KR20180064190A

KR20180064190A - 섬단풍나무의 캘러스 유도 또는 증식용 배지 및 이를 이용한 캘러스 유도 또는 증식방법

Info

Publication number: KR20180064190A
Application number: KR1020160164526A
Authority: KR
Inventors: 박소영; 박병준; 김유아
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-06-14
Also published as: KR101925316B1; WO2018105936A1

Abstract

본 발명은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용 또는 증식용 배지를 제공한다. 본 발명자들은 섬단풍나무로부터 캘러스를 유도하고 캘러스 증식에 적합한 배양조건을 밝혀, 섬단풍나무의 대량 조직배양에 적합한 배양조건을 확립하였다. 이로 인해, 지역적 특성으로 대량생산이 어려운 섬단풍나무의 대량생산이 가능하다.

Description

섬단풍나무의 캘러스 유도 또는 증식용 배지 및 이를 이용한 캘러스 유도 또는 증식방법{Medium for callus induction or callus proliferation of Acer takesimense and a method for callus induction or callus proliferation using thereof}

본 발명은 섬단풍나무의 캘러스 유도용 또는 증식용 배지 및 이를 이용한 캘러스 유도 또는 증식방법에 관한 것이다.

울릉도는 한반도와 일본 사이의 동해에 위치한 화산섬으로 내륙과 격리된 지리적 위치 및 온난다습한 기후 등으로 한반도와 다른 식생형을 가지고 있다. 울릉도의 식물구는 한반도와 구분하여 울릉도 식물지구로 분리하고 있으며, 향나무, 후박, 동백 등 750종의 식물이 자생하고 있다(Lee 등, 2007). 울릉도 자생식물은 항산화 및 항염 활성 등, 다양한 기능성 활성이 높아 화장품 및 의약품 분야에서 다양하게 활용 될 수 있는 기능성 소재로서의 가치가 높다(김 등, 2013).

섬단풍나무(Acer takesimense)는 울릉도에서 자생하고 있는 식물로 플라보놀(flavonols), 플라본(flavones) 등의 플라보노이드(flavonoid) 함량이 높아 다양한 기능성을 가지고 있다(Chang과 Giannasi, 1991). 하지만 섬단풍나무는 섬에서 자생하고 있다는 지역적 특성으로 인하여 대량생산에 큰 어려움이 있다.

식물 세포 및 조직배양은 식물의 활성물질 대량생산에서 효과적인 생산방법으로 다양한 연구가 수행되고 있다. 조직배양은 유전적으로 우수한 개체를 선발하여 토양, 기후 등의 영향 없이 균일한 연료를 지속적으로 공급할 수 있다는 장점이 있다(Roberts 2007, Dagla 2012, Negi와 Saxena 2011).

따라서 본 발명에서는 섬단풍나무로부터 캘러스를 유도하고 캘러스 증식에 적합한 배양조건을 확립하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 플라보노이드 함량이 높은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 대량 조직배양에 적합한 배양조건을 확립하고자 예의 연구 노력 하였다. 그 결과 본 발명자들은 식물생장조절제의 종류 및 농도, 배지의 종류 및 배지 첨가물에 따라 캘러스 유도 또는 증식효과가 달라짐을 밝혔고, 이의 결과로써 섬단풍나무의 캘러스 유도 또는 증식에 적합한 배양 조건을 확립하게 되었다. 본 발명에서는 각 배양 조건에서의 캘러스의 생존율, 캘러스 유도율, 부정근 유도율 등을 측정하여 캘러스 유도 및 증식에 최적화된 배양 조건을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용(callus induction) 배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 증식용(callus proliferation) 배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 증식방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬단풍나무(Acer takesimense) 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용(callus induction) 배지를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 증식용(callus proliferation) 배지를 제공한다.

본 발명자들은 플라보노이드 함량이 높은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 대량 조직배양에 적합한 배양조건을 확립하고자 예의 연구 노력한 결과, 식물생장조절제의 종류 및 농도, 배지의 종류 및 배지 첨가물에 따라 캘러스 유도 또는 증식효과가 달라짐을 밝혔고, 이의 결과로써 섬단풍나무의 캘러스 증식에 적합한 배양 조건을 확립하게 되었다. 본 발명에서는 각 배양 조건에서의 캘러스의 생존율, 캘러스 유도율, 부정근 유도율 등을 측정하여 캘러스 유도 및 증식에 최적화된 배양 조건을 확인하였다.

본 발명에서 이용되는 섬단풍나무(Acer takesimense)는 울릉도 특산 식물로 직접 재배/채취하여 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 섬단풍나무 종자의 기내 발아율은 16%였고, 초대배양을 통한 기내 신초 발생율은 44%를 보였다. 본 발명의 초대배양 조건은 본 발명자들이 2015년 게재한 연구논문의 초대배양 조건을 따랐다(Park JA, Park BJ, Kim AH, Park SY, Paek KY (2015) Airlift Bioreactor System and Nitrogen Sources for Biomass and Antioxidant Compound Production from In Vitro Culture of Vitis flexuosa Plantlets. Hort. Environ. Biotechnol. 56(3):358-365).

본 명세서에서 “식물생장조절제”는 영양물질이 아닌 유기화합물로서 적은 양으로 식물생리과정을 억제, 촉진 또는 조절하는 물질을 의미한다. 식물생장조절제는 예컨대 옥신(auxin), 사이토키닌(cytokinin), 지브렐린(giberellin), 에틸렌(ethylene), 낙엽산(abscisic acid) 등이 있다. 이 중 옥신은 주로 뿌리형성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 대표적으로 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA (-naphthaleneacetic acid), IAA (indolacetic acid) 등이 있다. 2,4-D의 경우, 일반적으로 옥신 중 세포생장에 크게 영향을 미친다. 사이토키닌은 옥신과 함께 식물세포배양에서 필수적인 생장조절제인데, 대표적으로 키네틴(6-furfurylamino purine), 6-BAP (6-benzylamino purine), 지아틴(zeatin), 2-ip 등이 있다. 그 중 키네틴은 고압멸균한 정어리의 정자 DNA에서 분리한 물질로서 담배 캘러스 조직 배양시 유사분열과 세포분열을 촉진하는데 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 지브렐린의 식물성장효과와 관련하여 일본공개 특허 제1988-245668호 등에 개시되어 있다.

본 발명의 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용(callus induction) 배지는 MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지에 포함되는 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)의 혼합물이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 식물생장조절제로서 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)을 각각 0.2-0.8 mg/L, 0.2-0.8 mg/L 및 0.05-0.15 mg/L 농도로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 식물생장조절제로서 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)을 각각 0.5 mg/L, 0.5 mg/L 및 0.1 mg/L 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지에 포함되는 수크로스는 25-33 g/L, 젤라이트(gelrite) 1.8-2.8 g/L 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 수크로스 30 g/L, 젤라이트(gelrite) 2.3 g/L 및 식물생장조절제를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 캘러스 유도용 배지는 식물생장조절제로서 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)을 각각 0.2-0.8 mg/L, 0.2-0.8 mg/L 및 0.05-0.15 mg/L 농도로 포함할 수 있다.

본 발명에 따르며, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962)에 수크로스, 젤라이트 및 식물생장조절제를 첨가하고 HP를 5.8로 조절한 후, 고온 고압(예컨대, 110-130℃, 20-30분간)으로 멸균하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 증식용(callus proliferation) 배지는 MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 증식용 배지에 포함되는 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D)이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 식물생장조절제로서 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D)을 0.5-1.5 mg/L 농도로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 유도용 배지는 식물생장조절제로서 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D)을 1 mg/L 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 증식용 배지에 포함되는 수크로스는 25-33 g/L, 젤라이트(gelrite) 1.8-2.8 g/L 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 캘러스 증식용 배지는 수크로스 30 g/L, 젤라이트(gelrite) 2.3 g/L 및 식물생장조절제를 포함한다.

본 발명의 캘러스 증식용 배지는 캘러스 증식률을 향상시키기 위하여 시트르산(citric acid) 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 추가적으로 포함할 수 있다. 하기 실시예에서와 같이, 시트르산 또는 아스코르브산 처리군은 friable 캘러스 유도율이 높고, 갈변율이 낮게 나타났다. 반면, 이노시톨과 카제인 가수분해물 처리군은 갈변율이 각각 28%, 36%로 높아서 캘러스 증식에 적합하지 않았다(표 6 참조).

본 발명의 캘러스 유도용/증식용 배지의 성분은 상기에 개시된 성분 외에도 식물의 생장에 직·간접적으로 영향을 주는 물질들을 포함할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 예컨대, 고농도 세포 배양 및 이차 대사산물의 최종 용적생산성을 증가시키기 위해서 배지 내 고농도 탄소원(자당, 유당, 과당, 포도당 등)을 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)의 절편을 상술한 본 발명의 캘러스 유도용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 섬단풍나무의 캘러스 유도방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)에서 유도된 캘러스를 상술한 본 발명의 캘러스 증식용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 섬단풍나무의 캘러스 증식방법을 제공한다.

본 발명의 캘러스 유도 또는 증식방법은 상술한 본 발명의 캘러스 유도 또는 증식용 배지를 이용하는 방법으로서, 상기 배지와의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)의 절편을 청구항 제 1 항의 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 상기 캘러스를 청구항 제 5 항의 배지에서 배양하여 캘러스를 증식시키는 단계; 상기 캘러스를 배양하여 신초(shoot)를 유도하는 단계; 및 상기 신초를 발근배지(rooting medium)에서 배양하여 뿌리가 형성된 소식물체를 제조하는 단계;를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense) 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 섬단풍나무(Acer takesimense) 식물체의 제조방법은 상술한 본 발명의 캘러스 유도/증식용 배지 및 캘러스 유도/증식방법을 이용하는 방법으로서, 상기 배지 또는 방법과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용 또는 증식용 배지를 제공한다.

(b) 본 발명자들은 섬단풍나무로부터 캘러스를 유도하고 캘러스 증식에 적합한 배양조건을 밝혀, 섬단풍나무의 대량 조직배양에 적합한 배양조건을 확립하였다.

(c) 이로 인해, 지역적 특성으로 대량생산이 어려운 섬단풍나무의 대량생산이 가능하다.

도 1은 섬단풍나무 종자의 인 비트로 파종 및 초대배양 결과를 나타낸다. (A: 섬단풍나무 종자, B: 발아, C: 기외 재배 중인 섬단풍나무, D: 기내 배양묘)
도 2는 섬단풍나무의 캘러스 유도 결과를 나타낸다. A. 2,4-D 1 mg/L; B. 2,4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L; C. 2,4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L + BA 0.5 mg/L.
도 3은 섬단풍나무 캘러스 성장에 있어 식물 생장 조절제의 효과를 보여준다. A. PGR free; B. 2,4-D 1 mg/L; C. NAA 1 mg/L; D. 2,4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 키네틴 0.5 mg/L. B의 적색 원은 friable 캘러스를 나타낸다.
도 4는 배지 종류에 따른 섬단풍나무 캘러스 증식 결과를 나타낸다. A. MS; B. WPM; C. B5; D. SH
도 5는 첨가제(addctives)에 따른 섬단풍나무 캘러스 증식 결과를 나타낸다. A. 시트르산; B. 이노시톨; C. 아스코르브산; D. 카제인 가수분해물.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

식물재료

본 연구의 실험재료로는 섬단풍나무의 성숙종자를 사용하였다. 종피를 제거한 종자를 70% 에탄올에 30초간 침지한 후 2%(w/v) NaOCl에 15분간 종자의 표면을 살균하였으며, 표면 살균된 종자는 멸균수로 3회 세척하였다. 표면이 살균된 종자는 30 g/L의 수크로스가 첨가된 MS 배지에 치상하여 발아시켰다. 또한, 온실에서 재배 중인 섬단풍나무의 유식물체를 채취하여 초대배양을 하였다. 온실에서 채취한 유식물체는 종자 소독 과정과 동일한 방법으로 살균하여 0.1 mg/L의 6-벤질아데닌(benzyladenine, BA)과 30 g/L의 수크로스가 첨가된 MS 배지에 치상하였다.

캘러스의 유도

기내에서 발아한 유식물체의 자엽 절편체를 5 x 5 mm 크기로 잘라 배지에 치상하여 캘러스를 유도하였다. 캘러스 유도배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962)에 수크로스 30 g/L, 젤라이트(gelrite) 2.3 g/L 및 식물생장조절제를 첨가하고 HP를 5.8로 조절한 후, 121℃에서 25분간 고압으로 멸균하여 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다. 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D) 단용과 2,4-D, 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 혼용, 2,4-D, NAA 및 티디아주론(thidiazuron, TDZ) 혼용으로 사용하였다. 섬단풍나무의 잎 절편체는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 4회 반복하였으며, 4주 후 생존율, 캘러스 유도율, 부정근 유도율, 부정근의 수 등을 조사하였다.

식물생장조절제(plant growth regulators, PGRs)가 캘러스의 증식에 미치는 영향

섬단풍나무의 캘러스 증식에 적합한 식물생장조절제의 종류 및 농도를 선정하기 위하여 MS 배지에 30 g/L의 수크로스와 2.3 g/L의 젤라이트를 첨가하고 2,4-D, NAA, 6-벤질아데닌(BA), 키네틴(kinetin)을 단용 또는 혼용하여 배지에 첨가하였다(표 1). 캘러스는 페트리디쉬 당 9개씩 치상하여 4회 반복하였으며, 암조건 배양실에서 3주간 배양하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율, 부정근 유도율을 조사하였다.

섬단풍나무의 캘러스 증식을 위한 식물생장조절제(PGRs) 처리

NO	PGRs (mg/L)
NO	2,4-D	NAA	BA	키네틴
1	0	0	0	0
2	1.0	0	0	0
3	2.0	0	0	0
4	1.0	0	0.1	0
5	1.0	0	0	0.1
6	0	1.0	0	0
7	0	2.0	0	0
8	0	2.0	0.1	0
9	0	2.0	0	0.1
10	0.5	0.5	0.1	0
11	0.5	0.5	0	0.1

배지 종류가 캘러스의 증식에 미치는 영향

섬단풍나무의 캘러스 증식에 적합한 배지 종류를 선정하기 위하여 배지 종류를 MS (Murashige and Skoog), WPM, B5, SH로 달리 처리하였다. 모든 배지에는 1 mg/L의 2,4-D, 30 g/L의 수크로스, 2.3 g/L 의 젤라이트가 첨가되었으며, 캘러스는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 5회 반복하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율, 부정근 유도율을 조사하였다.

배지 내 첨가물이 캘러스의 증식에 미치는 영향

캘러스의 증식률을 향상시키기 위하여 배지 내에 시트르산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 카제인 가수분해물(casein hydrosylate), 이노시톨(inositol)을 각각 1 g/L를 처리하였다. 배지는 1 mg/L의 2,4-D, 30 g/L의 수크로스, 2.3 g/L 의 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 이용하였다. 캘러스는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 5회 반복하였으며, 암배양 조건으로 3주간 배양하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율, 부정근 유도율을 조사하였다.

실험결과

기내 파종 및 초대배양

섬단풍나무 종자를 소독하여 기내에 파종한 결과, 총 37개의 종자 중에 18개의 종자가 오염이 났으며, 19개의 종자가 생존하였다. 그 중 6개의 종자만 발아하여 유식물체로 발달하였다(표 2 및 도 1). 따라서 섬단풍나무 종자의 기내 발아율은 16%를 나타냈다.

온실에서 재배 중인 섬단풍나무의 신초를 초대배양한 결과, 총 25개의 절편체 중 15개가 생존하였으며, 11개의 절편체에서 신초가 분화하였다. 따라서 초대배양을 통한 기내 신초 발생율은 44%를 보였다.

섬단풍나무(Acer takesimense)의 인 비트로 파종(seeding) 및 초대배양(primary culture) 결과

처리	Inoculation (No. of explant)	생존		신초형성 (Shoot formation)
처리	Inoculation (No. of explant)	개수	%	개수	%
파종(Seeding)	37	19	51	6	16
초대배양 (Primary culture)	25	15	60	11	44

캘러스의 유도

식물생장조절제의 종류 및 농도가 섬단풍나무의 자엽 절편체로부터 캘러스 유도 효율에 미치는 영향을 구명하기 위하여 2,4-D, NAA, BA를 단용 또는 혼용하여 처리하였다. 그 결과, 절편체의 생존율과 캘러스 유도율 모두 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에서 각각 100.00%, 95.83%으로 가장 높았다(표 3). 또한, 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에서 유도된 캘러스의 부피가 가장 컸다(도 2). 반면에, 2,4-D 단용 처리와 2,4-D, BA 혼용 처리의 경우, 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에 비하여 캘러스 유도율이 낮고 부정근 발생률이 높아 캘러스 유도에 효과적이지 않았다.

섬단풍나무 캘러스 유도에 대한 식물생장조절제(PGRs)의 영향

PGRs (mg/L)			생존율(%)	캘러스유도율(%)	부정근 유도율(%)	부정근 수(ea)
2,4-D	NAA	BA	생존율(%)	캘러스유도율(%)	부정근 유도율(%)	부정근 수(ea)
1	0	0	95.29± 2.59	59.63± 12.83	58.23± 9.06	2.73± 0.66
0.5	0.5	0	78.33± 9.87	11.67± 6.60	51.67± 10.38	5.74± 1.47
0.5	0.5	0.1	100.00± 0.00	95.83± 3.90	25.35± 11.68	3.16± 0.86

식물생장조절제가 캘러스의 증식에 미치는 영향

섬단풍나무 캘러스 증식에 적합한 식물생장조절제의 종류와 농도를 구명하기 위하여 다양한 종류의 식물생장조절제를 농도별로 처리하였다(표 4). 그 결과, 2,4-D 1 mg/L 처리군에서 분화력이 우수한 friable 캘러스 유도율이 36.11%으로 가장 높았으며, 캘러스의 지름이 1.08 cm로 부피가 가장 많이 증가하였다. 또한, 갈변율이 8.33%로 처리군 중에서 가장 낮으며 부정근 형성이 되지 않아 캘러스 증식에 가장 적합한 처리로 선정되었다. 반면에 가장 처리군은 캘러스 색은 하얀색이었지만 캘러스가 딱딱하고 부정근이 형성되어 적합하지 않았다. 옥신류의 2,4-D와 NAA, 사이토키닌류의 BA 또는 Kinetin이 혼용된 처리군은 갈변율이 높아 캘러스 증식에 적합하지 않았다(도 3).

섬단풍나무 캘러스 증식에 대한 식물생장조절제(PGRs)의 영향

식물생장조절제 (mg/L)				Friable 캘러스 유도율 (%)	캘러스 지름 (cm)	갈변율 (%)	부정근 유도율 (%)
2,4-D	NAA	BA	키네틴	Friable 캘러스 유도율 (%)	캘러스 지름 (cm)	갈변율 (%)	부정근 유도율 (%)
0	0	0	0	0.00± 0.00	0.63± 0.23	33.33± 22.68	0.00± 0.00
1.0	0	0	0	36.11± 14.61	1.08± 0.11	8.33± 5.32	0.00± 0.00
2.0	0	0	0	2.78± 2.78	0.93± 0.03	16.67± 3.21	8.33± 2.78
1.0	0	0.1	0	22.22± 12.00	0.85± 0.05	8.33± 2.78	0.00± 0.00
1.0	0	0	0.1	2.78± 2.78	0.85± 0.05	11.11± 4.54	0.00± 0.00
0	1.0	0	0	0.00± 0.00	0.86± 0.05	8.33± 2.78	8.33± 5.32
0	2.0	0	0	0.25± 0.25	0.90± 0.05	16.67± 7.12	13.89± 5.32
0	2.0	0.1	0	27.78± 13.98	0.89± 0.03	16.67± 7.17	8.33± 5.31
0	2.0	0	0.1	13.89± 5.32	0.80± 0.09	8.33± 11.11	13.89± 13.89
0	0.5	0.1	0	11.11± 7.86	0.68± 0.01	22.22± 11.11	0.00± 0.00
0	0.5	0	0.1	5.56± 3.21	0.83± 0.06	41.67± 8.33	11.11± 4.54

배지 종류가 캘러스의 증식에 미치는 영향

캘러스 증식에 적합한 최적의 배지 종류를 구명하기 위하여 다양한 종류의 배지를 처리하여 3주간 배양하였다. 그 결과, 기존에 사용하던 MS배지에서 friable 캘러스가 발생하였으며, 갈변율과 부정근 형성율이 각각 16%, 12%로 다른 처리군에 비하여 낮아 캘러스 증식에 적합하였다(표 5). 반면에 WPM 배지는 부정근 형성률이 52%로 높고 캘러스 지름이 0.86 cm로 가장 낮았다. 또한, B5 배지는 갈변율이 52%로 처리군 중에서 가장 높아 캘러스 배양에 적합하지 않았다(도 4).

섬단풍나무 캘러스 증식에 대한 배지(medium)의 영향

처리	Friable 캘러스 유도율(%)	캘러스 지름 (cm)	갈변율(%)	부정근 유도율 (%)
MS	4.00± 4.00	1.13± 0.04	16.00± 7.48	12.00± 8.00
WPM	8.00± 4.90	0.86± 0.04	36.00± 7.48	52.00± 33.56
B5	8.00± 4.90	1.16± 0.04	52.00±1 2.00	12.00± 8.00
SH	0	1.10± 0.03	28.00± 4.90	20.00± 6.32

배지 내 첨가물이 캘러스의 증식에 미치는 영향

캘러스 증식률을 향상시키기 위하여 MS 배지에 시트르산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 카제인 가수분해물(casein hydrosylate), 이노시톨(inositol)을 각각 1 g/L를 처리하여 3주간 배양하였다. 그 결과, 시트르산 처리군에서 friable 캘러스 유도율, 캘러스 지름이 각각 28%, 1.45 cm로 가장 높았다(표 6). 또한, 갈변율과 부정근 유도율이 각각 8%, 16%로 가장 낮아 캘러스의 증식에 적합하였다(도 5). 아스코르브산 처리군는 시트르산 처리군 다음으로 friable 캘러스 유도율이 높고, 갈변율이 낮게 나타났다. 이노시톨과 카제인 가수분해물 처리군은 갈변율이 각각 28%, 36%로 높아서 캘러스 증식에 적합하지 않았다.

섬단풍나무 캘러스 증식에 대한 첨가제(addictives)의 영향

처리	Friable 캘러스 유도율(%)	캘러스 지름(cm)	갈변율(%)	부정근 유도율 (%)
시트르산	28.00± 13.56	1.45± 0.04	8.00± 4.90	16
이노시톨	8.00± 4.90	1.39± 0.02	28.00± 4.90	4.00± 4.00
아스코르브산	12.00± 8.00	1.16± 0.04	14.14± 6.32	0
카제인 가수분해물	4.00± 4.00	0.96± 0.05	36.00± 11.67	28.00± 13.56

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예 일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

Chang, C. S., &Giannasi, D. E. (1991). Foliar flavonoids of Acer sect. Palmata series Palmata. Systematic Botany, 225-241.

Dagla, H. R. (2012). Plant tissue culture. Resonance, 17(8), 759-767.

Lee, J. H., Cho, H. J., Lee, B. C., Oh, S. H., &Bae, K. H. (2007). Forest vegetation types and growth characteristics of Seongin-bong in Ulleung Island, Korea. Korean Journal of Agricultural and Forest Meteorology, 9(1), 37-48.

Negi, D., & Saxena, S. (2011). PLANT TISSUE CULTURE. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 47, 604-610.

Roberts, S. C. (2007). Production and engineering of terpenoids in plant cell culture. Nature chemical biology, 3(7), 387-395.

김현준, 이동준, 구자정, 최경, 박광우, 강신호, ... &이평재. (2013). 울릉도 민속식물 추출물의 항염증 효과. Korean J. Plant Res, 26(2), 169-177.

Claims

MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 유도용(callus induction) 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)의 혼합물인 것을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 수크로스는 25-33 g/L, 젤라이트(gelrite) 1.8-2.8 g/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 2 항에 있어서, 상기 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)는 각각 0.2-0.8 mg/L, 0.2-0.8 mg/L 및 0.05-0.15 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
MS (Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense)의 캘러스 증식용(callus proliferation) 배지.
제 5 항에 있어서, 상기 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D)인 것을 특징으로 하는 배지.
제 5 항에 있어서, 상기 수크로스는 25-33 g/L, 젤라이트(gelrite) 1.8-2.8 g/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 6 항에 있어서, 상기 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D은) 0.5-1.5 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 5 항에 있어서, 상기 배지는 시트르산(citric acid) 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)의 절편을 청구항 제 1 항의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 섬단풍나무의 캘러스 유도방법.
섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)에서 유도된 캘러스를 청구항 제 5 항의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 섬단풍나무의 캘러스 증식방법.
섬단풍나무(Acer takesimense) 유식물체(plantlet)의 절편을 청구항 제 1 항의 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
상기 캘러스를 청구항 제 5 항의 배지에서 배양하여 캘러스를 증식시키는 단계;
상기 캘러스를 배양하여 신초(shoot)를 유도하는 단계; 및
상기 신초를 발근배지(rooting medium)에서 배양하여 뿌리가 형성된 소식물체를 제조하는 단계;
를 포함하는 섬단풍나무(Acer takesimense) 식물체의 제조방법.