KR20180073557A

KR20180073557A - 조성물 및 그의 방법

Info

Publication number: KR20180073557A
Application number: KR1020187008261A
Authority: KR
Inventors: 수닐 바스카란; 모한 비쉬와라만
Original assignee: 인두스 바이오텍 프라이빗 리미티드
Priority date: 2015-09-19
Filing date: 2016-09-17
Publication date: 2018-07-02
Also published as: FI3349748T3; US10493088B2; AU2016322956B2; ES2969066T3; EP3349748A1; CN108697686B; JP6820323B2; EP3349748B1; US20180256621A1; AU2016322956A1; DK3349748T3; CA2999183A1; CA2999183C; WO2017046777A1; EP3349748A4; JP2018532724A; CN108697686A; KR102144385B1

Abstract

본 개시는 트리고포에노사이드, 비텍스, 아이소-비텍스, 비텍스-2-o-람노 사이드 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 상기 조성물을 사용하여, 이에 한정되는 것은 아니지만, 저혈압, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염과 같은 다양한 상태를 관리하는 방법에 관한 것이다.

Description

조성물 및 그의 방법

본 개시는 광범위하게 식물화학, 생명공학 및 생화학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시는 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물; 및 상기 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 상기 조성물을 사용하여 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증, 및 부비동염과 같은 다양한 상태를 관리하는 방법에 관한 것이다.

식물화학물질이 풍부한 호로파(Fenugreek, 학명 Trigonella foenum - graecum)는 전통적으로 음식, 사료 및 의학 식물로 사용되어 왔다. 호로파는 아유르베다(인도 전통 의학) 및 중국 의학에서 의학적 사용의 긴 역사를 가지고, 분만 유도, 소화 촉진을 포함하는 수많은 적응증에 대해, 그리고 대사 및 건강을 향상시키기 위한 일반적인 강장제로서 사용되어 왔다.

호로파는 그 화학적 구성성분이 풍부하다. 호로파 씨앗은 약 45-60% 탄수화물류, 주로 점액성 섬유소(갈락토만난류); 라이신 및 트립토판이 높은 단백질류; 지질 같은 고정된 오일류; 피리딘-형 알칼로이드류, 주로 트리고넬린, 콜린, 겐티아닌, 및 카르파인; 플라바노이드류, 예컨대 아피게닌, 루테올린, 오리엔틴, 퀘르세틴, 비텍신, 및 아이소비텍신; 유리 아미노산, 예컨대 4-하이드록시아이소루신, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신; 칼슘 및 철; 가수분해에서 스테로이드성 사포게닌류를 수득하는 글리코사이드류와 같은 사포닌류(예컨대, 디오스게닌, 야모게닌, 티고게닌, 네오티고게닌); 콜레스테롤 및 사이토스테롤; 비타민 A, B1, C 및 니코틴산; 휘발성 오일류, 예컨대 n-알칸류 및 세스퀴테르펜류; 및 당류, 예컨대 라피노오스, 스타키오스, 수크로오스, 프룩토오스, 만노오스, 베르바스코스 및 자일로스를 함유한다. 씨앗은 또한 사포닌 페누그린(fenugrin) B 및 쿠마린 화합물을 함유한다. 씨앗은 또한 약 8%의 고정된 냄새가 역겨운 오일의 원인이 된다. 여러 C-글리코사이드 플라본류가 또한 호로파의 씨앗에서 확인되었다. 이들은 비텍신, 비텍신 글리코사이드, 및 오리엔틴(아이소-오리엔틴)의 아라비노사이드, 부수적인 스테로이드성 사포게닌류(페누그레에킨, 스밀라게닌, 사르사사포게닌, 유카게닌), 및 50%까지의 점액성 섬유소를 포함한다.

이들 상이한 화학적 구성성분들은 다양한 치료적 효과를 가진다. 스테로이드성 사포게닌 펩타이드 에스터인 페누그레에킨이라고 불리는 성분은 저혈당 특성을 가지고, 강화된 췌장 기능을 보였다. 이는 인간에서 위 배출을 지연하고, 탄수화물 흡수를 늦추고, 글루코오스 운송을 억제하도록 돕는다. 트리고넬린은 당뇨병이 없는 건강한 대상에서 저혈당 효과를 나타내는 것으로 제안된다. 스테로이드성 사포닌류(디오스게닌, 야모게닌, 티고게닌 및 네오티고게닌)는 콜레스테롤 흡수 및 합성을 억제함으로써 동맥경화에서 잠재적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 또한 이는 국부적으로 염증을 치료하기 위해, 그리고 동물에서 산후 수유를 촉진하기 위해 사용된다. 현재, 스테로이드 사포게닌인 디오스게닌은 피임약의 제조에 사용된다. 식물 페놀류는 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 소거 및 억제, 친전자체 소거 및 금속 킬레이션과 같은 그들의 항산화 특성에 주로 기인하여 잠재적인 건강 혜택을 가진다. 그들은 또한 항암, 항바이러스, 항균, 항염증, 혈압 강하 및 항산화 활성과 같은 약리학적 특성을 나타내는 것으로 보고되었다.

따라서, 호로파는 상이한 화학적 구성성분 및 치료학적 활성에 대해 연구된다. 호로파는 유럽, 예컨대 오스트리아, 프랑스, 독일, 그리스, 포르투갈, 러시아, 스페인, 스위스, 터키 및 영국(UK); 북아프리카, 예컨대 이집트, 에티오피아, 케냐, 모로코, 수단, 탄자니아 및 튀니지; 서아시아 및 남아시아, 예컨대 중국, 인도, 이란, 이스라엘, 일본, 레바논 및 파키스탄; 북아메리카 및 남아메리카 및 호주와 같은 다양한 지역에서 재배 작물로서 보고된다.

식물 성장 및 분포는 환경적인 요인에 의해 제한된다. 식물 성장 및 식물-화학적 분포에 영향을 미치는 환경적인 측면은 빛, 온도, 물(습도), 및 영양이다. 이들 환경적인 조건들은 전 세계에 걸쳐 상이한 지리적 위치에서 다르다. 그들은 유효 성분의 질과 양의 측면에서 식물 성장, 화학 물질 분포에, 그리고 유전적 다양성에 두드러진 효과를 나타냈다.

그러나, 개발 도상 인구의 지속적으로 증가하는 필요성에 기인하여, 몇 가지 용도를 위해, 호로파와 같은 생물학적 원료에서 얻을 수 있는 특정 성분을 확인하고 단리할 필요가 있다.

산소는 생명에 필수적이다. 탄수화물 및 지방산은 동물 세포에서 ATP를 생성하기 위해 가장 중요한 연료이다. 동물 세포에서 호흡은 산소에 의존한다. 연료 원천의 화학적인 결합으로부터 전자는 산소 및 수소 이온과 결합하여 물 및 이산화탄소를 형성한다. 세포들은 이 반응을 ATP의 생산과 결합시킨다. ATP의 형태인 고-에너지 인산염은 세포 내에서 수많은 합성 및 분해 과정에 필요하다. 이들은 인지질 전환을 위해 필수적인 막 운송, 단백질 합성, 지질생성, 및 탈아실화-재아실화 반응을 포함한다. 신체 기능은 혈액과 공기에서 낮은 수준의 산소에 영향을 받는다. 궁극적으로 이 감소된 공기 및 혈액 흐름은 폐를 통하여 산소 운송에 영향을 미친다. 폐에서 손상된 수준의 산소는 동맥 및 정맥에 고혈압을 야기하여, 조직의 흉터 및 비정상적 동맥 및 정맥 혈압을 발생시킨다.

연장된 또는 증가된 ATP의 고갈은 단백질 합성 장치의 구조적인 붕괴를 발생시키고, 이는 조면소포체(rough endoplasmic reticulum)로부터 리보좀을 탈착시키고, 폴리좀(polysome)을 모노좀으로 해리하여, 단백질 합성에서 결과적인 감소를 가져온다. 궁극적으로, 미토콘드리아 및 라이소좀 막에 비가역적 손상이 있으며, 세포는 괴사를 겪는다.

저산소증은 신체 또는 신체의 구역이 적절한 산소 공급이 되지 않는 병리학적 상태이다. 산소 수준이 장시간 동안 낮을 때, 폐동맥은 수축하고, 그 벽은 두꺼워진다. 이 수축과 농화(thickening)는 폐동맥에서 압력을 증가시킨다. 폐 조직의 양을 손상시키거나 감소시키는 폐 질환(예, 폐기종)은 또한 폐에서 혈관 수를 감소시킨다. 혈관의 감소된 수는 남은 혈관에서 압력을 증가시켜 폐고혈압을 야기한다.

폐고혈압(pulmonary hypertension, PAH)은 폐동맥에서 혈압이 정상 수준을 훨씬 넘고 생명에 위협이 될 수 있는 드문 폐질환이다. 이는 말초 폐동맥 순환의 혈관 리모델링을 특징으로 한다. 폐고혈압에서 보여지는 리모델링은 폐혈관 상피세포의 세포사멸사 및 증식 둘 다, 세포외 매트릭스 단백질의 침착 및 혈관주위 염증을 포함한다.

증가된 폐혈압은 전형적으로 심장의 왼쪽에 영향을 미치고 좌심실압을 상승시키는 질환에 의해 야기되고, 궁극적으로 폐혈관에서 상승된 압력으로 이어진다. 상승된 폐혈압은 폐포-모세혈관 벽에 급성 손상 및 후속적인 부종을 일으킬 수 있다. 지속적으로 높은 압력은 결국 폐포-모세 혈관 막의 벽의 비가역적 농화(thickening)로 이어져, 폐포 확산 용량을 감소시킨다. 대부분의 환자에서, 폐고혈압은 결국 우심실 비대에 이어 팽창 및 우심실 부전으로 이어진다. 우심실 부전은 운동 중 심박출량을 제한한다.

폐섬유증(pulmonary fibrosis, PF)은 폐의 흉터를 지칭한다. 폐섬유증은 폐고혈압의 발전을 촉진하는 폐혈관 리모델링과 연관된다. 그것은 조직을 흉터화함으로써 촉발된, 공기 주머니(폐포라고 불리는)의 벽이 두꺼워지는 폐 질병의 한 그룹을 설명하고, 산소가 혈액으로 들어가게 어렵게 한다. 낮은 산소 수준(및 딱딱한 흉터 조직 자체)은, 특히 걷고 운동할 때, 호흡 곤란을 유발할 수 있다. 폐섬유증은 폐에 대한 확인가능한 자극에 의해 유발될 수 있지만 많은 경우 원인을 알 수 없다.

기도 점액의 과분비는 점액성 섬모 청소율(muco-ciliary clearance)의 손상 및 세균 중복감염을 통해 호흡 부전으로 이어진다. 기도에서 뮤신류의 패밀리를 형성하는 점액 매트릭스의 주요 성분은 MUC5AC 및 MUC5B이다. 점액의 주요 성분들은 그들의 특징적인 점도, 접착력 및 탄성을 기도 분비에 제공하는, 크고 과도하게 당화된 단백질류(뮤신류)이다.

활성화된 호중구에서 방출된 반응성 산소종(ROS)은 인간 폐 점액상피세포주에서 상피 성장 인자 수용체의 전사촉진(transactivation)을 통해 뮤신 Muc5ac 합성을 일으킨다. 더욱이, 호중구 엘라스타아제는 산화-의존성 메커니즘에 의해 배양된 인간 기관지 상피 세포에서 Muc5ac의 과발현을 유도한다. 부비동염에서, Muc5ac 유전자에 의해 형성된 뮤신은 광대뼈 및 이마가 점액 분비에 의해 영향을 받는 상기도에서 막힌다.

급성 부비동염에서, 감염은 (며칠에 걸쳐) 빠르게 발전하고 짧은 시간 지속된다. 급성 부비동염의 대부분의 경우는 일주일 정도 지속되지만, 2-3주 지속되는 것도 드물지는 않다(즉, 대부분의 감기보다 길다). 때로는 더 길게 지속된다. 부비동염은 4-30일 정도 지속되는 경우 급성인 것으로, 4-12주 지속되는 경우 아급성인 것으로 취급된다. 그러나 만성 부비동염에서, 부비동염은 오래가고 12주 이상 지속된다.

현재 치료법

폐고혈압(PAH)에 대한 현재 치료법은 1) PDE5를 억제하거나, 2) 엔도텔린을 길항하거나, 3) 프로스타글란딘 경로를 외인성 프로스타사이클린으로 보충하는 약제를 포함한다. 이들 치료법은 PAH 환자를 위해 수명과 일상생활의 활동 수행을 향상시키지만, 폐 혈관 구조를 가차없이 변형시키는 진행 중인 세포증식 과정을 중단시키지는 않아 폐 이식으로 이어진다.

폐 재활 - 폐 재활은, 극심한 호흡곤란 없이 환자의 기능을 회복시키는 것을 목표로, PF 및 저산소증을 포함한 만성 폐 질병을 가진 사람들을 위한 체계적인 운동 프로그램이다. 전형적으로, 폐 재활은 컨디셔닝(conditioning); 운동 훈련 및 호흡 운동; 불안, 스트레스 및 정서적 관리; 영양 상담; 교육; 및 기타 구성요소를 포함한다.

폐 이식 - 폐섬유증은 지금 미국에서 폐 이식의 주요 적응증이고; 2013년에, PF는 수행된 모든 폐 이식의 거의 절반을 차지했다. 이식은 다른 중요한 건강 문제가 없는 환자의 수명과 삶의 질을 모두 향상시킬 수 있다.

N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC): NAC는 자연적으로 발생하는 항산화제이다. 과거에는 NAC가 일부 형태의 PF에서 발생하는 "산화적 부상"으로부터 폐를 보호하는데 도움이 될 수 있다고 생각되었다. 2014년에, 임상 시험이 NAC가 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)에 실질적인 유익한 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다.

닌테다닙(Nintedanib, Ofev®): 닌테다닙은 미국에서 IPF를 치료하도록 승인된 항섬유증 약물이다. 임상 시험에서 닌테다닙은 경도에서 중등도 IPF에서 폐기능의 감소를 늦추는 것으로 나타났다. 하루 두 번씩 경구 섭취된다.

이러한 치료법은 PF 환자의 수명과 일상생활 활동의 수행을 향상시키지만, ILD 또는 PF 및 폐 이식으로 이어지는 공기 주머니 및 기도에 영향을 미치는 폐 조직의 흉터화를 중단시키지 않는다.

통증과 발열을 완화하기 위한 파라세타몰(paracetamol)이나 이부프로펜 (ibuprofen); 막힌 코를 완화하기 위한 충혈 완화제 및 식염수 비강 스프레이 또는 점적제와 같이, 부비동염에 대한 처방전 없이 구입할 수 있는 의약품들이 있다. 이러한 약제는 즉각적인 완화를 제공하지만 상기도에서 점액 형성을 중단시키지 못한다. 부비동염으로 이어지는 점액 형성 및 코 막힘을 막는 방식으로 질병 진행을 예방할 수 있는 약물을 개발할 필요가 있다.

선행 기술:

CN103304605A는 고속 역류 크로마토그래피(HSCCC, high speed counter-current chromatography) 분리 기술을 이용하여 호로파로부터 플라보노이드 글리코사이드 및 스틸벤 글루코사이드형 화합물을 제조하는 방법이 개시되어, 분리 시간이 효과적으로 단축되고 통상적인 제조 방법의 복잡한 조작, 샘플 탈흡착 손실, 낮은 수율 등의 단점들이 극복된다. 이 방법에 따르면, 기술이 단순하고, 재생산성이 높으며, 분리 효율이 높고; 수득된 모노머 함량이 96.0퍼센트보다 높다. 상기 문헌은 글리코사이드 및 글루코사이드를 수득하기 위한 효율적인 공정을 중심으로 돌아간다.

WO2009121155A2는 우울증, 우울증과 관련된 질병, 공포증, 주의력 결핍, 약물 남용, 행동 부조화, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 편두통과 같은 모노아민 산화효소와 관련된 질병, 기능장애 및 교란의 치료에 유용한 약제의 제조에서 화학식 (I)의 벤조피라논 화합물을 개시한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 질병은 다른 항우울제로 통상적인 치료에 반응하지 않는 주요 우울증 또는 우울 증상을 포함한다.

CN103923074A는 호로파에서 비텍신 및 트리고넬린을 추출하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 특정 양의 호로파 씨앗 및 호로파 잎으로부터 20-35%의 수율로 비텍신 및 트리고넬린 함유하는 수 추출물을 수득하는 다양한 단계를 포함한다. 이 과정으로 비텍신과 트리고넬린의 추출율이 증가하고 비텍신과 트리고넬린의 추출 순도가 향상된다. 따라서, 이 문헌은 특허받은 방법으로 더 순수한 형태의 트리고넬린과 비텍신을 얻는 것에 중점을 두고 있다.

CN102920727A는 비텍신 람노사이드 및 비텍신 글루코시드가 풍부한 추출물을 제조하는 방법을 제공하며, 산사나무(hawthorn) 잎의 약초 추출 분야에 관한 것이다. 이 방법에 따르면, 비텍신 람노스사이드는 추출물의 30-55%를 차지하고 비텍신 글루코시드는 추출물의 10-35%를 차지한다. 이 문헌은 고순도의 두 성분을 얻는 것에 초점을 맞춘다.

Lamia Yacoubi 등(2011년 9월)은 래트에서 블레오마이신 유도된 폐섬유증을 억제를 위해 호로파(Trigonella foenum - graecum Linnaeus)와 그의 페놀성 추출물을 조사한다. 섬유화의 증가에 따른 상관관계가 발견되지 않아, 폐섬유증에서 염증에 대한 직접적인 역할은 거의 없음을 시사한다. 데이터는 첫 번째로 호로파의 폴리페놀이 강력한 항산화 활성을 나타내므로, 래트에서 블레오마이신 유도된 폐섬유증 모델에 대한 강력한 항염증 활성을 가짐을 제안하며, 두 번째로 그들은 염증 외에 다른 인자들이 아마도 폐섬유증의 병인을 방해한다는 것을 확인한다는 것을 제안한다.

Madhesh Murugesan 등(2011년 9월)은 호로파의 투여가 심근 손상의 범위를 줄이는데 더 효과적이며 래트에서 아이소프로테레놀 유도된 심근 경색동안 산화 스트레스에 유의하게 대항하였음을 보여준다.

그러나, 종래 기술 중 어느 것도 단독으로 또는 조합으로 산소 수준이 정상보다 낮게 감소되어 폐에서 산소 손상을 유발하여 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염과 같은 질병을 유발하는 상태의 치료에 사용하기 위한 조성물을 교시하고 있지 않다. 질병 진행을 중단시킬 뿐만 아니라 장기 이식의 단계로 장기가 손상되는 것을 예방할 수 있는 안전하고 효과적인 요법(regime)을 개발할 필요가 있다.

따라서, 본 개시는 선행 기술에서 관찰된 다양한 단점을 극복하고, 그리고 이에 한정된 것은 아니지만, 호로파와 같은 원료로부터 특정 활성 성분을 가진 조성물에 도달하고, 아미노산류, 알칼로이드류, 사포닌류 등과 같은 모든 다른 유효 성분을 제거하는 방법을 제공한다. 본 개시의 조성물은, 이에 한정된 것은 아니지만, 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염과 같은 상태를 관리하는데 효과적이다.

따라서, 본 개시는 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물; 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 수득하기 위한 방법으로서, 상기 방법은: (a) 조성물의 박편화된 원료 물질을 제 1 용매로 추출하여 제 1 추출물을 수득하는 단계, (b) 제 1 추출물을 제 2 용매로 처리하여 제 2 추출물을 수득하는 단계, (c) 제 2 추출물을 제 3 용매로 재추출하여 맑은 추출물을 얻는 단계, (d) 맑은 추출물을 농축시켜 고체 덩어리를 수득하는 단계, (e) 고체 덩어리를 수성 용매에 용해시켜 맑은 용액을 수득하는 단계; (f) 흡착제를 용매로 재생하고 세정하여 재생되고 세정된 흡착제를 수득하는 단계; (g) 재생되고 세정된 흡착제를 통과하여 맑은 용액을 통과시키고, 흡착제를 용매로 재세정하고, 알코올성 용매로 용리하여 용리물을 수득하는 단계, 및 (h) 용리물을 농축시키고 약학적으로 허용되는 부형제를 선택적으로 첨가하여 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 조성물을 수득하기 위한 방법; 및 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질병을 관리하는 방법으로, 상기 방법은 관리가 필요한 대상에게 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 질병을 관리하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 포함되어 있다.

본 개시가 용이하게 이해될 수 있고 실제적인 효과를 나타내게 하기 위해, 첨부된 도면을 참조하여 예시된 바와 같이, 예시적인 실시양태가 참조될 것이다. 아래의 상세한 설명과 함께 도면은 본 명세서에 통합되어 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시에 따른 실시양태를 추가로 예시하고 다양한 원리 및 이점을 설명하는 역할을 한다.
도 1a 및 도 1b는 일 실시양태에 따른, 본 발명의 조성물에서 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1의 존재를 나타내는 HPLC 그래프이다.
도 2a는 표준 트리고포에노사이드의 HPLC 그래프를 도시하고; 도 2b는 표준 비세닌-1의 HPLC 그래프를 도시하고; 도 2c는 표준 비텍신-2-o-람노사이드의 HPLC 그래프를 도시하고; 도 2d는 표준 비텍신의 HPLC 그래프를 도시하고; 도 2e는 표준 아이소비텍신의 HPLC 그래프를 도시한다.
도 3은 일 실시양태에 따른, 말초 혈액 산소 함량(맥박 산소, Pulse Ox)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 일 실시양태에 따른, 호흡 빈도(Frequency of Breathing (f))에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 일 실시양태에 따른, 강화된 중지(Enhanced Pause, P_enh)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6a는 우심실(Right Ventricular) dP/dt_min에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이고; 및 도 6b는 일 실시양태에 따른 우심실(Right Ventricular) dP/dt_max에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7a는 수축률 지수(Contractility Index)에서의 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이고, 도 7b는 일 실시양태에 따라, 타우(Tau)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은 일 실시양태에 따른, 흡기시간(Inspiratory Time)(T_i)에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 일 실시양태에 따른, 호기시간(Expiratory Time)(T_e)에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 일 실시양태에 따른, 강화된 중지(Enhanced Pause)(P_enh)에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 일 실시양태에 따른, 말초 혈액 산소 함량(Pulse Ox, 맥박 산소)에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12는 일 실시양태에 따라, 폐에서 Muc5ac m-RNA 발현에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 일 실시양태에 따라 폐에서 NF-κB m-RNA 발현에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.

본 개시는 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 개시는 또한 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 수득하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:

a) 조성물의 박편화된 원료 물질을 제 1 용매로 추출하여 제 1 추출물을 수득하는 단계;

b) 제 1 추출물을 제 2 용매로 처리하여 제 2 추출물을 수득하는 단계;

c) 제 2 추출물을 제 3 용매로 재추출하여 맑은 추출물을 얻는 단계;

d) 맑은 추출물을 농축시켜 고체 덩어리를 수득하는 단계;

e) 고체 덩어리를 수성 용매에 용해시켜 맑은 용액을 수득하는 단계;

f) 흡착제를 용매로 재생하고 세정하여 재생되고 세정된 흡착제를 수득하는 단계;

g) 재생되고 세정된 흡착제를 통과하여 맑은 용액을 통과시키고, 흡착제를 용매로 재세정하고, 알코올성 용매로 용리하여 용리물을 수득하는 단계; 및

h) 용리물을 농축시키고 약학적으로 허용되는 부형제를 선택적으로 첨가하여 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 것인 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 개시의 한 실시양태에서, 상기 원료 물질은 식물 원료, 바람직하게 호로파(Trigonella foenum graecum)로부터 유래된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 제 1 용매로 추출하는 것은 약 3.8시간 내지 약 4.2시간, 바람직하게 약 4시간의 기간에서, 약 25℃ 내지 약 30℃, 바람직하게 약 25℃ 내지 약 27℃의 범위인 온도에서 수행되고; 상기 제 1 용매는 n-헥산, n-펜탄 및 n-헵탄을 포함하는 그룹으로부터 선택된 지방족 화합물, 바람직하게 n-헥산이다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 제 2 용매로 처리하는 것은 약 26℃ 내지 약 30℃, 바람직하게 27℃ 내지 약 29℃ 범위인 온도에서 역류 방식으로 수행되고; 상기 제 2 용매는 에틸 아세테이트이다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 제 3 용매로 추출하는 것은 약 7시간 내지 약 9시간, 바람직하게 약 8시간의 기간에서, 약 22℃ 내지 약 27℃, 바람직하게 약 22℃ 내지 약 25℃ 범위인 온도에서 수행되고; 상기 제 3 용매는 n-부탄올이다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 농축하는 단계는 진공 농축에 의해 수행된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 상기 수성 용매는 탈이온수이다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 상기 흡착제는 수지 베드, 바람직하게 앰버라이트(Amberlite) XAD-16이고; 흡착제를 세정하기 위한 용매는 아이소프로필 알코올, 에탄올 및 탈이온수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되고; 흡착제의 재세정을 위한 용매는 염화나트륨 식염수 및 물, 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되고; 그리고 상기 알코올성 용매는 에탄올 및 아이소프로필 알코올을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게 아이소프로필 알코올이다.

본 개시는 또한 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질병을 관리하는 방법으로, 상기 방법은 관리가 필요한 대상에게 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 질병을 관리하는 방법에 관한 것이다.

본 개시의 한 실시양태에서, 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 및 비세닌-1은 함께 약 8% w/w 내지 약 31% w/w 범위의 농도를 가지고, 섬유소는 약 69% w/w 내지 약 92% w/w 범위의 농도로 존재한다.

본 개시의 다른 실시양태에서, 트리고포에노사이드는 약 0.1% w/w 내지 약 8% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비텍신은 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w 범위의 농도로 존재하며; 아이소비텍신은 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비텍신-2-o-람노사이드는 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비세닌-1은 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w 범위의 농도로 존재하며; 섬유소는 약 69% w/w 내지 약 92% w/w 범위의 농도로 존재한다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 검, 과립화제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 감미제, 첨가제, 용매, 활택제, 항점착제, 대전 방지제, 항산화제, 계면활성제, 점도강화제, 식물 셀룰로오스 물질, 착색제, 향료, 코팅제, 가소제, 방부제, 현탁제, 유화제 및 구형화제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 고체 경구 제제, 액체 경구 제제, 흡입 제제, 비강 제제, 비경구 제제, 식물약제, 건강 기능 식품 및 식품 재료 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 투여형태로 제제화된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 트로키제, 로젠지, 분산성 분말, 분산성 과립 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 액체 경구 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 점적제, 경질 또는 연질 겔 캡슐 중의 에멀젼, 시럽, 엘릭서 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 비경구 제제는 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 근육 내 저장소(depot), 피하 주사, 경피 주사 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 흡입 제제는 흡입기, 건조 분말 흡입기, 네뷸라이저(nebulizer) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 비강 제제는 비점적제, 비강 스프레이 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 상기 대상의 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위, 바람직하게는 상기 대상의 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg의 범위인 투여량으로 투여된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 상기 대상의 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 ㎍/kg의 범위, 바람직하게는 상기 대상의 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 약 25 ㎍/kg 범위의 투여량으로 스프레이 또는 흡입기로서 투여된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 대상은 인간을 포함한 포유동물이다.

본 개시는, 본 명세서를 통해 "본 발명의 조성물(instant composition)"로 지칭되는, 트리고포에노사이드, 비텍스, 아이소-비텍스, 비텍스-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 개시의 실시양태에서, 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드 및 비세닌-1은 함께 조성물의 약 8% w/w 내지 약 31% w/w을 구성하고, 섬유소는 조성물의 약 69% w/w 내지 약 92% w/w를 구성한다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 약 0.1% w/w 내지 약 8% w/w의 트리고포에노사이드, 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w의 비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w의 아이소비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w의 비텍신-2-o-람노사이드, 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w의 비세닌-1 및 약 69% w/w 내지 약 92% w/w의 섬유소를 포함한다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 약 10% w/w 내지 약 70% w/w 범위의 농도로 존재한다.

본 개시의 일 실시양태에서, 조성물은 생물 원료 물질로부터 수득된다. 한 예시적인 실시양태에서, 조성물은 식물 원료, 바람직하게 트리고넬라 포에눔 그라에쿰(Trigonella foenum-graecum)으로부터 수득된다.

본 개시의 비제한적인 실시양태에서, 조성물은 이에 한정된 것은 아니지만 호로파 기반 추출물을 포함하는 식물 추출물의 형태이다.

본 개시는 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 포함하는 조성물/추출물을 얻기 위한 간단하고, 비용 효과적이고 효율적인 방법을 제공한다.

한 비제한적인 실시양태에서, 조성물/추출물은 호로파(Trigonella foenum -graecum)로부터 수득되며, 조성물/추출물을 제조하는 방법은 호로파의 씨앗을 박편화기(flaker)에서 박편화하여 내부 코어를 노출시켜 평균 2 mm 크기의 박편을 수득하는 단계, 박편화된 씨앗을 일련의 추출 단계에 이어서, 추출물의 농축, 희석, 흡착, 크로마토그래피, 용리 및 농축, 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 활동을 수행하는 단계를 광범위하게 포함한다.

본 개시의 실시양태에서, 박편화 이후, 호로파 씨앗은 지방족 화합물인 제 1 용매로 추출된다. 한 예시적인 실시양태에서, 용매는 n-헥산, n-펜탄, n-헵탄을 포함하는 그룹으로부터 선택된 n-알칸, 바람직하게는 n-헥산이다. 이 단계는 약 3.8시간 내지 약 4.2시간, 바람직하게는 약 4시간의 기간에서, 약 25℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 27℃의 실온에서 수행되며, 지질 및 오일의 제거를 가능하게 한다.

제 1 용매로 추출 후, 수득된 추출물은 제 2 용매, 바람직하게는 에틸 아세테이트로 처리된다. 이 단계는 약 26℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 27℃ 내지 약 29℃의 온도에서 수행되고, 알칼로이드 및 다른 착색 불순물의 제거를 가능하게한다. 이어서, 약 7시간 내지 약 9시간의 범위에서, 바람직하게는 약 8시간의 기간에서, 약 22℃ 내지 약 27℃, 바람직하게는 약 22℃ 내지 약 25℃ 범위의 온도에서, 역류 방식으로 제 3 용매, 바람직하게 n-부탄올로 재추출된다. 이어서 수득된 추출물은 진공 농축되고 탈이온수에 용해되어, 이렇게 수득된 맑은 용액은 아이소프로필 알코올, 에탄올 및 탈이온수 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 용매로 재생되고 세정된 흡착제 수지를 통과시킨다. 컬럼/수지의 출구는 크로마토그래피, 바람직하게는 박층 크로마토그래피를 사용하여 모니터링한다. 전체 투명 용액이 흡착제 수지를 통과하면, 수지/컬럼은 염화나트륨 염수 및 물 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 용매로 세정되고, 에탄올 및 아이소프로필 알코올을 포함하는 그룹으로부터 선택된 용매, 바람직하게는 아이소프로필 알코올을 사용하여 용리된다. 그 후 용리물을 수집하고 농축시켜 본 개시의 조성물을 수득한다. 부형제는 최종 조성물에 선택적으로 첨가될 수 있다.

본 개시의 또 다른 비제한적인 실시양태에서, 조성물을 수득하는 방법은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소의 순차적인 첨가 및 결합하여 본 발명의 조성물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1은 함께 조성물의 약 8% w/w 내지 약 31% w/w를 구성하도록 첨가되고, 섬유소는 조성물의 약 69% w/w 내지 약 92% w/w를 구성하도록 첨가된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 방법은 약 0.1% w/w 내지 약 8% w/w의 트리고포에노사이드, 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w의 비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w 아이소비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w의 비텍신-2-o-람노사이드, 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w의 비세닌-1 및 약 69% w/w 내지 약 92% w/w의 섬유소를 결합하여 조성물을 얻는 단계를 포함한다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

한 예시적인 실시양태에서, 본 개시의 조성물은 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 질병 상태를 관리하기 위하여 사용된다.

본 개시는 관리가 필요한 대상에게 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질병 상태를 관리하는 방법을 더 제공한다.

본 개시의 한 실시양태에서, 용어 "관리하는" 또는 "관리"는 질병 상태 또는 장애 또는 악영향 또는 부작용의 예방, 치료 및 치유를 포함한다. 이 용어는 또한 최적 상태의 유지 및 질병 상태 또는 장애 또는 악영향 또는 부작용의 추가 진행의 예방을 포함한다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 대상은 인간을 포함하는 포유동물이다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 고체 경구 제제, 액체 경구 제제, 흡입 제제, 비강 제제, 비경구 제제, 식물약제, 영양 보조제 및 식품 재료 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 제제로 제제화된다. 상기 고형 경구 제제를 포함하는 그룹의 정제, 캡슐제, 트로키제, 로젠지, 분산성 분말, 분산성 과립 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고; 액체 경구 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 점적제, 경질 또는 연질 겔 캡슐 중 에멀젼, 시럽, 엘릭서 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되고; 비경구 제제는 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 근육 내 저장소, 피하 주사, 경피 주사 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 흡입 제제는 흡입기, 건조 분말 흡입기, 네뷸라이저(nebulizer) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 비강 제제는 비점적제, 비강 스프레이 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

본 개시의 비제한적인 실시양태에서, 조성물의 투여는 경구로 수행된다.

본 개시의 또 다른 실시양태에서, 본 개시의 조성물은 치료 효과를 얻기 위한 적합한 투여 제제로 제제화된다. 본 개시의 한 실시양태에서, 대상에 대한 본 발명의 조성물의 투여량은 산업에 대한 USFDA 지침에 따라 계산된다.

한 예시적인 실시양태에서, 조성물은 대상의 체중당 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 범위의 투여량, 바람직하게는 대상의 체중당 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg 범위의 투여량으로 투여된다.

또 다른 예시적인 실시양태에서, 조성물은 대상의 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 ㎍/kg의 범위의 투여량으로, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 약 25 ㎍/kg 범위의 투여량으로 스프레이 또는 흡입기로서 투여된다.

본 개시는 하기의 실시예의 도움으로 더 상세하게 설명된다. 그러나 이들 실시예는 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1(a): 호로파로부터 본 발명의 조성물의 제조

500g의 호로파 씨앗을 약 2mm 두께로 박편화하고, 약 4시간 동안 실온에서 약 3000ml의 n-헥산으로 추출하여 지질과 오일을 제거한다. 추출물을 2000ml의 에틸 아세테이트로 처리하여 알칼로이드 및 다른 착색 불순물을 제거한다. 이들 추출된 호로파 박편을 약 8시간 동안 역류 방식으로 약 2000ml의 n-부탄올로 재추출한다. 이 맑은 n-부탄올 추출물을 농축하여 약 6.5g 무게가 나가는 고체 덩어리를 얻은 다음 250ml의 탈이온수에 용해시켜 맑은 용액을 얻는다. 그 다음, 이 용액을 약 25ml의 Amberlite xad-16 수지를 함유하는 흡착제 수지 베드를 통과시키고, 이는 아이소프로필 알코올에 이어서 탈이온수로 재생하고 세정한다. 칼럼 출구를 다음 시스템에서 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 화합물의 부재에 대해 모니터링한다: 클로로포름(약 8ml) : 메탄올(약 2ml) : 물 약 1 방울. 일단 전량이 통과되면, 컬럼을 0.9% 염화나트륨 식염수로 세정한 후 약 250ml의 물로 세정한다. 칼럼을 약 250ml의 아이소프로필 알코올로 용리시킨 후, 용리물을 수집하고 농축시켜 약 1.4 g의 자유 유동성 엷은 갈색 분말을 얻고, 이는 트리고포에노사이드, 비텍스, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 포함하는 본 발명의 조성물이다.

더욱이, 분말이 상기 언급된 성분을 포함하는 것을 확인하기 위해, 분말을 HPLC 및 중량 측정법을 사용하여 분석한다.

HPLC 방법

샘플명: RD # FE 691

바이알: 1:A, 1

주입 #: 1

주입 부피: 20.00 ㎕

실행시간: 10:00 분

HPLC 수행시, 5개의 피크가 수득된다. 본 발명의 조성물의 HPLC 그래프가 도 1a에 도시된다. 이 피크들은 표준 HPLC 그래프(도 2a 내지 도 2e)와 비교하여 활성성분인 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드 및 비세닌-1과 일치하는 것으로 밝혀졌다.

HPLC를 사용하여 분석된 5가지 성분의 농도를 표준 프로토콜을 사용하여 HPLC 그래프로부터 계산하고, 하기 표 1에 제공한다:

샘플번호	성분	농도(%)
1	트리고포에노사이드	4.075
2	비텍신	3.415
3	아이소비텍신	2.800
4	비텍신-2-o-람노사이드	3.369
5	비세닌-1	1.554

표 1: 본 발명의 조성물에서 성분의 농도

중량 분석

프로토콜

수득된 분말 약 1 g에, 약 40ml의 아이소프로필 알코올(IPA)을 첨가하고, 약 30분 동안 실온에서 교반한다. 용액을 여과한 후, 투명한 IPA 추출물을 수득하고, 이를 수욕(water bath)에서 잔류물로 증발시키고 실온으로 냉각시킨다. 약 100ml의 아세톤을 상기 잔류물에 첨가하고 실온에서 약 30분 동안 교반한다. 이 용액을 와트만(Whatman) 여과지(사전에 칭량한 것)를 통해 여과하였다. 침전물을 약 2시간 동안 약 100℃에서 건조시킨 다음, 침전물과 여과지를 다시 칭량한다.

섬유소의 농도를 결정하기 위한 계산법:

침전물의 무게 = 침전물이 있는 여과지의 무게 - 여과지 무게

가용성 섬유소의 농도 = [(샘플의 초기 중량 - 침전물의 중량)/샘플의 초기 중량] × 100

이를 바탕으로, 수득된 가용성 섬유소의 농도는 약 77%로 결정된다.

실시예 1(b): 호로파로부터 본 발명의 조성물의 제조 방법

호로파 씨앗 500g을 약 2mm 두께로 박편화한 다음, 약 3.8시간 동안 실온에서 약 3000ml의 n-헵탄으로 추출하여 지질 및 오일을 제거한다. 추출물을 약 2000ml의 에틸 아세테이트로 처리하여 알칼로이드 및 다른 착색 불순물을 제거한다. 이들 추출된 호로파 박편을 약 8시간 동안 역류 방식으로 약 2000ml의 n-부탄올로 재추출한다. 이 맑은 n-부탄올 추출물을 농축시켜 약 6.5g의 무게가 나가는 고체 덩어리를 얻고, 이어서 250ml의 탈이온수에 용해시켜 맑은 용액을 얻는다. 이어서, 이 용액을 약 25ml의 Amberlite xad-16 수지를 함유하는 흡착제 수지 베드를 통과시키고, 이를 에탄올에 이어서 탈이온수로 재생하고 세정한다. 칼럼 출구를 다음 시스템에서 박층 크로마토그래피를 사용하여 화합물의 부재에 대해 모니터링한다: 클로로포름(약 8ml) : 메탄올(약 2ml) : 물 약 1 방울. 일단 전량이 통과되면, 컬럼을 0.9% 염화나트륨 식염수로 세정한 후 약 250ml의 물로 세정한다. 칼럼을 약 250ml의 아이소프로필 알코올로 용리시킨 후, 용리물을 수집하고 농축시켜 약 1.2g의 자유 유동성 엷은 갈색 분말을 얻고, 이는 트리고노에포사이드, 비텍스, 아이소-비텍스, 비텍스-비텍신, 2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 포함하는 본 발명의 조성물이다.

HPLC 방법

샘플명: IND 830 플랜트 배치

바이알: 1:A, 7

주입 #: 1

주입 부피: 20.00 ㎕

실행시간: 10:00 분

HPLC 수행시, 5 개의 피크가 수득된다. 본 개시의 조성물의 HPLC 그래프를 도 1b에 도시된다. 이 피크들은 표준 HPLC 그래프(도 2a 내지 도 2e)와 비교하여 활성성분인 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드 및 비세닌-1과 일치하는 것으로 밝혀졌다.

HPLC를 사용하여 분석된 이들 5가지 성분의 농도는 표준 프로토콜을 사용하여 HPLC 그래프로부터 계산되고 하기 표 2에 제공된다:

샘플번호	성분	농도(%)
1	트리고포에노사이드	3.259
2	비텍신	1.300
3	아이소비텍신	2.094
4	비텍신-2-o-람노사이드	2.022
5	비세닌-1	0.679

표 2: 본 발명의 조성물에서 성분의 농도

중량 분석

프로토콜

수득된 분말 약 1g에, 약 40ml의 아이소프로필 알코올(IPA)을 첨가하고 실온에서 약 30분 동안 교반한다. 용액을 여과한 후, 투명한 IPA 추출물을 수득하고, 이를 수욕(water bath)에서 잔류물로 증발시키고 실온으로 냉각시켰다. 상기 잔류물에 약 100ml의 아세톤을 첨가하고, 실온에서 약 30분 동안 교반한다. 이 용액을 와트만(Whatman) 여과지(사전에 칭량한 것)를 통해 여과하였다. 침전물을 약 100℃에서 약 2시간 동안 건조시킨 다음, 침전물과 여과지를 다시 칭량한다.

섬유소의 농도를 결정하기 위한 계산법:

이를 바탕으로, 얻어진 가용성 섬유소의 농도는 약 79%로 결정된다.

실시예 2: 본 발명의 조성물의 제조 방법

약 0.1% w/w 내지 약 8% w/w의 트리고포에노사이드, 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w 비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w의 아이소비텍신, 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w의 비텍신-2-o-람노사이드, 및 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w의 비세닌-1을 순차적으로 첨가하여 조합하고, 69% w/w 내지 약 92% w/w의 섬유소를 임의의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 조합물에 첨가하여, 본 개시의 조성물을 수득한다.

실시예 3: 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염에 대한 본 발명의 조성물의 평가

폐고혈압(Pulmonary Hypertension, PAH)이 마취 하에서 모노크로탈린(Monocrotaline, MCT)(60 mg/kg)의 피하 투여에 의해 약 200-220g의 수컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 유도된다. 모노크로탈린(MCT)이 투여된 동물은 28일 동안 비히클(10 mg/kg 증류수, p.o.) 또는 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg, p.o.) 둘 중의 하나로 처리된다. 필요한 파라미터가 다양한 날짜에 평가된다.

동물 모델:

폐동맥 고혈압(PAH)은 내피세포 증식, 평활근 과형성과 비대 및 외막(adventitial matrix)의 팽창과 함께 폐동맥의 재형성(리모델링)을 특징으로 한다. 폐동맥 압력에서 증가, 우심실 비대증 및 최종 폐성심(eventual cor pulmonale)은 이 질병을 구성하는 복잡한 병리생리학의 징후이다. 우심실(RV) 보상 비대 및 RV 실패와 연관된 기능적, 구조적 및 분자적 변화의 연구에 자주 사용되는 모델은 모노크로탈린(MCT)을 가진 래트의 치료이다. 그것은 크로탈라리아 스펙타빌리스(Crotalaria spectabilis)의 씨앗에서 유래된 식물 독소이며, 간에서 혼합된 기능 산화효소들에 의해 생체 내 활성화되어 반응성 이-기능성 교차 결합 화합물 MCT 피롤을 형성한다. 폐는 간으로 멀어지는 첫 번째 주요 혈관층을 나타내기 때문에, MCT는 전신 혈관에 영향을 미치지 않으면서 폐 혈관에 선택적으로 독성을 나타낸다.

실시예 3.1: 저산소증에 대한 본 발명의 조성물의 평가

실시예 1(a)에서 수득된 본 발명의 조성물이 다음 실험에 사용된다.

저산소증의 평가는 하기의 파라미터를 사용하여 수행한다:

a. 말초 혈관 산소 함량

b. 폐 기능 측정

i. 호흡률

ii. 강화된 중지

래트의 말초 혈액 산소 함량(맥박 산소)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 영향:

맥박 산소측정은 특히 혈액 산소 포화도의 비침습적 연속 측정에 편리하다. 혈액 산소 모니터는 산소가 부하되는 혈액의 퍼센트를 표시한다. 보다 구체적으로, 산소를 운반하는 혈액 중의 단백질인 헤모글로빈의 퍼센트가 얼마나 많은 양으로 부하되는지를 측정한다.

데이터는 One-Way ANOVA에 이어서 Dunnett의 사후 테스트로 분석된다. 정상 대조군과 비교시 ^### P < 0.001이고, MCT 대조군과 비교시 ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001이다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 3에 도시된다(28일째(Day 28) 결과).

	정상 (Normal)	MCT 대조 (MCT Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40mg/kg)
맥박 산소 (% O₂포화도)	94.43 ± 0.57	90.57 ± 0.36^###	91.57 ± 0.75	93.57 ± 0.57^**	93.57 ± 0.36^**

표 3: 말초 혈액 산소 함량(맥박 산소: pulse Ox )에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 영향

관찰된 바와 같이, 말초 혈액 산소 함량은 28일째(Day 28)에 정상군에 비해 MCT 대조군에서 유의하게 감소한다(P < 0.001). 본 발명의 조성물로 처리하면, 특히 20mg/kg 및 40mg/kg의 농도에서 MCT 대조군 래트가 정상 수준에 도달하는 것과 비교하여 말초 혈액 산소 함량에서 유의한 증가가 나타난다(P < 0.01).

래트의 호흡 빈도( frequency of breathing )(f)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과:

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어서 Bonferroni의 사후 테스트로 분석된다. 개별적인 날짜에 정상군에 비교시 ^# P < 0.05, ^## P < 0.01이고, MCT 대조군에 비교시 ^* P < 0.05이고, 결과는 하기 표 4 및 도 4에 나타낸다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	MCT 대조 (MCT Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
0	222.67 ± 8.27	219.11 ± 11.92	222.30 ± 13.59	224.94 ± 8.63	235.67 ± 8.09
14	222.07 ± 9.59	182.71 ± 11.26^#	205.19 ± 13.32	196.93 ± 10.15	183.33 ± 10.32
28	224.04 ± 16.78	170.37 ± 11.25^##	200.86 ± 10.77	214.93 ± 8.90^*	215.56 ± 6.05^*

표 4: 래트의 호흡 빈도(f)에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

0일째에는 정상군뿐만 아니라 MCT 대조군의 호흡 빈도에서 유의한 차이가 없다는 것을 관찰할 수 있다. 호흡 빈도는 정상군에 비해 14일 및 28일의 피하 MCT 투여 후 MCT 대조 래트에서 유의하게 감소하였다(P < 0.05 및 P < 0.01). MCT 대조군과 비교했을 때, 호흡 빈도는 28일의 처리 후 본 발명의 조성물 처리군(20 mg/kg 및 40 mg/kg)에서 유의하게 증가하였다(P < 0.05).

쥐의 강화된 중지( P _enh )에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과:

P_enh는 일반적으로 동물이 호흡할 때 전신 흐름 혈량측정기로 들어오고 나가는 기류 패턴의 형태에서 변화를 평가하는데 사용되는 무차원 지수이다. 지수는 호기 중 파형 아래의 면적 분포의 변화에 민감하며, 정규화된 영역이 곡선의 시작 부근에서 증가함에 따라 비선형 방식으로 증가한다.

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어서 Bonferroni의 사후 테스트로 분석된다. 각각의날짜에 정상군과 비교시 ^## P <0.01이고, MCT 대조군과 비교시 ^* P <0.05, ^** P <0.01이고, 그 결과는 아래 표 5 뿐만 아니라 도 5에 도시된다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	MCT 대조 (MCT Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
0	0.89 ± 0.04	0.90 ± 0.04	0.93 ± 0.07	0.95 ± 0.08	0.96 ± 0.05
14	0.97 ± 0.12	1.28 ± 0.14	1.08 ± 0.21	1.15 ± 0.16	1.21 ± 0.19
28	0.89 ± 0.05	1.48 ± 0.18^##	1.22 ± 0.09	0.97 ± 0.20^*	0.93 ± 0.08^**

표 5: 래트의 강화된 중지( P _enh )에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰되는 바와 같이, 0일째에는 정상군 및 본 발명의 조성물(10mg/kg, 20mg/kg 및 40mg/kg) 처리군 뿐만 아니라 MCT 대조군의 강화된 중지에서 현저한 차이가 없다. 강화된 중지는, 정상군에 비교시, 피하 MCT 투여 28일 후 MCT 대조 래트에서 유의하게 증가한다(P < 0.01). MCT 대조군과 비교할 때, 이 강화된 중지는 28일째에 본 발명의 조성물(20 mg/kg 및 40 mg/kg) 처리군에서 유의하게 그리고 용량 의존적으로 감소한다(P < 0.05 및 P < 0.01).

결론:

상술한 결과로부터, 본 발명의 조성물은 혈중 산소 포화도를 효과적으로 정상화하여 혈액을 통해 산소를 운반하는 헤모글로빈의 퍼센트의 회복을 야기하는 것이 명백하다. 호흡률의 정상화는 본 발명의 조성물에 의한 적절한 산소 공급의 지표이다. 또한, 낮은 산소 수준의 경우 전신 흐름으로 들어오고 나가는 기류 패턴의 형태 변화를 정상화한다. 따라서, 모든 상술한 발견들은 본 발명의 조성물이 저산소증에 안전하고 효과적인 약물임을 입증한다.

실시예 3.2: 혈류역학 측정을 사용한 폐고혈압에 대한 본 발명의 조성물의 영향

실시예 1(a)에서 얻어진 본 발명의 조성물을 하기 실험에 사용하였다.

혈류역학 측정은 dP/dt_max, dP/dt_min, 수축률 지수 및 타우와 같은 많은 파라미터를 포함한다. 이러한 파라미터는 시간에 따른 수축기 혈압과 이완기 혈압의 비율과 같은 공기 흐름 압력을 더 자세하게 말하는 데 도움이 된다. 그들은 또한 심근 완화의 과정에 대한 설명을 허용하는 시간 상수(타우)를 통해, 압력 강하 및 그 분석에 대해 자세히 설명한다.

수축 성능은 수축률 지수 dP/dt_max에 의해 평가되는 반면, 이완 이상기능은 증가된 사후부하에 대응하여 유발된다. 이완기는 등량적 이완의 시간 상수(타우)와 최종 이완 압력-직경 관계(EDPDR)로 평가되고, 전자는 활동적인 이완을 평가하는 반면 후자는 심근 경직의 생체 내 측정이다. 심근 이완의 동적 과정은 구출기(ejection phase)에서 초기 충전 기간(early filling period)으로 진행된다.

래트의 우심실 dP / dt _max 및 우심실 dP / dt _min 에서 MCT 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 영향:

데이터는 One-Way ANOVA에 이어서 Dunnett의 사후 테스트로 분석된다. 정상군에 비교시, ^## P < 0.01, ^### P < 0.001이고, 각각의 날짜에 MCT 대조군과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001이다. 결과는 하기 표 6과 도 6a 및 6b에 도시된다.

	정상 (Normal)	MCT 대조 (MCT Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
dP/dt_max (mm Hg)	982.3 ± 46.15	1376.00 ± 94.80^##	1254.00 ± 66.92	1090.00 ± 55.16^*	1042.00 ± 65.86^**
dP/dt_min (mm Hg)	-746.6 ± 76.15	-1356.00 ± 66.02^###	-1105.00 ± 39.62^*	-1041.00 ± 33.43^**	-1021.00 ± 46.38^***

표 6: 래트의 우심실 dP / dt _max 및 우심실 dP / dt _min 에서 MCT 유도된 변경에 대 한 본 발명의 조성물의 영향

관찰된 바와 같이, MCT 피하 투여의 28일 후 정상군과 비교시 MCT 대조군에서 dP/dt_min뿐만 아니라 dP/dt_max에서 유의한 증가가 있었다(P < 0.01 및 P < 0.001). MCT 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물(20 mg/kg 및 40 mg/kg)의 투여는 유의하게 및 투여량 의존적으로 dP/dt_max를 감소(P < 0.05 및 P < 0.01)시키는 반면에, 본 발명의 조성물의 투여는 세 가지 투여량 모두에서 유의하게 및 투여량 의존적으로 MCT 대조군과 비교하여 dP/dt_min를 감소시킨다(P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001, reps.).

래트의 수축률 지수 및 타우에 대한 MCT 유도된 변화에 대한 본 발명의 조성물의 효과:

데이터는 One-Way ANOVA와 Dunnett의 사후 테스트로 분석된다. 28일째에 정상군에 비해서 ^### P < 0.001이고, MCT 대조군에 비해 ^* P < 0.05, ^*** P < 0.001이다. 나타났다. 결과를 하기 표 7 및 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.

	정상 (Normal)	MCT 대조 (MCT Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/ml)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/ml)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/ml)
수축률 지수 (Contractility index)	17.71 ± 0.91	8.28 ± 0.77^###	9.28 ± 0.42	11.57 ± 0.52^*	13.71 ± 0.71^***
타우(Tau) (ms)	14.71 ± 1.12	26.14 ± 1.10^###	25.00 ± 0.97	21.29 ± 0.86^*	18.57 ± 0.89^***

표 7: 래트의 수축률 지수 및 타우(tau)에서의 MCT 유도된 변화에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰된 바와 같이, 정상군과 비교하여, 수축률 지수에서 유의한 감소(P < 0.001) 및 MCT 대조군의 타우에서 유의한 증가(P < 0.001)가 있다. MCT 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물의 투여(20 mg/kg 및 40 mg/kg)는 유의하게 및 용량 의존적으로 수축률 지수를 정상화(P < 0.05 및 P < 0.001)시키는 반면, MCT 대조군과 비교하여, 28일째에 본 발명의 조성물(20 ㎎/㎏ 및 40 mg/kg) 처리는 타우(τ)에서 유의하게 및 용량 의존적으로 회복(P < 0.05 및 P < 0.001)을 나타낸다.

결론: 본 발명의 조성물은 수축기 혈압 및 이완기 혈압을 효과적으로 정상화시키고, 폐고혈압에서 매우 중요한 활성을 나타내는 수축률 지수 및 타우를 회복하게 돕는다.

실시예 3.3: 블레오마이신 유도된 폐섬유증에서 본 발명의 조성물의 평가

실시예 1(b)에서 얻은 본 발명의 조성물을 하기 실험에 사용한다.

블레오마이신 유도된 폐섬유증[PF]에서의 본 발명의 조성물의 평가는 하기 파라미터들을 사용하여 수행된다:

a. 폐기능 측정

i. 흡기시간

ii. 호기시간

iii. 강화된 중지(P_enh)

b. 말초 혈액 산소 함량

프로토콜:

폐섬유증(PF)은 케타민 마취 하에서 블레오마이신(BLM)(6 IU/kg)의 기관내 투여에 의해 수컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트(180-220 gm)에서 유도된다. 블레오마이신이 투여된 동물은 28일 동안 비히클(10 ㎎/㎏ 증류수, p.o.) 또는 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg, 경구) 중 하나로 처리된다. 모의군(sham group)은 케타민 마취 하에서 비히클(10 mg/kg 증류수, p.o.)의 기관 내 투여를 받는 동물을 포함한다. 필수 파라미터는 다양한 날짜에 평가된다. 폐기능 검사 및 혈액학의 변화된 수준은 본 발명의 조성물(20 mg/kg 및 40 mg/kg, p.o.) 처리에 의해 유의하게 회복된 것으로 나타났다(P < 0.01 및 P < 0.001).

동물 모델:

폐섬유화의 블레오마이신-설치류 패러다임은 인간 폐섬유증의 확립되고 널리 사용되는 대리 모델이다. 블레오마이신에 의해 유발된 폐 손상에 대해 널리 받아들여지는 메커니즘 중 하나는 ROS를 생성하는 능력이다. 블레오마이신은 DNA/Fe²⁺에 결합하여 복합체를 형성하는 것으로 알려진다. 이 DNA/Fe² ⁺/블레오마이신 복합체는 산화환원 사이클을 거치며 초과산화물 및 수산화 래디컬과 같은 ROS를 생성하여 섬유증을 시작한다.

래트의 흡기시간( T _i )에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 영향:

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어서 Bonferroni의 사후 검사로 분석한다. 각각의 날짜에, 정상군과 비교하여, ^## P < 0.01, ^### P < 0.001이고, 모의군(sham group)과 비교하여 ^$$ P < 0.01, ^$$$ P < 0.001이고, BLM 대조군과 비교하여, ^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001이다. 결과는 하기 표 8 및 도 8에 도시된다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
0	165.89 ± 14.77	152.02 ± 6.59	167.04 ± 8.98	130.65 ± 7.30	149.60 ± 9.69	137.16 ± 11.42
7	157.52 ± 16.55	166.34 ± 15.32	243.87 ± 11.30^##,$$	238.76 ± 14.36	231.27 ± 27.47	226.60 ± 21.74
14	168.70 ± 16.85	185.31 ± 13.52	277.20 ± 33.03^##,$$$	243.56 ± 28.10	220.63 ± 30.96	278.12 ± 11.08
21	161.75 ± 5.49	166.92 ± 7.63	302.64 ± 22.99^###,$$$	265.76 ± 7.34	234.43 ± 16.95	257.66 ± 17.99*
28	161.35 ± 12.37	169.21 ± 9.59	310.38 ± 24.17^###,$$$	241.26 ± 20.53^**	220.75 ± 6.74^**	220.87 ± 8.09^**

표 8: 래트의 흡기시간( T _i )에서의 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰된 바와 같이, 0일째에 정상군 및 모의군과 비교하여 BLM 대조군의 흡기시간에는 유의한 차이가 없다. BLM의 기관내 점적주입은 7일 이후 정상군 및 모의군과 비교하여 BLM 대조군 래트의 흡기시간을 유의하게 증가시킨다(P < 0.001). 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg)로 28일 처리는 28일째에 BLM 대조군과 비교하여 흡기시간을 유의하게 감소시킨다(P <0.01).

래트의 호기시간( T _e )에서 블레오마이신에 의해 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 영향:

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어 Bonferroni의 사후 검사로 분석된다. 정상군과 비교하여 ^###P < 0.001이고, 모의군과 비교하여 ^$$$P < 0.001이고, 각각의 날짜에 BLM 대조군에 비해 ^*P < 0.05, ^**P < 0.01, ^***P < 0.001이다. 결과는 하기 표 9 및 도 9에 도시된다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
0	202.57 ± 8.37	211.18 ± 12.50	242.41 ± 21.77	219.70 ± 16.18	199.82 ± 14.83	204.33 ± 28.00
7	219.74 ± 21.55	223.35 ± 18.16	95.17 ± 15.14^###,$$$	89.27 ± 6.75	104.56 ± 19.25	105.34 ± 10.25
14	188.33 ± 22.88	213.13 ± 5.44	95.10 ± 9.77^###,$$$	112.00 ±11.25	123.26 ± 37.88	115.38 ± 7.21
21	198.96 ± 15.80	227.40 ± 18.94	62.87 ± 13.15^###,$$$	122.97 ± 18.00^*	127.23 ± 15.92^*	143.64 ± 17.06^**
28	203.94 ± 6.11	195.54 ± 10.60	62.42 ± 10.09^###,$$$	142.87 ± 15.50^**	132.85 ± 17.11^*	170.43 ± 12.19^***

표 9: 래트의 호기시간( T _e )에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명 의 조성물의 효과

관찰된 바와 같이, 호기시간은 0일째엔 정상군 및 모의군 뿐만 아니라 BLM 대조군 그룹에서도 유의하게 다르지 않다. 그러나, 정상군과 모의군과 비교하여, 7일간의 기관내 BLM 점적주입 후 BLM 대조군 쥐의 호기시간에서 유의한 감소가 있다(P < 0.001). 이 감소된 호기시간은, BLM 대조군 래트와 비교하여, 본 발명의 조성물(10, 20 및 40 mg/kg)로 28일 처리에 유의하게 증가된다(P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001).

래트의 강화된 중지( P _enh )에서의 블레오마이신 유도된 변화에 대한 본 발명의 조성물의 영향:

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어서 Bonferroni의 사후 검사로 분석된다. 개별적인 날짜에 정상군과 비교하여, ^### P < 0.001이고, 모의군과 비교하여 ^$$$ P < 0.001이고, 그리고 BLM 대조군과 비교하여 ^*** P < 0.001이다. 결과는 하기 표 10 및 도 10에 도시된다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
0	0.81 ± 0.04	0.80 ± 0.04	0.97 ± 0.11	0.82 ± 0.07	0.77 ± 0.04	0.75 ± 0.04
7	1.0 ± 0.19	1.03 ± 0.18	1.28 ± 0.11	1.15 ± 0.15	1.00 ± 0.19	1.42 ± 0.08
14	0.93 ± 0.16	0.88 ± 0.07	1.36 ± 0.12	1.38 ± 0.22	1.42 ± 0.03	1.09 ± 0.19
21	1.02 ± 0.14	0.85 ± 0.09	1.80 ± 0.25^###,$$$	1.97 ± 0.11	1.46 ± 0.29	1.41 ± 0.14
28	1.04 ± 0.05	1.15 ± 0.04	2.71 ± 0.19^###,$$$	1.82 ± 0.22^***	1.74 ± 0.04^***	1.64 ± 0.10^***

표 10: 쥐의 강화된 중지( P _enh )에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰될 수 있는 바와 같이, 0, 7, 14일에 정상군 및 모의군 뿐만 아니라 BLM 대조군의 강화된 중지에 현저한 차이는 없다. 강화된 중지는 BLM 대조군과 비교하여 21일간 기관 내 BLM 점적주입 후 BLM 대조군 래트에서 유의하게 증가된다(P < 0.001). BLM 대조군과 비교할 때, 이 강화된 중지는 28일 후 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg)에서 유의하게 정상화된다(P < 0.001).

래트의 말초 혈액 산소 함량(맥박 산소: pulse Ox )에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과:

데이터는 Two-Way ANOVA에 이어서, Bonferroni의 사후 검사로 분석된다. 각 날짜에 정상군과 비교하여 ^# P < 0.05, ^### P < 0.001이고, 모의군과 비교하여 ^$ P < 0.05, ^$$$ P < 0.001이고, 그리고 BLM 대조군과 비교하여 ^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001이다. 결과는 하기 표 11과 도 11에 도시된다.

시간 (in Days)	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/ml)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/ml)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/ml)
14	95.75 ± 0.47	95.25 ± 0.62	91.50 ± 0.64^#,$	92.50 ± 1.32	94.25 ± 0.47	92.00 ± 1.35
28	96.00 ± 0.40	95.00 ± 0.70	87.75 ± 1.31^###,$$$	92.00 ± 1.47^*	93.00 ± 1.08^**	92.75 ± 1.10^**

표 11: 래트의 말초 혈액 산소 함량(맥박 산소)에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰된 바와 같이, 말초 혈액 산소 함량은 각각 14일 및 28일에 정상 및 모의군과 비교하여 BLM 대조군에서 유의하게 감소하였다(P < 0.05 및 P < 0.001). 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg)로 처리는 BLM 대조군 래트에 비해 14일째에 말초 혈액 산소 함량의 현저한 증가를 생성하지 않는다. 그러나, 본 발명의 조성물(10mg/kg, 20mg/kg 및 40mg/kg)의 28일간의 투여는 유의하게 및 투여량 의존적으로 억제하고(P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.01), 28일째에 BLM 대조군 래트와 비교하여 혈중 산소 함량에 BLM 유도된 감소를 회복한다.

결론:

흡기시간, 호기시간 및 혈중 산소 함량의 정상화와 같은 폐기능 검사의 회복과 본 발명의 조성물에 의한 강화된 중지는 폐섬유증 치료에서 그 효능을 입증한다.

실시예 3.4: 블레오마이신 -유도된 부비동염에서 본 발명의 조성물의 평가

실시예 1(b)에서 수득된 본 발명의 조성물을 하기 실험에 사용한다.

블레오마이신 유도된 폐섬유증에서 본 발명의 조성물의 평가는 하기 파라미터들을 사용하여 수행된다:

a. 폐에서 유전자의 RT-PCR 분석

i. Muc5ac

ii. NF-κB

래트의 폐에서 Muc5ac m- RNA 발현의 블레오마이신에 의한 변경에 대한 본 발명의 조성물 효과:

Muc5ac은 표면 상피의 배상 세포로부터 분비되는 주요 점액으로 간주된다. 점액 과잉생산은 호흡 질환에서 점액섬모 이상기능의 구성요소이며, Muc5ac은 이러한 질환에서 기도 상피 세포에서 두드러지게 발현된다. 블레오마이신에 반응하여 생성된 산화 스트레스는 기관지 상피 세포에서 Muc5ac 생산을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 표피 성장 인자 수용체의 활성화를 포함할 수 있는 과정이다. 본 연구에서, 블레오마이신은 Muc5ac의 폐 mRNA를 증가시키고 기도 상피층의 점액 형성 세포를 증가시킨다. 본 발명의 조성물은 블레오마이신 유도된 폐 Muc5ac 형성 및 상피 점액 형성 세포를 용량 의존적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

데이터는 One-Way ANOVA에 이어서 Dunnett의 사후 검사로 분석된다. 28일째에 정상군과 비교하여, ^### P < 0.001이고, 모의군과 비교하여 ^$$$ P < 0.001이고, BLM 대조군과 비교하여 ^* P < 0.05, ^*** P < 0.001이다. 결과는 하기 표 12 및 도 12에 표로 정리되어 있다.

	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
Muc5ac/β-액틴	0.36 ± 0.04	0.48 ± 0.09	2.17 ± 0.21^###,$$$	1.41 ± 0.13^*	1.04 ± 0.17^***	0.63 ± 0.08^***

표 12: 래트의 폐에서 Muc5ac m- RNA 발현에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰되는 바와 같이, Muc5ac m-RNA 발현은 28일째에 정상군 및 모의군과 비교하여 BLM 대조군 래트에서 유의하게 상향조절된다(P < 0.001). 본 발명의 조성물 (10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg)로 처리를 28일간 지속하면, BLM 대조군 래트와 비교하여 폐에서 Muc5ac m-RNA를 유의하고 투여량 의존적으로 하향조절한다(P < 0.05, P < 0.001 및 P < 0.001).

래트의 폐에서 NF - κB m- RNA 발현에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과:

블레오마이신에 의해 생성된 ROS의 또 다른 표적은, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8, 연구에서 조사된 것을 포함하여 많은 사이토킨 유전자를 조절하는 전사 인자인 NF-κB의 활성화이다. TNF-α 및 IL-1β도 차례로 NF-κB를 활성화시킬 수 있다. 블레오마이신은 폐에서 NF-κB의 활성화시켜, 폐 상피 세포가 NF-κB p65를 분비한다는 것을 제안한다(Chitra et al., 2013). 본 연구에서는 본 발명의 조성물 처리는 산화제 유도된 NF-κB 활성을 억제하는 항산화 잠재력을 통해 그 효과를 발휘하고, 이로써 폐섬유증의 블레오마이신 모델에서 항섬유증 효과를 발휘한다는 것을 밝힌다.

데이터는 One-Way ANOVA에 이어서 Dunnett 사후 검사로 분석된다. 28일째에 정상군과 비교하여 ^## P < 0.01, ^### P < 0.001이고, 모의군과 비교하여 ^$$ P < 0.01, ^$$$ P < 0.001이고, BLM 대조군과 비교하여 ^* P < 0.05, ^*** P < 0.001이다. 결과는 하기 표 13 및 도 13에 도시된다.

	정상 (Normal)	모의 (Sham)	BLM 대조 (BLM Control)	본 발명의 조성물 C1(10) (10 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(20) (20 mg/kg)	본 발명의 조성물 C1(40) (40 mg/kg)
NF-κB/β-액틴	1.04 ± 0.65	0.67 ± 0.12	2.99 ± 0.21^###,$$$	1.72 ± 0.14^*	0.95 ± 0.28^***	0.97 ±0.16^***

표 13: 래트의 폐에서 NF - κB m- RNA에서 블레오마이신 유도된 변경에 대한 본 발명의 조성물의 효과

관찰된 바와 같이, 28일째에 정상군 및 모의군에 비교하여 BLM 대조군의 폐 NF-κB m-RNA 발현에서 유의한 상향 조절(P < 0.001 및 P < 0.01)이 있다. 그러나, 본 발명의 조성물(10 mg/kg, 20 mg/kg 및 40 mg/kg)로 처리는 BLM 대조군 래트와 비교하여 BLM 유도된 상향 조절된 폐 NF-κB m-RNA 발현을 유의하게 하향 조절한다(P < 0.05, P < 0.001 및 P < 0.001).

결론: 점액 형성 유전자(Muc5ac, NF-κB)는 상기도의 공기 경로에서 부비동염을 활성화시킨다. 이들 유전자의 투여량 의존 하향조절은 부비동염의 치료에 본 발명의 조성물의 효능을 보여준다.

따라서, 본 개시의 실시예는 저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염과 같은 질병 상태 치료에서 본 발명의 조성물의 효능을 보여준다.

본 개시의 추가적인 실시양태들 및 특징들은 본 개시에 제공된 설명에 기초하여 당업자에게 명백하다. 본 명세서의 실시양태들은 상세한 설명에서 다양한 특징들 및 그들의 이로운 설명을 제공한다. 잘 알려진/종래의 방법들 및 기술들의 설명은 본 명세서의 실시양태들을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 생략된다. 특정 실시양태에 대한 전술한 설명은 현재의 지식을 적용함으로써 다른 사람들이 포괄적인 개념을 벗어나지 않고 이러한 특정 실시양태와 같은 다양한 용도를 위해 용이하게 변형 및/또는 적응시킬 수 있는 본 실시양태의 일반적인 성질을 완전히 나타내며, 따라서 이러한 적응 및 변형은 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에서 이해되도록 의도되고 의도되어야 한다. 여기에 사용된 표현 또는 용어는 설명을 위한 것이지 제한하려는 것이 아님을 이해된다. 따라서, 본 개시의 실시양태는 바람직한 실시양태의 측면에서 설명되지만, 당업자는 본 명세서의 실시양태가 본 명세서에 설명된 바와 같이 실시양태들의 사상 및 범위 내에서 변형하여 실시될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 "포함하는" 또는 "포함한"과 같은 변형은 사용된 곳마다 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하고, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 문맥 및/또는 적용에 적절하면 당업자는 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 치환은 명료함을 위해 본 명세서에서 명시적으로 설정될 수 있다. "적어도" 또는 "적어도 하나"라는 표현의 사용은, 하나 이상의 원하는 물체 또는 결과를 달성하기 위해 본 개시의 실시양태에서 사용되기 때문에, 하나 이상의 요소 또는 성분 또는 양의 사용을 제안한다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 장치, 기사 등의 논의는 전적으로 본 개시 내용의 문맥을 제공하기 위한 것이다. 이러한 사안 중 일부 또는 전부가 선행 기술 자료의 일부를 구성하거나 본 출원의 우선일 이전의 언젠가 존재했던 것으로 본 개시와 관련된 분야에서 공공의 일반적인 지식이었던 것을 인정하는 것으로 받아들여서는 안된다. 본원에서 이 개시의 특정한 특징에 대해 상당한 강조가 이루어졌지만, 다양한 변경이 이루어질 수 있고 많은 변경이 본 개시의 원칙에서 벗어나지 않고 바람직한 실시양태에서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 개시의 특성 또는 바람직한 실시양태에서 이들 변경 및 다른 변경이 본 명세서의 개시로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이로써 앞선 서술 내용은 단순히 개시의 예시이고, 제한이 아닌 것으로 해석되어야 한다는 것이 명백히 이해된다.

Claims

트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물.
트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 조성물의 박편화된 원료 물질을 제 1 용매로 추출하여 제 1 추출물을 수득하는 단계;
b) 제 1 추출물을 제 2 용매로 처리하여 제 2 추출물을 수득하는 단계;
c) 제 2 추출물을 제 3 용매로 재추출하여 맑은 추출물을 얻는 단계;
d) 맑은 추출물을 농축시켜 고체 덩어리를 수득하는 단계;
e) 고체 덩어리를 수성 용매에 용해시켜 맑은 용액을 수득하는 단계;
f) 흡착제를 용매로 재생하고 세정하여 재생되고 세정된 흡착제를 수득하는 단계;
g) 재생되고 세정된 흡착제를 통과하여 맑은 용액을 통과시키고, 흡착제를 용매로 재세정하고, 알코올성 용매로 용리하여 용리물을 수득하는 단계; 및
h) 용리물을 농축시키고 약학적으로 허용되는 부형제를 선택적으로 첨가하여 조성물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 원료 물질은 식물 원료, 바람직하게 트리고넬라 포에눔 그라에쿰(Trigonella foenum graecum)에서 유래된 방법.
제 2 항에 있어서,
제 1 용매로 추출하는 것은 약 3.8시간 내지 약 4.2시간, 바람직하게 약 4시간의 기간에서 약 25℃ 내지 약 30℃, 바람직하게 약 25℃ 내지 약 27℃의 범위인 온도에서 수행되고; 상기 제 1 용매는 n-헥산, n-펜탄 및 n-헵탄을 포함하는 그룹으로부터 선택된 지방족 화합물, 바람직하게 n-헥산인 방법.
제 2 항에 있어서,
제 2 용매로 처리하는 것은 약 26℃ 내지 약 30℃, 바람직하게 27℃ 내지 약 29℃ 범위인 온도에서 수행되고; 상기 제 2 용매는 에틸 아세테이트인 방법.
제 2 항에 있어서,
제 3 용매로 추출하는 것은 약 7시간 내지 약 9시간, 바람직하게 약 8시간의 기간에서, 약 22℃ 내지 약 27℃, 바람직하게 약 22℃ 내지 약 25℃ 범위인 온도에서 역류 방식으로 수행되고; 상기 제 3 용매는 n-부탄올인 방법.
제 2 항에 있어서,
농축하는 단계는 진공 농축에 의해 수행되는 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 수성 용매는 탈이온수인 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 흡착제는 수지 베드, 바람직하게 앰버라이트 XAD-16이고; 흡착제를 세정하기 위한 용매는 아이소프로필 알코올, 에탄올 및 탈이온수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되고; 흡착제의 재세정을 위한 용매는 염화나트륨 식염수 및 물, 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되고; 그리고 상기 알코올성 용매는 에탄올 및 아이소프로필 알코올을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게 아이소프로필 알코올인 방법.
저산소증, 폐고혈압, 폐섬유증 및 부비동염 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 질병을 관리하는 방법으로, 상기 방법은 관리가 필요한 대상에게 트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 비세닌-1 및 섬유소를 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병을 관리하는 방법.
트리고포에노사이드, 비텍신, 아이소비텍신, 비텍신-2-o-람노사이드, 및 비세닌-1은 함께 약 8% w/w 내지 약 31% w/w 범위의 농도를 가지고, 섬유소는 약 69% w/w 내지 약 92% w/w 범위의 농도로 존재하는 제 1 항에 청구된 조성물, 제 2 항 또는 제 10 항에 청구된 방법.
트리고포에노사이드는 약 0.1% w/w 내지 약 8% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비텍신은 약 0.5% w/w 내지 약 5% w/w 범위의 농도로 존재하며; 아이소비텍신은 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비텍신-2-o-람노사이드는 약 0.5% w/w 내지 약 7% w/w 범위의 농도로 존재하며; 비세닌-1은 약 0.5% w/w 내지 약 4% w/w 범위의 농도로 존재하며; 섬유소는 약 69% w/w 내지 약 92% w/w 범위의 농도로 존재하는 제 1 항에 청구된 조성물, 제 2 항 또는 제 10 항에 청구된 방법.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 검, 과립화제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 감미제, 첨가제, 용매, 활택제, 항점착제, 대전 방지제, 항산화제, 계면활성제, 점도강화제, 식물 셀룰로오스 물질, 착색제, 향료, 코팅제, 가소제, 방부제, 현탁제, 유화제 및 구형화제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제 1 항에 청구된 조성물, 제 2 항 또는 제 10 항에 청구된 방법.
제 10 항에 있어서,
조성물은 고체 경구 제제, 액체 경구 제제, 흡입 제제, 비강 제제, 비경구 제제, 식물약제, 건강 기능 식품 및 식품 재료 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 투여형태로 제제화되는 방법.
제 14 항에 있어서,
고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 트로키제, 로젠지, 분산성 분말, 분산성 과립 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 액체 경구 제제는 수성 또는 유성 현탁액, 에멀젼, 점적제, 경질 또는 연질 겔 캡슐 중의 에멀젼, 시럽, 엘릭서 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 비경구 제제는 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 근육 내 저장소, 피하 주사, 경피 주사 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 흡입 제제는 흡입기, 건조 분말 흡입기, 네뷸라이저(nebulizer) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되며; 비강 제제는 비점적제, 비강 스프레이 또는 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 10 항에 있어서,
조성물은 상기 대상의 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위, 바람직하게는 상기 대상의 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg의 범위인 투여량으로 투여되는 방법.
제 10 항에 있어서,
조성물은 상기 대상의 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 ㎍/kg의 범위, 바람직하게는 상기 대상의 체중의 약 1 ㎍/kg 내지 약 25 ㎍/kg 범위의 투여량으로 스프레이 또는 흡입기로서 투여되는 방법.
제 10 항에 있어서,
대상은 인간을 포함한 포유동물인 방법.