TWI644667B - 脲基氮芥於癌症治療上之用途 - Google Patents

Abstract

使用脲基氮芥(BO-1055，一種水溶性DNA交聯劑)治療癌症的方法，癌症係選自由各種類型的人類白血病[例如急性骨髓性白血病(ALL)和急性B淋巴母細胞白血病(B-ALL)]、淋巴瘤、小細胞肺癌(SCLC)、肉瘤、及其他癌症所組成之群組。

Description

脲基氮芥於癌症治療上之用途

本發明係有關於一種脲基氮芥於癌症治療上之用途。

自從尼克森總統1971年宣告「癌症戰爭」以來，一套假說主導著癌症治療超過40年。「癌症戰爭」為有力動人的口號，卻帶來適得其反、甚至有潛在危險的細胞滅殺治療模式(Oronsky等人，2015年)。製藥產業仍發展癌症藥物來實現最高耐受劑量(MTD)，以試圖達到最全面和快速的細胞滅殺。

化療和放療是對抗癌細胞的最終武器，但會導致非設想中的「適者生存」反應；亦即以消滅腫瘤的化療，實際上可能會有反效果。這是因為當對化療敏感的癌細胞被殺死了，而競爭些微空間和資源的耐化療癌腫瘤細胞則以達爾文方式，適應環境並藉由克隆性擴增和遺傳多樣性發展形成腫瘤(Greaves & Maley 2012)。這種選汰壓力的代價造成抗藥性的出現和治療失敗，使得積極治療成為弄巧成拙的過程。

因此，需要有治療癌症的有效方法，該方法不會對非惡性組織產生明顯毒性。

烷化劑是一組抗癌化合物。脲基氮芥(也稱為BO-1055)是一種選擇性烷化劑，被敘述於美國專利第8,222,297 B2號中，其結構式如下：

雖然脲基氮芥先前被建議作為某些癌症的抗腫瘤劑，但仍明顯需要使用此化合物治療其它癌症的方法。

在一個實施例中，本發明提供在需要癌症治療的患者身上治療癌症的方法，包含對該患者投予治療有效量的脲基氮芥，其中癌症係選自由白血病、淋巴瘤、肺癌、小細胞肺癌(SCLC)、結腸直腸癌、前列腺癌、腎癌、神經膠質母細胞瘤、及肉瘤所組成之群組。

脲基氮芥(貫穿本申請全文也稱為「BO-1055」)具有以下結構式：

美國專利第8,222,297號描述脲基氮芥、以及製造此化合物的方法。

術語「脲基氮芥」還含括BO-1055的醫藥上可接受鹽、該化合物的異構物、鏡像異構物、及消旋混合物。

在較佳的實施例中，癌症係選自由白血病、淋巴瘤、SCLC、及肉瘤所組成之群組。

在一個實施例中，白血病包含急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或淋巴母細胞白血病(ALL、T細胞或B細胞亞型)、雙表型白血病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL、T細胞或B細胞亞型)及慢性骨髓性白血病(CML)。

在較佳的實施例中，治療係有效實現治療上明顯減少的癌細胞數目而不會對非惡性組織產生明顯毒性。

圖1繪示脲基氮芥劑量vs人類臍帶血(CB)造血祖細胞(HPC/wk2-CAFC)與造血幹細胞(HSC/wk5-CAFC)的曲線圖。

圖2繪示脲基氮芥劑量vs正常細胞類型與人類急性骨髓性白血病(AML)細胞株(MA-10)的相對螢光強度之曲線圖。

圖3繪示對小鼠投予脲基氮芥(BO-1055)、卡鉑、歐洲紫杉醇、及對照物後42天取出的不同器官之病理檢查照片。

圖4繪示脲基氮芥的DNA交聯凝膠移位試驗的照片。

圖5繪示在脲基氮芥治療後非小細胞肺癌H1299細胞的流式細胞量測術細胞週期分佈。

圖6繪示脲基氮芥結合到hERG受體的hERG螢光偏振試驗之圖形表示。

圖7繪示脲基氮芥與血漿蛋白結合vs時間的圖。

圖8繪示在72小時BO-1055對各種白血病細胞株和正常臍帶血CD34+ HSC/HPC的細胞毒性的阿爾瑪藍螢光強度劑量-反應曲線。

圖9繪示脲基氮芥劑量vs生長因子依賴性MA-10-W51細胞的相對螢光強度之曲線圖。

圖10A繪示注射有1×10³-3×10⁶個GFP-螢光素酶轉導的THP-1 AML細胞且未進一步治療的四隻小鼠的生物攝像照片組。

圖10B繪示注射有1×10³-1×10⁶個GFP-螢光素酶轉導的THP-1 AML細胞而且還在腫瘤注射時皮下植入每天釋放1μg的人類GM-CSF超過40天的滲透性微型泵的四隻小鼠的生物攝像照片組。

圖11描繪各五隻小鼠的六個生物攝像照片組。左側三組顯示只注射MV4-11-GFP螢光素酶細胞的小鼠；而右側三組顯示注射MV4-11-GFP螢光素酶細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

圖12描繪移植有表現GFP/螢光素酶的MA10細胞且：a)無細胞介素支撐(在左)和b)藉由微型泵植入物投予人類GM-CSF(右)的小鼠之生物攝像照片。

圖13描繪六隻各移植MA-10-W51-GFP螢光素酶細胞的小鼠之生物攝像照片；左側的三隻小鼠接受對照物注射，而右側的三隻小鼠接受脲基氮芥注射。

圖14描繪各五隻小鼠的六個生物攝像照片組。左側三組顯示只注射AML-2-CD34+-GFP-螢光素酶細胞的小鼠；而右側三組顯示注射AML-2-CD34+-GFP-螢光素酶細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

圖15為投予脲基氮芥後的天數vs植入原發性患者衍生的AML-2 CD34+細胞的存活小鼠的數量之曲線圖。

圖16繪示在72小時BO-1055對原發性患者pre-B ALL白血病與正常臍帶血CD34+ HPC/HSC相比的細胞毒性之阿爾瑪藍螢光強度劑量-反應曲線。

圖17繪示在脲基氮芥治療後表現CD19及/或CD34的pre-B-ALL細胞之流式細胞量測術分佈。

圖18繪示各三隻小鼠的四個生物攝像照片組。左側三組顯示只注射Pre-B-ALL CD34-GFP-螢光素酶細胞和對照培養液的小鼠；而右側三組顯示注射Pre-B-ALL CD34-GFP-螢光素酶細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

圖19繪示植入pre-B-ALL細胞並使用脲基氮芥和對照物治療的小鼠之存活分析圖。

圖20繪示各五隻小鼠的八個生物攝像照片組。左側四組顯示只注射GFP-Lu-SCLC H526細胞和對照培養液的小鼠；而右側四組顯示注射SCLC H526細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

圖21繪示GFP-Lu-SCLC H526細胞在圖20描繪的小鼠體內的生長對數圖。

圖22A為在不同荷SCLC H526異種移植物小鼠體內植入腫瘤(皮下)後、靜脈注射脲基氮芥或伊立替康或依托泊苷後的平均腫瘤大小vs天數之圖。

圖22B為在相同小鼠體內植入腫瘤後平均體重變化vs天數之圖。

圖23A在使用脲基氮芥和阿黴素(DOXO)治療的DLBCL(ABC亞型)OCY-LY3癌細胞上藉由GraphPad Prism獲得的增殖抑制曲線和IC₅₀。

圖23B描繪藉由GraphPad Prism在相同細胞上獲得的Fa-Ci圖。

圖23C描繪藉由GraphPad Prism在相同細胞上獲得的等效線圖；左側的組描繪BO1055 Cte+DOXO Var；而右側的組描繪DOXO Var+BO1055 Cte。

圖24繪示各五隻小鼠的六個生物攝像照片組。左側三組顯示只注射JEKO-1-GFP-Luc外膜細胞淋巴瘤細胞和對照培養液的小鼠；而右側三組顯示注射JEKO-1-GFP-Luc外膜細胞淋巴瘤細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

圖25A繪示在脲基氮芥治療後A673尤文氏肉瘤和A204橫紋肌肉瘤細胞株的流式細胞量測術細胞週期分佈。

圖25B繪示在脲基氮芥治療後凋亡和死亡的A673細胞之百分比。

圖25C繪示在脲基氮芥治療後A673細胞中的半胱天冬酶活性之曲線圖。

圖25D繪示在脲基氮芥治療後死亡A673細胞的百分比之圖形表示。

圖25E繪示在脲基氮芥治療後凋亡A673細胞的百分比之圖形表示。

圖26A為繪示使用各種濃度的脲基氮芥或4-氫過氧環磷醯胺治療之後在甲基纖維素培養物中抑制A673尤文氏肉瘤腫瘤球形成之曲線圖。

圖26B為顯示甲基纖維素中形成腫瘤球之影像。

圖27A繪示藉由GraphPad棱鏡在使用脲基氮芥與托泊替康的組合治療的A673尤文氏肉瘤細胞上獲得的等效線圖。

圖27B繪示使用脲基氮芥與SN-38的組合治療的相同細胞之等效線圖。

圖27C繪示使用脲基氮芥與阿黴素的組合治療的相同細胞之等效線圖。

圖27D繪示使用脲基氮芥與一種HSP90抑制劑PU-H71的組合治療的相同細胞之等效線圖。

圖28A繪示腫瘤體積vs從荷A673尤文氏肉瘤異種移植物並使用不同劑量的脲基氮芥治療的NSG小鼠開始治療的天數之曲線圖。

圖28B繪示相同小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。

圖28C繪示小鼠重量vs從相同小鼠開始脲基氮芥治療的天數之曲線圖。

圖28D繪示腫瘤大小vs從荷A204橫紋肌肉瘤異種移植物並使用脲基氮芥治療的NSG小鼠開始治療的天數之曲線圖。

圖28E繪示小鼠重量vs從相同小鼠開始脲基氮芥治療的天數之曲線圖。

圖29繪示腫瘤大小vs從荷原發性尤文氏肉瘤異種移植物且先每天注射環磷醯胺3天、並在逐漸腫瘤生長之後使用4次脲基氮芥注射治療的NSG小鼠開始治療的天數之曲線圖。

如本文中和所附申請專利範圍中使用的，單數形式「一」和「該」包括複數的指稱物，除非上下文另有明確說明。因此，舉例來說，提及「一個細胞」包括複數個這樣的細胞及所屬技術領域中具有通常知識者習知的該細胞之均等物等等。同樣地，術語「一」、「一個或更多個」及「至少一個」在本文中可以互換使用。還應注意的是，術語「包含」、「包括」、及「具有」可以互換使用。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解的相同的含義。雖然任何與本文所述類似或均等的方法和材料都可被用來實施或測試本發明，但現在描述的是較佳的方法和材料。為了描述和揭示在可能與本發明結合使用的出版物中報告的化學藥品、細胞株、載體、動物、儀器、統計分析及方法的目的，將本文中提及的所有出版物都以引用方式併入本文中。本文中沒有什麼可以被解讀為承認本發明由於先前的發明而沒有資格先於該等揭示內容。

在一個實施例中，本發明提供一種在需要癌症治療的患者身上治療癌症的方法，包含投予該患者治療有效量的脲基氮芥，其中癌症係選自由白血病、淋巴瘤、肺癌、小細胞肺癌(SCLC)、結腸直腸癌、前列腺癌、腎癌、神經膠質母細胞瘤、及肉瘤所組成之群組。

較佳的是，脲基氮芥被配製在醫藥組合物中。

脲基氮芥(貫穿本申請全文也稱為「BO-1055」)具有以下結構式：

美國專利第8,222,297號描述脲基氮芥、以及製造此化合物的方法。

術語「脲基氮芥」還含括BO-1055的醫藥上可接受鹽、化合物的異構物、鏡像異構物、及消旋混合物。本發明還包括治療不同癌症的方法，包含投予脲基氮芥的代謝物。術語「代謝物」意指任何從脲基氮芥的新陳代謝或代謝過程產生的物質。

在一較佳的實施例中，癌症係選自由白血病、淋巴瘤、SCLC、及肉瘤所組成之群組。

在一個實施例中，白血病包含急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或急性淋巴或淋巴母細胞白血病(ALL、T細胞或B細胞亞型)、雙表型白 血病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL、T細胞或B細胞亞型)及慢性骨髓性白血病(CML)。

在較佳的實施例中，治療係有效實現治療上明顯減少的癌細胞數目而不會對非惡性組織產生明顯毒性。

在一個實施例中，脲基氮芥的治療有效劑量依患者的重量介於約3和約4mg/kg之間。

在一些實施例中，本發明的方法進一步包含對正使用脲基氮芥治療的患者共同投予另一種抗癌活性劑。

本文中定義的「接觸」意指將本發明中使用的抗腫瘤化合物引入在試管、燒瓶、組織培養皿、晶片、排列、盤、微孔盤、毛細管、或類似物中含有受體的樣本中，並在足以允許抗腫瘤化合物與受體結合的溫度和時間下培育。使樣本與抗腫瘤化合物或其他特異性結合成分接觸的方法是所屬技術領域中具有通常知識者習知的，而且可以視運作的試驗方案類型來選擇。培育方法也是標準的並且是所屬技術領域中具有通常知識者習知的。

在另一個實施例中，術語「接觸」意指將本發明中使用的抗腫瘤化合物引入接受治療的患者體內，並在體內允許化合物進行接觸。

本文中使用的術語「治療」包括預防性以及病症忽輕忽重的治療。本文中使用的術語「降低」、「壓制」及「抑制」具有一般理解的減輕或減少的含義。本文中使用的術語「進展」意指範圍或嚴重性增加、促進、成長或變得更壞。本文中使用的術語「復發」意指疾病緩解之後重新發生。

本文中使用的術語「投予」是指使患者、組織、器官或細胞與抗腫瘤化合物接觸。如本文中使用的，投予可以在體外(即在試管中)、或在體 內(即在活體生物(例如人)的細胞或組織中)完成。在某些實施例中，本發明包括對患者或受試者投予本發明中有用的化合物。本文中等同使用的「患者」或「受試者」是指哺乳動物，較佳是人，並且屬於以下任一者：(1)具有藉由投予脲基氮芥可補救或可治療的病症或(2)易患有可藉由投予脲基氮芥來預防的病症。

如本文中使用的，「醫藥組合物」意指與適當的稀釋劑、防腐劑、助溶劑、乳化劑、及佐劑(統稱「醫藥上可接受的載體」)一起的治療有效量抗腫瘤化合物。如本文中使用的，術語「有效量」和「治療有效量」是指足以產生期望的治療反應而沒有不適當的不良副作用(例如毒性、刺激性、或過敏反應)的活性治療劑的量。具體的「有效量」將明顯地隨著如被治療的特定症狀、患者的身體狀況、被治療動物的種類、治療的持續時間、並行治療的性質(若有的話)、以及採用的具體製劑與化合物或其衍生物的結構等等因素而改變。在這種情況下，假使某量產生以下中之一者或更多者則該量將被視為是治療有效的：(a)疾病(例如胰臟癌、乳癌)的預防；及(b)此類疾病的逆轉或穩定化。最佳有效量可由所屬技術領域中具有通常知識者使用例行實驗輕易決定。

醫藥組合物是液體或凍乾的或其它乾燥製劑，並包括各種緩衝內容物的稀釋劑(例如Tris-鹽酸、乙酸、磷酸)、pH和離子強度添加劑例如白蛋白或明膠以防止吸附於表面、去污劑(例如吐溫(Tween)(聚山梨醇酯)20、吐溫80、普朗尼克(Pluronic)F68、膽汁酸鹽)、助溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏二亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、芐醇、對羥基苯甲酸酯)、填充物質或張力調節劑(例如乳糖、甘露醇)、諸如聚乙二醇 的聚合物對蛋白質的共價附接、與金屬離子複合、或材料摻入或摻到諸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等的聚合化合物的微粒製劑上、或到脂質體、微乳劑、微胞、單層或多層囊泡、紅細胞殘骸、或球形質體上。這樣的組合物將影響物理狀態、溶解性、穩定性、體內釋放速率、及體內清除速率。控釋或緩釋組合物包括在親脂性貯存場所(例如脂肪酸、蠟、油)中的製劑。

本發明還包括的是投予塗覆有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)的微粒組合物的方法。組合物的其他實施例合併微粒形式的保護塗層、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑用於各種投藥途徑，包括局部、腸胃外、肺、鼻和口服。在一個實施例中，醫藥組合物被腸胃外、癌周圍、經黏膜、經皮、肌內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內及腫瘤內投予。

另外，本文中使用的「醫藥上可接受載體」是所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知的，並且包括但不限於0.01-0.1M、而且較佳0.05M的磷酸鹽緩衝液或0.9%鹽水。此外，這樣的醫藥上可接受載體可以是水性或非水性溶液、懸浮液、及乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、以及可注射有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。

腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液及固定油。靜脈內載體包括流體和營養補充劑、電解質補充劑例如基於林格氏葡萄糖的那些，及類似物。防腐劑和其他添加劑也可以存在，例如抗菌劑、抗氧化劑、凝集劑、惰性氣體等。

依據本發明的控釋或緩釋組合物投藥包括在親脂性貯存場所(例如脂肪酸、蠟、油)中的製劑。本發明還包含的是塗覆有聚合物(例如泊洛沙 姆或泊洛沙胺)的微粒組合物及耦接到針對組織特異性受體、配位體或抗原的抗體或耦接到組織特異性受體的配位體的化合物。

依據本發明投藥的組合物之其他實施例包含微粒形式、保護性塗層、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑用於各種投藥途徑，包括腸胃外、肺、鼻及口服。

在依據本發明的又另一個方法中，醫藥組合物可被以控釋系統遞送。例如，試劑可以使用靜脈內輸注、可植入滲透泵、經皮貼劑、脂質體、或其它投藥模式投藥。在一個實施例中，可以使用泵(參見Langer，同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574(1989)。在另一個實施例中，可以使用聚合材料。在又另一個實施例中，控釋系統可被放在治療標靶(例如肝臟)附近，因此僅需要一部分的全身劑量(參見例如Goodson，在控釋的醫療應用中(in Medical Applications of Controlled Release)，同上，第2卷，第115-138頁(1984)。其它控釋系統在回顧中由Langer討論(科學(Science)249：1527-1533(1990)。

醫藥製劑可以單獨包含抗腫瘤化合物，或可以進一步包括醫藥上可接受載體，而且可以處於固體或液體的形式，例如片劑、粉劑、膠囊、丸劑、溶液、懸浮液、酏劑、乳劑、凝膠、霜劑或栓劑，包括直腸和尿道栓劑。醫藥上可接受載體包括膠、澱粉、糖、纖維素材料、及上述之混合物。含有抗腫瘤化合物的醫藥製劑可以藉由例如皮下植入丸劑來投予給患者。在進一步的實施例中，丸劑在一段期間提供控釋的抗腫瘤化合物。製劑也可以經由靜脈內、動 脈內、或肌肉內注射液體製劑、口服投予液體或固體製劑、或經由局部施用來投藥。投藥也可以藉由使用直腸栓劑或尿道栓劑來完成。

可藉由本發明投藥的醫藥製劑可以藉由習知的溶解、混合、造粒或片劑成型製程來製備。對於口服投藥，可以將抗腫瘤化合物與為此目的常用的添加劑(例如載體、穩定劑、或惰性稀釋劑)混合，並藉由常規方法轉化成適當的投藥形式，例如片劑、包衣片劑、硬或軟明膠膠囊、水性、醇性或油性溶液。適當的惰性載體的實例是傳統的片劑基質，例如與諸如阿拉伯膠、玉米澱粉、明膠等黏結劑組合的乳糖、蔗糖、或玉米澱粉，並具有崩解劑，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸，或具有潤滑劑，例如硬脂酸或硬脂酸鎂。

適當的油性載體或溶劑的實例是植物油或動物油，例如葵花油或魚肝油。製劑作為乾和濕顆粒都可以達到目的。對於腸胃外投藥(皮下、靜脈內、動脈內或肌肉內注射)來說，抗腫瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如鹽、酯、N-氧化物、及類似物)被轉變成溶液、懸浮液、或排出(假使是此目的慣常且適用的物質所需的)，例如助溶劑或其它助劑。實例是無菌液體，例如有或沒有添加界面活性劑和其它醫藥上可接受佐劑的水和油。說明性的油是石油、動物油、植物油或合成的來源，例如花生油、大豆油或礦物油。一般來說，水、鹽水、葡萄糖水溶液及有關的糖溶液和二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是較佳的液體載體，特別是用於可注射溶液。

含有活性成分的醫藥組合物的製備是所屬技術領域中眾所瞭解的。這種組合物可以被製備成噴霧劑被遞送到鼻咽或作為注射劑，可作為液體溶液或是懸浮液；然而，也可以製備適合在注射之前溶於或懸浮於液體的固體劑形。製劑也可以被乳化。活性治療成分經常與醫藥上可接受並且與活性成分 相容的賦形劑混合。適當的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、或類似物、或上述之任何組合。

此外，組合物可以含有少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、增強活性成分功效的pH緩衝劑。

活性成分可被配製成組合物，如中和的醫藥上可接受鹽形式。醫藥上可接受鹽包括使用無機酸或有機酸形成的酸加成鹽，無機酸例如鹽酸或磷酸，有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸、及類似物。從游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼和有機鹼，無機鹼例如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵，有機鹼例如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普羅卡因、及類似物。

對於使用例如霜劑、凝膠、滴劑、及類似物局部投藥到身體表面來說，抗腫瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如鹽、酯、N-氧化物等)被製備並在有或沒有醫藥載體的生理上可接受稀釋劑中作為溶液、懸浮液、或乳劑被施加。

在依據本發明的另一個方法中，活性化合物可被以囊泡遞送，特別是脂質體(參見Langer，科學249：1527-1533(1990)；Treat等人，在傳染病和癌症治療中的脂質體，Lopez-Berestein和Fidler(編)，Liss,N.Y.，第353-365(1989)；Lopez-Berestein同上，第317-327頁；大致參見以上出處)。

對於在藥物中的使用，抗腫瘤化合物的鹽可以是醫藥上可接受鹽。然而，其它的鹽在依據本發明的化合物或其醫藥上可接受鹽的製備中可以是有用的。化合物的適當醫藥上可接受鹽包括酸加成鹽，酸加成鹽例如可以藉由混合依據本發明的化合物的溶液與醫藥上可接受酸的溶液形成，醫藥上可接 受酸例如鹽酸、硫酸、甲磺酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

本文中提供以下實施例來說明本發明，而且該等實施例不應被以任何方式解讀為限制本發明。

實施例

實施例1

脲基氮芥的細胞毒性

在一組人和鼠良性組織類型中測定脲基氮芥(BO-1055)的毒性。

為了測定BO-1055對非惡性組織的毒性，發明人使用MTT法和阿爾瑪藍試驗(Hamid等人，2004)在29個不同的正常人、鼠或靈長類動物的細胞和組織類型(表1)上量測IC₅₀值。在全部29個正常組織上評估BO-1055。其中，24/29是高抗性的(IC₅₀ 10.0100.0μm)，5個是中抗性的(IC₅₀ 8.80-9.48μM)。後組包括輸卵管上皮、胎兒骨髓基質、在血清替代培養液中的臍帶血CD34+造血幹/祖細胞、CAFC 2週祖細胞和CAFC 5週造血幹細胞。

MSC：Castro-Malaspina等人1980年(第一次描述人類間質幹細胞及其後代)。初始用語CFU-F，目前替代命名間質基質細胞(因為只有一小部分的細胞群體具有自身復原的幹細胞特徵)。BMEC-hTERT：人類骨髓微血管內皮細胞-hTERT無限增殖(Franco等人，2001年)。MSC-hTERT：人類hTERT無限增殖的骨髓MSC(MacKenzie等人，2000年)。MRC5：使用hTERT無限增殖的人類胚胎肺纖維母細胞(Franco等人2001年，Wen等人2006年)。肺基部上皮細胞：使用hTERT或SV40無限增殖(16HBE SV40+、BCI-NSI hTERT、BEAS2B SV40 T、CCD-33Lu、NL31-PE)(Shaykhiev等人2013年，Walters等人2013年)。NOSE：正常人類卵巢上皮細胞。HS5、HS27A：使用乳頭狀瘤病毒無限增殖的成人骨髓基質細胞(Roecklein和Torok-Storb，1995年)。以非洲綠猴(草原猴)勞氏肉瘤轉化的腎細胞株(CV1)表示腎纖維母細胞(Jensen等人，1964年)。 CB CD34+：人類臍帶血CD34+細胞(Mulloy等人，2003年)。CB CFC：在半固體菌落試驗中的臍帶血造血祖細胞(CFC)(Chung等人，2005年)。SVGp12：星狀細胞，一種SV40轉化的人類胎兒神經膠質細胞株。

方法

(i)CFC試驗

藉由培養每ml的Iscove氏改良Dulbecco培養液(IMDM)中含500個純化的人臍帶血CD34⁺細胞以一式三份測定BO-1055和其它化合物對人造血祖細胞、菌落形成細胞(CFC)的毒性，IMDM含有1.2%的甲基纖維素、20ng/ml的人c-Kit配位體(KL)、20ng/ml的人IL-3、20ng/ml的人G-CSF、6單位/ml的人EPO、80μm的2-巰基乙醇、2mM的L-谷胺醯胺、50單位/ml的青黴素、50μg/ml的鏈黴素、0.125mM的氯化血紅素(Sigma)、及20%的血清替代物(生命技術，格蘭德島，NY)且存在或不存在各種劑量的BO-1055。14天後，將在顯微鏡下每個CFC菌落中含有超過50個細胞的菌落評為CFC，並將數據表示為平均值±標準差，n=3。

(ii)CAFC試驗

使用鵝卵石區形成試驗(CAFC)測定BO-1055在體外對人造血幹細胞(HSC)的毒性(Breems等人，1994年，Jo等人，2000年)。在MEM阿爾法培養液中建立200個純化人臍帶血CD34+細胞和MS-5細胞(鼠基質細胞)的共培養物，MEM阿爾法培養液中含12.5%的胎牛血清、12.5%的馬血清、10^-4M的單硫代甘油、10^-6M的氫化可的松、50μg/ml的慶大霉素、及2mM谷胺醯胺且含有或沒有各種劑量的試驗化學品。每週使用新鮮培養液補充一半的培養液一式三份。5週後，將共培養物的CAFC成員在相差顯微鏡下評分為在基質單層下方 8個相位暗細胞的區域。為了測定白血病幹細胞(LSC)，使用相同的試驗，但培養物在2週前打進鵝卵石區。利用解離鵝卵石區形成細胞二次再傳代到新鮮基質上來確認HSC和LSC兩者的自身恢復能力。

(iii)BO-1055對正常人組織和人癌組織的影響

在含有10%FCS且存在或不存在各種劑量的BO-1055的IMDM培養液中培養2,000~4,000個懸浮細胞或1,000~2,000個黏附腫瘤細胞/孔(在96孔或384孔盤中)一式三份。72小時後，將培養物用阿爾瑪藍脈衝整夜，並藉由Synergy H1盤式分析儀(BioTek公司)量測所得培養物的螢光強度。懸浮細胞包括純化的CB CD34+細胞、原生人白血病CD34+細胞、人類白血病和小細胞肺癌細胞株。黏附細胞是正常的人臍內皮細胞(HUVEC)、人骨髓內皮細胞(BMEC)、人骨髓間質幹細胞及各種的人實體瘤細胞株。當使用人CD34+細胞進行藥物篩選時，在添加阿爾瑪藍之前在20ng/ml的KL、20ng/ml的IL-3、20ng/ml的G-CSF及6單元/ml的EPO存在下培養500~1,000個細胞/孔7-10天。

如表1所示，脲基氮芥對一組正常人和鼠的組織和細胞類型具有相對低的毒性。該組包括四個支氣管上皮細胞株，其中三個藉由使用hTERT或SV40 T抗原(IC₅₀>10.0-40.0μM)轉導而無限增殖。從正常人卵巢表面上皮細胞和輸卵管基部上皮細胞取得的上皮細胞株也抗BO-1055(IC₅₀ 10.0-80.0μM)。內皮細胞由骨髓微血管內皮細胞株和正常臍帶衍生的血管內皮細胞代表，兩者皆抗BO-1055(IC₅₀>10-60.5μM)。間質基質/幹細胞(MSC)和肌纖維母細胞由14個細胞株代表。鼠和人胎兒和成人骨髓或肺衍生的MSC、胎兒皮膚MSC、脂肪組織衍生的MSC及靈長類動物腎纖維母細胞是相對抗BO-1055的(IC₅₀ 8.48>100μM)。

由乳頭狀瘤病毒無限增殖的良性人骨髓基質細胞株HS5和HS27A也抗BO-1055細胞毒性(IC₅₀>20-35.3μM)。在篩選組的正常人類造血細胞包括在無血清或含胎牛血清的懸浮培養物中(IC₅₀ 9.01-15.0μM)、或在用於造血祖細胞/HPC的半固體培養液菌落形成試驗中(CFU-GM、BFUE、CFU-混合(IC₅₀ 19.0μM)的純化臍帶血CD34+細胞。使用鵝卵石區形成試驗(Breems等人，1994年，Jo等人，2000年)進行第2週CAFC(HPC)的定量與對BO-1055的相對抗性的建檔(平均IC₅₀ 9.20μM，在n=4個獨立的臍帶血樣本中)。在第5週的CAFC試驗中的臍帶血造血幹細胞/HSC也是相對抗BO-1055的(平均IC₅₀ 9.10μM，在n=4個獨立的臍帶血樣本中)。

實施例2

在人類和小鼠正常組織類型組中測定烷化藥物卡鉑、順鉑、替莫唑胺、馬法蘭、苯達莫司汀及環磷醯胺(活性代謝物4-HC)的毒性

將用以測定BO-化合物之細胞毒性的19種良性組織類型的組也用來篩選六種常用烷化藥物卡鉑、順鉑、替莫唑胺、馬法蘭、苯達莫司汀及4-HC(環磷醯胺的活性代謝物)的毒性(表2)。

使用卡鉑篩選七種組織，有一種是中度敏感的(IC₅₀ 1.70μM)且6/7是高抗性的(IC₅₀ 32.8>1000μM)。12/14的株抗順鉑(IC₅₀ 20.0>100μM)，但2/3的支氣管株是敏感的(IC₅₀ 3.60-4.10μM)因為是臍帶血造血祖細胞(IC₅₀ 1.80μM)。

在7種組織上評估替莫唑胺，其中5種組織高度抗藥(IC₅₀ 20.0->100.0μM)，一種鼠MS5基質株顯示弱抗藥性(IC₅₀ 5.5μM)，而另一種HUVEC內皮細胞中度敏感。

MS5對其它的烷化劑也相當敏感，包括馬法蘭(IC₅₀ 1.64μM)和苯達莫司汀(IC₅₀ 2.24μM)，這是相對於測試的13種其它組織的馬法蘭抗藥性(IC₅₀ 7.0-320.0μM)。

苯達莫司汀對SV40無限增殖的支氣管上皮細胞(16HBESV40+IC₅₀ 3.55μM)和鼠骨髓基質(MS-5 IC₅₀ 2.24μM)有細胞毒性，但對測試的10種其它組織則無(IC₅₀ 20.0-400.0μM)。

4-HC(環磷醯胺的毒性代謝物)對2種正常組織有中度毒性(IC₅₀ 0.30-2.01μM)，而5種有抗藥性(IC₅₀ 12.5-47.0μM)。

篩選的所有正常細胞株都對卡鉑有抗藥性(7/7 IC₅₀ 23.0-1,000.0μM)。

實施例3

正常良性鼠細胞和人臍帶血CD34+細胞、造血祖細胞(HPC)及造血幹細胞(HSC)對脲基氮芥(BO-1055)細胞毒性的抗藥性

圖1顯示脲基氮芥對於由第2週CAFC試驗測定的人臍帶血CD34+ HPC增殖及由第5週CAFC試驗測定的造血幹細胞增殖(IC₅₀ 7.5-8.2μM)的影響。在獨立的臍帶血測試樣本間有敏感度變化，第2週CAFC的平均IC₅₀為9.20μM(祖細胞)，第5週CAFC的平均IC₅₀為9.10μM(HSC)(表2)。

圖2顯示與人急性骨髓性白血病(AML)細胞株相比脲基氮芥對各種正常細胞類型的增殖的影響。

正常細胞：人臍帶血CD34+細胞(hu-CB-CD34+)。這個亞群富含造血祖細胞(HPC~30%)和造血幹細胞(HSC~5%)。骨髓衍生的內皮細胞(BMEC)。人類間質基質細胞(MSC)、鼠MS-5(BM-MSC)及鼠OP9(BM-MSC)細胞。人類AML MA-10細胞：(使用MLL-AF9融合基因轉導的hu-CB-CD34細胞，細胞因子相關)。相對螢光強度表示在脲基氮芥存在下的螢光強度除以在沒有脲基氮芥存在下的螢光強度。

圖2顯示與MLL-AF9轉化的白血病細胞株相比，在各種正常鼠和人的組織類型上測得的連續稀釋BO-1055之細胞毒性。正常對照組織，包括人類骨髓內皮細胞(BMEC)、人MSC細胞及鼠MS-5和OP9骨髓基質細胞為抗BO-1055 細胞毒性(IC₅₀>10μM)，因為是正常的臍帶血CD34+細胞(IC₅₀>10μM)。這種化學抗性與從使用MLL-AF9白血病易位基因反轉錄病毒轉染得到的正常臍帶血CD34+細胞衍生的MA-10細胞株看到的化學敏感性相對(IC₅₀ 0.35μM)(Mulloy等人，2003年，Wunderlich及Mulloy，2009年)。將單白血病基因引入正常HSC/HPC將BO-1055的毒性提高>30倍。

實施例4

BO-1055治療對正常C57Bl/6小鼠之外周血血液學參數的體內作用

使用靜脈注射的MTD劑量(30mg/kg)和頻率(隔日x5)對正常健康小鼠投予BO-1055。發現這個劑量和藥物投予的時間表在裸鼠和NSG鼠體內產生腫瘤細胞株移植瘤的消退。在評估的23/24血液學參數(表3)的任何參數中沒有顯著抑制。這在嗜中性白血球、紅血球和血小板的情況下特別引人注目，嗜中性白血球、紅血球和血小板的水平在烷化藥物治療的臨床評估中是最常見的劑量限制毒性。單核細胞有3-4倍的增加。唯一的負面影響是在BO治療組中WBC數由於在第10天的溫和淋巴細胞而適度減少。

實施例5

停止BO-1055治療後取得的、帶有前列腺22Rv/HL2移植瘤的小鼠之各種組織的病理學評估

圖3繪示藥物治療開始後42天來自脲基氮芥(BO-1055)、卡鉑、及歐洲紫杉醇治療小鼠的不同器官之病理檢查結果。

本發明人已經研究了BO-1055和兩種正對照化合物(卡鉑、歐洲紫杉醇)在帶有前列腺22Rv/HL2腫瘤異種移植物(垂直植入裸鼠體內)的裸鼠身上的主要毒性。停止BO-1055治療後，經藥物治療的小鼠的平均體重在第35-40天恢復，表示脲基氮芥對宿主具有低毒性。我們還檢查了這些經治療小鼠的病理變化(圖3)。在投藥開始後第42天將經治療小鼠的不同器官移出、固定、及染色，以進行病理檢查。

在對照組與藥物治療組之間心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟沒有明顯的病理變化，表示脲基氮芥和兩種正對照化合物(卡鉑、歐洲紫杉醇)對宿主具有非常小的毒性，而且經治療小鼠在停止藥物治療後迅速恢復體重。

實施例6

垂直植入前列腺細胞株22Rv/HL2的裸鼠在BO-1055治療(每隔一天30mg/kg，持續42天)之後24小時的血液化學和全血細胞計數

在帶有前列腺22Rv/HL2(垂直植入)的小鼠(n=3)最後一次治療後24小時收集血液以進行血液化學測試(表4)和全血細胞計數(表5)。結果顯示，在所有使用卡鉑、歐洲紫杉醇、及BO1055治療的小鼠中AST(天冬胺酸轉胺酶)增加了(表4)。在BO-1055治療的小鼠中血尿素氮(BUN)略有增加，但沒有改變尿酸(UA)在血液中的水平。

全血細胞計數(表5)顯示BO-1055及卡鉑與歐洲紫杉醇皆減少白血球(WBC)、嗜中性白血球(NEU)以及血小板(PLT)計數。然而，在使用三種化合物治療所產生的白血球減少症的程度上沒有明顯的差異。

實施例7

BO-1055藥物動力學曲線的測定

在單次靜脈內和口服投予BO-1055之後的健康雄性斯潑累格多雷(Sprague Dawley)大鼠體內評估脲基氮芥的藥物動力學(PK)(表6)。經由頸靜脈中的留置導管以1.0mg/kg的劑量水平對1組2隻雄性大鼠投予單次靜脈內劑量。將製劑製備成5.0% w/v的DMSO溶液且蒸餾水中有10%w/v的聚氧乙烯蓖麻油。經由口服強飼以10mg/kg的劑量水平對另一組2隻雄性大鼠投予測試化合物BO-1055一次。將製劑製備成在蒸餾水中的0.5% w/v CMC溶液。給藥後從各組中所有動物的頸靜脈導管收集連續的血液樣本長達24小時。使用有效的LC-MS/MS試驗測定血漿中的BO-1055濃度水平，定量的下限(LLOQ)為2.5ng/mL。使用驗證的程式WinNonlin^TM、版本5.2.1將每個劑量水平下高於LLOQ的血漿濃度-時間數據用於計算BO-1055的藥物動力學參數。

將藥物動力學參數總結於表6。

從本研究的毒性動力學部分的關鍵觀察是：(i)在口服投予10mg/kg(LLOQ：2.5ng/mL)之後在BO-1055的任意取樣時間沒有發現可定量水 平；(ii)在口服投予BO-1055之後沒有口服吸收；(iii)BO-1055表現出低血漿清除(平均CL：18.00mL/min/kg)；(iv)在穩態時平均表觀分佈體積為0.15L/kg；(v)在大鼠模型中BO-1055具有t_1/2=0.58h的半衰期(n=2)。

本發明人進一步研究BO-1055的PK。

使用BO-1055作為單靜脈內投藥藉由推注(超過1分鐘)經由股靜脈以10mg/kg溶於0.9%生理食鹽水(NS)的劑量水平治療雄性Sprague-Dawley大鼠(6週，5隻雄性大鼠)。給藥後在0、5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240、300、360分鐘從頸靜脈收集連續的血液樣本。使用驗證過的HPLC-光電二極體陣列檢測試驗在血漿中測定BO-1055的濃度水平(Lin等人，2008年)。使用WinNonlin標準版1.0版(Scientific Consulting Inc.,Apex,NC,USA)進行所有的藥物動力學分析。結果顯示BO-1055的平均表觀消除半衰期(t_1/2)為0.77小時(46.4分鐘)(表7)。曲線下的面積(AUC)、清除率(Cl)及最大濃度(Cmax)分別為267±65.3min μg/mL、每kg39.4±10.6mL/min及13.4±6.17μg/mL。結果顯示BO-1055具有可接受的PK曲線且在投藥後(10mg/kg，靜脈注射)在大鼠體內迅速分佈並緩慢消失。在10mg/kg劑量的短暫靜脈內投藥時間之 後，發現脲基氮芥被迅速分佈到大鼠體內的所有器官，而且主要累積在腎，只在腦中檢測到有限的量(Chien等人，2013年)。

實施例8

脲基氮芥的作用機制

(i)脲基氮芥誘導DNA鏈間交聯(Kapuriya等人2011年)

藉由鹼性瓊脂糖凝膠移位試驗研究脲基氮芥的作用機制並與烷化藥物馬法蘭比較。凝膠顯示脲基氮芥能夠誘導DNA鏈間交聯，表示DNA交聯可以是此試劑的主要作用機制。

圖4顯示在指示的各種濃度下的脲基氮芥(BO-1055)之代表性DNA交聯凝膠移位試驗。對照道顯示單鏈DNA(SL)，而在所有測試道顯示的交聯(CL)是DNA雙鏈交聯。使用馬法蘭(1和10μM)作為正對照。

(ii)脲基氮芥誘導G2M遏制(Kapuriya等人2011年)

在人類非小細胞肺癌H1299細胞上研究脲基氮芥對細胞週期分佈的抑制作用。脲基氮芥治療在這些細胞中誘導明顯的G2M遏制。此外，發明人還在脲基氮芥治療之後發現增加的子G1群體(圖5)。

圖5顯示藉由使用脲基氮芥治療在人類非小細胞肺腺癌H1299的細胞週期抑制。

(iii)BO-1055的吸收、分佈、代謝、及消除(ADME)研究

進行ADME研究並總結於表8。Caco-2腸細胞滲透測試表示，化合物BO-1055不能穿透腸細胞，而藥物動力學研究表示，藥物不能在口服投藥後被施用和吸收。藥物/蛋白結合率高(99%)，表示這可以提供允許緩慢藥物釋放的藥物儲備。微粒體穩定性測試是75%，表示化合物可經由肝代謝去除。少的hERG結合表示測試化合物不可能產生心臟毒性。

實施例9

脲基氮芥的臨床前體內研究(BO-1055)

(i)在ICR小鼠靜脲注射之後脲基氮芥的非-GLP急性14天毒性

本發明人在ICR小鼠研究了脲基氮芥的急性靜脈注射14天毒性，以確定在腫瘤異種移植小鼠體內的最大耐受劑量(MTD)並最佳化藥物治療條件(例如劑量和時間表)。將不同劑量(二次蒸餾水中50、60、70、80、及100mg/kg)的脲基氮芥和載體對照組投予每組六隻ICR小鼠。觀察小鼠14天並記錄死亡率和體重以及測定脲基氮芥的半數致死劑量(LD₅₀)(表9)。以70mg/k投藥後<1小時第一次看到急性死亡率(1/6小鼠)，而且在80mg/kg下所有小鼠皆在<1小時死亡。在這些正常小鼠中BO-1055的LD₅₀是70mg/kg。

bLD50：半數致死量。LD₅₀經計算為70mg/kg，具有95%的58.8~107.2mg/kg可信區間。公式為對數劑量=1.73+0.0233概率K。 c載體：dd水

(ii)hERG抑制的研究和脲基氮芥的早期ADME研究

本發明人使用hERG FP試驗研究脲基氮芥的心臟安全性[Deacon等人，2007年]。人類醚-a-go-go相關基因(hERG)在涉及心臟復極化的心臟(IKr)中編碼內向整流電壓閘控鉀通道。hERG電流的抑制導致QT間期延長，從而產生潛在致命的心室性心律不整。由於這些心毒性作用，許多藥物已被從後期臨床試驗撤回；因此，在藥物探索早期鑑定抑制劑是很重要的。

使用hERG螢光偏振試驗研究hERG抑制來量測脲基氮芥對hERG受體的結合。該試驗是基於測試化合物顯示來自hERK受體(PredictorTM hERG膜)的螢光追蹤劑從而產生光訊號變化的能力。在黑色383孔試驗盤中藉由從測試化合物與螢光追蹤劑的競爭性結合測定劑量-反應結合曲線來進行試驗。脲基氮芥的hERG特異性結合的IC₅₀是12.6±1.64μM(n=3)對比阿斯咪唑(IC₅₀ 0.007μM)，表示弱或無抑制及可能性極低的心臟心律不整副作用。將脲基氮芥的濃度-反應曲線顯示於圖6。

圖6顯示以hERG抑制評估所評估的BO-1055心臟毒性結果。基於BO-1055的結合抑制(IC₅₀ 12.6μM)並與阿黴素(IC₅₀ 0.03±0.03，一種具有眾所周知的心臟毒性劑量限制毒性的藥物)相比，確定不太可能的是BO-1055將呈現心臟心律不整的副作用。

實施例10

藉由脲基氮芥研究Caco-2滲透性及P-糖蛋白(P-gp)在Caco-2細胞單層中介導的外排(表8)

(i)P-糖蛋白(P-gp)在Caco-2細胞單層中介導的外排

P-糖蛋白(P-gp，滲透性的糖蛋白)是多抗藥基因(MDR)亞家族很好調查的外排泵。P-gp是涉及數種藥物外排的能量依賴性轉運蛋白並阻礙該等藥物的細胞內吸收。利用穿透Caco-2細胞單層的滲透性來預測候選藥物的人滲透性，以進行深入的機制和吸收研究，並研究轉運體對滲透率和轉運介導的藥物-藥物相互作用的影響。

Caco-2滲透性試驗被視為是體外預測人體內腸道滲透性和口服藥物的生物利用率的業界黃金標準。Caco-2滲透性試驗使用所建立的方法藉由量測橫跨鄰接的Caco-2細胞單層的傳輸速率來預測治療化合物橫跨GIT的吸收。量測橫跨細胞單層從頂端到底側(A→B)和從底側到頂端(B→A)的傳輸使得外排比率能夠被計算並判斷化合物是否進行主動外排。Caco-2試驗量測測試化合物從供體室通過多孔膜傳代進入受體室，其中融合的Caco-2單層在多孔膜上形成細胞障壁。

Caco-2滲透性試驗的結果顯示，未檢測到BO-1055在A→B方向的帕普係數。在B→A方向的帕普係數為7.05×10^-6cm/sec。BO-1055在A→B和B→A方向上的質量均衡為<50%。>80%的質量均衡給出可接受近似的帕普。明顯部分的BO-1055在傳輸實驗過程中消失，不良的質量均衡產生而且所得的Papp變成不可靠的。

這項研究的結果是，脲基氮芥被認為是滲透性非常低的藥物，表示此劑具有不良的口服吸收。此外，脲基氮芥在Caco-2細胞單層的P-gp介導外排 的研究顯示，P-gp的外排比(B→A/A→B)為>>2，表示此試劑不能抑制P-gp。研究表示，脲基氮芥不適合用於口服投藥。

(ii)微粒體的穩定性

藥物代謝或外源性生物轉化在藥物發現中扮演重要的角色，因為會影響清除率、半衰期及口服生物利用率。肝臟是參與外源物代謝的主要器官。肝微粒體是主要包含內質網的亞細胞部分，內質網含有細胞色素P450酶、黃素單加氧酶、羧酸酯酶及環氧化物水解酶，因此提供第一階段代謝的有用模型。第一階段反應包含氧化、還原及/或水解並需要NADPH作為輔因子。因此，使用肝微粒體培育潛在的候選藥物可以對這些酶提供固有代謝易損性的量測。

使用7-乙氧基香豆素(7-EC)作為正對照研究BO-1055在大鼠肝微粒體(RLMs)的代謝穩定性。將結果顯示於表10。表10顯示BO-1055和7-EC在RLM中的表觀半衰期分別是29.7和23.5min。在匯集的RLM中BO-1055比7-EC更穩定。

實施例11

BO-1055(脲基氮芥)的血漿穩定性與蛋白結合

在藥物探索中，藥物-血漿蛋白結合的資訊在評估和理解吸收、分佈、代謝及排泄(ADME)相關的性質與候選藥物的藥物動力學曲線中是有價值的。藉由將BO-1055(20μM)攙入大鼠血漿來研究BO-1055對大鼠血漿蛋白的結合並對緩衝液透析直到達到平衡。測定BO-1055在血漿和緩衝液中的濃度來計算未結合或結合至血漿蛋白的藥物之百分比。

將結果顯示於圖7和表11。在20μM的標稱攙入濃度下2、4、6及24小時培育時間的平均結合值分別為99.68、99.69、92.01、及75.17%(圖7和表11)。圖7顯示使用多平衡透析法BO-1055結合到大鼠血漿蛋白達到平衡的時間進程。

實施例12

BO-1055(脲基氮芥)具有廣範圍的抗腫瘤活性

檢查脲基氮芥對各種人實體瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤細胞株的細胞毒性。如表12所示，在30%脲基氮芥對測試細胞株的IC₅₀值在次μM範圍中。而在一組29個良性細胞類型中沒有一個具有<5.00μM的IC₅₀值，而27%具有>20>100μM的IC₅₀值。

表12.用於細胞毒性評估的人癌細胞株、原發性患者的腫瘤樣本及多種類型的正常組織的組。每種癌類型/子類型的細胞株總數和一些單獨的欄顯示每組對BO-1055細胞毒性敏感(IC₅₀ <1.00μM)或具有中間敏感性(IC₅₀

實施例13

在異種移植模型中BO-1055在體外和體內對人類癌症細胞株和原發性人類腫瘤樣本的細胞毒性(IC ₅₀ μM)

在體外對多組人類癌細胞株評估BO-1055的細胞毒性。使用其它治療烷化劑和傳統化療劑進行比較。進行體內研究時，在裸鼠或NSG小鼠中使用異種移植模型在有和無BO-1055治療之下以腫瘤生長動力學呈現數據。

基於腫瘤類型和亞型以字母順序呈現數據。

實施例13A

白血病

據估計，在2012年世界各地有352,000個所有類型的白血病的案例和265,000個死亡，且發病率和死亡率在世界各地不同。

(i)白血病亞型

白血病可細分為急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或淋巴母細胞白血病(ALL、T細胞或B細胞亞型)、雙表型白血病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL、T細胞或B細胞亞型)及慢性骨髓性白血病(CML)。後者具有慢性期和急性期芽球危象。慢性骨髓單核球白血病(CMML)是另一種呈現骨髓造血不良症候群的變體形式，該變體形式之特徵在於異常無性骨髓增殖和進展為急性骨髓性白血病(AML)。一個CMML子組的特徵在於t(5；12)(q33；p13)平衡的染色體易位，該染色體易位將PDGFRβ融合到ets樣基因tel(Golub等人，1994年)。基於形態學的FAB分類認可8種白血病亞群，但最近的子分類是基於分子的功能。

大多數形式的急性骨髓性白血病(AML)的有效治療策略的發展在過去幾十年已被擱置。其中有許多的原因，包括此病相當大的異質性和缺乏可用於預測臨床結果和對不同療法的回應性的分子標記。

本發明人評估了脲基氮芥對一種子株人類T細胞白血病株CCRF-CEM、抗藥性為紫杉醇的330倍的CCRF-CEM/紫杉醇、及抗藥性為長春鹼的680倍的子株CCRF-CEM/VBL之細胞毒性。如表13所示，與母CCRF-CEM細胞株的相應IC₅₀相比，BO-1055對CCRF-CEM/紫杉醇和CCRF-CEM/VBL僅分別具有9.4或6.2倍減少的細胞毒性，表示此劑對紫杉醇或長春鹼沒有明顯的交叉抗藥性。這個數據也支持其它顯示BO-1055既不是膜多重抗藥性轉運體(即p-糖蛋白)的良好基質也不與突變的微管蛋白相互作用的證據。

(ii)MLL-AF9-無限增殖人類造血細胞株的發展

MLL基因的染色體重排與高風險的嬰兒、兒童、成人、及治療引起的急性白血病有關。到目前為止，約80種不同的直接MLL融合和大約120種往復MLL融合已經被特徵化在分子水平。MLL-AF9融合基因源自易位t(9；11)(p22；q23)，並與嬰兒的骨髓和淋巴譜系兩者的侵略性白血病相關，而在成人中，這種易位主要與急性骨髓性白血病相關。取決於外在線索，人類新生兒CD34⁺細胞在MLL-AF9表現時輕易地沿著骨髓或淋巴譜系無限增殖並在免疫受 損的小鼠體內引起主要淋巴白血病。與此相反，成人骨髓CD34⁺細胞的無限增殖更難以實現，而且是偏骨髓的，即使是在純化造血幹細胞(HSC)表現MLL-AF9時(Horton等人，2013年)。轉錄組分析確定富含HSC，但在MLL-AF9表現細胞中並非祖基因特徵。

雖然在成人細胞沒有觀察到，但表現MLL-AF9的新生細胞富含與不良預後、化療劑抗藥性及MYC傳訊相關的基因特徵。這些結果表示，新生兒細胞本質上比成人細胞更易於MLL-AF9介導的無限增殖(Horton等人，2013年)。Mulloy和同事(Wei等人，2008年)已經證明MLL-AF9在人類CD34+細胞的表現在免疫缺陷小鼠體內誘導急性骨髓、淋巴、或混合系白血病。某些白血病幹細胞(LSC)具有多種能力，而且可以是藉由改變鼠的生長因子或受體菌株、彰顯微環境訊號的重要性來導向的譜系。其他LSC進行嚴格的譜系提交，表示幹細胞室在MLL疾病中的異質性。

藉由藥物或遺傳手段定位Rac傳訊路徑導致MLL-AF9細胞的快速和特異性凋亡，表示Rac傳訊路徑可以是MLL重置AML的有效治療標靶。如永生細胞預期的，我們測試的所有細胞株都是端粒酶陽性。

MLL-AF9蛋白是自身活化hTERT表現/活性亦或是促進通常表現hTERT的細胞的生長仍有待確定。與其他涉及MLL的基因變化相比，據信MLLt(9；11)在預知上有利於AML-M5。MLL是一種被視為基因轉錄的積極全面調節劑的組織蛋白甲基轉移酶。這種蛋白質屬於包含轉活化域9aaTAD並涉及轉錄表現記憶後生維護的組織蛋白修飾酶組。

(iii)用於評估BO-1055細胞毒性的MLL-AF9細胞株

a)生長因子依賴性&細胞密度生長依賴性細胞株。使用MLL-AF9基因轉導的人類臍帶血CD34+細胞：MA-10、MA-18。使用MLL-AF9基因轉導的人類骨髓CD34+細胞：MA-23。使用MLL-AF9和N-ras基因轉導的人類臍帶血CD34+細胞：MA-9.3、MA-9.6。

b)生長因子獨立性白血病細胞株。使用Flt3 ITD(W51)轉導的人類MA-10細胞適應在沒有生長因子之下在體外增殖(摩爾實驗室)。人AML細胞株THP-1(MLL-AF9)；MOLM-13(MLL-AF9 & Flt3 ITD)；Kasumi(AML1-ETO)；MV4；11(MLL-AF4 & Flt3 ITD)；Set2(Jak2 V617)；HEL(Jak2 V617)。

(iv)BO-1055對急性骨髓性白血病細胞株有高細胞毒性，但對於具有突變JAK2T的白血病細胞株則無

如表14和圖8所示，BO-1055對3/7的AML細胞株有高度細胞毒性(IC₅₀ 0.18-0.45μM)，對一個有中度細胞毒性(IC₅₀ 1.50μM)，兩個JAK2 V617突變株有高抗藥性(IC₅₀ 10μM)，而一個AML-ETO AML株有高抗藥性(IC₅₀ 80.0μM)。藉由將MLL-AF9轉導進入正常CB CD34+細胞(MA10、MA18)或成人BM CD34+細胞(MA23)所開發的細胞株對BO-1055皆一致高度敏感(IC₅₀ 0.25-0.40μM(圖8)。使用兩種致癌基因轉導的正常CB CD34+細胞也對BO-1055高度敏感，無論是MLL-AF9+Flt3ITD轉導的(IC₅₀ 0.40μM)或是MLL-AF9+N-RASmut(IC₅₀ 0.81-2.91μM)。相較於對正常的CB CD34⁺的細胞毒性(IC₅₀ 9.9-10.2μM)可以得出的結論是，引入MLL-AF9致癌融合基因到正常CB或BM CD34+細胞中增加了25-40倍的BO-1055細胞毒性。加入第二種致癌 基因(Flt3ITD或N-Ras)並沒有將對BO-1055的敏感度進一步增強超過僅使用MLL-AF9所觀察到的。

(v)BO-1055對一些分子亞型的急性骨髓性白血病幹細胞有高度細胞毒性但對其他分子亞型則無

使用不同分子亞型的六種主要小兒AML樣本測定BO-1055對白血病幹細胞(LSC)的細胞毒性。使用MS5共同培養試驗量測第2週鵝卵石區形成細胞來進行LSC試驗(Schuringa等人，2004年，Chung等人，2005年，Moore等人，2007年)。如表14所示，來自三個患者樣本的白血病幹細胞對BO-1055非常敏感(IC₅₀ 0.12-0.90μM)。這些實例是預後不良的分子亞型(單染色體7、MLL-AF9及Flt3ITD)，表示BO-1055可以有效治療這個預後非常差的AML組。患有del17和預後良好的NPM1突變與反轉16的患者對BO-1055(IC₅₀ 6.25-7.0μM)比正常造血幹細胞更敏感，但治療窗狹窄。

(vi)比較正常CB CD34+細胞與AML和A.Mon.L細胞株及致癌基因轉導的CD34+細胞的BO-1055細胞毒性之劑量-反應分析

如圖8和表14所示，正常造血祖細胞(CB CD34+ FBS或SF)對BO-1055有抗藥性(IC₅₀ 9.9-10.2μM)。與此相反，A.Mon.L細胞株THP1和MOLM13是高度敏感的(IC₅₀ 0.18-0.45μM)。CB衍生的MLL-AF9轉導株MA-10和MA-18及BM-衍生的MLL-AF9轉導株MA-23對BO-1055細胞毒性是高度敏感的(IC₅₀ 0.25-0.40μM)。MA10 W51細胞株(CB MLL-AF9+Flt3ITD)被保持為生長因子獨立和生長因子(hGM-CSF或hIL-3)依賴的子株。前者(IC₅₀~10μM)比後者(IC₅₀ 0.28-0.40μM)更抗BO-1055細胞毒性。MA-9.3和MA-9.6 CB MLL-AF9+NRAS株對BO1055的敏感度不同，前者是高度敏感(IC₅₀ 0.81μM)，後者敏感度較低(IC₅₀ 2.91μM)。

圖9顯示BO-1055對生長因子依賴性MA-10-W51細胞(使用MLL-AF9融合基因和突變Flt3ITD轉導的正常CD34+)的增殖影響。BO-1055和BO-1978對生長因子依賴性MA-10-W51細胞的劑量滴定比較顯示，這兩種化合物都具有高度毒性，且BO-1978比BO-1055更高。

(vii)BO-1055、四種烷化藥物、微管結合藥、拓撲異構酶抑制劑、HSP90抑制劑及蒽環類抗腫瘤抗生素的「治療窗」，藉由比較對5種正常人組織和三種惡性白血病(AML細胞株、原發性AML及原發性B-ALL)的IC ₅₀ 所測

使用BO-1055在MV4獲得治療窗；11種AML細胞株和原發性兒科AML-2和B-ALL細胞強調BO-1055s在正常的支氣管上皮細胞(Bci-NSI)、輸卵管上皮細胞(FTEC)、內皮細胞(HUVEC)、骨髓間質基質(huMSC)、以及正常臍帶血造血祖細胞(CD34+細胞，CFC)上缺乏毒性。這與BO-1055對白血病的高細胞毒性形成對比(表15)。值得注意的是，使用烷化藥物4-HC(環磷醯胺的活性代謝物)、苯達莫司汀、順鉑、拓撲異構酶抑制劑依托泊苷和SN38、HSP90抑制劑PU-H71、蒽環類抗腫瘤抗生素(阿黴素)及微管結合生物鹼(長春新鹼)缺乏治療窗，這主要是由於上述藥物對正常CFC的毒性。

(viii)有和沒有外源性hGM-CSF投予的THP-1單核細胞白血病異種移植物中的腫瘤起始細胞頻率測定

為了測定需要的白血病細胞數量以確保植入，將NSG小鼠靜脈注射，且將從1x10³-3×10⁶ GFP-螢光素酶轉導的THP-1 AML細胞注入8隻NSG小鼠。

四隻植入小鼠不進一步治療(圖10A)，而四隻在腫瘤注射時皮下植入滲透性微型泵(Alzet)，該滲透性微型泵每天釋放1μg的人類GM-CSF超過40天(圖10B)。兩組的小鼠都在7週時進行生物攝像。

如圖10A和圖10B所示，在沒有外源性人類GM-CSF存在下，只在最高劑量(3×10⁶)的THP-1細胞檢測到植入物。在使用hGM-CSF處理的小鼠身上有明顯增加的植入物，且在此細胞株中檢測腫瘤起始細胞1×10⁶和1×10⁵都有30倍的增加。

(ix)具有人類MLL-AF9-易位AML細胞株MV4；11移植的NSG小鼠之BO-1055治療

MSG小鼠移植有10⁵個MV4；11-GFP/螢光素酶轉染細胞，轉染細胞被靜脈注射到10隻雄性12週齡NSG小鼠中的每隻。在5隻NSG小鼠中測定BO-1055的細胞毒性(30mg/kg，每隔一天，在第14天開始，×5)，且5隻對照小鼠僅獲得培養液。

圖11顯示此實驗的結果。左側三組顯示只注射MV4-11-GFP-螢光素酶細胞的小鼠；而右側三組顯示注射MV4-11-GFP螢光素酶細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

如圖11所示，4/5的對照小鼠(左側組)在第28天顯現迅速生長的腫瘤，只有1隻小鼠有少的植入物。此時在BO-1055治療組(右側組)中，與一週前2隻小鼠沒有檢測到腫瘤且3隻小鼠殘留非常小的腫瘤相比，有非常明顯的腫瘤植入物減少。在第28天在5隻BO-1055治療小鼠的任1隻中沒有明顯可檢測到的腫瘤。此時在對照組中，2隻小鼠由於大量腫瘤已被安樂死，而剩餘的小鼠顯現大量的腫瘤，在第28天攝像後不久將需要安樂死。

(x)移植有表現GFP/螢光素酶的人類MA10細胞的NSG小鼠之BO-1055治療

MA10是藉由MLL-AF9融合致癌基因的反轉錄病毒轉導和活化Flt3突變(FltITD)進入正常人類CD34+造血幹細胞和祖細胞所開發的hGM-CSF依賴性AML細胞株。在體外或在NSG小鼠體內沒有GM-CSF之下，MA10細胞沒有增殖。GM-CSF是限制物種的，人類細胞因子在小鼠體內沒有活性而且小鼠GM-CSF對人體細胞沒有活性。

發明人證明，每天將1μg的人類GM-CSF腹腔注入移植有MA10細胞的NSG小鼠將支持MA10細胞的植入和擴張(未示出數據)。本發明還證明的是，皮下植入釋放1μg/天的人類GM-CSF持續42天的滲透性微型泵(Alzet)將維持MA10細胞的不斷擴張。

圖12展示在無細胞因子支持(左)或藉由微型泵植入物投予人類GM-CSF(右)的NSG小鼠體內靜脈注射移植表現GFP/螢光素酶的一百萬個MA10細胞的結果。生物攝像在第28天進行。

圖12顯示在靜脈注射一百萬個細胞後在第18天比較有或沒有微型泵的MA10植入。在第18-25天有明顯的白血病植入，由只在GM-CSF存在下的螢光素酶生物攝像證明(右側兩隻老鼠)，沒有hGM-CSF之下沒有植入(左側兩隻老鼠)。這個人類白血病異種移植物對BO-1055單一療法的戲劇性反應特別明顯，因為相對於裸鼠異種移植物，沒有可以在藉由化療劑進行藥物減積之後促進腫瘤根除的功能性NK細胞或殘餘T或B細胞功能。

(xi)在移植有MA-10-W51臍帶血CD34+細胞、用MLL-AF9轉導和組成型活性Flt3內部串接複製(W51)及使用單劑量BO-1055治療的NSG小鼠的BO-1055異種移植研究

將NSG小鼠(六組)皮下植入產生hGM-CSF的微型泵並靜脈注射表現預後不良白血病的10⁶個MA-10-W51細胞，該預後不良白血病是藉由使用MLL-AF9和Flt3ITD致癌基因轉導臍帶血CD34+細胞發展的。在白血病細胞注射後10天，將30mg/kg的單劑量BO-1055投予一半的小鼠，其餘僅注射培養液。

如圖13所示，此白血病生長緩慢，但在第50天所有的對照小鼠被明顯植入(左側)，而在BO-1055治療的小鼠(右側)是不可檢測或最多植入邊緣。這種腫瘤抑制效果特別明顯，因為只使用單一劑量的30mg/kg BO-1055獲得。

(xii)BO-1055針對原發性(MLL-AF9+)小兒AML的體外和體內細胞毒性

在診斷時獲得來自患有MLL-AF9+ AML的兒科患者的骨髓樣本，並使用表現GFP/螢光素酶融合基因的慢病毒載體轉導。藉由FACS分離GFP+CD34+細胞，並將10⁵個細胞靜脈注入6隻12週齡NSG小鼠中的每一隻。每隔一段時間拍攝小鼠並在初始植入後第35天一半小鼠開始BO-1055的治療(每隔一天30mg/kg×5)，並且一半獲得對照培養液。

如圖14所示，在治療的小鼠中沒有可檢測的白血病，而所有的對照小鼠已逐漸生長白血病。治療組中1隻小鼠在治療開始後24小時死亡，但與治療無關。BO-1055治療的小鼠表現出腫瘤消退，在第47天沒有可檢測到的腫瘤(最後藥物治療後4天)。

(xiii)移植有第二代MLL-AF9+AML-2的NSG小鼠之卡普蘭-邁耶存活分析

如圖15所示，靜脈注射來自患有MLL-AF9+白血病的兒科患者的原發性AML樣本的6×10⁶個細胞的NSG小鼠在160天內全部死亡，而在白血病細 胞注射後第7天開始使用BO-1055(30mg/kg Q10D2×)治療的組多活48天。鑑於相對大量的注射白血病細胞和白血病的不良預後表型，這個反應尤其明顯。

(xiv)BO-1055對原發性小兒B-ALL的體外和體內細胞毒性

在存在或不存在於0.001-20.0μm的劑量範圍間滴定量測的BO-1055之下體外培養來自患有B-ALL的小兒患者的骨髓樣本。

將劑量反應曲線與使用正常臍帶血CD34+細胞得到的進行比較，正常臍帶血CD34+細胞被保持在含FBS的培養液中或無血清培養液中(圖16)。BO-1055對B-ALL細胞有高度細胞毒性(IC₅₀ 0.30μM)，而在含FCS培養液或在無血清培養液(具有補充劑的「血清替代」培養液)中的正常臍帶血CD34+細胞相對抗BO-1055毒性(IC₅₀ 8.5-10.5μM)。然後用表現GFP/螢光素酶融合基因的慢病毒載體轉導B-ALL細胞，並且藉由FACS選擇GFP+CD34+細胞(圖17)。

(xv)原發性B-ALL的FACS分析

圖17展現實驗結果，從而藉由Ficoll密度梯度分離原發性B-ALL細胞，並藉由CD34親和柱進一步選擇輕密度細胞，然後分析FACS用於CD34和CD19的表現。

藉由在FACS分析中結合CD34與B細胞標記CD19，原發性樣本中19.3%的細胞是CD34。絕大多數的這些CD34細胞是CD34+CD19+雙陽性的。親和柱分離之後，100%是CD34+而98.4%是雙陽性CD34+CD19+(圖17)。

(xvi)在NSG小鼠移植後原發性小兒B-ALL細胞的器官分佈

將NSG小鼠移植2百萬個CD34+ B-ALL細胞或2百萬個未分離細胞。植入之後，藉由FACS分析使用單株抗體對人CD34和人CD19測定器官分佈(表16)。巨大的脾臟腫大是明顯的，有310-400百萬個細胞的脾細胞密度，細 胞密度比正常NSG小鼠增加30-40倍。這個增加的63-74%是由於人CD19+細胞擴增，而且這些中50-54%是CD34+ B-ALL細胞。植入的細胞也廣泛滲入骨髓中，且每個股骨有37-56百萬個細胞，而且這些中92-96%是人CD19+，而68-81%是人CD34+CD19+。B-ALL細胞也存在於末梢血液中(1%的人CD34+CD19+和2%的CD34-CD19+細胞)。

(xvii)BO-1055對靜脈注射移植有原發性Pre-B-ALL-GFP-Lu細胞的NSG小鼠的作用

圖19中使用的6隻移植有原發性Pre-B-ALL細胞的小鼠表現出快速腫瘤生長及在開始BO-1055治療7天內的腫瘤生長抑制(在第7天開始Q10D×2)(圖18)。

圖18顯示四組生物攝像照片，每組都有3隻小鼠。左側的3組顯示只有注射Pre-B-ALL CD34-GFP-螢光素酶細胞和對照培養液的小鼠；而右側的3組顯示注射Pre-B-ALL CD34-GFP-螢光素酶細胞並被進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

在71天之前，對照小鼠具有廣泛的腫瘤浸潤，主要在脊柱和顱骨的骨髓內，而2隻倖存的BO-1055治療小鼠中的一隻沒有可檢測到的腫瘤，而另一隻主要在股骨和肱骨的頭部具有小白血病病灶。第三隻小鼠因為與腫瘤發展或治療無關的原因而死亡。此數據顯示在BO-1055治療小鼠中腫瘤生長有明顯的對數2的減少。

將在有或沒有BO-1055治療的異種移植研究中為原發性B-ALL荷瘤小鼠計算出的卡普蘭-邁耶存活曲線顯示於圖19。這個BO-1055的時間表對荷瘤小鼠的總存活率有非常明顯的影響，且藥物治療組的存活比對照治療組長~100天。

實施例13B

肺癌

在2014年全世界有160萬個肺癌病例。在美國有224,210個新病例且159,260人死亡，而且5年存活率為16.8%。假使在早期(IA)診斷，則5年存活率為49%，但假使在第四階段診斷，則5年存活率為1%。

(i)肺癌亞型

肺癌是大的和極其異類的惡性腫瘤家族。在2004年修訂的世界衛生組織(WHO)輸入系統中明確認定超過50種不同的組織變體(Brambilla等人，2001年)。肺癌依組織學類型被大致分類成非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)。

(ii)非小細胞肺癌(NSCLC)

非小細胞肺癌可被細分為腺癌、大細胞癌和鱗狀細胞癌。腺癌是最常見的(所有肺癌的40%)，接著是鱗狀(30%)、小細胞(13-15%)、及大細胞(9-10%)(Travis等人，2004年)。罕見的亞型是巨細胞癌、肉瘤樣癌、橫紋肌癌及乳頭狀腺癌。支氣管肺泡癌是更頻繁發生在女性非吸煙者和有較好預後的腺癌的一個亞型。許多細胞株已經從這些亞型衍生出，而且有一些細胞株可以具有超過一種亞型的特徵，例如腺鱗狀線。K-Ras致癌基因突變是10-30%肺腺癌的原因，而約4%的非小細胞肺癌涉及EML4-ALK酪胺酸激酶融合基因(Sasaiki等人，2010年)。突變和表皮生長因子受體(EGFR)的擴增在NSCLC是常見的，並為使用EGFR抑制劑治療提供依據。Her2/neu較少受到影響(Dempke等人，2010年)。其它時常突變或擴增的基因是c-MET、NKX2-1、LKB1、PIK3CA及BRAF(Dempke等人，2010年，Dela Cruz等人，2011年)。

(iii)在一組43個NSCLC細胞株上BO-1055與四種烷化藥物相比的細胞毒性

收集大量的NSCL細胞株組來含括形態亞型，包括腺癌(30株)、腺鱗狀癌(4株)和鱗狀癌(9株)。

表17顯示在一組代表非小細胞肺癌腺癌、鱗狀細胞癌及顯示混合的腺和鱗狀形態的細胞株的45個人類細胞株上BO-1055與四種其他的烷化化療 劑-烷化鉑藥物卡鉑和順鉑、及烷化藥物馬法蘭和BCNU(苯達莫司汀)相比的IC₅₀值。這些中，38株被用於評估BO-1055的細胞毒性，而18株被發現有抗藥性(IC₅₀ 10μM)，6株呈弱抗藥性(IC₅₀ 5.0-9.9μM)，13株是弱敏感的(IC₅₀ 1.0-4.9μM)，只有1株是高度敏感(IC₅₀<1.0μM)。在腺癌組中，9/26的株是在中度至高度BO-1055化學敏感組中，包括在EGFR、KRAS(×2)HER2/4、EML4-ALK(×2)、TP53、BRAF有突變並刪除SMARCA4的株。在鱗狀和腺鱗狀組中，5/12的株是中度敏感的，而7/12是中度到高度抗BO-1055的。在中度敏感組中上調或突變的致癌基因包括PIK3C、KRAS、FGFR、CDKN2A、及TP53。

從這些觀察可以得出的結論是，BO-1055的細胞毒性未藉由癌症的突變狀態明顯確定，因為具有相同突變的細胞株可以是敏感或有抗藥性的。肺癌細胞株中對BO-1055的差異敏感度的分子基礎仍有待確定。

(iv)大細胞肺癌(LCLC)

非小細胞肺癌中，這種類型通常是在稍後的階段發現。大細胞肺癌傾向於快速生長，並蔓延到附近的淋巴結進入胸壁。大細胞肺癌還可蔓延到 更遠的器官，即使當肺中的腫瘤是相對較小時。在美國每年大約有20,000個新病例。

LCLC的一種臨床重要亞型是「大細胞神經內分泌癌」(LCNEC)，大細胞神經內分泌癌被認為是由神經內分泌細胞衍生的。此外，被稱為「聯合大細胞神經內分泌癌」(或C-LCNEC)的「子變體」被認定在新的WHO分類下。要被稱為c-LCNEC時腫瘤必須含有至少10%的LCNEC細胞，並與至少10%其他形式的非小細胞肺癌結合。

(v)BO-1055對4個大細胞肺癌株的細胞毒性

發明人已經評估了BO-1055對四種大細胞肺癌細胞株(H1299、H299、H460、及SHP77)的細胞毒性。如表18所示，測試的細胞株對BO-1055有中度到高度的化學敏感度。

(vi)小細胞肺癌(SCLC)

這種肺癌是衍生自小支氣管的神經上皮或神經內分泌細胞，並可以表現CD44。該細胞含有密集的神經分泌顆粒，從而給予這種腫瘤內分泌/腫瘤相關症候群。大多數病況出現在較大氣道中、成長快速、而且在病程早期蔓延，在表現時有60-70%的轉移。

(vii)聯合小細胞肺癌(c-SCLC)

依據目前世界衛生組織的肺腫瘤分類方案c-SCLC被認為是SCLC的變體。c-SCLC是一種多相肺癌，含有與非小細胞肺癌中的一個(或更多個)組分混合的SCLC組分。雖然c-SCLC的真正發病率是未知的，但病例系列表明c-SCLC可能佔SCLC所有病例的多達25%至30%，並佔所有肺癌病例的4%至6%。在「純」SCLC中EGFR突變是非常罕見的(<5%)，但EGFR突變在c-SCLC中是相當多見的(約15%-20%)。這些陽性腫瘤更可能回應EGFR-TKI的治療。在高(50%-67%)比例的病例中，c-SCLC出現來表現女性激素(即雌激素及/或孕激素)受體，類似於乳癌。

然而，目前未知這些受體的阻斷是否影響c-SCLC的生長。

(viii)BO-1055在變體形式的小細胞肺癌細胞株上的細胞毒性

由NCI細胞株H82、H211及H526提供變體形式的SCLC的三個實例。如表19所示，兩個細胞株對BO-1055是高度敏感的(IC₅₀ 0.34-0.39μM)，而一個是中度敏感的(IC₅₀ 2.00μM)。

(ix)BO-1055在一組SCLC株上的細胞毒性與其它烷化藥物和化療劑的毒性相比

使用阿爾瑪藍試驗評估11種SCLC株(包括典型和變體形式的SCLC)的BO-1055 72小時細胞毒性(表20)。包括3種典型和3種變體的6種株是非常敏感的(IC₅₀ 0.05-0.39μM)，具有25-200的治療指數(TI)範圍。一種是中度敏感的(IC₅₀ 2.00μM)，TI是5，包括2種典型和2種變體的4種株具有抗藥性(IC₅₀ 20-40μM)，且TI為0.4-1.6。三種烷化劑(順鉑、馬法蘭和BCNU(卡莫司汀))也對一些株表現出高細胞毒性，而其他具有抗藥性。

使用順鉑治療，3/19的株是高度敏感的(IC₅₀<1.0μM)，14/19是中度敏感的(IC₅₀ 1.0-4.9μM)，而2/19是高抗藥性的(IC₅₀>10.0μM)。

類似地，使用馬法蘭，4/16的株是高度敏感的，5/16是中度敏感的，2/16有中度抗藥性，而5/16有高度抗藥性。測試的所有株都對BCNU/卡莫司汀有高度抗藥性。蒽環類抗腫瘤抗生素阿黴素對測試過的17個株有高度毒性。阿黴素不是任何用於SCLC聯合化療的主要方案的組成部分，可能反映潛在的嚴重副作用，尤其是心毒性。長春新鹼對16/17的株有高細胞毒性，一個是中度敏感的。VP-16/依托泊苷表現出混合模式的毒性，且6/16的株是高度敏感的，5/16是中度敏感的，2/16有中度抗藥性，3個有高度抗藥性。在烷化劑與BO-1055之間沒有交叉抗藥性的證據。例如，H82株對BO-1055非常敏感，但對順鉑、馬法蘭和BCNU以及依托泊苷有高度抗藥性，而且是所有測試的株中對阿黴素最有抗藥性的。

表20.BO-1055與在一組21個包括典型和變體實例的小細胞肺癌細胞株上篩選的三種烷化藥物(順鉑、馬法蘭、BCNU/卡莫司汀)、蒽環抗腫瘤抗生素(阿黴素/阿德力黴素)、長春花生物鹼微管蛋白黏結劑、及細胞週期

(x)BO-1055與其它烷化藥物和化療劑相比在SCLC細胞株H526上的治療窗測定

從BO-1055對惡性細胞株的體外細胞毒性測定(IC₅₀值)與在一組正常人體組織上的細胞毒性相比來計算「治療窗」(TW)，在本實施例(表20)中該惡性細胞株是SCLC變體株H526。良性組織包括：(a)人臍帶作為新生兒源的內皮細胞(HUVEC)；(b)成人骨髓間質細胞(huMSC)；(c)藉由hTERT的反轉錄病毒轉導無限增殖的正常人肺支氣管上皮細胞(Bci-NSI)；(d)藉由hTERT的反轉錄病毒轉導無限增殖的正常人輸卵管基部上皮細胞(FTEC)及(e) 人臍帶血衍生的CD34+造血細胞，包含紅血球的、顆粒細胞/單核細胞、巨核細胞及B淋巴細胞譜系的造血幹細胞(HSC 5%)和造血祖細胞(CFC 95%)的群體。

BO 1055在其對抗H526的毒性和缺乏對抗篩選的正常組織組的毒性之間有100-533倍的優異治療窗。這在與其它藥物相比證明的明顯較小治療窗上有明顯的對比，其它藥物包括烷化藥物4-羥基環磷醯胺(4-HC)、苯達莫司汀、馬法蘭及順鉑、而且還有拓撲異構酶抑制劑依托泊苷、SN38、HSP90抑制劑PUH71及微管結合生物鹼長春新鹼。

(xi)使用BO-1055治療異種移植小細胞肺癌細胞株H526的NSG小鼠之體內研究

藉由皮下注射50,000個腫瘤細胞在10隻12週齡的NSG雄性小鼠的組中建立GFP/螢光素酶標記的H526的異種移植物。在第12天進行螢光素酶生物攝像，然後將5隻小鼠靜脈注射30mg/kg的BO-1055，並且5隻小鼠注射培養液作 為對照。從第12天至第30天每隔一天重複BO-1055或對照培養液的注射，並在第12天在基線及在藥物治療過程中在第21天、第26天和第30天進行生物攝像。

圖20顯示八組、每組五隻小鼠的生物攝像照片。左側的四組顯示只被注射GFP-Lu-SCLC H526細胞和對照培養液的小鼠；而右側的四組顯示被注射SCLC H526細胞並進一步使用脲基氮芥治療的小鼠。

如圖20中可以看出的，從第12天到第30天在4/5的對照小鼠中看到發展中的腫瘤生長(1隻小鼠在基線具有移植的腫瘤，但並沒有表現出發展中的腫瘤生長。在BO-1055治療的小鼠中在第26天未檢測到腫瘤，而且在第30天3/5被治療的小鼠仍然無腫瘤。

在圖21中將數據表示為總光子發射，圖21顯示在第20天和第30天之間在治療與對照小鼠之間有對數2的總光子發射差。

(xii)帶有SCLC H526異種移植物且使用BO-1055治療的裸鼠之體內研究

本發明人還評估了BO-1055在帶有SCLC H526異種移植物的裸鼠體內的治療功效。使用經由靜脈注射以40mg/kg BO-1055治療四隻小鼠，每2天1次，共4次。使用伊立替康(30mg/kg，每天1次共6次，靜脈注射，n=4)和依托泊苷(30mg/kg，每2天1次共6次，靜脈注射，n=4)作為正對照組。如在圖22A和圖22B所示，BO-1055比伊立替康或依托泊苷更有效。

當腫瘤體積大於2000mm³時將荷瘤小鼠犧牲。在第47天將對照和正對照小鼠犧牲；BO-1055治療的小鼠(n=4)：在第28天3/4完全緩解(CR)，在第32天2/4 CR；在第77天1/4 CR。

實施例13C

淋巴瘤

淋巴瘤是淋巴系統的腫瘤，而且佔所有癌症的3-4%，在成人中是第7最常見形式的癌症，而在兒童中是第3最常見的。在2012年全球有566,000個病例和305,000人死亡。

有幾十種淋巴瘤亞型，一些被認為是可治癒的，而其他的預後則非常差。治療選擇包括一些化療、放療、標靶療法及手術的組合。

在下面討論其中一些亞型。

(i)霍奇金淋巴瘤(HL)

這種形式的淋巴瘤是藉由里德-斯特恩伯格細胞的存在所標示。有兩種主要的霍奇金淋巴瘤類型，最常見的是大多在青壯年中發現的結節硬化形式。第二個最常見的形式是混合細胞型亞型，男性最常見，更可能被診斷出時已是晚期。這些病例中70%涉及Epstein-Barr病毒。

(ii)非霍奇金淋巴瘤(NHL)

在2014年在美國有70,800個新的非霍奇金淋巴瘤病例，其中10%是T細胞淋巴瘤，而90%是B細胞淋巴瘤。有一些B細胞非霍奇金淋巴瘤的亞型具有不同的預後和治療反應。

(iii)濾泡性淋巴瘤

濾泡性淋巴瘤在美國和歐洲是第二最常見形式的淋巴瘤，且在2014年有14,160個新病例。濾泡性淋巴瘤發生在老年人，通常涉及淋巴結、骨髓及脾，與過度表現Bcl-2的t(14；18)易位相關。最常見是無痛，而且生長非常緩慢。沒有已知的治癒；然而，超過85%的患者在確診後活至少五年，而且50%的患者活超過12年。諸如通常與利妥昔單抗組合的苯達莫司汀(Treanda)和來那度 胺(Revlimid)藥物已被證明對這種亞型是有效的，而且可以用來作為一線治療的一部分。隨著時間的推移，濾泡性淋巴瘤可能變成DLBCL，然後需要更積極的治療。

(iv)原發性縱隔B細胞淋巴瘤

這種淋巴瘤主要影響十幾歲到30歲出頭的人。許多患者使用化療和放射治療的組合治癒。然而，即使有這種治療，約20%的患者仍具有發展中的疾病。

(v)未另作指定的周邊T細胞淋巴瘤

這是最常見的T細胞淋巴瘤，而且通常表現為小到大CD3+淋巴細胞的混合物並具有不規則的核輪廓。可以被進一步細分成幾種罕見變體，但所有常常都是彌散性的而且通常是攻擊性的腫瘤。

(vi)黴菌病蕈狀肉芽腫

這是最常見的皮膚淋巴惡性腫瘤，呈現局部或更一般化的皮膚淋巴細胞浸潤且通常無痛。在較攻擊性的變體塞扎裡氏病(Sezary’s disease)中，有皮膚紅斑和末梢血液參與。5年的總生存率為75%。

(vii)瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)

這是最常見形式的淋巴瘤。在北美包含~35%的NHL，並佔所有攻擊性病例的60%。在2014年美國有21,240個新病例。DLBCL可以細分為具有生長中心B細胞(GCB)起源和具有活化B細胞(ABC)起源的。DLBCL是NHL的攻擊性形式，約40%的時間涉及淋巴結以外的其他器官。

(viii)結合代表ABC和GBC子組的人類DLBCL細胞株的淋巴瘤細胞株組的建立；人外膜細胞淋巴瘤株和鼠B細胞淋巴瘤

(a)細胞株和方法：在IMDM培養液中培養瀰漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞株LY1、Ly8、Ly10、Ly18，並在RPMI中培養Ly3、Ly19、SUDHL-4、SUDHL-6、Pfeifer、Farage、Toledo、Karpas-422、HBL1、U2932。在RPMI培養液中例行培養外膜細胞淋巴瘤(MCL)細胞株JEKO-1、Mino、Granta-519、NECB-1、Z-138、REC-1及HBL2。所有培養液都補充了10% FBS、1%L-谷胺醯胺、1%青黴素和鏈黴素。在GRCF DNA Services(馬里蘭州巴爾的摩市的約翰.霍普金斯大學)使用分析套組(PowerPlex 16HS)藉由STR分析驗證之後從美國菌種中心(ATCC，馬納薩斯，VA，USA)或從MSKCC調查者取得細胞株。

(b)自發性鼠B細胞淋巴瘤：我們還藉由NSG小鼠的重複傳代按照腹膜內或皮下注射加基質膠或藉由靜脈注射任一者保持了在裸鼠體內自發形成的CD19+ B細胞淋巴瘤。這個原發性淋巴瘤類似於人的DLBCL，並被用於測定BO化合物在體外長期保持淋巴瘤細胞所必需的鼠MS5基質細胞存在或不存在下進行體外治療的細胞毒性。

(ix)瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞株的表型和分子特徵

如表25所示，用以評估BO-1055細胞毒性的十二種人類非霍奇金淋巴瘤細胞株是可基於從生長中心B細胞(GCB)或活化B細胞(ABC)的衍生被進一步細分為亞型的DLBCL實例。其中八個株有TP53突變，而七個有BCL2 t(14；18)易位。這種易位存在於~70%的濾泡性淋巴瘤和~30%的瀰漫性大B細胞淋巴瘤中。其他類型的BCL2基因重排或擴增在兩個株中發現，而三個株具有野 生型(wt)BCL2。BCL6基因在5/10的株是野生型，在3/10擴增，在一個易位，並且在一個被刪除。

BCL6基因狀態被匹配到由每個細胞株產生的BCL6蛋白水平。Myc在4/12的株中被擴增或重新排列。

表22還顯示了患者在為了細胞株生產取得細胞時的臨床狀態。五個株在第一次確診時取得而七個株在復發時取得。細胞株的細胞遺傳學研究顯示，3例具有正常數量的染色體，5例為超二倍體，3例為近四倍體或超四倍體。

(x)BO-1055在淋巴瘤細胞株的細胞毒性

測定BO-1055的體外細胞毒性：(a)16種人類DLBCL細胞株，12種屬於GCB子組，4種屬於ABC子組：(b)7種人外膜細胞淋巴瘤株以及(c)一種在支撐的基質單層存在或不存在下的原發性鼠B細胞淋巴瘤(表23)。

基於評估的21-25株，在整體藥物反應中三個淋巴瘤子組和鼠B細胞淋巴瘤沒有明顯發散。

(xi)BO-1055和33種化療劑對40種淋巴瘤細胞株篩選的細胞毒性之比較，化療劑包括路徑靶向劑、HSP90和HSP70抑制劑、蛋白酶體抑制劑、順鉑、阿黴素及硼替佐米

將BO-1055的細胞毒性(IC₅₀ μM)與一組抗癌藥物-化合物的細胞毒性相比，該組抗癌藥物-化合物包括路徑靶向劑、HSP90和HSP70抑制劑、蛋白酶體抑制劑、順鉑、阿黴素、及硼替佐米。這些被評估用於針對各種淋巴瘤細胞株的細胞毒性，包括人類DLBCL GBC和ABC亞型、外膜細胞淋巴瘤，如表24所示。

此表顯示在公眾可訪問網站上可取得的數據(IC₅₀ μM)(Broad研究所，桑格研究所)以及由Drs T.L.Su和台灣中央研究院的Lee、及Dr M.A.S.Moore和他在MSKCC的同事產出的數據。

(a)評估用於與表24的BO-1055比較細胞毒性的化合物性質。

ARN：ARN-231卵巢癌幹細胞抑制劑(Moore MA未公開)

TT46 HSP70抑制劑(Kang等人，2014年)。

PUH71：HSP90抑制劑(Ambati等人2014年，Jhaveri等人2014年)。

17-AAG/坦螺旋霉素：HSP90抑制劑(Jhaveri等人，2014年)。

Bort：硼替佐米/萬珂：蛋白酶體抑制劑。

Cisp：順鉑烷化劑鉑類藥物。

Doxo：阿黴素，一種蒽環類抗腫瘤抗生素。

TK：TKI258、Dovitinib、EGFR、FGFR1、PDGFRβ、VEGFR-1、KDR抑制劑、諾華三期。

AEW：AEW541，一種IGFR抑制劑，臨床前，諾華。

SOR：索拉非尼/多吉美、Flt3、c-KIT、PDGFRβ、RET、Raf激酶B、Raf激酶C、VEGFR-1、KDR、FLT4抑制劑，FDA2005年批准，拜耳。

TOPO：拓撲替康/癌康定，拓撲異構酶1抑制劑。FDA1996年核准，葛蘭素史克。

(b)在(xiii)(a)描述的各種化合物在各種代表不同腫瘤子組的人淋巴瘤細胞株的組上的細胞毒性

10個株是高度敏感的(IC₅₀ 0.11-0.87μM)，6個株是中度敏感的(IC₅₀ 1.95-4.14μM)，6個株有中度抗藥性(IC₅₀ 5.06-8.95μM)，只有1個株有高抗藥性(IC₅₀ 12.5μM)。

使用BO-1055篩選的27個株中，11個株是高度敏感的(定義為IC₅₀<1μM)，具有IC₅₀ 0.12-0.84μM。14個株是中度敏感的(定義為IC₅₀ 1.00-4.99μM)，具有從1.08-4.90μM(TI 2.04-9.03)的IC₅₀。兩個株有抗藥性(IC₅₀>10.0μM)。將DLBCL株細分為ABC和GBC類型評估BO-1055細胞毒性沒有發現明顯差異。在4個株的ABC組中，一個株是非常敏感的(IC₅₀<1.0μM)，而三個株是中度敏感的(IC₅₀ 1.0-4.9μM)。

在GBC組的10個株中，4個非常敏感的，4個中度敏感，1個有中度抗藥性，而一個對BO-1055有高抗藥性。TP53狀態似乎並沒有確定BO-1055的敏感性，因為八個具有TP53突變的株有一個範圍的IC₅₀值(0.29-4.90μM)，4個TP53野生型株也是(IC₅₀ 0.12-7.02μM)。BCL2突變狀態同樣沒有確定BO-1055的毒性，因為具有WT Bcl2的株有0.12至>10.0μM的IC₅₀範圍，而突變/重排/擴增的BCL2株也有類似的範圍(IC₅₀ 0.29-4.9μM)。

的細胞毒性(IC₅₀)為0.80μM，順鉑的是>10.0μM * BO-1055的數據由MSKCC的Dr M.A.SMoore和中央研究院的Dr T.L.Su產出。ARN的數據由Dr M.A.S Moore和在MSKCC的同事產出。TT46和PUH71的數據來自MSKCC的Drs G.Chiosis、M.A.S.Moore及E Caldas。由Dr S Danishefsky和在MSKCC的同事合成的Isofludalone的數據是由Dr M.A.S Moore和在MSKCC的同事產出。MSKCC首先開發的SAHA的數據來自多個來源。

(xii)BO-1055與阿黴素的組合對DLBCL(ABC亞型)細胞株OCY-LY3的細胞毒性

使用Chou-Talalay法(Chou和Talaley，1984年)計算組合指數(CI)，其中約定CI>1表示拮抗作用，CI=1表示加成效果，而CI<1表示協同作用。多項研究確立，Chou-Talalay分析適用於藥物之間的相互作用(Chou，2010年)。培育OCY-LY3細胞72小時，且藥物濃度增加(從20μM-0.02μM 8倍連續稀釋)作為單一藥物或藥物組合(Cte對應於各別藥物的IC₅₀)。處理後，藉由阿爾瑪藍評估細胞。

圖23A：藉由GraphPad棱鏡獲得的增殖抑制曲線和IC₅₀。BO-1055或阿黴素在DLBCL(ABC亞型)細胞株OCI-LY3上作為單一療法或組合的細胞毒性。

圖23B：藉由標準化GraphPad棱鏡C.獲得的增殖抑制曲線和IC₅₀。Fa-Ci圖：作用導向的。

圖23C：BO-1055與阿黴素組合的等效線圖：左：BO1055 Cte+DOXO Var。右：DOXO Var+BO1055 Cte(Chou，2010年)。劑量導向-其中CI<1=協同作用；CI=1=加成；CI>1=拮抗作用。值藉由CompuSyn軟體(Chou 和Talalay 1984年，Chou 2010年)計算。

等效線圖：

(xiii)在DLBCL(GBC)細胞株上測定BO-1055與HSP抑制劑(PUH71、TT46)、硼替佐米、及阿黴素組合的細胞毒性

在藥物的IC₅₀以7-9種不同的濃度滴定與BO-1055組合的藥物，或將藥物以對應於每個的IC₅₀的劑量加入並與7-9種不同濃度的BO-1055組合。標靶細胞株是GBC子組的12種人DLBCL細胞株。

在DLBCL(GBC)細胞株上使用以下組合的組合研究結果：1)BO-1055和HSP90抑制劑PUH71；及2)BO-1055和HSP70抑制劑TT46列於表25，表25給出每種藥物在單劑治療的IC₅₀數據及聯合治療的組合指數，其中一種藥物在其IC₅₀ μM下使用，而其它藥物被滴定超過8次連續稀釋(Chou 2010年)。

在組合1，BO-1055是變數，而HSP抑制劑在它們的IC₅₀ μM劑量下使用。在組合2，PUH71或TT46是變數，而BO-1055在其IC₅₀ μM劑量使用。表25的上段呈現PUH71的數據，而表25的底部部分呈現TT46的數據。

在BO-1055和PUH71的11個可評估數據組中，PUH71與BO-1055在對抗Z-138的兩種組合中都是協同的，但與此相反，TT46在對抗同一細胞株的兩種組合中都是拮抗的。PUH71對GRANTA是雙重拮抗的，而TT46在組合-1對GRANTA是協同的，在組合2是拮抗的。兩種HSP抑制劑與BO-1055組合對REC-1都是拮抗的。PUH71與BO-1055對MINO有雙重協同作用，而TT46與BO-1055對此細胞株只在組合1是協同的，在組合2是拮抗的。PUH71和TT46與BO-1055對NECB1在組合1都是協同的，在組合2都是拮抗的。

(xiv)外膜細胞淋巴瘤(MCL)

MCL為最稀有的非霍奇金淋巴瘤(NHLS)之一，包含約6%的NHL病例(在2014年有4960個新病例)。最常出現在60歲以上的人，而且男性比女性更常見，比率為4比1。在美國目前有~15,000位MLC患者。

它是從圍繞正常淋巴結生長中心濾泡的外膜區內的CD5陽性抗原原始預生長中心B細胞惡性轉化產生的。在人類中，CD5基因位於染色體11的長臂。CD5用於減輕來自BCR的活化訊號，使得B-1細胞只能被非常強的刺激(例如細菌蛋白)、而不是由正常組織蛋白活化。MCL細胞可以轉移到其他淋巴結或組織，例如骨髓、肝臟和腸胃道。由於在t(11；14)(q13；q32)的易位，MCL是由週期蛋白D1蛋白的過度表現識別。涉及p53途徑的其他基因異常對於疾病的發生和發展是重要的(參見表25)。MCL難以治療，而且很少被視為治癒。中位存活時間是約3年左右，但現在新的患者被估計為接近6年。

(xv)BO-1055、環磷醯胺、阿黴素、太平洋紫杉醇及帕比司他對外膜細胞淋巴瘤細胞株的細胞毒性

如表26所示，BO-1055在各種MCL細胞株上的平均IC₅₀±SD(μM)值如下：JEKO-1(0.266±0.27)，Z-138(0.182±0.15)，HBL2(0.161±0.34)。

本發明人的結果表示，BO-1055在其針對人B細胞淋巴瘤和各種正常人類細胞類型的毒性之間具有明顯治療窗(50-100倍)。使用BO-1055治療導致在S相的細胞積累及參與DNA修復的蛋白上調[MRE11、p-P95/NBS1(ser343)、RAD50、p-ATR(ser428)]，而一個重要的B細胞淋巴瘤生物標記物Bcl-6被下調。

表26.BO-1055在一組7種人類外膜細胞淋巴瘤細胞株上的細胞毒性(IC₅₀ μM)。為了比較，顯示阿黴素(DNA嵌入蒽環)、太平洋紫杉醇(微

(xvi)BO-1055、4種烷化藥物及四種其他化療劑在MCL株JEKO-1上與五種正常組織相比的治療窗量測

從表26呈現的IC₅₀數據計算治療窗(TW)，表26顯示使用11種化合物對抗一組良性組織和MCL細胞株JEKO-1得到的72小時細胞毒性(IC₅₀ uM)。

表27顯示各化合物的計算治療窗。表27的上部顯示十種化合物對五種正常人體組織和MCL細胞株JEKO-1的IC₅₀ μM值。表的下部將數據表示為良性組織相對於Jeko-1上的IC₅₀之間的IC₅₀值倍數差異。

當使用正常造血細胞毒性作為潛在劑量限制毒性的決定因素時，BO-1055具有所有篩選藥物的最佳TW。比較MCL數據與非造血正常組織的TW進一步支持BO-1055作為在對惡性細胞有高毒性的藥物劑量下具有明顯選擇性且對正常組織傷害最小的高活性抗惡性腫瘤藥物的位置。在比較其他良性組織與MCL株時觀察到，由於對正常上皮細胞、內皮細胞、及間質基質缺乏明顯毒性，BO-1055的TW也同樣優異。

由於烷化藥物4-HC、苯達莫司汀和順鉑、以及依托泊苷、HSP90抑制劑PU-H71和拓撲異構酶抑制劑SN38對正常造血祖細胞的毒性，這些藥物也缺乏治療窗。

在臍帶血造血祖細胞(CD34+細胞、CFC)、內皮細胞(HUVEC)、骨髓間質幹細胞(huMSC)、人hTERT無限增殖的肺支氣管(Bci-NSI)和輸卵管(FTEC)上皮細胞上測定IC₅₀(μM)。

表27顯示的數據(下組)確定對惡性細胞有毒的、但對測試的正常細胞無毒的藥物劑量之間的治療窗(TW)。BO-1055的這個範圍是從30-296倍，是篩選的11種藥物中骨髓毒性最少的。

4-HC，環磷醯胺的活性代謝物，也對CD34+細胞和正常上皮和間質細胞具有高毒性。

苯達莫司汀和馬法蘭對正常上皮細胞、內皮細胞和間質具有高TW值，但當針對CD34+細胞評估時只有有限的窗(1.60-6.36倍)。

順鉑在上皮細胞與間質細胞上具有有限窗(1.6-8.0)，在內皮細胞上有小幅窗(50倍)，但被造血毒性明顯限制。

當用於諸如卡波西氏肉瘤、尤文氏肉瘤、肺癌、睾丸癌、淋巴瘤、骨髓性白血病、及神經膠質母細胞瘤等癌症的化療時，拓撲異構酶II抑制劑依托泊苷也受限於對CD34+細胞的高毒性，如藉由其記錄的骨髓抑制副作用確認(Hande，1998年)。依托泊苷也已被用於骨髓或造血幹細胞移植前的處理方案。

SN-38是天然生物鹼喜樹鹼的半合成類似物伊立替康的活性代謝物，是一種有效的拓撲異構酶1抑制劑(比伊立替康本身有效1000倍以上)。體外細胞毒性試驗顯示，SN-38相對於伊立替康的效力從2倍變化到2000倍(Pommier等人，2010年)。SN-38對非造血組織的TW是250-2,500，但是對CD34+細胞只有8.75，這與SN-38代謝物是引起~25%服用伊立替康的患者經歷的腹瀉、骨髓抑制及極度免疫抑制等症狀的原因的觀察一致。

HSP90抑制劑PUH71的TW測定表示造血細胞和血管內皮細胞毒性問題的可能性，儘管假使能選擇地抑制腫瘤血管生成後者可以是正面的特徵。

長春花生物鹼長春新鹼是微管蛋白結合藥物，抑制微管結構的裝配和區塊中期複製。它被用於治療非霍奇金氏淋巴瘤作為CHOP化療方案的一部分，以及用於霍奇金氏淋巴瘤作為MOPP、COPP及BEACOPP的一部分。它也被用於治療多發性骨髓瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、和腎母細胞瘤。它也可用於在使用地塞米松和L-天冬醯胺酶的ALL中誘導緩解，並與強的松(prednisone)組合來治療兒童白血病。它已被用作治療慢性特發性血小板減少性紫癜的免疫抑制劑。造血細胞和內皮細胞的TW都暗示藥物的骨隨抑制和血管破壞潛力。主要的副作用是化療引起的、會愈來愈嚴重且不可逆轉的周邊神經病變。20-75%的治療患者發生毛髮脫落，而且它也是骨髓抑制的，並誘導白血球減少症和血小板減少症。

(xvii)BO-1055與硼替佐米、阿黴素、HSP90-和HSP-70抑制劑對外膜細胞淋巴瘤細胞株的藥物組合細胞毒性研究

對一組由Jeko-1、HBL2、Z-138、REC-1、Granta、Mino、及NECB1代表的人外膜細胞淋巴瘤(MLC)細胞株測定BO-1055與硼替佐米/萬珂、阿黴素、及熱休克蛋白抑制劑PUH71(HSP90抑制劑)和TT46(HSP70抑制劑)組合可能的加成或協同細胞毒性作用。將這些數據顯示於表28和29。

藉由將BO-1055保持在對應於作為單一藥劑時對細胞株測得的IC₅₀的單一濃度獲得一組數據，然後藉由組合BO-1055與在7-9倍範圍的藥物濃度間的滴定濃度的每個藥物來評估相互作用的細胞毒性持續72小時，並且藉由阿爾瑪藍試驗測定細胞毒性/代謝活性的抑制作用(IC₅₀)。

藉由組合一種在其作為單劑時的IC₅₀的藥物與在藥物劑量的7-9倍範圍間滴定的BO-1055並在72小時進行IC₅₀測定來獲得第二組數據。

使用5種可評估的株，BO-1055與萬珂在對2種株(Z-138、MINO)的兩種組合都是協同細胞毒性的，對1種株(REC-1)兩種組合都是拮抗的，而且對2種株(RANTA、NECB1)組合1是協同的，組合2是拮抗的。使用BO-1055和阿黴素，兩種組合對2種株(Z-138、MINO)都是協同的，兩種組合對1種株(REC-1)都是拮抗的，而且2種株使用組合1是協同的，並且對組合2是拮抗的(RANTA、NECB1)。

因此，個別的MCL株顯示回應藥物組合的明顯變化，但它們對萬珂和硼替佐米的反應是相同的。與此相反，相同的MCL細胞株組對HSP90抑制作用顯示與HSP70抑制作用相比不同的反應(表29)。PUH71與BO-1055在對Z-138的兩種組合都是協同的，但與此相反，TT46在兩種組合中對同一細胞株是拮抗的。PUH71對GRANTA是雙重拮抗的，而TT46對GRANTA在組合1是協同的，在組合2是拮抗的。兩種HSP抑制劑在與BO-1055的兩個組合中對REC-1都是拮抗的。PUH71與BO-1055對MINO是雙重協同的，而TT46與BO-1055對此細胞株只在組合1是協同的，而在組合2是拮抗的。PUH71和TT46與BO-1055對NECB1在組合1都是協同的，在組合2都是拮抗的。

表28.使用BO-1055和阿黴素或萬珂(硼替佐米)組合治療外膜細胞淋巴瘤株的功效

表29.使用BO-1055與HSP90抑制劑PUH71或HSP70抑制劑TT46組合治療外膜細胞淋巴瘤細胞株的功效

(xviii)外膜細胞淋巴瘤的異種移植模型與BO-1055產生的腫瘤抑制

使用GFP/螢光素酶標記JAKO-1外膜細胞淋巴瘤細胞株，並將500,000個細胞靜脈注射到10隻12週齡NSG雌性小鼠中的每一隻。IVIS螢光素生物攝像是在第15天進行的，在該時間點5隻小鼠每隔一天被靜脈注射BO-1055(30 mg/kg)持續10天，5隻小鼠接受類似時間表的安慰劑(培養液)投予。每隔一段時間對動物攝像，如圖24所示。

在腫瘤移植後對照組顯現進行的腫瘤生長長達7週(在此對照組中一隻小鼠在第32天之前死亡，但這個死亡可能與腫瘤無關)。BO-1055治療的小鼠顯現急劇抑制的腫瘤生長，而且在第7週(藥物治療結束25天後)在五隻小鼠的任一隻上沒有可大略觀察到的腫瘤。在治療組中藉由敏感性生物攝像檢測到腫瘤逐漸復發，在第41天開始(圖24)。所有對照小鼠在第7週都因腫瘤負擔而被安樂死。在研究終止時，BO-1055治療的小鼠在第75天都活著。

實施例14

肉瘤

在2013/14年據估計世界各地有60,000個肉瘤病例，在美國每年有3,020個新發病例，且1,460人死亡，5年存活率為66.6%。發展肉瘤的終生風險是0.1%。有超過70種病理肉瘤亞型。任何特定肉瘤的進展和預後皆取決於亞型以及階段。兩種主要的分支是骨肉瘤(病例的20%)和軟組織肉瘤(病例的80%)。

(i)骨肉瘤

這是一種攻擊性的惡性腫瘤，源自原始間質細胞並表現出骨母細胞分化和惡性類骨質產生。骨肉瘤在小兒患者中佔所有惡性腫瘤的2.4%，並且佔所有原發性骨癌的約20%。它是兒童癌症中第八常見的形式，而且在兒童和年輕成人中是最常見組織學形式的原發性骨癌。它是一種罕見的疾病，在歐洲和美國每年只有約1,000個體被確診，每年約有300人死亡。

(ii)滑膜細胞肉瘤

這個肉瘤好發於青壯年，最常見於關節旁的手臂或腿，但他們很少侵入關節本身。最常見的部位是鄰近膝蓋。不像其他的軟組織肉瘤，滑膜細胞肉瘤往往是痛苦的。治療通常包括使用放射線根本切除與化療或截肢結合化療。

(iii)橫紋肌肉瘤

這些紋狀或骨骼肌的癌性腫瘤是最常見的軟組織肉瘤類型之一，而且在兒童中佔確診的軟組織肉瘤的一半左右。它們最常生長在手臂或腿，但也會在頭部或頸部或在泌尿或生殖器官中發展。有幾種不同的類型，包括多形性的、泡狀的、胚胎的及葡萄狀的。

(iv)平滑肌肉瘤(平滑肌肉腫瘤)和子宮肉瘤

這些肉瘤是平滑肌的癌性腫瘤。他們最常發生在器官(例如腸胃道和子宮)。患者的平均年齡是60歲。在腸胃道中出現的腫瘤中61%發生於胃，29%在小腸，並且10%在結腸中。腸胃道或子宮平滑肌肉瘤的症狀是大量出血和疼痛。轉移發生在超過一半的患者身上。轉移通常發生在肺部，腸胃道腫瘤除外，腸胃道腫瘤往往轉移到肝臟。子宮平滑肌肉瘤的治療是腹式子宮切除術。

(v)胃腸肉瘤，另外稱為腸胃道間質瘤(GIST)

GIST發展於胃和腸道的基質，其特徵是活化的c-Kit突變。可使用Gleevec®治療。

(vi)卡波西氏肉瘤

卡波西氏肉瘤是在內襯口、鼻、肛門的皮膚或黏膜下方的組織中發現癌細胞的疾病。卡波西氏肉瘤有三組患者。第一組通常包括猶太人、義大利或地中海遺傳的老年男性。這種類型的卡波西氏通常在10-15年間進展緩慢。 患者共同在小腿的前部發展出藍色病變，這通常蔓延成多重器官損傷。一段時間後，疾病會擴散到其他器官。卡波西氏肉瘤的第二組發生在接受器官移植的患者。由於移植後的免疫抑制治療，患者的免疫系統被削弱因而更容易受到感染。卡波西氏肉瘤的第三組在愛滋病患者中發現。這組被稱為流行性卡波西氏肉瘤。由於免疫系統被HIV病毒削弱，感染和其他諸如卡波西氏症的疾病會侵入人體。卡波西氏肉瘤在患有愛滋病的人身上通常擴散更迅速，而且可以在身體的許多部位發現。放射療法通常是卡波西氏症治療；然而，當病變已擴散到器官，往往也可使用化療。

(vii)脂肪肉瘤

這是最常被診斷的軟組織腫瘤，而且是在報導肉瘤的最大類別中。這些腫瘤通常在深部脂肪組織發展。它們最常發生在大腿、膝蓋後面、腹股溝、臀肌區或腹膜後。脂肪肉瘤通常是惡性的，很少是來自預先存在的脂肪瘤，脂肪瘤是一種非癌腫瘤。他們最常在30至60歲之間的成人中發現，而且男性比女性稍微常見。轉移到淋巴結發生在約10%的病例中。

(viii)軟骨肉瘤

這些腫瘤從軟骨細胞發展。

(ix)尤文氏肉瘤(ES)

尤文氏肉瘤家族腫瘤(ESFT)是主要在青少年和青壯年中發現的骨或軟組織肉瘤，尖峰發生率在年齡10和20之間(Burchill，2008年)。ES的基因特徵在於涉及尤文氏肉瘤斷點區1(EWSR1)基因的染色體易位。染色體22上的EWSR1易位到染色體11發生在85%的ES病例中，形成了融合蛋白產物EWS-FLI1(de Alava & Gerald，2000年)。此外，融合產物EWS-ERG在10%的 病例中確定。EWSR1斷點似乎是遺傳易位的熱點，而且可以雜亂地結合其他肉瘤亞型中的C-末端基因例如透明細胞肉瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤等。FLI1、ERG及其他ETS基因含有DNA結合域，而EWS-FLI1蛋白的功能是作為調節惡性轉化到ES的異常轉錄因子。患有轉移性尤文氏肉瘤的患者預後仍然慘淡，儘管有全身治療的發展，5年存活率通常不會超過30%(Jiang等人，2015年)。

(x)平滑肌肉瘤。這些腫瘤從腹部和骨盆區器官的平滑肌及血管發展

BO-1055在一組28種人的肉瘤細胞株中的細胞毒性

DNA交聯劑持續是兒科肉瘤的化療的重要部分。在目前的研究中，本發明人發現，BO-1055在體外和腫瘤異種移植模型中對各種肉瘤細胞株的細胞生長表現出明顯的細胞毒性。發明人測定BO-1055在尤文氏肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、及結締組織增生性小圓藍細胞瘤(DSRCT)細胞株中介導細胞毒性的功效，並與帝盟多、馬法蘭、及阿黴素相比。(表30)(Ambati等人，2014a,b)。

BO-1055對8/9的尤文氏細胞株是高毒性的(IC₅₀ 0.14-0.61μM)，而對1/9是中等毒性的(IC₅₀ 1.04μM)。同樣地，BO-1055對4/5的橫紋肌肉瘤株是高毒性的(IC₅₀ 0.08-0.40μM)，但對一個株(SMS-CTR胚胎型)有高抗藥性(IC₅₀ 10.0μM)。兩種結締組織增生性小圓細胞瘤株對BO-1055是中度敏感的(IC₅₀ 2.41-3.74μM)。相比之下，5種骨肉瘤株中有3種對BO-1055有高度抗藥性(IC₅₀ 10.0-100.0μM)。一個株是高度敏感的(IC₅₀ 0.45μM)，而一個是中度敏感的(IC₅₀ 2.67μM)。

在9種株上測定替莫唑胺(TMZ)毒性，其中3種是尤文氏肉瘤並且有高抗藥性(IC₅₀ 245.0-405.0μM)，5/6的橫紋肌肉瘤株亦如此(IC₅₀ 191.0> 1,000.0μM)。RH30(濾泡型)橫紋肌肉瘤株對TMZ有中度抗藥性(IC₅₀ 9.0μM)，但對BO-1055高度敏感(IC₅₀ 0.24μM)。馬法蘭對所測試的8種尤文氏和橫紋肌肉瘤株有高度細胞毒性(IC₅₀ 0.0001-0.020μM)。

阿黴素對其篩選的所有株都有高細胞毒性，包括三種尤文氏肉瘤(IC₅₀ 0.005-0.38μM)。對BO-1055有高抗藥性的兩種骨肉瘤株對阿黴素是高度敏感的(IC₅₀ 0.025-0.090μM)，測試的一種橫紋肌肉瘤株亦同(IC₅₀ 0.011μM)。結果證明，BO-1055比TMZ更具細胞毒性，但對測試的肉瘤細胞株的細胞生長的影響比馬法蘭和阿黴素低。

(xi)BO-1055在A673尤文氏肉瘤細胞和A204橫紋肌肉瘤細胞中誘導在G2/M期的細胞週期阻滯

藉由流式細胞術測定BO-1055在A673尤文氏肉瘤細胞株和A204橫紋肌肉瘤細胞株中誘導的細胞週期抑制和凋亡(圖25A)。圖25A顯示在12、24、48及72小時使用7-AAD(用於生存力測試)和Annexin V-APC(用於凋亡)染色、在指定濃度的BO-1055下A673細胞株的流式細胞術分析結果。

結果顯示，BO-1055在兩種細胞株中在G2/M期以劑量依賴和時間依賴的方式誘導細胞週期阻滯。

圖25B顯示在BO-1055治療後在不同時間點的凋亡及死亡細胞百分比的圖形表示。

圖25C顯示使用BO-1055治療後48h和72h在A673細胞中的半胱天冬酶3/7活性之曲線圖。

圖25D為在施加不同劑量的BO-1055之後12、24、48及72小時死亡A673細胞的百分比之圖形表示。

圖25E為在施加不同劑量的BO-1055之後12、24、48及72小時凋亡A673細胞的百分比之圖形表示。

(xii)BO-1055在甲基纖維素培養物腫瘤球形成試驗中抑制A673尤文氏肉瘤

本發明人藉由腫瘤球形成試驗研究在甲基纖維素培養物中抑制A673尤文氏肉瘤(圖26A和圖26B)。

圖26A顯示使用各種濃度的BO-1055或4-氫過氧環磷醯胺治療之後在甲基纖維素培養物中抑制A673尤文氏肉瘤腫瘤球形成。使用1.00μM的4-HC和<0.10μM的BO-1055看到50%的球形成抑制。

圖26B顯示甲基纖維素中形成腫瘤球。

結果顯示，BO-1055比用作正對照的4-氫過氧環磷醯更具細胞毒性。

(xiii)BO-1055與不同化療劑組合對A673尤文氏肉瘤細胞株的體外協同細胞毒性

本發明人評估使用BO-1055與不同化療劑例如拓撲替康、SN-38、阿黴素、及PU-H71的組合BO-1055在A673尤文氏肉瘤細胞株上的細胞毒性作用。

如圖27A-D所示，藉由組合BO-1055與不同的測試化療劑，BO-1055對A673尤文氏肉瘤細胞株有協同細胞毒性。

具體來說，在96孔盤中以格子形式同時施加改變濃度的BO-1055和第二藥物並使用阿爾瑪藍細胞增殖試驗定量細胞毒性。然後，使用Compusyn軟體為每個組合產生Fa組合指數(CI)圖和標準化等效線圖。

圖27A顯示BO-1055與托泊替康組合的等效線圖；圖27B顯示BO-1055與SN-38組合的等效線圖；圖27C顯示BO-1055與阿黴素組合的等效線圖；以及圖27D顯示BO-1055與PU-H71組合的等效線圖。這個組合展現體外對尤文氏肉瘤細胞的協同作用。

(xiv)BO-1055對NSG鼠體內的尤文氏肉瘤腫瘤移植物展現有效的治療效果

測定BO-1055在荷尤文氏肉瘤異種移植物的NSG鼠中的治療效果。如圖31A-E所示，BO-1055以30mg/kg的劑量在裸鼠體內導致腫瘤生長完全消退，四劑藉由尾靜脈注射。在治療組中注意到腫瘤完全消退。

藉由尾靜脈注射以10mg/kg、20mg/kg及30mg/kg的劑量給予荷有大小約100mm³的A673尤文氏肉瘤異種移植物的NSG小鼠(每組n=5)5劑的BO-1055。將結果顯示於圖28A-C。

圖28A顯示一周量測兩次的腫瘤體積曲線圖。

圖28B顯示小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。

圖28C顯示治療小鼠的重量曲線圖。

使用BO-1055藉由尾靜脈注射以30mg/kg的劑量隔日治療每組荷A204橫紋肌肉瘤異種移植物的裸鼠(n=5)持續5劑。將結果顯示於圖28D和圖28E。

圖28D顯示腫瘤尺寸圖。

圖28E顯示經治療小鼠的重量曲線圖。

在治療組中注意到腫瘤完全消退。

(xv)BO-1055有效抑制尤文氏肉瘤異種移植物，一種在NSG小鼠體內的抗環磷醯胺異種移植物

使用BO-1055對抗皮下移植到NSG小鼠體內的尤文氏肉瘤原發性患者腫瘤樣本之抗環磷醯胺異種移植物。當腫瘤在NSG小鼠體內達到100mm³時，將小鼠隨機分成對照組和藥物治療組。對照組小鼠接受PBS注射劑，藥物治 療組的小鼠接受MTD劑量的環磷醯胺(70mg/kg)，隔日腹腔注射持續3劑(在圖29中以較短的箭頭圖示)。腫瘤生長在環磷醯胺治療小鼠中沒有被抑制。當腫瘤達到500mm³時，開始使用BO-1055治療，劑量為30mg/kg，隔日靜脈注射4劑(以較長的箭頭圖示)。注意到使用BO-1055治療後，環磷醯胺難治的腫瘤消退了。

將結果繪示於圖29。如可以看到的，BO-1055抑制了來自已使用兩種烷化劑治療作為前期治療的復發尤文氏肉瘤患者、在NSG小鼠(二次傳代)體內建立的抗環磷醯胺異種移植物。

參考文獻：

1) Akyurek N, Uner A, Benekli M, Barista I. Prognostic significance of MYC, BCL2, and BCL6 rearrangements in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone plus rituximab. Cancer 2011; 118 (17): 4173-83.

2) Ambati SR, Lopes EC, Kosugi K, Mony U, Zehir A, Shah SK, Taldone T, Moreira AL, Meyers PA, Chiosis G, Moore MA. Pre-clinical efficacy of PU-H71, a novel HSP90 inhibitor, alone and in combination with bortezomib in Ewing's sarcoma. Mol Oncol. 2014a Mar; 8(2): 323-36.

3) Ambati SR, Wong EW, Pera B, Peguero E, Caldas Lopes E, Chen JJ, Shieh JH, Su TL, Moore MA. Pre-clinical evaluation of a novel DNA crosslinking agent, Ureidomustine (BO-1055) in pediatric sarcomas. Proceedings of the 105^th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2014b April 4-9; San Diego, CA; Cancer Res 2014; 74(19 Suppl); Abstract nr 3980.

4) American Cancer Society: Cancer Facts and Figures 2015. Atlanta, Ga: American Cancer Society, 2015. Available online

5) Apostolopoulos C, Castellano L, Stebbing J, Giamas G. Bendamustine as a model for the activity of alkylating agents. Future Oncol. 2008, 4: 323-332.

6) Appleman LJ, Balasubramaniam S, Parise RA, Bryla C, Redon CE, Nakamura AJ, Bonner WM, Wright JJ, Piekarz R, Kohler DR, Jiang Y, Belani CP, Eiseman J, Chu E, Beumer JH, Bates SE.. A Phase I Study of DMS612, a Novel Bifunctional Alkylating Agent. Clin Cancer Res. 2015 Feb 15; 21(4): 721-9.

7) Armitage JO. My Treatment Approach to Patients With Diffuse Large B-Cell Lymphoma. Mayo Clinic Proceedings. 2012; 87(2): 161-171.

8) Armstrong AJ, George DJ. Satraplatin in the treatment of hormone-refractory metastatic prostate cancer. Therapeutics Clin Risk Management. 2007; 3(5): 877-883.

9) Azim HA, Ganti AK. Treatment options for relapsed small-cell lung cancer. Anticancer Drugs 2007; 18 (3): 255-261.

10) Barretina J, Caponigro G, Stransky N, et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 2012 Mar 28; 483(7391): 603-7. doi: 10.1038/nature11003.

11) Bartelink IH, van Reij EM, Gerhardt CE, van Maarseveen EM, de Wildt A, Versluys B, Lindemans CA, Bierings MB, Boelens JJ. Fludarabine and exposure-targeted busulfan compares favorably with busulfan/cyclophosphamide-based regimens in pediatric hematopoietic cell transplantation: maintaining efficacy with less toxicity. Biol Blood Marrow Transplant. 2014; 20(3): 345-53.

12) Baughn LB, Di Liberto M, Wu K, Toogood PL, Louie T, Gottschalk R, Niesvizky R, Cho H, Ely S, Moore MAS, Chen-Kiang S. A novel orally active small molecule potently induces G1 arrest in primary myeloma cells and prevents tumor growth by specific inhibition of Cyclin-dependent kinase 4/6. Cancer Res. 2006. 66: 7661-7667.

13) Berry S, Cosby R, Asmis T, Chan K, Hammad N, Krzyzanowska MK. Cancer care Ontario’s Gastrointestinal Disease Site Group. Continuous versus intermittent chemotherapy strategies in metastatic colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis. Ann Oncol 2015; 26:477-485.

14) Biesalski HK, Bueno de Mesquita B, Chesson A et al. European Consensus Statement on Lung Cancer: risk factors and prevention. Lung Cancer Panel. CA Cancer J Clin 1998; 48 (3): 167-176; discussion 164-166. doi: 10.3322/canjclin. 48.3.16.

15) Bode-Lesniewska B, et al. Relevance of translocation type in myxoid liposarcoma and identification of a novel EWSR1-DDIT3 fusion Genes Chromosom Canc. 2007; 46: 961-971

16) Boss, R. Shadow falls on anti-antiogiogenetic drugs. Cancer Decisions Newsletter Archives. 2009, March 15.

17) Bower M, Newlands ES, Bleehen NM, Brada M, Begent RJH, Calvert H, Colquhoun I, Lewis P, Brampton MH. Multicentre CRC phase II trial of temozolomide in recurrent or progressive high-grade glioma. Cancer Chemother. Pharmacol. 1997, 40, 484-488.

18) Brambilla E, Travis WD, Colby TV, Corrin B, Shimosato Y The new World Health Organization classification of lung tumours. Eur. Respir. J. 2001;18 (6): 1059-68.

19) Breems DA, Blokland EA, Nebens S, Ploemacher RE. Frequency analysis of human primitive haematopoietic stem cell subsets using a cobblestone area forming cell assay. Leukemia 1994; 8: 1095-104.

20) Brenner A. et al., A Phase 1/2 study of TH-302, investigational hypoxia-activated prodrug, and bevacizumab in patients with bevacizumab-refractory recurrent glioblastoma. Society of Neuro-oncology Annual Meeting, 2014 Abstract # AT-12.

21) Brenner H, Gondos A, Pulte D. Survival expectations of patients diagnosed with Hodgkin’s lymphoma in 2006-2010. Oncologist. 2009 Aug; 14(8): 806-13. doi: 10.1634/theoncologist. 2008-0285.

22) Browder T, Butterfield CE, Kraling BM, Shi B, Marshall B, O’Reilly MS, et al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer. Cancer Res 2000; 60: 1878-86.

23) Burchill SA. Molecular abnormalities in Ewing's sarcoma. Expert Rev Anticancer Ther. 2008; 8: 1675-1687.

24) Casanovas O, Hicklin DJ, Bergers G, Hanahan D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell. 2005, 8: 299-309.

25) Castro-Malaspina HM Gay RE, Resnick G. Kapoor N, Chiareri D, McKenzie S, Broxmeyer H, and Moore MAS. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood. 1980 Aug; 56(2): 289-301

26) Cavazos, D.A. et al., Pharmacodynamic biomarker assessments in a Phase I/II trial of the hypoxia-activated prodrug TH-302 and bevacizumab in bevacizumab-refractory recurrent glioblastoma. Society of Neuro-oncology Annual Meeting, 2014. Abstract #DD-02.

27) Chan JK, Loizzi V, Manetta A, Berman ML. Oral altretamine used as salvage therapy in recurrent ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 2004; 92 (1): 368-71.

28) Chen YR, Su TL, Hsia PW unpublished results 2013.

29) Chien SI, Yen JC, Kakadiya R, Chen CH, Lee TC, Su TL, Tsai TH: Determination of tissue distribution of potent antitumor agent ureidomustin (BO-1055) by HPLC and its pharmacokinetic application in rats. J Chromatogy 2013; 917-918: 62-70.

30) Cho HY, Wang W, Jhaveri N et al. NEO212, temozolomide Conjugated to Perillyl Alcohol, Is a Novel Drug for Effective Treatment of a Broad Range of Temozolomide Resistant Gliomas. Mol Cancer Ther 2014; 13(8); 2004-17.

31) Cho YS, Wu K-D, Moore MAS, Chou T-C, Danishefsky SJ. Second-generation epothilones: discovery of fludelone and its extraordinary antitumor properties. Drugs of the Future 2005, 30(5): 1-9.

32) Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res 2010; 70(2): 440-446.

33) Chou TC, Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 1984; 22: 27-55.Choy H, Park C, Yao M. Current status and future prospects for satraplatin, an oral platinum analogue. Clin Cancer Res 2008; 14 (6): 1633-8.

34) Chung KY, Morrone G, Schuringa JJ, Wong B, Dorn DC, Moore MA. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 2005 Jan 1; 105(1): 77-84.

35) Chung KY, Morrone G, Schuringa JJ, Wong B, Dorn DC, Moore MA. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 2005, 105: 77-84.

36) Coiffier B, Thieblemont C, Van Den Neste E et al. Long-term outcome of patients in the LNH-98.5 trial, the first randomized study comparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCL patients: a study by the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte. Blood 2010; 116(12): 2040-5.

37) Deacon M, Singleton D, Szalkai N et al. Early evaluation of compound QT prolongation effects: A predictive 384-well fluorescence polarization binding assay for measuring hERG blockade. J Pharmacol Toxicol Methods 2007; 55: 255-264.

38) de Alava E, Gerald WL. Molecular biology of the Ewing's sarcoma/primitive neuroectodermal tumor family. J Clin Oncol. 2000; 18: 204-213.

39) Dela Cruz CS, Tanoue LT, Matthay RA. Lung cancer epidemiology, etiology and prevention Clinic in Chest Med 2011; 32 (4): 605-644.

40) Delhommeau F, Dupont S, Della Valle V, et al. Mutations in TET2 in Myeloid Cancers. N Engl J Med 2009; 360(22): 2289-2301.

41) Denny WA, Wilson WR. The design of selectively activated anti-cancer prodrugs for use in antibody-directed and genedirected enzyme prodrugs therapies. J. Pharm. Pharmacol. 1998, 50: 387-394.

42) Dietlein F and Reinhardt HC. Molecular Pathways: Exploiting Tumor-Specific Molecular Defects in DNA Repair Pathways for Precision Cancer Therapy. Clin Cancer Res 2014; 20: 5882-5887.117.

43) Droogendijk HJ, Kluin-Nelemans HJ, van Doormaal JJ, Oranje AP, van de Loosdrecht AA, van Daele PL. Imatinib mesylate in the treatment of systemic mastocytosis: a phase II trial. Cancer. 2006, 107, 345-51.

44) Du R, Lu KV, Petritsch C, Liu P, Ganss R, Passegué E, Song H, Vandenberg S, Johnson RS, Werb Z, Bergers G. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 2008, 13: 206-220.

45) Fernandez FG, Battafarano RJ. Large-cell neuroendocrine carcinoma of the lung. Cancer Control 2006; 13 (4): 270-5.

46) Feugier P, Li N, Jo DY, Shieh JH, MacKenzie KL, Lesesve JF, Latger-Cannard V, Bensoussan D, Crystal RG, Rafii S, Stoltz JF, Moore MA. Osteopetrotic mouse stroma with thrombopoietin, c-kit ligand, and flk-2 ligand supports long-term mobilized CD34+ hematopoiesis in vitro. Stem Cells Dev. 2005. 14: 505-16.

47) Franco S, MacKenzie KL, Dias S, Alvarez S, Rafii S, Moore MAS. Clonal variation in phenotype and lifespan of human embryonic fibroblasts (MRC-5) transduced with the catalytic component of telomerase (hTERT). Exp Cell Research, 2001, 268: 14-25.

48) Fuld AD, Dragnev KH, Rigas JR. Pemetrexed in advanced non-small-cell lung cancer". Expert Opin Pharmacother 2010; 11 (8): 1387-402.

49) Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, Greenman CD, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature 2012; 483: 570-5.

50) Gatenby RA, Silva AS, Gillies RJ, Frieden BR. Adaptive therapy. Cancer Res 2009; 69(11): 4894-903.

51) Golub TR, Barker GF, Lovett M, Gilliland DG. Fusion of PDGF receptor β to a novel ets-like gene, tel, in chronic myelomonocytic leukemia with t(5;12) chromosomal translocation. Cell 1994; 77: 307-316.

52) Greaves M, Maley CC. Clonal evolution in cancer. Nature 2012; 481:306-1310.

53) Grothey A, Hart LL, Rowland KM, Ansari RH, Alberts SR, Chowhan NM, et al. Intermittent oxaliplatin (oxali) administration and time-to-treatment-failure (TTF) in metastatic colorectal cancer (mCRC): final results of the Phase III CONcePT trial. J Clin Oncol 2008; 26(15 Suppl): 4010.

54) Hait WN. Anticancer drug development: the grand challenges. Nature Reviews, Drug Discovery, 2010, 9: 253-254.

55) Hamid R, Rotshteyn Y, Rabadi L, Parikh R, Bullock P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high through-put screening. Toxicology in Vitro 2004; 18: 703-710.

56) Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011; 144(5): 646-74

57) Hanin L. Why victory in the war on cancer remains elusive: biomedical hypotheses and mathematical models. Cancers (Basel) 2011; 3(1): 340-67

58) Hayette S, Thomas X, J allades L, et al. High DNA methyltransferase DNMT3B levels: a poor prognostic marker in acute myeloid leukemia. PLoS One 2012; 7(12): e51527.

59) He S, Shen J, Hong L, Niu L, Niu D.. Capecitabine “metronomic” chemotherapy for palliative treatment of elderly patients with advanced gastric cancer after fluoropyrimidine-based chemotherapy. Med Oncol 2012; 29(1): 100-35 6.10.1007/s12032-010-9791-x

60) Hochhaus A, Müller MC, Radich J, Branford S, Kantarjian HM, Hanfstein B, Rousselot P, Kim DW, Lipton JH, Bleickardt E, Lambert A, Hughes TP. Dasatinib-associated major molecular responses in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase following imatinib failure: response dynamics and predictive value. Leukemia. 2009 Sep; 23(9): 1628-33.

61) Hochster HS. Stop and go: yes or no？ J Clin Oncol 2009; 27(34): 5677-910.

62) Horn L, Dahlberg SE, Sandler AB, Dowlati A, Moore DF, Murren JR, Schiller JH. Phase II study of cisplatin plus etoposide and bevacizumab for previously untreated, extensive-stage small-cell lung cancer. Eastern Cooperative Oncology Group Study E3501. J. Clin Oncol 2009; 27: 6006-11.

63) Horton SJ, Jaques J, Woolthuis C, van Dijk J, Mesuraca M, Huls G, Morrone G, Vellenga E, Schuringa JJ. MLL-AF9-mediated immortalization of human hematopoietic cells along different lineages changes during ontogeny. Leukemia 2013; 27: 1116-1126.

64) Hoy SM. Obinutuzumab: A Review of Its Use in Patients with Chronic Lymphocytic Leukaemia. Drugs. 2015 Feb; 75(3):285-96. doi: 10.1007/s40265-014-0340-3.

65) Huang X, Di Liberto M, Ja yabalan D, Liang J, Ely S, Bretz J, Shaffer AL, Louie T, Chen I, Randolph S, Hahn W, Staudt LM, Niesvizky R, Moore MAS, Chen-Kiang S. Prolonged early G1 arrest by selective CDK4/CDK6 inhibition sensitizes myeloma cells to cytotoxic killing through cell cycle-coupled loss of IRF4. Blood. 2012;120(5): 1095-106.

66) Hugate RR, Wilkins RM, Kelly CM, Madsen W, Hinshaw I, Camozzi AB. Intraarterial chemotherapy for extremity osteosarcoma and MFH in adults. Clin Orthop Relat Res.2008 Jun; 466(6): 1292-301. doi: 10.1007/sl 1999-008-0252-1.

67) Jahnke K, Thiel E, Bechrakis NE et al. Ifosfamide or trofosfamide in patients with intraocular lymphoma. J. Neurooncol. 2009; 93 (2): 213-7.

68) Jhaveri K, Ochiana SO, Dunphy MP, Gerecitano JF, Corben AD, Peter RI, Janjigian YY, Gomes-DaGama EM, Koren J 3rd, Modi S, Chiosis G. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opin Investig Drugs. 2014; 23(5): 611-28.

69) Jiang Y, Ludwig J, Janku F.Targeted therapies for advanced Ewing's sarcoma family of tumors. Cancer Treatment Rev. On line March 2015 doi: 10.1016/j.ctrv.2015.03.008

70) Jo D-Y, Rafii S, Hamada T, Moore MAS. Chemotaxis of primitive hematopoietic cells in response to stromal cell-derived factor-1. J. Clin Invest 2000; 105:101-111.

71) Johnson BE, Janne PA. Epidermal growth factor receptor mutations in patients with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2005, 65:7525-7529.

72) Jordan AM, Khan TH, Malkin H, Helen MI, Osborn HMI. Synthesis and analysis of urea and carbamate prodrugs as candidates for melanocyte-directed enzyme prodrug therapy (MDEPT). Bioorg. Med. Chem. 2002, 10: 2625-2633.

73) Jordan AM, Khan TH, Osborn HMI, Photiou A, Riley PA. Melanocyte-directed enzyme prodrug therapy (MDEPT): Development of a targeted treatment for malignant melanoma. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7:1775-1780.

74) Kakadiya R, Dong H, Kumar A, Dodiya N, Kapuriya N, Zhang X, Chou TC, Lee TC, Shah A, Su TL. Potent DNA-directed alkylating agents: Synthesis and biological activity of phenyl N-mustard-quinoline conjugates having a urea or hydrazinecarboximide linker. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18: 2285-2299.

75) Kaldor JM, Day NE, Hemminki K. Quantifying the carcinogenicity of antineoplastic drugs. Eur. J. Cancer Cli. Oncol. 1988, 24:703-711.

76) Kalia M. Personalized oncology: recent advances and future challenges. Metabolism. 2013;62 Suppl 1:S11-4.

77) Kang Y, Taldone T, Patel HJ, Patel PD, Rodina A, Gozman A, Maharaj R, Clement CC, Patel MR, Brodsky JL, Young JC, Chiosis G. Heat shock protein 70 inhibitors. 1. 2,5'-thiodipyrimidine and 5-(phenylthio)pyrimidine acrylamides as irreversible binders to an allosteric site on heat shock protein 70. J Med Chem. 2014;57(4):1188-207.

78) Kapuriya N, Kakadiya R, Dong H, Kumar A, Lee PC, Zhang X, Chou TC, Lee TC, Chen CH, Lam K, Marvania B, Shah A, Su TL. Design, synthesis, and biological evaluation of novel water-soluble N-mustards as potential anticancer agents. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19:471-485.

79) Kapuriya N, Kapuriya K, Dong H, Zhang X, Chou TC, Chen YT, Lee TC, Lee WC, Tsai TH, Naliapara Y, Su TL. Novel DNA-directed alkylating agents: Design, synthesis and potent antitumor effect of phenyl N-mustard-9-anilinoacridine conjugates via a carbamate or carbonate linker. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17: 1264-1275.

80) Kapuriya N, Kapuriya K, Zhang X, Chou TC, 5 Kakadiya R, Wu YT, Tsai TH, Chen YT, Lee TC, Shah A, Naliapara Y, Su TL. Synthesis and biological activity of stable and potent antitumor agents, aniline nitrogen mustards linked to 9-anilinoacridines via a urea linkage. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16:5413-5423.

81) Knaggs S, Malkin H, Osborn HMI, Williams NAO, Yaqoob P. New prodrugs derived from 6-aminodopamine and 4-aminophenol as candidates for melanocyte-directed enzyme prodrug therapy (MDEPT). Org. Biomol. Chem. 2005, 3: 4002-4010.

82) Ko YH, Smith BL, Wang Y et al. Advanced cancers: eradication in all cases using 3-bromopyruvate therapy to deplete ATP. Biochem Biophys Res Commun 2004; 5: 324: 269-75.

83) Ko YH, Verhoeven HA, Lee MJ, Corbin DJ, Vogl TJ, Pedersen PL. A translational study "case report" on the small molecule "energy blocker" 3-bromopyruvate (3BP) as a potent anticancer agent: From bench side to bedside. J Bioenergetics Biomembranes 2012; 44 (1): 163-70.

84) Lam K. (DCB) Su T.-L. Unpublished results.

85) Le Chevalier T. Adjuvant chemotherapy for resectable non-small-cell lung cancer: where is it going？ Annal Oncol 2010; 21 (Suppl. 7): vii196-198.

86) Lenz HJ, Van Cutsem E, Khambata-Ford S, Mayer RJ, Gold P, Stella P, Mirtsching B, Cohn AL, Pippas AW, Azarnia N, Tsuchihashi Z, Mauro DJ, Rowinsky EK. Multicenter phase II and translational study of cetuximab in metastatic colorectal carcinoma refractory to irinotecan, oxaliplatin, and fluoropyrimidines. J. Clin. Oncol. 2006, 24: 4914-4921.

87) Lien K, Georgsdottir S, Sivanathan L, Chan K, Emmenegger U.. Low-dose metronomic chemotherapy: a systematic literature analysis. Eur J Cancer. 2013; 49(16):3387-95.

88) Lin LC, Chen Y.F, Lee WC, Wu YT, Tsa, T.H. Pharmacokinetics of gastrodin and its metabolite p-hydroxybenzyl alcohol in rat blood, brain and bile by microdialysis coupled to LC-MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 48: 909-917.

89) Luetke A, Meyers PA, Lewis A, Juergens H. Osteosarcoma treatment - where do we stand？ A state of the art review. Cancer Treat Rev. 2014; 40 (4): 523-532.

90) MacKenzie KL, Franco S, May C, Sadelain M, Moore MAS. Mass cultured human fibroblasts overexpressing hTERT encounter a growth crisis following an extended period of proliferation. Exp Cell Res 2000, 259: 336-350.

91) Malik IA, Mehboobali N, Iqbal MP. Effect of ifosfamide on intracellular glutathione levels in peripheral blood lymphocytes and its correlation with therapeutic response in patients with advanced ovarian cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 1997, 39: 561-565.

92) Marcucci G, Maharry K, Wu Y, et al. IDH1 and IDH2 gene mutations identify novel molecular subsets within de novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study. J Clin Oncol 2010; 28(14): 2348-2355.

93) Marks PA, Breslow R. Dimethyl sulfoxide to vorinostat: development of this histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug. Nat Biotechnol. 2007; 25(1): 84-90.

94) Mathupala SP, Ko YH, Pedersen PL. The pivotal roles of mitochondria in cancer: Warburg and beyond and encouraging prospects for effective therapies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 2010;1797 (6-7): 1225.

95) Mérino D1, Khaw SL, Glaser SP et al. Bcl-2, Bcl-x(L), and Bcl-w are not equivalent targets of ABT-737 and navitoclax (ABT-263) in lymphoid and leukemic cells. Blood. 2012; 119(24): 5807-16.

96) Monneret C. Platinum anticancer drugs. From serendipity to rational design. Ann Pharm Fr. 2011 Nov; 69(6): 286-95

97) Mulloy JC, Cammenga J, Berguido FJ, Wu K, Zhou P, Comenzo RL, Ja hnwar S, Moore MAS, Nimer SD. Maintaining the self-renewal and differentiation potential of human CD34+ hematopoietic stem cells using a single genetic element. Blood. 2003, 102: 4369-76.

98) Murray N and Turrisi AT. A review of first-line treatment for small-cell lung cancer. J Thoracic Oncol 2006; 1 (3): 270-278.

99) NSCLC Meta-analysis Collaborative, Group. Preoperative chemotherapy for non small-cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis of individual participant data. Lancet 2014; 383 (9928): 1561-71.

100) O’Brien J. Study sheds light on angiogenesis inhibitors, points to limitations, solutions. UCSF Press Release, March 2, 2009.

101) Orlando L, Cardillo A, Rocca A, Balduzzi A, Ghisini R, Peruzzotti G, et al. Prolonged clinical benefit with metronomic chemotherapy in patients with metastatic breast cancer. Anticancer Drugs (2006) 17(8): 961-7.

102) Oronsky B, Carter CA, Mackie V, et al. The War on Cancer: A Military Perspective. Frontiers in Oncology. 2015; 4: 387.

103) Oronsky BT, Reid T, Knox SJ, and Scicinski JJ. The Scarlet Letter of Alkylation: A Mini Review of Selective Alkylating Agents. Transl Oncol. 2012; 5(4): 226-229. Drug Metab Dispos. 2012 Sep; 40(9): 1810-6.

104) Osborne MR, Lawley PD, Crofton-Sleigh C, Warren W. Products from alkylation of DNA in cells by melphalan: human soft tissue sarcoma cell line RD and Escherichia coli WP2. Chem Biol Interact. 1995, 97: 287-296.

105) Ottaviani G., Jaffe N. The epidemiology of osteosarcoma. In: Jaffe N. et al. "Pediatric and Adolescent Osteosarcoma. 2009, New York: Springer.

106) Pàez-Ribes M, Pàez-Ribes M, Allen E, Hudock J, Takeda T, Okuyama H, Viñals F, Inoue M, Bergers G, Hanahan D, Casanovas O. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis.Cancer Cell. 2009, 15: 220-231.

107) Pao W, Miller V, Zakowski M, Doherty J, Politi K, Sarkaria I, Singh B, Heelan R, Rusch V, Fulton L, Mardis E, Kupfer D, Wilson R, Kris M, Varmus H. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib". Proc Nal Acad Sci USA 2004; 101, 36, 13306-13311.

108) Parise RA, Anyang BN, Eiseman JL, Egorin MJ, Covey JM, Beumer JH. Formation of active products of benzaldehyde dimethane sulfonate (NSC281612, DMS612) in human blood and plasma and their activity against renal cell carcinoma lines. Cancer Chemother Pharmacol. 2013; 71: 73-83.

109) Patel K, Ravandi F, Ma D, et al. Acute myeloid leukemia with IDH1 or IDH2 mutation: frequency and clinicopathologic features. Am J Clin Pathol 2011; 135(1): 35-45.

110) Pedersen P L. 3-bromopyruvate (3BP) a fast acting, promising, powerful, specific, and effective "small molecule" anti-cancer agent taken from labside to bedside: Introduction to a special issue". J Bioenergetics Biomembranes 2012; 44: 1-6. doi:10.1007/s 5 10863-012-9425-4.

111) Rai KR, Peterson BL, Appelbaum FR, Kolitz J, Elias L, Shepherd L, Hines J, Threatte GA, Larson RA, Cheson BD, Schiffer CA. Fludarabine compared with chlorambucil as primary therapy for chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2000; 343 (24): 1750-7.

112) Ravandi F, Patel K, Luthra R, et al. Prognostic significance of alterations in IDH enzyme isoforms in patients with AML treated with high-dose cytarabine and idarubicin. Cancer 2012; 118(10): 2665-2673.

113) Roecklein BA and Torok-Storb B. Functionally distinct human marrow stromal cell lines immortalized by transduction with the human papilloma virus E6/E7 genes. Blood 1995 Feb 15; 85(4): 997-1005.

114) Roth JA, Cristiano RG. Gene therapy for cancer: what have we done and where are we going？ J. Natl. Cancer Inst. 1997, 89:21-30.

115) Rudin CM, Hann CL Garon EB et al.Phase II Study of Single-Agent Navitoclax (ABT-and Biomarker Correlates in Patients with Relapsed Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res 2012 18 (11): 3163-3169 doi: 10.1158/1078-0432. CCR-11-3090.

116) Saito K, Matsumoto S, Devasahayam N, Subramanian S, Munasinghe JP, Morris HD, Lizak MJ, Ardenkjaer-Larsen JH, Mitchell JB, Krishna MC: Transient decrease in tumor oxygenation after intravenous administration of pyruvate. Magn Reson Med 2012, 67: 801-807.

117) Sawyers CL. The 2011 Gordon Wilson Lecture: overcoming resistance to targeted cancer drugs. Trans Am Clin Climatol Assoc. 2012; 123: 114-23; discussion 123-5.

118) Sawyers CL, van 't Veer LJ. Reliable and effective diagnostics are keys to accelerating personalized cancer medicine and transforming cancer care: a policy statement from the American Association for Cancer Research. Clin Cancer Res. 2014 ; 20(19): 4978-81.

119) Sawyers CL. Opportunities and challenges in the development of kinase inhibitor therapy for cancer. Genes Dev. 2003, 17: 2998-3010.

120) Schuringa JJ, Chung KY, Morrone G, Moore MAS. Constitutive activation of STAT5 promotes human hematopoietic stem cell self-renewal and erythroid differentiation. J Exp Med. 2004, 200: 623-635.

121) Seedhouse CH, Hunter HM, Lloyd-Lewis B, Massip A-M, Pallis M, Carter G I, Grundy M, Shang1 S, Russell NH. DNA repair contributes to the drug-resistant phenotype of primary acute myeloid leukaemia cells with FLT3 internal tandem duplications and is reversed by the FLT3 inhibitor PKC412. Leukemia, 2006, 20: 2130-2136.

122) Shah NP, Tran C, Lee FY, Chen P, Norris D, Sawyers CL. Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor. Science 2004, 305: 399-32

123) Shaykhiev et al 2013, Shaykhiev R, Wang R, Zwick RK, Hackett NR, Leung R, Moore MA, Sima CS, Chao IW, Downey RJ, Strulovici-Barel Y, Salit J, Crystal RG. Airway basal cells of healthy smokers express an embryonic stem cell signature relevant to lung cancer. Stem Cells. 2013; 31(9): 1992-2002.

124) Siddik ZH. Mechanisms of Action of Cancer Chemotherapeutic Agents: DNAInteractive Alkylating Agents and Antitumour Platinum-Based Drugs. 2005; John Wiley & Sons, Ltd.

125) Silva AS, Kam Y, Khin ZP, Minton SE, Gillies RJ, Gatenby RA. Evolutionary approaches to prolong progression-free 5 survival in breast cancer. Cancer Res 2012; 72(24): 6362-70.

126) Stevens MFG., Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig G.U, Lunt E, Newton CG. Antitumour imidazotetrazines. 1. Synthesis and chemistry of 8-carbamoyl-3-(2-chloroethyl)- imidazo- [5,1-d] 1,2,3,5-tetrazin-4(3H)-one, a novel broad-spectrum antitumour agent. J. Med. Chem. 1984, 27, 196-201.

127) Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Je mal A. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin 2015 Mar;65(2):87-108. doi: 10.3322/caac.21262. Epub 2015 Feb 4.

128) Travis WD, Brambilla E, Muller-Hermelink HK, Harris CC (Eds.): World Health Organization Classification of Tu mours. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. IARC Press: Lyon, France 2004.

129) Tsai TH, Su TL. Unpublished results.

130) Turturro F, Leary C, Stephens J, Veillon D, Lowery-Nordberg M. Caution using hypomethylating agents in myelodysplasia or myeloid leukemia with complex cytogenetics. J Clin Oncol. 2010 Aug 1; 28(22): e380-1.

131) Walters MS, Gomi K, Ashbridge B, Moore MA, Arbelaez V, Heldrich J, Ding BS, Rafii S, Staudt MR, Crystal RG. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 2013; 14:135-. doi: 10.1186/1465-9921-14-135.

132) Warshamana-Greene G, Litz J, Buchdunger E, García-Echeverría C, Hofmann F, Krystal G. The insulin-like growth factor-I receptor kinase inhibitor, N P-ADW742, sensitizes small cell lung cancer cell lines to the effects of chemotherapy. Clin Cancer Res, 2005, 11: 1563-1571.

133) Wei J, Wunderlich M, Fox C, Alvarez S, Cigudosa JC, Wilhelm JS, Zheng Y, Cancelas JA, Gu Y, Jansen M, Dimartino JF, Mulloy JC. Microenvironment Determines Lineage Fate in a Human Model of MLL-AF9 Leukemia. Cancer Cell 2008; 13: 483-495.

134) Weiss GJ, Infante JR, Chiorean EG Borad BJ, Bendell JC, JR Molina, Tibes R, Ramanathan RK, Lewandowski K, Jones SF, Lacouture ME, Langmuir VK, Lee H, Kroll S, Burris III HA. Phase 1 Study of the Safety, Tolerability, and Pharmacokinetics of TH-302, a Hypoxia-Activated Prodrug, in Patients with Advanced Solid Malignancies. Clin Cancer Res. 2011; 17(9): 2997-3004.

135) Wen VW, Wu K, Baksh S, Hinshelwood RA, Lock RB, Clarke SJ, Moore MAS, MacKenzie KL. Telomere-driven karyotypic complexity concurs with p16INK4a inactivation in TP53-competent immortal endothelial cells. Cancer Research. 2006, 66: 10691-10700.

136) Wheate NJ, Walker S, Craig GE, Oun R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions 2010; 39 (35): 8113-27.

137) Wright G, Tan B, Rosenwald A, Hurt EH, Wiestner A, Staudt LM. A gene expression based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma. Proc Nat Acad Sci 2003; 100 (17): 9991-96.

138) Wu K-D, Cho YS, Katz J, Ponomarev V Chen-Kiang S, Danishefsky SJ, Moore MAS. Investigation of anti-tumor effects of synthetic epothilone analogs in human myeloma models in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102; 10640- 10645.

139) Wunderlich M, Mulloy JC. Model systems for examining effects of leukemiaassociated oncogenes in primary human CD34+ cells via retroviral transduction. Methods Mol Biol. 2009; 538: 263-85.

Claims (4)

1. 脲基氮芥用於製備治療癌症之藥物之用途，其中該癌症係選自由白血病、小細胞肺癌(SCLC)、及肉瘤所組成之群組；其中該脲基氮芥係如下所示之化合物：

   

   其中，該白血病係選自急性骨髓性白血病、雙表型白血病、慢性淋巴細胞性白血病、及慢性骨髓性白血病所構成之群組。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該藥物係用於產生治療上明顯減少的癌細胞數目而且不會對非惡性組織產生明顯毒性。
3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該脲基氮芥被配製成一醫藥組合物。
4. 如申請專利範圍第3項之用途，該醫藥組合物進一步包含另一種抗癌活性劑。