KR20180052617A

KR20180052617A - 암 치료에서 우레이도무스틴(bo-1055)의 용도

Info

Publication number: KR20180052617A
Application number: KR1020187005781A
Authority: KR
Inventors: 말콤 무어; 재-흥 시에; 찬-롱 수; 테-창 리
Original assignee: 아카데미아 시니카; 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2018-05-18
Also published as: WO2017031156A1; BR112018003191A2; US10548861B2; EP3337784A4; MX2018002047A; JP2018535186A; AU2016308116A1; CN107922321A; US20200246284A1; SG10202001388YA; US20190008808A1; TW201711679A; EP3337784A1; TWI644667B; WO2017031156A8; CA2994009A1

Abstract

다양한 유형의 인간 백혈병[급성 골수성 백혈병(ALL) 및 급성 B 림프구성 백혈병(B-ALL)과 같은], 림프종, 소폐세포암(SCLC), 육종 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암의 치료에서, 수용성 NDA 가교제인, 우레이도무스틴(BO-1055)을 사용하는 방법.

Description

암 치료에서 우레이도무스틴(Ureidomustine)(BO-1055)의 용도

발명의 배경

1971년 닉슨 대통령의 "암에 대한 전쟁" 선포 이래 40년 이상 일련의 가정이 암 치료를 지배해 왔다. 암에 대한 전쟁은 역효과를 내고 잠재적으로 위험하기까지 한 세포 사멸 패러다임에 대하여 직접적인 책임이 있는 강력한 연상의 비유이다(Oronsky et al. 2015). 제약 산업은 최대한의 빠른 세포 사멸을 달성하기 위한 시도로서 최대 내성 용량(maximally tolerated dose: MTD)을 획득하기 위해 여전히 암 치료약을 개발하고 있다.

화학요법(chemotherapy)과 방사선은 의도되지 않은 적자생존에 이르는 암 세포에 대한 궁극적인 스트레스 테스트이다. 종양을 제거하기 위하여 고안된 화학요법은 실제로 반대의 효과를 낼 수 있다. 희소한 공간과 자원에 대한 경쟁의 의하여 통상 화학내성(chemoresistant) 형태를 유지하는 화학 민감성 세포(chemosensitive cell)는 사멸되고, 한편 암 종양은 다윈적 형태로 그 환경에 적응하고 클론성확장과 유전적 다양화에 의해 진화하기 때문이다(Greaves & Maley 2012). 이 선택 압력의 대가는 획득된 내성과 치료 실패로 나타나며 공격적 치료를 자기 실패적 과정으로 만든다.

따라서, 비악성 조직에 대해 상당한 독성을 초래하지 않는 효과적 암치료 방법이 필요하다.

알킬화제(Alkylating agent)는 일련의 항암 화합물이다. BO-1055라고도 알려진 우레이도무스틴(Ureidomustine)은 선택적 알킬화제이다. 미국 특허 제8,222,297호 B2에는 다음과 같은 구조식을 가지는 것으로 기술되어 있다:

우레이도무스틴은 이전에 일부 암에 대한 항종양제제로 제안되었지만, 이 화합물로 다른 암들을 치료하는 방법에 대한 상당한 필요가 여전히 남아있다.

발명의 요약

본 발명의 한 구체예에서, 치료를 필요로 하는 환자에게 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 환자에게 치료적으로 유효한 양의 우레이도무스틴을 투여하는 것을 포함하는데, 이 때 상기 암은 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 폐암(lung cancer), 소폐세포암(small lungcell carcinoma: SCLC), 결장직장암(colorectal cancer), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal cancer), 교모세포종(glioblastoma), 및 육종(sarcoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

우레이도무스틴(본 출원 전반에 걸쳐 "BO-1055"로도 지칭됨)은 다음과 같은 구조식을 가진다:

미국특허 제8,222,297호는 우레이도무스틴뿐 아니라 이 화합물을 만드는 과정도 기술하고 있다.

"우레이도무스틴"이란 용어는 BO-1055의 약학적으로 허용되는 염, 이성질체(isomer), 거울상 이성질체, 및 이 화합물의 라세믹 혼합물 등을 포괄한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 암은 백혈병, 림프종, SCLC 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML) 또는 급성 림프성 또는 림프구성 백혈병(ALL, T-세포 또는 B-세포 하위유형), 이중표현형 백혈병(bi-phenotypic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL, T-세포 또는 B-세포 하위유형) 및 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia: CML)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 치료는 비악성 조직에 대해 상당한 독성을 초래하지 않으면서 암세포의 수를 치료적으로 유의하게 감소시키는 데 효과적이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 우레이도무스틴 투여량 대 인간 제대혈(CB) 조혈 모세포(HPC/wk2-CAFC) 및 조혈 줄기세포(HSC/wk5-CAFC)의 관계를 도시한다.

도 2는 우레이도무스틴의 투여량 대 정상 세포 유형 및 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주(MA-10)의 상대 형광 강도의 관계를 도시한다.

도 3은 우레이도무스틴(BO-1055), 카보플라틴, 도세탁셀 및 대조군을 쥐에 투여한 후 42일 후 서로 다른 장기의 병리학적 검사 사진을 보여 준다.

도 4는 우레이도무스틴에 대한 DNA 가교(cross-linking) 겔 이동 분석의 사진을 보여준다.

도 5는 우레이도무스틴 치료 후 비-소세포 폐암(non-small lung carcinoma) H1299 세포의 유동 세포계측법 세포 주기 분포(flow cytometry cell cycle distribution)를 보여준다.

도 6은 hERG 수용체에 대한 우레이도무스틴 결합의 hERG 형광 편광 분석의 그래프를 보여준다.

도 7은 혈장 단백질에 결합된 우레이도무스틴 대 시간의 플롯을 보여준다.

도 8은 다양한 백혈병 세포주 및 정상 제대혈(normal cord blood) CD34+ HSC/HPC에 대한 72시간에서의 BO-1055 세포독성의 알라마르 블루 형광 강도 용량-반응(dose-response) 곡선을 보여준다.

도 9는 우레이도무스틴의 투여량 대 성장인자 의존성 MA-10-W51 세포의 상대 형광 강도의 플롯을 보여준다.

도 10a는 1x10³-3x10⁶ GFP-루시페라제 형질도입 THP-1 AML 세포를 주사하고 더 이상 처리를 하지 않은 4마리 쥐의 생체영상 사진 패널을 보여준다.

도 10b는 1x10³-1x10⁶ GFP-루시페라제 형질도입 THP-1 AML 세포를 주사하고 또한 종양 주사시 40일 동안 일일 1ug의 인간 GM-CSF를 방출한 삼투압 미니펌프를 피하 임플란트한 4마리 쥐의 생체영상 사진 패널을 보여준다.

도 11은 5마리 쥐 각각의 6개의 생체영상 사진 패널을 보여준다. 왼쪽 3개의 패널은 MV4-11-GFP-루시페라제 세포만 주입된 쥐를 보여준다. 오른쪽 3개의 패널은 MV4-11-GFP-루시페라제 세포를 주입하고 우레이도무스틴으로 더 처리한 쥐를 보여준다.

도 12는 a) 사이토킨(cytokine) 지지체가 없고(왼쪽); b) 미니펌프 임플란트에 의해 인간 GM-CSF가 투여된 것(오른쪽)과 함께 GFP/루시페라제를 발현하는 MA10 세포로 이식된 쥐의 생체영상 사진을 보여준다.

도 13은 MA-10-W51-GFP-루시페라제 세포가 이식된 6마리 쥐 각각의 생체영상 사진을 보여주는데, 왼쪽의 3마리 쥐는 대조군 주사를, 오른쪽의 3마리 쥐는 우레이도무스틴을 주사하였다.

도 14는 5마리 쥐 각각의 6개의 생체영상 사진으로, 왼쪽의 3개 패널은 AML-2-CD34+-GFP-루시페라제 세포로만 주사된 쥐를 보여주고, 오른쪽의 3개 패널은 AML-2-CD34+-GFP-루시페라제 세포로 주사하고 우레이도무스틴으로 더 처리한 쥐를 보여준다.

도 15는 우레이도무스틴 투여 후 일 수 대 일차적인 환자-유래 AML-2 CD34+ 세포로 이식된 생존 쥐의 수를 나타내는 차트이다.

도 16은 정상 제대혈 CD34+ HPC/HSC와 비교하여 1차 프리-B(primary patient pre-B) ALL 백혈병에 대한 72시간에서의 BO-1055 세포독성의 알라마르 블루 형광 강도 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 17은 우레이도무스틴 치료 후의 CD19 및/또는 CD34를 발현하는 프리-B ALL 세포유동 세포계측법 분포(flow cytometry distribution)를 나타낸다.

도 18은 3마리 쥐 각각의 4개의 생체영상 사진 패널을 나타낸다. 왼쪽 3개의 패널은 프리-B-ALL CD34-GFP-루시페라제 세포 및 대조 배지(control media)만을 주입한 쥐를 보여준다. 오른쪽 3개의 패널은 프리-B-ALL CD34-GFP-루시페라제 세포를 주입하고 우레이도무스틴으로 더 처리한 쥐를 보여준다.

도 19는 우레이도무스틴 및 대조군으로 처리한 프리-B-ALL 세포로 이식한 쥐의 생존 분석 차트를 보여준다.

도 20은 5마리 쥐 각각의 8개 생체영상 사진 패널을 보여준다. 왼쪽의 4개 패널은 GFP-Lu-SCLC H526 세포 및 대조 배지만 주사한 쥐를 보여주고, 오른쪽 4개 패널은 SCLC H526 세포를 주사하고 우레이도무스틴으로 더 처리한 쥐를 보여준다.

도 21은 도 20에 나타낸 쥐들에서 GFP-Lu-SCLC H526 세포들의 성장을 로그 차트로 보여준다.

도 22a는 우레이도무스틴 또는 이리노테칸(irinotecan) 또는 에토포사이드(etoposide)의 정맥내 주사(intravenous injection) 후 SCLC H526 이종이식편(xenograft)(피하)을 보유하는 다양한 쥐에서 평균 종양 크기 대 종양 이식 후 일 수의 차트이다.

도 22b는 동일한 쥐에서 평균 체중 변화 대 종양 이식 후 일 수의 차트이다.

도 23a는 우레이도무스틴 및 독소루비신(DOXO)으로 처리된 DLBCL(ABC 서브타입) OCY-LY3 암세포에 대한 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에 의해 획득된 증식억제곡선(proliferation inhibition curve)및 IC₅₀을 나타낸다.

도 23b는 동일한 세포들에 대한 그래프패드 프리즘에 의해 획득된 Fa-Ci 플롯을 나타낸다.

도 23c는 동일한 세포들에 대한 그래프패드 프리즘에 의해 획득된 이소볼로그램(isobologram)을 나타낸다. 왼쪽 패널은 BO1055 Cte + DOXO Var를 나타내고, 오른쪽 패널은 DOXO Var + BO1055 Cte를 나타낸다.

도 24는 5마리 쥐 각각의 6개 생체영상 사진 패널을 보여준다. 왼쪽의 3개 패널은 JEKO-1-GFP-Luc 맨틀 세포 림프종 및 대조 배지만을 주입한 쥐를 보여주고, 오른쪽의 3개 패널은 JEKO-1-GFP-Luc 맨틀 세포 림프종을 주입하고 우레이도무스틴으로 더 처리한 쥐를 보여준다.

도 25a는 우레이도무스틴 치료 후 A673 유잉 육종(Ewing's sarcoma) 및 A204 횡문근육종(rhabdomyosarcoma) 세포주의 유동 세포계측법 세포 주기 분포를 나타낸다.

도 25b는 우레이도무스틴 치료 후 세포사(apoptotic) 및 죽은 A673 세포의 백분율을 나타낸다.

도 25c는 우레이도무스틴 치료 후 A673 세포들에서의 카스파아제 활성의 그래프를 보여준다.

도 25d는 우레이도무스틴 치료 후 죽은 A673 세포들의 백분율을 그래프로 나타내어 보여준다.

도 25e는 우레이도무스틴 치료 후 세포사(apoptotic) A673 세포들의 백분율을 그래프로 나타내어 보여준다.

도 26a는 다양한 농도의 우레이도무스틴 또는 4-하이드로퍼옥시사이클로포스파미드(4-Hydroperoxycyclophosphamide)로 처리한 후의 메틸셀룰로오스배양(methylcellulose culture)에서 A673 유잉 육종 온코-스피어(onco-sphere) 형성의 억제를 보여주는 그래프이다.

도 26b는 메틸셀룰로오스에서 온코-스피어 형성을 보여주는 이미지이다.

도 27a는 우레이도무스틴과 토포테칸(topotecan)의 조합으로 처리된 A673 유잉 육종 세포에 대한 그래프패드 프리즘으로 얻어진 이소볼로그램을 보여준다.

도 27b는 우레이도무스틴과 SN-38의 조합으로 처리된 동일한 세포들의 이소볼로그램을 보여준다.

도 27c는 우레이도무스틴과 독소루비신의 조합으로 처리된 동일한 세포들의 이소볼로그램을 보여준다.

도 27d는 우레이도무스틴과 HSP90 억제제인 PU-H71의 조합으로 처리된 동일한 세포들의 이소볼로그램을 보여준다.

도 28a는 종양 부피 대 A673 유잉 육종 이식편을 보유하고 상이한 용량의 우레이도무스틴으로 처리된 NSG 쥐의 치료 시작으로부터의 일 수의 그래프를 보여준다.

도 28b는 동일한 쥐들에서의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.

도 28c는 쥐의 중량 대 동일한 쥐의 우레이도무스틴 치료 시작으로부터의 일 수의 그래프를 나타낸다.

도 28d는 종양 크기 대 A204 횡문근육종 이식편을 보유하고 우레이도무스틴으로 처리된 NSG 쥐들의 치료 시작일로부터의 일 수의 그래프를 나타낸다.

도 28e는 쥐의 중량 대 동일한 쥐의 우레이도무스틴 치료 시작일로부터의 일 수의 그래프를 나타낸다.

도 29는 종양 크기 대 1차 유잉 육종(primary Ewing's sarcoma) 이식편을 보유하고 매일 3회의 사이클로포스파미드 주입으로 먼저 처리되고, 점진적인 종양 성장을 따라서 4회의 우레이도무스틴을 주입한 NSG 쥐의 치료 시작으로부터의 일 수의 그래프를 나타낸다.

발명의 상세한 셜명

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서 예를 들어 "하나의 세포"에 대한 언급은 당해 기술분야의 당업자에게 공지된 다수의 그러한 세포들 및 그 등가물을 포함한다. 또한 "하나의(a, an)", "하나 이상의(one or more)" 및 "적어도 하나의(at least one)" 등의 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 "포함하는(comprising 또는 including)" 및 "갖는(having)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만 바람직한 방법 및 재료가 여기에 기술된다. 여기에서 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물들에 보고된 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 도구, 통계분석 및 방법론을 기술하고 공개하기 위한 목적으로 본 명세서에 포함된다. 어떠한 것도 선행발명에 의해 그러한 공개보다 시기적으로 선행하지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게서, 상기 환자에게 치료적으로 유효한 양의 우레이도무스틴을 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 암은 백혈병, 림프종, 폐암, 소폐세포암(SCLC), 결장직장암(colorectal cancer), 전립선암, 신장암, 교모세포종(glioblastoma), 및 육종으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

바람직하게, 우레이도무스틴은 약제학적 조성물로 제형화(formulate)된다.

우레이도무스틴(본 출원 전반에 걸쳐 "BO-1055"라고도 함)은 다음과 같은 구조식을 갖는다:

미국특허 제8,222,297호는 우레이도무스틴 및 이 화합물을 제조하는 프로세스를 기술한다.

"우레이도무스틴"이라는 용어는 또한 BO-1055의 약학적으로 허용되는 염, 이 화합물의 이성질체, 거울상이성질체, 및 라세믹 혼합물들을 포괄한다. 본 발명은 또한 우레이도무스틴의 대사산물(metabolites)을 투여하는 것을 포함하는 상이한 암들의 치료 방법들을 포괄한다. "대사산물"이란 용어는 대사작용(metabolism) 또는 대사과정(metabolic process)에 의해 우레이도무스틴으로부터 생성된 임의의 물질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 암은 백혈병, 림프종, SCLC 및 육종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 백혈병은 급성골수성 백혈병(AML), 급성 림프성 또는 급성 림프성 또는 림프구성 백혈병((ALL, T-세포 또는 B-세포 하위유형), 이중표현형 백혈병, 만성림프구성 백혈병(CLL, T-세포 또는 B-세포 하위유형), 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 치료는 비악성조직에 대하여 상당한 독성을 초래하지 않으면서 암세포의 수를 치료적으로 유의하게 감소시키는 것을 달성하기에 효과적이다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 우레이도무스틴의 치료적 유효량은 환자의 체중당 약 3 내지 4mg/kg 사이이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 우레이도무스틴으로 치료를 받고 있는 환자에게 다른 항암 활성제를 동시 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 명세서에서 정의된 바와 같이, "접촉함(contacting)"은 본 발명에서 사용된 항-종양(anti-tumor) 화합물이 시험관, 플라스크, 조직배양물, 칩, 어레이, 플레이트, 마이크로플레이트, 모세관, 또는 그와 같은 것들에서 수용체를 함유하는 샘플에 도입되고, 상기 항-종양 화합물이 수용체에 결합하도록 허용하기에 충분한 온도 및 시간에서 배양되는 것을 의미한다. 샘플을 항-종양 화합물 또는 다른 특이적 결합 성분과 접촉시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 수행될 분석 프로토콜의 유형에 따라 선택될 수 있다. 배양방법들 또한 표준적이며 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, "접촉함(contacting)"이라는 용어는 본 발명에서 사용되는 항-종양 화합물이 치료를 받는 환자에게 도입되고 화합물이 생체 내에서 접촉되도록 허용된다는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 사용된 것과 같이, "치료함(treating)"이라는 용어는 예방적 치료 및 장애 치료(disorder remittent treatment)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이 "감소함(reducing)", "억제함(suppressing)" 및 "저해함(inhibiting)"은 일반적으로 적어지거나 감소한다는 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이 "진행(progression)"이라는 용어는 용어의 범위 또는 심각성의 증가, 발전, 성장 또는 악화를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이 "재발(recurrence)"은 치료 후 질병이 다시 시작되는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 사용된 것과 같이, "투여(administering)"라는 용어는 환자, 조직, 기관, 또는 세포를 항-종양 화합물과 접촉시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이 투여는 예를 들어 테스트 튜브와 같이 체외에서, 또는 예를 들어 살아 있는 생물체의 세포 또는 조직에서와 같이, 예를 들어, 인간에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명에서 유용한 화합물을 환자(patient) 또는 대상자(subject)에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 동등하게 사용되는 "환자(patient)" 또는 "대상자(subject)"는 (1) 우레이도무스틴의 투여에 의해 치유 또는 치료될 수 있는 장애를 가지고 있거나 (2) 우레이도무스틴의 투여에 의해 예방가능한 장애에 걸리기 쉬운 포유동물, 바람직하게는 인간을 가리킨다.

본 발명의 명세서에서 사용된 것과 같이, "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 적절한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 및 보조제 등, 총체적으로 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically-acceptable carriers)"와 함께 치료적으로 유효한 양의 항-종양화합물을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 사용된 것과 같이 "유효량(effective amount)" 및 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 독성, 자극, 또는 알레르기 반응과 같은 과도한 부작용이 없이 원하는 치료적 반응을 산출하기에 충분한 활성 치료제의 양을 의미한다. 특정한 "유효량(effective amount)"은, 분명히, 치료가 되는 특정한 조건, 환자의 신체적 상태, 치료되는 동물의 유형, 치료의 기간, 병용 치료의 성격(있는 경우), 및 채택되는 특정한 제제 및 화합물 또는 그 유도체의 구조와 같은 요인에 따라 변동할 것이다. 이 경우, 용량은 다음 중 하나의 결과를 가져오는 경우 치료 효과가 있는 것으로 간주될 것이다: (a) 질환(예: 췌장암, 유방암)의 예방; 및 (b) 그러한 질병의 역전 또는 안정화. 최적 유효량은 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

약학적 조성물은 액체, 또는 동결건조된 또는 달리 건조된 제제(formulation)이고, 다양한 완충액 함량(예: Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제, 표면에의 흡수를 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 세제(detergent)(예: 트윈(Tween)(폴리소르베이트) 20, 트윈 80, 플루로닉(Pluronic) F68, 담즙산염), 가용화제(예: 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 항-산화제(예: 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 방부제(예: 티메로살(Thimerosal), 벤질 알코올, 파라벤), 벌킹 물질 또는 토니시티 조절제(tonicity modifier)(예:락토오스, 만니톨), 단백질에 대한 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체의 공유결합, 금속 이온과의 착물형성(complexation), 또는 폴리락틱산, 폴리클리콜릭산, 하이드로겔 등과 같은 고분자 화합물의 미립자 제제(particulate preparation) 내로 또는 위로의, 또는 리포솜, 마이크로이멀젼, 교질입자(micell), 단막 또는 다중층 소포(unilamellaror multilamellarvesicles), 에리쓰로사이트 고스트(erythrocyte ghosts), 또는 스피로플라스트(spheroplasts) 위로의 물질의 혼입을 포함한다. 그러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 클리어런스 속도에 영향을 줄 것이다. 조절되거나(controlled) 지속된(sustained) 방출 조성물은 친지질성 저장소(ipophilic depot)(예: 지방산, 왁스, 오일)의 제제(formulation)를 포함한다.

또한 중합체(예: 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물을 투여하는 방법도 본 발명이 포괄한다. 조성물의 다른 구체예들은 국소(topical), 비경구(parenteral), 폐(pulmonary), 비강(nasal) 및 경구(oral)를 포함하는 다양한 투여 경로에 대한 미립자 형태의 보호 코팅, 프로테아제 억제제, 또는 투과 촉진제를 포함한다. 한 구체예에서, 약학적 조성물은 비경구(pareterally), 암주변부(paracancerally), 경점막(transmucosally), 경피(tansdermally), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenously), 피내(intradermally), 피하(subcutaneously), 복강내(intraperitonealy), 심실내(intraventricularly), 두개내(intracranially), 및 종양내(intratumorally)로 투여된다.

또한, 본 명세서에서 사용된 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)는 당업자에게 잘 알려져 있으며 0.01-0.1M, 바람직하게는 0.05M 인산염 완충액(phosphate buffer)또는 0.9% 식염수(saline)를 포함하지만 그에 국한되지는 않는다. 또한 그러한 약학적으로 허용가능한 담체들은 수성(aqueous) 또는 비수성(non-aqueous)의 용액, 현탁액(suspension) 또는 에멀젼(emulsion)일 수 있다. 비수성 용매의 사례는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 올레산 에틸(ethyl oleate)과 같은 주사 가능한 유기 에스터이다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 식염수 및 완충된 매질(buffered media)을 포함한다.

비경구 비히클(vehicle)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거(lactated Ringer's), 및 고정유(fixed oil)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제(nutrientreplenisher), 링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은 전해질 보충제를 포함한다. 예를 들어 항균제, 항산화제, 대조제(collating agent), 불활성 가스와 같은 방부제 및 다른 첨가제들 또한 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 투여할 수 있는 조절되거나(controlled) 지속된(sustained) 방출 조성물은 친지방성 저장소(예: 지방산, 왁스, 오일)의 제제를 포함한다. 또한 본 발명은 중합체(예: 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물 및 조직 특이적 수용체, 리간드, 또는 항원에 대하여 직접적으로 지향된 항체 또는 조직 특이적 수용체의 리간드에 커플링된 항체에 커플링된 화합물을 포함한다.

본 발명에 따라 투여된 조성물의 다른 구체예는 비경구, 폐, 비강 및 경구를 포함하는 다양한 투여 경로를 위한 미립자 형태, 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투과 촉진제를 포함한다.

본 발명에 따른 또다른 방법에서, 약학적 조성물은 제어된 방출 시스템(controlled release system)으로 전달될 수 있다. 예를 들어 제제(agent)는 정맥 내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포솜 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다(앞의 Langer 참조. Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwaldet al., Surgery88:507(1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574(1989) 참조). 다른 구체예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적물, 예를 들어 간에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서, 시스템 투여량(systemic dose)의 단지 일부만을 필요로 한다(예: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra,vol. 2, pp. 115-138(1984) 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 Langer에 의한 리뷰에서 논의된다(Science 249:1527-1533(1990)).

약학적 제제(pharmaceutical preparation)는 항-종양 화합물만을 포함할 수도 있고, 또는 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 더 포함할 수도 있으며, 정제, 분말, 캡슐, 펠릿, 용액, 현탁액, 엘릭서(elixir), 에멀젼, 겔, 크림 또는 직장 및 요도 좌약을 포함하는 좌약과 같이 고체 또는 액체 형태일 수도 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 수지, 전분, 당, 셀룰로스 물질 및 그 혼합물을 포함한다. 항-종양 화합물을 포함하는 약학적 제제는 예를 들어 펠릿의 피하 이식에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 펠릿은 일정 시간에 걸쳐 항-종양 화합물의 제어된 방출을 제공한다. 상기 제제는 또한 액체 제제의 정맥 내, 동맥 내, 또는 근육내 주사, 액체 또는 고체 제제의 경구 투여, 또는 국소적 적용에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장 좌약 또는 요도 좌약의 사용에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 의해 투여될 수 있는 약학적 제제는 공지된 용해, 혼합, 과립화 또는 정제 형성 공정에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여를 위해, 항-종양 화합물은 이러한 목적을 위한 비히클, 안정화제, 또는 불활성 희석제(inert diluent)와 같은 통상적인 첨가제와 혼합될 수 있고, 통상적인 방법으로 정제, 코팅된 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알코올성 또는 유성 용액과 같이 투여하기 적절한 형태로 변환될 수 있다. 적절한 비활성 비히클의 예로는 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴과 같은 결합제, 또는 옥수수전분, 감자 전분, 알긴산과 같은 붕해제, 또는 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 조합된, 락토오스, 수크로스, 또는 옥수수 전분과 같은 통상적인 정제 베이스들이 있다.

적합한 오일성 비히클 또는 용매의 예로는 해바라기유 또는 생선 간유와 같은 식물성 또는 동물성 오일이 있다. 제제는 건조 및 습식 과립으로 효과를 내도록 할 수 있다. 비경구 투여용(피하, 정맥 내, 동맥 내 또는 근육내 주사)의 경우, 항-종양 화합물 또는 염, 에스터, N-옥사이드 등과 같은 이들의 생리학적으로 허용되는 유도체는 용액, 현탁액, 또는 배출액(expulsion)으로, 원한다면 예를 들어 가용화제 또는 기타 보조제와 같이 이 목적에 통상적이고 적합한 물질로 변환된다. 계면활성제 또는 다른 약학적으로 하용가능한 보조제(adjuvant)의 첨가 여부에 관계없이 물과 오일과 같은 무균 액체를 예로 들 수 있다. 예시적인 오일로, 예를 들어 땅콩 오일, 대두유, 또는 미네랄 오일과 같은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 유래의 오일들을 들 수 있다. 일반적으로 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 당 용액, 그리고 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸텐 글리콜과 같은 글리콜은 특히 주사 가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다.

활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 조성물은 비강 인두(nasopharynx)에 전달되는 에어로졸로서 또는 액체 용액이거나 현탁액으로 주사제로서 제조될 수 있다. 또한 제제는 유화될 수 있다. 활성 치료 성분은 종종 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 함께 쓸 수 있는 부형제(excipient)와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올 등 또는 이들의 임의의 조합이다.

또한, 상기 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키는 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

활성성분은 중화된 약학적으로 허용가능한 염 형태로서 조성물에 제제화 될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 산 부가 염을 포함한다. 유리 카르복실 그룹으로부터 형성된 염은 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 무기 염기로부터 유도될 수 있다.

예를 들어, 크림, 겔, 드롭(drop) 등을 사용하여 신체 표면에 국소 투여 하기 위해서 항-종양 화합물 또는 염, 에스터, N-옥사이드 등과 같은 이들의 생리학적으로 허용되는 유도체들은 제조되어 약학적 담체와 함께인지의 여부에 관계없이 생리학적으로 허용가능한 희석제 내에 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 적용된다.

본 발명에 따른 또다른 방법에서, 활성 화합물은 소포, 특히 리포솜 내에서 전달될 수 있다(참조: Langer, Science 249:1527-1533(1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, N.Y., pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein ibid., pp. 317-327; 일반적으로 ibid 참조).

약제에 사용하기 위해, 항-종양 화합물의 염은 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 그러나 다른 염들은 본 발명에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 제조에 유용할 수 있다. 화합물의 적합한 약학적으로 허용가능한 염들은 예를 들어 본 발명에 따른 화합물의 용액을 염산, 황산, 메탄술폰산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 아세트산, 벤조산, 옥살산, 구연산, 타르타르산, 탄산, 또는 인산과 같은 약학적으로 허용가능한 산의 용액과 혼합하여 형성될 수 있는 산부가염(acid addition salt)을 포함한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 본 명세서에 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1

우레이도무스틴의 세포독성

사람 및 쥐의 양성 조직 유형(benign tissue type)에서 결정된 우레이도무스틴(BO-1055) 독성.

비악성(non-malignant) 조직에 대한 BO-1055의 독성을 결정하기 위하여, 발명자들은 MTT 및 알라마르 블루 분석(Hamid et al. 2004)을 사용하여 29종의 정상 인간, 쥐 또는 영장류 세포 및 조직 유형에 대한 IC₅₀값을 측정하였다(표 1). BO-1055는 모든 29개의 정상 조직에서 평가되었다. 이들 중 24/29는 고내성(IC₅₀10.0-=100.0㎛)이었으며, 5개는 중등도 내성(IC₅₀8.80-9.48μM)이었다. 후자의 그룹은 나팔관 상피(fallopian tubeepithelium), 태아 골수 간질(fetal bone marrow stroma), 혈청 대체 배지(serum replacement medium)에 있는 제대혈 CD34+ 조혈 줄기/모세포 CAFC 2주 모세포(progenitor) 및 CAFC 5주 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)를 포함한다.

체외*에서 다양한 인간, 쥐, 및 영장류 정상조직에 대한 수용성 우레이도무스틴(BO-1055)의 세포독성. 72시간 세포독성(IC ₅₀ , μM).

정상 조직	조직 유형	1055
16HBE SV40+	기관지 상피(Bronchial epithelium)	≥10.0
BCI-NSI hTERT	기관지 상피	40.0
BEAS2B SV40	기관지 상피	≥10.0
CCD-33Lu	폐 섬유 아세포(Lungfibroblasts)	34.5
NL31-PE	폐 상피	≥10.0
FTE-hTERT	팔로피오 상피(Fallopian epithelium)	9.48
NOSE	난소 상피	≥10.0
HS578	유방 상피	>100.0
BMEC-hTert	BM 내피	≥10.0
HUVEC	제대 내피(Umbilical endothelium)	60.5
BMMSC	BM 메센카임(BM Mesenchyme)	32.8
MS-5(쥐)	성인 BM 스트로마(Adult BM stroma)	≥10.0
OP9 (쥐)	두개관 스트로마(Calvarial stroma)	≥10.0
HS27	성인 BM 스트로마	35.3
HS5	성인 BM 스트로마	≥20.0
FBMC	태아 BM 스트로마	8.48
MSC	지방 메센카임	20.0
HEL 299	태아 폐섬유 아세포	≥10.0
HFL1	태아 폐섬유 아세포	14.2
MRC5	태아 폐섬유 아세포	≥10.0
피부	태아 섬유 아세포	≥10.0
IMR90	태아 폐근섬유 아세포	12.89
CV1 영장류	신장 섬유아세포	>100.0
제대혈 CFC	CFU-GM, BFU-E, CFU-C	19.0
제대혈 1	CB CD34+ cells(no FCS)	9.01
제대혈2	CB CD34+ cells(+ FCS)	15.0
제대혈	CB Wk2 CAFC HPC	9.20
제대혈	CB Wk5 CAFC HSC	9.10
SVGp12	아스트로글리아	≥10.0

*표 1에서 사용된 양성 세포(benign cell)의 설명.

MSC: Castro-Malaspina et al 1980(인간 간엽 줄기 세포와 그 자세포(proeny)에 대한 최초의 기술). 초기 용어 CFU-F, 현재 대체 명명 간엽 간질 세포(mesenchymal stromal cell)(세포 집단의 작은 부분만이 자체-갱신 줄기 세포 특성을 가지기 때문). BMEC-hTERT: 인간 골수 미세혈관 내피(human bone marrow microvascular endothelium)- hTERT 불멸화(Franco et al. 2001). MSC-hTERT: 인간 hTERT 불멸화 골수 MSC (MacKenzie et al. 2000). MRC5: hTERT로 불멸화된 인간 배아 폐섬유아세포(Franco et al 2001, Wen et al 2006). 폐 기저막 상피: hTERT 또는 SV40으로 불멸화(16HBE SV40+, BCI-NSI hTERT, BEAS2B SV40 T, CCD-33Lu, NL31-PE)(Shaykhiev et al 2013, Walters et al 2013). NOSE: 정상적 인간 난소 상피. HS5, HS27a: 유두종 바이러스(papilloma virus)로 불멸화된 성인 인간 골수 간질 세포(Roecklein and Torok-Storb 1995). 아프리카 녹색 원숭이로 대표되는 신장 섬유 아세포(Cercopithecus aethiops) 라우스(Raus) 육종-형질 전환된 신장 세포주(CV1)(Jensen et al. 1964). CB CD34+: 인간 제대혈 CD34+ 세포(Mulloy et al 2003). CB CFC: 반고체 콜로니 분석에서 제대혈 조혈 모세포(Cord Blood hematopoietic progenitor cell)(CFC)(Chung et al 2005). SVGp12: 아스트로글리아(Astroglia) SV40 변환 인간 인간 태아 신경교 세포주(fetal glial cell line).

방법:

(i) CFC 분석

인간 조혈 모세포(human hematopoietic progenitor cell), 콜로니 형성 세포(colony-forming cell: CFC)에 대한 BO-1055 및 다른 화합물의 독성은 3배에서의 BO-1055의 다양한 용량의 존재 또는 결여 하에서 1.2% 메틸 셀룰로오스, 20ng/ml 인간 c-Kit 리간드(KL), 20ng/ml 인간 IL-3, 20ng/ml 인간 G-CSF, 6units/ml 인간 EPO, 80mM 2-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 50units/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신, 0.125mM 헤민(시그마), 및 20% 혈청 대체물(Life Technology, Grand Island, NY)을 함유하는 IMDM(Iscove's Modified DulbeccoMedium) 500 정제 인간 제대혈 CD34+ 세포/ml를 배양하여 결정되었다. 14일 후 50세포/콜로니 CFC 이상의 콜로니를 함유하는 콜로니들이 CFC로서 현미경 하에서 스코어링하고 데이터를 평균(Mean) ± S.D., n=3 으로 나타내었다

(ii) CAFC 분석

체외에서 인간 조혈 줄기 세포(HSC)에 대한 BO-1055의 독성은 CAFC(cobblestones area forming assay)(Breems et al. 1994, Jo et al. 2000)를 사용하여 결정되었다. 시험 약제의 다양한 용량이 있거나 없거나 200개의 정제된 인간 제대혈 CD34+ 세포와 MS-5 세포(쥐 간질 세포)의 공동 배양이 12.5%의 태아 송아지 혈청, 12.5%의 말 혈청, 10^-4M 모노티올글리세롤, 10^-6M 하이드로 코르티손, 50㎍/ml의 겐타마이신을 함유하는 MEM 알파 배지에서 이루어졌다. 배지의 절반은 매주 새로운 배지로 3배(triplicates)로 보충되었다. 5주 후, 공동배양의 CAFC 수치는 위상차 현미경(phase contrast microscope)하에서 간질 단층(stromal monolayer) 아래 8개 이상의 위상-암(pahse-dark) 세포의 영역으로서 스코어링되었다. 백혈병 줄기 세포(LSC)를 결정하기 위해 동일한 분석이 사용되었으나 배양은 2주씩 코블스톤 영역(cobblestone areas)에 대하여 스코어링되었다. HSC 및 LSC 양자의 재생능력을 확인하기 위하여 새로운 간질 위로의 해리된 코블스톤 영역 형성 세포의 2차 재-통과(secondary re-passage)가 사용되었다.

(iii) 정상 인간 조직과 인간 암 조직에 대한 BO-1055의 효과

웰(well) 당 2,000~4,000의 부유세포(suspension cell) 또는 1,000~2,000의 부착성 종양 세포(adherent tumorcell)(96-웰 또는 384-웰 플레이트에서)들이 10% FCS를 함유하는 IMDM 배지에서 3배의 BO-1055의 다양한 용량의 존재하에서 또는 부재하에서 배양되었다. 72시간 후 상기 배양물을 알라마르 블루로 밤새 펄싱하고 그 결과인 배양물의 형광 강도를 시너지 H1 플레이트 리더(BioTek Inc)로 측정하였다. 상기 부유 세포(suspension cell)는 정제된 CB CD34+ 세포, 일차 인간 백혈병 CD34+ 세포, 인간 백혈병 및 소세포폐암 세포주를 포함한다. 부착성 세포들은 정상 인간 탯줄 내피 세포(human umbilical endothelial cell: HUVEC), 인간 골수 내피 세포(BMEC), 인간 골수 간엽 줄기 세포(human bone marrow mesenchymal stem cell), 및 다양한 인간 고형 종양 세포주였다. 인간의 CD34+ 세포들이 약물 스크리닝에 사용될 때는, 알라마르 블루를 첨가하기 전에 500~1,000세포/웰이 20ng/ml KL, 20ng/ml IL-3, 20ng/ml G-CSF 및 6units/ml EPO의 존재 하에 7-10일간 배양되었다.

표 1에서 볼 수 있듯이, 우레이도무스틴은 정상 인간 및 쥐의 조직 및 세포유형의 패널에 대하여 상대적으로 저독성이다. 이 패널은 기관지 상피 세포주를 포함하고, 이들 중 셋은 hTERT 또는 SV40 T 항원(IC₅₀ >10.0-40.0μM)과의 형질도입에 의해 불멸화(immortalization)된다. 정상 인간의 난소 표면 상피와 나팔관 기초 상피에서 얻어진 상피 세포주(epithelial line) 또한 BO-1055에 내성(resistance)을 보였다(IC₅₀10.0-80.0μM). 내피 세포는 골수 미세 혈관 내피 세포주 및 제대혈 유래 혈과 내피 세포에 의해 대표되는데, 양자 모두 BO-1055에 내성을 보였다(IC₅₀ >10-60.5μM). MSC(Mesenchymal stromal/stem cell) 및 근섬유아세포는 14개의 세포주로 나타내어졌다. 쥐 및 인간 태아 및 성인 골수 또는 폐 유래 MSC, 태아 피부 MSC, 지방 조직 유래 MSC 및 영장류 신장 섬유아세포는 BO-1055에 상대적으로 내성이 있었다(IC₅₀8.48>100mM).

유두종 바이러스(papilloma virus)에 의해 불멸화된 양성 인간 골수 간질 세포주 HS5 및 HS27a는 BO-1055 세포독성에 대해 내성이 있었다(IC₅₀ >20-35.3μM). 스크리닝 패널에서 정상 인간 조혈 세포는 무혈청 또는 송아지 혈청 함유 현탁 배양(IC₅₀9.01-15.0μM)에서, 또는 조혈 전구 세포/HPC(CFU-GM, BFUE, CFU-Mix(IC₅₀ 19.0mM)에 대한 반고체 배지 콜로니 형성 분석에서 정제된 재대혈 CD34+ 세포를 포함하였다. 2주 CAFC(HPC)의 정량 및 BO-1055에 대한 상대적 내성의 문서화를 위해 코블스톤 면적-형성 분석(cobblestone area-forming assay)(Breems et al 1994, Jo et al 2000)이 사용되었다(n=4 독립 제대혈 샘플에서 평균 IC₅₀ 9.20μM). 5주 CAFC 분석에서 제대혈 조혈 줄기 세포/HSC 또한 상대적으로 BO-1055에 내성이 있었다(n=4 독립 제대혈 샘플에서 평균 IC₅₀ 9.10μM)

실시예 2

인간 및 쥐의 정상 조직의 패널에서 결정된 알킬화 약물들 카보플라틴(Carboplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 테모졸로마이드(Temozolomide), 멜팔란(Melphalan), 벤다무스틴(Bendamustine) 및 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)(활성 대사산물 4-HC)의 독성.

BO-화합물의 세포독성을 결정하기 위해 사용된 19개 양성 조직 유형의 패널이 6개의 통상적으로 사용되는 알킬화 약물 카보플라틴, 시스플라틴, 테모졸로마이드, 멜팔란, 벤다무스틴 및 4-HC의 세포독성에 대한 스크리닝을 위해서 또한 사용되었다.

7개의 조직이 카보플라틴으로 스크리닝이 되었는데 하나는 중등도의 민감성(moderately sensitive)을 보였고(1.70μM의 IC₅₀), 6/7은 높은 내성이 있었다(IC₅₀: 32.8->1000 μM). 12/14 라인이 시스플라틴에 내성이 있었으나(IC₅₀of ≥20.0->100μM), 제대혈 조혈 전구 세포(IC₅₀ 1.80μM)와 마찬가지로, 2/3 기관지 라인은 민감했다(IC₅₀ 3.60-4.10μM).

테모졸로마이드는 약물 내성이 높은 5개의 조직(IC₅₀ 20.0->100.0μM)과, 하나는 약한 내성을 나타내는 쥐의 MS5 간질 라인(stromal line)과, 다른 쪽은 중등도 민감성의 HUVEC 내피와, 7개의 조직에 대해 평가되었다.

MS5 또한 멜팔란(IC₅₀1.64μM) 및 벤다무스틴(IC₅₀2.24μM)을 포함하는 다른 알킬화제에 대해 상당히 민감하였는데, 이것은 시험된 13개의 다른 조직의 멜팔란 내성(IC₅₀ 7.0-320.0μM)과 대조적이었다.

벤다무스틴은 SV40-불멸화 기관지 내피(16HBESV40+ IC₅₀3.55μM) 및 쥐의 골수 간질(murine bone marrow stroma)(MS-5 IC₅₀ 2.24μM)에 독성이 있었으나 시험된 다른 10개의 조직(IC₅₀ 20.0-400.0μM)에 대해서는 그렇지 않았다.

4-HC(시클로포스파미드의 독성 대사산물)는 2개의 정상 조직(IC₅₀ 0.30-2.01μM)에 대해서 중간 정도의 세포독성을 가졌으나 5개는 내성이 있었다(IC₅₀ 12.5-47.0μM).

알킬화 악물 카보플라틴, 시스플라티느 테모졸로마이드(TMZ), 멜팔란(Melp), 벤다무스틴 및 4-HC(시클로포스파미드의 활성 대사산물)의 다양한 인간, 영장류, 및 쥐의 조직 및 텔로머라제-(telomerase-) 또는 SV40-불멸화된 정상 조직에 대한 체외 72시간 세포독성(IC ₅₀ μM).

정상 조직	조직 유형	카보-플라틴	시스-플라틴	TMZ	멜프(Melp)	벤다무스틴	4-HC
16HBE SV40+	기관지 상피	35.5	3.60	nd	nd	3.55	nd
BCI-NSI hTERT	기관지 상피	Nd	30.0	≥40.0	80.0	85.0	18.0
BEAS2B SV40T	기관지 상피	120.0	4.10	nd	nd	>10.0	nd
FTE-hTERT	팔로피오 상피	Nd	100.0	nd	320	400.0	12.5
NOSE	난소 상피	Nd	≥25.0	nd	≥25.0	nd	0.30
HS578	유방 상피	Nd	>100	>100	>100	>100	nd
BMEC-hTert	BM 내피	Nd	20.0	nd	160.0	300.0	nd
HUVEC	UBC 내피	Nd	50.0	4.35	320.0	140.0	40.5
BMMSC	BM 스트로마	32.8	20.0	≥45.0	160.0	30.0	40.5
MS-5 murine	성인 BM 스트로마	Nd	22.0	5.59	1.64	2.24	nd
HS27 PV trans	성인 BM 스트로마	35.3	nd	nd	9.10	nd	nd
HS5 PV trans	성인 BM 스트로마	Nd	nd	nd	>10.0	nd	nd
FBMC	태아 BM 스트로마	Nd	nd	nd	>10.0	nd	nd
HFL1	FL 섬유 아세포	Nd	nd	nd	9.20	nd	nd
MRC5	FL 섬유 아세포	210.0	nd	nd	nd	≥20.0	nd
IMR90	FL 근섬유 아세포	1,000	>100	57.3	56.8	32.3	nd
CV1 (primate)	신장 섬유 아세포	Nd	97.9	>100	99.5	>100	47.0
Cord Blood	BFU-E, CFU-GM, CFC	1.70	1.80	nd	7.00	10.0	2.01
HL-1	심근 세포(Cardiomyocyte)	Nd	47.0	nd	nd	nd	nd

*72시간 알라마르 블루 분석에 의해 결정된 IC₅₀에 대한 분석. nd=결정되지 않음. 스크리닝된 모든 정상 라인들은 카보플라틴에 내성이 있었음(7/7 IC₅₀ 23.0-1,000.0

실시예 3

정상 양성 쥐 세포 및 인간 제대혈 CD34+ 세포, 조혈 모세포(HPC), 및 조혈 줄기 세포(HSC)의 우레이도무스틴(BO-1055) 세포독성에 대한 내성.

도 1은 2주 CAFC 분석에 의해 결정된 인간 CB CD34+ HPC 및 5주 CAFC 분석에 의해 결정된 HSC의 증식에 대한 우레이도무스틴의 영향을 보여준다(IC₅₀7.5-8.2μM). 2주 CAFC(프로제니터 세포)에 대한 9.20μM의, 및 5주 CAFC(HSC)에 대한 9.10μM의 평균 IC₅₀으로 시험된 독립적 CB 샘플들 간에 민감성의 변이가 있었다(표 2).

도 2는 인간 AML(acute myeloid leukemia) 세포주와 비교하여 다양한 정상 세포 유형의 증식에 대한 우레이도무스틴의 영향을 보여준다.

정상 세포: 인간 제대혈 CD34+ 세포(hu-CB-CD34+). 이 하위 모집단은 조혈모세포(HPC ~30%) 및 조혈 줄기 세포(HSC ~5%)에 대하여 강화(enrichment)되었다. BM 유래 내피 세포(BMEC). 인간 간엽 간질세포(human mesenchymal stromal cell: MSC), 뮤린 MS-5(BM-MSC) 및 뮤린OP9(BM-MSC) 세포. 인간 AML MA-10 세포: (MLL-AF9 융합 유전자로 형질전환된 hu-CB-CD34 세포, 사이토킨 의존성). 상대 형광 강도는 우레이도무스틴 존재하의 형광 강도를 우레이도무스틴 부재하의 형광 강도로 나눈 값을 나타낸다.

도 2는 MLL-AF9 변환된 백혈병 세포주에 비교하여 다양한 정상 쥐 및 인간 조직 유형에 대하여 결정된 BO-1055의 연속 희석액의 세포독성을 보여준다. 인간 골수 내피(BMEC), 인간 MSC 세포 및 쥐 MS-5 및 OP9 골수 간질 세포를 포함한 정상 대조군 조직은 정상적인 제대혈 CD34+ 세포가 그런 것처럼(IC₅₀>10μM) BO-1055 세포독성에 내성이었다(IC₅₀>10μM). 이 화학내성(chemoresistance)은 MLL-AF9 백혈병 전위 유전자(leukemic translocation gene)로 역전사된(retrovirally transfected) 정상 인간 제대혈 CD34+ 유래 MA-10 세포주에서 보이는 화학민감성(chemosensitivity)과 대조된다(IC₅₀0.35μM)(Mulloy et al. 2003, Wunderlichand Mulloy 2009). 정상 HSC/HPC에 단일 백혈병 유전자를 도입하면 BO-1055의 독성이 30배 이상 증가했다.

실시예 4

정상 C57Bl/6 쥐의 말초 혈액의 혈액학적 파라미터에 대한 BO-1055 처리의 체내(in vivo) 효과.

BO-1055가 MTD 용량(30mg/kg) 및 빈도(격일 x5)로 정상적인 건강한 쥐에 정맥내 투여되었다. 약물 투여의 이러한 용량(dose) 및 스케줄은 누드(Nude) 및 NSG 쥐에서 종양 세포주 이식물(tumor cell line xenograft)의 퇴행(regression)을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 평가된 혈액학적 파라미터 23/24 중 어느 것에서도 유의한 서프레션(suppression)이 없었다(표 3). 이것은 호중구(neutrophils), 적혈구 및 혈소판의 경우에 특히 두드러지며, 그 수준은 알킬화 약물 요법의 의학적 평가에서 볼 수 있는 가장 빈번한 용량 제한 독성들이다. 단핵구(monocytes)에서 3-4배 증가가 있었다. 유일한 부작용은 BO 투여군에서 10일째 경도의 림프구로 인한 WBC 수치의 완만한(modest) 감소였다.

건강한 C57Bl/6 쥐에서 일반 혈액 검사(Complete Blood Count). 대조군 PBS n=4 또는 1, 3, 5, 8, 10일에 30mg/kg로 정맥내 BO-1055 처리. n=4. RBC 값은 10 ⁶ /μL. 다른 모든 값은 10 ³ /μL

혈액학적 파라미터	대조군 베이스라인	대조군 10일	BO-1055 베이스라인	BO-1055 10일
RBC(M/mL)	9.62±0.54	9.58±0.24	9.22±0.11	9.08±0.18
HGB(g/dL)	13.90±0.60	14.00±0.21	13.50±0.11	13.08±0.25
HCT(%)	48.03±2.24	48.43±0.58	47.73±0.66	46.30±1.04
MCV(fL)	50.00±0.59	50.57±1.04	51.75±0.27	51.03±1.25
MCH(pg)	14.47±0.23	14.60±0.25	14.65±0.10	14.40±0.15
MCHC(g/dL)	28.93±0.33	28.90±0.12	28.30±0.17	28.28±0.42
RDW-SD(fL)	32.57±0.66	33.20±0.67	33.95±0.69	32.48±0.29
RDW-CV(%)	24.37±0.64	24.23±1.11	23.98±0.44	23.18±0.64
RET(K/mL)	404.7±6.73	485.5±84.3	419.4±10.01	426.9±5.92
RET(%)	4.23±0.21	5.11±1.00	5.11±1.00	4.72±0.37
PLT(K/mL)	908.7±178.9	844.3±181.3	1122.5±38.4	1108.3±76.1
PDW(fL)	7.20±0.25	7.07±0.2	6.65±0.05	7.40±0.24
MPV(fL)	6.30±0.17	6.17±0.22	6.05±0.10	6.38±0.09
WBC(K/mL)	8.63±1.31	13.60±0.96	8.13±0.76	5.34±0.99
NEUT(K/mL)	0.86±0.10	1.92±0.46	1.66±0.30	1.90±0.37
LYMPH(K/mL)	7.55±1.21	11.34±1.36	6.21±0.67	2.90±0.92
MONO(K/mL)	0.06±0.02	0.09±0.02	0.16±0.04	0.39±0.06
EO(K/mL)	0.15±0.02	0.24±0.03	0.08±0.02	0.13±0.03
BASO(K/mL)	0.01±0.01	0.01±0.01	0.03±0.01	0.02±0.01
NEUT(%)	10.07±0.50	14.70±4.57	20.48±3.61	37.20±7.11
LYMPH(%)	87.23±0.78	82.77±4.85	76.45±3.60	51.63±7.32
MONO(%)	0.73±0.17	0.67±0.07	1.83±0.39	7.80±1.29
EO(%)	1.87±0.39	1.80±0.36	0.95±0.18	2.93±1.18
BASO(%)	0.10±0.06	0.07±0.03	0.30±0.08	0.45±0.16

실시예 5

BO-1055로 치료하는 것을 중단한 후 전립선 22Rv/HL2 종양 이식편을 보유한 쥐의 다양한 조직의 병리학적 평가.

도 3은 약물 치료를 시작한 후 42일 후에 우레이도무스틴(BO-1055), 카보플라틴 및 도세탁셀 처리 쥐로부터의 상이한 기관의 병리학적 검사 결과를 나타낸다.

본 발명의 발명자들은 전립선 22Rv/HL2 종양 이식편(누드 쥐에서 정위 이식(orthotropic implantation))을 가지는 누드 쥐에서 BO-1055 및 2개의 양성(positive) 대조 화합물(카보플라틴, 도세탁셀)의 주요 독성을 조사하였다. BO-1055로 치료하기를 중단한 후 35-40일에 약물 처리된 쥐의 평균 체중이 회복되었는데 이는 우레이도무스틴의 호스트에 대한 독성이 낮다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 이들 처리된 쥐에서 병리학적 변화를 조사했다(도 3). 병리학적 검사를 위하여 약물 투여 개시 후 42일째 처리된 쥐의 상이한 기관들을 제거하여 고정하고 염색하였다.

대조군과 약물투여군 사이에 심장, 간, 비장, 폐 및 신장에 뚜렷한 병리학적 변화가 없었는데, 이는 우레이도무스틴 및 2개의 양성(positive) 대조 화합물(카보플라틴, 도세탁셀)이 호스트에 대하여 거의 독성을 가지지 않았다는 것을 나타내고, 처리된 쥐는 약물 치료를 중단한 후 빠르게 체중을 회복하였다.

실시예 6

BO-1055 치료(42일간 매 이틀째 마다 30m/kg) 24시간 후 전립선 세포주 22Rv/HL2의 정위 이식을 사용한 누드 쥐의 혈액화학(Blood Chemistry) 및

일반 혈액 검사(Complete Blood Count).

혈액화학 시험(표 4) 및 일반 혈액 검사(표 5)를 위해서 전립선 22Rv/HL2(정위 이식)을 가지는 쥐로부터의 마지막 치료 24시간 후 혈액이 수집되었다(표 5). 그 결과는 카보플라틴, 도세탁셀, 및 BO-1055로 처리한 모든 쥐에서 AST(aspartate aminotransferase)가 증가하였음을 보여준다(표 4). 혈액 요소 질소(blood urea nitrogen: BUN)는 BO-1055 처리 쥐에서 약간 증가하였지만, 혈액 내 요산(uricacid: UA) 수준은 변화시키지 않는다.

혈액 화학 테스트 결과: 쥐의 마지막 약물 치료 24시간 후에 혈액이 수집되었다(n=3).

	AST(U/L)	ALT(U/L)	CREA(mg/dL)	BUN(mg/dL)	UA(mg/dL)
비히클	77.10	50.60	0.32	25.02	3.30
카보플라틴	119.15	64.85	0.31	21.17	1.97
BO-1055	102.17	56.83	0.38	37.23	3.73
도세탁셀	108.60	54.08	0.32	21.93	3.60

일반 혈액 검사(표 5)는 BO-1055 및 카보플라틴과 도세탁셀 양자가 백혈구(WBC), 호중구(NEU) 및 혈소판(PLT) 수를 낮추었음을 보여주었다. 그러나 상기 세가지 화합물로 처리한 결과로 백혈구 감소(leukopenia)에서 유의한 차이는 없다.

정위(orthotropic) 이식된 인간 전립선 암 세포주 22Rv/HL2를 가지고 BO-1055, 카보플라틴 또는 도세탁셀로 처리된 쥐에서의 일반 혈액 검사(Complete Cell Count)(마지막 약물 처리 24시간 후 혈액 수집. n=3).

	WBC	NEU	LYM	MONO	EOS	BASO	RBC	PLT
비히클	5.10*	1.89	2.86	0.05	0.16	0.05	9.64	897
카보플라틴	1.97	1.13	0.60	0.07	0.13	0.03	9.37	369
BO-1055	2.98	0.83	1.52	0.08	0.14	0.06	9.52	195
도세탁셀	2.49	1.34	0.66	0.04	0.12	0.08	7.55	308

*RBC 값들은 10⁶/μL 다른 모든 값들은 10³/μL

실시예 7

BO-1055의 약동학적 프로파일 측정.

우레이도무스틴의 약동학(pharmacokinetics: PK)은 건강한 스프레이그 돌리(Sprague Dawley) 쥐에서 BO-1055의 단일 정맥 내 투여 및 경구 투여 후 평가되었다(표 6). 단일의 정맥 내 투여는 경정맥 내에서 유치 도관(indwelling catheter)을 통해 1.0 mg/kg의 용량 수준으로 2마리 수컷 쥐 그룹에 투여되었다. 제제는 증류수 중 10%w/v 크레모포아(Cremophor)를 함유하는 5.0%w/v DMSO중으로의 용액으로서 제조되었다. 시험 화합물 BO-1055는 구강 위관병(oral gavage)을 통해 10mg/kg 수준의 용량으로 다른 그룹의 2마리 수컷 쥐에 투여되었다. 제제는 증류수에서 0.5%w/v CMC중의 용액으로서 제조되었다. 그룹 내 모든 동물들로부터 투여 후 24시간까지 경정맥 카테터로부터 연속 혈액 샘플이 수집되었다. BO-1055의 농도 수준은 정량하한치(LLOQ)가 2.5ng/mL인 검증된 LC-MS/MS 분석을 사용하여 혈장에서 결정되었다. 각 투여량 수준에서 LLOQ 위의 혈장 농도-시간 데이터가 검증된 프로그램 WinNonlin™, 버전 5.2.1을 사용하여 BO-1055의 약동학적 파라미터 계산에 사용되었다.

약동학적 파라미터들은 표 6에 요약되어있다.

본 연구의 독성동태(toxicokinetic) 부분에서의 주요 관찰은 다음과 같다: (i) 10mg/kg(LLOQ: 2.5ng/mL)의 경구 투여 후 BO-1055의 어떤 샘플링 시간에서도 정량할 수 있는 수준이 발견되지 않았다; (ii) BO-1055의 경구 투여 후 경구 흡수는 없다. (iii) BO-1055는 낮은 혈장 클리어런스를 나타내었다(평균 CL: 18.00mL/min/kg) (iv) 정상 상태에서 분포의 평균 겉보기 부피(Mean apparent volume)는 0.15L/kg이었다. (v) BO-1055는 쥐 모델(n=2)에서 t_1/2=0.58의 반감기를 가진다.

쥐에 대하여 정맥 내 또는 경구 투여 후 BO-1055(우레이도무스틴)의 약동학적(Pharmacokinetic) 파라미터의 요약(Chien et al 2013).

그룹	용량	C0	Cmax	Tmax	t_1/2	AUC (0-last)	AUC (0-∞)	CLss	Vss
	(mg/kg)	(ng/mL)	(ng/mL)	(h)	(h)	(h*ng/mL)	(h*ng/mL)	(mL/min/kg)	(L/kg)
IV(N=2)	1	11980	ND	ND	0.58	925.81	934.93	18.00	0.15
PO(N=2)	10	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND

ND: 결정되지 않음(Not determined). 데이터가 군에 대한 PK 파라미터 결정에 적합하지 않음.

본 발명의 발명자들은 BO-1055의 PK를 더 연구하였다.

수컷 스프레이그-돌리 쥐(6주, 5마리의 수컷 쥐)를 0.9% 정상식염수(NS)에서 10mg/kg의 용량으로 대퇴 정맥을 통하여 볼루수 주사에 의하여 단일 정맥내 투여로서 처리되었다. 투여 후 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360에 경정맥으로부터 연속 혈액 샘플을 수집하였다. 검증된 HPLC-포토 다이오드 어레이 검출분석(Lin et al 2008)을 사용하여 혈장에서 BO-1055의 농도 수준이 결정되었다. 모든 약동학 분석은 WinNonlin Standard Edition Version 1.0(Scientic Consulting Inc., Apex, NC, USA)을 사용하여 수행되었다. 그 결과는 BO-1055의 평균 겉보기 제거 반감기(mean apparent elimination half-life)가 0.77h(46.4min)임을 보여 주었다(표 7). AUC(area under curve), 클리어런스(Cl), 및 최대 농도(Cmax)는 각각 267±65.3min ㎍/mL, 킬로그램 당 39.4±10.6mL/min, 및 13.4±6.17㎍/mL이었다. 결과는 BO-1055가 쥐에서 투여(10 mg/kg, 정맥내 주사) 후 급속 배분 및 느린 제거로 허용가능한 PK 프로파일을 가짐을 보여주었다. 10mg/kg 용량으로 짧은 정맥 내 투여 시간 후, 우레이도무스틴은 쥐에서 모든 장기에 빨리 분산되었고, 주로 신장에 축적되었으며, 뇌에서 제한된 양만 검출되었다(Chien et al. 2013).

투여(10mg/kg, 쥐에서 정맥 주사를 통하여(n=5)) 후 BO-1055(우레이도무스틴)의 약동학적 파라미터들(Chien et al. 2013)

약동학 파라미터
t_1/2	46.4 ± 13.1 min
AUC	267 ± 65.3 min ㎍/mL
Cl	39.2 ± 10.6 mL/min per kg
Cmax	13.4 ± 6.17 ㎍/mL

t_1/2:반감기; AUC: 곡선 아래 면적;

Cl: 클리어런스; Cmax: 최대 농도

실시예 8

우레이도무스틴의 작용 메커니즘

i) 우레이도무스틴은 DNA 스트랜드 간 크로스링킹(inter-strand cross-linking)을 유도한다(Kapuriya et al 2011)

우레이도무스틴의 작용 메커니즘은 알칼리성 아가로즈 겔 변이 분석법으로 조사하고 알킬화 약물 멜팔란과 비교하였다. 겔은 우레이도무스틴이 DNA 스트랜드간 크로스링킹을 유도할 수 있음을 보여주는데 이는 DNA 크로스링킹이 이 제제의 작용의 주된 메커니즘일 수 있다는 것을 시사한다.

도 4는 지적된대로 다양한 농도에서 우레이도무스틴(BO-1055)에 대한 대표적인 DNA 크로스링킹 겔 이동 분석을 보여 준다. 대조 레인(lane)은 싱글 스트랜드(SL) DNA를 보여주지만, 시험된 레인에서 보여주는 크로스링킹(CL)은 DNA 더블 스트랜드 크로스 링킹이다. 멜팔란(1 및 10μM)이 양성(positive) 대조군으로 사용되었다.

ii) 우레이도무스틴은 G2M 정지(arrest)를 유도한다(Kapuriya et al 2011).

세포 주기 분포에 대한 우레이도무스틴의 억제 효과가 인간 비소폐암 H1299 세포에서 연구되었다. 우레이도무스틴 처리는 이들 세포에서 유의한 G2/M 정지를 유도하였다. 또한 본 발명자들은 우레이도무스틴 처리에 따르는 증가된 sub-G1을 발견하였다(도 5).

도 5는 우레이도무스틴으로 처리함에 의한 인간 비소세포폐선암(non-small cell lungadenocarcinoma) H1299에서 세포 주기 억제를 나타낸다.

(iii) BO-1055의 흡수, 분포, 대사 및 제거 (ADME) 연구

ADME 연구가 수행되었으며 표8에 요약되었다. Caco-2 장 세포 침투 검사는 화합물 BO-1055가 장 세포에 침투할 수 없다는 것을 나타내며, 약동학적 연구는 상기 약물이 경구 투여 후 투여 및 흡수 될 수 없다는 것을 나타낸다. 약물/단백질 결합률이 높으며(99%) 이것이 약물 방출이 느려질 수 있도록 약물 리저브(drug reserve )를 제공 할 수 있음을 나타낸다. 마이크로솜 안정성 시험은 75% 였으며, 화합물이 간 대사를 통해 제거될 수 있음을 나타낸다. 낮은 hERG 결합은 시험된 화합물이 심장 독성을 일으키지 않을 것을 나타낸다.

우레이도무스틴의 초기 ADME 연구의 요약

ADME 연구를 위한 항목들	평가 기준	테스트 결과
Caco-2 Papp, 겉보기 투과율 계수(apparent permeability coefficient)(cm/sec). (10 μM))	Papp( A to B) 고 표준=18.2x10-6cm/sec(프로프라놀롤) 저 표준=0.88x10-6cm/sec(로다민 123)	Papp( A to B) = ND(10μM) Papp ( B to A) = 7.5x10-6cm/sec(10μM) 낮은 장내 투과율
P-글리코프로틴(P-gp) 유출 수송체	유출률(efflux ratio) < 2	유출률: ND 가능한 P-gp 라이어빌리티(liabilities)
단백질 결합	고 표준=99% (와파린(Warfarin), 1μM) 저 표준=17% (아세타미노펜, 10μM)	99%(2hr) 높은 인간 혈장 단백질 결합=1% free
마이크로솜 안정성	고 표준=95%(60mins) (7-EC, 2μM) 저 표준= 5%(60 mins)(와파린, 2μM)	75% (60 mins 턴오버%) (양성 대조 7-EC≥82%) 높은 내재적 클리어런스
잠재적 심장독성 화합물 억 제 확인을 위한 hERG 결합 분석(IC₅₀)	＞1μM 고 라이어빌리티: 아테미졸 (IC₅₀=4-6nM)	12.6μM 저 hERG 결합. 심장독성 아님
초기 PK(경구 생체이용률(Oral Bioavailability))	경구에 대해 F> 20%, t1/2 > 0.5hr	경구 흡수 안됨 t_1/2= 0.58hr(IV)

실시예 9

우레이도무스틴(BO-1055)의 전임상 체내 연구

i) ICR 쥐에서 정맥 내 주사 후 우레이도무스틴의 비-GLP 급성 14일 독성.

본 발명의 발명자들은 종양 이식 쥐(tumorxenografted mouse)에서 최대 내성 용량(MTD)을 결정하고 약물 처리 조건(예: 투여량 및 스케줄)을 최적화하기 위해 ICR 쥐에서 우레이도무스틴의 급성 정맥 내 주사 14일 독성을 연구하였다. 우레이도무스틴을 그룹 당 6마리의 ICR 쥐에게 상이한 용량(이중 증류수 중 50, 60, 70, 80 및 100mg/kg) 및 비히클 대조군으로 투여하였다. 쥐를 14일 동안 관찰하고 사망률 및 체중을 기록하고 우레이도무스틴의 치사량(LD₅₀)의 중간값(median)을 결정하였다(표 9). 급성 사망률은 약물 투여 후 1시간에 70mg/kg(1/6 쥐) 미만으로 처음으로 나타났고, 80mg/kg에서는 모든 쥐가 1시간 이내에 사망했다. 이들 정상 쥐에서의 BO-1055의 LD₅₀은 70mg/kg이었다.

정상 ICR 쥐에서 우레이도무스틴의 급성 정맥내 주사(acute intravenous injection) 14일 독성

	연구기간 중 발생한 사망
	투약 후 사망
용량 mg/kg	>1 hr	1-4 hrs	SD2-5	SD6	SD7	SD8	SD9	SD 10	SD11	SD12-14	사망률 (N/N)a	LD₅₀ mg/kg
0b	0	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	0/6
50	0	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	0/6
60	0	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	0/6
70	1	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	1/6	70
80	6	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	6/6
100	6	0	0000	0	0	0	0	0	0	0	6/6

aN/N: 죽은 쥐의 수/관찰된 쥐의 수. 투여 후(hrs) 칼럼은 약물 주입 후 1시간 이내에 또는 이후 3시간 이내에 발생한 사망 개체의 수를 나타냄. SD = BO-1055 주입 후 연구 일 수

bLD50: 치사량 중간값. LD ₅₀ 은 95% 신뢰 구간이 58.8~107.2mg/kg인 70mg/kg으로 계산됨. 공식은 Log 용량 = 1.73 + 0.0233 probit K임. c비히클: dd 워터

ii) 우레이도무스틴의 hERG 억제 연구 및 초기 ADME 연구

본 발명의 발명자들은 hERG FP 분석을 사용하여 우레이도무스틴의 심장 안전성(cardiac safety)을 조사하였다[Deacon et al. 2007]. 인간 에터-에이-고-고(human ether-a-go-go) 관련 유전자(hERG)는 심장 재분극에 관여하는 심장(IKr)의 내재 정류 전압 게이트 칼륨 채널(inward rectifying voltage gated potassium channel)을 인코딩한다. hERG 전류의 억제는 QT 간격 연장을 일으켜 잠재적으로 치명적인 심실 빈맥 부정맥(ventricular tachyarrhythmia)을 유발할 수 있다. 이러한 심혈관 독성 영향으로 인해 후기의 임상 시험에서 다수의 약물이 회수되어왔다. 따라서 신약 개발 초기에 저해제를 확인하는 것이 중요하다.

hERG 억제는 hERG 수용체에 대한 우레이도무스틴의 결합을 측정하기 위해 hERG 형광 분극 분석을 사용하여 연구되었다. 이 분석은 광학 신호의 변화를 일으키는 hERK 수용체(PredictorTM hERG 막)의 형광 추적자(fluorescent tracer)를 표시함에 있어 시험 화합물의 능력에 기초를 둔다. 분석은 검정색 383-웰 분석 플레이트에서 시험 화합물의 형광 추적자와의 경쟁적 결합으로부터 용량-반응 결합 곡선을 결정함으로써 수행되었다. 우레이도무스틴에 의한 hERG-특이적 결합의 IC₅₀은 약 12.6±1.64μM(n=3) 대 아테미졸(IC₅₀ 0.007μM)이었으며, 억제가 약하거나 전혀 나타나지 않고 심장 부정맥의 부작용 가능성이 거의 없음을 나타낸다. 우레이도무스틴의 농도-반응 곡선은 도 6과 같다.

도 6은 hERG 저해 평가에 의한 BO-1055 심장 독성의 평가 결과를 나타낸다. 독성을 제한하는 잘 알려진 심장 독성 용량을 가진 약물인 독소루비신(IC₅₀ 0.03±0.03)과 비교한 BO-1055(IC₅₀ 12.6μM)에 의한 결합 억제에 근거하여, BO-1055가 심장 부정맥의 부작용을 나타낼 것 같지는 않은 것으로 결정되었다.

실시예 10

우레이도무스틴에 의한 Caco-2 세포 단층(monolayer)에서의 Caco-2 투과성 및 P-글리코프로틴(P-gp) 매개 유출에 관한 연구(표 8).

(i) Caco-2 세포 단층에서의 P-글리코프로틴(P-gp) 매개 유출:

P-글리코프로틴(P-gp, 투과성(Permeability) 글리코프로틴)은 다제 내성 유전자(MDR) 서브패밀리의 매우 잘 조사된 유출(efflux) 펌프이다. P-gp는 다수의 약물을 유출시키는 데 관여하는 에너지 의존성 수송체 단백질이며 약물의 세포 내 흡수를 방해한다. Caco-2 세포 단층들에 걸친 투과성은 약물 후보 물질의 인간 투과성을 예측하고, 심층적인 기계적(mechanistic) 및 흡수 연구를 수행하고, 투과성에 대한 수송체(transporter)의 영향과 수송체-매개 약물-약물 상호작용을 연구하는 데 사용된다.

Caco-2 침투성 분석은 경구 투여 약물의 체내 인간 장(intestine) 투과성 및 생물학적 이용 가능성에 대한 체외 예측을 위한 업계의 골드 스탠더드로 간주된다. Caco-2 침투성 분석은 인접한 Caco-2 세포 단층에 걸친 수송의 속도를 측정함으로써 GIT에 걸친 치료 화합물의 흡수를 예측하는 확립된 방법을 사용한다. 세포 단층에 걸친 바소래터럴(basolateral)(A→B)에 에이피컬(apical)인 및 바소래터럴(basolateral)(B→A)에 에이피컬(apical)인 수송을 측정하면 유출률(efflux ratio)의 계산과 화합물이 활성 유출이 되는지 여부의 결정을 할 수 있다. Caco-2 분석은 시험 화합물이 도너 챔버로부터 수용체 챔버 안으로 융합 Caco-2 단층(confluent Caco-2 monolayer)이 세포 장벽을 형성하는 다공성 막을 통과하여 지나가는 것을 측정한다.

Caco-2 투과성 분석 결과는 A→B 방향의 BO-1055의 Papp 계수가 검출되지 않았음을 보여 준다. B→A 방향의 Papp 계수는 7.05x10^-6cm/sec이었다. A→B 및 B→A 방향에서 BO-1055의 질량 균형은 50% 미만이었다. 질량 균형이 80%를 초과하면 Papp의 허용 가능한 근사값을 얻을 수 있다. 수송 실험 동안 BO-1055의 상당 부분이 사라졌고 질량 균형이 좋지 않아 얻어진 Papp은 신뢰할 수 없게 되었다.

이 연구의 결과는 우레이도무스틴이 투과성이 매우 낮은 약물로 간주되어 이 약제가 경구 흡수율이 낮다는 것을 나타낸다. 또한, 우레이도무스틴의 Caco-2 세포 단층들에서 P-gp 매개 유출에 대한 연구는 P-gp 유출율(B→A/A→B)이 >>2인 것을 보여주였고, 이는 이 약제가 P-gp를 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. 이 연구는 우레이도무스틴이 경구 투여에 적합하지 않다는 것을 시사한다.

(ii) 마이크로솜 안정성

약물 대사 또는 생체 이물질 생체 변환(xenobiotic biotransformation plays)은 클리어런스, 반감기 및 경구 생체 이용률에 영향을 미치기 때문에 약물 발견에 중요한 역할을 한다. 간은 생체 이물의 신진 대사에 관여하는 주요 기관이다. 간 마이크로솜은 사이토크롬 P450 효소, 플라빈-모노옥시게나제, 카르복실에스테라아제 및 에폭사이드 가수분해효소(hydrolase)를 함유하는 소포체를 주로 포함하는 준세포 분획(subcellular fractions)이고, 따라서 제1상 대사(metabolism)의 유용한 모델을 제공한다. 제1상 반응은 산화, 환원 및/또는 가수분해를 포함하고 보조인자(cofactor)로서 NADPH를 필요로 한다. 따라서 잠재적인 약물후보 물질을 간 마이크로솜으로 배양하면 이러한 효소들에 대한 고유의 대사적 취약성을 측정할 수 있다.

쥐의 간 마이크로솜(RLM)에서 BO-1055의 대사 안정성을 7-에톡시쿠마린(Ethoxycoumarin)(7-EC)을 양성 대조군(positive control)으로 하여 연구하였다. 결과를 표 10에 나타내었다. 표 10은 RLM에서 BO-1055 및 7-EC의 겉보기 반감기가 각각 29.7 및 23.5분임을 보여준다. BO-1055는 풀링된 RLM에서 7-EC보다 더 안정적이었다.

쥐의 간 마이크로솜(microsomes)에서 60분간 배양된 BO-1055 및 7-에톡시 쿠마린(ethoxycoumarin)의 대사 안정성 파라미터 요약.

화합물	MR (nmol/min/mg)	t1/2(분)	60분에서의 잔존%	매트릭스
BO-1055	0.0203	29.7	25	RLM²
7-EC¹	0.0448	23.5	18	RLM

MR: 신진대사율(Metabolic Rate)(MR(nmol/min/mg protein) = λ*C0/Cprotein)

¹7-EC: 7-에톡시쿠마린(Ethoxycoumarin).

²RLM: 쥐의 간 마이크로솜 풀(Pooled rat liver microsomes).

실시예 11

BO-1055(우레이도무스틴)의 혈장 안정성 및 단백질 결합

신약 발견 연구(drug discovery)에서, 약물-혈장 단백질 결합에 대한 정보는 약물 후보 물질의 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 관련 특성 및 약물 동태학 관련 프로파일을 평가하고 이해하는 데 중요하다. 쥐의 혈장 단백질에 대한 BO-1055의 결합은 쥐 혈장에 BO-1055(20μM)를 첨가하고 평형(equilibrium)이 달성 될 때까지 완충액에 대해 투석하여 연구하였다. 혈장 및 완충액 중의 BO-1055의 농도를 결정하여 혈장 단백질에 결합되지 않거나 결합된 약물의 백분율을 계산하였다.

결과는 도 7 및 표 11에서 볼 수 있다. 평균 결합 값은 20μM의 공칭의 스파이크 농도에서 각각 2, 4, 6, 24h의 배양 시간에 대해 99.68, 99.69, 92.01, 및 75.17%이었다(도 7 및 표 11). 도 7은 다중-평형투석법(multi-equilibriumdialysis method)을 사용하여 쥐 혈장 단백질에 대한 BO-1055 결합의 평형 도달 시간 경과를 보여준다.

쥐의 혈장에서 BO-1055의 평균 부분 결합(fractional binding) 측정

배양 시간(h)	% bound(결합 %)	CV(%)
2	99.68	0.01
4	99.69	0.04
6	92.01	0.66
24	75.17	3.87

실시예 12

BO-1055(우레이도무스틴)는 광범위한 항종양 활성을 가지고 있다.

다양한 인간 고형 종양, 육종, 백혈병 및 림프종 세포주에 대한 우레이도무스틴 세포독성을 조사하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 시험된 세포주에 대한 우레이도무스틴의 IC₅₀ 값은 30%에서 서브-μM 범위였다. 29개의 양성 세포 유형의 패널에서 <5.00μM의 IC₅₀ 값을 가지고 있는 것은 없었고, 27%는 > 20~100μM의 IC₅₀ 값을 가졌다.

인간 암세포주 패널, 1차 환자 종양 샘플 및 세포독성 평가에 사용되는 여러 종류의 정상 조직. 각 암 유형/하위유형의 라인의 총 수 및 숫자 분리 컬럼은 BO-1055 세포독성에 민감한 그룹(IC ₅₀ <1.00μM) 또는 중간 민감성을 가진 그룹(IC ₅₀ 1.00-4.99μM), 저내성(IC ₅₀ 5.00-9.99μM), 및 고내성(IC ₅₀ 10.0μM)의 라인의 수를 보여줌.

암 세포주 암 유형/하위유형	합계	IC₅₀μM	IC₅₀μM	IC₅₀μM	IC₅₀μM
	라인	<1.00	1.00-4.99	5.00-9.99	≥10.0
	No.	민감	중간	저 내성	내성
유방암	10	3	1	0	6
대장암	4	1	0	0	3
아교모세포종	4	0	1	2	1
AML 변환 CB, BM	6	5	1	0	0
백혈병 AML	9	3	3	1	2
백혈병 AML JAK2-V617	4	0	0	0	4
백혈병 T-ALL, B-ALL, 비-T/B	5	4	1	0	0
골수종	9	1	2	1	5
난소암	11	0	3	0	8
백혈병 1차	9	5	1	3	0
림프종 B-세포 DLBCL(GCB)	11	4	7	0	0
림프종 B-세포 DLBCL(ABC)	4	1	3	0	0
림프종 맨틀 세포	7	4	2	0	1
림프종 B-세포(쥐)	2	2	0	0	0
전립선 암	3	0	2	1	0
신장암	3	0	1	1	1
유잉 육종	8	7	1	0	0
육종, 데스모플라스틱 SRCT	2	0	2	0	0
육종, 골육종	4	0	1	0	3
육종, 횡문근육종	4	3	0	0	1
육종, 활액낭(Synovial)	1	1	0	0	0
폐암NSCLC	28	2	8	1	17
폐 정립+편평(Adenosquamous+Squamous)	12	1	3	3	5
폐암 대세포	4	0	1	1	2
폐암 소세포	10	5	1	0	4
총 암세포 라인 수	174	52	44	14	63
정상 조직 다중 유형	25	0	0	4	21
정상 라인수 + 종양 라인수 합계	199	52	44	18	84

실시예 13

이종이식 모델에서 인간 암세포주 및 시험관 내 및 체내 1차 인간 종양 샘플에 대한 BO-1055 세포독성(IC ₅₀ μM).

BO-1055의 세포독성을 시험관 내에서 인간 암세포주의 패널에 대해 평가하였다. 다른 치료용 알킬화제와 기존의 화학요법제를 비교하였다. 체내 연구가 수행된 곳에서, 데이터는 누드 또는 NSG 쥐에서 이종이식 모델을 사용하여 BO-1055 치료를 하거나 또는 하지않은 상태에서 종양 성장 동력학에 제시된다.

종양 유형 및 하위유형에 따라 데이터가 알파벳순으로 제시된다.

실시예 13A

백혈병(Leukemia)

2012년 전세계에서 모든 유형의 백혈병 사례가 352,000건, 사망자가 265,000건에 이르렀고, 전세계적으로 사망률이 다양한 것으로 추정된다.

i) 백혈병의 하위유형:

백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프성 또는 림프구성 백혈병(ALL, T-세포 또는 B-세포 하위유형), 이중-표현형 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL, T-세포 또는 B-세포 하위유형) 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 세분된다. 후자는 만성기와 급성기 모두 격렬한 위기를 겪는다. 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)은 비정상적인 클론 골수 증식 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로 진행되는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)으로 나타나는 또다른 변이형이다. CMML의 하위 그룹은 PDGFRβ를 ets-like 유전자 tel과 융합시키는 t(5;12)(q33;p13) 균형있는 염색체 전위에 의해 특징지어진다(Golub et al 1994). 형태학에 근거한 FAB 분류는 8 개의 백혈병 하위그룹을 인식하지만, 보다 최근의 하위-분류는 분자 특성에 기반을 두고있다.

대부분의 형태의 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 효과적인 치료 전략 개발은 지난 수십년 동안 약해졌다. 이에 대한 원인으로는, 질병의 상당한 이질성과 여러 치료법에 대한 임상 결과 및 반응성을 예측하는 데 사용될 수 있는 분자 마커(molecular maker)의 결핍을 포함하여 여러가지 이유가 있다.

본 발명의 발명자들은 인간 T-세포 백혈병 라인 CCRF-CEM, 서브라인(subline), 택솔(taxol)에 대하여 330배의 CCRF-CEM/택솔(Taxol), 및 빈블라스틴(vinblastine)에 대하여 680배인 서브라인 CCRF-CEM/VBL에 대한 우레이도무스틴(ureidomustine)의 세포독성을 평가하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, BO-1055는 모 CCRF-CEM 세포주의 상응하는 IC₅₀과 비교하여, 각각, CCRF-CEM/택솔 및 CCRF-CEM/VBL에 대해 단지 9.4 또는 6.2배 감소된 세포독성을 갖고, 이는 이 약제가 택솔 또는 빈블라스틴과 현저히 교차-내성이 아님을 나타낸다. 이 데이터는 또한 BO-1055가 막 다약제 내성 수송체(membrane multidrug resistance transporter)(즉, p-당단백질)에 대한 좋은 기질이 아니고 또한 돌연변이된 튜불린과 상호작용하지 않는다는 것을 보여주는 다른 증거를 뒷받침한다.

인간 T-세포 백혈병 세포주 CCRF-CM 및 파클리탁셀(Paclitaxel)-내성(CCRF-CEM/Taxol) 또는 빈블라스트-내성(CCRF-CEM/VBL) 서브라인에 대한 우레이도무스틴(BO-1055) 독성(IC ₅₀ μM)

화합물(Compound)	CCRF-CEM (μM)	CCRF-CEM/Taxol a (μM)	CCRF-CEM/VBL b (μM)
우레이도무스틴 (ureidomustine)	0.13±0.002	1.22±0.02[9.4x] c	0.80±0.01[6.2x]

a CCRF-CEM/Tax는 모 세포주 CCRF-CEM보다 330배 더 내성이 있고;

b CCRF-CEM/BVL은 모 세포주 CCRF-CEM보다 980배 더 내성이 있으며;

c 괄호 안의 숫자는 모 세포주의 상응하는 IC₅₀과 비교하여 결정된 교차-내성의 표시이다.

ii) MLL-AF9- 불멸화 인간 조혈 세포주의 발달

MLL 유전자의 염색체 재배열은 고-위험 유아, 소아, 성인, 및 치료-유도 급성 백혈병과 관련되어 있다. 지금까지, 약 80가지의 직접적인 MLL 융합과 약 120가지의 상호 MLL 융합이 분자 수준에서 특징지어졌다. MLL-AF9 융합 유전자는 전위 t(9;11)(p22;q23)에서 비롯되었고 유아의 골수 및 림프계 계통의 공격적인 백혈병과 관련이 있는 반면, 성인에서는, 이 전위가 주로 급성 골수성 백혈병과 연관되어 있다. 외부 신호에 의존하여, 인간 신생 CD34+ 세포는 MLL-AF9 발현시 골수 또는 림프계 계통을 따라 쉽게 불멸화되고 면역-손상된 쥐에서 주로 림프성 백혈병을 일으킨다. 대조적으로, 성체 골수 CD34+ 세포의 불멸화는 달성하기가 더 어렵고 MLL-AF9가 정제된 조혈 줄기 세포(HSC)에서 발현되더라도 골수-편향된다(Horton et al. 2013). 트랜스크립톰(Transcriptome) 분석은 MLL-AF9 발현 세포에서 HSC의 증식을 확인했지만 전구 유전자 표지는 확인하지 못했다.

성체 세포에서는 관찰되지 않았지만, MLL-AF9를 발현하는 신생 세포는 예후가 좋지 않고, 화학요법제 및 MYC 신호전달에 대한 내성과 관련된 유전자 표지가 풍부해졌다. 이러한 결과는 신생 세포가 본질적으로 성체 세포보다 MLL-AF9-매개 불멸화에 더 많이 걸리기 쉽다는 것을 나타낸다(Horton et al. 2013). Mulloy와 그 외(Wei et al 2008)는 인간 CD34+ 세포에서 MLL-AF9의 발현이 면역-결핍 쥐에서 급성 골수성, 림프성, 또는 혼합-계통의 백혈병을 유도한다는 것을 보여주었다. 일부 백혈병 줄기 세포(LSC)는 다능성이었고 쥐의 성장 인자 또는 수용체 균주를 변경하여 계통을 지휘할 수 있었고, 이는 미세-환경 신호의 중요성을 강조한다. 다른 LSC는 정확하게 계통을 지휘하였고, 이는 MLL 질병에 있는 줄기 세포 구획의 이질성을 보여준다.

약리학적 또는 유전학적 수단으로 Rac 신호전달 경로를 표적으로 삼는 것은 MLL-AF9 세포의 신속하고 특이적인 세포사멸을 가져왔고, Rac 신호전달 경로가 MLL-재배열된 AML에서 유효한 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다. 불멸의 세포에 대해 예상했듯이, 우리가 테스트한 모든 세포주는 텔로머라제 양성이다.

MLL-AF9 단백질이 hTERT 발현/활성을 스스로 활성화시키거나 hTERT를 정상적으로 발현하는 세포의 성장을 촉진하는지의 여부는 아직 결정되지 않고 있다. MLL t(9; 11)은 MLL에 관련된 다른 유전적 변형과 비교하여 AML-M5에서 예후적으로 유리하다고 여겨진다. MLL은 유전자 전사의 양성 광범위한 조절인자로 간주되는 히스톤 메틸전이효소이다. 이 단백질은 전사활성화 도메인(transactivation domain) 9aaTAD를 포함하는 히스톤-조절(histone-modifying) 효소 군에 속하고 전사 기억의 후성적(epigenetic) 유지에 관여한다.

iii) BO-1055 세포독성의 평가에 사용된 MLL-AF9 세포주

a) 성장 인자-의존성 및 세포 밀도 성장 의존성 세포주. MLL-AF9 유전자로 형질도입된 인간 제대혈 CD34+ 세포: MA-10, MA-18. MLL-AF9 유전자로 형질도입된 인간 골수 CD34+ 세포: MA-23. MLL-AF9 및 N-ras 유전자가 형질도입된 인간 제대혈 CD34+ 세포: MA-9.3, MA-9.6.

b) 성장 인자 독립성 백혈병 세포주. Flt3 ITD(W51)로 형질도입된 인간 MA-10 세포를 성장 인자없이 시험관 내 증식에 적응시켰다(Moore Laboratory). 인간 AML 세포주 THP-1(MLL-AF9); MOLM-13(MLL-AF9 및 Flt3 ITD); 카스미(Kasumi)(AML1-ETO); MV4;11(MLL-AF4 및 Flt3 ITD); Set2(Jak2 V617); HEL(Jak2 V617).

iv) BO-1055는 급성 골수성 백혈병 세포주에 대해 높은 세포독성을 가지지만, 돌연변이된 JAK2T를 갖는 백혈병 세포주에는 그렇지 않다.

표 14 및 도 8에 도시된 바와 같이, BO-1055는 3/7 AML 세포주(IC₅₀ 0.18-0.45μM)에 대해 세포독성이 매우 높았고,

2개의 JAK2 V617 돌연변이 계통이 고(highly) 내성이고(IC₅₀≥10μM) 1개의 AML-ETO AML 계통이 고 내성이고(IC₅₀ 80.0μM), 1개의 중간정도의 세포독성(IC₅₀ 1.50μM)을 나타내었다. MLL-AF9을 정상 CB CD34+ 세포(MA10, MA18) 또는 성체 BM CD34+ 세포(MA23)에 형질도입하여 개발된 세포주는, BO-1055(IC₅₀ 0.25-0.40uM(도 8)에 대해 균일하게 매우 민감했다. 2종의 종양원성으로 형질도입된 정상 CB CD34+ 세포는 또한 형질도입된 MLL-AF9+Flt3ITD(IC₅₀ 0.40uM) 또는 MLL-AF9+N-RASmut(IC₅₀ 0.81-2.91uM)의, BO-1055에 대해 매우 민감했다. 정상 CB CD34+(IC₅₀ 9.9-10.2uM)에 대한 세포독성과 비교하면 정상 CB 또는 BM CD34+ 세포에 MLL-AF9 종양원성 융합 유전자를 도입하면 BO-1055 세포독성이 25-40배 증가한다는 결론을 얻을 수 있다. 두번째 종양원성(Flt3ITD or N-Ras)의 첨가는 MLL-AF9로만 관찰된 것보다 BO-1055에 대한 민감성을 더 향상시키지 못했다.

v) BO-1055는 일부 분자 하위유형에서는 급성 골수성 백혈병 줄기 세포에 대해 세포독성이 크지만 다른 물질에서는 그렇지 않다.

백혈병 줄기 세포(LSC)에 대한 BO-1055 세포독성은 상이한 분자 하위유형의 6개의 주요 소아 AML 샘플을 사용하여 결정되었다. LSC에 대한 분석은 2주의 조약돌 영역-형성 세포의 측정과 함께 MS5 공동-배양 분석을 사용하여 수행되었다(Schuringa et al 2004, Chung et al 2005, Moore et al 2007). 표 14에 나타난 바와 같이, 환자 샘플로부터의 LSC는 BO-1055(IC₅₀ 0.12-0.90μM)에 매우 민감하다. 이러한 예들은 BO-1055가 그밖에 예후가 매우 안 좋은 AML 그룹의 효과적인 치료제일 수 있음을 나타내는 나쁜 예후의 분자 하위유형들(Monosomy 7, MLL-AF9 및 Flt3ITD)이다. del17과 예후가 좋은 NPM1 돌연변이 및 Inversion 16을 가진 환자는 정상 HSC보다 BO-1055(IC₅₀ 6.25-7.0μM)에 더 민감했지만 치료 범위(therapeutic window)는 좁았다.

AML, T-ALL 및 상이한 분자 하위유형 및 MLL-AF9±NRAS 또는 Flt3ITD로 형질전환된 HSC의 AML의 1차 환자 샘플을 포함하는 27개의 백혈병 세포주의 패널 상의 BO-1055, 테모졸로마이드(Temozolomide(TZM)) 및 멜팔란(Melphalan)의 IC ₅₀ (μM).

백혈병 급성 골수(Leukemia Acute Myeloid(돌연변이(mutation), 전위(translocations))	BO-1055	TMZ	Melph
HL-60 CDKN2A, NRAS, p53 del.	1.50	49.0	0.17
Kasumi-1 AML-ETO	80.0	389.0	0.004
MOLM13 MLL-AF9	0.18
MV4;11 MLL-AF4 +Flt3ITD	0.30
THP-1 MLL-MLLT3, CDKN2A/B del, PTEN del.	0.45
AML JAK2-V617 mut
HEL	≥10.0
SET2	≥10.0
백혈병 AML HSC-유래
AML 9.3 MLL-AF9+NRAS	0.81
AML 9.6 MLL-AF9+NRAS	2.91
MA-10 CB+MLL-AF9	0.35
MA-10-W51 CB MLL-AF9+Flt3ITD	0.40
MA-18 CB+MLL-AF9	0.40
MA-23 BM+MLL-AF9	0.25
AML Patients LSC
AML-1 Monosomy 7	<0.20
AML-2 MLL-AF9	0.12		7.00
AML-3 Flt3ITD	0.90
AML-4 t-AML, del17(p)	7.50
AML-5 NPM1	7.50
AML-6 Inversion 16	6.25
AML-13	0.31		7.00
백혈병 T-ALL
CCRF-CEM	0.68	424.0	0.001
CCRF-CEM/VBL	0.80
CCRF-CEM/탁솔	1.22	502.0
COG-LL-317		181.0	0.001
JURKAT	2.50	2.07	0.25
MOLT-4		181.5.	0.001
환자 샘플(Patient Samples) B-ALL, T-ALL
인간B-ALL	1.05		30.0
인간T-ALL	1.00

(vi) 정상 CB CD34+ 세포를 AML 및 A.Mon.L 세포주 및 종양유전자-형질도입된 CD34+ 세포와 비교한 BO-1055 세포독성의 투여량-반응 분석.

도 8 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 정상 조혈 전구 세포(CB CD34+FBS 또는 SF)는 BO-1055(IC₅₀ 9.9-10.2μM)에 내성이 있었다. 대조적으로, A. Mon. L 세포주 THP1 및 MOLM13은 매우 민감했다(IC₅₀ 0.18-0.45μM). CB-유래 MLL-AF9 형질도입 라인(line) MA-10 및 MA-18 및 BM-유래 MLL-AF9 형질도입 라인 MA-23은 BO-1055 세포독성(IC₅₀ 0.25-0.40μM)에 매우 민감하였다. MA10 W51 세포주(CB MLL-AF9+Flt3ITD)는 성장 인자 독립성 및 성장 인자(hGM-CSF 또는 hIL-3) 의존성 서브-라인으로 유지되었다. 전자는 후자(IC₅₀ 0.28-0.40μM)보다 BO-1055 세포독성(IC₅₀ ~10μM)에 대한 내성이 더 컸다. MA-9.3과 MA-9.6 CB MLL-AF9+NRAS 라인은 BO1055에 대해 민감성이 다른데 전자는 매우 민감하고(IC₅₀ 0.81μM) 후자는 덜 민감하다(IC₅₀ 2.91μM).

도 9는 성장 인자 의존성 MA-10-W51 세포(MLL-AF9 융합 유전자 및 돌연변이된 Flt3ITD로 형질도입된 정상 CD34+)의 증식에 대한 BO-1055의 효과를 나타낸다. 성장 인자 의존성 MA-10-W51 세포에 대한 BO-1055와 BO-1978의 용량 적정 비교는 두 화합물 모두 BO-1978이 BO-1055보다 훨씬, 높은 세포독성이 있음을 보여준다.

(vii) 5개의 정상 인간 조직 및 3개의 악성 백혈병- AML 세포주, 1차 AML 및 1차 B-ALL에 대한 IC ₅₀ 의 비교에 의해 결정된, BO-1055, 4가지 알킬화 약물, 미세관(microtubule) 결합 약물, 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor), HSP90 억제제 및 안트라시클린 항종양 항생제의 "치료 범위".

MV4;11 AML 세포주와 1차 소아용 AML-2와 B-ALL 세포의 BO-1055로 얻은 치료범위는 정상 기관지 상피(Bci-NSI), 나팔관 상피(FTEC), 내피(HUVEC), 골수 간엽 기질(huMSC), 및 정상 제대혈 조혈 전구 세포(CD34+ 세포, CFC)에 대한 BO-1055 독성의 결핍을 두드러지게 한다. 이는 백혈병에 대한 BO-1055의 높은 세포독성과 대조적이었다(표 15). 중요한 것은 알킬화 약물 4-HC(시클로포스파마이드(cyclophosphamide)의 활성 대사산물), 벤다무스틴(bendamustine), 시스플라틴(cisplatin), 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제 에토포사이드(etoposide) 및 SN38, HSP90 억제제 PU-H71, 안트라시클린 항종양제 항생제(anthracycline antitumor antibiotic)(독소루비신(doxorubicin)) 및 마이크로튜블 결합 알칼로이드(빈크리스틴(vincristine))가 부족하다는 점이고, 이는 주로 정상 CFC에 대한 독성 때문이다.

AML 세포주(MV4; 11), 1차 AML(AML-2) 및 1차 B-ALL에 대한 독성과 5개의 정상 인간 조직 유형에 대한 독성(IC ₅₀ μM)을 비교한, BO-1055, 알킬화 약물 및 기타 화학요법 약물의 치료 범위 측정.

1. 화학물(Chemical)	CD34+	HUVEC	huMSC	NSI	FTEC	MV4;11
BO-1055	50.00	166.67	66.67	133.33	266.67	1.00
4-HC	1.34	27.00	27.00	12.00	8.33	1.00
Benamustine	0.17	2.50	5.00	2.50	6.67	1.00
멜팔란(Melphalan)	7.00	320.00	160.00	ND	ND	ND
시스플라틴(Cisplatin)	0.75	6.25	2.50	3.75	12.50	1.00
독소루비신(Doxorubicin)	10.53	18.42	23.68	26.32	328.95	1.00
에토포시드(Etoposide)	0.23	0.90	180.00	1.28	512.82	1.00
PUH71	1.00	7.78	14.00	33.33	1777.8	1.00
SN-38	1.17	66.67	33.33	83.33	333.33	1.00
빈크리스틴(Vincristine)	5.20	0.56	14.00	444.44	555.56	1.00
2. 화학물(Chemical)	CD34+	HUVEC	huMSC	Bci-	FTEC	AML-2
BO-1055	48.00	160.00	64.00	128.00	256.00	1.00
4-HC	0.64	12.96	12.96	5.76	4.00	1.00
Benamustine	0.50	7.50	15.00	7.50	20.00	1.00
멜팔란(Melphalan)	1.00	45.71	22.86	ND	45.71	μ ) 1.00
시스플라틴(Cisplatin)	0.10	0.83	0.33	0.50	1.67	1.00
독소루비신(Doxorubicin)	1.03	1.79	2.31	2.56	32.05	1.00
에토포시드(Etoposide)	0.94	3.68	738.95	5.26	2105.3	1.00
PUH71	0.50	3.89	7.00	16.67	888.89	1.00
SN-38	7.00	400.00	200.00	500.00	2000.0	1.00
빈크리스틴(Vincristine)	2.60	0.28	7.00	222.22	277.78	1.00
3. 화학물(Chemical)	CD34+	HUVEC	huMSC	Bci-	FTEC	B-ALL
BO-1055	12.00	40.00	16.00	32.00	64.00	1.00
4-HC	0.40	8.10	8.10	3.60	333.33	1.00
Benamustine	0.13	1.88	3.75	1.88	555.56	1.00
멜팔란(Melphalan)	0.23	10.67	5.33	ND	1.67	1.00
시스플라틴(Cisplatin)	0.10	0.83	0.33	0.50	20.00	1.00
독소루비신(Doxorubicin)	1.03	1.79	2.31	2.56	256.00	1.00
에토포시드(Etoposide)	0.94	3.68	738.95	5.26	160.00	1.00
PUH71	0.29	2.24	4.04	9.62	32.05	1.00
SN-38	0.78	44.44	22.22	55.56	2105.3	1.00
빈크리스틴(Vincristine)	0.16	0.02	0.42	13.33	45.71	1.00

(viii) 외인성 hGM-CSF 투여가 있거나 없는 THP-1 단핵구 백혈병의 이종이식편에서 종양-개시 세포 빈도의 측정.

생착을 보장하는 데 필요한 백혈병 세포의 수를 측정하기 위해, NSG 쥐에 1x10³-3x10⁶ GFP-루시페라제(Luciferase) 형질도입 THP-1 AML 세포를 8마리의 NSG 쥐로 정맥내 주입하였다.

4마리의 이식된 쥐를 추가로 처리하지 않았고(도 10a) 그리고 4마리는 종양 주사시 40일 동안 하루에 1㎍의 인간 GM-CSF를 방출시키는 삼투압 미니펌프(Alzet)를 피하 주입시켰다. 두 그룹의 쥐는 7주에 생체영상을 얻었다(bioimaged).

도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 외인성 인간 GM-CSF이 없는 생착은 THP-1 세포의 최고 투여량(3x10⁶)에서만 검출되었다. 증가된 생착은 이 세포주의 종양-개시 세포의 검출에서 1x10⁶ 및 1x10⁵ -30-배 증가한 hGM-CSF로 처리된 쥐에서 명백하게 나타났다.

(ix) 인간 MLL-AF9-전위 AML 세포주 MV4;11을 이식한 NSG 쥐의 BO-1055 처리.

MSG 쥐에 10⁵ MV4를 이식하였고; 11-GFP/루시페라제 형질도입 세포를 수컷 12주-령의 NSG 쥐 10마리 각각에 정맥내 주사하였다. BO-1055(d14 x5에서 시작하여 매초 30mg/kg)의 세포독성은 배지(media)를 단독으로 수용한 5마리 쥐와 함께 5마리 쥐에서 측정하였다.

도 11은 이 실험의 결과를 나타낸다. 왼쪽의 세 패널은 MV4-11-GFP-루시페라제 세포만 주입된 쥐를 나타내고; 오른쪽의 세 패널은 MV4-11-GFP-루시페라제 세포가 주입되고 우레이도무스틴으로 더 처리된 쥐를 보여준다.

도 11에 도시된 바와 같이, 4/5 대조군 쥐(왼쪽 패널)는 낮은 생착만을 갖는 쥐 1마리를 사용하여 28일까지 급성 증식 종양을 나타냈다. 이 시점에서 BO-1055 처리 그룹(오른쪽 패널)에서 일주일 전에 비해 2마리의 쥐의 종양이 발견되지 않았고 3마리의 쥐에 매우 작은 종양이 남아있어 종양 주입에서 매우 현저한 감소가 있었다. 28일까지 5마리의 BO-1055 처리된 쥐 중 어느 것에서도 현저하게 검출가능한 종양이 관찰되지 않았다. 이 시점에서 대조군에서는 2마리의 쥐가 다량의 종양으로 인해 안락사되어 있었고 나머지 쥐는 28일째 영상촬영 직후 안락사가 필요한 광범위한 종양을 보였다.

x) GFP/루시페라제를 발현하는 인간 MA10 세포를 이식한 NSG 쥐의 BO-1055 처리

MA10은 MLL-AF9 융합 암유전자와 활성화된 Flt3 돌연변이(FltITD)를 정상 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구세포에 레트로바이러스 형질도입하여 개발한 hGM-CSF-의존성 AML 세포주이다. GM-CSF가 시험관 내 또는 체내에서 NSG 쥐에 존재하지 않는 경우, MA10 세포는 증식하지 않았다. GM-CSF는 제한적인 종(species)이어서, 인간 사이토카인은 쥐에서 활성이 없고 쥐 GM-CSF는 인간 세포에서 활성이 없다.

본 발명의 발명자들은 MA10 세포를 이식한 NSG 쥐에 1㎍의 인간 GM-CSF를 매일 복강내 주입하면 이들의 생착 및 팽창을 유지할 수 있음을 보였다(데이터는 표시되지 않음). 발명자들은 또한 1ug/일의 인간 GM-CSF를 42일 동안 방출하는 삼투압 미니펌프(Alzet)의 피하 이식은 MA10 세포의 지속적인 확장을 유지함을 보였다.

도 12는 사이토카인을 지원하지 않거나(왼쪽) 또는 미니펌프 이식으로 인간 GM-CSF를 투여한(오른쪽) NSG 쥐에서 GFP/루시페라제를 발현하는 100만 MA10 세포의 정맥내 이식 결과를 보여준다. 생체영상화는 28일에 수행되었다.

도 12는 100만 세포의 정맥내 주입 후 18일째에 미니펌프 유무에 따른 MA10의 비교 생착을 나타낸다. 18-25일까지 hGM-CSF가 없이 생착이 없는 경우(왼쪽 쥐 2마리) GM-CSF의 존재하에서만(오른쪽 쥐 2마리) 루시페라제 생체영상으로 입증된 현저한 백혈병 생착이 나타났다. BO-1055 단일요법에 대한 인간 백혈병 이종이식의 이러한 극적인 반응은, 누드 쥐(nude mouse) 이종이식과 달리 화학요법제에 의한 약물 감량 이후 종양 박멸을 촉진할 수 있는 기능성 NK 세포 또는 잔류 T 또는 B-세포 기능이 없었기 때문에, 특히 두드러졌다.

xi) MLL-AF9 및 구조적으로 활성인 Flt3 내부 순차 중복(internal tandem duplication)(W51)으로 형질도입된 MA-10-W51 제대혈 CD34+ 세포를 이식하고 단회 투여 BO-1055로 처리한 NSG 쥐의 BO-1055에 대한 이종이식편 연구.

NSG 쥐(6마리의 그룹)에는 hGM-CSF를 생산하는 미니펌프를 피하 이식하고 제대혈 CD34+ 세포에 MLL-AF9 및 Flt3ITD 암유전자를 형질도입하여 생성된 예후가 좋지 않은 백혈병을 나타내는 10⁶ MA-10-W51 세포를 정맥내 주입하였다. 백혈병 세포 주입 10일 후 30mg/kg의 BO-1055의 단일 투여량을 쥐의 절반에 투여하고 나머지는 단독으로 배지를 주입하였다.

도 13에 도시된 바와 같이, 이 백혈병은 서서히 자랐지만 50일째까지 모든 대조군 쥐(왼쪽)에서 명확하게 생착된 반면 BO-1055 처리된 쥐(오른쪽)에서는, 기껏해야 발견되지 않거나 기준에 달하지 않는 정도로 나타났다. 이 종양 억제 효과는 30mg/kg BO-1055의 단회 투여만으로 얻어졌기 때문에 특히 현저했다.

xii) 1차(MLL-AF9+) 소아 AML에 대한 BO-1055의 시험관 내 및 체내 세포독성.

진단시 MLL-AF9+ AML 소아 환자의 골수 샘플을 채취하여 GFP/루시페라제 융합 유전자를 발현하는 렌티벡터(lentivector)로 형질도입하였다. GFP+CD34+ 세포를 FACS로 분리하고 10⁵ 세포는 6마리의 12주령의 NSG 쥐 각각에 정맥내 주입하였다. 쥐를 사이를 띄워서 촬영하고 초기 생착 후 35일째에, 쥐의 절반이 BO-1055 치료(격일 30mg/kg x5)를 시작했고 절반은 대조군 배양을 받았다.

도 14에 나타난 바와 같이, 치료된 쥐에서는 검출가능한 백혈병이 없었지만 모든 대조군 쥐에서는 점차적으로 백혈병이 진행되었다. 치료군에서 한 마리의 쥐는 치료 개시 후 24시간 후에 사망했지만 치료와 관련이 없었다. BO-1055 치료된 쥐는 47일(최종 약물 치료 후 4일)까지 검출가능한 종양 없이 종양 퇴화를 보여주었다.

xiii) 두번째 관 MLL-AF9+AML-2로 이식된 NSG 쥐의 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 생존 분석.

도 15에 나타난 바와 같이, MLL-AF9+ 백혈병 소아 환자의 1차 AML 샘플로부터의 6x10⁶세포를 정맥내 주입한 쥐들은 모두 160일 동안 죽었지만 백혈병 세포 주사 후 7일부터 BO-1055(30mg/kg Q10D2x)로 치료된 그룹은 48일 더 길게 살았다. 이 반응은 주사된 백혈병 세포의 상대적으로 많은 수, 및 백혈병의 좋지 않은 예후 표현형을 고려할 때 특히 중요했다.

xiv) 1차 소아 B-ALL에 대한 BO-1055의 시험관 내 및 체내 세포독성.

B-ALL 소아 환자의 골수 샘플을 0.001-20.0μm의 투여량 범위에서 정량 BO-1055의 존재 또는 부존재하에 시험관 내에서 배양하였다.

용량 반응 곡선은 FBS-함유 배지 또는 혈청이 없는 배지에서 유지된 정상 제대혈 CD34+ 세포를 사용하여 얻은 결과와 비교되었다(그림 16). BO-1055는 B-ALL 세포에 높은 세포독성을 보였으나(IC₅₀ 0.30μM) FCS-함유 배지 또는 무-혈청 배지(보충제가 첨가된 "혈청 대체" 배지)의 정상 제대혈 CD34+ 세포는, BO-1055 독성(IC₅₀ 8.5-10.5μM)에 상대적으로 내성이 있었다. 그 다음 B-ALL 세포를 GFP/루시페라제 융합 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고 FACS에 의해 GFP+ CD34+ 세포를 분리하였다(도 17).

xv) 1차 B-ALL의 FACS 분석.

도 17은 1차 B-ALL 세포가 피콜(Ficoll) 밀도 구배에 의해 분리되고 CD34 친 화성 칼럼에 의해 추가로 선택된 저밀도 세포가 FACS에 의해 CD34 및 CD19 발현이 분석된 실험 결과를 나타낸다.

FACS 분석에서 CD34와 B-세포 마커(marker) CD19를 결합한 결과, 1차 샘플에서 19.3%의 세포가 CD34였다. 이 CD34 세포의 대다수는 CD34+ CD19+ 이중 양성이었다. 친화성 컬럼 분리 후, 100%는 CD34+이고 98.4%는 이중 양성 CD34+ CD19+이었다(도 17).

xvi). NSG 쥐에서 이식 후 1차 소아 B-ALL 세포의 장기 분포.

NSG 쥐에 2백만개의 CD34+ B-ALL 세포 또는 2백만개의 분리되지 않은 세포를 이식하였다. 이식 후, 장기 분포는 인간 CD34 및 인간 CD19에 대한 단일클론 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 결정되었다(표 16). 거대한 비장 확대는 3억1천-4억개의 세포를 가진 지라의 세포질에서 나타났고, 정상 NSG 쥐와 비교하여 세포질이 30-40배 증가했다. 이 증가의 63-74%는 인간 CD19+ 세포의 확장으로 인한 것이고 이들 중, 50-54%는 CD34+ B-ALL 세포였다. 이식된 세포들은 또한 대퇴골 당(per femur) 37-56백만개의 세포로 광범위하게 골수에 침투하였고 이들 92-96%는 인간 CD19+이고 68-81%는 인간 CD34+ CD19+이었다. B-ALL 세포는 또한 말초 혈액에 존재하였다(1% 인간 CD34+CD19+ 및 2% CD34-CD19+ 세포).

NSG 쥐에서 이식 후 생착 및 조직 분포 인간 1차 B-ALL 세포.

조직	세포 수	hCD34+CD19+	hCD34-CD19+
#1* 지라	3억 7천만	50.17%	12.62%
#1 BM	4천만	81.18%	14.68%
#2* 지라	3억 1천만	53.53%	12.24%
#2 BM	37백만	74.44%	20.97%
#3* 지라	3억 9천만	46.59%	20.67%
#3* BM	41백만	79.13%	16.02%
#4 지라	3억 1천만	48.95%	17.73%
#4 BM	38백만	68.20%	27.64%
#5 지라	4억	50.43%	23.44%
#5 BM	56백만	68.22%	24.33%

*: #1-#3은 2백만개의 CD34+ 세포를 수용하였고, #4-#5는 2백만개의 정상 세포를 수용하였다.

xvii) 1차 Pre-B-ALL-GFP-Lu 세포를 정맥내 이식한 NSG 쥐에 BO-1055가 미치는 영향

도 19에서 사용된 1차 Pre-B-ALL 세포를 이식한 6마리의 쥐들은 BO-1055 치료의 시작 7일 이내에(7일부터 Q10D2x 시작) 급속한 종양 성장 및 종양 성장 억제를 보였다(도 18).

도 18은 각각 3마리 쥐의 4개의 생체영상 사진 패널을 도시한다. 왼쪽의 세 패널은 Pre-B-ALL CD34-GFP-루시페라제 세포와 대조 배지만이 주사된 쥐를 보여주고; 그리고 오른쪽의 세 패널은 Pre-B-ALL CD34-GFP-루시페라제 세포가 주사되고 추가로 우레이도무스틴으로 치료된 쥐를 보여준다.

71일까지, 대조군 쥐는, 주로 척추 및 두개골의 골수 내에서, 광범위한 종양 침윤이 있었지만 살아있는 두 BO-1055 치료된 쥐 중 하나는 검출가능한 종양이 없었고 다른 하나는 주로 대퇴골 및 상완골의 머리에 작은 백혈병 병소(foci)를 가졌다. 세 번째 쥐는 종양 발달이나 치료와 무관한 원인으로 사망했다. 이 데이터는 BO-1055 치료된 쥐에서 종양 성장의 유의적인 2로그(log) 감소를 나타낸다.

BO-1055 치료를 하거나 하지 않은 이종이식편 연구에서 1차 B-ALL 종양-보유 쥐에 대해 계산된 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 생존 곡선이 도 19에 도시되어있다. BO-1055의 이러한 스케줄은 약물 치료된 그룹에서 대조군-치료된 그룹보다 100일 이상 오래 생존하는 종양-보유 쥐의 전반적인 생존에 매우 중요한 영향을 미쳤다.

실시예 13B

폐암(LUNG CANCER)

2014년 전세계적으로 160만건의 폐암이 발생했다. 미국에서는 159,260건의 사망자와 5년 생존율이 16.8%인 224,210건의 새로운 케이스가 있었다. 초기 단계(IA)에서 진단을 받는 경우 5년 생존율은 49%이지만 IV 단계에서 진단된다면 1%이다.

(i) 폐암의 하부유형(Lung cancer subtypes).

폐암은 크고 예외적으로 악성의 이종 집단이다. 세계보건기구(WHO: World Health Organization) 자료형 체계(Brambilla et al. 2001)의 2004년 개정안에서 50가지 이상의 다양한 조직학적 변형체가 명시적으로 인정되었다. 폐암은 조직학적 유형에 따라 비-소세포 폐암(NSCLC)과 소세포 폐암(SCLC)으로 크게 분류된다.

(ii) 비-소세포 폐암(Non-Small Cell LungCancer(NSCLC))

NSCLC는 선암, 대세포암 및 편평세포암으로 세분될 수 있다. 선암은 편평(30%), 소-세포(13-15%), 및 대-세포(9-10%)에 이어 가장 빈번한 암(전체 폐암의 40%)이다(Travis et al. 2004). 드문 하부유형에는 거대세포암, 육종성암, 육종양암 및 유두샘암이 있다. 세기관지암은 여성 비-흡연자에서 더 자주 발생하고 예후가 좋은 선암의 하부유형이다. 다수의 세포주가 이들 하부유형으로부터 유도되고, 그리고 일부 세포주는 하부유형 예를 들어 선편평세포주 하나 이상의 하부유형의 특징을 가질 수 있다. K-Ras 원-종양유전자의 돌연변이는 폐 선암의 10-30%를 차지하고 비-소세포 폐암의 약 4%는 EML4-ALK 타이로신 키나아제 융합 유전자를 포함한다(Sasaiki et al 2010). 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR)의 돌연변이와 증폭은 NSCLC에서 흔히 나타나고 EGFR-억제제 치료의 기초를 제공한다. Her2/neu는 덜 자주 영향을 받는다(Dempke et al. 2010). 종종 돌연변이되거나 증폭되는 다른 유전자들은 c-MET, NKX2-1, LKB1, PIK3CA 및 BRAF이다(Dempke et al. 2010, Dela Cruz et al. 2011).

(ⅲ) 43개의 NSCLC 세포주 패널에서 4개의 알킬화 약물과 비교한 BO-1055의 세포독성.

선암(30개의 라인(line)), 선편평세포암(4개의 라인) 및 편평상피(9개의 라인)를 포함한 형태학적 하부유형을 다루기 위해 NSCL 라인의 광범위한 패널을 결집하였다.

표 17은 비-소세포폐암선암, 편평상피암 및 혼합된 아데노- 및 편평상피 형태학을 나타내는 세포주의 45개의 인간 세포주 대표 패널에 대해 4개의 다른 알킬화 화학요법제인- 알킬화 백금 약물인 카보플라틴 및 시스플라틴, 및 알킬화 약물 멜팔란 및 BCNU(벤다무스틴)을 비교한 BO-1055의 IC₅₀의 값을 보여준다. 이 중, 38개의 라인은 BO-1055 세포독성에 대해 평가되었고 18개는 내성이 있는 것으로 발견됐고(IC₅₀ ≥10uM), 6개는 약한 내성이 있었고(IC₅₀ 5.0-9.9uM), 13개는 약한 민감성이 있었고(IC₅₀ 1.0-4.9) 그리고 단 1개는 매우 민감했다(IC₅₀ <1.0uM). 상기 선암 그룹에서 9/26 라인은 EGFR, KRAS(x2) HER2/4, EML4-ALK(x2), TP53, BRAF, 및 결실된 SMARCA4에 돌연변이가 있는 라인을 포함한, 중등도 내지 고도의 BO-1055 화학-민감성 그룹에 있었다. 편평상피 및 아데노-편평상피 그룹에서 5/12 라인은 중등도의 민감성이 있었고 7/12은 BO-1055에 대해 중등도 내지 고도의 내성이 있었다. 중등도로 민감한 그룹에서 상향조절되거나 돌연변이된 종양유전자는 PIK3C, KRAS, FGFR, CDKN2A, 및 TP53을 포함하였다.

이러한 관찰 결과 BO-1055의 세포독성은 동일한 돌연변이를 가진 세포주가 민감하거나 내성이 있을 수 있기 때문에 암의 돌연변이 상태에 의해 크게 결정되지 않는다고 결론지을 수 있다. 폐암 세포주에서 BO-1055에 대한 각각의 민감성의 분자적 기초가 결정되어야 한다.

30개의 NSCLC 선암종, 4개의 폐 아데노-편평상피 세포주, 및 9개의 폐 편평상피 세포 암주에서 4가지 알킬화 약물, 카보플라틴, 시스플라틴, 멜팔란, 및 BCNU와 비교한 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM).

NSCLC (돌연변이)	1055	Carb	Cisp	Melph	BCNU
CALU-1 (KRAS)	≥20.0	96.18	≥20.0
CALU-3 HER2, CDKN2A, p53	≥10.0	84.50	≥100.0
CALU-6 (KRAS)	3.31	14.70	3.25
CL1-0	14.6
CL100T1	≥10.0		2.80
CL1-5	6.08
CL141T (TP53	≥10.0		2.45
CL97	≥10.0		≥15.0
H125 돌연변이 없음(no mutations)*			1.50	8.20	≥100.0
H1395 (BRAF, STK11	≥10.0	17.41	≥15.0
H1650 (EGFR, PTEN del)	6.20	69.70	7.51
H1666 (BRAF)	≥10.0	90.71	≥20.0
H1755 (BRAF)	≥20.0	41.41	≥15.0
H1781 (HER2/4)	0.39	3.99	1.67
H1975 (EGFR)	≥10.0	60.16	≥10.0
H1993 (MET amp.)	6.72
H2228 (EML4-ALK)	1.70	8.62	≥25.0
H23 KRAS p53 STK1 SMARKA4			2.50	8.70	≥100.0
H3122 (EML4-ALK)	4.87	109.0	≥30.0
H3255 (EGFR)	2.04	24.28	≥25.0
H358 KRAS			5.90	≥30,0	≥75.0
H522 (KRAS, TP53, SMARCA4 del)	3.00			≥30.0
H525	1.40	72.70	7.74
HCC364 (BRAF)	4.00	172.0	≥75.0
HCC5 (PIK3CA)	≥10.0
HCC827 (EGFR, KRAS, MET amp).	5.53	138.4
HEL299			1.80
MOR			3.90
PC9 (EGFR)	≥10.0	32.10	8.12
PC9/gefb4 Gefetinib 내성(resistant)	≥10.0		≥35.0
SK-LU-1 (KRAS)	4.23	42.38	6.94
폐선편평상피(LungAdenosquamous)	1055	Carb	Cisp	Melph	BCNU
H1373 (KRAS)	≥10.0	29.30	9.46
H322 None reported			≥10.0	≥75.0	≥200.0
H596 (PIK3CA)	4.00	34.10	≥10.0	≥55.0	≥225.0
H647 (KRAS)	≥10.0	25.50	8.75	≥55.0	≥150.0
폐편평상피 세포 (LungSquamous Cell) Ca	1055	Carb	Cisplat	Melph	BCNU
A549 CDKN2A KRAS STK11(del SMARK4, LKB1)	1.40	41.30	≥30.0	≥10.0
A549-DR 시스플라틴 내성(Cisplatin resistant)	≥10.0
EBC1 (MET amp)	4.51	168.0	≥100.0
H1703(FGFR, TP53, CDKN2A/SMARCA4)	1.67	≥80.0	≥20.0
H226 none reported			2.90	≥55.0	≥150.0
H520 (FGFR)	5.00	75.61	9.10	≥25.0	≥120.0
HCC15 (HER4, NRAS, MET)	6.15	173.0	≥85.0
HCC2450 (PIK3C)	3.00	34.53	≥80.0
PC1(jap)	≥10.0	57.42	≥20.0
SK-MES-1 (KRAS)	≥10.0	160.0	≥50.0

*COSMIC 암에서의 체세포 돌연변이 카탈로그

(iv) 대-세포 폐암(LCLC(Large-Cell Lung Carcinoma)).

비-소세포폐암 중의, 이러한 유형은 일반적으로 후기 단계에서 발견된다. LCLC는 빠르게 성장하고 인근 림프절과 흉벽으로 전이하는 경향이 있다. 폐의 종양이 상대적으로 작을 때에도, 더 먼 장기로 전이할 수 있다. 미국에서는 매년 약 2만 건의 신규 사례가 있다.

LCLC의 임상적으로 중요한 하위유형 중 하나는 신경내분비 세포에서 유래한 것으로 알려진, “대-세포 신경내분비암"(LCNEC)이다. 또한, 새로운 WHO 분류에 따라, “결합 대-세포 신경내분비암"(또는 c-LCNEC)이라고 불리는, "하위변종"이 인정된다. c-LCNEC로 지정되기 위해서는, 종양은 적어도 10%의 NSCLC의 다른 형태와 결합한, 적어도 10%의 LCNEC 세포를 함유해야 한다.

(v) 4개의 대-세포폐암주에 대한 42 BO-화합물의 세포독성.

본 발명의 발명자들은 4개의 대-세포폐암주(H1299, H299, H460, 및 SHP77)에 대한 BO-1055 42의 세포독성을 평가하였다. 표 18에 나타낸 바와 같이, 시험된 세포주는 BO-1055에 대해 중등도 내지 고도의 화학적-민감성을 가졌다.

4개의 대-세포폐암주에 대한 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM). (SHP77은 SCLC의 파생물이거나 또는 SCLC/LCLC가 혼합된 것으로 간주됨)

대-세포폐암(Large-Cell LungCancer)	LCLC 돌연변이	1055
H1299	TP53 NRAS, SMARCA4	10.4
H299	NRAS	5.34
H460	PIK3CA, KRAS, LKB1. (TP53wt)	6.20
SHP77*	SCLC 변이 대세포(variant large cell)	≥40.0

(vi) 소-세포폐암(SCLC(Small-Cell Lung Carcinoma)).

소-세포폐암은 세기관지의 신경상피세포 또는 신경내분비세포에서 유래된 것으로 CD44를 발현시킬 수 있다. 이 세포들은 이 종양에 내분비/신생물딸림 증후군 연관성을 부여하는 고밀도 신경분비 과립을 함유하고 있다. 대부분의 경우는 큰 기도에서 발생하고, 신속하게 증식하여 제시하는대로 60-70%의 전이로 질병의 초기에 확산된다.

(vii) 결합 소-세포폐암(c-SCLC(Combined small-cell lung carcinoma)).

결합 소-세포폐암은 현재 세계보건기구 폐 종양 분류 체계 하에서 CLC의 변형으로 간주된다. 이는 NSCLC의 하나(또는 그 이상)의 성분과 혼합된 SCLC 성분을 포함하는 다발성 폐암이다. c-SCLC의 실제 발생률은 알려지지 않았지만, 사례의 일련들은 SCLC의 모든 사례 중 무려 25% 내지 30%를 차지하고, 그리고 모든 폐암 사례의 4% 내지 6%를 차지할 수 있다고 제시한다. EGFR 돌연변이는 “순수한" SCLC에서 매우 드물지만(5% 미만), c-SCLC에서는 상당히 흔하다(약 15%-20%). 이러한 양성 종양들은 EGFR-TKI 치료에 반응할 가능성이 더 크다. c-SCLC는 유방암과 유사하게, 높은(50%-67%) 비율로 여성 호르몬(예를 들어, 에스트로겐 및/또는 프로게스테론) 수용체를 발현하는 것으로 보인다.

그러나, 이들 수용체의 차단이 c-SCLC의 성장에 영향을 미치는지의 여부는 현재 알려져있지 않다.

(viii) 소세포폐암 세포주의 변이형에 대한 BO-1055의 세포독성.

SCLC의 변이형의 세가지 예가 NCI 세포주 H82, H211 및 H526에 의해 제공된다. 표 19에 나타낸 바와 같이, 두 세포주는 BO-1055에 대해 매우 민감한 반면(IC₅₀ 0.34-0.39μM), 하나의 세포주는 중등도의 민감성을 가졌다(IC₅₀ 2.00μM)

3개의 변이형 소세포폐암 세포주(IC ₅₀ μM±S.D.)상의 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM).

IC₅₀(μM)	H82	H211	H524
BO-1055	0.39 ± 0.05	2.00± 1.01	0.34 ± 0.01

(ix) 다른 알킬화 약물 및 화학요법제의 독성과 비교하여 SCLC 라인의 패널에서 BO-1055의 세포독성.

표준형 및 변이형 SCLC를 포함한, 11개의 SCLC 라인을 알라마 블루 분석을 사용하여 BO-1055 72시간 세포독성을 평가했다(표 20). 3개의 표준형과 3개의 변이형을 포함한 6개의 라인은 치료 지수(Therapeutic Index, TI) 범위가 25-200으로 매우 민감했다(IC₅₀ 0.05-0.39μM). 하나는 5의 TI로 중등도의 민감성(IC₅₀ 2.00μM)이었고 그리고 2개의 표준형과 2개의 변이형을 포함하는, 넷은 0.4-1.6의 TI의 민감성을 가졌다(IC₅₀ 20-40μM). 3가지 알킬화제(시스플라틴, 멜팔란 및 BCNU(카르무스틴))는 또한 일부 라인에 대해 높은 세포독성을 보였고, 그리고 다른 라인에 대해 내성을 보였다.

시스플라틴 치료에서, 3/19 라인은 매우 민감하였고(IC₅₀ <1.0μM), 14/19는 중등도로 민감하였고(IC₅₀ 1.0-4.9μM) 그리고 2/19는 매우 내성이 있었다(IC₅₀>10.0μM).

유사하게, 멜팔란(melphalan)의 경우, 4/16 라인은 매우 민감하였고, 5/16은 중등도로 민감하였고, 2/16은 중등도로 내성이 있었고 5/16은 매우 내성이 있었다. 테스트한 모든 라인은 BCNU/카르무스틴에 대해 내성이 높았다. 안트라시클린 항종양 항생제 독소루비신(doxorubicin)은 테스트된 모든 17개의 라인에 대해 높은 세포독성을 보였다. 독소루비신은 SCLC의 병용화학요법에 대한 주요 프로토콜 중 하나의 성분이 아니고, 잠재적인 심각한 부작용, 특히 심장독성에 대한 설명을 가능하게 한다. 빈크리스틴은 16/17 라인에 대해 세포독성이 높았고 하나는 중등도의 민감성을 보였다. VP-16/에토포시드는 6/16 라인이 매우 민감하고, 5/16은 중등도로 민감하고, 2/16은 중등도로 내성이 있고 3 라인은 매우 내성이 있는 혼합된 독성 패턴을 보였다. 알킬화제와 BO-1055 사이에 교차 내성의 증거는 없었다. 예를 들어, H82 라인은 BO-1055에 매우 민감하지만 시스플라틴, 멜팔란 및 BCNU 뿐만 아니라 에토포시드에 대해서도 내성이 강했고, 독소루비신에 대해 테스트한 모든 라인 중에서 가장 내성이 있었다.

표준형 및 변이형 예를 포함한, 21가지 SCLC 세포주의 패널에 스크리닝된 3가지 알킬화 약물(시스플라틴, 멜팔란, BCNU/카르무스틴), 안트라시클린 항종양 항생제(독소루비신/아드리아마이신), 일일초알칼로이드 튜불린 바인더 및 세포 주기 억제제(빈크리스틴/온코빈) 및 토포아이소머라제 II 억제제(VP-16/에토포시드)와 비교한 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM).

SCLC LINES	BO-1055	Cisp	Melph	BCNU	Doxo	Vinc	VP-16
DMS-79 표준형	0.05
H128 표준형		4.79	≥20	≥75	0.10	0.005	≥25
H146 표준형		3.77	≥15.0	≥95	0.14	2.90	2.90
H187 표준형		1.01	1.80	≥35	0.03	0.001	0.60
H209 표준형		0.31	0.20	≥35	0.03	0.001	0.50
H211 변이형	2.00	1.21			0.15	0.002
H249 표준형		1.51	≥10.0	≥75	0.13	0.001	4.10
H345 표준형	23.0
H417 변이형		2.01	0.80	≥75	0.01	0.002	3.70
H524 변이형	0.34	0.41	2.79	≥45	0.02	0.001	1.40
H526 변이형	0.12	2.85	0.10	≥30	0.01	0.136	0.80
H562 표준형	0.25	1.39	2.80	≥35	0.17	0.001	5.50
H60 표준형		2.09	≥10.0	36.0	0.13	0.002	≥20
H69 표준형	<20.0	3.42	6.30	103.1	0.06	0.003	0.40
H678 표준형		3.81	0.10	≥125	0.01	0.002	0.31
H719 표준형		1.12	7.91	≥100	0.09	0.002	≥10
H82 변이형	0.39	≥20.0	84.0	≥150	0.23	0.007	9.70
H841 변이형		≥20.0	3.60		0.02	0.002	0.60
H889 표준형	0.25	0.41	2.79	≥45	0.02	0.001	1.40
N-417 변이형	30.0
SHP-77 변이형	40.0

(x) 다른 알킬화 약물 및 화학요법제와 비교한 SCLC 세포주 H526상의 BO-1055의 치료 범위 측정.

“치료 범위(Therapeutic Window)”(TW)는 정상 인간 조직의 패널에서 화합물의 세포독성과 비교한, 이 실시예(표 20) SCLC 변이주 H526에서, 악성 세포주상의 BO-1055의 시험관 내 세포독성 측정(IC₅₀ 값)으로부터 계산되었다. 양성 조직은 (a) 내피 세포의 신생 공급원으로서 인간 탯줄(HUVEC); (b) 성인 인간 골수 간충직세포(huMSC); (c) hTERT의 레트로바이러스 형질도입에 의해 불멸화되는 정상 인간 폐 기관지 상피(Bci-NSI); (d) hTERT의 레트로바이러스 형질도입에 의해 불멸화된 정상 인간 나팔관 기저 상피(FTEC) 및 (e) 인간 제대혈-유래 CD34+ 조혈 세포를 포함하였고, 모집단은 적혈구, 과립구/단핵구, 거핵구 및 B-림프구 계통의 조혈 줄기세포(HSC 5%) 및 조혈 간세포(CFC 95%)로 구성되었다.

H526에 대한 독성과 선별된 정상 조직의 패널에 대한 독성의 결핍 사이에는 BO 1055에 대한 100-533배의 우수한 치료 범위가 있었다. 이는 알킬화 약물인 4-하이드 록시시클로포스파미드(4-HC), 벤다무스틴, 멜팔란 및 시스플라틴을 포함하는, 다른 약물들, 그리고 또한 토포아이소머라제 억제제 에토포시드(etoposide), SN38, HSP90 억제제 PUH71 및 미세관 결합 알칼로이드 빈크리스틴(Vincristine)과 비교하여 현저히 작은 치료 범위와 현저한 대조를 보였다.

정상 상피, 내피, 간충직 스트로마 및 정상 조혈 간세포(CFC)에 대한 독성의 결여와 비교하여 H526 변이 SCLC 세포주에서 BO-1055로 얻은 치료 범위(TW). H526에 대해 1.00의 값으로 정규화된 데이터.

화학물(Chemicals)	CD34+	HUVEC	huMSC	Bci-	FTEC	H526
BO-1055	100.0	333.33	133.33	266.67	533.33	1.00
4-HC	1.68	33.75	33.75	15.00	10.42	1.00
Benamustine	1.60	24.00	48.00	24.00	64.00	1.00
Melphalan	1.20	10.00	4.00	6.00	20.00	1.00
Cisplatin	33.33	58.33	75.00	83.33	1041.7	1.00
Doxorubicin	0.23	0.90	180.00	1.28	512.82	1.00
Etoposide	0.75	5.83	10.50	25.00	1333.3	1.00
PUH71	0.70	40.00	20.00	50.00	200.00	1.00
SN-38	8.67	0.93	23.33	740.74	925.93	1.00

(xi) BO-1055로 치료된 소세포 폐암 세포주 H526의 NSG 쥐 이종이식편의 체내 연구.

GFP/루시페라제-표지된 H526의 이종이식은 50,000 종양 세포의 피하 주사에 의해 12주령된 10마리의 NSG 수컷 쥐 그룹으로 수행되었다. 루시페라제 생체영상을 12일째에 수행한 다음 5마리의 쥐에게 30mg/kg의 BO-1055를 정맥 안으로 주사하였고 대조군으로서 배양 배지 5마리를 주사하였다. BO-1055 또는 대조군 배지 주사를 12일부터 30일까지 매 2일마다 반복하고 약물 치료 중 기준치인 12일 및 21일, 26일 및 30일째에 생체영상화 하였다.

도 20은 5마리의 각 쥐의 8개 생체영상 사진 패널을 도시한다. 왼쪽의 4개 패널은 GFP-Lu-SCLC H526 세포 및 대조 배지만을 주사한 쥐를 나타내고; 오른쪽의 4 개 패널은 SCLC H526 세포가 주사되고 추가로 우레이도무스틴으로 치료된 쥐를 나타낸다.

도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, d12에서 d30까지 4/5 대조군 쥐에서 진행성 종양 성장이 관찰되었다(하나의 쥐는 초기에 종양이 이식되었으나 진행성 종양 성장을 나타내지 않았다. BO-1055-치료된 쥐에서 d26 동안 종양은 검출되지 않았고 d30에 3/5의 치료된 쥐는 여전히 종양이 존재하지 않았다.

상기 데이터는 20일에서 30일 사이에 치료된 쥐와 대조군 쥐 사이의 총 광전자 방출에 2로그 차이가 있음을 보여주는 도 21의 총 광전자 방출로 표현되었다.

(xii) BO-1055로 치료한 SCLC H526 이종이식을 한 누드 쥐의 체내 연구

본 발명의 발명자들은 또한 SCLC H526 이종이식을 한 누드 쥐에서 BO-1055의 치료 효능을 평가하였다. 4마리의 쥐를 40mg/kg의 BO-1055로, 정맥내 주사로, 2일에 1회씩 4회 치료하였다. 양성 대조군으로 이리노테칸(30mg/kg, 매일 1회씩 6회, 정맥내 주사, n=4)과 에토포시드(30mg/kg, 2일에 1회씩 6회, 정맥내 주사, n=4)가 사용되었다. 도 22a 및 도 22b에 도시된 바와 같이, BO-1055는 이리노테칸 또는 에토포시드보다 효과적이다.

종양 부피가 2000mm³ 이상일 때 종양이 있는 쥐를 희생시켰다. 대조군과 양성 대조군 쥐를 47일째에 희생시켰고; BO-1055 치료 쥐(n=4): -+28일째 3/4 완전완화(CR(complete remission)), 32일째 2/4 CR; 77일째 1/4 CR이었다.

실시예 13C

림프종(LYMPHOMA)

림프종은 림프계의 종양으로 모든 암의 3-4%이고 성인에서 7번째로 가장 흔한 암 유형이며 유아에서 3번째로 가장 흔하다. 2012년에는 전세계적으로 566,000건의 사례가 있었고 305,000건의 사망 사례가 있었다.

림프종에는 수십개의 하위유형이 있고, 일부는 치료가 가능한 반면 다른 것들은 예후가 매우 좋지 않다. 치료 옵션에는 화학요법, 방사선 치료, 표적 치료 및 수술의 일부 병용이 있다.

이러한 하위유형은 아래에서 다뤄진다.

(i) 호지킨 림프종(HL(Hodgkin Lymphoma))

이 형태의 림프종은 스턴버그-리드(Reed-Sternberg)세포의 존재로 특징된다. 호지킨 림프종에는 두가지 주요 유형이 있고, 가장 흔한 것은 젊은 성인에서 주로 발견되는 것은 결정공막염이다. 두번째로-흔한 유형은 남성에서 가장 흔하고 경과 단계에서 진단될 가능성이 높은 혼합-세포질(Mixed-cellularity) 하위유형이다. 앱스타인바(Epstein-Barr) 바이러스는 이 사례의 70%에 관여한다.

(ii) 비-호지킨 림프종(NHL(Non-Hodgkin lymphoma))

2014년에 미국에는 70,800건의 새로운 NHL 사례가 있었고 그 중, 10%가 T-세포 림프종이었고 90%가 B-세포 림프종이었다. 여러가지 예후와 치료 반응을 보이는 많은 B-세포 NHL의 하위유형이 있다.

(iii) 여포성 림프종(Follicular lymphoma)

여포성 림프종은 2014년에 14,160건의 새로운 사례가 있었던 미국과 유럽에서 두번째로 흔한 유형의 림프종이다. 이는 고령에서 발생하고, 대개 림프절, 골수 및 비장과 관련이 있으며, Bcl-1을 과발현하는 t(14; 18) 전위와 연관되어 있다. 이는 가장 자주 진행이 더디고, 그리고 매우 천천히 자란다. 알려진 치료법은 없지만; 환자의 85% 이상은 진단 후 최소 5년 동안 살고, 그리고 50%는 12년 이상 산다. 대개 리툭시맵(rituximab)과 함께, 벤다무스틴(bendamustine(Treanda))과 레널리도마이드(lenalidomide(Revlimid))와 같은 약물들은, 이 하위유형에 효과적이고 가장 중요한 치료의 일부로 사용할 수 있다. 시간이 지남에 따라, 여포성 림프종이 더 적극적인 치료가 필요한 DLBCL로 변할 수 있다.

(iv) 1차 종격 B-세포 림프종(Primary mediastinal B-cell lymphoma).

이 림프종은 주로 10대부터 30대 초반까지 사람들에게 영향을 준다. 많은 환자들이 화학요법과 방사선 치료의 병용으로 치료된다. 그러나, 이 치료에 의해도, 약 20%의 환자들이 진행성 질환을 갖고 있다.

(v) 그 외에 명확하지 않은 말초 T-세포 림프종(Peripheral T-Cell Lymphoma)

이는 가장 흔한 T-세포 림프종이고 일반적으로 불규칙한 핵 윤곽을 가진 작은 것에서부터 큰 CD3+ 림프구 세포까지의 혼합으로 나타난다. 이는 몇가지 드문 변이형으로 더 세분화될 수 있지만 모든 종양이 흔하게 전이되고 일반적으로 공격적인 종양이다.

(vi) 균상식육종(Mycosis fungoides)

균상식육종은 국소화되거나 또는 보다 일반화된 피부 림프종 세포 침윤으로 나타나는 가장 일반적인 피부 악성 림프종이고 일반적으로 진행이 더디다. 더 공격적인 변이형인, 시자리 질환(Sezary's disease)에서는, 피부 홍반과 말초 혈관 관여가 있다. 5년 생존율은 대체로 75%이다

(vii) 광범위큰B세포림프종(DLBCL(Diffuse Large B-Cell Lymphoma))

이는 가장 일반적인 유형의 림프종이다. 북미지역의 NHL ~35%와 모든 공격적인 사례의 60%를 차지한다. 2014년에 미국에서 21,240건의 새로운 사례가 있었다. DLBCL은 종자중심 B-세포(Germinal Center B-cell(GCB)) 유래와 활성화된 B-세포(ABC) 유래를 가진 것들로 세분될 수 있다. DLBCL은 약 40%가 림프절 이외의 장기와 관련이 있는 공격적 유형의 NHL이다.

(viii) ABC 및 GBC 하위그룹을 대표하는 인간 DLBCL 세포주를 통합한 림프종 세포주 패널의 확립; 인간 맨틀 세포 림프종 라인 및 쥐의 B-세포 림프종.

(a) 세포주 및 방법: 광범위큰B세포림프종(DLBCL) 세포주 LY1, Ly8, Ly10, Ly18을 IMDM 배지에서 배양하였고 그리고 Ly3, Ly19, SUDHL-4, SUDHL-6, Pfeifer, Farage, Toledo, Karpas-422, HBL1, U2932를 RPMI에서 배양하였다. 맨틀 세포 림프종(Mantle cell lymphoma(MCL)) 세포주 JEKO-1, Mino, Granta-519, NECB-1, Z-138, REC-1 및 HBL2를 RPMI 배지에서 정례적으로 배양하였다. 모든 배지에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린, 및 스트렙토마이신을 보충하였다. 세포주는 프로파일링 키트(Profiling Kit(PowerPlex 16HS))를 사용하여 GRCF DNA 서비스(Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland)에서 STR 프로파일링으로 인증된 후 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)) 또는 MSKCC 조사기관으로부터 획득했다.

(b) 자발적인 쥐의 B-세포 림프종. 우리는 또한 누드 쥐에서 자발적으로 발생한 CD19+ B-세포 림프종을, NSG 쥐에서 복강내 또는 피하 주사 후 매트리겔(Matrigel)의 반복적인 통과에 의해 또는 정맥 내 주사에 의해 유지했다. 이 원발성 림프종은 인간 DLBCL과 유사하고 림프종 세포의 장기간 시험관 내 유지에 필요한 쥐의 MS5 간질 세포의 존재 또는 부재하에 체외에서 처리하여 BO-화합물의 세포독성을 결정하는 데 사용되었다.

(ix) 광범위큰B-세포림프종(DLBCL) 세포주의 표현형 및 분자적 특징.

표 25에 나타낸 바와 같이, BO-1055 세포독성을 평가하기 위해 사용된 12개의 인간 비-호지킨 림프종 세포주는 DLBCL의 예로서 종자중심 B-세포(GCB) 또는 활성화된 B-세포(ABC)로부터의 유도에 기초한 하위유형으로 더 세분될 수 있다. 상기 세포주 중 8개는 TP53 돌연변이가 있었고 7개는 BCL2 t(14; 18) 전위를 가지고 있었다. 이 전위는 여포성림프종의 ~70% 및 광범위큰B세포림프종의 ~30%에 존재한다. 다른 유형의 BCL2 유전자 재배치 또는 증폭은 두 세포주에서 발견되었고 그리고 세 세포주는 야생형(wt) BCL2를 보였다. BCL6 유전자는 5/10 세포주에서 야생형이었고, 3/10에서는 증폭되었고, 하나에서는 전위되었고 그리고 하나에서는 결실되었다.

BCL6 유전자 상태는 각 세포주에서 생산된 BCL6 단백질의 수준과 일치했다. Myc는 4/12 세포주에서 증폭되거나 재배열되었다.

표 22는 또한 세포주 생산을 위해 세포를 얻은 시점의 환자의 임상 상태를 보여준다. 첫 진단시 5개, 재발시 7개의 세포주가 얻어졌다. 이 세포주들의 세포유전학적 연구에 따르면 3개가 정상 염색체 수를 보였고, 5개는 고이배체였고 그리고 3개는 4배체 또는 고4배체에 가까웠다.

종자중심(Germinal Center) B-세포(GCB) 하위유형 또는 활성화된 B-세포(ABC) 하위유형의 광범위큰B세포림프종(DLBCL) 세포주의 유래와 분자적 특징.

세포주 (Cell Line)	DLBCL 하위유형	임상적 상태 (Clinical Status)	TP53 상태	Ploidy	BCL2 상태	BCL6 prot.	BCL6 유전자	Myc 상태
Ly1	GCB	Rel.	Mut.	46-47, xy	t(14,18)	+++	Amp.	Amp,
Ly3	ABC	Rel.	Wt	72-75 xy	Amp	++	Amp.	Wt
Ly8	GCB	Dx	Mut.	46-48 x	t(14,18)	+	Trans.	Rea.
Ly10	ABC	Dx	Wt	46 xx	Wt	++	Wt	Wt
Ly18	GCB	Dx	Mut.	96-98 xxx	Rea	nd	Wt	Rea.
Ly19	GCB	Rel.	Mut.	nd	t(14,18)	nd	Nd	Wt
SUDHL-4	GCB	Dx	Mut.	47-51 xxy	t(14,18)	+	Amp.	Wt
SUDHL-6	GCB	Dx	Wt	42-48 x	t(14,18)	++	Wt	Wt
Pfeiffer	GCB	Rel.	Mut.	46 xy	t(14,18)	+/-	Nd	Wt
Farage	GCB	Rel.	Mut.	46 xx	Wt	++	Wt	Wt
Toledo	GCB	Rel.	nd	>2n xx	Wt	-	Del.	Wt
Karpas-422	GCB	Rel.	Wt	44-48 xx	t(14,18)	++	Wt	Rea.

Mut= 돌연변이 유전자, Wt- 야생형 유전자, Amp=증폭 유전자, Rea=재배치, Del=결실 유전자, Trans=전위된, Dx= 진단시, Rel= 재발시, nd=측정되지 않음.

(x) 림프종 세포주에서 BO-1055의 세포독성.

BO-1055의 시험관 내 세포독성은: (a) 16개의 인간 DLBCL 세포주, 12개의 GCB 서브그룹 및 4개의 ABC 서브그룹: (b) 7개의 인간 맨틀 세포 림프종 라인 및 (c) 1개의 원발성 쥐 B-세포 림프종을 유지하는 간질 단층의 존재 또는 부재하에 측정하였다(표 23).

평가된 21-25개의 라인을 토대로, 3개의 림프종 서브그룹과 쥐의 B-세포 림프종은 전반적인 약물 반응에서 크게 벗어나지 않았다.

인간 DLBCL 하위유형 GBC 및 ABC, 맨틀 세포 림프종 및 자발적 쥐 B-세포 림프종의 예를 포함하여, 24개의 림프종 라인에 대해 스크리닝된 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM) 비교.

림프종 B-세포	DLBCL 하위유형GCB (돌연변이)	BO-1055
Farage	p53mut.Myc,Bcl6,Bcl2cWt	0.44
Karpas-422	p53wt t(14,18) Bcl6 Wt,Myc Rear.	5.85
Ly1 (OCH-Ly1)	p53mut t(14,18) Myc, Bcl6 amp. Stg IV	3.86
LY18 (OCH-Ly18)	p53mut.Bcl2,Myc 재배열(rearraged)	0.61
LY19 (OCH-Ly19)	p53mut t(14,18) Myc wt	0.29
LY7 (OCH-Ly7)	p53mut	5.06
Ly8 (OCH-Ly8)	p53mut. t(14,18)Bcl6 trans.Myc rear.	0.22
Pfeiffer	p53mut t(14,18 Bcl6 +/-,Myc wt	3.87
SUDHL-4	p53mut t(14,18),Bcl6 amp.Myc wt	1.95
SUDHL-5	t(14,18),	4.14
SUDHL-6	p53wt t(14,18).Bcl6,Myc wt	5.93
Toledo	p53?Bcl2wt,Bcl6 del.Myc wt	8.95
림프종 B-세포	DLBCL 하위유형ABC(돌연변이)	BO-1055
HBL1		0.87
Ly10 (OCH-Ly10)	p53wt Bcl2/6wt Myc wt	0.12
Ly3 (OCH-Ly3)	p53wt Bcl2/6 amp.	3.50
U2932		2.22
맨틀 세포	t(11;14) (q13;q32)	BO-1055
Granta-519	CD5-p53wt. CCND1+	5.50
HBL2	CD5+ p53 Mut	0.16
JEKO-1	CD5+ p53WT Bcl2+,CCND1+	0.27
Mino	CD5+ p53 mut,Bcl2+CCND1+	0.11
NECB-1	CD5 p53 del	7.71
REC-1	CD5- p53 WT	12.50
Z-138	CD5- p53 WT	0.30
림프종 B-세포	쥐	*BO-1055*
쥐BCL	자발적 NSG CD19+	0.46
쥐BCL	on irrad MS5 스트로마	0.80

BO-1055에 대한 IC₅₀ μM를 나타내는 데이터. 회색으로 윤곽이 표시된 ≥8.00μM 값.

(xi) BO-1055 및 경로 표적제, HSP90 및 HSP70 억제제, 프로테아좀 억제제, 시스플라틴, 독소루비신, 및 보르테조마이브를 포함한, 40개의 림프종 세포주에 대해 스크리닝된, 33개의 화학요법제의 세포독성 비교.

BO-1055의 세포독성(IC₅₀ μM)은 경로 표적제, HSP90 및 HSP70 억제제, 프로테아좀 억제제, 시스플라틴, 독소루비신, 및 보르테조마이브를 포함하는 항암제-화합물 패널의 세포독성과 비교되었다. 이들은 표 24에 나타낸 바와 같이, 인간 DLBCL GBC 및 ABC 하위유형, 맨틀 세포 림프종을 비롯한, 다양한 림프종 세포주에 대한 세포독성을 평가하였다.

이 표는 공개 접근가능한 사이트(Broad Institute, Sanger Institute)에서 이용할 수있는 데이터(IC₅₀ μM)와 대만의 아카데미카 시니카(Academica Sinica)의 Drs T.L. Su와 Lee 및 MSKCC의 Dr M.A.S. 무어(Moore)와 그 외에 의해 생성된 데이터를 보여준다.

(a) 표 24의 BO-1055와 비교한 세포독성을 평가한 화합물의 성질.

ARN: ARN-231 난소암 줄기 세포 억제제(미발표된 Moore MA).

TT46 HSP70 억제제(Kang et al 2014).

PUH71: HSP90 억제제(Ambati et al. 2014a, Jhaveri et al. 2014).

17-AAG/ 타네스피마이신(Tanespimycin): HSP90 억제제(Jhaveri et al. 2014).

Bort: 보르테조마이브(Bortezomib)/벨케이드(Velcade): 프로테아좀(Proteasome) 억제제.

Cisp: 시스플라틴 알킬화 백금 약물. Doxo: 독소루비신(Doxorubicin), 안트라시클린(anthracycline) 항종양 항생제.

TK: TKI258, 도비티니브(Dovitinib), EGFR, FGFR1, PDGFR베타, VEGFR-1, KDR 억제제. 3단계 노바르티스.

AEW: AEW541, IGFR 억제제, 임상 전의, 노바르티스.

SOR: 소라페니브(Sorafenib)/넥사바라(Nexavar), Flt3, c-KIT, PDGFRβ, RET, Raf 키나아제 B, Raf 키나아제 C, VEGFR-1, KDR, FLT4 억제제, FDA 승인 2005. 바이엘

TOPO: 토포테칸(Topotecan)/하이켐틴(Hycamtin), 토포아이소머라제 1 억제제. FDA 승인 1996. 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline).

(b) 각각의 종양 하위그룹을 대표하는 다양한 인간 림프종 세포주의 패널에서 (xiii) (a)에 기술된 다양한 화합물의 세포독성

10개의 라인은 매우 민감하였고(IC₅₀ 0.11 -0.87μM), 6개의 라인은 중등도의 민감성(IC₅₀ 1.95-4.14μM), 6개의 라인은 중등도의 내성(IC₅₀ 5.06-8.95μM) 및 단 1개의 라인은 높은 내성(IC₅₀ 12.5μM)을 보였다,,

BO-1055로 스크리닝된 27개의 라인 중, 11개의 라인이 IC₅₀ 0.12-0.84μM로 매우 민감했다(IC₅₀ <1μM로 정의됨). IC₅₀이 1.08-4.90μM(TI 2.04-9.03)에서 14개의 라인은 중등도로 민감했다(IC₅₀ 1.00-4.99μM로 정의됨). 2개의 라인은 내성이 있었다(IC₅₀>10.0μM). DLBCL 라인을 ABC 및 GBC 유형으로 하위-분류할 때 BO-1055 세포독성을 평가한 결과 유의한 차이는 나타나지 않았다. 4개의 세포주로 구성된 ABC 그룹에서 하나의 라인은 매우 민감하였고(IC₅₀ <1.0μM) 세 개의 라인은 중등도로 민감하였다(IC₅₀ 1.0-4.9μM).

10개의 라인의 GBC 그룹에서, BO-1055에 4개는 매우 민감하였고, 4개는 중등도로 민감하였고, 1개는 중등도 내성 그리고 1개는 고도의 내성이 있었다. 4개의 TP53 야생형 라인(IC₅₀ 0.12-7.02μM)과 마찬가지로, TP53 돌연변이가 있는 8개의 라인이 IC₅₀ 값(0.29-4.90μM)의 범위를 가지기 때문에 TP53 상태는 BO-1055 민감성을 결정하지 않는 것으로 보였다. WT Bcl2가 있는 라인은 0.12에서 >10.0μM의 IC₅₀ 범위를 갖고 돌연변이/재배열/증폭된 BCL2 라인은 유사한 범위(IC₅₀ 0.29-4.9μM)를 가졌기 때문에 BCL2 돌연변이 상태는 마찬가지로 BO-1055 독성을 결정하지 못했다.

인간 DLBCL GBC 및 ABC 하위유형, 맨틀 세포 림프종을 포함한 다양한 림프종 세포주에 대해 스크리닝된, 경로 표적제, HSP90 및 HSP70 억제제, 프로테아좀 억제제, 시스플라틴, 독소루비신, 보르테조마이브를 포함하는 다양한 항암제와 비교한 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM).

림프종
DLBCL(GCB)

BO-1055

ARN

TT46

PUH
71

17-AAG

Bort

Cisp

Doxo

TK

AEW

SOR

TOPO

Farage

0.44

nd

>10.0

0.273

nd

Nd

nd

Karpas-422

5.85

1.32

0.22

0.45

nd

0.019

>10.0

0.211

nd

Nd

nd

LY1

3.86

0.31

0.20

0.26

nd

0.005

>10.0

0.011

nd

Nd

nd

LY8

0.22

nd

>10.0

0.093

nd

Nd

nd

LY18

0.61

nd

0.22

0.27

nd

0.010

>10.0

0.097

nd

Nd

nd

LY19

0.29

nd

>10.0

0.121

nd

Nd

nd

LY7

5.06

nd

Nd

nd

LY8

0.22

nd

0.95

0.81

nd

0.078

>10.0

0.084

3.35

4.09

≥8.0

0.19

Pfeiffer

3.87

0.90

0.08

0.41

0.45

0.004

>10.0

0.061

2.38

3.75

4.57

0.06

SUDHL-4

1.95

0.50

0.19

0.20

0.05

0.003

>20.0

0.206

4.19

0.40

5.62

0.12

SUDHL-5

4.14

nd

0.40

0.41

nd

0.018

nd

0.912

nd

Nd

nd

SUDHL-6

5.93

0.38

0.68

0.05

nd

0.001

>10.0

0.195

0.21

0.18

≥8.0

0.11

Toledo

8.95

>10.0

2.66

0.37

0.108

>10.0

nd

Nd

nd

림프종
DLBCL(GCB)

BO-1055

ARN

TT46

PUH
71

17-AAG

Bort

Cisp

Doxo

TK

AEW

SOR

TOPO

HBL1

0.87

0.28

0.16

1.67

1.23

0.004

>10.0

0.211

nd

Nd

nd

LY10

0.12

nd

0.14

nd

>10.0

0.084

≥8.0

2.60

LY3

3.50

0.85

1.80

2.78

nd

0.021

>10.0

0.023

nd

Nd

nd

U2932

2.22

1.35

0.25

0.49

0.03

0.005

>20.0

0.050

nd

Nd

nd

림프종
쥐 B

BO-1055

ARN

TT46

PUH
71

17-AAG

Bort

Cisp

Doxo

TK

AEW

SOR

TOPO

CD19+

0.46

nd

0.24

nd

0.006

nd

0.124

nd

Nd

nd

스트로마 상(On stroma)

0.80

0.98

0.14

nd

>10

0.001

nd

Nd

nd

림프종
맨틀 세포

BO-1055

ARN

TT46

PUH
71

17-AAG

Bort

Cisp

Doxo

TK

AEW

SOR

TOPO

그랜타-519

5.50

nd

0.25

1.22

nd

0.008

>10.0

0.41

3.40

≥8.0

0.05

HBL2

0.16

nd

>10.0

0.03

nd

Nd

nd

JEKO-1

0.27

nd

0.25

0.26

nd

12.5

0.04

nd

Nd

nd

Mino

0.11

nd

0.22

0.26

nd

0.042

>10.0

0.07

1.60

5.57

≥8.0

0.05

NECB-1

7.71

nd

1.55

1.66

nd

0.143

>10.0

1.23

nd

Nd

nd

REC-1

12.5

nd

>10.0

0.05

nd

Nd

nd

Z-138

0.30

nd

0.06

nd

0.008

>10.0

0.34

nd

Nd

nd

림프종
DLBCL(GCB)

Karpas-422

5.85

1.32

0.22

1.52

nd

0.066

>10.0

0.56

nd

Nd

nd

LY1

3.86

0.31

0.20

0.308

nd

0.005

>10.0

0.11

nd

Nd

nd

Pfeiffer

3.87

0.90

0.08

0.108

0.45

0.004

>10.0

0.061

2.38

3.75

4.57

0.06

SU-DHL-4

1.95

0.50

0.19

0.20

0.051

0.003

>20.0

0.21

4.19

0.40

5.62

0.11

nd=결정되지 않음 회색으로 윤곽이 표시된 ≥8.00μm의 값. *NOD-SCID-IL2Ry 쥐에서 유래한 자발적인 B-세포 림프종. 기질의 지지가 없는 림프종 세포에서 결정된 세포독성. 조사된 MS5와의 공동-배양에서 BO-1055의 간질 세포독성(IC₅₀)은 0.80μM이었고 시스플라틴(Cisplatin)은 >10.0μM이었다. *MSKCC의 Dr M.A.S Moore 및 아카데미아 시니카(Academia Sinica)의 Dr T.L.에 의해 생성된 BO-1055에 대한 데이터. MSKCC의 Dr M.A.S. 무어(Moore)와 그 외에 의해 생성된 ARN에 대한 데이터. MSKCC의 Drs G. Chiosis, M.A.S. Moore와 E Caldas의 TT46 및 PUH71에 대한 데이터. MSKCC의 Dr S Danishefsky와 그 외가 합성한, 이소플루달론(isofludalone)에 대한 데이터는, MSKCC의 Dr MAS Moore와 그 외에 의해 생성되었다. MSKCC에서 처음 개발된, SAHA에 대한 데이터는, 여러 소스에서 제공되었다.

(xii) DLBCL(ABC 하위유형) 세포주 OCY-LY3에 대한 BO-1055 및 독소루비신의 조합의 세포독성.

조합 지수(CI)는 CI>1이 길항작용을 나타내고, CI=1이 부가 효과를 나타내고, 그리고 CI<1이 시너지를 나타냄을 규정하는 Chou-Talalay 방법(Chou 및 Talaley 1984)을 사용하여 계산되었다. Chou-Talalay 분석이 약물-약물 상호작용(Chou 2010)에 적용가능하다는 여러 연구가 있다. OCY-LY3 세포는 단일 약물 또는 약물 조합(각 약물에 대한 IC₅₀에 상응하는 Cte)으로 농도가 증가하는 약물(20uM-0.02uM에서 8배 연속 희석)으로 72시간 동안 배양되었다. 처리 후, 세포들을 알라마르 블루(Alamar Blue)에 의해 평가하였다.

도 23a: 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에 의해 얻어진 증식 억제 곡선 및 IC₅₀. 단일요법으로 또는 DLBCL(ABC 하위유형) 세포주 OCI-LY3와 조합한 BO-1055 또는 독소루비신(Doxorubicin)의 세포독성 도면.

도 23b: 그래프패드 프리즘.씨(GraphPad Prism.C)에 의해 얻어진 증식 억제 곡선 및 IC₅₀. 표준화. Fa-Ci 플롯(Plot): 효과 중심.

도 23c: BO-1055와 독소루비신의 조합에 대한 이소볼로그램: 왼쪽: BO1055 Cte + DOXO Var. 오른쪽: DOXO Var + BO1055 Cte(Chou 2010). 투여 중심 - CI<1 = 공동상승작용(Synergism); CI=1 = 첨가제; CI>1 = 길항작용. 값들은 CompuSyn 소프트웨어(Chou and Talalay 1984, Chou 2010)에 의해 계산되었다.

이소볼로그램:

(xiii) DLBCL(GBC) 세포주에서 측정된 BO-1055 및 HSP 억제제(PUH71, TT46), 보르테조마이브, 및 독소루비신의 조합의 세포독성.

약물을 IC₅₀에서 BO-1055와 조합하여 7-9가지 농도로 적정하거나 또는 약물을 각각 IC₅₀에 상응하는 용량으로 첨가하고 7-9가지 농도의 BO-1055와 함께 첨가하였다. 표적 세포주는 GBC 하위그룹의 12개의 인간 DLBCL 세포주였다.

1) BO-1055 및 HSP90 억제제 PUH71; 및 2) BO-1055 및 HSP70 억제제 TT46의 조합을 사용하는 DLBCL(GBC) 세포주에 대한 조합 연구의 결과가 단일 약물 처리 및 병용 요법을 위한 조합 지수에서의 각 약물에 대한 IC₅₀ 데이터를 나타내는 표 25에서 나타났고, 여기서 하나의 약물은 IC₅₀μM에서 사용되고, 그리고 다른 약물은 8연속 희석으로 적정한다(Chou 2010).

Comb-1에서, BO-1055는 가변적이고 그리고 HSP 억제제는 IC₅₀μM 용량으로 사용된다. Comb-2에서, PUH71 또는 TT46은 가변적이고, 그리고 BO-1055는 IC₅₀μM 용량으로 사용된다. 표 25의 상단 섹션은 PUH71에 대한 데이터를 제공하는 반면, 표 25의 하단 섹션은 TT46에 대한 데이터를 제공한다.

BO-1055 및 PUH71을 갖는 11개의 평가가능한 데이터 세트 중, PUH71은 Z-138에 대한 두 가지 조합 모두에서 BO-1055와 상승효과적이었지만 대조적으로, TT46은 동일한 세포주에 대한 두 가지 조합 모두에서 길항적이었다. PUH71은 그랜타(GRANTA)에 대해 이중으로 길항적이었지만 TT46은 combo-1에서 상승효과가 있었고 그리고 그랜타(GRANTA)에 대해 combo-2에서는 길항적이었다. 두 HSP 억제제 모두 BO-1055와의 두 조합에서 REC-1에 대해 길항적이었다. PUH71은 MINO에 대해 BO-1055와 이중 상승효과가 있었지만 TT46은 combo-1에서만이 이 세포주에 대해 BO-1055와 상승작용하였고 combo-2에서는 길항적이었다. PUH71 및 TT46은 모두 combo-1에서 NECB1에 대해 BO-1055와 상승작용하였고 그리고 combo-2에서 길항작용하였다.

DLBCL(GBC) 세포주에서 측정된 B0-1055, 및 PUH71, TT46, 보르테조마이브, 및 독소루비신의 잠재적 부가적 또는 상승효과적 세포독성

라인 DLBCL (GCB)	BO-1055 IC ₅₀ (μM)	PUH71 IC ₅₀ (μM)	Comb-1 BO-1055(Var) PUH71(Cte)	Comb-2 PUH71(Var) BO-1055(Cte)	Cl 값 Fa=0.5 Comb-1 Comb-2	효과 Comb-1 Comb-2
OCY-LY1	3.186	0.208	Complete Effect	0.206	0.223 0.971	상승효과적 부가적
OCY-LY7	5.061	0.391	5.124	0.387	1.105 1.542	길항적 길항적
OCI-LY8	0.224	0.814	0.029	0.273	0.602 0.993	상승효과적 부가적
OCI-LY18	0.608	0.274	0.586	0.167	1.341 0.067	길항적 상승효과적
OCI-LY19	0.287	0.221	____	____	_____ _____	______ ______
SUDHL4	1.954	0.379	0.580	0.232	0.932 0.976	부가적 부가적
SUDHL5	4.137	0.336	Complete Effect	Complete Effect	0.422 0.320	상승효과적 상승효과적
SUDHL6	5.931	0.672	5.141	0.487	1.214 0.916	길항적 부가적
FARAGE	0.444	0.785	1.840	1.221	5.632 3.218	길항적 길항적
PFEIFER	3.874	0.335	2.580	0.372	1.234 1.121	길항적 길항적
TOLEDO	8.950	10.92	9.901	12.569	4.327 5.002	길항적 길항적
KARPAS-422	5.847	1.520	2.467	0.781	0.292 0.193	상승효과적 상승효과적
DLBCL 라인 (GCB)	BO-1055 IC ₅₀ (μM)	TT46 IC ₅₀ (μM)	Comb-1 BO-1055(Var) TT46(Cte)	Comb-2 TT46(Var) BO-1055(Cte)	CI(Fa=0.5 Comb-1 Comb-2	효과 Comb-1 Comb-2
OCY-LY1	3.091	0.199	Complete Effect	0.277	0.235 1.156	상승효과적 길항적
OCY-LY7	5.016	1.697	5.448	1.726	5.391 1.297	길항적 길항적
OCI-LY8	0.394	0.478	0.174	0.482	0.795 2.491	상승효과적 길항적
OCI-LY18	0.398	0.220	0.450	0.118	1.631 0.189	길항적 상승효과적
OCI-LY19	0.287	0.217	_____	_____	_____ _____	_____ _____
SUDHL4	1.639	0.124	2.016	0.230	4.693 4.324	길항적 길항적
SUDHL5	3.945	0.402	Complete Effect	Complete Effect	0.126 0.215	상승효과적 상승효과적
SUDHL6	3.241	0.682	3.248	0.510	2.284 3.234	길항적 길항적
FARAGE	0.978	1.479	Complete Effect	Complete Effect	0.344 0.231	상승효과적 상승효과적
PFEIFER	4.783	0.054	4.521	0.100	2.456 1.038	길항적 길항적
TOLEDO	7.821	25.00	12.863	24.660	8.087 2.345	길항적 길항적
KARPAS-422	6.989	0.215	1.169	0.125	0.360 0.874	상승효과적 상승효과적

(xiv) 맨틀 세포 림프종(MCL(Mantle Cell Lymphoma))

MCL은 NHL 사례의 약 6%(2014년에 4960건의 신규 사례)를 포함하는, 비-호지킨 림프종(NHL) 중 가장 드문 사례 중 하나이다. 60세 이상의 사람들에서 가장 많이 나타나고 그리고 여성보다 남성에서 4 대 1의 비율로 훨씬 더 흔하다. 미국에서 현재 MLC 환자가 ~1만 5천명 있다.

이는 정상 림프절(lymph node) 종자중심 모낭을 둘러싸고있는 맨틀 영역(mantle zone) 내에서 CD5 양성 항원-투약하지않은 전-초기 중심 B-세포의 악성 형질전환에 기인한다. 인간에서는, CD5 유전자가 11번 염색체의 긴 팔에 위치하고 있다. CD5는 BCR에서 활성 신호를 완화하여 B-1 세포가 매우 강한 자극(세균성 단백질과 같은)에 의해서만 활성화될 수 있고 정상 조직 단백질에 의해서는 활성화될 수 없다. MCL 세포는 다른 림프절 또는 골수, 간 및 위장관과 같은, 조직으로 전이할 수 있다. MCL은 t(11;14)(q13;q32)에서 전위(translocation)로 인한 사이클린(cyclin) D1 단백질의 과발현에 의해 확인된다. p53 경로와 관련된 추가 유전적 이상은, 질병 발달 및 진행에 중요하다(표 25 참조). MCL은 치료가 어렵고 치료가 거의 고려되지 않는다. 평균 생존 기간은 약 3년이었으나, 현재 신생 환자의 경우 6년에 이르는 것으로 추산된다.

(xv) 맨틀 세포 림프종 세포주에서 BO-1055, 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 독소루비신(Doxorubicin), 파클리탁셀(Paclitaxel) 및 파노비노스탯(Panobinostat)의 세포독성

표 26에 나타낸 바와 같이, 다양한 MCL 세포주에서 BO-1055의 평균 IC₅₀±SD(μM) 값은 다음과 같다:

JEKO-1(0.266±0.27),

Z-138(0.182±0.15),

HBL2(0.161±0.34).

본 발명의 발명자들의 결과는 BO-1055가 인간 B-세포 림프종 및 다양한 정상 인간 세포 유형에 대한 독성 사이에 유의한 치료 범위(50-100배)를 갖는다는 것을 나타내었다. BO-1055로 처리하면 S-상에 세포가 축적되고 그리고 DNA 복구에 관여하는 단백질[MRE11, p-P95/NBS1(ser343), RAD50, p-ATR(ser428)]의 상향-조절이 일어난 반면 중요한 B-세포 림프종 바이오마커인, Bcl-6은 하향-조절되었다.

7개의 인간 맨틀 세포 림프종 세포주 패널 상의 BO-1055의 세포독성(IC ₅₀ μM). 비교를 위해, 독소루비신(doxorubicin(DNA 삽입 안트라시클린(intercalating anthracycline))), 파클리탁셀(paclitaxel(미세관 결합 약물(microtubule binding drug))), 시스플라틴(cisplatin(알킬화 백금 약물(alkylating platinum drug))), 및 파노비노스탯(panobinostat)(HDAC 억제제)에 대한 세포독성 데이터가 제시된다.

맨틀 세포 림프종	돌연변이 및 마커(marker)	BO-1055	독소루비신	파클리탁셀	시스플라틴	파노비노스탯
그랜타-519	CD5- TP53wt CyclinD1 amp.	1.450	0.412	0.049	>10.0	0.041
HBL2	CD5+ TP53 Mut	0.161	0.028	0.016	>10.0	0.013
JEKO-1	CD5+ TP53 wt, Bcl2+, CyclinD1	0.266	0.035	0.017	12.5	0.210
Mino	CD5+ TP53mut, Bcl2+ CyclinD1 amp.	0.583	0.065	0.025	>10.0	0.291
NECB-1	CD5+ TP53 del	8.410	0.163	0.064	>10.0	0.020
REC-1	CD5- TP53 WT	>10.0	0.051	0.021	>10.0	0.060
Z-138	CD5- TP53 WT	0.182	0.033	0.012	>10.0	Nd

(xvi) 5개의 정상 조직과 비교하여 MCL 라인 JEKO-1의 BO-1055, 4가지 알킬화 약물 및 4가지 다른 화학요법제의 치료 범위 측정.

치료 범위(Therapeutic Window(TW))는 양성 조직 및 MCL 세포주 JEKO-1 패널에 대해 11가지 화합물로 얻은 72시간 세포독성(IC₅₀uM)을 나타내는 표 26에 제시된 IC₅₀ 데이터로부터 계산하였다.

표 27은 각 화합물에 대한 계산된 치료 범위를 나타낸다. 표 27의 상단은 5개의 정상 인간 조직 및 MCL 세포주 JEKO-1에 대한 10가지 화합물에 대한 IC₅₀μM 값을 나타낸다. 표의 하단 부분은 Jeko-1에서의 IC₅₀에 대한 양성 조직 사이의 IC₅₀ 값의 배수 차이로 데이터를 나타낸다.

BO-1055는 정상 조혈 세포 독성이 잠재적인 독성 제한 투여량의 결정 요인으로 사용될 때 선별된 모든 약물 중 TW가 가장 우수하다. MCL 데이터를 비-조혈 정상 조직과 비교하는 TW는 BO-1055의 역할을 악성 세포에 매우 독성이 강한 약물 투여량에서 현저한 선택성과 정상 조직에 대한 최소한의 손상으로 고도의 활성 항암제로서 지지한다. 다른 양성 조직과 MCL 라인을 비교할 때 관찰된 BO-1055의 TW는 또한 정상 상피, 내피, 및 간충직 스트로마에 유의한 독성이 없기 때문에 우수하다.

정상 조혈 간세포에 이들 약물의 독성 때문에 알킬화 약물인 4-HC, 벤다무스틴(Bendamustine) 및 시스플라틴(Cisplatin)뿐 아니라 에토포시드(Etoposide), HSP90 억제제 PU-H71 및 토포아이소머라제(Topoisomerase) 억제제 SN38와의 치료 범위가 부족했다.

IC₅₀(μM)은 제대혈 조혈 원종(CD34+ 세포, CFC), 내피(HUVEC), 골수 중간엽 줄기 세포(huMSC), 폐 기관지(Bci-NSI) 및 나팔관(FTEC)의 인간 hTERT 불멸화 상피에서 측정되었다.

독소루비신, 에토포시드, PUH71, SN-38, 빈크리스틴, 및 4가지 알킬화 약물에 대한 TW와 비교한 MCL 라인 JEKO-1상의 BO-1055의 치료 범위(TW) 측정.

1. 혼합물(Compound)	CD34	HUVEC	HuMSC	Bci-NSI	FTEC	JEKO-1
	IC₅₀(μM)
BO-1055	15.00	50.00	20.00	40.00	80.00	0.27
4-HC	2.01	40.50	40.50	18.00	12.50	10.00
벤다무스틴	10.00	150.00	300.00	150.00	400.00	6.25
멜팔란	7.00	320.00	160.00	nd	120.00	1.10
시스플라틴	6.00	50.00	20.00	30.00	100.00	12.50
독소루비신	0.20	0.35	0.45	0.50	6.25	0.05
에토포시드	0.09	0.35	70.20	0.50	200.00	0.78
PUH71	0.05	0.35	0.63	1.50	80.00	0.31
SN-38	7.00	400.00	200.00	500.00	2,000.0	0.80
빈크리스틴	2.34	0.25	6.30	200.00	250.00	0.39

2. 혼합물(Compound)	CD34	HUVEC	HuMSC	Bci-NSI	FTEC	JEKO-1
	Jeko-1에서 IC₅₀과 비교하여 양성 조직 사이의 IC₅₀ 값의 2배 차이
BO-1055	30.00	185.18	74.07	148.15	296.29	1.00
4-HC	0.20	40.50	4.05	1.80	1.25	1.00
벤다무스틴	1.60	150.00	48.00	24.00	64.00	1.00
멜팔란	6.36	290.90	145.45	nd	290.90	1.00
시스플라틴	0.48	50.00	1.60	2.40	8.00	1.00
독소루비신	4.00	0.35	9.00	10.00	125.00	1.00
에토포시드	0.12	0.35	90.00	0.64	256.41	1.00
PUH71	0.15	0.35	2.03	4.84	258.06	1.00
SN-38	8.75	400.00	250.00	625.00	2,500.0	1.00
빈크리스틴	6.00	0.25	16.15	512.82	641.03	1.00

표 27(아래 패널)에 표시된 데이터는 악성 세포에 독성이지만 시험된 정상 세포에는 독성이 없는 약물 투여량 사이의 치료 범위(TW)를 나타낸다. 이것은 선별된 11가지 약물 중에서 골수독성이 가장 적은 BO-1055의 경우 30-296배의 범위였다.

시클로포스파미드의 활성 대사산물인, 4-HC는, 또한 CD34+ 세포 및 정상 상피와 간충직 세포에 높은 독성을 보였다.

벤다무스틴(Bendamustine)과 멜팔란(Melphalan)은 정상 상피, 내피 및 간충조직에 대해 높은 TW 값을 보였으나 CD34+ 세포(1.60-6.36배)에 대해 평가할 때에는 제한된 범위만을 보였다.

시스플라틴은 상피와 간층조직에서 제한된 범위(1.6-8.0)를 가지고, 조혈 독성에 의해 유의하게 제한된 내피에서의 크지 않은 범위(50배)를 갖는다.

토포아이소머라제 II 억제제 에토포시드(Etoposide)는 또한 카포시 육종, 유잉 육종, 폐암, 고환암, 림프종, 골수성 백혈병, 및 다형교아종(Hande 1998)과 같은 암의 화학요법에 사용될 때 문서화된 골수 억제 부작용에 의해 확인된 바와 같이, CD34+ 세포에 대한 높은 독성으로 인해 제한된다. 또한 이는 골수 또는 혈액 줄기 세포 이식에 앞서 컨디셔닝 요법에 사용되었다.

SN-38은 자연 알칼로이드 캠토테신의 반합성 유사체인, 이리노테칸의 활성 대사산물이고 강력한 토포아이소머라제 1 억제제이다(이리노테칸 자체보다 1000배 이상 활성이다). 시험관 내 세포독성 분석 결과 이리노테칸에 비해 SN-38의 효능이 2배에서 2000배까지 다양하다(Pommier et al. 2010). SN-38의 TW는 비-조혈 조직의 경우 250-2,500이지만 CD34+ 세포의 경우 8.75에 불과하며 SN-38 대사산물이 이리노테칸 투여 환자의 ~25%가 경험하는 설사, 골수억제 및 극단적인 면역억제 증상을 일으키는 원인이 된다는 관찰과 일치한다.

HSP90 억제제 PUH71에 대한 TW 측정은 혈관 내피 독성 문제가 종양의 신생혈관형성을 선택적으로 억제할 수 있다면 긍정적인 특징일 수 있지만, 조혈 및 혈관 내피 독성 문제의 가능성을 시사한다.

빈카 알칼로이드 빈크리스틴은 미세관 구조의 집합을 억제하고 중기 복제를 차단하는 튜불린-결합 약물이다. 이는 비-호지킨 림프종을 CHOP 화학요법 처방의 일부로, 그리고 호지킨 림프종을 MOPP, COPP 및 BEACOPP의 일부로 치료하는 데 사용된다. 이는 또한 다발성 골수종, 횡문근육종, 신경아세포종, 및 빌름스 종양의 치료에도 사용되었다. 이는 또한 소아 백혈병을 치료하기 위해 덱사메타손(dexamethasone) 및 L-아스파라기나아제(asparaginase)로 ALL에서, 그리고 프레드니손(prednisone)과 함께 병의 완화를 유도하기 위해 사용된다. 이는 만성 특발 혈소판감소 자색반증 치료에 면역억제제로 사용되어 왔다. 조혈 세포와 내피 세포 둘 다의 TW는 약물의 골수억제 및 혈관 손상 가능성을 암시한다. 주요 부작용은 진행성이고 비가역적인 화학요법-유도 말초신경증이다. 탈모가 치료받는 환자의 20-75%에서 발생하고 그리고 이는 또한 골수억제성이고 백혈구감소 및 혈소판감소를 유발한다.

(xvii) 맨틀 세포 림프종 세포주에서 BO-1055 및 보르테조마이브, 독소루비신, HSP90- 및 HSP-70 억제제와의 약물 조합 세포독성 연구.

BO-1055와 보르테조마이브(bortezomib)/벨케이드(velcade), 독소루비신(doxorubicin), 및 열충격단백질 억제제 PUH71(HSP90 억제제) 및 TT46(HSP70 억제제)의 조합의 가능한 첨가 또는 상승효과적 세포독성 작용을 Jeko-1, HBL2, Z-138, REC-1, 그랜타(Granta), 미노(Mino) 및 NECB1에 의해 나타나는 인간 맨틀 세포 림프종(MLC) 세포주의 패널에 대해 측정하였다. 이들 데이터를 표 28 및 표 29에 나타낸다.

한 세트의 데이터는 BO-1055를 세포주에 대해 측정된 단일 약제로서의 IC₅₀에 상응하는 단일 농도로 유지시킴으로써 얻었고, 이어서 알라마르 블루 분석에 의해 BO-1055를 72시간 동안 7-9배 범위의 약물 농도에 걸쳐 각 약물의 적정 농도와 조합함으로써 그리고 대사 활성도(IC₅₀)의 세포독성/억제를 측정함으로써 상호적인 세포독성을 평가하였다.

두번째 세트의 데이터는 단일 약제로서 그 IC₅₀에서 하나의 약물을 약물 투여량의 7-9배 범위에 걸쳐 적정된 BO-1055와 조합하고 72시간에서 IC₅₀을 결정함으로써 얻어졌다.

5개의 평가가능한 라인과 함께, BO-1055 및 벨케이드(velcade)는 2개의 라인(Z-138, MINO)에 대한 두 조합물 모두에 대해 상승효과가 있었고, 1개의 라인(REC-1)에 대한 두 조합물에서는 길항적이었고 2개의 라인(RANTA, NECB1)에 대한 combo-1과는 상승효과가 있었고 그리고 combo-2와는 길항적이었다. BO-1055와 독소루비신(doxorubicin)의 두 가지 조합 모두가 2개의 라인(Z-138, MINO)에 대해 상승효과가 있었고, 두 가지 조합 모두 1개의 라인(REC-1)에 대해 길항적이었고 그리고 2개의 라인은 combo-1과 상승효과적이었고 그리고 combo-2(RANTA, NECB1)에 대해서는 길항적이었다.

따라서, 각각의 MCL 라인은 약물 조합에 대한 반응에서 현저한 변화를 보였으 나, 벨케이드(velcade)와 보르테조마이브(bortezomib)에 대한 반응은 동일했다. 대조적으로, 동일한 패널의 MCL 라인은 HSP70 억제와 비교하여 HSP90 억제에 대해 상이한 반응을 보였다(표 29). PUH71은 Z-138에 대한 두 가지 조합에서 BO-1055와 상승효과적이었지만 대조적으로, TT46은 동일한 세포주에 대한 두 가지 조합에서 길항적이었다. PUH71은 GRANTA에 대해 이중으로 길항적이었지만 TT46은 combo-1에서 상승효과가 있었고 그리고 그랜타(GRANTA)에 대해 combo-2에서는 길항적이었다. 두 HSP 억제제 모두 BO-1055와의 두 조합에서 REC-1에 대해 길항적이었다. PUH71은 MINO에 대해 BO-1055와 이중 상승효과가 있었지만 TT46은 combo-1에서만이 이 세포주에 대해 BO-1055와 상승작용하였고 그리고 combo-2에서는 길항적(antagonistic)이었다. PUH71 및 TT46은 모두 combo-1에서 NECB1에 대한 BO-1055와 상승작용하였고 그리고 combo-2에서 길항적이었다.

BO-1055와 독소루비신(Doxorubicin) 또는 벨케이드(Velcade(보르테조마이브(bortezomib)))와 맨틀 세포 림프종 라인의 병용 치료의 효능

IC₅₀(μM) 값은 각각의 단일 약물 또는 약물 조합 치료에 대해 언급된다. 상승작용: CI < 0.9, 첨가: 0.90 ≤ CI ≤ 1.10, 길항작용: CI > 1.10

맨틀 세포 림프종 세포주와 BO-1055 및 HSP90 억제제 PUH71 또는 HSP70 억제제 TT46의 병용 치료의 효능

IC₅₀(μM) 값은 각각의 단일 약물 또는 약물 조합 치료에 대해 언급된다. 상승작용: CI < 0.9 첨가: 0.90 ≤ CI ≤ 1.10 길항작용: CI ≥ 1.10

(xviii) 맨틀 세포 림프종의 이종이식 모델 및 BO-1055에 의해 발생된 종양 억제

Jako-1 맨틀 세포 림프종 세포주를 GFP/루시페라제로 표지하고 12주령의 10마리의 NSG 암컷 쥐 각각에 500,000개의 세포를 정맥내 주사하였다. IVIS 루시페린 생체영상을 15일째에 수행하였고 이 시점에서 5마리의 쥐에게 BO-1055(30mg/kg)를 10일간 격일로 정맥내 투여하고 5마리의 쥐에는 위약(배양 배지)의 유사한 투여 스케줄을 주었다. 동물들은 도 24와 같이 간격을 두고 영상화되었다.

대조군은 종양 이식 후 7주까지 점진적인 종양 성장을 보였다(이 대조군에서 한 마리의 쥐는 d32 이전에 사망했으나 이 사망은 종양과 관련이 없을 것임). BO-1055로 처리한 쥐는 종양의 성장을 현저히 억제했고 5마리의 쥐 중 임의의 쥐에서 7주까지는(약물 치료 종료 후 25일) 총체적으로 종양이 관찰되지 않았다. 종양의 점진적 재발은 치료군에서 정교한 생체영상으로 감지되었고, 41일째부터 시작되었다(그림 24). 모든 대조군 쥐는 종양 부담 때문에 7주에 안락사시켰다. 연구가 종료되었을 때 BO-1055 처리된 쥐는 모두 75일째에 생존했다.

실시예 14C

육종(SARCOMA)

육종의 경우 2013/14년에는 전세계적으로 60,000건 및 미국에서는 매년 3,020건의 새로운 사례가 발생하여 1,460명이 사망하고 5년 생존율이 66.6%에 이른다. 육종의 평생 발병 위험은 0.1%이다. 70개 이상의 조직학적 육종 하위유형이 있다. 특정 육종의 진행과 예후는 하위유형과 등급에 따라 다르다. 두가지 중요한 세분은 골(Osseous) 육종(사례의 20%) 및 연조직 육종(사례의 80%)이다.

(i) 골육종( Osteosarcoma) .

골육종은 원시 간엽 세포에서 발생하고 조골세포 분화 및 악성 뼈의 생성을 나타내는 공격성 악성 종양이다. 골육종은 소아 환자에서 모든 악성종양의 2.4%를 차지하고, 모든 원발성 골암의 약 20%를 차지한다. 소아암의 8번째로 흔한 유형이고 어린이와 젊은 성인에서 가장 흔한 조직학적 유형의 원발성 골암이다. 이는 매년 유럽과 미국의 약 1,000명의 환자에서만 매년 약 300명이 사망하는 것으로 진단되는 드문 질환이다.

(ii) 활막세포육종( Synovial Cell Sarcoma) .

이는 대개 젊은 성인에서 발생하고, 가장 일반적으로 관절 옆의 팔이나 다리에서 발생하지만, 드물게 관절 자체에도 침범한다. 가장 일반적인 위치는 무릎에 인접해 있다. 다른 연조직육종과 달리, 활막 세포 육종은 종종 고통스럽다. 치료는 대개 방사선으로의 근치절제 및 화학요법 또는 화학요법과 병용된 절단으로 이루어진다.

(iii) 횡문근육종( Rhabdomyosarcomas) .

횡문근 또는 골격근의 이러한 암성 종양은 연조직육종의 가장 일반적인 유형 중 하나이고, 유아에서 진단된 연조직육종의 약 절반을 차지한다. 그들은 가장 일반적으로 팔 또는 다리에서 자라지만 머리나 목에서 또는 요로나 생식 기관에서도 발생할 수 있다. 다형성, 폐포, 배아 및 포도상을 비롯한, 여러 가지 유형이 있다.

(iv) 평활근육종(평활근 종양) 및 자궁육종( Leiomyosarcoma (Smooth Muscle Tumor) and Uterine Sarcoma)

이는 평활근의 암 종양이다. 가장 흔히 기관(예: 위장관과 자궁)에서 발생한다. 환자의 평균 연령은 60세이다. 위장관에서 발생하는 종양 중 61%가 위에서 발생하고, 29%는 소장에서, 그리고 10%는 결장에서 발생한다. 위장(GI) 또는 자궁 평활근육종의 증상은 심한 출혈과 통증이다. 전이는 환자의 절반 이상에서 발생한다. 전이는 일반적으로 간에서 자주 전이되는, 위장 종양을 제외하고 폐에서 발생한다. 자궁 평활근육종 치료에는 총 복식자궁절제술이 있다.

(v) 위장관 간질성 종양(Gastrointestinal Stromal Tumor(GIST))으로 알려진, 위장육종( Gastrointestinal Sarcoma) .

GIST는 위장의 스트로마에서 발생하고 c-Kit 돌연변이를 활성화시키는 특징이 있다. 이는 Gleevec®으로 치료한다.

(vi) 카포시육종( Kaposi's Sarcoma) .

카포시육종은 암세포가 입, 코 및 항문을 덮는 피부 또는 점막 아래의 조직에서 발견되는 질병이다. 카포시육종 환자에는 세 가지 그룹이 있다. 첫 번째 그룹에는 일반적으로 유대인, 이탈리아인 또는 지중해 인종 유전의 나이든 남성이 포함된다. 이 유형의 카포시는 보통 10-15년 동안 천천히 진행된다. 환자들은 일반적으로 하퇴의 앞쪽에 푸른 병변이 생기고, 이는 일반적으로 여러 병변으로 퍼진다. 얼마 후, 이 질병은 다른 장기로 퍼질 수 있다. 카포시육종의 두 번째 그룹은 장기 이식을 받은 환자에서 발생한다. 이식 후 면역억제 치료로 인해, 환자의 면역 체계가 약해져 감염에 더 취약하다. 카포시육종의 세 번째 그룹은 에이즈(AIDS) 환자에서 발견된다. 이 그룹을 유행성 카포시육종이라고 한다. HIV 바이러스에 의해 약화된 면역 체계 때문에, 카포시(Kaposi's)와 같은 다른 질병 및 감염이 인체에 침투할 수 있다. 에이즈에 걸린 사람들의 카포시육종은 대개 더 빨리 퍼지고 신체의 여러 부분에서 발견될 수 있다. 방사선 요법은 대개 카포시의 치료법이지만; 병반이 장기로 퍼진 경우, 화학요법도 종종 사용된다.

(vii) 지방육종( Liposarcoma) .

이는 가장 흔히 진단되는 연조직종양으로 보고된 육종의 가장 큰 카테고리에 속한다. 이 종양들은 대개 깊은 지방 조직에서 발생한다. 그들은 가장 일반적으로 허벅지 안, 무릎, 사타구니, 둔부 부위 뒤 또는 후복막강 안에서 발생한다. 지방육종은 대개 악성이고 비-암성 종양인, 기존 지방종에서 유래하는 경우는 드물다. 그들은 30세에서 60세 사이의 성인에서 가장 흔하게 발견되고 여성보다 남성에서 약간 더 흔하다. 림프절 전이는 약 10%의 사례에서 발생한다.

(viii) 연골육종( Chondrosarcoma) .

연골육종 종양은 연골 세포에서 발생한다.

(ix) 유잉육종(ES( Ewing's sarcoma) )

유잉육종 군의 종양(ESFT)은 주로 10세에서 20세 사이에 피크를 나타내는, 청소년기와 젊은 성인에서 발견되는 골육종 또는 연조직육종이다(Burchill 2008). ES는 유잉육종 절단점 영역 1(EWSR1) 유전자를 포함하는 염색체 전위에 의해 유전적으로 특성화된다. 염색체 22에서 EWSR1이 염색체 11로 전위되면 85%의 ES 사례에서, 융합 단백질 생성물인 EWS-FLI1이 형성된다(de Alava & Gerald 2000). 또한, 융합 생성물인 EWS-ERG는 10%의 사례에서 확인된다. EWSR1 절단점(breakpoint)은 유전자 전위를 위한 핫스팟(hot spot)으로 보이고 명확한 세포 육종, 골외 점액성 연골육종 및 기타와 같은 다른 육종 하위유형의 다른 C-말단 유전자와 무분별하게 결합할 수 있다. FLI1, ERG 및 다른 ETS 유전자는 DNA-결합 도메인을 포함하고 EWS-FLI1 단백질은 ES로의 악성 형질전환을 조절하는 비정상적 전사 인자로서 기능한다. 전이성 유잉육종 환자의 예후는 참담하고 5-년 생존율은 전신 요법의 발전에도 불구하고 보통 30%를 초과하지 않는다(Jiang et al. 2015).

(x) 평활근육종( Leiomyosarcoma) . 평활근육종 종양은 복부 및 골반 장기 및 혈관의 평활근으로부터 발생한다.

28개의 인간 육종 세포주의 패널에서 BO-1055의 세포독성

DNA 가교제는 소아과 육종의 화학요법에서 중요한 부분을 차지하고 있다. 현재 연구에서, 본 발명자들은 시험관 내 및 종양 이종이식 모델에서 다양한 육종 세포주의 세포 성장에 대해 BO-1055가 현저한 세포독성을 나타냄을 발견하였다. 본 발명자들은 유잉육종, 횡문근육종, 골육종, 및 결합조직성 소원형푸른세포종양(DSRCT) 세포주에서 BO-1055-매개 세포독성의 효능을 측정하고 테마졸라미드(Temazolamide), 멜팔란(Melphalan), 및 독소루비신(Doxrubicin)과 비교하였다. (표 30)(Ambati et al. 2014a, b).

BO-1055는 8/9 유잉(Ewing) 세포주에 대해 독성이 높았고(IC₅₀ 0.14-0.61μM) 1/9에 대해서는 중등도의 독성이었다(IC₅₀ 1.04μM). 유사하게, BO-1055는 4/5 횡문근육종 라인에 대해 독성이 높았지만(IC₅₀ 0.08-0.40μM) 하나의 라인(SMS-CTR 배아(embryonal) 유형)은 매우 내성이 있었다(IC₅₀≥10.0μM). 2개의 결합조직성 소원형세포종양 라인은 BO-1055에 중등도로 민감했다(IC₅₀ 2.41-3.74μM). 대조적으로, 5개의 골육종 라인 중 3개가 BO-1055에 대해 내성이 높았다(IC₅₀≥10.0- ≥100.0μM). 하나의 라인은 매우 민감하였고(IC₅₀ 0.45μM), 하나는 중등도로 민감했다(IC₅₀ 2.67μM).

테모졸라미드(Temozolamide(TMZ)) 독성은 9개의 라인에서 측정되었고 이 중, 3개는 유잉육종이었고 5/6 횡문근육종 라인(IC50 191.0-> 1,000.0μM)과 같이 매우 내성이 높았다(IC₅₀ 245.0-405.0μM). RH30(폐포 형) 횡문근육종 라인은 TMZ에 대해 중등도의 내성을 보였으나(IC₅₀ 9.0μM) BO-1055에는 매우 민감하였다(IC₅₀ 0.24μM). 멜팔란(Melphalan)은 테스트된 유잉(Ewing)과 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)의 8개 라인에 대해 세포독성이 높았다(IC₅₀ 0.0001-0.020μM).

독소루비신은 3가지 유잉육종을 포함하여, 모든 선별된 라인에 대해 세포독성이 높았다(IC₅₀ 0.005-0.38μM). BO-1055에 대해 내성이 강한 2개의 골육종 라인은 테스트된 횡문근육종 라인과 마찬가지로(IC₅₀ 0.011μM) 독소루비신(doxorubicin)에 대해 매우 민감하였다(IC₅₀ 0.025-0.090μM). 상기 결과는 BO-1055가 TMZ보다 더 세포독성이 있지만, 테스트된 육종 세포주의 세포 성장에 대하여 멜팔란 및 독소루비신보다는 덜 강력함을 입증한다.

BO-1055 세포독성 활성을 4개의 종양 하위유형을 나타내는 28개의 인간 육종 세포주 패널에서 측정하였다:- 결합조직성 소원형세포종양(DSVCT) n=2, 유잉(Ewing’s) n=11, 골육종(Osteosarcoma) n=5 및 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma) n=9

육종, DSRCT ¹	BO-1055	TMZ ²	Melph ²	Doxo ²
BER	2.41	ND³	ND	ND
BOD	3.74	ND	ND	ND
육종 Ewing's	BO-1055	TMZ	Melph	Doxo
A673	0.52	ND	ND	0.38
CAR	0.31	ND	ND	ND
CHLA-9	0.60	294.0	0.0001	ND
IARC-EW1	0.43	ND	ND	ND
ORA	0.32	ND	ND	ND
SIM-1	1.04	ND	ND	ND
SK-N-MC	0.61	ND	ND	ND
TC-32	0.60	ND	ND	0.005
ZUC	0.14	ND	ND	ND
육종, 골육종	BO-1055	TMZ	Melph	Doxo
HOS	0.43	ND	ND	ND
MG63	2.67	ND	ND	ND
OSA	≥10.0	ND	ND	ND
Saos-1	≥100.0	ND	ND	0.025
U2OS	≥20.0	ND	ND	0.090
횡문근육종	BO-1055	TMZ	Melph	Doxo
A204 (육종양)	0.08	569.0	ND	0.011
RH30 폐포	0.24	9.00	0.0200	ND
RMS-559 배아	0.25	ND	ND	ND
SMS-CTR 배아	≥10.0	ND	ND	ND
TE-381-T⁴	0.40	ND	ND	ND

¹DSRCT=결합조직성 소-원형-세포 종양; ²TMZ=테모졸로미드(Temozolomide), ²Melph=멜팔란, ²Doxo=독소루비신. ³ND=결정되지 않음; ⁴결합된 결합조직 및 연조직, 섬유아세포

(xi) BO-1055는 A673 유잉육종 세포 및 A204 횡문근육종 세포에서 G2/M 기의 세포주기 정지를 유도한다

A673 유잉육종 세포주 및 A204 횡문근육종 세포주에서 BO-1055에 의해 유도된 세포주기 억제 및 세포사멸을 유동세포계측법(flow cytometry)으로 측정하였다(도 25a). 도 25a는 표시된 농도의 BO-1055에서 12, 24, 48 및 72시간에서 7-AAD(생존율 테스트용) 및 아넥신(Annexin) V-APC(세포사멸용) 염색을 사용한 A673 세포주의 유동세포계측 분석 결과를 나타낸다.

그 결과 BO-1055는 용량-의존성 및 시간-의존성 방식으로 두 세포주에서 G2/M기에 세포 주기 정지를 유도하는 것으로 나타났다.

도 25b는 BO-1055 처리 후 상이한 시점에서의 세포사멸 및 사멸 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.

도 25c는 BO-1055로 처리한 후 48시간 및 72시간에 A673 세포에서 카스파제 3/7 활성을 나타내는 그래프이다.

도 25d는 상이한 투여량의 BO-1055가 적용된 후 12, 24, 48 및 72시간에 죽은 A673 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.

도 25e는 상이한 투여량의 BO-1055가 적용된 후 12, 24, 48 및 72시간에 세포사멸 A673 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다.

(xii) BO-1055는 메틸셀룰로오스 배양 온코-구(onco-sphere) 형성 분석에서 A673 유잉육종을 억제하였다

본 발명의 발명자들은 온코-구 형성 분석에 의한 메틸셀룰로오스 배양에서 억제 A673 유잉육종을 연구하였다(도 26a 및 26b).

도 26a는 다양한 농도의 BO-1055 또는 4-하이드로퍼옥시시클로포스파미드로 처리한 후 메틸셀룰로오스 배양물에서 A673 유잉육종 온코-구 형성의 억제를 나타낸다. 구 형성의 50% 억제는 1.00μM 4-HC 및 <0.10 μM BO-1055에서 나타났다.

도 26b는 메틸셀룰로오스에서의 온코구 형성을 도시한다.

결과는 BO-1055가 양성 대조군으로 사용된, 4-하이드로퍼옥시시클로포스파미드(Hydroperoxycyclophosphamide)보다 더 세포독성이 있음을 보여주었다.

(xiii) A673 유잉육종 세포주에 대한 BO-1055의 상이한 화학요법제와의 병용에 의한 시험관 내 상승효과.

본 발명의 발명자는 토포테칸, SN-38, 독소루비신, 및 PU-H71과 같은, 다른 화학요법제와 BO-1055의 조합을 이용하여 A673 유잉육종 세포주에서 BO-1055의 세포독성 효과를 평가하였다.

도 27a-d에 도시된 바와 같이, 시험된 상이한 화학요법제와 병용한 A673 유잉육종 세포주에 대한 BO-1055의 상승효과적 세포독성이 나타나있다.

구체적으로, 다양한 농도의 BO-1055 및 두번째의 약물을 96 웰 플레이트에서 격자 형태로 동시에 적용하고 알라마 블루(Alamar blue) 세포 증식 분석을 사용하여 세포독성을 정량화하였다. 그 다음, 각 조합에 대해 컴퓨신(Compusyn) 소프트웨어를 사용하여 Fa-조합 지수(CI) 플롯과 표준화 이소볼로그램을 생성했다.

도 27a는 BO-1055와 토포테칸의 조합의 이소볼로그램을 도시하고;

도 27b는 BO-1055와 SN-38의 조합의 이소볼로그램을 도시하고;

도 27c는 BO-1055와 독소루비신의 조합의 이소볼로그램을 도시하고; 그리고

도 27d는 BO-1055와 PU-H71의 조합의 이소볼로그램을 도시한다. 이 조합은 시험관 내 유잉육종 세포에 대하여 상승작용을 나타낸다.

(xiv) BO-1055는 NSG 쥐의 유잉육종 종양 이종이식에 대하여 강력한 치료 효능을 나타낸다.

유잉육종 이종이식된 NSG 쥐에서 BO-1055의 치료 효능을 측정하였다. 도 31a-e에 도시된 바와 같이, BO-1055는 꼬리 정맥 주사에 의한 30mg/kg 용량 4회의 누드 쥐에서 종양 성장의 완전한 퇴행을 야기하였다. 치료된 그룹에서 종양의 완전한 퇴행이 관찰되었다.

약 100mm³ 크기의 A673 유잉육종 이종이식된 NSG 쥐(그룹 당 n=5)에게 꼬리 정맥 주사에 의해 10mg/kg, 20mg/kg 및 30mg/kg의 용량으로 BO-1055를 5회 투여했다. 그 결과를 도 28a-c에 나타낸다.

도 28a는 일주일에 2회 측정한 종양 부피의 플롯을 도시한다.

도 28b는 쥐에서의 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한다.

도 28c는 치료된 쥐의 중량 플롯을 도시한다.

A204 횡문근육종 이종이식된 그룹 당 누드 쥐(n=5)를 BO-1055로 꼬리 정맥 주사로 5일간 30mg/kg의 양으로 교대로 처리하였다. 그 결과를 도 28d 및 28e에 나타낸다.

도 28d는 종양 크기의 플롯을 도시한다.

도 28e는 치료된 쥐의 중량 플롯을 도시한다.

치료된 그룹에서 종양의 완전한 퇴행이 관찰되었다.

(xv) BO-1055는 NSG 쥐에서 시클로포스파미드-내성(cyclophosphamide-resistant) 이종이식편인, 유잉육종 이종이식편을 효과적으로 억제했다

BO-1055를 NSG 쥐에 피하 이식된 유잉육종 1차 환자 종양 샘플의 시클로포스파미드-내성 이종이식에 대해 사용하였다. NSG 쥐의 종양이 100mm³에 도달하면, 쥐를 무작위로 대조군 및 약물 치료군으로 분류하였다. 대조군의 쥐는 PBS 를 주사하였고, 약물 치료군의 쥐는 시클로포스파미드의 MTD 투여량(70mg/kg)을 격일로 3회 복강내 주사하였다(도 29에서 짧은 화살표로 나타냄). 종양 성장은 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 처리된 쥐에서는 억제되지 않았다. 종양이 ≥500mm³에 도달하면, 30mg/kg의 용량으로 BO-1055로 치료가 시작되었다. 격일로 4회, 정맥내 주사(긴 화살표로 나타냄). BO-1055로 치료시 시클로포스파미드-면역(cyclophosphamide-refractory) 종양의 퇴행을 주목한다.

그 결과를 도 29에 나타낸다. 알 수 있듯이, BO-1055는 두 가지 알킬화제를 선행 치료제로 사용하여 악화된 유잉육종 환자에서 NSG 쥐(두 번째 계통)에서 확립된 시클로포스파미드-내성 이종이식편을 저해했다.

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Claims

환자의 암을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 우레이도무스틴을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 암은 백혈병, 림프종, 소세포폐암(SCLC), 교모세포종 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 소폐세포암(small lung cell carcinoma)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 육종인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 암 세포의 수를 치료학적으로 현저하게 감소시키고 그리고 비-악성 조직에 대해 현저한 독성을 초래하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 우레이도무스틴은 약학적 조성물로서 제제화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자에게 또다른 항암 활성제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.