KR20180057754A - 항아토피 활성을 가진 발효대사체 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 증상 경감용 조성물에 대한 것이다.

Description

항아토피 활성을 가진 발효대사체 조성물{COMPOSITION COMPRISING FERMENTED EXTRACTS HAVING ANTI-ATOPIC ACTIVITY}
본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 증상 경감용 조성물에 대한 것이다.
구아바(Psidium guajava Linn)는 옛 잉카인들이 고산지대에서 기르고 즐겨 먹었던 것으로 도금양과(Myrtaceae)의 상록활엽 관목 또는 소교목으로 아메리카 열대지방이 원산이며, 아열대에까지 널리 분포되어 있다. 구아바는 영문으로 Guava, Guayabo 또는 Kuawa로 표시되며, 과일, 뿌리 및 잎은 오랫동안 민간의약으로 이용되어 왔다. 구아바는 관목 또는 교목으로 높이가 3~7m이며 가지를 많이 치고 잎은 마주나며 잎을 누르면 강한 향기가 나는 특성이 있다. 꽃은 지름 3cm정도로 꽃잎이 4개이며 잎겨드랑이에 달리고 대부분 하나씩 피지만 가끔 2~3개의 흰 꽃이 피는 경우가 있다. 열매는 공 모양 또는 달걀을 거꾸로 세운 모양이며 길이 5~12cm, 지름 5~7cm 정도이고 연한 붉은빛으로 익어 향기를 풍기며 작고 단단한 종자가 여러 개 들어 있다. 과육은 즙이 많고 달콤하며 비타민 C가 오렌지 보다 5배 이상 많고 비타민 A, B도 풍부해 과일 중에 "비타민 제왕"이라 불린다. 또한 구아바는 재배하기 쉽고 기온 및 토양 조건에 대한 적응 범위가 비교적 넓으나 열대에서 아열대의 중간 조건이 생육에 가장 적당한 것으로 알려져 있다.
구아바의 재배 환경적 특성과 생리적 특성은 지구 온난화로 인한 기후변화에 대처할 수 있는 매우 적합한 대체작물이며, 또한 고비용 시설하우스, 가온 등의 추가적인 시설을 전혀 필요로 하지 않는 무가온 식물로서 고비용 농산물의 생산 환경을 획기적으로 개선할 수 있는 저탄소 녹색성장에 적합한 친환경 식물이라 할 수 있다. 현재 우리나라에서 1991년부터 본격적으로 재배법이 연구되어 제주도, 의령 및 경기도 일대에서 재배되고, 현재 우리나라에 구아바의 토착화는 성공을 하였지만 대부분 관상용으로 사용되거나 열매만을 이용하여 소비되고 있으며, 구아바 잎을 이용한 가공제품은 미미한 수준이다. 구아바의 열매와 잎은 식용 및 기능성 소재로서 활용가치가 매우 높은 고부가가치 식물로서, 현재 국내에서는 식약청으로부터 구아바 잎 열수추출물이 식후혈당조절에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품으로 개별인정이 되어 있고, 일본에서는 구아바차 음료가 혈당조절용 특정 보건용 식품으로서 시판되고 있는 등 향후 고소득 작물로서 재배면적이 확대될 것으로 예측된다.
울금은 생강과의 식물인 울금(Curcuma longa Radix), 온울금(C. aromatica), 광서아출(C. kwangsiensis), 봉아출(C. zedoaria)을 포함한다. 보통 강황과 많이 비교되는데, 강황은 뿌리줄기인 반면 울금은 덩이뿌리를 사용해 건조한 것이다. 중국 남부와 인도, 오키나와를 비롯한 동남아시아지역에서 자생하거나 재배되며 우리나라의 중남부지역에서도 재배된다. 본래 울금이란 명칭은 술과 함께 섞으면 누렇게 금빛으로 변하기 때문에 붙여진 이름이며, 모양이 아술(莪?)과 비슷하고 말의 질병을 치료하므로 마술(馬?)이라 부르기도 하였다. 다른 이름으로 마술(馬述), 황울(黃鬱), 을금(乙金), 걸금(乞金), 옥금(玉金), 왕금(王金), 심황(深黃) 등이 있다. 이 약은 특이한 냄새와 자극성이 있으며 씹으면 침을 누렇게 물들인다. 맛은 맵고 쓰며 성질은 서늘하다. 울금은 기를 소통시키고 혈액순환을 도와 생리통, 생리 불순, 옆구리 통증을 완화시킨다. 또한 토혈, 코피, 피오줌을 치료하는 데에도 효능이 있으며, 정신을 맑게 하고 흉복부가 그득한 것을 없애주므로 담즙 분비 촉진과 담낭 결석 치료에도 쓰인다. 약리작용은 담즙분비, 배설 촉진, 관상동맥 안의 반괴 형성을 감소시킨다고 보고되었다. 생김새는 원뿌리줄기와 곁뿌리줄기로 나눌 수 있다. 원뿌리줄기는 난형이고, 곁뿌리줄기는 양끝이 원주형으로 약간 구부러지고 테가 있으며 측아(側芽)를 가진 것도 있다. 주피가 붙은 것은 황갈색이고 광택이 있다. 주피를 제거한 것은 어두운 적색이고 바깥면에 적색의 가루가 붙어 있다. 울금은 기원전부터 기록되어 있으며 염료와 식품 착색재로도 사용되었다. 인도 카레의 주원료로 알려져 있으며, 일본에서는 단무지 착색재로 울금을 이용하고 있다. 특히 세계적 장수마을로 알려진 일본 오키나와 일대에서 특용작물로 재배돼 건강식품으로 애용되고 있다.
잎새버섯은 은행나뭇잎처럼 생긴 갓들이 여러겹 겹쳐져 자실체 다발을 이루고 색은 흑색, 흑갈색, 회갈색, 백색이다. 갓 표면에는 방사상의 섬유무늬와 희미한 고리무늬가 있고 밑면의 관공은 백색, 길이 1~3mm, 자루에 내린형이고, 구멍은 원형이다. 가을에 참나무류 등 활엽수류 생입목, 고사목의 밑동부위에서 사물기생하여 다발로 발생한다. 일찍부터 그 희소성 때문에 숲의 보석이라고 불렸는데, 최근에는 혈당 저하, 콜라겐 합성 촉진, 정장작용 및 골다공증 예방 등에 탁월한 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 초석잠은 국화과에 속하는 여러해살이 풀로서, 풀아래 잠들어 있는 누애와 같다고 해서 붙혀진 이름이다. 네 개의 모를 가지고 있는 줄기는 곧게 서서 1m 안팎의 높이로 자라며 약간의 가지를 친다. 잎은 길쭉한 타원 꼴에 가까운 피침 꼴로 잎자루가 있으며 마디마다 2장의 잎이 마주 자리한다. 밑동은 둥글고 끝이 뾰족하며 가장자리에는 무딘 톱니를 가지고 있다. 꽃은 층층으로 뭉쳐 피어나는데 전체적으로는 이삭처럼 보인다. 꽃은 입술처럼 생겼고 아래 입술이 세 개로 갈라진다. 분홍빛으로 피는 꽃의 크기는 12~15mm이다.제주도를 포함한 전국 각지에 분포하며 다소 습한 풀밭에 난다.온몸에 땀이 나게 하고 호흡을 조절해주며 지혈과 종기를 가시게 하는 효능이 있다. 적용질환은 감기를 비롯하여 두통, 인후염, 기관지염, 폐병을 치료하는 데 쓴다. 또한 피를 머물게 하는 작용을 하기 때문에 코피나 토혈, 소변과 대변에 피가 섞이는 증세, 월경과다와 월경불순, 자궁염 등을 다스리는 약으로도 쓰인다. 그밖에 종기가 났을 때에도 치료약으로 사용한다.
오디는 뽕나무 또는 산뽕나무의 열매로 상실(桑實)·오들개라고도 한다. 지름 약 2cm로서 처음에는 녹색이다가 검은빛을 띤 자주색으로 익는다. 상실(桑實)·오들개라고도 한다. 지름 약 2cm로서 처음에는 녹색이다가 검은빛을 띤 자주색으로 익는다. 익으면 즙이 풍부해지며, 맛은 당분이 들어 있어 새콤달콤하고 신선한 향기가 난다. 뽕나무는 예로부터 밭둑이나 산골짜기에 많이 심었고 한국(중부지방)과 중국에서 주로 재배한다. 성분으로는 포도당과 과당·시트르산·사과산·타닌·펙틴을 비롯하여 비타민(A·B1·B2·D)·칼슘·인·철 등이 들어 있다. 강장제로 알려져 있으며 내장, 특히 간장과 신장의 기능을 좋게 한다. 갈증을 해소하고 관절을 부드럽게 하며 알코올을 분해하고 마음을 편안하게 하여 불면증과 건망증에도 효과가 있다. 그밖에 머리가 세는 것을 막아 주고 조혈작용이 있어서 류머티즘 치료에도 쓰며, 혈당과 콜레스테롤 저하 효과가 있다. 날로 먹거나 술 또는 주스를 담근다. 오디술은 예로부터 상심주·선인주라고 하여 귀하게 여겼는데, 빛깔이 곱고 유기산이 적어서 시지 않고 달콤하다. 약간 덜익은 열매로 담그는 것이 좋으며, 맛과 향을 더하기 위해 매실주나 석류주와 섞어 마시면 좋다. 농축액을 밀가루 반죽과 섞어 과자를 만들거나 저온으로 말려서 가루를 내어 먹기도 한다
율피는 밤을 싸고 있는 얇은 속껍질로서, 주성분은 탄닌, 식이섬유 및 미네랄류이며 수렴작용에 의한 보습효과, 항산화, 항염증 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 알레르기 질환의 일종으로 특히 유아기와 아동기에 주로 발생하며 심한 소양감을 동반하는 만성 염증성 피부질환이다. 구미, 유럽에서의 유병률은 20~35%로 매우 높으며 치료와 예방 방법이 개선되고 있음에도 불구하고 계속 증가하고 있다. 한국에서도 초등학생까지 아동의 아토피피부염 진단비율이 1995년 13.7%에서 2005년 29%로 두배 이상의 큰 폭으로 증가하였고 중증 환자의 비율도 증가하는 추세에 있는 것으로 보고되고 있다.
아토피(atopy)는 그리스어인 a-topos가 어원으로 '특이한', '부적당한' 또는 '비정상적인 반응' 등의 뜻을 가지고 있으며, 알레르기 반응을 일으키게 하는 면역물질(IgE, immunoglobulin E)을 쉽게 형성함으로써 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등을 잘 일으키는 유전적 경향을 나타낸다. 아토피피부염의 원인이나 발생기전은 아직 확실히 알려져있지 않으나 유전적, 환경적 요인, 여러 가지 면역학적 이상 등이 복잡하게 연관되어 작용한다고 알려져있다. 아토피 피부염의 임상적 특징은 크게 소양증(국한성 또는 전신성 가려움), 발진, 만성적 재발 등을 들 수 있다. 혈청 내 IgE 수치 향상, eosinophilia, basophilia의 자발적인 히스타민 분비 증가, CD23 발현 증가, CD8 suppressor 감소, Th2에 의한 IL-4, IL-5 분비 증가 등의 현상을 동반하기도 한다. 아토피 피부염은 연령대에 따라 유아형(생후 2~24개월), 소아형(3~4세에서 10세 전후의 소아), 사춘기 및 성인형(만 12세 이후)으로 분류되며 아토피 피부염은 대부분 IgE와 연관된 면역기전에 의해 발병되는데 특정 알러젠에 대한 즉시형 면역반응보다는 T 세포 이상에 의한 지연형 면역 반응이 관여하는 것으로 보고되어있다.
현재 아토피 피부염의 증상 완화를 위하여 사용되고 있는 치료방법으로는 환경개선, 스테로이드 외용제 처방, 보습제, 항히스타민제, 항생제 등이 사용되고 있으나 항히스타민제를 장기간 사용할 경우 내성이나 저혈압, 피부염, 소화기장애 등의 부작용을 일으킬 수 있어 지속적인 사용은 어려우며, 특히 스테로이드 외용제를 장기간 복용할 경우에는 고혈압, 심부전, 피부위축 또는 소아 환자의 성장 지연 등의 심각한 부작용이 일어날 수 있으므로 사용이 더욱 제한된다. 이처럼 발병환자의 삶의 질을 떨어뜨리며 근본적인 치료방법이 없는 아토피 피부염의 증상 완화를 위하여 부작용을 최소화하고 장기간 사용할 수 있는 천연물 자원을 탐색하고 개발하는 것이 시급한 것으로 판단된다.
대한민국 공개특허 제1020160088731호 대한민국 공개특허 제1020160123592호
본 발명은 구아바잎/울금/잎새버섯/초석잠/맥강/오디/율피 발효대사체 추출물을 포함하는 아토피 피부염 증상 경감용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 아토피 피부염 증상 경감에 유리한 발효대사체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 증상 경감용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물의 각 발효대사체 추출물의 함량은 10-90 중량% 범위에서 선택될 수 있으나, 바람직하게는, 구아바 발효대사체 추출물 40중량%, 오디 발효대사체 추출물 15중량%, 잎새버섯 발효대사체 추출물 15중량%, 초석잠 발효대사체 추출물 15중량%, 맥강 발효대사체 추출물 5중량%, 울금 발효대사체 추출물 5중량% 및 율피 발효대사체 추출물 5중량%이다.
본 발명의 조성성분 각각의 발효대사체를 제조하는 방법은 하기와 같다.
본 발명의 구아바 발효대사체는 건조된 구아바잎을 2-3cm 길이로 분쇄한 구아바잎 분말에 맥강분말 5중량%를 혼합하여 제조된 고체발효배지를 멸균한 다음, PDB 배지에서 배양한 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10중량% 접종하고 수분함량은 40-60%로 조절한 후, 온도 30℃, 상대습도 80% 조건에서 5일간 정치 배양하는 1단 고체발효단계를 거친 후 상기 1단 고체발효배지에 10배 가수하여 95℃에서 30분간 환류추출하고 여과 및 감압농축을 거쳐 20브릭스의 액상 추출물을 얻어, 이에 설탕 5%를 첨가하고 효모추출물 0.5%를 혼합하여 제조된 액체발효배지를 멸균한 후, PDB 배지에서 배양된 5종의 유산균혼합균주를 10% 접종하여 37℃의 온도에서 5일간 정치배양하는 2단 액체발효단계를 거친 다음, 100℃의 온도에서 10분동안 살균을 거쳐 여과 및 감압농축하여 제조된다(도 1).
상기 건조 구아바잎은 수분함량이 10%이하로 조절되는 것이 바람직하며, 건조 구아바잎을 2~3cm 크기로 분쇄함은 곰팡이균 생육에 가장 유리하기 때문이다. 상기 맥강분말은 곰팡이 생육 영양성분으로서 전분 35.25 중량%, 식이섬유 35.44중량%, 항암물질인 베타-글루칸 4.96중량%, 총 폴리페놀 2.25중량%, 조단백질 16.64중량%, 조회분 2.78중량% 및 유리당 2.68 중량%로 구성된 성분으로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 생육에 필요한 영양분을 제공할 뿐만 아니라 기능성을 배가시키는 두 가지 효과를 동시에 얻을 수 있는 배지재료이다. 맥강만을 발효기질로 하여 아스퍼질러스 오리재의 생육도를 조사한 결과 103CFU/g 정도의 균이 검출되었고, 항산화활성도 대조구에 비해 증가하여 우수한 발효기질임을 확인하였다.
상기 배지 멸균조건은 121℃ 온도, 1.5기압에서 15분간 멸균하는 것이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 오리재는 PDB배지에서 30℃의 온도로 5일간 진탕배양하여 준비하였다. 아스퍼질러스 오리재에 의한 1단 고체발효 조건 중 상대습도는 80%로 유지됨이 바람직한데 이는 1단 고체발효시 배지내 수분함량이 중요한 환경이기 때문이고 배지 수분을 40-60% 범위로 유지하기 위해 가장 바람직한 습도조건이다.
상기 2단 발효배지 접종을 위한 5종의 유산균혼합균주는 식용이 가능하고 기능성과 무독성이 인정된 균주로서 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus ), 락토바실러스 카제이( Latctobacillus casei) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)을 MRS에서 37℃온도, 24시간 정치배양하여 준비하는 것이 바람직하다.
상기 울금 발효대사체는 건조된 울금을 3-4cm 길이로 절단한 후 맥강분말을 5중량% 혼합하여 제조된 고체발효배지에 PDB 배지에서 배양한 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10중량% 접종하고 수분함량은 40-60%로 조절한 후, 온도 30℃, 상대습도 80% 조건에서 5일간 정치 배양하는 1단 고체발효단계와 상기 1단 고체발효기질 대비 70% 주정을 5배 첨가하여 실온에서 8시간 환류추출한 다음, 여과 및 감압농축하여 수분 5% 이하로 동결건조시킨 다음, 동결건조된 고체발효 울금 주정 추출분말 2)중량%, 울금분말 3중량%, 글루코오스 2중량%, 이스트 추출물 0.4중량%를 첨가하여 제조된 액체발효배지를 멸균한 후 바실러스 서브틸리스와 류코노스톡 메센테로이데스를 2% 접종하여 37℃에서 5일간 진탕배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축하고 동결건조하여 수분함량 5% 이하의 발효대사체 분말로 제조된다(도 2).
상기 건조된 울금은 곰팡이 생육에 필요한 산소공급을 용이하게 수분 함유량 10% 이하로 조절함이 바람직하고, 이를 3~4cm로 절단하여 곰팡이균 생육에 가장 유리한 재료 크기로 함이 바람직하였다. 첨가되는 맥강은 상기 구아바잎 발효배지에 첨가되는 맥강분말과 동일 성분이다. 상기 배지 멸균조건은 동일하게 온도 121℃ 및 1.5기압에서 15~20분간 멸균함이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 PDB배지에서 30℃, 120rpm의 조건에서 5일간 진탕배양하여 준비하는 것이 바람직하다. 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillius subtilis )는 NB배지에서 37℃, 120rpm, 2일간 배양하고, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mensenteroides )는 MRS 액체배지에서 37℃, 1일간 배양하는 것이 바람직하다.
울금 발효대사체의 커큐민 함량을 HPLC(waters. USA)를 사용하여 측정하였다. HPLC 조건으로 칼럼은 YMC-Pack ODS AM-303(4.6x250mm, YMC Co., Japan)이며 이동상은 아세토니트릴과 0.1% 아세트산 수용액의 50:50 혼합용액이며 유속은 1.0ml/min이었다. 검출 조건은 UV 420nm(Waters 2487 Dual Absorbance Detector, Waters Co., USA)이며 20ul의 분석시액을 주입하였다. 커큐민 표준품은 sigma사(USA)를 lmg/ml stock solution으로 제조하여 표준곡선을 작성한 다음 울금 발효체의 커큐민 함량을 정량하였다. 하기 표에서 확인되는 바와 같이 본 발명에서 개발된 제조방법에 따른 울금 발효대사체는 일반 울금에 비해 커큐민 함량이 약 11배 증가하였다. 울금 발효대사체의 커큐민 함량이 높은 것은 1단 고체발효에서 제조된 울금주정추출분말 2% 첨가에 기인된 것으로 사료된다.
울금 종류 커큐민 함량 (mg%)
일반 울금 495.42
울금 발효대사체 5,448.26
본 발명의 잎새버섯 발효대사체는, 건조된 잎새버섯을 1-3cm 길이로 분쇄한 후 중량대비 14배의 정제수를 가수하고 95℃에서 12시간동안 환류추출한 다음 여과 및 감압농축하여 얻어진 20브릭스의 잎새버섯 열수 추출물을 중량대비 1%의 글루코오스와 0.4%의 효모추출물을 첨가하고 멸균하여 액체발효배지를 제조한 다음, 락토바실러스 플란타룸과 류코노스톡 메센테로이드즈 배양액을 2%씩 접종한 후 30℃ 온도에서 3일간 정치배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축과 동결건조단계를 거쳐 제조된다(도 3).
우선 잎새버섯 열수추출물의 고형물 함량을 5브릭스, 10브릭스, 20브릭스로 조절한 후 MRS배지에서 전배양한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum )과 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides ) 유산균을 접종하여 30℃, 30일간 정치배양하면서 균 생육정도를 조사한 결과 20브릭스 농도에서도 유산균의 생육이 억제되지 않음이 확인되어 20브릭스 농도의 추출물을 사용하여 발효대사체를 제조하였다.
본 발명의 초석잠 발효대사체는 건조된 초석잠을 100 매쉬 이하로 분쇄한 후 중량대비 10배 가수하여 100℃에서 10시간동안 1회 환류추출한 다음 여과 및 감압농축하여 얻어진 15브릭스의 초석잠 농축액에 중량대비 글루코스 1% 및 효모추출물 0.4% 첨가하고 멸균하여 액체발효배지를 제조한 다음, 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10% 접종한 후 30℃온도에서 5일간 120rpm으로 5일간 진탕배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축과 동결건조 단계를 거쳐 제조된다(도 4).
상기 초석잠 발효대사체 제조를 위한 발효배지 원료로 건조 초석잠 그대로 사용하지 않고 열수 추출된 초석잠을 이용하는 것이 바람직하였는데, 초석잠의 열수추출농축액(15Brix)을 사용하여 아스퍼질러스 오리재로 발효시킨 초석잠 발효액은 초석잠분말로 발효시킨 것에 비해 총 폴리페놀, 스타키오스(stachyose), 조 사포닌 함량등이 높게 나타났다(표 2).
초석잠 원료 총폴리페놀 함량(%) 스타키오스 함량(%) 조사포닌 함량(mg%)
건조분말 2.93 12.25 93
열수추출 농축액
(15브릭스)
3.55
18.56
105
상기 맥강 발효대사체는 맥강 100g을 100℃에서 1시간 동안 살균한 후 냉각시키고, 물 100ml에 탈지분유 30g, 효모 5g, 포도당 2g을 용해시켜 100℃에서 10분간 살균한 후 상기 살균한 맥강과 혼합하여 발효기질을 준비한 다음, NB 배지에서 배양된 바실러스 서브틸러스를 발효기질 중량대비 10% 접종한 다음 40℃에서 3일간 배양하여 발효시킨 후 100℃에서 10분간 살균한 다음 70% 에탄올을 3배가하여 실온에서 5시간동안 추출한 다음 추출액을 여과한 후, 감압농축 및 동결건조 단계를 거쳐 제조된다(도 5).
맥강 주요성분은 전분 32-38 중량%, 조단백 17-18 중량%, 무기질 2-3 중량%, 유리당 2-3 중량%, 식이섬유 35-36 중량%, 베타글루칸 4-5 중량% 및 총 페놀 2-3 중량%이다. 이와 같이 맥강에는 생리활성 물질 뿐만 아니라 미생물 생육에 유용한 영양성분이 다량 함유되어 있어 발효기질로서 많은 장점이 있다.
본 발명의 오디 발효대사체는 착즙된 오디를 여과 및 감압농축하여 10-20 브릭스의 발효기질 용액을 제조한 다음, 락토바실러스 플란타룸 및 비피도박테리움 롱검을 2%씩 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양한 후, 에탄올을 혼합하여 저온침전 시킨 후 원심분리 및 감압농축하여 동결건조를 거쳐 제조된다(도 6),
오디를 착즙하여 감압농축한후 10, 15, 20브릭스 용액으로 조절한 다음 면역조절 기능이 보고된 락토바실러스 플란타룸 및 비피도박테리움 롱검을 접종하여 균생육 정도와 고형분 및 pH 변화를 조사한 결과, 10~20 브릭스에서 비슷한 특성을 아래 표와 같이 보이는 바 10-20 브릭스 모두 배지로 사용가능하다.
성분 배양시간에 따른 pH/고형분(Brix) 변화
0일 1일 2일 3일
10브릭스 5.03/10.0 4.02/5.0 3.95/3.7 3.8/3.8
15브릭스 5.03/15.0 3.87/9.7 3.91/6.1 3.82/5.8
20브릭스 5.04/20.0 4.10/14.1 3.92/8.5 3.80/8.3
오디발효액은 비발효오디 대비 당함량이 3배이상 감소하였고, 유기산 함량은 20배 증가하며, 유리 안토시아닌 색소는 2배 이상 증가하였다.
상기 율피 발효대사체는 건조율피 원료 중량대비 10배의 물을 가하여 90℃에서 4시간 2회 반복하여 환류추출한 다음 여과, 감압농축 및 동결건조하여 얻은 율피동결건조분말 1중량%, 맥강 1중량%, 유당 1중량%, 설탕 1 중량%를 첨가하여 발효배지를 제조한 다음, 살균하여 MRS 배지에서 배양된 락토바실러스 플란타룸 및 비피도박테리움 롱검을 2%씩 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양한 후, 에탄올을 혼합하여 저온침전 시킨 후 원심분리 및 감압농축하여 동결건조를 거쳐 제조된다(도 7).
본 발명의 조성물은 구아바잎, 오디, 잎새버섯, 초석잠, 맥강, 울금 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합으로, 추출용매로는 바람직하게는 물, C1 내지 C6의 유기용매에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있으며, 상기 C1 내지 C6의 유기용매는 C1 내지 C6의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 추출물 제조에 사용되는 용매는 더욱 바람직하게는 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 상기 알코올은 에탄올인 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직하게는 물과 에탄올을 혼합하여 60-80% 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 용매의 양은 추출대상인 상기 발효대사체 각 재료의 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 재료 총 중량의 1배-10배의 부피량으로 사용되고, 추출용매로서 에탄올을 사용할 경우 가장 바람직하게는 5-10배의 부피량이다.
본 발명의 추출물 추출온도는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃일 수 있고, 물을 사용할 경우 가장 바람직하게는 100℃일 수 있고(열수 추출), 에탄올을 사용할 경우 가장 바람직하게는 30-80℃일 수 있다(에탄올 추출).
본 발명의 추출물 추출시간은 특별히 제한되지 아니하나, 2시간 내지 6시간일 수 있으며, 물을 사용할 경우 가장 바람직하게는 5-6 시간일 수 있고, 에탄올을 사용할 경우 가장 바람직하게는 3-4시간일 수 있다.
본 발명 추출물은 공지의 천연물 추출법으로 추출될 수 있다. 예를 들어 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 가열추출 또는 환류추출법으로 추출할 수 있다. 본 발명의 추출단계는 1회 내지 3회, 바람직하게는 1회 내지 2회 반복 추출할 수 있고, 에탄올을 사용할 경우 가장 바람직하게는 1회 내지 23회 반복 추출할 수 있다.
본 발명의 추출물은 여과, 감압농축 및 동결건조의 공정을 통하여 분말화하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 조성물은 아토피 피부염 증상 경감 효능이 있다.
따라서 본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 증상의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 증상의 경감용 화장수, 로션, 크림, 연고 등의 피부외용제를 제공한다.
발명의 조성물은 분말제, 겔제, 연고제, 크림제, 또는 액제 및 고형제 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 피부 외용제 조성물에 배합되는 일반적인 성분들, 예를 들면 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 또는 향료 등과 적절히 배합하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 피부외용제는 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 상태에 따라 그 사용횟수를 달
리할 수 있다.
본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 및 식품 첨가제 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 차, 주스, 엑기스 파우치 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.
또한, 본 발명의 추출물 및 추출물 혼합을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 액상, 분말 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 식품 첨가물로 사용시에 원료에 대하여 0.1 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 5중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만, 본 발명에 따른 조성물의 100중량부당 30중량% 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 아토피 피부염 증상 치료 및 경감용 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 호로파 추출물, 야관문 추출물 및 남가새 추출물로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 추출물 또는 둘 이상의 추출물 혼합을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅방법에 다라 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 상기 발효대사체 추출물 혼합은 0.1 내지 5g 의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다.
본 발명의 발효대사체 추출물 혼합을 포함하는 조성물을 식품, 피부외용제 및 약제를 적용함으로써 부작용 없는 성분의 아토피 피부염 증상의 완화 및 치료에 획기적인 효과를 거둘 수 있다.
도 1은 구아바잎 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이고,
도 2는 울금 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 3은 잎새버섯 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 4는 초식잠 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 5는 맥강 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 6는 오디 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 7은 율피 발효대사체 제조 공정에 대한 모식도이며,
도 8은 비발효조성물 에탄올추출물(NFE)(A), 발효조성물 열수추출물(FCW)(B) 및 발효조성물 에탄올추출물(FCE)(C)의 세포독성에 대한 실험결과를 보여주는 그래프이며,
도 9는 비발효조성물 에탄올추출물(NFE)(A), 발효조성물 열수추출물(FCW)(B) 및 발효조성물 에탄올추출물(FCE)(C)의 아토피 피부염 관련 유전자 (TARC, MDC, CTACK)실험결과를 보여주는 그래프이며,
도 10은 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NF-κB 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 11은 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NF-κB p65의 핵 내로의 트랜스로케이션(translocation)에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 12는 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 IκB 단백질의 양에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 13은 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 TARC 유전자 발현에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 14는 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 STAT1의 Tyr 701 잔기의 인산화에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 15는 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 TARC 유전자 발현에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 16은 동물 실험 절차에 대한 모식도이며,
도 17은 NC/Nga 마우스의 체중변화에 대한 결과 그래프이고,
도 18은 NC/Nga 마우스의 귀 두께 변화에 대한 결과 그래프이며,
도 19는 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NC/Nga 마우스의 혈청내 IgE 양에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 20은 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NC/Nga 마우스 혈청내 IL-10 생성량에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도21은 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NC/Nga 마우스 혈청내 IgE 생성량에 대한 영향을 보여주는 도면이며,
도 22는 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 NC/Nga 마우스 혈청내 IL-4와 TNF-α 유전자 발현에 대한 영향을 보여주는 도면이다.
본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 <구아바잎 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도1의 공정도에 따라 구아바잎 발효대사체를 얻은 후 제조된 액체배양액을 100℃ 온도에서 10분동안 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 구아바잎 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 2 <울금 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도2의 공정도에 따라 울금 발효대사체를 얻은 후 제조된 액체배양액을 100℃ 온도에서 10분동안 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 울금 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 3 <잎새버섯 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도3의 공정도에 따라 잎새버섯 발효대사체를 얻은 후 제조된 액체배양액을 100℃ 온도에서 10분동안 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 잎새버섯 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 4 <초석잠 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도4의 공정도에 따라 초석잠 발효대사체를 얻은 후 제조된 액체배양액을 100℃ 온도에서 10분동안 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 초석잠 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 5 <맥강 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도5의 공정도에 따라 맥강 발효대사체를 얻은 후 5배의 물을 가수한 후 100℃ 온도에서 6시간동안 환류추출한 다음 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 맥강 발효대사체에 70%에탄올을 3배가하여 실온에서 6시간 환류 추출한 다음 여과, 감압농축 및 동결건조 하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다. 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 6 <오디 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도6의 공정도에 따라 오디 발효대사체를 얻은 후 이 액체배양액을 100℃온도에서 10분간 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 오디 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 7 <율피 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물의 제조>
도7의 공정도에 따라 율피 발효대사체를 얻은 후 이 액체배양액을 100℃온도에서 10분간 열처리한 후 여과, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물 분말을 제조하였다.
또한, 상기 율피 발효대사체에 동량의 에탄올을 첨가하여 4℃의 온도에서 12시간 침전시킨 후 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 8 <본 발명의 항아토피 발효조성물의 제조>
실시예 1 내지 실시예7에서 제조된 발효대사체 열수추출물 및 에탄올추출물 각각을 하기 표와 같은 비율로 혼합하여 발효대사체 열수추출물 조성물(FCW)과 발효대사체 에탄올추출물 조성물(FCE)를 제조하였다.
발효대사체 조성비율(중량%)
구아바 40
오디 15
잎새버섯 15
초석잠 15
맥강 5
울금 5
율피 5
제조예 1 <비발효 에탄올추출물(NFE)의 제조>
발효를 거치지 않은 구아바, 오디, 잎새버섯, 초석잠, 맥각, 울금 및 율피 분말 에탄올 추출하고 동결건조하여 얻은 각 추출물 분말을 상기 표4에서와 동일한 비율로 혼합한 조성물을 준비하였다.
제조예 2 <발효대사체 에탄올 추출물의 조성물(FCE)을 함유하는 화장수의 제조>
발효조성물 에탄올추출물 제형은 화장수로 개발이 적당한 것으로 사료되어, 아래 표5와 같이 제조하였다.
원료 단위 (중량 %)
발효조성물 에탄올추출물 50, 100 mg/mL
폴리에틸렌글리콜(400) 40
에탄올 30
정제수 잔량
합계 100
실험예1 : 세포독성 실험
피부에서의 염증반응 과정은 Th2 키모카인(chemokine)들에 의존적으로 일어나며, 키모카인들은 면역세포들을 조절하는데 관여함. TARC는 Th2 유형의 키모카인으로 피부세포, 수지상세포, 내피세포, 상피세포 등에서 만들어진다. 대식세포 유래 키모카인(Macrophage-derived chemokine) (MDC/CCL22)은 TARC와 밀접하게 관련되어 있으며, 수지상세포, B 림프구, 대식세포, 피부세포, 내피세포 등에 의해 생성된다. 최근의 연구에 따르면 아토피 피부염 환자의 혈청내 TARC와 MDC 키모카인의 양에 따라 아토피 피부염 유발이 결정된다고 알려져 있으며, 이들 키모카인들에 의해 여러 가지 질병들이 조절된다. CTACK/CCL27(Cutaneous T cell-attracting chemokine)는 피부에서 선택적으로 발현되며 아토피 피부염을 조절하는 키모카인인 것으로 알려져 있다.
발효조성물에 대한 아토피 피부염의 억제 효능을 평가하기 위해 먼저 비발효조성물 에탄올추출물(NFE), 발효조성물 열수추출물(FCW) 및 발효조성물 에탄올추출물(FCE)의 세포독성을 확인하였다. 각 조성물을 HaCaT 세포에 처리한 후 세포독성을 관찰한 결과, 비발효조성물 에탄올추출물(NFE)의 경우 10㎍/ml, 발효조성물 열수 추출물(FCW)과 발효조성물 에탄올추출물(FCE)의 경우 100㎍/ml 까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 8).
실험예2 : 아토피 피부염 관련 유전자 ( TARC , MDC , CTACK )의 발현에 미치는 영향
발효조성물이 인체 피부 각질 세포에서 아토피 피부염 관련 유전자 (TARC, MDC, CTACK)의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 TARC, MDC 및 CTACK의 유전자 발현이 비발효조성물 열수추출물과 발효조성물 에탄올추출물의 처리 농도 의존적으로 감소하였다. 비발효조성물 에탄올추출물의 경우 TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 TARC, MDC 및 CTACK의 유전자 발현에 영향이 없었다(도9).
실험예3 : NF - κB 루시퍼라아제 활성( luciferase activity)에 대한 영향
HaCaT 세포에 pGL3-NF-κB-Luc vector를 형질전환 시킨 뒤 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)과 TNF-α와 IFN-γ을 24시간 처리한 뒤 NF-κB 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)에 대한 영향을 조사한 결과, TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 NF-κB 전사활성이 발효조성물 에탄올추출물의 농도 의존적으로 감소하였다(도 10).
실험예 4: 핵 내로 이동되는 NF - κB 단백질 양 및 IκB 단백질의 양의 변화
핵 내로 이동되는 NF-κB 단백질 양을 측정한 결과 TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 NF-κB p65의 핵 내로의 트랜스로케이션(translocation)이 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 농도 의존적으로 감소하였다 (도 11). 또한, IκB 단백질의 양의 경우 TNF-α와 IFN-γ에 의해 데그라데이션(degradation) 되어 감소하며 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)에 의해 회복됨을 확인하였다(도12).
실험예5 : 전사조절인자 NF - κB 조절 여부
발효조성물 에탄올 추출물의 전사조절인자 NF-κB 조절 여부를 확인하기 위해 NF-κB 인히비터인 JSH-23을 처리하여 아토피 피부염 지표인 TARC 유전자 발현에 대한 영향을 측정하였다. TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 TARC 유전자 발현이 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)과 JSH-23의 단독과 동시처리에 의해 감소하였다(도 13).
실험예6
STAT1은 IFN-γ와 같은 사이토카인의 신호전달에 의해 활성화되어 각질세포에서 면역반응을 조절하는 핵심 전사조절인자이다. 발효조성물 에탄올 추출물(FCE)의 TARC의 생성 및 유전자 발현 억제효능 조절기전을 조사하기 위하여 STAT1에 대한 영향을 조사하였다. TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 STAT1의 Tyr 701 잔기의 인산화가 발효조성물 에탄올추출물(FCE)의 농도 의존적으로 감소하였다(도14).
실험예7
발효조성물 에탄올추출물의 전사조절인자 STAT1 조절 여부를 확인하기 위해 STAT1 억제자(inhibitor)인 AG490을 처리하여 아토피 피부염 지표인 TARC 유전자 발현에 대한 영향을 측정하였다. TNF-α와 IFN-γ에 의해 증가된 TARC 유전자 발현이 발효조성물 에탄올추출물(FCE)과 AG490의 단독과 동시처리에 의해 감소하였다(도 15).
실험예 8: 동물실험: 아토피 피부염 외적 증상의 경감
1) 실험조건
실험 동물
6주령 NC/Nga 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하여 2주간 안정화 단계를 거친 후 실험하였으며, 1% 또는 0.2%의 DNCB는 등과 귀에 도포하여 아토피 피부염을 유발하였다. 그 후 발효조성물 에탄올추출물 시료에 대한 억제 효능을 알아보기 위해 제조예 2에서 제조된 화장수를 농도별로 등과 귀에 도포하였으며 실험모식도는 아래와 같다(도16).
2) 실험결과
아토피 피부염 동물모델에서 발효조성물 에탄올추출물에 의한 아토피 피부염 억제 효과를 조사하기 위해 마우스에서의표피 두께, 진피 두께, 염증성 세포의 침윤 등의결과를 측정하였다.
DNCB에 의한 아토피 피부염 유발에 의해 NC/Nga 마우스의 체중이 감소하였으며, 발효조성물 에탄올추출물 처리에 의해 마우스의 체중이 회복하였다(도 17). 또한 DNCB에 의해 증가된 귀의 두께는 발효조성물 에탄올추출물 처리에 의해 감소하였다(도 18).
실험예 9: 동물실험: 마우스 혈청의 과민성 면역반응에 대한 변화
1) 실험조건
혈청 IgE 측정
실험동물의 꼬리 정맥과 안와 동맥으로부터 채취한 혈액을 원심분리 한 후 혈청 IgE 농도를 sandwich ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 시료를 96well plate에 50mM carbonate buffer로 희석한(× 1000) 1st 항체를 100μL씩 분주한 후 4℃에서 overnight시겼다. 1/4 block buffer를 300μL씩 분주하여 실온에서 30분 반응시킨 후 항체가 함유되어 있는 시료를 20μL씩 각 well 에 첨가한 후 실온에서 2시간 반응시켰다. 효소 표식한 2nd biotin-conjugate antibody 100μL를 각 well에 첨가한 후 실온에서 2시간 반응시켰다. HRP-streptavidin conjugate를 100μL씩 넣고 실온에서 30분 배양한 후 기질용액을 각 well에 100μL씩 넣고 37℃에서 20-30분 동안 반응시켰다. 각 단계는 0.05% PBS-Twin (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA)으로 세척하였으며 마지막으로 발색 후 1.5% oxalic acid를 100 μL넣고 반응을 정지시키고, ELISA reader(405nm)로 측정하였다.
혈청 IL-4, IL-5, IFN -γ 측정
실험동물의 안와 동맥으로부터 채취한 혈액을 원심분리한 후 혈청 IL-4, IL-5, IFN-γ 농도를 sandiwich ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 시료를 96well plate에 PBS로 180배 희석한 capture antibody를 100μL씩 분주하여 실온에서 overnight 시킨 후, block buffer 300μL을 분주하여 최소 1시간 실온에서 반응시킨 다음 reagent diluent로 희석한 각 샘플과 표준액을 100μL씩 분주한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. Streptavidin-HRP을 working dilution으로 희석하여 100μL씩 각 well에 분주하여 실온에 20분 반응시킨 후, substrate solution을 100μL씩 분주하고 다시 실온에 20분 반응시켰다. 각 단계는 0.05% PBS-Twin으로 세척하였으며 마지막으로 발색 후 2NH2SO4를 50μL씩 넣고 반응을 정지시킨 다음 동일한 과정을 통하여 purified cytokine을 표준으로 하여 ELISA reader(405nm)로 측정하였다.
비장 임파구 배양 분리, 배양 및 비장임파구의 IgE 측정
실험동물을 경추탈골로 희생시켜 비장을 적출하고 비장임파구는 RPMI 1640 medium(Invitrogen Corporation) 내에서 cell strainer로 분리하였다. 임파구 세포에 RPMI 1640 medium을 첨가하여 300×g,4℃에서 5분씩 3번 원심분리한다. 임파구를 분리한 후 RPMI 10% FBS(Invitrogen Corporation)가 함유된 RPMI 1640 medium에 부유시켜 24well plate에 2 × 106cells/well의 농도로 분주하고, 임파구의 증식을 촉진시키기 위하여 125μg/mL의 농도로 PBS에 용해시킨 concanavalin A를 10% 첨가한 후 5% CO2, 37℃ incubator에서 48시간 배양하였다. 배양한 임파구 상층액의 IgE 함량을 sandwich ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 총 항체 양의 측정으로는 항체의 F(ab)2단편을, 항원 특이적 정량법으로는 항원을 ELISA plate에 고정한다음 배양상층(supernatant)을 반응시켰다. 항체는 ELISA plate 표면에 비특이적으로 결합하는 경향이 있기 때문 에, 고정항체 또는 항원을 고정시킨 후 단백질용액으로 처리하는 blocking 조작을 행한 다음 고정항체 또는 항원에 결합한 항체에 효소 표식한 항체를 결합시켜, 기질용액을 첨가하여 발색시켰다.
IgE는 검출감도를 높일 필요가 있기 때문에 avidin-biotin법을 사용해 ELISA법으로 검출하였다.
대식세포 활성화에 대한 영향
실험동물에 시료를 투여한 다음, 복강 대식세포를 분리하여 대식세포의 수를 비교한 뒤 대식세포의 활성화를 확인하였다. 대식세포 탐식능 (식세포 작용; phagocytosis) FITC-zymosan method를 측정하였고 Nitric Oxide 측정은 실험동물에 시료를 투여한 다음, 복강 대식세포를 분리하여Griess시약을 이용하여 NO를 측정하였다.
2) 실험결과
아토피 피부염 유발로 증가된 IgE양을 NC/Nga 마우스의 혈청을 분리하여 측정한 결과, DNCB에 의해 증가된 IgE 양이 발효조성물 에탄올추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하였다(도 19).
아토피 피부염 유발에 의해 변화되는 IL-10 생성량을 NC/Nga 마우스 혈청에서 확인한 결과, DNCB에 의해 감소된 IL-10 생성량에 대해 발효조성물 에탄올추출물은 영향이 없었다(도 20).
아토피 피부염 유발로 증가된 IgE 생성량을 마우스의 혈청에서 측정한 결과, DNCB에 의해 증가된 IgE 생성량이 발효조성물 에탄올추출물 시료 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 21).
아토피 피부염과 같은 면역반응의 유발에 의해 IL-4와 TNF-α 유전자 발현에 변화를 확인하기 위해 마우스 귀 조직에서 cDNA를 얻어 이를 확인하였다. DNCB 투여에 의한 IL-4와 TNF-α 유전자 발현이 발효조성물 에탄올추출물시료에 의해 감소하였다(도 22).
본 발명에 따르면 아토피 피부염 증상 개선에 획기적 활성을 갖는 새로운 천연성분을 함유하는 조성물을 제공함으로써 아토피 피부염 건강식품분야 및 의약분야 산업에 획기적인 기여를 할 것으로 예상된다.

Claims (10)

  1. 구아바 발효대사체 추출물, 오디 발효대사체 추출물, 잎새버섯 발효대사체 추출물, 초석잠 발효대사체 추출물, 맥강 발효대사체 추출물, 울금 발효대사체 추출물 및 율피 발효대사체 추출물의 혼합을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 구아바 발효대사체 추출물 40중량%, 오디 발효대사체 추출물 15중량%, 잎새버섯 발효대사체 추출물 15중량%, 초석잠 발효대사체 추출물 15중량%, 맥강 발효대사체 추출물 5중량%, 울금 발효대사체 추출물 5중량% 및 율피 발효대사체 추출물 5중량%의 혼합비로 혼합되는, 아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 추출물은 발효대사체를 열수 추출 또는 에탄올 추출 방법으로 얻어지는, 아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 구아바 발효대사체는
    건조된 구아바잎을 2-3cm 길이로 분쇄한 구아바잎 분말에 맥강분말 5중량%를 혼합하여 제조된 고체발효배지를 멸균한 다음, PDB 배지에서 배양한 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10중량% 접종하고 수분함량은 40-60%로 조절한 후, 온도 30℃, 상대습도 80% 조건에서 5일간 정치 배양하는 1단 고체발효단계를 거친 후 상기 1단 고체발효배지에 10배 가수하여 95℃에서 30분간 환류추출하고 여과 및 감압농축을 거쳐 20브릭스의 액상 추출물을 얻어, 이에 설탕 5%를 첨가하고 효모추출물 0.5%를 혼합하여 제조된 액체발효배지를 멸균한 후, PDB 배지에서 배양된 5종의 유산균혼합균주를 10% 접종하여 37℃의 온도에서 5일간 정치배양하는 2단 액체발효단계를 거친 다음, 100℃의 온도에서 10분동안 살균을 거쳐 여과 및 감압농축하여 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물:
  5. 제1항에 있어서, 울금 발효대사체는
    건조된 울금을 3-4cm 길이로 절단한 후 맥강분말을 5중량% 혼합하여 제조된 고체발효배지에 PDB 배지에서 배양한 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10중량% 접종하고 수분함량은 40-60%로 조절한 후, 온도 30℃, 상대습도 80% 조건에서 5일간 정치 배양하는 1단 고체발효단계와 상기 1단 고체발효기질 대비 70% 주정을 5배 첨가하여 실온에서 8시간 환류추출한 다음, 여과 및 감압농축하여 수분 5% 이하로 동결건조시킨 후 동결건조된 고체발효 울금 주정 추출분말 2중량%, 울금분말 3중량%, 글루코오스 2중량%, 이스트 추출물 0.4중량%를 첨가하여 제조된 액체발효배지를 멸균한 후 바실러스 서브틸리스와 류코노스톡 메센테로이데스를 2% 접종하여 37℃에서 5일간 진탕배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축하고 동결건조하여 수분함량 5% 이하로 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 잎새버섯 발효대사체는,
    건조된 잎새버섯을 1-3cm 길이로 분쇄한 후 중량대비 14배의 정제수를 가수하고 95℃에서 12시간동안 환류추출한 다음 여과 및 감압농축하여 얻어진 20브릭스의 잎새버섯 추출물을 중량대비 1%의 글루코오스와 0.4%의 효모추출물을 첨가하고 멸균하여 액체발효배지를 제조한 다음, 락토바실러스 플란타룸과 류코노스톡 메센트로이데스 배양액을 2%씩 접종한 후 30℃ 온도에서 3일간 정치배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축과 동결건조단계를 거쳐 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 초석잠 발효대사체는,
    건조된 초석잠을 100 매쉬 이하로 분쇄한 후 중량대비 10배 가수하여 100℃에서 10시간동안 1회 환류추출한 다음 여과 및 감압농축하여 얻어진 15브릭스의 초석잠 농축액에 중량대비 글루코스 1% 및 효모추출물 0.4% 첨가하고 멸균하여 액체발효배지를 제조한 다음, 아스퍼질러스 오리재 배양액을 10% 접종한 후 30℃온도에서 5일간 120rpm으로 5일간 진탕배양한 다음 살균, 여과 및 감압농축과 동결건조 단계를 거쳐 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 맥강 발효대사체는
    맥강 100g을 100℃에서 1시간 동안 살균한 후 냉각시키고, 물 100ml에 탈지분유 30g, 효모 5g, 포도당 2g을 용해시켜 100℃에서 10분간 살균한 후 상기 살균한 맥강과 혼합하여 발효기질을 준비한 다음, NB 배지에서 배양된 바실러스 서브틸러스를 발효기질 중량대비 10% 접종한 다음 40℃에서 3일간 배양하여 발효시킨 후 100℃에서 10분간 살균한 다음 70% 에탄올을 3배가하여 실온에서 5시간동안 추출한 다음 추출액을 여과한 후, 감압농축 및 동결건조 단계를 거쳐 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 오디 발효대사체는
    착즙된 오디를 여과 및 감압농축하여 10-20브릭스의 발효기질 용액을 제조한 다음, 락토바실러스 플란타룸 및 비피도박테리움 롱검을 2%씩 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양한 후, 에탄올을 혼합하여 저온침전 시킨 후 원심분리 및 감압농축하여 동결건조를 거쳐 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 율피 발효대사체는
    건조율피 원료 중량대비 10배의 물을 가하여 90℃에서 4시간 2회 반복하여 환류추출한 다음 여과, 감압농축 및 동결건조하여 얻은 율피동결건조분말 1중량%, 맥강 1중량%, 유당 1중량%, 설탕 1 중량%를 첨가하여 발효배지를 제조한 다음, 살균하여 MRS 배지에서 배양된 락토바실러스 플란타룸 및 비피도박테리움 롱검을 2%씩 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양한 후, 에탄올을 혼합하여 저온침전 시킨 후 원심분리 및 감압농축하여 동결건조를 거쳐 제조되는,
    아토피 피부염 증상 경감용 조성물.
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