何治疗或保护益处。一些人解释了这与肿瘤演变出各种机制以避免免疫攻击这一理论的分歧。为了进行正常的免疫反应，APC摄取肿瘤衍生的抗原，并在加工后将其呈递给T 细胞，以引发T细胞产生针对携带该抗原的肿瘤细胞的细胞毒性。 APC与T细胞之间的相互作用受各种配体-受体相互作用的调节，包括识别肿瘤相关抗原并与MHC分子形成复合物的T细胞受体(TCR)，和共激活物CD28。CTLA4作为T细胞的负调节物，而CD40则作为 APC的正调节物。PD-1为细胞毒性T细胞的另一种负调节物，并且用作免疫检查点。肿瘤细胞可以表达被称为PD-L1的PD-1配体， PD-L1激活PD-1并因此抑制T细胞的抗肿瘤活性。肿瘤也可以募集调节性T细胞，调节性T细胞可抑制细胞毒性T细胞活性以保护肿瘤免受免疫攻击。已经努力操控用于治疗癌症的免疫信号应答，但是应答率和对于无进展生存的影响留下了许多改进空间。此外，对削弱免疫抑制的化合物的过度依赖可能会打破免疫系统与自身免疫性疾病间的平衡。例如，所观察到的纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗 (pembrolizumab)的副作用包括各种免疫相关的肝炎、肺炎、垂体炎、结肠炎等，表明进一步增强一般免疫力可能带来潜在的风险。

发明内容

鉴于前述，需要用于治疗癌症的改进的组合物和策略，特别是利用在受试者中的免疫应答的组合物和策略。本公开内容解决了这一需求，并且还提供了其他益处。在本文公开的一些实施方案中，提供了通过将诱导肿瘤坏死(增加免疫系统对肿瘤抗原的暴露)与施用免疫检查点抑制剂进行组合来增强针对实体瘤的免疫应答的方法。

在一个方面，本公开内容提供了一种增强对受试者中的实体瘤的免疫应答的方法，该方法包括：(a)向所述受试者施用低氧激活的生物还原剂(HABA)；(b)通过(i)向所述受试者施用低氧诱导剂或(ii)对供应所述实体瘤的一个或多个血管进行栓塞来诱导低氧；以及(c)在步骤(b)之前、同时或之后，以与不存在免疫检查点抑制剂时的免疫应答相比有效增强对所述实体瘤的免疫应答的量施用所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述低氧激活的生物还原剂为替拉扎明。在一些实施方案中，步骤(b)包括施用低氧诱导剂，该低氧诱导剂为血管阻断剂。在一些实施方案中，所述血管阻断剂为DMXAA、二苯乙烯或二苯乙烯衍生物。在一些实施方案中，所述二苯乙烯衍生物选自：考布他汀(combretastatin)、考布他汀衍生物、顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-氨基二苯乙烯(二苯乙烯5c)、顺式 -3,4',5-三甲氧基-3'-羟基二苯乙烯(二苯乙烯6c)和二苯乙烯5c的前药吗啉代-氨基甲酸酯衍生物。在一些实施方案中，步骤(b)包括施用低氧诱导剂，该低氧诱导剂为抗血管生成剂。在一些实施方案中，所述低氧激活的生物还原剂和所述低氧诱导剂以有效诱导至少75％的所述实体瘤的坏死的量来施用。在一些实施方案中，步骤(b)包括通过施用栓塞剂对所述一个或多个血管进行栓塞。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗(atezolizumab)、MEDI4736和伊匹木单抗(ipilimumab)。在一些实施方案中，所述实体瘤为选自下组的肿瘤：肝细胞癌、胆管癌、肝脏中的转移性结直肠癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌和胰腺癌。在一些实施方案中，步骤(b)包括经动脉栓塞。在一些实施方案中，步骤(b)在步骤(a)之后进行。在一些实施方案中，步骤(b)包括施用低氧诱导剂。在一些实施方案中，步骤(c) 包括在步骤(b)之后两次或更多次施用所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，施用所述免疫检查点调节剂有效地将所述实体瘤维持在小于治疗前大小的50％的大小至少6个月。在一些实施方案中，施用所述HABA、诱导低氧和施用所述免疫检查点抑制剂的组合在治疗所述受试者的增生性病症中表现出协同效应。

在一个方面，本公开内容提供了一种用于增强对受试者中的实体瘤的免疫应答的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含：(a) 低氧激活的生物还原剂(HABA)；(b)低氧诱导剂或栓塞剂；以及 (c)免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述HABA为替拉扎明。在一些实施方案中，组分(b)为低氧诱导剂，该低氧诱导剂为血管阻断剂。在一些实施方案中，所述血管阻断剂为DMXAA、二苯乙烯或二苯乙烯衍生物。在一些实施方案中，所述二苯乙烯衍生物选自：考布他汀、考布他汀衍生物、顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-氨基二苯乙烯(二苯乙烯5c)、顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-羟基二苯乙烯(二苯乙烯6c)和二苯乙烯5c的前药吗啉代-氨基甲酸酯衍生物。在一些实施方案中，组分(b)为低氧诱导剂，该低氧诱导剂为抗血管生成剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为PD-1、PD-L1或CTLA-4 的抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、MEDI4736和伊匹木单抗。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地且个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1提供了说明肿瘤细胞、细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞(APC) 和调节性T细胞之间的相互作用和调节的示例图。该图说明了阻断检查点PD-1、PD-L1或CTLA4可如何调节肿瘤内的免疫抑制效应。

图2说明了在HBx转基因小鼠模型中比较左肝动脉结扎(HAL) 与盐水、多柔比星或替拉扎明的组合的示例结果。用生理盐水、替拉扎明(从尾静脉静脉内注射3mg/kg)或多柔比星(10mg/kg)及随后左肝动脉结扎40min来处理荷瘤的HBx转基因小鼠。在处理后的不同天测量小鼠体重、胆红素和ALT。在第7天将小鼠处死以供肝细胞癌(HCC)肿瘤的组织学分析。

图3提供了组织的图像，其图示了在用替拉扎明和肝动脉结扎治疗HCC之后诱导肿瘤坏死并触发炎性反应的效果。用替拉扎明(从尾静脉静脉内注射3mg/kg)及随后左肝动脉结扎40min来治疗荷瘤的HBx转基因小鼠。在第7天将小鼠处死以供HCC肿瘤的组织学分析。所显示的是由多个组织切片组装的、具有接近完全(99％)肿瘤坏死的整个肿瘤的复合图片。还注意到坏死肿瘤的边缘具有高度的炎性细胞浸润(所有扩展的放大插图)。

图4提供了获得完全应答(CR)的两名患者的对比度增强的 MRI扫描的代表性图片。这些患者在经动脉栓塞之前分别接受5和 10mg/m²的替拉扎明。后续的MRI扫描在栓塞程序之后第6周完成。箭头突出表示的暗区为肿瘤，其没有对比度增强的迹象，并且被评估为完全肿瘤坏死或CR。

图5提供了组织的图像，其图示了通过替拉扎明和血管阻断剂诱导肿瘤坏死并触发炎性应答的效果。将NCI-H460细胞皮下注射至 BALB/c裸鼠中以形成肿瘤异种移植物。一旦肿瘤生长至直径大小为 10mm，则用替拉扎明(30mg/kg，腹膜内)加(A)考布他汀A4(10mg/kg，静脉内)或(B)DMXAA(20mg/kg，静脉内)(Chaplin DJ， 2006)治疗小鼠。第一次治疗后3周将小鼠处死，并解剖肿瘤以供 H&E染色。所显示的是组织学的代表性图片。指示了肿瘤坏死区域和附近的炎性浸润区域。

图6提供了一张表格，其描述了评价在治疗C57BL/6小鼠的皮下3LL肺同系癌症模型中施用抗-mPD-1、替拉扎明(TPZ)、考布他汀A4磷酸酯、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)及其各种组合的病理学和免疫组织化学的研究的实验设计。

图7提供了在治疗C57BL/6小鼠的皮下3LL肺同系癌症模型中施用抗-mPD-1、替拉扎明(TPZ)、考布他汀A4磷酸酯(ComA4P)、 5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)及其各种组合后，基于福尔马林固定、石蜡包埋组织的苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤坏死百分比的结果。星号(*)表示通过Mann-Whitney检验所确定的与媒介物组相比的统计学显著性(P<0.05)。

图8是提供图7中所描绘的H&E染色的3LL肿瘤组织切片中肿瘤坏死百分比的表格。

具体实施方式

术语“约”或“大约”意指处于如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于该值如何测量或确定，即测量系统的局限性。例如，“约”可意指按照本领域中的实践，在1个或超过1个标准差内。或者，“约”可意指给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可意指在数值的数量级范围内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，应当假定术语“约”意指对于该特定值在可接受的误差范围内。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿类、人类、农场动物、运动动物和宠物。也包括在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。

术语“治疗剂”、“有治疗能力的药剂”或“处理剂”可互换使用，是指在向受试者施用后赋予一些有益效果的分子或化合物。有益效果包括实现诊断确定；改善疾病、症状、病症或病理状况；减少或预防疾病、症状、病症或状况的发作；以及通常抵消疾病、症状、病症或病理状况。

如本文所用的，“治疗”、“减轻”和“改善”可互换使用。这些术语是指用于获得包括但不限于治疗益处和/或预防益处的有益或期望结果的方法。治疗益处意指治疗中的一种或多种疾病、状况或症状的任何治疗相关的改善或效果。为了获得预防益处，可向处于发展特定疾病、状况或症状的风险中的受试者或向报告了疾病的一种或多种生理症状的受试者施用组合物，即便该疾病、状况或症状可能尚未显现出来。通常，预防益处包括降低治疗中的一种或多种疾病、状况或症状的发生率和/或恶化(例如在已治疗和未治疗的群体之间，或在受试者的已治疗和未治疗状态之间)。

术语“共同施用”、“与...联合施用”及其语法上的等同语包括向动物施用两种或更多种药剂，使得药剂和/或它们的代谢物同时存在于动物中。共同施用包括以单独组合物同时施用、以单独组合物在不同时间施用(例如，顺序施用单独组合物)或以两种药剂均存在于其中的组合物来施用。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望结果的药剂的量。治疗有效量可根据以下一项或多项而改变：所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，这些可以容易地由本领域普通技术人员确定。有效量的活性剂可以以单剂量或多剂量施用。组分在本文中可以被描述为至少具有有效量，或至少具有有效的，如与特定目标或目的相关联的量，诸如本文所描述的任何量。

“协同”或“协同效应”可以使得联合组合物的一种或多种效应大于每个单独组分的一种或多种效应，或者它们可以大于每个单独组分的一种或多种效应之和。协同效应可以为约或大于约10％、20％、30％、 50％、75％、100％、110％、120％、150％、200％、250％、350％或500％或者甚至超过单独组分中的一种对受试者的效应，或者当单独施用时每种组分的加和效应。该效应可以是本文所述的任何可测量的效应。

在一个方面，本公开内容提供了一种增强对受试者中的实体瘤的免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)向所述受试者施用低氧激活的生物还原剂(HABA)；(b)在步骤(a)之后通过(i)向所述受试者施用低氧诱导剂或(ii)对供应所述实体瘤的一个或多个血管进行栓塞来诱导低氧，其中所述HABA和低氧在诱导实体瘤的坏死中是有效的；和(c)在步骤(b)之前、同时或之后，以与不存在免疫检查点抑制剂时的免疫应答相比有效增强对实体瘤的免疫应答的量来施用所述免疫检查点抑制剂。

通常，低氧激活的生物还原剂(HABA)为这样的化合物：在氧气的存在下为无活性的前药，并且在低氧环境(例如低氧)中转化为相对于前药形式具有增加的活性的活性形式。在一些实施方案中，在低氧环境中增加的活性由实体瘤内的肿瘤细胞死亡水平来证实，在根据本文所述的方法进行施用时(例如当通过本文所述的方法在肿瘤中或在含有肿瘤的区域中生成局部低氧区时)的肿瘤细胞死亡水平比当将相同量的低氧激活的生物还原剂施用于实体瘤或含有实体瘤的区域(除了未通过本文所述的方法生成低氧区)时更大。在一些实施方案中，活性的增加为至少约10倍或更高，并且该增加可以高得多，例如，约20-200倍，或约50-200倍，或100-200倍或更高。HABA 的实例包括但不限于替拉扎明、巴诺蒽醌(banoxantrone)(AQ4N)、泊非霉素、阿帕兹醌(apaziquone)(EO9)、1,2-双(甲基磺酰基)-1-(2- 氯乙基)-2-[[1-(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]肼(KS119)、二硝基苯甲酰胺芥子衍生物(诸如PR104)和4-[3-(2-硝基-1-咪唑基)-丙基氨基]-7- 氯喹啉盐酸盐(NLCQ-1、NSC709257)。其他实例包括但不限于硝基咪唑类米索硝唑、依他硝唑和尼莫拉唑、TG-302、SN30000、丝裂霉素C(MMC)、泊非霉素、RH1和EO9(阿帕兹醌)。在一些实施方案中，该HABA为替拉扎明。在一些实施方案中，替拉扎明具有以下结构

在一些实施方案中，低氧区域为氧水平小于约10％，并且优选小于约5％的区域。在一些实施方案中，低氧区域中的氧水平约为10％、 9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方案中，约10％或更低，并且优选约5％或更低的氧水平足以将低氧激活的生物还原剂如替拉扎明激活至为前药形式活性的至少10倍的水平。本领域技术人员熟知生物系统中氧水平的测量值，并且还知道氧测量值可以以“mmHg”表示，其中例如10％O₂等于约76mmHg而1％O₂等于约7.6 mmHg。

HABA可通过诱导低氧来激活，诱导低氧有利地在施用HABA 之后进行。可采用多种策略中的任一种来诱导局部低氧区域，在该局部低氧区域内生物还原剂得以激活。在一些实施方案中，这通过对供应靶区域的一个或多个血管进行机械栓塞来实现，诸如通过由介入放射科医师放置的导管施用栓塞剂或装置以机械方式阻塞血管。在一些实施方案中，通过经动脉栓塞诱导低氧。在一些实施方案中，局部或系统地施用一种或多种低氧诱导剂如血管阻断剂(VDA)和/或抗血管生成剂(AAA)，以产生局部低氧区域，在该局部低氧区域内预先施用或共同施用的HABA得以激活。

在一些实施方案中，所述血管阻断剂(VDA)为DMXAA、二苯乙烯或二苯乙烯衍生物。二苯乙烯衍生物的实例包括但不限于考布他汀、考布他汀衍生物、顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-氨基二苯乙烯(二苯乙烯5c)、顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-羟基二苯乙烯(二苯乙烯6c)和二苯乙烯5c的前药吗啉代-氨基甲酸酯衍生物。另外的VDA包括但不限于：(5S)-5-(乙酰基氨基)-9,10,11-三甲氧基-6,7-二氢-5H-二苯并 [a,c]环庚烯-3-基二氢磷酸酯(ZD6126)、(N-[2-[4-羟基苯基]氨基]-3- 吡啶基]-4-甲氧基苯磺酰胺)(E7010或ABT-751)。即使全身施用，这些化合物也会在肿瘤中选择性地诱导严重的低氧。VDA的施用可被认为是一种类型的化学栓塞，与在标准栓塞中直接阻塞血管相反，其使用化学药剂在含肿瘤的区域中选择性地实现相同的栓塞目标。根据任一种单独药剂在治疗实体瘤恶性肿瘤中的活性，VDA与低氧激活的生物还原剂如替拉扎明的组合的效果出人意料地超出预计。它们的活性是协同的。例如，与由任一单独药剂的肿瘤细胞杀伤水平相比，在替拉扎明后给予VDA使得替拉扎明激活并使随后的肿瘤细胞杀伤增加至少10倍或更高。该策略还可以与下述栓塞相结合，从而更有效地诱导肿瘤低氧和替拉扎明激活。

在一些实施方案中，所述低氧诱导剂为抗血管生成剂(AAA)。 AAA的非限制性实例包括贝伐珠单抗、伊曲康唑、羧胺三唑、TNP-470、 CM101、IFNα、IL-12、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、血管抑素、内皮抑素、2-甲氧雌二醇、替可加兰(tecogalan)、四硫钼酸盐、沙利度胺、血小板反应蛋白、催乳素、α_vβ₃抑制剂、利诺胺、他喹莫德、雷珠单抗、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和依维莫司。另外的AAA包括但不限于：阿柏西普、 IMC-1C11、瓦他拉尼(PTK-87)、N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6- 基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺(AMG 706)、3-(4-溴-2,6- 二氟-苄氧基)-5-[3-(4-吡咯烷-1-基-丁基)-脲基]-异噻唑-4-甲酸酰胺 (CP-547,632)、N-(4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基)-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(ABT-869)和西地尼布(AXD-2171)。单克隆抗体如贝伐珠单抗具有超过7天的半衰期，并且通过中和血管生成因子VEGF起作用。VEGF的丧失最终阻止了肿瘤中的新血管形成并且由于肿瘤内氧的消耗而导致肿瘤低氧。小分子化合物如索拉非尼和舒尼替尼具有小于24小时的半衰期，并且通过直接抑制VEGF受体的激酶活性起作用。

在一些实施方案中，使用VDA和AAA的组合来诱导肿瘤低氧。在一些实施方案中，VDA诱导对肿瘤血流的立即抑制以诱导低氧和 HABA的激活。在诱导肿瘤低氧的一些实施方案中，AAA将用于抑制肿瘤的代偿性低氧应答，诸如产生VEGF或其他血管生成因子，这些因子动员来自骨髓中的内皮祖细胞以修复受损的肿瘤血管。VDA 与AAA如贝伐珠单抗的组合有助于防止VEGF的代偿性效应并抑制肿瘤血管中的修复过程，从而增强VDA在使肿瘤保持在低氧状态下的效应。

在一些实施方案中，还考虑了这些方法的各种组合(例如栓塞加一种或多种低氧诱导剂)，整体效应是靶向地、局部地提供激活的生物还原剂，以及在没有通常由全身暴露于生物还原剂引起的副作用的情况下有效杀死靶向部位内或靶向部位处的肿瘤细胞。这种增强还可以允许使用较低剂量的药剂，同时保持充足和有效的肿瘤细胞杀伤水平，从而进一步降低毒性。在一些实施方案中，本文所述的联合肿瘤治疗的组分包括一种或多种抗血管生成剂(AAA)和一种或多种血管阻断剂(VDA)以及低氧激活的生物还原剂(HABA)。当共同施用时，AAA与VDA的组合诱导肿瘤细胞长期低氧，并且在自身杀死肿瘤细胞方面显示出一定的功效。然而，当它们如本文所述与低氧激活的生物还原剂(HABA)联合施用时，它们的活性以协同方式显著增强。在一些实施方案中，本文所述的方法是通过共同施用HABA 来增强AAA和/或VDA的抗癌活性的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法是通过共同施用AAA和/或VDA来增强HABA的抗癌活性的方法。在一些实施方案中，通过施用免疫检查点抑制剂进一步增强功效。

在栓塞程序的一个实例中，栓塞包括在肿瘤或含有由可鉴别的动脉分支(例如，供应肝细胞癌的肝动脉)供应的肿瘤的区域中使用的局部疗法，其通过注射物质(例如碘油(Lipiodol)、明胶海绵 (gelfoam)、血凝块，特别是珠子等)来诱导供应含肿瘤区域的动脉分支发生阻塞，使得肿瘤细胞不能获得足够的血流并死亡。该区域和周围正常器官或组织的血液供应的解剖结构确定了周围的器官/组织是否由于栓塞后缺乏血液供应而可能经历显著的损伤。例如，正常肝脏由双血管——肝动脉和门静脉供应，并因此允许在不会对正常肝脏造成显著损伤的情况下阻塞肝动脉或其分支。该程序通常由介入放射科医师进行，其在荧光镜X射线引导下将导管从股动脉置于腹股沟中，并将导管的尖端推进到供应肿瘤的肝动脉分支。一旦通过注射造影剂鉴别了供应肿瘤的动脉分支，则注射栓塞剂如碘油或明胶海绵以阻塞该分支。

除了碘油之外，其他栓塞剂还包括但不限于明胶海绵、血凝块、纳米颗粒或任何可实现血管阻塞目的的在临床上得到证实的机械作用剂。栓塞剂和低氧激活的生物还原剂(HABA)的施用可以以任何合适的方式进行。例如，HABA可在施用栓塞剂之前(例如，在约1-120 分钟之前)施用，并且随后栓塞剂的施用在该区域中“捕获”HABA。或者，可以将两种药剂共同施用(例如使用包括混合物形式的两种药剂的制剂)。在一些实施方案中，对于通过该方法治疗的患者，所施用的HABA的剂量将在约1mg至约200mg(例如替拉扎明)，并且优选约5mg至约80mg的范围内；并且要施用的栓塞剂的剂量将在约5-40ml，并且优选约20-30ml(例如碘油)的范围内。施用足够的栓塞剂以在荧光镜X射线检查下实现血管的预期分支的完全阻塞，从而确保在栓塞区域中产生低氧区域或状况。栓塞剂的施用通常通过动脉内注射进行。或者，可通过其他手段如特定的珠子进行栓塞以诱导阻塞。

在一些实施方案中，HABA与低氧诱导的组合诱导实体瘤的坏死。在一些实施方案中，该组合诱导一种或多种肿瘤中的至少50％、 75％、80％、85％、95％或更多的坏死。诱导坏死的程度可以是在治疗后的特定时间之后达到的程度。例如，至少50％的肿瘤坏死可在治疗后1、2、3、4周或更多周内或在治疗后1、2、3、4、5个月或更多个月内实现。在一些实施方案中，通过治疗诱导的肿瘤坏死的程度是相对于起始肿瘤大小，在治疗后观察到的最大坏死水平。

在一些实施方案中，肿瘤的坏死在受试者中诱导针对由肿瘤表达的一种或多种抗原的免疫应答。例如，肿瘤抗原包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原 (ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、BCR-abl、p53、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6、HPV E7、BING-4、钙激活的氯离子通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、存活蛋白、BAGE、CAGE、GAGE、SAGE、 XAGE、NY-ESO-1/LAGE、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、 Gp100/pmel17、TRP-1、TRP-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原(PSA)、 b-连环蛋白、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2或TGRbRII。

施用HABA、诱导低氧和施用免疫检查点抑制剂可以是顺序的或同时的。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以与HABA和/ 或诱导低氧顺序地施用。例如，免疫检查点抑制剂可以在施用HABA 或诱导低氧或两者之前单独施用。在一些实施方案中，可以施用检查点抑制剂，随后施用HABA，并且稍后诱导低氧。免疫检查点抑制剂可以在施用HABA和/或诱导低氧之后单独施用。或者，免疫检查点抑制剂可以与HABA和/或诱导低氧联合施用。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前、同时或之后施用。当在诱导低氧之前施用时，免疫检查点抑制剂可以在诱导低氧之前约5分钟至约24小时或更长时间施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前约5、10、15、20、25、30、45或60分钟施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前约1、2、3、4、5、6、7、8、12、18、24小时施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前施用一次。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧之前多次(例如2、3、4、5、10、15、25 次或更多次)施用。当同时施用时，两种药剂可以通过相同或不同的施用途径以联合组合物(例如在单一液体悬浮液中)或以几乎同时施用的单独组合物的形式施用。当在诱导低氧后施用时，免疫检查点抑制剂可在诱导低氧后约5分钟至约24小时或更长时间施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后约5、10、15、20、25、30、45或60分钟施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后约1、2、3、4、5、6、7、8、12、18、24小时施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后施用一次。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后多次(例如2、3、4、5、10、15、25 次或更多次)施用。

免疫检查点抑制剂的施用可以遵循设定的给药方案，直至获得指定的端点，诸如目标治疗结果。给药方案的实例包括每天一次或多次(例如1、2、3次或更多次)；每1、2、3、4、5、6、7天或更多天一次或多次；每1、2、3、4周或更多周一次或多次；每1、2、3、 4、5、6个月或更多个月一次或多次；或这些方式的组合(例如按照递减给药方案)施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在诱导低氧后数周内多次施用，例如在诱导低氧后1、2、 3、4、5、6、8、12、16、20、24或52周内每天1、2、3、4次或更多次施用。

通常，免疫检查点抑制剂是完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种免疫检查点蛋白质的药剂。免疫检查点蛋白质调节T细胞的活化或功能。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂增加T细胞 (包括但不限于辅助性T细胞和细胞毒性T细胞)的活性或功能。在一些实施方案中，辅助性T细胞包括但不限于Th1细胞、Th2细胞和 Th17细胞。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂增加细胞毒性T 细胞和辅助性T细胞的活性，同时降低调节性T细胞的活性，从而增加针对抗原的免疫应答。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂响应于肿瘤抗原而增加T细胞的增殖。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂响应于肿瘤抗原而增加T细胞的细胞因子分泌，该肿瘤抗原包括但不限于IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、IL-21、IL22、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL9、 CCL17、CCL19、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、 G-CSF、GM-CSF、IFNb、IFNg、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-23、IL-27、MIF、TGFb、TNFa、VEGF或制癌蛋白M。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂通过释放细胞毒素(包括但不限于穿孔蛋白、粒酶和粒溶素)来增加细胞毒性T细胞活性或杀死肿瘤细胞。免疫检查点蛋白质的靶标的实例包括但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、 B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为VTCN1)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA，也称为CD272)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白 4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡-1(PD-1)、程序性死亡-1配体(PD-L1和PD-L2)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞活化的V 结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、IL-10或TGF-β。

图1提供了说明肿瘤细胞、细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞(APC) 和调节性T细胞之间的相互作用以及使用各种抗体调节免疫检查点的示例图。例如，图1所示的是针对包括CTLA4、PD-1和PD-L1在内的免疫检查点受体的抗体。抗PD-1和抗PD-L1抗体可通过阻断 PD-1与PD-L1之间的相互作用增强细胞毒性T细胞活性。向肿瘤细胞施用抗PD-L1或抗PD-1可防止免疫逃避并增加免疫介导的抗肿瘤活性。另外描绘的抗-CTLA4抗体可通过阻断CTLA4接合的免疫抑制作用增强活性细胞毒性T细胞的免疫介导的细胞毒性，从而潜在地增强T细胞增殖。这类抗体可降低调节性T细胞的活性。

可有利地采用多种免疫检查点抑制剂中的任一种。抑制剂可为小分子、抑制性多肽(例如，如在天然或截短的配体或受体中)、适体或抗体。在一些实施方案中，该抑制剂为结合免疫检查点蛋白质的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗体为包含两个重链和两个轻链序列的全长抗体。在一些实施方案中，该抗体为IgM、IgG、 IgE、IgA或IgD同种型。在一些实施方案中，该抗体为IgG亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在一些实施方案中，该抗体为重链、轻链或至少一个重链和至少一个轻链。在一些实施方案中，该抗体为抗体片段，诸如Fab、Fab′或Fab′₂、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(ddFv)、V_L、V_H、骆驼Ig、V-NAR、VHH、三特异性(Fab₃)、双特异性(Fab₂)、双抗体((V_L-V_H)₂或(V_H-V_L)₂)、三抗体(三价)、四抗体(四价)、微抗体((scFv-CH₃)₂)、双特异性单链Fv(Bis-scFv)、IgGδC_H2、scFv-Fc或(scFv)₂-Fc、片段或单链抗体。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、MEDI4736、lambrolizumab、MPDL3280A、 BMS-936559、BMS-936558/MDX-1106、CT-011、pidilizumab、加利昔单抗(galiximab)、AMP-514、MEDI4736、MK-3475、MPDL3280A、 IMP321、BMS-986016、IPH2101、MSB0010718C、AUNP 12、曲美木单抗(tremelimumab)和伊匹木单抗。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是来源于人类或非人类动物(例如小鼠或大鼠)的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合免疫检查点蛋白质。可获得多种用于制备单克隆抗体的方法。通常，单克隆抗体获自或源自单克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。在一些实施方案中，除了并非源自非人抗体来源的部分以外还包含来自非人抗体的一个或多个重链和/或轻链的抗体(诸如在嵌合或人源化抗体中)与相应的亲本非人抗体(a)能够竞争结合；(b) 保留功能特征；(c)结合相同的表位；并且/或者(d)具有相似的结合亲和力。

在一些方面，提供了包含来自人抗体的一个或多个重链和/或轻链的单克隆抗体。人抗体包括具有完全人类氨基酸序列，例如人重链和人轻链可变区和人恒定区的抗体。作为非人抗体的抗体可通过用存在于人抗体中的氨基酸残基置换非人类氨基酸残基来制备为完全人抗体。因此，人抗体包括已经用存在于任何其他人抗体中的一个或多个氨基酸置换一个或多个人类或非人类氨基酸残基的抗体。

在一些实施方案中，获自非人类动物的抗体可以是人源化的。在一些实施方案中，人源化抗体在特异性结合受体免疫球蛋白分子中的所需抗原的一个或多个互补决定区(CDR)中具有非人类氨基酸残基(例如小鼠、大鼠、山羊、兔子)并且在Fv构架区(FR)中具有一个或多个人类氨基酸残基，其为CDR侧翼的氨基酸残基。在一些实施方案中，通过将来自非人抗体的合适的CDR区段插入人抗体支架来产生人源化抗体，其中该人源化抗体能够特异性结合免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，人源化单克隆抗体包含来自第一非人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR结构域，该CDR结构域用于替代来自第二人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR结构域。在一些实施方案中，第一抗体获自非人类动物，并且能够特异性结合免疫检查点蛋白质。来自第一抗体的CDR结构域替代第二人抗体中的CDR 结构域，其中第二人抗体缺乏对免疫检查点蛋白质的结合特异性。该过程生成这样的人源化单克隆抗体：其由于添加了来自第一抗体的 CDR结构域而能够特异性结合免疫检查点蛋白质，并且因为剩余的抗体结构域来源于人抗体而不被免疫系统识别为外来的。在一些实施方案中，包含来自第一抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR结构域的人源化抗体与相应的第一抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；并且/或者(d)具有相似的结合亲和力。

低氧激活的生物还原剂、低氧诱导剂和免疫检查点抑制剂可被配制成用于通过任何合适的施用途径向受试者施用的药物组合物。施用途径的实例包括但不限于肠胃外(包括皮下、静脉内、动脉内、骨内、脑内、脑室内、鞘内、髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)、直肠、局部、经皮或口服(例如，以胶囊、悬浮液或片剂的形式)。药物组合物通常包含一种或多种活性剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂，该药学上可接受的赋形剂包括但不限于溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如，水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂，它们适合于药物施用或体内接触或递送。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。这类药学上可接受的载体包括片剂(包覆或未包覆的)、胶囊(硬或软)、微珠、粉末、颗粒和晶体。也可将补充活性化合物(例如，防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入到组合物中。

共溶剂的非限制性实例含有羟基基团或其他极性基团，例如醇类如异丙醇；二醇如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。共溶剂的非限制性实例含有羟基基团或其他极性基团，例如醇类如异丙醇；二醇如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。

还可将补充化合物(例如，防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂(包括杀生物剂和生物抑制剂如抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂))掺入组合物中。因此，药物组合物可包含防腐剂、抗氧化剂和抗微生物剂。可使用防腐剂来抑制微生物生长或增加成分的稳定性，从而延长药物制剂的保质期。合适的防腐剂是本领域已知的，并且包括例如EDTA、 EGTA、苯扎氯铵或苯甲酸或苯甲酸盐如苯甲酸钠。抗氧化剂包括例如抗坏血酸、维生素A、维生素E、生育酚和类似的维生素或维生素原。抗微生物剂或化合物直接或间接地抑制、减少、延迟、中止、消除、阻止、抑制或防止由致病性或非致病性微生物生物体带来的污染或其生长、传染性、复制、增殖、繁殖。抗微生物剂的种类包括抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂。抗微生物剂包括杀死或破坏(-杀灭剂)或抑制(-抑制剂)由微生物生物体带来的污染或其生长、传染性、复制、增殖、繁殖的药剂和化合物。

在一些实施方案中，可重复一个或多个治疗步骤。例如，施用 HABA、诱导低氧和施用免疫检查点抑制剂的步骤可在整个治疗过程中一起重复一次或多次。在一些实施方案中，重复一个步骤而不重复其他步骤。例如，在治疗过程中根据给药方案，在施用HABA和诱导低氧之后，免疫检查点抑制剂可施用两次或更多次。在一些实施方案中，在治疗过程中根据给药方案，在施用HABA和诱导低氧之后施用免疫检查点抑制剂3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 20次或更多次。在一些实施方案中，在治疗过程中根据给药方案，在施用HABA和诱导低氧之前施用免疫检查点抑制剂3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、20次或更多次。在一些实施方案中，在治疗过程中根据给药方案，在施用HABA和诱导低氧之后每小时一次、每天一次、每周一次或每月一次施用免疫检查点抑制剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法、组合物和试剂盒可用于治疗受试者的增生性病症，特别是包含一种或多种实体瘤的增生性病症。增生性病症的实例包括但不限于棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性髓母细胞白血病伴成熟、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、未分化甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝利尼管癌(Bellini duct carcinoma)、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、布伦纳瘤(Brenner tumor)、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、原发灶不明的癌症(Cancer of Unknown Primary Site)、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤、卡斯尔曼病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管上皮癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T 细胞淋巴瘤、德戈病(Degos disease)、隆凸性皮肤纤维肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤因家族肿瘤(Ewing Family of Tumor)、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病(Extramammary Paget's disease)、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胃肠间质瘤、胚细胞瘤、生殖细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒-单核细胞白血病、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、肾癌、克拉茨金瘤(Klatskin tumor)、克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor)、喉癌(Laryngeal Cancer)、喉癌 (Laryngeal cancer)、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔胚细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、转移性结直肠癌、混合苗勒管瘤(Mixed Mullerian tumor)、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、多发性骨髓瘤(Multiple myeloma)、蕈样肉芽肿病(Mycosis Fungoides)、蕈样肉芽肿病(Mycosis fungoides)、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、寡星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌(OralCancer)、口癌(Oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌(Ovarian Cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病(Paget's disease of the breast)、潘科斯特瘤(Pancoast tumor)、胰腺癌(PancreaticCancer)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质瘤、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里希特转化(Richter's transformation)、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病(Schwannomatosis)、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、性索-间质肿瘤、塞泽里综合征(Sezary Syndrome)、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T 细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、终末期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、弗纳-莫里森综合征(Verner Morrison syndrome)、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症 (Waldenstrom's macroglobulinemia)、沃辛瘤(Warthin's tumor)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)或其任何组合。在一些实施方案中，治疗实体瘤。实体瘤的实例包括但不限于肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌和胰腺癌。在一些实施方案中，施用HABA、诱导低氧和施用免疫检查点抑制剂的组合在治疗受试者中的增生性病症中表现出协同效应。

特别地，治疗癌症的功效可通过任何合适的度量标准加以衡量。在一些实施方案中，治疗功效基于治疗增生性病症如癌症的效果进行衡量。通常，本发明的方法和组合物关于治疗增生性病症(例如癌症，无论是良性的还是恶性的)的治疗功效可通过如下指标来衡量：所述方法和组合物促进抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管形成、根除肿瘤细胞和/或至少一个肿瘤的大小减小(从而治疗人的增生性病症)的程度。本文讨论了在确定治疗功效时要考虑的几个参数。临床医师可以确定特定情况下参数的适当组合。本发明方法在治疗癌症(例如，减小肿瘤大小或根除癌细胞)中的进展可使用任何合适的方法来确定，诸如临床上目前用于追踪肿瘤大小和癌症进展的那些方法。在一些实施方案中，用于评估癌症治疗的主要功效参数优选为肿瘤大小的减小。肿瘤大小可以使用任何合适的技术来确定，诸如尺寸的测量，或使用可用的计算机软件诸如维克森林大学(Wake Forest University)开发的FreeFlight软件(其能够精确估计肿瘤体积)来估测肿瘤体积。肿瘤大小可以通过使用例如CT、超声波、SPECT、螺旋CT、MRI、照片等等的肿瘤可视化来确定。在结束治疗期后手术切除肿瘤的实施方案中，肿瘤组织的存在和肿瘤大小可以通过待切除组织的总体分析和 /或通过切除组织的病理学分析来确定。

理想地，肿瘤的生长因治疗而稳定下来(即，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，并且/或者不转移)。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12周或更多周。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。优选地，肿瘤的大小降低至少约5％(例如，至少约10％、15％、20％或25％)。更优选地，肿瘤大小降低至少约30％(例如，至少约35％、40％、45％、 50％、55％、60％或65％)。甚至更优选地，肿瘤大小降低至少约70％ (例如，至少约75％、80％、85％、90％或95％)。最优选地，肿瘤完全消除或降低到检测水平以下。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周保持无肿瘤(例如在缓解中)。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月保持无肿瘤。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10年或更多年保持无肿瘤。

当在治疗期结束后手术切除肿瘤时，本发明方法在减小肿瘤大小中的功效可以通过测量切除的坏死(即死亡)组织的百分比来确定。在一些实施方案中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，更优选约90％或更大(例如，约90％、95％或100％)，则治疗是有疗效的。最优选地，切除组织的坏死百分比约为100％，也就是说，没有肿瘤组织存在或可检测。

可采用许多次要参数来确定本发明方法的功效。次要参数的实例包括但不限于新肿瘤的检测、肿瘤抗原或标志物(例如，CEA、PSA 或CA-125)的检测、活检、外科手术降期(即，肿瘤的手术分期从不可切除转变为可切除)、PET扫描、生存期、疾病无进展生存期、到疾病进展的时间、生活质量评估如临床效益反应评估等，所有这些均可指示人类癌症的整体进展(或消退)。活检对检测组织内癌细胞的根除特别有用。采用放射免疫检测(RAID)利用由肿瘤产生和/或与之相关的血清标志物(抗原)(“肿瘤标志物”或“肿瘤相关抗原”) 水平对肿瘤进行定位及分期，并且可用作治疗前诊断预测、治疗后复发的诊断指标以及治疗后治疗功效的指标。可被评估为治疗功效指标的肿瘤标志物或肿瘤相关抗原的实例包括但不限于：癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、CA19-9、神经节苷脂分子(例如，GM2、GD2和GD3)、MART-1、热休克蛋白(例如，gp96)，唾液酸化Tn(STn)、酪氨酸酶、MUC-1、HER-2/neu、c-erb-B2、KSA、 PSMA、p53、RAS、EGF-R、VEGF、MAGE和gp100。其他肿瘤相关抗原是本领域已知的。RAID技术联合内窥镜检测系统也能有效地区分小肿瘤和周围组织(参见例如，美国专利号4,932,412)。

在一些实施方案中，通过一个或多个以下结果证明人类患者中癌症的治疗：(a)肿瘤完全消失(即，完全应答)，(b)与治疗前的肿瘤大小相比，在治疗期结束后至少四周，肿瘤大小减小约25％至约50％，(c)与治疗期前的肿瘤大小相比，在治疗期结束后至少四周，肿瘤大小减小至少约50％，以及(d)与治疗期前的肿瘤相关抗原水平相比，在治疗期结束后约4-12周时特定肿瘤相关抗原水平降低至少2％(例如，降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％或90％)。虽然优选肿瘤相关抗原水平降低至少2％，但是肿瘤相关抗原水平的任何降低均是治疗患者癌症的证据。例如，对于不可切除的局部晚期胰腺癌，治疗可如下得到证实：与治疗期之前的 CA19-9水平相比，在治疗期结束后4-12周时CA19-9肿瘤相关抗原水平降低至少10％。类似地，对于局部晚期直肠癌，治疗可如下得到证实：与治疗期之前的CEA水平相比，在治疗期结束后4-12周时CEA 肿瘤相关抗原水平降低至少10％。

关于生活质量评估，如临床效益反应标准，根据本发明的治疗的治疗益处可在疼痛强度、止痛剂使用和/或卡氏功能量表(Karnofsky Performance Scale)评分方面进行证明。卡氏功能量表允许对患者根据其功能障碍进行分类。卡氏功能量表评分为0-100。通常，较低的卡氏评分预示生存期的预后不良。因此，备选地或另外地，人类患者中癌症的治疗通过以下方面来证明：(a)与治疗前患者报告的疼痛强度相比，诸如在治疗结束后12周内的任何连续四周时间段，患者报告的疼痛强度降低至少50％(例如，降低至少60％、70％、80％、90％或100％)，(b)与治疗前患者报告的止痛剂使用相比，诸如在治疗结束后12周内的任何连续四周时间段，患者报告的止痛剂使用减少至少50％(例如，减少至少60％、70％、80％、90％或100％)，和/或(c)与治疗期之前患者报告的卡氏功能量表评分相比，诸如在治疗期结束后12周内的任何连续四周时间段，患者报告的卡氏功能量表评分增加至少20分(例如，增加至少30分、50分、70分或90 分)。

尽管所提到的测试和/或其他测试的备选的或另外的结果可以证明治疗功效，但对人类患者中的增生性病症(例如癌症，无论是良性的还是恶性的)的治疗理想地由一个或多个(以任何组合方式)前述结果来证实。

在一些实施方案中，优选在受试者中没有显著的不良事件的情况下减小肿瘤大小。不良事件根据国立癌症研究所(NCI)的癌症疗法评估计划(CTEP)来分类或“分级”，其中0级代表最小的不良副作用，而4级代表最严重的不良事件。NCI毒性量表(1999年4月发布)和通用毒性标准手册(1999年8月更新)可从NCI获得，例如通过NCI因特网网站www.ctep.info.nih.gov或由NCI癌症治疗和诊断部赞助的研究药剂临床试验的参与者的调查员手册(1998年3月更新) 获得。期望地，本文所述的方法与最小的不良事件相关，例如，如根据CTEP/NCI分级的0级、1级或2级不良事件。然而，尽管优选减小肿瘤大小，但这并不是必需的，原因在于尽管肿瘤细胞得到根除(诸如坏死)，但肿瘤的实际大小可能不会缩小。根除癌细胞足以实现治疗效果。同样地，肿瘤大小的任何减小均足以实现治疗效果。

在Cancer Facts and Figures 2001,American Cancer Society,New York,N.Y.和国际专利申请WO 01/24684中进一步描述了人类中各种癌症的检测、监测和评定。因此，临床医师可使用标准测试来确定本发明方法的各种实施方案在治疗癌症中的功效。然而，除了肿瘤的大小和扩散之外，临床医师还可以在评估治疗功效中考虑患者的生活质量和生存期。

在一些实施方案中，施用HABA、诱导低氧和施用免疫检查点抑制剂相比于单独的任一种药剂的治疗、同时递送两种药剂的治疗和 /或以相反顺序的两种药剂的治疗提供改善的治疗功效。可使用任何合适的方法(包括但不限于本文所述的那些方法)来测量改善的功效。在一些实施方案中，使用适当的指标(例如肿瘤大小减小、肿瘤大小稳定性的持续时间、无转移事件的持续时间、无疾病生存的持续时间)，改善的治疗功效为至少改善约10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、75％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、150％、200％、 300％、400％、500％、600％、700％、1000％、10000％或更多。使用适当的指标(例如肿瘤大小减小、肿瘤大小稳定性的持续时间、无转移事件的持续时间、无疾病生存的持续时间)，改善的功效还可表示为改善倍数，诸如至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9 倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、 100倍、1000倍、10000倍或更多倍。

在一个方面，本公开内容提供了用于增强对受试者中的实体瘤的免疫应答的试剂盒，诸如根据本文所述的任何用途。试剂盒可以以任何组合包括本文所述的一种或多种组合物。在一些实施方案中，该试剂盒包含(a)低氧激活的生物还原剂(HABA)；(b)低氧诱导剂或栓塞剂；和(c)免疫检查点抑制剂。以上提供了HABA、低氧诱导剂、栓塞剂和免疫检查点抑制剂的非限制性实例，诸如关于本公开内容的各种方法。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含供临床医师、保健提供者或患者使用的说明书，例如印刷材料或包装。试剂盒中的药物组合物和其他物质可以包含在任何合适的容器中，并且可以是立即可用的形式或需要与试剂盒中的其他试剂或使用者提供的试剂来组合(例如稀释浓缩组合物或重建冻干组合物)。

实施例

以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案的目的而给出的，并不意味着以任何方式限制本发明。本发明实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述的方法，均为示例性的，并非旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求范围限定的本发明的精神内的变化以及其他用途。

实施例1.在肝细胞癌模型中替拉扎明和肝动脉结扎的组合。

材料和方法：将所有的HBx转基因小鼠在无特定病原体的设施中进行饲喂并随访；随后收集个体小鼠的尾巴以供3周龄断奶时的基因分型过程。肝细胞癌(HCC)在>95％的17-18月龄的雄性HBx转基因小鼠中自发产生。具有0.5-2cm直径肿瘤的转基因小鼠用于研究。

用替拉扎明和肝动脉结扎治疗荷瘤的HBx小鼠：对HBx转基因小鼠进行左肝动脉结扎40min，并随后解开丝线结扎。在药物效果的研究中，在肝动脉结扎之前将0.9％盐水、多柔比星(10mg/kg)或 TPZ(3mg/kg)注射到每只小鼠的尾静脉中，持续7min。注射结束后，进行中线剖腹手术以暴露肝左叶和肝门，从而解剖左或总肝动脉以供短暂结扎。在实验期间，通过腹膜内注射400mg/kg阿佛丁 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)将所有小鼠麻醉。在第一周内收集系列血清样品以供通过使用ARKRAY Spotchem EZ化学分析仪 SP-4430(Arkray，Inc.，Kyoto，Japan)评估ALT和总胆红素。1或7 天后，收集肝组织以供HE染色。

肿瘤坏死的组织学和形态学分析：对于每只小鼠，将含有整个肿瘤和相邻的非肿瘤区的肝组织在10％甲醛中固定过夜并在石蜡中包埋。跨越整个肿瘤的肝组织切片(3μm厚度)经历苏木精和伊红 (H&E)染色以用于组织学分析。通过使用ImageJ软件(Version1.46r， National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)，通过将坏死面积除以覆盖整个肿瘤的五个横截面中的总肿瘤面积来对每个肿瘤中的坏死百分比进行定量。以下进一步讨论了详细的结果。

实施例2：在肺癌模型中替拉扎明和考布他汀A4和DMXAA的组合。

材料和方法：人类肺癌NCI-H460细胞购自ATCC并用于本研究。在接种到小鼠中之前将细胞在5次传代内进行亚培养。在动物适应期后，在用3-4％异氟烷麻醉的情况下，将200μL无血清培养基/ 基质胶(50:50v/v)中的大约1.5×10⁶个NCI-H460细胞皮下注射到每只小鼠中。BALB/c裸鼠(雄性，约4～5周龄且体重18～20g)购自中国上海斯莱克实验动物有限公司(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.,China)，并按照处理组以3-5只小鼠/笼安置在动物饲养室中。小鼠可以自由获取食物(经辐照的，中国上海斯莱克实验动物有限公司) 和水(由Mol Ultrapure Water System过滤的市政自来水)。

在第一次剂量后的第18天，用CO₂窒息后颈椎脱位对来自每个组的小鼠施以安乐死，收集肿瘤，称重，并拍摄照片。使用福尔马林固定的肿瘤以供组织病理学研究。福尔马林固定后，将肿瘤进行石蜡包埋以获得FFPE块。对于来自一只小鼠的每个肿瘤大块而制备一块。将FFPE块切成约4μm厚，并进行处理以供H&E染色、组织病理学检查和对肿瘤坏死的定量。以下进一步讨论了详细的结果。

实施例3：诱导肿瘤坏死并将肿瘤在体内转化为癌症疫苗。

为了解决肿瘤异质性和基因组不稳定性的问题，理想的癌症疫苗是每个患者的自体肿瘤。然而，肿瘤本身通常并非极具免疫原性，并且即使在单独的免疫检查点抑制剂的存在下，抗肿瘤免疫的程度通常也是不足的。通过诱导肿瘤坏死可以增强免疫应答，这与强烈的炎性应答相关，其导致将肿瘤相关抗原呈递给T细胞并增加肿瘤特异性 T细胞的群体。诱导肿瘤坏死的一种方法适用于例如肝脏内的癌症，肝脏是具有来自门静脉和肝动脉的双重血液供应的器官，允许在对正常肝脏没有显著损害的情况下对供应肿瘤的肝动脉进行栓塞。诱导肿瘤坏死的策略为替拉扎明(低氧激活的药剂)和经动脉栓塞(TAE) 的组合以产生肿瘤低氧，肿瘤低氧激活替拉扎明以诱导肿瘤坏死。在 HBx转基因小鼠模型中证实了该组合的功效。

用于该研究的动物模型为表达HBx的转基因小鼠，HBx为乙型肝炎病毒的致癌基因，其显示能够诱导肝细胞转化为肿瘤。HBx转基因小鼠在大约18个月时自发地产生肝细胞癌。肿瘤病变没有基线肿瘤坏死，并且理想地用于研究由替拉扎明和肝动脉结扎(HAL)组合诱导的肿瘤坏死程度。首先在滴定研究中，确定了与短暂HAL相结合的HBx转基因小鼠模型中的替拉扎明的有效剂量为3mg/kg。接下来，研究了替拉扎明与HAL联合的功效，并与TACE中常用的化疗剂多柔比星进行比较。首先测试一个小组以比较盐水(n＝1)、多柔比星(10mg/kg，n＝1)和替拉扎明(3mg/kg，n＝1)连同短暂的左 HAL对具有可触知的HCC的HBx转基因小鼠治疗的功效。在用替拉扎明和短暂的左HAL治疗后1天将小鼠处死。替拉扎明治疗的小鼠的ALT水平比多柔比星治疗的小鼠高得多。治疗后第1天的组织病理学检查显示，替拉扎明诱导HAL区域内HCC中超过99％的坏死，相反，多柔比星治疗的HCC中仅约5％的坏死。该结果表明，当与 HAL相结合来诱导肿瘤坏死时，替拉扎明比多柔比星更有效。

进行相同的研究以检查治疗后7天的组织病理学变化。每组使用的小鼠数目为盐水(n＝2)、多柔比星(10mg/kg，n＝2)和替拉扎明(3mg/kg，n＝3)。对于用替拉扎明或多柔比星治疗的HCC，通过 oxyFlo传感器监测肿瘤血流量，并显示HAL使血流量降低至30％，这足以诱发肿瘤低氧。

小鼠体重分析显示无统计学显著变化，但多柔比星治疗的小鼠的平均体重略低(图2中 A)。在整个7天中，三组中的血清总胆红素水平都在正常范围内(图2中 B)。在用替拉扎明和短暂的左HAL治疗的组中，血清ALT水平在第1天达到峰值(图2中 C)。随后，ALT水平降低并在第3天左右恢复正常。多柔比星和短暂的HAL也在第1 天诱导ALT升高，但低于替拉扎明和左HAL，并且到第2天，两组的ALT均恢复至正常水平。在第7天的解剖过程中，因其变得苍白可以证实在用替拉扎明和短暂的HAL治疗的HCC中出现肿瘤坏死，而在来自用盐水或多柔比星处理的小鼠的HCC中则未出现肿瘤坏死 (图2中 D)。通过H&E染色的组织病理学分析证实，在替拉扎明和左 HAL的联合治疗后，左HAL区域中的HCC具有90-99％的坏死。在用盐水或多柔比星联合左HAL处理的HCC中未检测到或几乎未检测到病理学变化(图2中E)。由于这些小鼠往往具有多处HCC，因此在用作内部对照的右叶中存在肿瘤结节。在任何动物的任何右叶中均不会出现肿瘤坏死。在肝脏左叶的无肿瘤部分中未见坏死迹象，表明到第7天，替拉扎明和左HAL的组合在同一叶的正常肝脏中未导致任何显著损伤。尽管如ALT升高所提示的，可能会在第1天出现短暂性损伤，但在第7天完全恢复。

研究结果表明，替拉扎明和TAE的组合在诱导肿瘤坏死中优于单独的TAE或多柔比星与TAE的组合。多柔比星目前用作TACE(经动脉化疗栓塞)的化疗组分以供治疗中期HCC。上述数据表明，为了达到最大的肿瘤坏死以引发针对HCC的免疫力，使用替拉扎明与 TAE联合比用多柔比星的TACE好得多。

然后使用同一模型来检查治疗后的肿瘤坏死程度以及通过该方法诱导的肿瘤坏死是否与明显的炎性应答相关，这有助于用作抗原呈递细胞的巨噬细胞/树突细胞吞噬坏死碎片。在更高放大倍数的视图 (图3)中，通过组装多个组织切片来确定肿瘤坏死的百分比，以评估在用替拉扎明和HAL治疗后肿瘤坏死的总体百分比。观察到整个肿瘤的超过99％坏死。仔细检查坏死肿瘤的周围区域以寻找炎性细胞浸润。图3的插图显示，坏死肿瘤的周围区域具有非常强烈的炎性浸润，这符合坏死触发炎性应答的理论。

实施例4：在适于使用替拉扎明和经动脉栓塞(TAE)的组合进行栓塞的肝细胞癌患 者中诱导肿瘤坏死。

为了检测替拉扎明联合TAE在人类中的临床耐受性和功效，在美国主要医疗中心开始I期剂量定义研究以检查耐受性、初步功效并确定替拉扎明在联合TAE时推荐的2期剂量(RP2D)。入选的HCC 患者为Child-Pugh A级，其不是手术候选者，并且具有最多4个肿瘤病变，其中肿瘤病变大小均不大于10cm并且适合于栓塞。前12名可评估患者的结果可用于分析。

在前两个队列中，通过全身静脉内输注以5和10mg/m²施用替拉扎明，这明显低于先前3期研究中使用的250-330mg/m²的剂量。基于从替拉扎明和左肝动脉结扎的小鼠研究估计的毒性剂量的1/10 的当量和在动物模型研究中所证实的有效结果(实施例1)来选择剂量。三名患者入选任一队列。由于未观察到毒性或剂量限制性毒性 (DLT)，故全体均对治疗具有耐受性。随后，基于动脉内(IA)施用的良好耐受特征，将施用途径切换至经由肝动脉的IA，之后在大鼠毒理学研究中进行肝动脉结扎。IA途径的起始临床剂量为5mg/m²，其为显示可耐受的IV剂量的50％。然后将IA队列的剂量上调至10 mg/m²，其中在任一队列中为3名患者。由于未观察到毒性或剂量限制性毒性(DLT)，故所有患者对治疗均具有耐受性。

对前12名患者的初步功效进行分析，并在图4中示例说明。基于改良的实体瘤响应评价标准(RECIST)，通过对比MRI读取功效结果，从而仅测量存活肿瘤的大小。初步功效分析显示，对于没有对比度增强的病变的12名可评估患者中的6名具有强有力的活性，诸如在(图4)中，其表明所有肿瘤组织已经坏死，即在用替拉扎明与 TAE单一治疗之后实现根据改良的RECIST所定义的完全应答(CR)。另外三名患者具有超过30％的坏死或部分应答(PR)。总应答率 (CR+PR)为83％。与过去对超过10,000名经历经动脉化疗栓塞 (TACE)的患者的荟萃分析所报道的50％CR+PR的历史对照相比，这一结果明显更好。

实施例5.在用替拉扎明和经动脉栓塞治疗的具有其他肿瘤病变的患者中，未治疗 的病变的肿瘤缩小。

在I期临床研究中治疗的12名患者中，几名患者具有多个肿瘤病变并且不能在单一程序中治疗。一名患者具有三个最大直径分别为 15、26、10mm大小的病变。因为26和10mm病变彼此相邻以及考虑血管供应，介入放射科医师选择对26和10mm病变进行治疗。第一个程序时15mm的第三个病变未经治疗。当在第6周进行随访MRI 时，发现两个治疗的病变达到CR；并且第三个病变(在基线处为15 mm)的最大直径缩小到仅9mm。与该发现相一致的一个潜在的解释是，这两个病变的治疗诱导抗肿瘤免疫，其使得未治疗的病变更小。换言之，两个治疗的病变潜在地用作增强患者免疫系统以控制剩余肿瘤病变的癌症疫苗。

实施例6：使用替拉扎明和血管阻断剂在非肝脏组织中诱导肿瘤坏死。

诱导肿瘤坏死的另一种方法是应用于不太适合于栓塞程序的各种实体瘤。本实施例中诱导实体瘤低氧的方法是通过使用血管阻断剂，诸如DMXAA(5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸，也称为ASA404或 Vadimezan)或二苯乙烯衍生物，包括考布他汀A4、考布他汀A4磷酸酯或顺式-3,4',5-三甲氧基-3'-氨基二苯乙烯(二苯乙烯4a)。已证明这些化合物能够关闭肿瘤血流并诱导肿瘤低氧(Chaplin DJ，2006) (Tozer GM，2005)。在该实施例中，在肺癌异种移植模型中检查了替拉扎明和考布他汀A4或DMXAA的组合作为实例来检测其诱导肿瘤坏死的能力。

通过在BALB/c裸鼠中皮下注射NCI-H460人肺癌细胞以形成肿瘤异种移植物来生成肺癌小鼠模型，从而检测替拉扎明和两种血管阻断剂——考布他汀A4或DMXAA的组合。当平均肿瘤体积达到约 480-550mm³(直径1cm左右)并且肿瘤是实体瘤且大小渐增时，每周一次向荷瘤小鼠给予替拉扎明(30mg/kg，腹膜内)和考布他汀 A4(10mg/kg，静脉内)或DMXAA(20mg/kg，静脉内)共两个剂量，以确保该组合能够诱导肿瘤坏死。首先给予替拉扎明，然后3-5min 后注射考布他汀A4或DMXAA。这两种血管阻断剂均导致几乎立即关闭肿瘤血管。在第一次给药后，观察动物的任何异常情况，为期最多三周。

在第3周结束时处死经治疗的小鼠，并收获肿瘤以供通过H&E 染色进行组织学检查。大多数肿瘤表现出约50-70％的肿瘤坏死，而用生理盐水处理的对照肿瘤具有小于20％的坏死。图5中显示代表性的组织病理学图片。关键发现是治疗后大面积的肿瘤坏死，并且坏死肿瘤周围有强烈的炎性浸润。该结果与先前在HCC中的发现一致，即肿瘤坏死与强烈的炎性反应相关并因此能够加强抗肿瘤免疫。

一旦通过由替拉扎明与TAE或血管阻断剂的组合诱导的坏死肿瘤来完成自体肿瘤“疫苗接种”，则长期来看，由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，所诱导的T细胞群体可能最终仍然不能有效控制肿瘤。因此，提出使用检查点抑制剂作为维持疗法来消除肿瘤内的免疫抑制作用的组合。

实施例7：在肺癌模型中施用HABA、低氧诱导剂和免疫检查点抑制剂的组合

在研究施用免疫检查点抑制剂联合低氧激活的生物还原剂和低氧诱导剂的效果的研究中，在C57BL/6小鼠的皮下3LL肺同系癌症模型的治疗中施用抗-mPD-1、替拉扎明(TPZ)、考布他汀A4磷酸酯、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)及其各种组合。

雄性C57BL/6小鼠购自上海实验动物中心(SLAC，(Shanghai， China，SCXK 2012-0002)；年龄：6-8周；体重：18-22g)。将小鼠保持在恒温恒湿的SPF室内，每个笼子中有4只动物。温度为 20.5-24.5℃。湿度保持在40％-75％。光照周期包括12小时的光照和 12小时的黑暗。将小鼠保持在聚碳酸酯笼(325mm×210mm×180mm) 中。笼子垫底材料是玉米芯，每周更换两次。在整个研究期间，小鼠可以自由获取经辐照灭菌的干燥颗粒食物，并且自由获取无菌饮用水。

在37℃的5％CO₂的空气气氛中，将3LL肿瘤细胞作为单层培养物在补充有10％热灭活的胎牛血清和L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM 培养基中体外维持。每周两次通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞常规传代培养。收获在指数生长期生长的3LL肿瘤细胞并对接种进行计数。

C57BL/6小鼠在右胁下接种在0.05mL磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中的3LL肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)以供肿瘤发育。当平均肿瘤体积达到约455.64mm³时，在接种后9天开始治疗。图6显示了每个研究组中的治疗施用(“N”表示动物编号，“i.v.”表示静脉内注射，“i.p.”表示腹膜内注射)。基于体重调节给药量(0.1mg/10g)。当3LL同系模型的肿瘤大小在试验品治疗后11天时达到大约4000mm³时，将肿瘤手术切除并在10％福尔马林中固定以供H&E染色和用F4/80进行免疫标志物染色。

在修整后尽快将整个肿瘤组织放入10％中性缓冲福尔马林中。通过脱水、清洗、浸润将固定的组织加工成块。该程序可以通过自动组织处理器进行。为了制备福尔马林固定石蜡包埋的样品，遵循以下步骤。将熔融石蜡倒入包埋模具中。将处理过的组织放入该模具中，适用的包埋表面正面朝下(以避免生成气泡)。将包含组织的石蜡模具放在冷冻式载台上。然后使用切片机将石蜡块切成具有5μm厚度的切片。将合适的切片放入45℃蒸馏水浴中。通过载玻片将展开的切片从水浴中拉出，然后将载玻片风干。

对于苏木精和伊红(H&E)染色，将石蜡载玻片放入60℃的烘箱中约2小时，随后在室温下冷却。然后对石蜡载玻片进行脱蜡、H&E 染色、脱水、清洗和封固。使用永久性封固介质施加盖玻片。最后，对载玻片进行显微镜检查并拍摄照片。通过肿瘤坏死面积除以总肿瘤载玻片面积来进行肿瘤坏死百分比(％)的计算。

图7示出了如通过H&E染色所示，用包括抗mPD-1、替拉扎明(TPZ)、考布他汀A4磷酸酯、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA) 及其各种组合在内的试验品治疗后的肿瘤坏死率。星号(*)表示通过Mann-Whitney检验所确定的与媒介物组相比的统计学显著性 (P<0.05)。与媒介物组相比，TPZ、考布他汀A4磷酸酯和抗mPD-1 的组合显示肿瘤坏死率显著增加。图8提供了图7中描绘的数据。

虽然本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (4)

1.替拉扎明、考布他汀A4磷酸酯和PD-1免疫检查点抑制剂在制备增强对有需要的受试者中的实体瘤的免疫应答的方法的药物中的应用，所述实体瘤是以下肿瘤：肺癌，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用替拉扎明；

(b)向所述受试者施用考布他汀A4磷酸酯；以及

(c)向所述受试者施用所述PD-1免疫检查点抑制剂，其中所述PD-1免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体；

其中所述(a)、(b)和(c)以任何次序顺序或者同时进行。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述抗PD-1抗体选自：纳武单抗和派姆单抗。

3.根据权利要求1所述的应用，其中步骤(b)在步骤(a)之后进行。

4.根据权利要求1所述的应用，其中步骤(c)包括在步骤(b)之后两次或更多次施用所述PD-1免疫检查点抑制剂。

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