JP2023517671A - ６－チオ－ｄＧ、チェックポイント阻害剤および放射線療法を使用するがんの逐次処置 - Google Patents

６－チオ－ｄＧ、チェックポイント阻害剤および放射線療法を使用するがんの逐次処置 Download PDF

Info

Publication number
JP2023517671A
JP2023517671A JP2022554769A JP2022554769A JP2023517671A JP 2023517671 A JP2023517671 A JP 2023517671A JP 2022554769 A JP2022554769 A JP 2022554769A JP 2022554769 A JP2022554769 A JP 2022554769A JP 2023517671 A JP2023517671 A JP 2023517671A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
thio
cancer
cells
tumor
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022554769A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021183873A5 (ja
Inventor
ジェリー シャイ
ヤン－シン フー
イルゲン メンデル
アンリ ジャン
Original Assignee
ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム filed Critical ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム
Publication of JP2023517671A publication Critical patent/JP2023517671A/ja
Publication of JPWO2021183873A5 publication Critical patent/JPWO2021183873A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A61N2005/1092—Details
    • A61N2005/1098—Enhancing the effect of the particle by an injected agent or implanted device
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

同系およびヒト化マウスがんモデルにおいて自然免疫および適応免疫依存的に腫瘍退縮をもたらす、がんを処置するための、テロメラーゼ媒介性テロメアターゲティング薬物である6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）、チェックポイント阻害剤および/または放射線療法による処置方法が、本明細書に開示される。

Description

優先権の主張
本出願は、2020年3月13日に出願された米国仮出願第62/989,041号に対する優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府による助成金支援の陳述
本発明は、National Cancer Instituteによって授与された助成金番号2P50CA070907-21A1の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本開示の分野
本開示は、医学、薬理学、分子生物学および腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本開示は、6-チオ-dG、チェックポイント阻害剤および/または放射線療法の逐次治療を使用してがんを処置するための方法および組成物に関する。
本開示の背景
免疫療法は、免疫腫瘍学分野において多くのがんの処置に革命をもたらした（Brahmer et al., 2012; Hodi et al., 2010; Ribas and Wolchok,2018; Topalian et al., 2012）。最も一般的に使用される免疫療法は、黒色腫、非小細胞肺がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、腎細胞がん、胃がん、直腸がんおよび複製中に起こるそのDNA中のエラーを修復することができない任意の固形腫瘍などの進行がんについてFDAによって承認されているPD-L1/PD-1チェックポイント遮断である（Garon et al., 2015; Ribas et al., 2016; Rizvi et al., 2015b; Socinski et al., 2018; National Cancer Institute）。免疫療法の成功にもかかわらず、免疫抑制性腫瘍微小環境、腫瘍免疫原性ならびに一次耐性および適応耐性の出現のために、多くの患者は、これらの療法にあまり応答しない（Chen and Han,2015; Gide et al., 2018）。最近の研究は、腫瘍変異およびネオアンチゲンの存在量がチェックポイント遮断に対するがん患者の応答を部分的に規定することを示しているが、十分に応答しない、高い変異およびネオアンチゲンを有するかなりの数の患者がなお存在しており（Le et al., 2017; Mandal et al., 2019; Rizvi et al., 2015a）、ネオアンチゲンは抗腫瘍免疫応答を誘発するのに十分ではないことを示唆している。したがって、より良好な免疫応答のための他の因子を同定し、患者の全生存を改善するための新しいアプローチを開発する緊急の必要性が存在する。
有効な抗腫瘍適応免疫応答の生成は、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を必要とし、抗原提示細胞の活性化は十分な自然感知に大きく依存する。自然感知は、高移動度群ボックス1タンパク質、細胞外ATPおよびストレスを受けた腫瘍細胞から放出される腫瘍DNAなどの危険信号によってしばしば提供される（Kroemer et al., 2013; Pitt et al., 2017）。最近の研究は、放射線およびDNA損傷療法における細胞質DNA感知の重要性を強調している（Deng et al., 2014; Sen et al., 2019）。例えば、核エンベロープ膜を喪失する小核（小さなDNA含有細胞小器官）の形態での、細胞質中のDNAの存在は、免疫応答の引き金を引くことができる。小核は、遺伝毒性ストレスおよび細胞分裂中の染色体誤分離の結果としての染色体損傷の産物である（Fenech et al., 2011）。細胞質DNAセンサであるcGASは、小核を認識し、GTP（グアノシン三リン酸）およびATP（アデノシン三リン酸）をセカンドメッセンジャーcGAMP（環状GMP-AMP）に変換する（Wu et al., 2013）。次いで、アダプタータンパク質であるIFN遺伝子の刺激因子（STING）が、cGAMPに結合する（Ablasser et al., 2013; Diner et al., 2013; Gao et al., 2013; Zhang et al., 2013）。この複雑な過程は、TANK結合キナーゼ1（TBK1）およびIFN調節因子3（IRF3）を活性化し（Liu et al., 2015; Tanaka and Chen,2012）、I型IFNおよびその他のサイトカインの下流の転写をさらに活性化し（（LiおよびChen、2018年）にて概説）、最終的に自然感知を増加させる。
真核生物の直鎖染色体は、染色体の安定性を維持するために不可欠であるテロメア（TTAGGG）と呼ばれる特殊な構造によってキャップされている（（Blackburn、1991）にて概説）。テロメアは、すべてのヒト染色体の最後の約10kbおよびすべてのマウス染色体の最後の12～80kbを構成する（Lansdorp et al., 1996; Zijlmans et al., 1997）。すべての体細胞ヒト細胞において、テロメアは、末端複製問題およびテロメア維持機構の欠如のために、各細胞分裂とともに短縮する（（Greider、1996）にて概説）。しかしながら、単細胞真核生物、生殖系列細胞および不死性がん細胞は、酵素テロメラーゼを活性化することによって、ほぼ常にそれらのテロメアを一定の長さに維持する（Greider and Blackburn, 1985;McEachern and Blackburn, 1996;Morin,1989; Nakamura et al., 1997;Singer and Gottschling, 1994;Yu et al., 1990）。テロメラーゼは、TTAGGGリピートを染色体の末端に付加することによってテロメアを伸長させる逆転写酵素であり、ヒト腫瘍の約90％で発現されるが、ほとんどの正常細胞では発現されない（Shay and Bacchetti, 1997）。したがって、テロメラーゼは、抗がん療法を開発するための魅力的な標的である。
ヌクレオシド類似体である6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）は、がん分野における新規かつ有効な治療アプローチである。デノボ合成されたテロメア中へのテロメラーゼによる6-チオ-dGの組込みは、テロメアDNAに対する損傷を誘導することが知られている（Mender et al., 2015a）。これは、最小限の副作用で、多くの腫瘍由来異種移植モデルにおいて迅速な腫瘍縮小または増殖停止をもたらす（Mender et al., 2018; Sengupta et al., 2018;Zhang et al., 2018）。直接的テロメラーゼ阻害剤を上回るこのテロメアを標的とする療法の最も重要な利点は、6-チオ-dGが腫瘍殺傷効果のために長い遅延期間を有しないことである。さらに、6-チオ-dGはテロメラーゼを直接阻害するのではなく、他のポリメラーゼよりもテロメラーゼによって優先的に認識され、テロメア中に組み込まれて即時のDNA鎖終結をもたらす。重要なことに、6-チオ-dGの効果は、腫瘍テロメラーゼを乗っ取って不安定なテロメアを作製することにより、最初のテロメア長に非依存的である（Mender et al., 2015b）。
本開示の概要
したがって、本開示の一局面では、処置サイクルごとに、有効量の6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程を含む、対象におけるがんを処置する方法が提供される。いくつかの態様では、がんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫の1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤またはCTLA-4阻害剤である。一態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、1つもしくは複数のCTLA-4阻害剤、1つもしくは複数のPD-1阻害剤、または1つもしくは複数のPD-L1阻害剤の組み合わせである。
いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001およびAMP-515の1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、PD-L1阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170およびBMS-9986189の1つまたは複数から選択される。
いくつかの態様では、CTLA-4阻害剤は、イピリムマブおよびトレメリムマブの1つまたは複数から選択される。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGは、治療サイクルあたり約1日間～約5日間投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤は、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される。
本明細書で使用される場合、治療サイクルという用語は、治療の投与の間の約1週間～約12週間を意味する。
本明細書に開示される方法の一態様では、6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤は、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される。
別の態様では、6-チオ-dGを対象に投与する工程であって、それに、セミプリマブ（Libtayo（登録商標））による処置が続く、工程を含む、処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群の1つまたは複数から選択される、方法が、本明細書において開示される。本方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGは、治療サイクルあたり約1日間～約5日間投与される。本方法のいくつかの態様では、セミプリマブは、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される。本方法の一態様では、6-チオ-dGおよびセミプリマブは、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される。
一態様では、6-チオ-dGを対象に投与する工程であって、それに、アテゾリズマブによる処置が続く、工程を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群の1つまたは複数から選択される、方法が、本明細書において開示される。本方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGは、治療サイクルあたり約1日間～約5日間投与される。本方法のいくつかの態様では、アテゾリズマブは、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される。本方法の一態様では、6-チオ-dGおよびアテゾリズマブは、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される。
本開示の別の局面では、6-チオ-dGを対象に投与する工程であって、それに、放射線療法と組み合わせて投与される免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程を含む、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤はPD-L1阻害剤、PD-1阻害剤またはCTAL-4阻害剤である。いくつかの態様では、PD-L1阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170およびBMS-9986189の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、PD-L1阻害剤はアテゾリズマブである。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001およびAMP-515の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、PD-1阻害剤はセミプリマブである。いくつかの態様では、CTLA-4阻害剤はイピリムマブまたはトレメリムマブである。いくつかの態様では、処置されるがんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、処置されるがんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がんまたは乳がんである。いくつかの態様では、脳がんは、成体脳がんである。いくつかの態様では、放射線療法が最初に投与され、その後、1つまたは複数のチェックポイント阻害剤が投与される。いくつかの態様では、1つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与後に、放射線療法が投与される。
開示される方法のいくつかの態様では、処置されるがんは、肺、結腸直腸、肝臓、黒色腫、膵臓、卵巣または脳（成体）である。
開示される方法のいくつかの態様では、処置されるがんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がんまたは乳がんである。
開示される方法の他の態様では、約1日間～約5日間の治療にわたって投与される6-チオ-dGの総投与量は、治療サイクルあたり約10mg～約2000mgまたは約15mg～約2000mgまたは約20mg～約2000mgまたは約10mg～約4800mgである。
開示される方法の一態様では、処置されるがんは転移性である。
開示される方法のいくつかの態様では、処置されるがんは再発性であるか、または再発する。
開示される方法のいくつかの態様では、処置されるがんは治療抵抗性である。一態様では、治療抵抗性がんはチェックポイント阻害剤治療抵抗性である。別の態様では、治療抵抗性がんは、PD-1、PD-L1および/またはCTLA-4阻害剤の1つまたは複数に対して抵抗性である。いくつかの態様では、がんは、限定されないが、エルロチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性である。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、処置される対象は、チェックポイント阻害剤治療で以前に処置されている。一態様では、対象は、PD-1、PD-L1またはCTLA-4の1つまたは複数で以前に処置されている。別の態様では、対象は、チロシンキナーゼ阻害剤治療で以前に処置されている。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGの投与とその後のチェックポイント阻害剤による処置が、少なくとも1回繰り返される。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤は全身的に投与される。他の態様では、6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤は、腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与される。一態様では、6-チオ-dGは腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与され、チェックポイント阻害剤が全身的に投与される。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍増殖の阻害をもたらす。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が処置されるがんの寛解をもたらす。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよび1つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与は、腫瘍量の低下をもたらす。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよび1つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与はがん細胞転移の阻害をもたらす。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、6-チオ-dGおよび1つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与は、腫瘍根絶をもたらす。
別の局面では、治療有効用量の6-チオ-dGを対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が続く、工程を含む、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、がんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される。いくつかの態様では、処置されるがんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がんまたは乳がんである。いくつかの態様では、脳がんは、成体脳がんである。
別の局面では、治療有効用量の6-チオ-dGを対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が先行する、工程を含む、対象におけるがんを処置する方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、がんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、脳（成体）、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される。いくつかの態様では、処置されるがんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がんまたは乳がんである。いくつかの態様では、がんは成体脳がんである。
本明細書に開示される方法の一態様では、6-チオ-dGの投与および放射線療法は少なくとも1回繰り返される。
がんは、テロメラーゼ活性を示し得る。6-チオ-dGならびにアテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170、BMS-9986189、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001AMP-515、イピルムマブおよびトレメリムマブなどのPD-1、PD-L1およびCTLA-4阻害剤は、化学療法剤、放射線療法、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与され得る。投与される6-チオ-dGの1日投与量は、約0.15mg/kg～約70mg/kgであり得る。6-チオ-dG投与とPD-L1、PD-1および/またはCTLA-4阻害剤投与との間の間隔は、約1日～約14日、例えば約1日～約4日、または約2日～約4日、または約2日～約5日、または約2日～約6日、または約2日～約7日、または約2日～約8日、または約2日～約9日、または約2日～約10日、または約2日～約11日、または約2日～約12日、または約2日～約13日であり得る。本方法は、前記対象からの成体脳がん細胞におけるテロメラーゼ活性を評価する工程をさらに含み得る。6-チオ-dGならびにPD-1、PD-L1および/またはCTLA-4阻害剤の投与は、腫瘍増殖の阻害、前記がんの寛解、腫瘍量の低下、がん細胞転移の阻害、または腫瘍根絶をもたらし得る。
がんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病または皮膚がんであり得る。がんは、転移性および/または再発性および/または治療抵抗性であり得る。治療抵抗性がんは、PD-L1、PD-1および/またはCTLA-4抵抗性など、チェックポイント阻害剤治療抵抗性であり得る。対象は、PD-L1、PD-1および/またはCTLA-4治療などのチェックポイント阻害剤治療で以前に処置されたことがあり得る。6-チオ-dGの投与と、その後のPD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤による処置は、少なくとも1回繰り返される。6-チオ-dGならびにPD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤は、全身的に投与され得るか、または腫瘍部位に局所もしくは局部投与され得る。6-チオ-dGは、PD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤と同じまたは異なる経路で投与され得る。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本開示の特定の態様を示しているが、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられていることを理解すべきである。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに実証するために含まれている。本開示は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
（図１Ａ）図1A～図1G。6-チオ-dGの治療効果はCD8＋T細胞に依存する。（図1A）MC38細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を5日間処理した。（図1Bおよび図1C）13日間、示された用量での、MC38細胞における6-チオ-dGのコロニー形成アッセイ。3日ごとに6-チオ-dGで細胞を処理し、次いで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。3つの生物学的反復の代表的な画像を図1Bに示し、定量化データを図1Cに示した。（図1Dおよび図1E）WT（図1D）またはRag1-/-（図1E）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。（図1Fおよび図1G）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗CD4（図1F）または抗CD8（図1G）を処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2～3回の独立した実験からの平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図1C）または二元配置ANOVA（図1D～G）によって決定した。図9A～図9Dも参照されたい。
（図１Ｂ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｃ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｄ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｅ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｆ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｇ）図1Aの説明を参照のこと。
（図２Ａ）図2A～図2F。6-チオ-dG処置は腫瘍特異的T細胞応答を増加させる。（図2Aおよび図2B）C57BL/6マウス（n＝4～5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の6日後、全T細胞（図2A）およびKi67＋CD8＋T細胞（図2B）の頻度について、腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図2C）MC38-OVA腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝5）を6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の3日後、H-2Kb-OVA257～264四量体を含むOVA特異的CD8＋T細胞について、腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図2Dおよび図2E）（A）と同じ実験スキームで、脾細胞を収集し、照射されたMC38腫瘍細胞で48時間再刺激した。IFN-γ産生細胞をELISPOTアッセイによって決定した。代表的なスポットを図2Dに示し、定量データ（n＝5）を図2Eに示した。（図2F）IFN-γレポーターマウス（n＝3）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の11日後、腫瘍を細かく刻み、YFP＋T細胞のフローサイトメトリー検出のために消化した。p値は、対応のない両側t検定によって決定した（図2A～C、図2Eおよび図2F）。図102A～Fも参照されたい。
（図２Ｂ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｃ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｄ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｅ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｆ）図2Aの説明を参照のこと。
（図３Ａ）図3A～図3F。6-チオ-dG処置は、樹状細胞のクロスプライミング能力を増強する。（図3A）C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗CSF1Rを処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。（図3B）Batf3-/-マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図3C）6-チオ-dG処置後のWTおよびBatf3-/-マウス（n＝5）における無腫瘍マウスのパーセンテージ。（図3D）200nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで一晩前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを精製し、ナイーブOT-1T細胞と共培養した。48時間後、上清を収集し、サイトメトリービーズアレイ（CBA）によるIFN-γ産生について試験した。（図3E）200nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで18時間前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、IFN-β ELISAのために上清を収集した。（F）Ifnar1-/-マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2～3回の独立した実験からの平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVA（図3A、図3Bおよび図3F）または対応のない両側t検定（図3C～E）によって決定した。
（図３Ｂ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｃ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｄ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｅ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｆ）図3Aの説明を参照のこと。
（図４Ａ）図4A～図4G。宿主におけるSTINGシグナル伝達は、6-チオ-dGによって誘導される自然感知のために必要である。（図4Aおよび図4B）Myd88-/-（図4A）またはTmem173-/-（図4B）マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図4Cおよび図4D）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のTmem173KO（図4C）またはMb21d1KO（図4D）MC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図4Eおよび図4F）MC38腫瘍細胞を1μMの6-チオ-dGで24時間処理した。TIF（テロメア機能不全誘発病巣）アッセイが、MC38細胞における6-チオ-dG処理によるTIFの誘導を確認する。n＝100（対照）、n＝100（6-チオ-dG）。（図4G）500nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで4時間前処理されたHCT116ヒト結腸がん細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを精製し、細胞質DNAを抽出した。DCの細胞質中のMT-CO1およびヒト18Sの相対的存在量をqPCRによって検出した。データは、2～3回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVA（A～D）または対応のない両側t検定（図4Fおよび図4G）によって決定した。図11A～図11Hも参照されたい。
（図４Ｂ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｃ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｄ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｅ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｆ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｇ）図4Aの説明を参照のこと。
（図５Ａ）図5A～5F。6-チオ-dGは、進行腫瘍モデルにおけるPD-L1遮断耐性を克服する。（図5A）MC38腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝4～5）を6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最初の処置の7日後、PD-1＋CD8＋T細胞頻度（左）およびPD-1 MFI（右）を試験した。（図5Bおよび図5C）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11日目）で処置した。50μgの抗PD-L1抗体を13および17日目に投与した。腫瘍増殖（図5B）および生存能力（図5C）を示した。（図5D）6-チオ-dG（3mg/kg、10日目、11日目）もしくは抗PD-L1（2.5kg/mg、10日目）または両方の併用処置で、MC38腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝5）を処置した。最初の処置の7日後、流入リンパ系を採取し、IFN-γ ELISPOTのために照射されたMC38腫瘍細胞またはLLC腫瘍細胞で刺激した。（図5Eおよび図5F）C57BL/6マウス（n＝5）に1×106個のLLCマウス肺腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、4、5、6および10、11日目）で処置した。8日目および13日目に200μgの抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍増殖を3～4日ごとに測定した（図5E）。6週間後、逐次処置群中の無腫瘍マウス（n＝4）および対照マウスに、5×106個のLLC（右側腹部）および5×106個のMC38（左側腹部）腫瘍細胞を再負荷した。腫瘍増殖を3～4日ごとに測定した（図5F）。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図5A、図5D）または二元配置ANOVA（図5B、図5Eおよび図5F）またはログランク検定（図5C）によって決定した。図12も参照されたい。
（図５Ｂ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｃ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｄ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｅ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｆ）図5Aの説明を参照のこと。
（図６Ａ）図6A～6E。6-チオ-dGは、ヒト化マウスモデルにおいてヒト結腸がん負荷量を低下させる。（図6A）TCGAデータベースからの、高および低TERT（テロメラーゼ逆転写酵素、テロメラーゼの触媒サブユニット）発現結腸直腸腺癌患者における全生存。（図6B）HCT116ヒト結腸がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を5日間処理した。（図6C）ヒト化マウス腫瘍モデルの模式図。（図6Dおよび図6E）NSG-SGM3マウス（n＝5）（図6D）またはヒト化NSG-SGM3マウス（n＝4）（図6E）に1×106個のHCT116腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、8、9、10日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、ログランク検定（図6A）または二元配置ANOVA（図6Dおよび図6E）によって決定した。図13A～図13Fも参照されたい。
（図６Ｂ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｃ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｄ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｅ）図6Aの説明を参照のこと。
（図７）c-GAS/STING/IFNの6-チオ-dG誘導の概略図。
（図８）図8A～図8B。6-チオ-dGとその後のPD-L1は、完全な腫瘍寛解および免疫原性記憶をもたらすことの証拠。
（図９Ａ）図9A～図9D（図1A～図1Gに関連する）。（図9A）LLCマウス肺がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を4日間処理した。（図9B）C57BL/6マウス（n＝5）に1×106個のLLC腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、4、5、6日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図9C）CT26マウス結腸がん細胞における6-チオ-dGのIC50。（図9D）BALB/Cマウス（n＝5）に5×105個のCT26腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、5、6、7日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVAによって決定した。
（図９Ｂ）図9Aの説明を参照のこと。
（図９Ｃ）図9Aの説明を参照のこと。
（図９Ｄ）図9Aの説明を参照のこと。
（図１０Ａ）図10A～図10F（図2A～図2Gに関連する）。（図10A～図10D）C57BL/6マウス（n＝4～5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最初の処置の7日後、CD45＋細胞のうちのCD8＋T細胞（図10A）および全腫瘍細胞のうちのCD8＋T細胞（図10B）について腫瘍を分析し、CD4＋Foxp3＋Treg細胞（図10C）およびNK細胞（図11D）の頻度について腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図10E）C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗NK1.1を処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。（図10F）IFN-γレポーターマウス（n＝3）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の11日後、腫瘍を細かく刻み、YFP＋T細胞のフローサイトメトリー検出のために消化した。代表的なフローサイトメトリーゲーティングを示した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図10A～D）または二元配置ANOVA（図10E）によって決定した。
（図１０Ｂ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｃ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｄ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｅ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｆ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１１Ａ）図11A～図11H（図4A～図4Gに関連する）。（図11A）0.2μMまたは1μMの6-チオ-dGで6時間前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを磁気ビーズで精製し、ウエスタンブロットに供した。（図11B）200nMの6-チオ-dGで一晩前処理されたMC38腫瘍細胞と共に野生型（WT）またはTmem173KOマウス由来のBMDCを培養し、次いで、磁気ビーズでDCを精製し、qPCRを行ってIFN-βの相対的存在量を試験した。（図11Cおよび図11D）C57BL/6マウス（n＝3）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11、12日目）で処置した。最後の注射の3日後、マウスを屠殺した;腫瘍を収集し、TIF（テロメア機能不全誘発病巣）染色のために固定した。フルオレセイン顕微鏡（100倍）によって画像を得た。赤色の点はDNA損傷（γ-H2AX）を示し、緑色の点はテロメアを示し、黄色の点はTIF（テロメア上のDNA損傷）を示す。スケールバー、10μM。（図11Eおよび図11F）6-チオ-dG処置はMC38細胞において小核を誘導した。（図11E）後期分裂終期における2つの娘細胞の代表的な写真は、MC38細胞中にテロメアシグナルならびに被覆されたおよび被覆されていない小核を含有する。緑色の点はテロメアシグナルを表し、赤色はラミンA/C（核エンベロープバイオマーカー）を表す。（図11F）48時間後での1μMの6-チオ-dG処置によって誘発された小核の定量。（図11Gおよび図11H）10万個のMC38細胞を6ウェルプレートに播種し、細胞を25μM EdUで標識した。2日後、細胞を洗い、新鮮な培地中で1μMの6-チオ-dGと共に一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗い、DCと一晩共培養した。翌日、磁気ビーズでDCを精製した。次いで、精製されたDCを固定し、免疫FISHのためにサイトスピンを行った。テロメアプローブ:緑色、EdU:赤色、DAPI:青色。自動取得システムを備えたAxio Imager Z2を用いて63倍の倍率で画像を捕捉し、ISISソフトウェア（カメラ:coolcube 1-metasystems）で分析した。
代表的な画像化（図11G）および定量化データ（図11H）が示された、n＝100。データは、2～3回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（B、FおよびH）によって決定した。
（図１１Ｂ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｃ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｄ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｅ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｆ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｇ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｈ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１２）図12（図5A～図5Gに関連する）。C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11日目）で処置した。13日目および17日目に50μgの抗PD-L1抗体を投与した。マウスの体重を測定した。データは、平均±SEMとして示した。
（図１３Ａ）図13A～図13F（図6A～図6Eに関連する）。（図13A～図13C）ヒト化マウス再構成の12週間後、マウス末梢血中のヒトCD45＋細胞およびCD3＋T細胞をフローサイトメトリーによって試験した。代表的なフローサイトメトリープロットを図13Aに示した。処置前の対照群および6-チオ-dG群におけるCD45およびCD3の頻度を図13Bおよび13Cに示した、n＝5。（図13D）A375ヒト黒色腫がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を4日間処理した。（図13E）NSG-SGM3マウス（n＝5）に2×106個のA375腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7日目および8日目）または抗PD-L1＋抗CTLA-4（200μg腹腔内、10日目および13日目）または6-チオ-dG＋抗PD-L1および抗CTLA-4の組み合わせで処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図13F）ヒト化NSG-SGM3マウス（n＝5～7）に2×106個のA375腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、13日目および14日目）または抗PD-L1＋抗CTLA-4（200μg腹腔内、16日目および19日目）または6-チオ-dG＋抗PD-L1および抗CTLA-4の組み合わせで処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、平均±SEMとして示した。p値は、対応のない両側t検定（図13Bおよび13C、有意でないp＞0.05）または二元配置ANOVA（図13F）によって決定した。
（図１３Ｂ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｃ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｄ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｅ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｆ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１４）図14は、LLC細胞由来腫瘍（NSCLC）を有するマウスにおける腫瘍体積に対する抗PD-1剤セミプリマブ（Libtayo（登録商標））との6-チオ-dGの効果を示す。投与は、6-チオ-dG3mg/kg（腹腔内）およびセミプリマブ-10mg/kg（腹腔内）であった。異なる群に、以下の表に示すように投与した。1日目（2020年12月31日）:1000K LLC細胞を35匹のB6マウスに接種した。11～13日目:実験開始。3mg/kgの6-チオ-dGおよび10mg/kgのLibtayoを本研究において使用した。
（表Ａ）投与スケジュール
Figure 2023517671000001
（図１５）図15は、LLC細胞由来腫瘍（NSCLC）を有するマウスにおける腫瘍体積に対する抗PD-1剤セミプリマブ（Libtayo（登録商標））との6-チオ-dGの効果を示す。投与は、6-チオ-dG3mg/kg（腹腔内）およびセミプリマブ-10mg/kg（腹腔内）であった。異なる群に、上の表に示すように投与した。1日目（2020年12月31日）:1000K LLC細胞を35匹のB6マウスに接種した。11～13日目:実験開始。3mg/kgの6-チオ-dGおよび10mg/kgのLibtayoを本研究において使用した。
（図１６）図16は、小細胞肺がん（SCLC）ヒト化マウスモデルにおけるPD-1剤ペンブロリズマブと組み合わせた6-チオ-dGの効果を示す。
（図１７）図17は、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。
（図１８Ａ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18A 投与スケジュール。
（図１８Ｂ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18B 最初の局所的IR、その後の6-チオ-dGでの3回投与、その後の抗PD-L1抗体での2回の処理によりインビボにおいて処理されたHCC53N肝がん細胞（p53およびNRASノックアウト）は、完全な腫瘍寛解という結果になった。
（図１８Ｃ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18C 10倍多いHCC53N細胞を再負荷したが、腫瘍が再増殖しなかったことから、免疫学的記憶が示唆される。
（図１８Ｄ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18D ナイーブマウスを試験すると、腫瘍が急速に増殖した。
詳細な説明
テロメラーゼは、腫瘍細胞中でほぼ普遍的に発現される。テロメラーゼによって媒介されるテロメアを標的とする薬物である6-チオ-dGは、テロメラーゼ陽性がん細胞中ではテロメア損傷を直接誘導するが、テロメラーゼが沈黙している正常な細胞では誘導しないことによって、最初の処置と治療に対する応答との間の遅延時間を短縮する。本研究において、本発明者らは、テロメラーゼ陽性がん細胞においてテロメアストレスを誘導する6-チオ-dGが自然感知のために迅速なDNA損傷を開始することができるかどうかを調べることを目的とした。本発明者らは、同系野生型マウスおよび遺伝子欠損マウスを使用して、6-チオ-dGがどのように自然感知の引き金を引き、6-チオ-dGがどのように宿主抗腫瘍免疫に寄与するかを評価した。重要なことに、本発明者らは、6-チオ-dGが進行腫瘍におけるPD-L1遮断耐性を克服することを実証する。予想外なことに、6-チオ-dGは、宿主STING依存的様式でDNA媒介性の自然感知および免疫応答の活性化を誘導し、改善された抗腫瘍効果をもたらした。さらに、6-チオ-dGと、逐次にこれに続く抗PD-L1治療は、進行腫瘍を完全に排除することができる。したがって、6-チオ-dGは、診療においてテロメラーゼ陽性およびPD-L1耐性がん患者に利益をもたらすことができる、腫瘍を標的とする免疫刺激薬である。
本開示のこれらおよび他の局面は、以下で詳細に説明される。
I. テロメア、テロメラーゼおよびテロメア機能不全
有糸分裂の間、細胞は細胞の遺伝物質のコピーを作製する。遺伝物質の半分は、それぞれの新しい娘細胞に移行する。1つの世代から次の世代へと情報が確実に首尾よく伝達されるようにするために、各染色体は、その「アーム」の末端に位置するテロメアと呼ばれる特別な保護キャップを有する。テロメアは、酵素テロメラーゼの存在によって制御される。
テロメアは、身体の染色体の末端にある反復DNA配列（例えば、TTAGGG）である。テロメアは15,000塩基対の長さに達することができる。テロメアは、染色体がその末端における塩基対配列を失うことを防ぐことによって機能する。テロメアは、染色体が互いに融合することも阻止する。しかしながら、細胞が分裂するたびに、テロメアの一部が失われる（通常、分裂ごとに25～200塩基対）。テロメアが短くなりすぎると、染色体が「臨界長」に達して複製することができなくなる。これは、細胞が老化し、アポトーシスと呼ばれる過程によって死滅したり、または老化したりすることを意味する。テロメア活性は、侵食および付加という2つの機構によって制御される。上述の侵食は、ラギング鎖DNA合成が最後まで完了することができないために細胞が分裂するたびに起こる。付加は、テロメラーゼの活性によって決定される。
テロメア末端トランスフェラーゼとも呼ばれるテロメラーゼは、既存の染色体の末端にTTAGGG配列を付加することによって染色体を伸長させる、タンパク質およびRNAサブユニットから構成される酵素である。テロメラーゼは、胎児組織、成体生殖細胞中に見られ、腫瘍細胞中にも見られる。テロメラーゼ活性は、発生中に調節され、体（身体）細胞中では極めて低い、ほとんど検出不可能な活性を有する。これらの体細胞は、通常はテロメラーゼを使用しないので、老化する。細胞の老化の結果が身体の老化である。テロメラーゼが細胞内で活性化されれば、細胞は成長および分裂を続ける。この「不死細胞」理論は、老化およびがんという2つの研究分野で重要である。
細胞の加齢または老化は、細胞が年を取り、成長を停止するかまたは死滅する過程である。細胞の加齢または老化は、染色体が臨界長に達する点まで染色体のテロメアが短くなることによる。細胞の老化は、ねじ巻き時計に似ている。時計が巻かれた状態を維持すれば、細胞は不死化し、新しい細胞を絶えず産生する。時計の巻きが緩めば、細胞は新しい細胞の産生を停止し、複製老化と呼ばれるものを経験するか、または死滅する。細胞は絶えず老化している。身体の細胞にそれらの複製能力を拡大させることができれば、特に、短いテロメアの遺伝に関連する疾患（テロメロパシーまたはテロメアスペクトラム障害と呼ばれる）に対していくつかの興味深い可能性を確実に生み出す。したがって、テロメラーゼ研究は、老化過程に関連する重要な発見をもたらし得る。
がん細胞は、正常な短テロメア老化現象を回避し、悪性細胞になる。悪性細胞は、制御不能に成長し、人体全体の遠い組織まで広がる腫瘍を形成するまで増殖する。テロメラーゼは、ほとんどすべてのヒトがん細胞において検出されている。これは、多くの種類の腫瘍に選択的増殖の利点を付与する。テロメラーゼ活性が停止されれば、がん細胞中のテロメアは、正常な身体細胞におけるテロメアと同様に、次第に短くなるであろう。これにより、がん細胞が発生の初期段階で制御不能に分裂することが防止される。腫瘍が既に完全に発達している場合、腫瘍を除去され得、再発を防ぐために抗テロメラーゼ療法を投与することができる。本質的に、テロメラーゼがその機能を果たすのを妨げることは、がん細胞を不死から致死に変えるであろう。しかしながら、直接的テロメラーゼ阻害剤は、処置の開始から腫瘍縮小が起こるまでの遅延期間を必要とし、増加した毒性のために臨床開発があまり進行していない。したがって、本発明は、遅延期間を短縮するが、テロメラーゼ活性が有効であることを必要とし、副作用を潜在的に低減する方法を提供する。
II. がんを処置する
A. 逐次治療のための治療剤
1. いくつかの態様では、PD-L1阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170およびBMS-9986189の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、PD-L1阻害剤はアテゾリズマブである。
アテゾリズマブ（商品名Tecentriq（登録商標））は、タンパク質、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）に対するIgG1アイソタイプの完全にヒト化された、操作されたモノクローナル抗体である。2015年には、アテゾリズマブは、いくつかのタイプの固形腫瘍に対する免疫療法として臨床試験中であった。2016年5月に、アテゾリズマブは膀胱がん処置についてFDAによって承認されたが、2017年5月に、二次膀胱がんに対する第III相試験に失敗した。2016年10月に、FDAは、尿路上皮癌および白金含有化学療法中またはその後に疾患が進行した転移性非小細胞肺がん（NSCLC）患者の処置についてアテゾリズマブを承認した。EGFRまたはALKゲノムの腫瘍異常を有する患者は、アテゾリズマブを受ける前に、これらの異常に対するFDAで承認された治療時に疾患が進行しているはずである。2018年9月には、カナダのトロントで第19回World Conference on Lung Cancer（WCLC）において発表された研究結果によると、アテゾリズマブは進行期小細胞肺がん処置での生存を延長することが発表された。2018年10月に、進行したトリプルネガティブ乳がん患者に対するnab-パクリタキセルと本薬物の併用臨床試験が終了した。2019年3月には、FDAによって承認された試験により決定されたように、アテゾリズマブは、その腫瘍がPD-L1を発現する（任意の強度のPD-L1染色された腫瘍浸潤免疫細胞が腫瘍面積の1％以上をカバーする）切除不能な局所進行性または転移性トリプルネガティブ乳がん（TNBC）の成人患者に対して、タンパク質結合パクリタキセルとの併用で米国において承認された。2019年3月には、アテゾリズマブは、カルボプラチンおよびエトポシドとの併用で、進行期小細胞肺がん（ES-SCLC）の成人患者の第一選択処置に対して米国で承認された。研究における最も一般的な有害作用は、疲労、食欲不振、悪心および感染症であった。尿路感染が最も一般的な重度の有害作用であった。
アテゾリズマブは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）およびCD80受容体（B7-1R）とのPD-L1の相互作用を遮断する。PD-L1は、ある特定の腫瘍上に高度に発現することができ、PD-L1の発現がなければがんを認識して攻撃し得る免疫細胞（特に、細胞傷害性T細胞）の低下した活性化をもたらすと考えられている。アテゾリズマブによるPD-L1の阻害は、この阻害剤効果を除去し、それによって抗腫瘍応答を生じさせることができる。これは、免疫チェックポイント阻害として知られるより一般的な戦略である、T細胞活性化に関連する阻害性シグナルを遮断するためのいくつかの方法のうちの1つである。いくつかのがん（特に膀胱）については、利益が得られる確率はPD-L1発現に関連するが、PD-L1発現を有するほとんどのがんは依然として応答せず、PD-L1発現を有しない一部のがん（約15％）は応答する。
アベルマブ（Bavencio（登録商標））は、Merck SeronoおよびPfizerによって開発された完全ヒトIgG1抗体である。アベルマブは、転移性メルケル細胞癌の処置に対して、FDAによって承認されている。アベルマブは胃がんの第III相臨床試験に失敗した。
デュルバルマブ（Imfinzi（登録商標））は、AstraZenecaによって開発された完全ヒトIgG1抗体である。デュルバルマブは、化学放射線同時併用療法後の尿路上皮癌および切除不能な非小細胞肺がんの処置に対して、FDAによって承認されている。
KN035は、現在米国、中国および日本で臨床評価中の皮下製剤を有する唯一のPD-L1抗体である。
AUNP12は、がんを処置するための臨床試験において評価されている、Aurigene and Laboratoires Pierre Fabreによって開発された最初の消化性PD-1/PD-L1阻害剤としての29マーペプチドである。
Aurigene/CurisによってPD-L1およびVISTAアンタゴニストとして発見されたCA-170は、現在、中皮腫の処置のための第I相臨床試験中である。
2. セミプリマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001およびAMP-515などのPD-1阻害剤。いくつかの態様では、PD-1阻害剤はセミプリマブまたはペンブロリズマブである。
商標名Libtayo（登録商標）で販売されているセミプリマブは、扁平上皮皮膚がん、基底細胞癌皮膚がんおよび非小細胞肺がんの処置のためのモノクローナル抗体医薬品である。セミプリマブは、プログラム死受容体-1（PD-1）に結合し、PD-1/PD-L1経路を遮断する薬物のクラスに属する。2018年9月には、セミプリマブは、治療的手術または治療的放射線の候補ではない転移性皮膚扁平上皮癌（CSCC）または局所進行性CSCCを有する人々を処置することに対して、米国食品医薬品局（FDA）によって承認された。セミプリマブは、黒色腫子宮頸がん、脳がん、頭頸部がん、腎細胞癌およびホジキンリンパ腫の処置について研究されている。
ペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブ、商標名Keytruda（登録商標）で販売されている）は、がん免疫療法において使用されるヒト化抗体である。ペンブロリズマブは、2014年に米国で医療用途について承認された。2017年に、米国食品医薬品局（FDA）は、ある特定の遺伝的異常（ミスマッチ修復不全またはマイクロサテライト不安定性）を伴う任意の切除不能なまたは転移性の固形腫瘍についてペンブロリズマブを承認した。Keytruda（登録商標）に対して承認された適応症には、現在、適応症の中でもとりわけ、転移性黒色腫、NSCLC、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫および転移性食道扁平上皮癌が含まれる。ペンブロリズマブは、静脈内へのゆっくりとした注射によって投与される。
3. 6-チオグアニンおよび6-メルカプトプリンなどのチオプリンは、現在、臨床診療において抗炎症剤、抗白血病剤および免疫抑制剤として使用されている。活性化反応において、6-チオグアニンは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）酵素によって6-チオグアノシン一リン酸に変換される。次いで、6-チオグアノシン一リン酸は、キナーゼおよびRNAレダクターゼによって6-チオ-2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸にさらに代謝され、最終的にDNA複製中にDNA鎖に組み込まれ得る。DNAに組み込まれた6-チオグアニンはまた、活性酸素種を生成し得、活性酸素種は、DNA、タンパク質およびその他の細胞高分子にさらなる損傷を引き起こし、したがって細胞複製を阻止し得る。チオプリンはいくつかの種類の白血病の処置のために臨床使用されているが、1つには増加した毒性および他の治療法の開発のために、固形腫瘍処置に対するチオプリンの有用性は制限されている。
1つの特定のチオプリンは、6-チオ-dGである。この化合物は、ヌクレオシド類似体であり、テロメラーゼによって媒介されるテロメア破壊化合物であることが判明している。したがって、がん細胞は6-チオ-dGに対して非常に感受性であり、観察されたIC50値は、治療抵抗性がんさえ含む細胞型に応じて、0.7～2.9μMの範囲である（Mender et al., 2018）。構造を以下に示す。
Figure 2023517671000002
B. 処置レジメン
本開示は、6-チオ-dG処置と、その後のPD-L1、PD-1および/またはCTLA-4治療を用いたがんの逐次処置を提供する。各処置の期間は変動し得、処置間の短い間隔が有利であると考えられる。例えば、6-チオ-dG処置は、わずか2日間であり得るが、2～4日間を含む、3日間、4日間またはそれを超える日数であり得る。PD-L1、PD-1および/またはCTLA-4処置の前の間隔は、少なくとも1日であるべきであり、14日まで、例えば2～4日であり得る。活性化されたエフェクターT細胞に対する6-チオ-dGの潜在的に有害な影響のために、6-チオ-dGとPD-L1、PD-1および/またはCTLA-4との間の重なりは回避されるべきである。
6-チオ-dGの1日投与量は、0.5mg/kg～10mg/kgであり、好ましくは静脈内または経口である。PD-L1、PD-1および/またはCTLA-4の用量は、承認された現行の投与スケジュールの間にあり、これに一致する。
C. テロメラーゼ陽性がん
テロメラーゼ陽性がんは、テロメラーゼ陰性がんより本開示の方法の影響をはるかに受けやすい。したがって、がんがテロメラーゼ陽性であるか否かを判定するために生検を試験することは、必須ではないが非常に有用である。
テロメラーゼ活性を検出するための最も一般的な方法は、テロメア反復増幅プロトコル（TRAP）であり、これは、TRAPの修飾のいくつか（液滴デジタルTRAPに対して、ddTRAPと呼ばれる）を使用して半定量的および定量的分析を行うことを可能にする。これらの修飾としては、シンチレーション近接アッセイ、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、転写増幅アッセイ、および磁気ビーズベースの抽出アッセイがある。
テロメア反復増幅プロトコルは、プライマー伸長、テロメラーゼによって合成されたDNAの増幅、および最後にその検出という3つの主要な段階に細分することができる。伸長段階では、細胞抽出物中に存在するテロメラーゼによって、テロメア反復配列がテロメア模倣オリゴヌクレオチドに付加される。テロメラーゼによって合成されたDNAのPCR増幅は、テロメア模倣およびリバースプライマーを用いて行われる。テロメラーゼによって合成されたDNA中には、異なる標識を組み込むことができる。次いで、この段階の後に検出が続く（例えば、PCR産物の電気泳動分離および画像化）。
さらに他の方法は、テロメラーゼの定量的単離、および所与の細胞量からのテロメラーゼの総活性のその後の測定を含み、テロメラーゼの総活性は適切な標準と比較することができる。テロメラーゼが単離され、インビトロで試験されると、多種多様な標識方法および検出方法を使用することができる。
D. 薬剤耐性がん
しばしば化学療法抵抗性と互換的に使用される抗新生物抵抗性とは、新生物（がん性）細胞の抵抗性、すなわち抗がん治療にもかかわらずがん細胞が生存し、成長する能力である。いくつかの事例では、がんは、多剤耐性と呼ばれる複数の薬物に対する耐性を発達させることができる。
がん細胞の不均一性という概念に根ざしており、がん細胞に耐性を付与する、固有の遺伝的特徴および薬物曝露後の獲得耐性という、抗新生物治療の失敗の2つの一般的な原因が存在する。耐性細胞の特徴には、変化した膜輸送、増強されたDNA修復、アポトーシス経路の欠陥、標的分子、タンパク質および経路機構の変化、例えば酵素的不活性化が含まれる。がんは遺伝性疾患であるので、ゲノム変化（例えば、遺伝子増幅および欠失）およびエピジェネティック修飾という2つのゲノム事象が獲得薬剤耐性の基礎に存在する。がん細胞は、抗新生物薬に対する生存を確実にするために、遺伝子、タンパク質、および変化した経路を含む様々なツールを絶えず使用している。
化学療法抵抗性と同義である抗新生物抵抗性は、異なる抗がん治療にもかかわらず生存し成長するがん細胞の能力、すなわちがん細胞の多剤耐性である。（i）がん細胞の不均一性という概念に根ざしており、最初からがん細胞に耐性を付与する、遺伝的特徴などの自然耐性;（ii）薬物曝露後の獲得耐性という、抗新生物治療の失敗の2つの一般的な原因が存在する。
がんは遺伝子疾患であるので、ゲノム変化（例えば、遺伝子増幅および欠失）およびエピジェネティック修飾という2つのゲノム事象が獲得薬剤耐性のこれらの機構の基礎に存在する。
ゲノム不安定性による染色体再編成は、遺伝子増幅および欠失を引き起こすことができる。遺伝子増幅は、染色体の領域のコピー数の増加であり、これは固形腫瘍において頻繁に発生し、変化した遺伝子発現を通じて腫瘍の進展に寄与し得る。
1993年のハムスター細胞研究は、DNA合成に関与するDHFR遺伝子中の増幅が、遺伝子の下での染色体切断から始まり、その後の架橋-切断-融合形成のサイクルが大きな染色体内反復をもたらすことを示した。がん遺伝子の過剰増幅は、化学療法に応答して起こり得、いくつかのクラスの耐性において基礎を成す機序であると考えられる。例えば、DHFR増幅はメトトレキサートに応答して起こり、TYMS（DNA合成に関与する）増幅は5-フルオロウラシルに応答して起こり、BCR-ABL増幅はメシル酸イマチニブに応答して起こる。がん患者由来の細胞中で遺伝子増幅の領域を決定することは、極めて大きな臨床的意義を有する。遺伝子欠失は、遺伝子増幅の反対であり、染色体の領域が失われ、TP53などの腫瘍抑制遺伝子を失うことによって薬剤耐性が生じる。
ゲノム不安定性は、複製フォークがその移動において妨害されるかまたは失速するときに起こり得る。これは、複製フォーク障壁、PTIP、CHD4およびPARP1などのタンパク質で起こり得、これらは通常、細胞のDNA損傷センサ、調査因子および応答因子であるBRCA1およびBRCA2によって除去される。
抗新生物薬耐性におけるエピジェネティック修飾は、遺伝子発現の調節に寄与するので、がんの発達および薬剤耐性において主要な役割を果たす。エピジェネティック制御の2つの主な種類は、DNAメチル化およびヒストンメチル化/アセチル化である。DNAメチル化は、通常は上流プロモーター領域においてDNAにメチル基を付加する過程であり、その領域でのDNA転写を停止させ、個々の遺伝子を効果的に発現停止させる。脱アセチル化などのヒストン修飾は、クロマチン形成を変化させ、大きな染色体領域を発現抑制する。遺伝子発現の正常な調節が崩壊するがん細胞においては、がん遺伝子は低メチル化を介して活性化され、腫瘍抑制因子は高メチル化を介して発現抑制される。同様に、薬剤耐性の発生において、エピジェネティック修飾は、プロ薬剤耐性遺伝子の活性化および過剰発現をもたらし得ることが示唆されている。
がん細胞株に関する研究は、MDR1遺伝子プロモーターの低メチル化（メチル化の喪失）が過剰発現および多剤耐性を引き起こすことを示した。
薬物取り込みおよび葉酸キャリア発現のないメトトレキサート耐性乳がん細胞株において、DNAメチル化阻害剤であるDACを与えると、薬物取り込みおよび葉酸キャリア発現が改善した。
黒色腫細胞におけるアルキル化薬フォテムスチンに対する獲得耐性は、MGMT遺伝子エクソンの高メチル化に関連する高いMGMT活性を示した。
イマチニブ（Gleevec（登録商標））耐性細胞株では、メチル化を介したSOCS-3遺伝子の発現停止がSTAT3タンパク質活性化を引き起こし、これが制御されない増殖を引き起こしたことが示されている。
がん細胞は、変化した膜輸送、増強されたDNA修復、アポトーシス経路の欠陥、標的分子、タンパク質および経路機構の変化、例えば酵素的不活性化によって、複数の薬物に対して耐性になり得る。
多くのクラスの抗新生物薬は、DNA、核成分などの細胞内成分および経路に対して作用し、多くのクラスの抗新生物薬はがん細胞に入る必要があることを意味する。p-糖タンパク質（P-gp）または多剤耐性タンパク質は、薬物を細胞の外に移動させることができ、それによって薬物有効性を低下または消失させるリン酸化およびグリコシル化された膜輸送体である。この輸送体タンパク質はMDR1遺伝子によってコードされ、ATP結合カセット（ABC）タンパク質とも呼ばれる。MDR1は、不規則な基質特異性を有しており、MDR1が細胞膜を横切って多くの構造的に多様な化合物、主に疎水性化合物を輸送することを可能にする。医薬品に応答してMDR1遺伝子が活性化および過剰発現されることができ、したがって多くの薬物への耐性に対する基礎を形成し得ることが研究によって見出された。がん細胞におけるMDR1遺伝子の過剰発現は、抗新生物薬の細胞内レベルを細胞殺傷レベルより下に維持するために使用される。
例えば、抗生物質リファンピシンはMDR1発現を誘導することが見出されている。異なる薬剤耐性細胞株および患者DNAでの実験により、MDR1の活性化または過剰発現を開始する遺伝子再構成が明らかになった。MDR1のエクソン226中のC3435T多型も、p-糖タンパク質活性と強く相関関係が示されている。
MDR1は、転写因子として作用するタンパク質複合体であるNF-κBを介して活性化される。ラットでは、NF-κB結合部位はmdr1b遺伝子に隣接しており、腫瘍細胞の変異されたNF-κB遺伝子または腫瘍細胞の阻害性IκB遺伝子が化学療法下において変異されるので、NF-κBは、腫瘍細胞中で活性であり得る。結腸直腸がん細胞では、NF-κBまたはMDR1の阻害は、化学療法剤に応答して、増加したアポトーシスを引き起こした。
増強されたDNA修復は、がん細胞が薬物誘発性DNA損傷を克服する能力において重要な役割を果たす。
シスプラチンなどの白金ベースの化学療法は、腫瘍細胞のDNA鎖を架橋することによって腫瘍細胞を標的とし、変異および損傷を引き起こす。このような損傷は、がん細胞においてプログラム細胞死（例えば、アポトーシス）の引き金を引くであろう。シスプラチン耐性は、がん細胞が、DNAからシスプラチンを除去し、生じた損傷を修復することによってこのような損傷を元に戻す能力の強化を発達させる場合に生じる。シスプラチン耐性細胞は、除去修復交差補完（ERCC1）遺伝子およびタンパク質の発現を上方制御する。
いくつかの化学療法はアルキル化剤である、すなわち、アルキル基をDNAに付着させてDNAが読み取られることを阻止する。O6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ（MGMT）は、DNAからアルキル基を除去するDNA修復酵素である。MGMT発現は多くのがん細胞において上方制御され、がん細胞をアルキル化剤から保護する。増加したMGMT発現は、結腸がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、乳がん、神経膠腫、骨髄腫および膵臓がんで見出されている。
TP53は、p53タンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子であり、DNA修復、細胞周期停止またはアポトーシスのいずれかによってDNA損傷に応答する。遺伝子欠失によるTP53の喪失は、DNA損傷にもかかわらず細胞が連続的に複製することを可能にし得る。DNA損傷の耐容性は、通常DNA損傷を介してアポトーシスを誘導する薬物に対する耐性の方法をがん細胞に付与することができる。
アポトーシス経路に関連する薬剤耐性に関与する他の遺伝子には、h-rasおよびbcl-2/baxが含まれる。発がん性h-rasはERCC1の発現を増加させ、増強されたDNA修復をもたらすことが見出されている（上記参照）。h-rasの阻害は、神経膠芽腫細胞におけるシスプラチン感受性を増加させることが見出された。Bcl-2は生存促進性のがん遺伝子であるので、白血病細胞（非ホジキンリンパ腫）中でのBcl-2の上方制御された発現は、化学療法剤に応答したアポトーシスの減少したレベルをもたらした。
標的療法の間、標的はしばしばそれ自体を改変し、治療がもはや有効ではない点までその発現を減少させる。この一例は、乳がんの抗エストロゲン処置に際してのエストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）の喪失である。ERおよびPRの喪失を伴う腫瘍は、もはやタモキシフェンまたは他の抗エストロゲン処置に対して応答せず、がん細胞は、エストロゲン合成阻害剤に対していくらか応答性を保つが、最終的には内分泌操作に対して非応答性となり、成長のためにエストロゲンにもはや依存しなくなる。
乳がんを処置するために使用される治療薬の別の系統は、EGFRファミリーからのヒト上皮成長因子受容体2（HER2）のようなキナーゼの標的化である。変異は、阻害剤による処置時にHER2遺伝子中にしばしば生じ、肺がん患者の約50％がEGFR-T790Mゲートキーパー変異を有することが見出された。
慢性骨髄性白血病（CML）の処置は、イマチニブと呼ばれるBCR/ABL融合遺伝子を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤を含む。イマチニブに対して耐性である一部の人々では、BCR/ABL遺伝子は、再活性化もしくは増幅されるか、または遺伝子に単一の点変異が生じている。これらの点変異は、BCR-ABLタンパク質の自己リン酸化を促進し、適切な薬物活性化のためにイマチニブによって結合されることができない活性型へとATP結合部位の安定化をもたらす。
DNA複製における酵素としてのその重要な役割のために、トポイソメラーゼはがん治療のための有益な標的であり、多くのトポイソメラーゼ阻害剤が作製されている。トポイソメラーゼレベルが減少する場合、またはトポイソメラーゼの異なるアイソフォームが細胞内に異なって分布する場合に、耐性が起こり得る。患者白血病細胞において、変異体酵素も報告されている他、トポイソメラーゼ阻害剤に対する耐性を付与する他のがんにおける変異も報告されている。
抗新生物耐性の機構の1つは、薬物代謝酵素またはキャリア分子の過剰発現である。代謝酵素の発現を増加させることにより、薬物は、次いで排泄され得る薬物コンジュゲートまたは不活性形態へより迅速に変換される。例えば、グルタチオンの求電子特性は、グルタチオンが細胞傷害剤と反応して細胞傷害剤を不活性化することを可能にするので、グルタチオンの増加した発現は薬剤耐性を促進する。いくつかの事例では、薬物を不活性形態から活性形態へと加工するために酵素が必要とされるので、薬物代謝酵素の減少した発現または発現の喪失は耐性を付与する。白血病およびリンパ腫に対して一般的に使用される化学療法であるアラビノシドは、デオキシシチジンキナーゼによってシトシンアラビノシド三リン酸に変換される。デオキシシチジンキナーゼの変異または発現の喪失は、アラビノシドに対する耐性をもたらす。これは、酵素的非活性化の一形態である。
成長因子発現レベルも、抗新生物療法に対する耐性を促進することができる。乳がんでは、薬剤耐性細胞は高レベルのIL-6を発現することが見出されたが、感受性細胞は有意なレベルの成長因子を発現しなかった。IL-6は、MDR1遺伝子発現を活性化するCCAATエンハンサー結合タンパク質転写因子を活性化する。
別の種類の抗新生物耐性は、チェックポイント阻害剤に対する耐性である。免疫チェックポイント遮断に対する一次耐性は、抗PD-1に基づく治療で処置された黒色腫患者の約40％～65％において生じる。この臨床的問題は、がん免疫サイクルの3つの段階のいずれかで有効な抗腫瘍免疫応答を誘導することができない場合に生じる。今日まで、一次耐性に関連している因子としては、上昇したレベルのベースライン血清LDH、増加したベースライン腫瘍量、ベースライン黒色腫組織試料におけるPD-L1発現の欠如、T細胞浸潤の欠如、処置中の早期に採取された黒色腫生検におけるPD-1T細胞およびPD-L1マクロファージの非存在、不十分なネオアンチゲンおよび低い遺伝子変異数、生得的抗PD-1耐性シグネチャ（IPRES）転写シグネチャの存在、またはインターフェロンシグネチャの非存在が挙げられる。
免疫療法に対する獲得耐性は、腫瘍細胞が免疫系を回避することを可能にする遺伝的形質およびエピジェネティック形質を有する腫瘍細胞の亜集団の選択が存在する場合に生じ得る。一例は、免疫療法およびサイトカイン遺伝子療法で処置された患者由来の黒色腫細胞株において報告されたB2M発現の喪失である。これはMHCクラスI発現の喪失をもたらし、したがってCD8＋T細胞による認識のその後の減少をもたらした。JAK1/2変異も、近年、黒色腫における免疫療法に対する獲得耐性の遺伝子マーカーとして同定されている。腫瘍細胞におけるこれらの変異は、IFN-γに対する減少した感受性をもたらし、最終的にはIFN-γによって誘導される細胞増殖停止を抑制する。JAK1またはJAK2をコードする遺伝子における機能喪失変異が、ベースラインおよび進行生検の全エクソーム配列決定後に再発腫瘍において見出された;すべての患者がペンブロリズマブによる処置に対して他覚所見を有し、次いで進行した。さらに、獲得耐性は個々の細胞のレベルでも起こり得、腫瘍細胞は、腫瘍微小環境内の免疫分子に応答して腫瘍細胞の遺伝子発現を変化させる。例えば、PD-L1は、T細胞によって放出されるIFN-γなどの免疫サイトカインに応答して腫瘍細胞によって上方制御され得、このため、T細胞機能を制限し、一次耐性および獲得耐性の両方で起こり得る。
III. 薬学的製剤および投与の経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物は、意図される用途に適した形態で調製される。一般に、これは、発熱物質の他、ヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
一般に、薬物を安定にし、標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝液を使用することが望まれる。本開示の水性組成物は、薬学的に許容され得る担体または水性媒体中に溶解または分散された有効量の薬物を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」という語句は、動物またはヒトに投与された場合に有害な、アレルギー性の、またはその他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、ヒトへの投与に適した医薬品などの医薬品を製剤化する際の使用に対して許容され得る溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質（agent）の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または作用物質が本開示の活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。組成物の作用物質を不活性化しない限り、補助活性成分も組成物中に組み込むことができる。
本開示の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本開示によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介し得るが、一般に全身投与を含む。これには、経口、経鼻または頬側が含まれる。あるいは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射、または腫瘍内もしくは腫瘍に局所的な、例えば腫瘍脈管構造によるものであり得る。このような組成物は、通常、上に記載されるように、薬学的に許容され得る組成物として投与されるであろう。
活性化合物はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与され得る。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中で、ならびに油中で調製することもできる。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。
注射可能な使用に適した薬学的形態には、例えば、無菌の水溶液または分散液および無菌の注射可能溶液または分散液の即時の調製のための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は、容易な注入可能性が存在する程度に無菌であり、流動性である。調製物は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの事例では、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、所望に応じて（例えば、上に列挙したような）任意の他の成分と共に適切な量の活性化合物を溶媒中に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、例えば上に列挙されるように、基本的分散媒と所望の他の成分とを含有する無菌ビヒクル中に種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分と任意のさらなる所望の成分の予め滅菌濾過された溶液から、活性成分と任意のさらなる所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。
本開示の組成物は、一般に、中性または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）酸付加塩が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導することもできる。
製剤化すると、溶液は、好ましくは、投与製剤と適合する様式で、治療上有効な量で投与される。製剤は、注射溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与され得る。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は一般に適切に緩衝され、液体希釈剤はまず、例えば十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために使用され得る。好ましくは、当業者に公知であるように、特に本開示に照らして、無菌水性媒体が使用される。実例として、単回用量を1mlの等張性NaCl溶液中に溶解し、1000mlの皮下点滴療法液に添加するか、または提案された注入部位に注射し得る（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035～1038頁および1570～1580頁を参照されたい。）。処置されている対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の対象に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics規格によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
IV. 併用療法
本開示の文脈において、6-チオ-dG/アテゾリズマブなどの抗PD-L1または6-チオ-dG/Libtayo（登録商標）などの抗PD-1または抗CTAL-4は、化学療法もしくは放射線療法の介入またはその他の処置と組み合わせて使用することができることも企図される。特に、6-チオ-dG、抗PD-L1、抗PD-1または抗CTLA-4を、がん細胞機能の異なる局面を標的とする他の療法と組み合わせることが有効であることも判明し得る。
本開示の方法および組成物を使用して、細胞を死滅させ、細胞成長を阻害し、転移を阻害し、血管新生を阻害するか、またはその他腫瘍細胞の悪性表現型を元に戻すか、もしくは低減させるために、一般に、「標的」細胞を6-チオ-dGおよび少なくとも1つの他の作用物質と接触させる。これらの組成物は、細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な一連の量または組み合わせた量で提供される。この過程は、細胞を6-チオ-dG/抗PD-L1、抗PD-1または抗CTLA-4および他の作用物質または因子と同時に接触させることを含み得る。これは、細胞を両方の作用物質を含む単一の組成物または薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を2つの異なる組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成され得、一方の組成物は本開示によるインターフェロンプロドラッグを含み、他方はその他の作用物質を含む。
あるいは、6-チオ-dG/抗PD-L1、抗PD-1または抗CTLA-4療法は、数分から数週間の範囲の間隔で他の作用物質処置に先行または後続し得る。他の作用物質とインターフェロンプロドラッグが細胞に別々に適用される態様においては、作用物質と発現構築物がなお細胞に対して有利に併用効果を発揮することができるように、一般的には、各送達間に著しい期間が経過しないように努めるであろう。このような例では、細胞を両方のモダリティと、互いの約12時間～約24時間以内に、より好ましくは互いの約6時間～約12時間以内に接触させることが想定され、わずか約12時間の遅延時間が最も好ましい。いくつかの状況において、処置のための期間を著しく延長することが望ましいことがあり得るが、この場合、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6または7）～数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が経過する。
インターフェロンプロドラッグまたは他の作用物質のいずれかの2回以上の投与が所望されることも考えられる。以下に例示されるように、6-チオ-dG/抗PD-L1、抗PD-1または抗CTLA-4療法が「A」であり、他の療法が「B」である様々な組み合わせが使用され得る。
Figure 2023517671000003
他の組み合わせも想定される。同様に、細胞死滅を達成するために、両作用物質は、細胞を死滅させるのに有効な併用量で細胞に送達される。
がん治療に適した作用物質または因子には、細胞に適用された場合にDNA損傷を誘導する任意の化学化合物または処置方法が含まれる。このような作用物質および因子には、照射、マイクロ波、電子放出などのDNA損傷を誘発する放射線および波が含まれる。「化学療法剤」または「遺伝毒性剤」とも記載される様々な化学化合物が使用され得る。これは、限局的腫瘍部位を照射することによって達成され得る;あるいは、治療有効量の薬学的組成物を対象に投与することによって、腫瘍細胞を作用物質と接触させ得る。
様々なクラスの化学療法剤が、本開示との使用のために企図される。イメテルスタットは後述されている。他の化学療法薬としては、タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）、フェソロデックス、ラロキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレル、ラソフォキシフェン、オルメロキシフェンおよびトレミフェンなどの選択的エストロゲン受容体アンタゴニスト（「SERM」）が挙げられる。作用物質カンプトテシン、アクチノマイシンDおよびマイトマイシンCは、一般的に使用される化学療法薬である。本開示はまた、放射線をベースとするか、または実際の化合物であるかを問わず、シスプラチンとのX線の使用またはエトポシドとのシスプラチンの使用など、1つまたは複数のDNA損傷剤の組み合わせの使用を包含する。作用物質は、併用治療組成物として調製され、使用され得る。
熱ショックタンパク質90は、多くの真核細胞に見られる調節タンパク質である。HSP90阻害剤は、がんの処置において有用であることが示されている。このような阻害剤には、ゲルダナマイシン、17-（アリルアミノ）-17-デメトキシゲルダナマイシン、PU-H71およびリファブチンが含まれる。
DNAを直接架橋するか、または付加物を形成する作用物質も想定される。シスプラチンなどの作用物質、および他のDNAアルキル化剤が使用され得る。シスプラチンは、がんを処置するために広く使用されており、合計3治療単位に対して、3週間ごとに5日間、20mg/m2の有効用量が臨床適用において使用されている。シスプラチンは経口的に吸収されず、したがって、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内に注射によって送達されなければならない。
DNAを損傷する作用物質には、DNA複製、有糸分裂および染色体分離を妨害する化合物も含まれる。このような化学療法化合物には、ドキソルビシンとしても知られるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが含まれる。新生物の処置のために臨床現場で広く使用されているこれらの化合物は、ドキソルビシンについては21日間隔で25～75mg/m2の範囲の用量で静脈内にボーラス注射を通じて、エトポシドについては35～50mg/m2の範囲の用量で静脈内にまたは静脈内用量の2倍で経口的に投与される。タキサンなどの微小管阻害剤も企図される。これらの分子は、イチイ属の植物によって産生されるジテルペンであり、パクリタキセルおよびドセタキセルが含まれる。
イレッサ、mTOR、哺乳類ラパマイシン標的（FK506結合タンパク質12ラパマイシン関連タンパク質1（FRAP1）としても知られる）などの上皮成長因子受容体阻害剤は、細胞成長、細胞増殖、細胞運動性、細胞生存、タンパク質合成および転写を調節するセリン/トレオニンプロテインキナーゼである。したがって、ラパマイシンおよびその類似体（「ラパログ」）は、本開示にしたがうがん治療での使用が企図される。ここで特に有用な別のEGFR阻害剤はゲフィチニブである。
別の可能な治療は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激するサイトカイン群のメンバーであるTNF-α（腫瘍壊死因子-α）である。TNFの主な役割は、免疫細胞の調節にある。TNFはまた、アポトーシス細胞死を誘導し、炎症を誘導し、腫瘍形成およびウイルス複製を阻害することができる。
核酸前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を破壊する作用物質も、DNA損傷をもたらす。したがって、多数の核酸前駆体が開発されている。広範な試験を受けており、容易に入手可能な作用物質が特に有用である。したがって、5-フルオロウラシル（5-FU）などの作用物質は、新生物組織によって優先的に使用され、この作用物質を新生物細胞への標的化に特に有用とする。非常に毒性であるが、5-FUは、局所を含む広範囲の担体で適用可能であり、しかしながら、3mg/kg/日～15mg/kg/日の範囲の用量での静脈内投与が一般的に使用されている。
DNA損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子には、一般にγ線、x線および/または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達として知られているものが含まれる。マイクロ波およびUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も企図される。これらの因子はすべて、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製と修復、および染色体の組み立てと維持に対する広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。x線の線量範囲は、長期間（3～4週間）の1日あたり50～200レントゲンの線量から、2000～6000レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度および種類ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
さらに、別個の免疫療法、ホルモン療法、毒素療法および/または手術を使用することができることも企図される。
当業者は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、第33章、特に624～652頁を参照されたい。処置されている対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の対象に対する適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics規格によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
V. 実施例
以下の実施例セクションは、様々な態様の例に関するさらなる詳細を提供する。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らによって良好に機能することが発見された技術および/または組成物を表すことを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。これらの実施例は、本明細書に記載される方法およびシステムの例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。そのようなものの非限定的な例には、以下に提示されるものが含まれるが、これらに限定されない。
実施例1-材料および方法
マウス
C57BL/6Jバックグラウンドの雌C57BL/6J、BALB/c、Myd88-/-、Tmem173-/-、Batf3-/-およびOT-1 CD8＋T細胞受容体トランスジェニックマウスならびにNSG-SMG3マウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。C57BL/6バックグラウンドのRag1-/-マウスおよびIFNレポーターマウス（Ifngtm3.1Lky/J）をUTサウスウェスタンマウスブリーディングコアから購入した。Ifnαr1-/-マウスは、University of ChicagoのDr.Anita Chongによって提供された。すべてのマウスは、特定病原体除去条件下に維持した。動物のケアおよび実験は、施設およびNational Institutes of Healthのプロトコルおよびガイドラインの下で行った。本研究は、University of Texas Southwestern Medical CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されている。
細胞株および試薬
MC38、CT26、LLC A375およびHCT116細胞をATCCから購入した。OVA遺伝子のレンチウイルス形質導入によって、MC38-OVA細胞を作製した。すべての細胞株は、マイコプラズマ混入キット（R＆D）を使用して日常的に試験され、10％熱不活性化ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中、5％CO2下、37℃で培養した。
抗CD4（GK1.5）、抗NK1.1（PK136）、抗CD8（53-5.8）および抗CSF1R（AFS98）mAbをBioXCellから購入した。抗PD-L1（アテゾリズマブ）および抗CTLA-4（イピリムマブ）は、UT Southwestern Simmons Cancer Center Pharmacyからいただいた。6-チオ-dGはMetkinen Oyから購入した。インビトロ研究のために、6-チオ-dGをDMSO/水（1:1）に溶解して、10mMストック溶液を調製した。インビボ研究のために、3mg/kgの6-チオ-dGを腹腔内注射用の5％DMSO（1×PBS中）中に調製した。使用まで、薬物を-20℃で凍結させた。
細胞生存率アッセイ
細胞増殖アッセイを用いてIC50を決定するために、96ウェルプレート中、8つの異なる点での2倍希釈系列を用いて、6-チオ-dGでマウスおよびヒトがん細胞株をスクリーニングした。薬物の添加の24時間前に細胞を蒔き、4～5日間インキュベートし、Cell Titer 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assayを製造者の説明書に従って（Promega）使用してアッセイした。ウェルあたりの細胞数は、倍加時間に反比例して、ウェルあたり1,000から10,000細胞の範囲であった。用量応答曲線を作成し、Graphpad Prismを用いてIC50を計算した。すべての試料は3つ組で分析し、標準偏差は2～3回の独立した実験からのものである。
コロニー形成アッセイ
MC38細胞を3つの異なる濃度で6ウェルプレート（1000～4000細胞/ウェル）上に播種し、3～4日ごとに様々な薬物濃度で処理した。13日間の処理後、細胞を固定し、6％グルタルアルデヒド（Fisher Scientific）＋0.5％クリスタルバイオレット（Sigma）溶液で染色した。水道水で洗浄した後、細胞を風乾し、G-BOX（Syngene、モデル:G-BOX F3）を用いて画像を捕捉した。
テロメア機能不全誘発病巣（TIF）および小核アッセイ
TIFアッセイは、テロメア配列特異的なペプチド核酸（PNA）プローブを使用した、γ-H2AX、53BP1などのDNA損傷応答因子に対する抗体およびテロメアタンパク質またはテロメアに対する抗体によるDNA損傷の共局在化検出に基づいている（Mender and Shay、2015）。簡潔には、細胞を4ウェルチャンバースライド中に播種した。翌日、細胞を、1μMの6-チオ-dGで24時間（TIFアッセイの場合）または1～3μM 6-チオ-dGで48時間（小核アッセイの場合）処理した。次いで、スライドをPBSで2回すすぎ、PBS中の4％ホルムアルデヒド（Thermo Fisher）で10分間固定した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中0.5％ TritonX-100中で10分間透過処理した。透過処理後、細胞をPBSで3回洗浄した。0.1％PBST（TritonX-100）中の10％ヤギ血清で細胞を1時間ブロックした。γ-H2AX（TIFアッセイ、マウス、1:1000）（Millipore）またはラミンA/C（小核アッセイ、マウス、1:500）（Santa Cruz）をブロッキング溶液で希釈し、細胞上で2時間インキュベートした。PBST（0.1％Triton中1×PBS）で3回洗浄し、PBSで3回洗浄した後、Alexaflour568をコンジュゲートしたヤギ抗マウス（1:500）（Invitrogen）と共に細胞を40分間インキュベートし、次いで、0.1％PBSTで5回洗浄した。PBS中の4％ホルムアルデヒドにおいて、細胞を室温で20分間固定した。70％、90％、100％エタノールでスライドを順次脱水した後、FAMをコンジュゲートしたテロメア配列（Cリッチ）特異的PNAプローブ、70％ホルムアミド、30％2×SSC、10％（w/v）MgCl2・6H2O（Fisher Sci）、核酸ハイブリダイゼーションおよび検出のための0.25％（w/v）ブロッキング試薬（Roche）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液で、ヒートブロック上80℃で7分間変性させ、その後、室温で一晩インキュベートした。スライドを70％ホルムアミド（Ambion）/0.6×SSC（Invitrogen）（2×1時間）、2×SSC（1×15分）、PBS（1×5分）で順次洗浄し、70％、90％、100％エタノールで順次脱水し、次いで、DAPIを含むVectashield封入剤（Vector Laboratories）で封入した。100倍対物レンズを使用してフルオレセイン顕微鏡で画像を捕捉した。Image Jを用いてTIFを定量した。
骨髄由来樹状細胞中のDNAの検出
細胞を前述のようにEdUで標識した（Min et al., 2019）。簡潔には、10万個のMC38細胞を6ウェルプレートに播種し、25μM EdUで標識した。2日後、細胞を洗い、1μMの6-チオ-dGで24時間処理した。細胞を再び洗い、BMDCと共に一晩共培養した。翌日、DCを磁気ビーズで選別し、洗浄し、固定し、サイトスピンを行った。次いで、新鮮な自製EdU染色溶液（1mM CuSO4、2mMアスコルビン酸を含有するPBS）中の6-カルボキシテトラメチルローダミン蛍光性アジド（Invitrogen）でスライドを30分間染色した。次いで、PBSでスライドを少なくとも1時間激しく洗浄し、次いで、「テロメア機能不全誘発病巣（TIF）および小核アッセイ」方法の部に記載されているように、FAM-TelGプローブを使用するテロメアFISH工程が続いた。自動分裂中期捕捉システムを備えたAxio Imager Z2（Coolcube1 camera）を用いて63倍の倍率で画像を捕捉し、ISISソフトウェア（Metasystems）で分析した。
免疫FISH
簡潔には、キシレン（2×5分）、100％エタノール（2×2分）、95％エタノール（1×2分）、75％エタノール（1×2分）および50％エタノール（1×2分）で5μM組織切片を脱パラフィンし、次いで、水道水で洗浄した（2×3分）。脱パラフィン処理した組織切片をクエン酸ナトリウム緩衝液（10mM クエン酸Na、0.05％Tween20、pH＝6.0）中、マイクロ波で20分間インキュベートして、抗原を賦活化した。組織切片を冷却した後、組織切片を1×PBSで5分間すすぎ、次いで、95％エタノール中で3分間脱水した。FITCをコンジュゲートしたテロメア配列（TTAGGG）3特異的PNAプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（70％ホルムアミド、30％2×SSC、10％（w/v）MgCl2・6H2O（Fisher Sci）、0.25％（w/v）ブロッキング試薬（Roche））を用いて、ヒートブロック上で、80℃で7分間変性を行った。70％ホルムアミド/0.6×SSC（3×15分）、2×SSC（1×15分）、PBS（1×5分）、PBST（PBS＋0.1％Tween20;1×5分）でスライドを順次洗浄し、ブロッキング緩衝液（PBST中4％BSA）と共に30分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中のホスホヒストンH2AX抗体（1:500）（Cell Signaling）と共に切片を室温で1時間インキュベートした。PBSTで2×5分間洗浄した後、ブロッキング緩衝液中のAlexaflour 568をコンジュゲートしたヤギ抗ウサギと共に組織切片を室温で1時間インキュベートした。PBST（3×5分）およびPBS（1×5分）で切片を順次洗浄した。DAPIを含むVectashield封入剤でスライドを封入した。100倍対物レンズを使用してフルオレセイン顕微鏡で画像を捕捉した。Image Jを用いてTIFを定量した。
腫瘍増殖および処置
100μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、マウスの右背側側腹部の皮下に合計5×105個のMC38、5×105個のCT26または1×106個のLLC細胞を接種した。腫瘍が約100mm3に増殖した時点で、担腫瘍マウスを処置群に無作為にグループ分けした。6-チオ-dG単回処置のために、MC38腫瘍およびLLC腫瘍では7、8および9日目に、CT26腫瘍については5、6、7日目に3mg/kgの6-チオ-dGを腹腔内に与えた。CSF1R、NK1.1、CD4＋およびCD8＋T細胞枯渇のために、200μgの抗体を処置開始の1日前に腹腔内注射し、次いで2週間にわたって週に2回腹腔内注射した。MC38モデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、10日目および11日目に6-チオ-dGを与え、13日目および17日目に50μgのPD-L1を腹腔内注射した。LLCモデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、4、5、6、10および11日目に6-チオ-dGを与え、8および13日目に200μgのPD-L1を腹腔内注射した。腫瘍体積を長さ（a）、幅（b）および高さ（h）によって測定し、腫瘍体積＝abh/2として計算した。
ヒト化マウス腫瘍モデル
ヒト化マウス再構成は以前に記載された（Qiao et al., 2019）。簡潔には、4週齢のNSG-SGM3雌マウスに、ヒトCD34＋細胞導入の1日前に100cGy（X-RAD 320照射装置によるX線照射）を照射した。臍帯血はUT Southwestern Parkland Hospitalから入手した。密度勾配遠心分離（Ficoll（登録商標）Paque Plus、GE healthcare）、その後、抗ヒトCD34マイクロビーズ（Stemcell）による正の免疫磁気選択によって、臍帯血からヒトCD34＋細胞を精製した。1×105個のCD34＋細胞を各レシピエントマウス中に静脈内注射した。生着の12週後に、50％を超えるヒトCD45＋細胞再構成を有するヒト化マウスおよび年齢と性別を合わせた非ヒト化マウスに、1×106個のHCT116腫瘍細胞を右側腹部の皮下に接種した。3mg/kgの6-チオ-dGを7、8および9日目に腹腔内に与えた。腫瘍体積を週に2回測定した。UTSW Human Investigation CommitteeプロトコルおよびUTSW Institutional Animal Care and Use Committeeを遵守して実験を行った。
Tmem173およびMb21d1ノックアウトMC38細胞株
CRISPR/Cas9技術によって、MC38細胞中のTmem173およびMb21d1遺伝子をノックアウトした。Tmem173に対するガイド配列
Figure 2023517671000004
およびMb21d1に対するガイド配列
Figure 2023517671000005
をpx458プラスミド（GFP選択マーカーを有する非組込みプラスミド）中にクローニングし、次いで、リポフェクタミン2000（Thermo Fisher）を使用して腫瘍細胞中に一過性に形質移入した。24時間後、GFP陽性細胞を選別し、さらに1週間培養した。次いで、選別された細胞を96ウェルプレート中に播種した。さらに1週間後、GFP陰性クローンを12ウェルプレートの中に入れ、ウエスタンブロットを行ってノックアウトクローンを同定した。最後に、実験のためにすべてのノックアウトクローンを一緒にプールした。
IFN-γ酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ELISPOT）
MC38腫瘍をC57BL/6の右側腹部に皮下注射した。6-チオ-dG単回処置のために、3mg/kgの6-チオ-dGを7、8および9日目に腹腔内に与えた。MC38モデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、3mg/kgの6-チオ-dGを10日目および11日目に与え、50μgのPD-L1を最後の処置の11.7日後に腹腔内注射し、担腫瘍マウスから腫瘍流入領域リンパ系および脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。照射したMC38腫瘍細胞および対照LLC腫瘍細胞を使用して、腫瘍特異的T細胞を再刺激した。1.5×105個の流入領域リンパ節細胞または脾細胞および7.5×104個の放射線照射された腫瘍細胞を48時間共培養し、IFN-γ ELISPOTキット（BD Bioscience）を製造者の説明書に従って使用してELISPOTアッセイを行った。CTL-ImmunoSpot（登録商標）S6 Analyzer（Cellular Technology Limited）を用いてIFN-γスポットを計数した。
骨髄樹状細胞（BMDC）およびT細胞のインビトロ共培養
骨髄（BM）細胞の単一細胞懸濁液をC57BL/6マウスの脛骨および大腿骨から収集した。BM細胞を10cmの皿に入れ、20ng/mLの組換えマウスGM-CSF（BioLegend）を含有する完全RPMI1640培地で培養した。3日目および6日目に、新鮮な培地を培養物中に添加した。BMDCを7日目に採集した。ネガティブCD8＋T細胞単離キット（Stemcell）を用いて、OT-1トランスジェニックマウスのリンパ節および脾臓からCD8＋T細胞を単離した。MC38-OVA細胞を200nMの6-チオ-dGで4時間前処理した。次いで、薬物を洗い流し、腫瘍細胞を72時間培養し続け、BMDC採集と同じ日に採集した。次いで、MC38-OVA細胞をBMDCと共に一晩共培養した。IFN-βELISA試験（PBL）のために上清を収集した。BMDCをCD11c＋ポジティブセレクションキット（Stemcell）で選別し、OT-1 CD8＋T細胞と共に48時間共培養した。上清を収集し、サイトメトリービーズアレイアッセイ（BD Biosciences）によってIFN-γを測定した。
細胞質DNA抽出および定量的リアルタイムPCR
HCT116細胞を500nMの6-チオ-dGで4時間前処理した。次いで、薬物を洗い流し、腫瘍細胞を72時間培養し続け、BMDC採集と同じ日に採集した。次いで、1:1でHCT116細胞を1×106個のBMDCと4時間混合した。BMDCを精製し、2つの等しい一定分量に分割した。Purelink Genomic DNAキット（Invitrogen）を用いて、1つの一定分量を全ゲノムDNAに対して抽出し、標準化対照としての役割を果たした。150mM NaCl、50mM HEPESおよび25mg/mLジギトニン（Sigma）を含有する100μLの細胞質抽出緩衝液に他の一定分量を再懸濁し、原形質膜透過処理のために室温で10分間インキュベートした（West et al., 2015）。次いで、細胞を遠心分離して無傷の細胞をペレット化した。細胞質上清を収集し、12000gで10分間遠心分離して残りの細胞残屑をペレット化した。次いで、Purelink Genomic DNAキット（Invitrogen）を用いて細胞質DNAを抽出した。ヒトDNAプライマーおよびマウスDNAプライマーを使用して、全細胞抽出物および細胞質画分の両方に対して定量的PCRを行った（Xu et al., 2017）。
腫瘍消化
腫瘍組織を切除し、1mg/mLコラゲナーゼI（Sigma）および0.5mg/mL DNaseI（Roche）を用いて37℃で30分間消化し、次いで腫瘍を70μm細胞ろ過器に通して未消化腫瘍の大きな断片を除去した。2mM EDTAを含有するPBSで腫瘍浸潤細胞を2回洗浄した。
フローサイトメトリー分析
細胞の単一細胞懸濁液を抗FcγIII/II受容体（クローン2.4G2）と共に15分間インキュベートして非特異的結合を遮断した後、コンジュゲートされた抗体で染色し、次いで、表記された抗体と共に暗所で4℃にて30分間インキュベートした。死細胞を排除するために、Fixable viability Dye eFlour 506またはeFlour780（eBioscience）を使用した。製造者の説明書に従ってTrue-Nuclear転写因子緩衝液セット（BioLegend）を使用することによって、Foxp3およびKi67を細胞内で染色した。CytoFLEXフローサイトメータ（Beckman Coulter,Inc）でデータを収集し、FlowJo（Tree Star Inc.,Ashland,OR）ソフトウェアを使用することによって分析した。
定量的リアルタイムPCR
異なるプライマーセット（
Figure 2023517671000006
）を用い、製造者の説明書に従って、SsoAdvanced（商標）Universal SYBR（登録商標）Green Supermix（Bio-Rad）を用いてリアルタイムPCRを行った。マウスGAPDHを内部対照として使用した。2-ΔΔCt法を用いて相対発現変化を算出した。
免疫ブロッティング
BMDCおよびMC38処置は、「骨髄樹状細胞のインビトロ共培養」と同じであった。共培養の6時間後に、CD11c＋ポジティブセレクションキット（Stemcell）でDCを単離した。タンパク質試料調製および免疫ブロット手順は、以前に記載されたように行った（Liu et al., 2019）。pSTING（Cell signaling、72971）、STING（Cell signaling、50494）、pTBK1（Cell signaling、5483）、TBK1（Cell signaling、3504）に対するウサギモノクローナル抗体を用いて、タンパク質を検出した。タンパク質のローディングは、シクロフィリンA）に対する抗体（Cell signaling、2175を用いて決定した。抗ウサギ（5％BSA中1:2000）を二次抗体のために使用した（Cell signaling、7074）。X線フィルム（GeneMate、F-9024-8X10）を使用して膜を現像した。化学発光ウエスタンブロットのために、Clarity Max Western ECL Substrate（Biorad、1705062）またはSupersignal West PicoPlus Chemiluminescent Substrate（Thermoscientific、34577）を使用した。
定量および統計解析
すべてのデータ解析は、GraphPad Prism統計ソフトウェアを用いて行い、平均±SEMとして示した。腫瘍増殖については二元配置ANOVAまたは生存についてはログランク検定またはその他の解析については対応のない両側t検定によってp値を決定した。p＜0.05の値を統計学的に有意と考えた。
実施例2-結果
6-チオ-dGの治療効果はCD8＋T細胞に依存する
異種移植片モデルを用いた以前の研究はすべて、10日間にわたる6-チオ-dGでの集中的な毎日の処置が、多くの腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を部分的に制御することができることを示した（Mender et al., 2015a;Mender et al., 2018;Zhang et al., 2018）。しかしながら、腫瘍と適応免疫系の間での相互作用に対するこの薬物の潜在的な役割は不明である。6-チオ-dGがT細胞応答のためにテロメアをベースとしたDNA感知を誘導するかどうかを調べるために、本発明者らは、まず、免疫適格宿主中のテロメラーゼ陽性マウス結腸がん細胞（MC38）に対する6-チオ-dGによる細胞生存性の阻害を明らかにした。MC38腫瘍細胞は、370nMのIC50濃度で6-チオ-dGに対して感受性である（図1A）。本発明者らはまた、独立したコロニー形成アッセイによってMC38細胞における6-チオ-dG感受性を確認した。6-チオ-dGで3日ごとに13日間処理されたMC38細胞では、0.5μMの6-チオ-dG処理によって、コロニーを形成する細胞が50％未満となった（図1Bおよび図1C）。インビボで同系マウスモデルにおいて、6-チオ-dGが腫瘍量を低下させるかどうかを評価するために、本発明者らはMC38細胞を免疫適格野生型（WT）C57BL/6マウスに皮下接種した。腫瘍接種の7日後に（腫瘍体積が約100mm3であったとき）、3mg/kgの6-チオ-dGを毎日3日間だけ投与したところ、対照腫瘍と比較して腫瘍増殖が有意に減少した（図1D）。本発明者らはまた、わずか3日の処置でテロメラーゼ陽性LLC（C57BL/6マウスに由来するルイス肺マウス癌）およびCT26（BALB/Cマウスに由来する結腸マウス癌）腫瘍モデルにおいてインビトロでの細胞生存率阻害およびインビボでの有意な腫瘍増殖遅延を観察したので、これはMC38腫瘍モデルに対する特有の応答ではなかった（図9A～図9D）。
本発明者らは、異種移植片モデルにおける集中投与戦略（5mg/kg、毎日2週間）と比較して、このような短期間の6-チオ-dGによる処置を与え、同系マウスモデルにおいてさらに良好な抗腫瘍効果を達成したので、6-チオ-dGがインビボで免疫刺激的役割を有する可能性があると推測した。したがって、本発明者らは、成熟T細胞および成熟B細胞を生成することができないRag1ノックアウトマウスに腫瘍を接種した。実際に、6-チオ-dGの治療効果は完全に減弱し（図1E）、インビボでの腫瘍制御のために、適応免疫細胞が主に必要とされることを示している。T細胞のいずれのサブセットが6-チオ-dGによって媒介される抗腫瘍効果に寄与するかを明らかにするために、本発明者らは、6-チオ-dG処置を与えながらCD4＋またはCD8＋T細胞を枯渇させ、CD4＋T細胞枯渇の軽微な影響を観察した（図1F）。しかしながら、CD8＋T細胞の枯渇は、6-チオ-dGの治療効果を完全に消失させた（図1G）。総合すると、このデータは、6-チオ-dG処置におけるCD8＋T細胞の本質的な役割を示唆すると解釈することができる。
6-チオ-dG処置は腫瘍特異的T細胞応答を増加させる
6-チオ-dGの治療効果はT細胞に依存するので、本発明者らは、6-チオ-dG処置が腫瘍微小環境中での免疫細胞拡大増殖を変化させ得ると推論した。これを試験するために、本発明者らは、6-チオ-dG処置の3つの1日用量の最後の6日後に腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の数を分析した。本発明者らは、6-チオ-dG処置後に、TIL中でのCD3＋T細胞およびCD8＋T細胞の頻度の増加を見出した（図2A、図10Aおよび図10B）。本発明者らはまた、上昇したKi67発現によって示されるCD8＋T細胞増殖の有意な上方制御を観察したが（図2B）、Treg細胞の有意な変化は観察しなかった（図10C）。腫瘍浸潤NK細胞も増加したが、本発明者らは、6-チオ-dGの治療効果に対するNK細胞枯渇の影響を見なかった（図10Dおよび図10E）。CD8枯渇実験と合わせると、これは、6-チオ-dGによって媒介される抗腫瘍効果において、NK細胞は必須ではないが、CD8＋T細胞応答は必要とされることを示唆している。
本発明者らはさらに、腫瘍組織中の抗原特異的T細胞の追跡を可能にするMC38-OVA腫瘍モデルを使用することによって、6-チオ-dG処置後の抗原特異的T細胞応答を試験した。実際に、本発明者らは、6-チオ-dG処置の6日後に、増加した腫瘍特異的CD8＋T細胞を腫瘍中に観察した（図2C）。本発明者らはまた、6-チオ-dG処置後にIFN-γ産生T細胞を測定することによって、MC38腫瘍モデルにおいて増強された腫瘍特異的細胞傷害性T細胞応答を観察した（図2Dおよび図2E）。インビボでIFN-γを産生するT細胞の能力を直接評価するために、本発明者らは、YFP発現を有するIFN-γ産生T細胞の追跡を可能にするIFN-γYFPレポーターマウスを利用した（Reinhardt et al., 2009）。6-チオ-dG処置は腫瘍中のYFP＋T細胞を有意に増加させ、T細胞の増強されたIFN-γ産生能力を示唆した（図2Fおよび図10F）。適応免疫応答の顕著な特徴は、同じ抗原が出現したときに迅速なリコール応答を開始する記憶の形成である。6-チオ-dG処置が記憶応答を誘導するかどうかを決定するために、6-チオ-dG処置後に完全に退縮した腫瘍を有するマウスを5週間休ませ、同じMC38腫瘍であるが、10倍多い腫瘍細胞を反対側の側腹部（左側腹部）に再負荷し、対照として右側腹部にLLC腫瘍細胞を接種した。ナイーブマウス（MC38細胞または6-チオ-dGに曝露されたことがない）に同じ数のMC38細胞を注射すると、腫瘍は激しく増殖した。注目すべきことに、6-チオ-dG処置によるすべての治療されたマウスは、再負荷されたMC38腫瘍を自然に拒絶した。
6-チオ-dG処置は、樹状細胞のクロスプライミング能力を増強する
DCまたはマクロファージなどの抗原提示細胞（APC）による抗原交差提示は、腫瘍特異的CD8＋T細胞活性化の原因となる。どのAPCサブセットが6-チオ-dGによって誘導されるT細胞活性化に寄与するかを調べるために、本発明者らは、まず抗CSF1R抗体を使用してマクロファージを枯渇させた。本発明者らは、マクロファージ枯渇群において6-チオ-dGがさらに良好に機能することを見出したが（図3A）、これは免疫抑制性腫瘍関連マクロファージの除去の相加的効果によって説明することができる。BATF3（塩基性ロイシンジッパーATF様転写因子3）依存性DCは、抗原特異的CD8＋T細胞のプライミングにとって決定的に重要である（Broz et al., 2014;Edelson et al., 2010）。Batf3欠損マウスにおける6-チオ-dG処置は、腫瘍増殖を部分的に遅延させたが、WTマウスと比較して有意に有効性が低かった（図3B）。注目すべきことに、WTマウスの60％は完全に無腫瘍であったが、Batf3-/-マウスでは、いずれのマウスも無腫瘍でなかった（図3C）ので、6-チオ-dGの治療効果におけるBATF3依存性DCの重要な役割が示唆される。
6-チオ-dG処理がDCのクロスプライミング能力を増強することを直接実証するために、本発明者らは、6-チオ-dGで前処理されたMC38-OVA腫瘍細胞を骨髄由来DC（BMDC）と一晩共培養した。次いで、DCを精製し、OVA257～264エピトープを認識するための特異性を有するTCRを発現するナイーブOT-1トランスジェニックCD8＋T細胞と共培養した。本発明者らは、6-チオ-dG処理群においてCD8＋T細胞によるIFN-γ産生の有意な増加を観察したが（図3D）、これは、6-チオ-dG処理後のDCの増加したクロスプライミング能力を示している。IFN-Iシグナル伝達はDCのクロスプライミング能力を促進するので（Diamond et al., 2011; Le Bon et al., 2003; Sanchez-Paulete et al., 2017）、本発明者らは、DCを6-チオ-dG処理された腫瘍細胞と共培養した後に、DCによるIFN-βの産生を試験した。実際に、IFN-β産生は、6-チオ-dG処理群において有意に増加し、DCの自然感知の増加を示した（図3E）。本発明者らは、IFN-I経路が6-チオ-dGによって媒介される抗腫瘍効果のために必須であるかどうかをさらに調査した。Ifnar1-/-マウスを使用して、本発明者らは、宿主におけるIFN-Iシグナル伝達の喪失が6-チオ-dGの抗腫瘍効果を消失させたことを示し（図3F）、このことは、6-チオ-dG処置におけるIFN-Iシグナル伝達の不可欠な役割を示している。
宿主におけるSTINGシグナル伝達は、6-チオ-dGによって誘導される自然感知のために必要である
ストレス下の腫瘍細胞は、APC中のTLR/Myd88経路に関与し、IFN-Iシグナル伝達を開始するために、危険関連分子パターン（DAMP）を放出し得る。腫瘍由来のDNAはまた、細胞質DNAを感知するcGAS/STING経路の引き金を引き、IFN-I経路を活性化することができる（Deng et al., 2014; Li et al., 2019）。どの上流経路が宿主細胞中で6-チオ-dGによって引き金が引かれたIFN-Iシグナル伝達活性化において必須であるかをさらに詳しく描くために、本発明者らは、Myd88-/-およびTmem173-/-（Tmem173はSTINGをコードする）マウス中にMC38腫瘍を接種した。6-チオ-dG処置は、Myd88-/-マウスでは腫瘍増殖を十分に制御したが、Tmem173-/-マウスでは有効性を完全に失っており（図4Aおよび図4B）、6-チオ-dGが引き金を引く自然感知における宿主STINGシグナル伝達の不可欠な役割を示唆している。本発明者らはさらに、6-チオ-dG処置が宿主STING/IFN-I経路を活性化するかどうかを調べた。本発明者らは、6-チオ-dGで前処理された腫瘍細胞との共培養後にDC中でTBK1リン酸化の増加を観察し、Tmem173 DCではリン酸化が完全に減弱した（図11A）。6-チオ-dG処理は、STING依存的様式で、DCにおけるIFN-β産生を誘導した（図11B）。以前の研究では、腫瘍内在性STINGシグナル伝達が自然感知を誘導するがん治療において決定的に重要であることが報告されたので（Sen et al., 2019; Vanpouille-Box et al., 2017）、本発明者らは、腫瘍内在性STINGシグナル伝達が6-チオ-dG処置の有効性にも寄与するかどうかを試験した。本発明者らは、CRISPR/Cas9を使用して、MC38腫瘍細胞中のTmem173およびMb21d1（Mb21d1はcGASをコードする）をノックアウトした。他の研究とは対照的に、6-チオ-dG処置は、Tmem173KOおよびMb21d1KO腫瘍細胞を有するマウスにおいて腫瘍増殖を依然として制御したので、腫瘍内在性STINGシグナル伝達は非必須の役割を果たした（図4Cおよび図4D）。
次いで、本発明者らは、6-チオ-dGで処理された腫瘍細胞がDCにおいてどのようにして自然感知の引き金を引くかを明らかにすることを試みた。6-チオ-dGはテロメアを標的とする薬物であるので、6-チオ-dGによって誘導されるテロメアストレスは、DNAを放出することによってDCの自然感知に寄与し得る。したがって、本発明者らは、まず、TIF（テロメア機能不全誘発病巣）アッセイによってテロメアストレスを分析し、6-チオ-dGがMC38細胞においてテロメア損傷を誘導することを示した（図4Eおよび図4F）。テロメアはゲノムDNAのごく一部（約1/6000）に過ぎないので、DNA損傷とテロメアが共に局在することは有意である。本発明者らはまた、MC38腫瘍担持マウス由来の6-チオ-dG処理された腫瘍組織においてTIFの同様の増加を観察した（図11Cおよび図11D）。6-チオ-dGはまた、終期の間に2つの娘細胞間に間期ブリッジを誘導し、多くがテロメア配列を含有していたので、これは、細胞が有糸分裂後に再び間期に入ったときに、多くの小核がテロメアシグナルを含有する理由を説明し得る（図11E）。これらの細胞質断片は、脆弱な核エンベロープを有する小核を形成し（図11Eおよび図11F）、最終的に危険シグナルとして認識され得る。これらのDNA断片は細胞から放出され、DCによって取り込まれ得る。
この仮説を実証するために、本発明者らは、ヒト結腸がん細胞株であるHCT116を6-チオ-dGで処理し、マウスBMDCと4時間共培養し、次いでDCを単離し、細胞質DNAを抽出した。マウスBMDCとのヒト腫瘍細胞株の短時間の共培養により、本発明者らはDNAを異なる起源から区別することができた。本発明者らは、6-チオ-dG処理後のマウスDCの細胞質中にヒトDNA（MT-CO1およびヒト18S）の増加を見出し、これは、腫瘍由来のDNAが宿主DCの中に入ることを示唆している（図4G）。6-チオ-dG処理がDCによる特有のテロメアDNAの取り込みを増加させるかどうかを決定するために、本発明者らは腫瘍細胞をEdUで標識し、次いで細胞を洗浄した。次に、本発明者らは、6-チオ-dGで処理し、次いで細胞を再び洗浄した。最後に、本発明者らは腫瘍細胞をDCと共培養し、次いで分析のためにDCを単離した。細胞質中に腫瘍DNAの取り込みを有したDC（EdU＋DC）の中で、本発明者らは、6-チオ-dG処理後にEdUとのテロメア共局在化の増加を観察し、腫瘍由来のテロメアDNAの有意な取り込みを示唆した（図11Gおよび図11H）。総合すると、本発明者らは、6-チオ-dGが、宿主細胞質のDNA感知STING/IFN-I経路の活性化を介して自然感知の引き金を引くことを実証した。
6-チオ-dGは、進行腫瘍におけるPD-L1遮断耐性を克服する
6-チオ-dG処置はCD8＋T細胞を活性化し、全CD8＋T細胞の頻度でのおよび細胞あたりでのPD-1発現も上方制御した（図5A）。PD-1は、T細胞活性化を制限する共阻害分子である。上昇したPD-1発現は、6-チオ-dG処置後に細胞傷害性CD8＋T細胞機能を最終的に阻害し得る。したがって、本発明者らは、特に単独処置の有効性を制限する複数の耐性機序を含有するより免疫抑制性の微小環境を有する進行腫瘍状況において、6-チオ-dGとPD-1/PD-L1遮断の組み合わせが、全体的な抗腫瘍免疫応答を増強し得ると推論した。6-チオ-dG単独処置は、約100mm3の比較的小さな腫瘍サイズにおいてのみ有効であったので、進行腫瘍処置のために、本発明者らは腫瘍サイズを150～200mm3に到達させ、次いで6-チオ-dGおよび/または抗PD-L1処置で処置した。このような進行がんでは、腫瘍体積は、6-チオ-dGでの1日2回の処置または抗PD-L1での2回の処置によって制御することが困難である（図5B）。しかしながら、6-チオ-dGおよび抗PD-L1の逐次投与は、腫瘍増殖を完全に阻害した（図5B）。注目すべきことに、併用処置群中のマウスのみが100％の生存率を達成し（図5C）、PD-L1遮断との6-チオ-dG処置の相乗効果を示している。さらに、本発明者らは、併用処置群中のマウスの体重減少を一切観察しなかった（図12）。本発明者はさらに、流入領域リンパ節（dLN）における腫瘍特異的T細胞応答を分析し、抗PD-L1処置が進行腫瘍におけるT細胞活性化に対してほとんど影響を及ぼさないことを見出した。対照的に、併用療法は、他の群と比較してIFN-γ産生を有意に増加させた。対照LLC腫瘍刺激群にはIFN-γスポットがほとんど存在しなかったので、免疫応答はMC38腫瘍特異的であった（図5D）。
MC38は免疫原性腫瘍モデルであることが知られている。併用療法がより低免疫原性の腫瘍モデルにおいてもPD-L1遮断耐性を克服することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、PD-L1遮断に対して耐性であることが報告されているマウスLLC腫瘍モデルを使用した（Bullock et al., 2019; Li et al., 2017）。以前の報告と一致して、抗PD-L1での単独処置は治療効果を有していなかった（図5E）。注目すべきことに、6-チオ-dGと抗PD-L1との組み合わせは、マウス腫瘍量を有意に低下させ、マウスの40％が最終的に腫瘍を完全に拒絶した（図5E）。本発明者らは、記憶応答を調べるために、腫瘍退縮の6週間後に腫瘍の存在しないマウスに再負荷を行った。すべての併用処置されたマウスはLLC腫瘍を自発的に拒絶したが、MC38腫瘍は拒絶しなかったことから、長期間持続する腫瘍特異的免疫記憶が示唆される（図5F）。これらの結果に基づくと、6-チオ-dG処置は、進行腫瘍におけるPD-L1遮断耐性を克服する。これは、診療においてPD-1/PD-L1遮断耐性の患者に利益をもたらす可能性を秘める。
6-チオ-dGは、ヒト化マウスモデルにおいてヒト結腸がん負荷量を低下させる
以前の研究は、高TERT（テロメラーゼの触媒サブユニット）発現患者が非小細胞肺がんおよびB細胞慢性リンパ性白血病などの様々ながんにおいて臨床転帰が不良であることを示した（Terrin et al., 2007; Wang et al., 2002）。このため、本発明者らは、TCGAデータベースから結腸直腸腺癌患者を分析し、TERTの異常な高発現を有する患者が、低いTERT発現を有する結腸がん患者と比較して有意により悪い全生存率を有することを見出した（図6A）。6-チオ-dGによって誘導されるテロメアストレスがより臨床的に適切なモデルにおいてがん患者に利益をもたらし得るかどうかを直接実証するために、本発明者らは、ヒト骨髄細胞のより良好な発達を支援するヒトSCF-1、GM-CSFおよびIL-3トランスジェニック発現を有するNSG-SGM3マウスを用いてヒト化マウスモデルを開発した。本発明者らは、ヒトCD34＋造血幹細胞（HSC）を用いてNSG-SGM3マウス中のヒト免疫系を再構成した。HSC移入の12週間後、ヒト化マウスは、平均60％超のヒトCD45＋細胞および循環中のヒトCD45＋細胞のうち20％超のヒトT細胞を有していた（図13A～図13C）。次いで、本発明者らは、0.73μMのIC50で6-チオ-dG処理に感受性を有するヒト結腸がん細胞株であるHCT116（図6B）をNSG-SGM3対照マウスおよびヒト化NSG-SGM3マウスに接種した。ヒト化マウスの対照群は、処置が開始される前には6-チオ-dG処置群と同様のヒト免疫細胞の構成を有していた（図13Bおよび図13C）。3用量の6-チオ-dG処置後、免疫無防備状態のマウスは、対照群と比較して有意な差を有さなかった（図6D）。特筆すべきことに、ヒト化マウスは、6-チオ-dG処置により腫瘍増殖を有意に遅延させた（図6Cおよび図6E）。次いで、本発明者らは、インビトロで6-チオ-dGに対して感受性であるヒト黒色腫細胞株A375を試験した（図13D）。本発明者らは、比較的短時間の6-チオ-dG処置を与えたので、免疫無防備状態のNSG-SGM3マウスではいかなる効果も観察しなかった（図13E）。注目すべきことに、本発明者らは、2用量の6-チオ-dGによる処置が、ヒト化マウスにおける腫瘍増殖を部分的に遅延させることを見出した。さらに、チェックポイント遮断との組み合わせは腫瘍量をさらに低下させ、6-チオ-dGによる前処置がヒト腫瘍をチェックポイント遮断に感作させることを示唆している（図13F）。いくつかの免疫細胞が欠失し、ヒトT細胞の数が限られているために、ヒト化マウスはヒト免疫を部分的に復活させるに過ぎないことを考えると、本発明者らが完全な腫瘍退縮を観察しなかったことは驚くべきことではない。
本発明者らは、6-チオ-dGによる3日の処置の後、2日後に抗PD-L1で処置すると、ルイス肺癌において完全な腫瘍寛解がもたらされることを実証した（図8A～図8B）。これは、図8Aに例示されるように極めて侵襲性の腫瘍型である。皮下に注射された腫瘍は、20日以内に1000m3超に達した。本発明者らは、抗PD-L1で処置したのみでは同じ急速な腫瘍増殖を観察した。しかしながら、6-チオ-dG（THIO）でのわずか3回の処置で、20日間有意な腫瘍制御がもたらされる。驚くべきことに、THIOとその後の抗PDL-L1（アテゾリズマブ）による処置は、完全な腫瘍退縮をもたらした。本発明者らは、治癒したマウスをさらに5週間維持し、同じマウスにさらに5回LLC腫瘍を再負荷したが、腫瘍増殖は観察されなかった。しかしながら、本発明者らがLLC治癒マウスにMC38を注射した場合、腫瘍は増殖し、抗PD-L1は影響を及ぼさなかった（図8B）。THIOで処置されたことがない対照マウスでは、対照LLC腫瘍はMC38と同様に増殖した。これは、腫瘍特異的免疫記憶を示唆する。
全体として、これらのデータは、6-チオ-dGがテロメラーゼ依存性DNA損傷を誘導し、DCによって取り込まれる腫瘍DNAを増加させることを支持すると解釈することができる。増加した細胞質DNAは、DC内在性のSTING/IFN-I経路の引き金を引き、DCのクロスプライミング能力の増強およびその後の腫瘍特異的T細胞活性化をもたらす。さらに、6-チオ-dGは、進行腫瘍におけるPD-L1遮断耐性を克服する。本研究は、診療においてがん患者の幅広い集団に利益をもたらす可能性がある新規な免疫刺激薬として6-チオ-dGを同定する。
実施例3-考察
腫瘍細胞における高いテロメラーゼ発現は、がんの発達についての予後不良因子として認識されている（Zhang et al., 2018）。ここで、本発明者らは、同系の結腸および肺マウスモデルならびにヒト化マウスがんモデルにおいて抗腫瘍免疫応答を誘導することにおけるテロメラーゼ依存性テロメアターゲティング療法（6-チオ-dG）の以前には不確定であった役割を報告する。この効果は、DC中の細胞質DNA感知STING/IFN-I経路の引き金を引くことを通じて媒介され、最終的には、DCのクロスプライミング能力およびその後の腫瘍特異的T細胞活性化を増強する。テロメラーゼは普遍的な腫瘍マーカーであり、多くの他のテロメラーゼ陽性がんに対して適用することができる可能性があるので、これは注目すべき知見である。さらに、6-チオ-dGおよび抗PD-L1の逐次投与は、PD-L1遮断耐性腫瘍におけるPD-L1耐性を克服し、診療において併用療法がPD-L1抵抗性患者に利益をもたらすことができることを示唆している。
現在の定説は、6-チオ-dG処置は主にテロメアを障害し、DNA損傷を誘導することによって腫瘍細胞を死滅させることである。本研究は、この薬物が、主としてDNA感知およびT細胞応答に依存して腫瘍を制御することも実証している。ほとんどの以前の研究は、完全な免疫系のない異種移植片モデルを使用している。これらのモデルでは、腫瘍内在性の作用または自然免疫応答の一部を研究することができるに過ぎない。たとえこれらが重要な因子であり得るとしても、T細胞は長期の腫瘍制御に不可欠である。さらに、ほとんどの以前の研究は、腫瘍細胞をより効率的に直接死滅させる高用量または集中的投薬戦略を使用する傾向があるが、免疫細胞に対する毒性または腫瘍細胞の非免疫原性死のいずれかのために、実際には、免疫応答を弱める（Galluzziら、2017;Kroemerら、2013）。また、これらの集中的投薬戦略は、しばしば腫瘍の耐性機構の出現をもたらす。本研究において、本発明者らは、担腫瘍マウス中の宿主免疫応答に対する6-チオ-dGでのより低用量かつより短い処置レジメンの影響を完全に評価するために、完全な免疫系を有する同系マウスモデルおよび臨床的により適切なヒト化マウスモデルを利用した。6-チオ-dGが免疫刺激薬であるというこの発見は、初期免疫を増幅するための免疫療法を含むより優れた組み合わせ処置の設計を可能にし得る。
蓄積しつつある研究は、腫瘍DNAによって媒介される自然感知が抗腫瘍免疫応答の誘導にとって極めて重要であり、STING/IFNI経路が主に抗腫瘍免疫応答の開始に関与するが、宿主または腫瘍自律性STINGがより不可欠であるかどうかは異なる処置レジメンに応じて決まることを示す（Deng et al., 2014; Li et al., 2019; Qiao et al., 2017; Sen et al., 2019; Vanpouille-Box et al., 2017; Woo et al., 2014）。この齟齬は、腫瘍細胞と比較した宿主の相対的なSTING活性化強度によって説明される可能性があり、例えば、腫瘍細胞はSTING経路抑制または低活性を有し得る（Xia et al., 2016）。本発明者らは、Tmem173欠損マウスでは6-チオ-dGがその有効性を完全に失ったが、Tmem173欠損腫瘍では失わなかったので、6-チオ-dG処置が引き金を引く自然感知が宿主STINGシグナル伝達依存性であることを実証した。MC38腫瘍中のSTINGシグナル伝達は活動しているので、6-チオ-dG処置後に、腫瘍内在性STINGは活性化されたが、ほとんどの腫瘍細胞は死滅したので、I型IFNはほとんど産生され得ないというのが1つの説明である。別の可能性は、腫瘍細胞中のSTING活性化を制限する内在性の機構が存在し得るということであるが、これは依然としてほとんど確定されていない。最近の報告は、STINGシグナル伝達がオートファジー活性化にも関与することができることを示したが（Gui et al., 2019; Nassour et al., 2019）、本発明者らは6-チオ-dG処置後に腫瘍細胞中にオートファジーの活性化を認めなかったので（データは示さず）、6-チオ-dGの治療効果に寄与している可能性はより低い。また、6-チオ-dGは、Ifnar1欠損マウスでは有効性を失い、IFNIシグナル伝達の関与が示唆された。しかしながら、オートファジーのSTING活性化は、IFNIシグナル伝達に非依存的である。
一般的なDNA損傷誘導アプローチ、例えば、すべての増殖している細胞にDNA損傷を非選択的に誘導する放射線療法または化学療法と比較すると、6-チオ-dGの1つの独特の特徴は、テロメラーゼを発現している細胞、主に腫瘍細胞にテロメア関連DNA損傷を特異的に誘導するが、免疫細胞およびテロメラーゼが沈黙しているその他の体細胞には影響を及ぼさないことである。重要なことに、6-チオ-dGは、デノボ合成されるテロメア中に優先的に組み込まれることができ、急速な腫瘍縮小を引き起こす。しかしながら、直接的テロメラーゼ阻害剤は、テロメラーゼ活性の阻害を通じて機能し、テロメアの漸進的短縮に依存する。対照的に、6-チオ-dGは、初期テロメア長にかかわらず急速に効果を発揮する。これは、直接的テロメラーゼ阻害剤と比較して毒性を低下させる上で極めて重要である（Gryaznov et al., 2007; Mender et al., 2015b）。本発明者らは、6-チオ-dGによって誘導されるDNA損傷がテロメアと共に顕著に局在することを示し、テロメア機能不全誘発病巣（TIF）の形成を示している。テロメアはゲノムDNAの約1/6000に過ぎないので、いずれのTIFも高度に有意である。さらに、いくつかのTIFはDCによって取り込まれ、STING依存性IFNIシグナル伝達の引き金をさらに引く。
チェックポイント遮断、特にPD-1/PD-L1遮断の圧倒的な成功にもかかわらず、診療においては、少数の患者のみが良好に応答する。一次耐性および適応耐性の両方が、PD-1/PD-L1療法の臨床的有益性を制限する（Chen and Han,2015;Gide et al., 2018; Zaretsky et al., 2016; Zou et al., 2016）。本発明者らは、適切な自然感知の欠如が腫瘍微小環境内部でのT細胞活性化を制限し得ると考えており、したがって、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方を標的とする併用療法が緊急に必要とされている。PD-L1遮断は、「ブレーキを解除する」ことによって適応免疫応答を再活性化し、一方、6-チオ-dGは「燃料を添加する」ことによって自然感知を誘導した。本発明者らは、6-チオ-dGとPD-L1遮断の組み合わせが全体的な抗腫瘍免疫応答を増強するはずであると仮定した。実際、本研究は、6-チオ-dGおよび抗PD-L1の逐次投与が、進行腫瘍およびPD-L1遮断耐性腫瘍において相乗効果を有することを示した。最適な併用レジメンに関してさらなる研究を実施すべきである。
全体として、これらの結果は、抗腫瘍免疫応答を増強する上での、テロメラーゼ依存性のテロメアターゲティング小分子薬物である6-チオ-dGの以前には確定されていなかった役割を明らかにする。機構的には、6-チオ-dGはテロメア機能不全を誘導し、細胞質DNA放出を増加させる。重要なことに、これらのテロメアDNA断片はDCによって取り込まれ、DC内在性のSTING/IFN経路を活性化し、DCの増強されたクロスプライミング能力およびその後の腫瘍特異的T細胞活性化をもたらす。さらに、進行腫瘍およびPD-L1遮断耐性腫瘍における6-チオ-dGと抗PD-L1の逐次投与の顕著な有効性を示す本研究は、併用療法を臨床試験に推進するための強力な科学的根拠を提供する。本発明者らは、これらの知見が近い将来に臨床に応用され、診療においてより多くの患者に利益をもたらすことを予想している。
本明細書に開示され、特許請求されている方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本開示の組成物および方法を特定の態様に関して説明してきたが、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法および方法の工程または工程の順序に変更が適用され得ることは当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載される作用物質は化学的かつ生理学的に関連する特定の作用物質と置き換えられ得るが、同一のまたは同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に自明なすべてのこのような類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
VI. 参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載された詳細を補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する限度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 2023517671000007
Figure 2023517671000008
Figure 2023517671000009
Figure 2023517671000010
Figure 2023517671000011
Figure 2023517671000012
Figure 2023517671000013
Figure 2023517671000014
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、処置される対象は、チェックポイント阻害剤治療で以前に処置されている。一態様では、対象は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤またはCTLA-4阻害剤の1つまたは複数で以前に処置されている。別の態様では、対象は、チロシンキナーゼ阻害剤治療で以前に処置されている。
がんは、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病または皮膚がんであり得る。がんは、転移性および/または再発性および/または治療抵抗性であり得る。治療抵抗性がんは、PD-L1阻害剤、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤抵抗性など、チェックポイント阻害剤治療抵抗性であり得る。対象は、PD-L1阻害剤治療、PD-1阻害剤治療および/またはCTLA-4阻害剤治療などのチェックポイント阻害剤治療で以前に処置されたことがあり得る。6-チオ-dGの投与と、その後のPD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤による処置は、少なくとも1回繰り返される。6-チオ-dGならびにPD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤は、全身的に投与され得るか、または腫瘍部位に局所もしくは局部投与され得る。6-チオ-dGは、PD-1、PD-L1および/またはCTLA4阻害剤と同じまたは異なる経路で投与され得る。
[本発明1001]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
[本発明1002]
免疫チェックポイント阻害剤がPD-1阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
免疫チェックポイント阻害剤がPD-L1阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
免疫チェックポイント阻害剤が、1つまたは複数のCTLA-4阻害剤と1つまたは複数のPD-1阻害剤との組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
免疫チェックポイント阻害剤が、1つまたは複数のCTLA-4阻害剤と1つまたは複数のPD-L1阻害剤との組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
投与される6-チオ-dGが、治療サイクルあたり約1日間～約5日間である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
チェックポイント阻害剤が、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、セミプリマブ（Libtayo（登録商標））による処置が続く、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
[本発明1011]
6-チオ-dGが、治療サイクルあたり約1日間～約5日間投与される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
セミプリマブ（Libtayo（登録商標））が、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される、本発明1010および1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
6-チオ-dGおよびセミプリマブ（Libtayo（登録商標））が、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される、本発明1010～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法と組み合わせて投与される免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
[本発明1015]
約1日～約5日の治療にわたって投与される6-チオ-dGの総投与量が約20～約2000mgである、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記がんが、肺、結腸直腸、肝臓、黒色腫または神経膠芽腫である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記がんが転移性である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記がんが再発性である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記がんが治療抵抗性である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記治療抵抗性がんがチェックポイント阻害剤治療抵抗性である、本発明1010の方法。
[本発明1021]
前記治療抵抗性がんが、PD-1、PD-L1およびCTLA-4阻害剤の1つまたは複数に対して耐性である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記対象がチェックポイント阻害剤治療で以前に処置されている、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記対象が、PD-1、PD-L1およびCTLA-4治療のうちの1つまたは複数で以前に処置されている、本発明1022の方法。
[本発明1024]
6-チオ-2-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）の投与とその後のチェックポイント阻害剤による処置が、少なくとも1回繰り返される、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が全身的に投与される、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1026]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与される、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1027]
6-チオ-dGが腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与され、チェックポイント阻害剤が全身的に投与される、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1028]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍増殖の阻害をもたらす、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1029]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が前記がんの寛解をもたらす、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1030]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍量の低下をもたらす、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1031]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与ががん細胞転移の阻害をもたらす、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1032]
6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍根絶をもたらす、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1033]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が続く、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
[本発明1034]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が先行する、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
[本発明1035]
前記がんが、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がん、乳がんからなる群から選択される、本発明1029または1030の方法。
[本発明1036]
6-チオ-2-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）の投与および放射線療法が少なくとも1回繰り返される、本発明1029～1031のいずれかの方法。
[本発明1037]
6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、免疫チェックポイント阻害剤および放射線療法による処置が続く、工程
を含む、対象におけるがんを処置する方法。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤はPD-L1阻害剤、PD-1阻害剤またはCTAL-4阻害剤である。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170およびBMS-9986189のうちの1つまたは複数から選択される。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤はアテゾリズマブである。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001およびAMP-515の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、放射線療法と組み合わせて投与されるセミプリマブ（Libtayo（登録商標））であり、前記がんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本開示の特定の態様を示しているが、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示としてのみ与えられていることを理解すべきである。
（図１Ａ）図1A～図1G。6-チオ-dGの治療効果はCD8＋T細胞に依存する。（図1A）MC38細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を5日間処理した。（図1Bおよび図1C）13日間、示された用量での、MC38細胞における6-チオ-dGのコロニー形成アッセイ。3日ごとに6-チオ-dGで細胞を処理し、次いで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。3つの生物学的反復の代表的な画像を図1Bに示し、定量化データを図1Cに示した。（図1Dおよび図1E）WT（図1D）またはRag1-/-（図1E）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。（図1Fおよび図1G）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗CD4（図1F）または抗CD8（図1G）を処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2～3回の独立した実験からの平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図1C）または二元配置ANOVA（図1D～G）によって決定した。図9A～図9Dも参照されたい。
（図１Ｂ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｃ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｄ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｅ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｆ）図1Aの説明を参照のこと。
（図１Ｇ）図1Aの説明を参照のこと。
（図２Ａ）図2A～図2F。6-チオ-dG処置は腫瘍特異的T細胞応答を増加させる。（図2Aおよび図2B）C57BL/6マウス（n＝4～5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の6日後、全T細胞（図2A）およびKi67＋CD8＋T細胞（図2B）の頻度について、腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図2C）MC38-OVA腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝5）を6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の3日後、H-2Kb-OVA257～264四量体を含むOVA特異的CD8＋T細胞について、腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図2Dおよび図2E）（A）と同じ実験スキームで、脾細胞を収集し、照射されたMC38腫瘍細胞で48時間再刺激した。IFN-γ産生細胞をELISPOTアッセイによって決定した。代表的なスポットを図2Dに示し、定量データ（n＝5）を図2Eに示した。（図2F）IFN-γレポーターマウス（n＝3）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の11日後、腫瘍を細かく刻み、YFP＋T細胞のフローサイトメトリー検出のために消化した。p値は、対応のない両側t検定によって決定した（図2A～C、図2Eおよび図2F）。図10A～Fも参照されたい。
（図２Ｂ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｃ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｄ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｅ）図2Aの説明を参照のこと。
（図２Ｆ）図2Aの説明を参照のこと。
（図３Ａ）図3A～図3F。6-チオ-dG処置は、樹状細胞のクロスプライミング能力を増強する。（図3A）C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗CSF1Rを処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。（図3B）Batf3-/-マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図3C）6-チオ-dG処置後のWTおよびBatf3-/-マウス（n＝5）における無腫瘍マウスのパーセンテージ。（図3D）200nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで一晩前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを精製し、ナイーブOT-1T細胞と共培養した。48時間後、上清を収集し、サイトメトリービーズアレイ（CBA）によるIFN-γ産生について試験した。（図3E）200nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで18時間前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、IFN-β ELISAのために上清を収集した。（F）Ifnar1-/-マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2～3回の独立した実験からの平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVA（図3A、図3Bおよび図3F）または対応のない両側t検定（図3C～E）によって決定した。
（図３Ｂ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｃ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｄ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｅ）図3Aの説明を参照のこと。
（図３Ｆ）図3Aの説明を参照のこと。
（図４Ａ）図4A～図4G。宿主におけるSTINGシグナル伝達は、6-チオ-dGによって誘導される自然感知のために必要である。（図4Aおよび図4B）Myd88-/-（図4A）またはTmem173-/-（図4B）マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図4Cおよび図4D）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のTmem173KO（図4C）またはMb21d1KO（図4D）MC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図4Eおよび図4F）MC38腫瘍細胞を1μMの6-チオ-dGで24時間処理した。TIF（テロメア機能不全誘発病巣）アッセイが、MC38細胞における6-チオ-dG処理によるTIFの誘導を確認する。n＝100（対照）、n＝100（6-チオ-dG）。（図4G）500nMの6-チオ-dGまたはビヒクルで4時間前処理されたHCT116ヒト結腸がん細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを精製し、細胞質DNAを抽出した。DCの細胞質中のMT-CO1およびヒト18Sの相対的存在量をqPCRによって検出した。データは、2～3回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVA（A～D）または対応のない両側t検定（図4Fおよび図4G）によって決定した。図11A～図11Hも参照されたい。
（図４Ｂ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｃ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｄ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｅ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｆ）図4Aの説明を参照のこと。
（図４Ｇ）図4Aの説明を参照のこと。
（図５Ａ）図5A～5F。6-チオ-dGは、進行腫瘍モデルにおけるPD-L1遮断耐性を克服する。（図5A）MC38腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝4～5）を6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最初の処置の7日後、PD-1＋CD8＋T細胞頻度（左）およびPD-1 MFI（右）を試験した。（図5Bおよび図5C）C57BL/6マウス（n＝5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11日目）で処置した。50μgの抗PD-L1抗体を13および17日目に投与した。腫瘍増殖（図5B）および生存能力（図5C）を示した。（図5D）6-チオ-dG（3mg/kg、10日目、11日目）もしくは抗PD-L1（2.5kg/mg、10日目）または両方の併用処置で、MC38腫瘍を有するC57BL/6マウス（n＝5）を処置した。最初の処置の7日後、流入リンパ系を採取し、IFN-γ ELISPOTのために照射されたMC38腫瘍細胞またはLLC腫瘍細胞で刺激した。（図5Eおよび図5F）C57BL/6マウス（n＝5）に1×106個のLLCマウス肺腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、4、5、6および10、11日目）で処置した。8日目および13日目に200μgの抗PD-L1抗体を投与した。腫瘍増殖を3～4日ごとに測定した（図5E）。6週間後、逐次処置群中の無腫瘍マウス（n＝4）および対照マウスに、5×106個のLLC（右側腹部）および5×106個のMC38（左側腹部）腫瘍細胞を再負荷した。腫瘍増殖を3～4日ごとに測定した（図5F）。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図5A、図5D）または二元配置ANOVA（図5B、図5Eおよび図5F）またはログランク検定（図5C）によって決定した。図12も参照されたい。
（図５Ｂ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｃ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｄ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｅ）図5Aの説明を参照のこと。
（図５Ｆ）図5Aの説明を参照のこと。
（図６Ａ）図6A～6E。6-チオ-dGは、ヒト化マウスモデルにおいてヒト結腸がん負荷量を低下させる。（図6A）TCGAデータベースからの、高および低TERT（テロメラーゼ逆転写酵素、テロメラーゼの触媒サブユニット）発現結腸直腸腺癌患者における全生存。（図6B）HCT116ヒト結腸がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を5日間処理した。（図6C）ヒト化マウス腫瘍モデルの模式図。（図6Dおよび図6E）NSG-SGM3マウス（n＝5）（図6D）またはヒト化NSG-SGM3マウス（n＝4）（図6E）に1×106個のHCT116腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、8、9、10日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、ログランク検定（図6A）または二元配置ANOVA（図6Dおよび図6E）によって決定した。図13A～図13Fも参照されたい。
（図６Ｂ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｃ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｄ）図6Aの説明を参照のこと。
（図６Ｅ）図6Aの説明を参照のこと。
（図７）c-GAS/STING/IFNの6-チオ-dG誘導の概略図。
（図８）図8A～図8B。6-チオ-dGとその後のPD-L1阻害剤は、完全な腫瘍寛解および免疫原性記憶をもたらすことの証拠。
（図９Ａ）図9A～図9D（図1A～図1Gに関連する）。（図9A）LLCマウス肺がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を4日間処理した。（図9B）C57BL/6マウス（n＝5）に1×106個のLLC腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、4、5、6日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図9C）CT26マウス結腸がん細胞における6-チオ-dGのIC50。（図9D）BALB/Cマウス（n＝5）に5×105個のCT26腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、5、6、7日目）で処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、二元配置ANOVAによって決定した。
（図９Ｂ）図9Aの説明を参照のこと。
（図９Ｃ）図9Aの説明を参照のこと。
（図９Ｄ）図9Aの説明を参照のこと。
（図１０Ａ）図10A～図10F（図2A～図2Gに関連する）。（図10A～図10D）C57BL/6マウス（n＝4～5）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最初の処置の7日後、CD45＋細胞のうちのCD8＋T細胞（図10A）および全腫瘍細胞のうちのCD8＋T細胞（図10B）について腫瘍を分析し、CD4＋Foxp3＋Treg細胞（図10C）およびNK細胞（図11D）の頻度について腫瘍浸潤T細胞を分析した。（図10E）C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。200μgの抗NK1.1を処置開始の1日前に投与し、次いで3週間にわたって週に2回投与した。（図10F）IFN-γレポーターマウス（n＝3）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7、8、9日目）で処置した。最後の処置の11日後、腫瘍を細かく刻み、YFP＋T細胞のフローサイトメトリー検出のために消化した。代表的なフローサイトメトリーゲーティングを示した。データは、2回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（図10A～D）または二元配置ANOVA（図10E）によって決定した。
（図１０Ｂ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｃ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｄ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｅ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１０Ｆ）図10Aの説明を参照のこと。
（図１１Ａ）図11A～図11H（図4A～図4Gに関連する）。（図11A）0.2μMまたは1μMの6-チオ-dGで6時間前処理されたMC38腫瘍細胞と共にBMDCを培養し、次いでDCを磁気ビーズで精製し、ウエスタンブロットに供した。（図11B）200nMの6-チオ-dGで一晩前処理されたMC38腫瘍細胞と共に野生型（WT）またはTmem173KOマウス由来のBMDCを培養し、次いで、磁気ビーズでDCを精製し、qPCRを行ってIFN-βの相対的存在量を試験した。（図11Cおよび図11D）C57BL/6マウス（n＝3）に、5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11、12日目）で処置した。最後の注射の3日後、マウスを屠殺した;腫瘍を収集し、TIF（テロメア機能不全誘発病巣）染色のために固定した。フルオレセイン顕微鏡（100倍）によって画像を得た。赤色の点はDNA損傷（γ-H2AX）を示し、緑色の点はテロメアを示し、黄色の点はTIF（テロメア上のDNA損傷）を示す。スケールバー、10μM。（図11Eおよび図11F）6-チオ-dG処置はMC38細胞において小核を誘導した。（図11E）後期分裂終期における2つの娘細胞の代表的な写真は、MC38細胞中にテロメアシグナルならびに被覆されたおよび被覆されていない小核を含有する。緑色の点はテロメアシグナルを表し、赤色はラミンA/C（核エンベロープバイオマーカー）を表す。（図11F）48時間後での1μMの6-チオ-dG処置によって誘発された小核の定量。（図11Gおよび図11H）10万個のMC38細胞を6ウェルプレートに播種し、細胞を25μM EdUで標識した。2日後、細胞を洗い、新鮮な培地中で1μMの6-チオ-dGと共に一晩インキュベートした。次いで、細胞を洗い、DCと一晩共培養した。翌日、磁気ビーズでDCを精製した。次いで、精製されたDCを固定し、免疫FISHのためにサイトスピンを行った。テロメアプローブ:緑色、EdU:赤色、DAPI:青色。自動取得システムを備えたAxio Imager Z2を用いて63倍の倍率で画像を捕捉し、ISISソフトウェア（カメラ:coolcube 1-metasystems）で分析した。
代表的な画像化（図11G）および定量化データ（図11H）が示された、n＝100。データは、2～3回の独立した実験の平均±SEMとして示された。p値は、対応のない両側t検定（B、FおよびH）によって決定した。
（図１１Ｂ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｃ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｄ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｅ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｆ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｇ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１１Ｈ）図11Aの説明を参照のこと。
（図１２）図12（図5A～図5Gに関連する）。C57BL/6マウス（n＝5）に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、10、11日目）で処置した。13日目および17日目に50μgの抗PD-L1抗体を投与した。マウスの体重を測定した。データは、平均±SEMとして示した。
（図１３Ａ）図13A～図13F（図6A～図6Eに関連する）。（図13A～図13C）ヒト化マウス再構成の12週間後、マウス末梢血中のヒトCD45＋細胞およびCD3＋T細胞をフローサイトメトリーによって試験した。代表的なフローサイトメトリープロットを図13Aに示した。処置前の対照群および6-チオ-dG群におけるCD45およびCD3の頻度を図13Bおよび13Cに示した、n＝5。（図13D）A375ヒト黒色腫がん細胞における6-チオ-dGの細胞生存率（IC50）。6-チオ-dGで細胞を4日間処理した。（図13E）NSG-SGM3マウス（n＝5）に2×106個のA375腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、7日目および8日目）または抗PD-L1＋抗CTLA-4（200μg腹腔内、10日目および13日目）または6-チオ-dG＋抗PD-L1および抗CTLA-4の組み合わせで処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。（図13F）ヒト化NSG-SGM3マウス（n＝5～7）に2×106個のA375腫瘍細胞を接種し、6-チオ-dG（3mg/kg、13日目および14日目）または抗PD-L1＋抗CTLA-4（200μg腹腔内、16日目および19日目）または6-チオ-dG＋抗PD-L1および抗CTLA-4の組み合わせで処置した。腫瘍増殖を3日ごとに測定した。データは、平均±SEMとして示した。p値は、対応のない両側t検定（図13Bおよび13C、有意でないp＞0.05）または二元配置ANOVA（図13F）によって決定した。
（図１３Ｂ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｃ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｄ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｅ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１３Ｆ）図13Aの説明を参照のこと。
（図１４）図14は、LLC細胞由来腫瘍（NSCLC）を有するマウスにおける腫瘍体積に対する抗PD-1剤セミプリマブ（Libtayo（登録商標））との6-チオ-dGの効果を示す。投与は、6-チオ-dG3mg/kg（腹腔内）およびセミプリマブ-10mg/kg（腹腔内）であった。異なる群に、以下の表に示すように投与した。1日目（2020年12月31日）:1000K LLC細胞を35匹のB6マウスに接種した。11～13日目:実験開始。3mg/kgの6-チオ-dGおよび10mg/kgのLibtayoを本研究において使用した。
（表Ａ）投与スケジュール
Figure 2023517671000087
（図１５）図15は、LLC細胞由来腫瘍（NSCLC）を有するマウスにおける腫瘍体積に対する抗PD-1剤セミプリマブ（Libtayo（登録商標））との6-チオ-dGの効果を示す。投与は、6-チオ-dG3mg/kg（腹腔内）およびセミプリマブ-10mg/kg（腹腔内）であった。異なる群に、上の表に示すように投与した。1日目（2020年12月31日）:1000K LLC細胞を35匹のB6マウスに接種した。11～13日目:実験開始。3mg/kgの6-チオ-dGおよび10mg/kgのLibtayoを本研究において使用した。
（図１６）図16は、小細胞肺がん（SCLC）ヒト化マウスモデルにおけるPD-1剤ペンブロリズマブと組み合わせた6-チオ-dGの効果を示す。
（図１７）図17は、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。
（図１８Ａ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18A 投与スケジュール。
（図１８Ｂ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18B 最初の局所的IR、その後の6-チオ-dGでの3回投与、その後の抗PD-L1抗体での2回の処理によりインビボにおいて処理されたHCC53N肝がん細胞（p53およびNRASノックアウト）は、完全な腫瘍寛解という結果になった。
（図１８Ｃ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18C 10倍多いHCC53N細胞を再負荷したが、腫瘍が再増殖しなかったことから、免疫学的記憶が示唆される。
（図１８Ｄ）図18A～図18Dは、HCCマウスモデルにおけるPD-L1阻害剤および放射線と組み合わせた6-チオ-dGを示す。図18D ナイーブマウスを試験すると、腫瘍が急速に増殖した。
AUNP12は、がんを処置するための臨床試験において評価されている、Aurigene and Laboratoires Pierre Fabreによって開発された最初のペプチドPD-1/PD-L1阻害剤としての29マーペプチドである。
B. 処置レジメン
本開示は、6-チオ-dG処置と、その後のPD-L1阻害剤治療、PD-1阻害剤治療および/またはCTLA-4阻害剤治療を用いたがんの逐次処置を提供する。各処置の期間は変動し得、処置間の短い間隔が有利であると考えられる。例えば、6-チオ-dG処置は、わずか2日間であり得るが、2～4日間を含む、3日間、4日間またはそれを超える日数であり得る。PD-L1阻害剤、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤処置の前の間隔は、少なくとも1日であるべきであり、14日まで、例えば2～4日であり得る。活性化されたエフェクターT細胞に対する6-チオ-dGの潜在的に有害な影響のために、6-チオ-dGとPD-L1阻害剤、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤との間の重なりは回避されるべきである。
6-チオ-dGの1日投与量は、0.5mg/kg～10mg/kgであり、好ましくは静脈内または経口である。PD-L1阻害剤、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤の用量は、承認された現行の投与スケジュールの間にあり、これに一致する。
テロメア機能不全誘発病巣（TIF）および小核アッセイ
TIFアッセイは、テロメア配列特異的なペプチド核酸（PNA）プローブを使用した、γ-H2AX、53BP1などのDNA損傷応答因子に対する抗体およびテロメアタンパク質またはテロメアに対する抗体によるDNA損傷の共局在化検出に基づいている（Mender and Shay、2015）。簡潔には、細胞を4ウェルチャンバースライド中に播種した。翌日、細胞を、1μMの6-チオ-dGで24時間（TIFアッセイの場合）または1～3μM 6-チオ-dGで48時間（小核アッセイの場合）処理した。次いで、スライドをPBSで2回すすぎ、PBS中の4％ホルムアルデヒド（Thermo Fisher）で10分間固定した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中0.5％ TritonX-100中で10分間透過処理した。透過処理後、細胞をPBSで3回洗浄した。0.1％PBST（TritonX-100）中の10％ヤギ血清で細胞を1時間ブロックした。γ-H2AX（TIFアッセイ、マウス、1:1000）（Millipore）またはラミンA/C（小核アッセイ、マウス、1:500）（Santa Cruz）をブロッキング溶液で希釈し、細胞上で2時間インキュベートした。PBST（0.1％Triton中1×PBS）で3回洗浄し、PBSで3回洗浄した後、Alexafluor568をコンジュゲートしたヤギ抗マウス（1:500）（Invitrogen）と共に細胞を40分間インキュベートし、次いで、0.1％PBSTで5回洗浄した。PBS中の4％ホルムアルデヒドにおいて、細胞を室温で20分間固定した。70％、90％、100％エタノールでスライドを順次脱水した後、FAMをコンジュゲートしたテロメア配列（Cリッチ）特異的PNAプローブ、70％ホルムアミド、30％2×SSC、10％（w/v）MgCl2・6H2O（Fisher Sci）、核酸ハイブリダイゼーションおよび検出のための0.25％（w/v）ブロッキング試薬（Roche）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液で、ヒートブロック上80℃で7分間変性させ、その後、室温で一晩インキュベートした。スライドを70％ホルムアミド（Ambion）/0.6×SSC（Invitrogen）（2×1時間）、2×SSC（1×15分）、PBS（1×5分）で順次洗浄し、70％、90％、100％エタノールで順次脱水し、次いで、DAPIを含むVectashield封入剤（Vector Laboratories）で封入した。100倍対物レンズを使用してフルオレセイン顕微鏡で画像を捕捉した。Image Jを用いてTIFを定量した。
免疫FISH
簡潔には、キシレン（2×5分）、100％エタノール（2×2分）、95％エタノール（1×2分）、75％エタノール（1×2分）および50％エタノール（1×2分）で5μM組織切片を脱パラフィンし、次いで、水道水で洗浄した（2×3分）。脱パラフィン処理した組織切片をクエン酸ナトリウム緩衝液（10mM クエン酸Na、0.05％Tween20、pH＝6.0）中、マイクロ波で20分間インキュベートして、抗原を賦活化した。組織切片を冷却した後、組織切片を1×PBSで5分間すすぎ、次いで、95％エタノール中で3分間脱水した。FITCをコンジュゲートしたテロメア配列（TTAGGG）3特異的PNAプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（70％ホルムアミド、30％2×SSC、10％（w/v）MgCl2・6H2O（Fisher Sci）、0.25％（w/v）ブロッキング試薬（Roche））を用いて、ヒートブロック上で、80℃で7分間変性を行った。70％ホルムアミド/0.6×SSC（3×15分）、2×SSC（1×15分）、PBS（1×5分）、PBST（PBS＋0.1％Tween20;1×5分）でスライドを順次洗浄し、ブロッキング緩衝液（PBST中4％BSA）と共に30分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中のホスホヒストンH2AX抗体（1:500）（Cell Signaling）と共に切片を室温で1時間インキュベートした。PBSTで2×5分間洗浄した後、ブロッキング緩衝液中のAlexafluor 568をコンジュゲートしたヤギ抗ウサギと共に組織切片を室温で1時間インキュベートした。PBST（3×5分）およびPBS（1×5分）で切片を順次洗浄した。DAPIを含むVectashield封入剤でスライドを封入した。100倍対物レンズを使用してフルオレセイン顕微鏡で画像を捕捉した。Image Jを用いてTIFを定量した。
腫瘍増殖および処置
100μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、マウスの右背側側腹部の皮下に合計5×105個のMC38、5×105個のCT26または1×106個のLLC細胞を接種した。腫瘍が約100mm3に増殖した時点で、担腫瘍マウスを処置群に無作為にグループ分けした。6-チオ-dG単回処置のために、MC38腫瘍およびLLC腫瘍では7、8および9日目に、CT26腫瘍については5、6、7日目に3mg/kgの6-チオ-dGを腹腔内に与えた。CSF1R、NK1.1、CD4＋およびCD8＋T細胞枯渇のために、200μgの抗体を処置開始の1日前に腹腔内注射し、次いで2週間にわたって週に2回腹腔内注射した。MC38モデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、10日目および11日目に6-チオ-dGを与え、13日目および17日目に50μgの抗PD-L1抗体を腹腔内注射した。LLCモデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、4、5、6、10および11日目に6-チオ-dGを与え、8および13日目に200μgのPD-L1を腹腔内注射した。腫瘍体積を長さ（a）、幅（b）および高さ（h）によって測定し、腫瘍体積＝abh/2として計算した。
IFN-γ酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ELISPOT）
MC38腫瘍をC57BL/6の右側腹部に皮下注射した。6-チオ-dG単回処置のために、3mg/kgの6-チオ-dGを7、8および9日目に腹腔内に与えた。MC38モデルにおけるPD-L1遮断併用療法のために、3mg/kgの6-チオ-dGを10日目および11日目に与え、50μgの抗PD-L1抗体を最後の処置の11.7日後に腹腔内注射し、担腫瘍マウスから腫瘍流入領域リンパ系および脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。照射したMC38腫瘍細胞および対照LLC腫瘍細胞を使用して、腫瘍特異的T細胞を再刺激した。1.5×105個の流入領域リンパ節細胞または脾細胞および7.5×104個の放射線照射された腫瘍細胞を48時間共培養し、IFN-γ ELISPOTキット（BD Bioscience）を製造者の説明書に従って使用してELISPOTアッセイを行った。CTL-ImmunoSpot（登録商標）S6 Analyzer（Cellular Technology Limited）を用いてIFN-γスポットを計数した。
フローサイトメトリー分析
細胞の単一細胞懸濁液を抗FcγIII/II受容体（クローン2.4G2）と共に15分間インキュベートして非特異的結合を遮断した後、コンジュゲートされた抗体で染色し、次いで、表記された抗体と共に暗所で4℃にて30分間インキュベートした。死細胞を排除するために、Fixable viability Dye eFluor 506またはeFluor780（eBioscience）を使用した。製造者の説明書に従ってTrue-Nuclear転写因子緩衝液セット（BioLegend）を使用することによって、Foxp3およびKi67を細胞内で染色した。CytoFLEXフローサイトメータ（Beckman Coulter,Inc）でデータを収集し、FlowJo（Tree Star Inc.,Ashland,OR）ソフトウェアを使用することによって分析した。
本発明者らは、6-チオ-dGによる3日の処置の後、2日後に抗PD-L1で処置すると、ルイス肺癌において完全な腫瘍寛解がもたらされることを実証した（図8A～図8B）。これは、図8Aに例示されるように極めて侵襲性の腫瘍型である。皮下に注射された腫瘍は、20日以内に1000mm 3超に達した。本発明者らは、抗PD-L1で処置したのみでは同じ急速な腫瘍増殖を観察した。しかしながら、6-チオ-dG（THIO）でのわずか3回の処置で、20日間有意な腫瘍制御がもたらされる。驚くべきことに、THIOとその後の抗PDL-L1（アテゾリズマブ）による処置は、完全な腫瘍退縮をもたらした。本発明者らは、治癒したマウスをさらに5週間維持し、同じマウスにさらに5回LLC腫瘍を再負荷したが、腫瘍増殖は観察されなかった。しかしながら、本発明者らがLLC治癒マウスにMC38を注射した場合、腫瘍は増殖し、抗PD-L1は影響を及ぼさなかった（図8B）。THIOで処置されたことがない対照マウスでは、対照LLC腫瘍はMC38と同様に増殖した。これは、腫瘍特異的免疫記憶を示唆する。

Claims (37)

  1. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
  2. 免疫チェックポイント阻害剤がPD-1阻害剤である、請求項1記載の方法。
  3. 免疫チェックポイント阻害剤がPD-L1阻害剤である、請求項1記載の方法。
  4. 免疫チェックポイント阻害剤がCTLA-4阻害剤である、請求項1記載の方法。
  5. 免疫チェックポイント阻害剤が、1つまたは複数のCTLA-4阻害剤と1つまたは複数のPD-1阻害剤との組み合わせである、請求項1記載の方法。
  6. 免疫チェックポイント阻害剤が、1つまたは複数のCTLA-4阻害剤と1つまたは複数のPD-L1阻害剤との組み合わせである、請求項1記載の方法。
  7. 投与される6-チオ-dGが、治療サイクルあたり約1日間～約5日間である、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. チェックポイント阻害剤が、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  9. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、セミプリマブ（Libtayo（登録商標））による処置が続く、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
  11. 6-チオ-dGが、治療サイクルあたり約1日間～約5日間投与される、請求項10記載の方法。
  12. セミプリマブ（Libtayo（登録商標））が、治療サイクルあたり約1日間～約3日間投与される、請求項10および11のいずれか一項記載の方法。
  13. 6-チオ-dGおよびセミプリマブ（Libtayo（登録商標））が、化学療法剤、ホルモン療法、毒素療法または手術と組み合わせて投与される、請求項10～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法と組み合わせて投与される免疫チェックポイント阻害剤による処置が続く、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
  15. 約1日～約5日の治療にわたって投与される6-チオ-dGの総投与量が約20～約2000mgである、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記がんが、肺、結腸直腸、肝臓、黒色腫または神経膠芽腫である、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記がんが転移性である、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記がんが再発性である、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記がんが治療抵抗性である、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記治療抵抗性がんがチェックポイント阻害剤治療抵抗性である、請求項10記載の方法。
  21. 前記治療抵抗性がんが、PD-1、PD-L1およびCTLA-4阻害剤の1つまたは複数に対して耐性である、請求項1記載の方法。
  22. 前記対象がチェックポイント阻害剤治療で以前に処置されている、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記対象が、PD-1、PD-L1およびCTLA-4治療のうちの1つまたは複数で以前に処置されている、請求項22記載の方法。
  24. 6-チオ-2-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）の投与とその後のチェックポイント阻害剤による処置が、少なくとも1回繰り返される、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  25. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が全身的に投与される、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  26. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤が腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与される、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  27. 6-チオ-dGが腫瘍部位に局所的にまたは局部的に投与され、チェックポイント阻害剤が全身的に投与される、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  28. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍増殖の阻害をもたらす、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  29. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が前記がんの寛解をもたらす、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  30. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍量の低下をもたらす、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  31. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与ががん細胞転移の阻害をもたらす、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  32. 6-チオ-dGおよびチェックポイント阻害剤の投与が腫瘍根絶をもたらす、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  33. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が続く、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
  34. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、放射線療法による処置が先行する、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される、方法。
  35. 前記がんが、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、脳がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、リンパ腫、白血病、皮膚がん、乳がんからなる群から選択される、請求項29または30記載の方法。
  36. 6-チオ-2-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）の投与および放射線療法が少なくとも1回繰り返される、請求項29～31のいずれか一項記載の方法。
  37. 6-チオ-2'-デオキシグアノシン（6-チオ-dG）を対象に投与する工程であって、それに、免疫チェックポイント阻害剤および放射線療法による処置が続く、工程
    を含む、対象におけるがんを処置する方法。いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤はPD-L1阻害剤、PD-1阻害剤またはCTAL-4阻害剤である。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、コシベリマブ、ビントラフスプアルファ、デュルバルマブ、MGD013、KNO35、KN046、AUNP12、CA-170およびBMS-9986189のうちの1つまたは複数から選択される。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤はアテゾリズマブである。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、JTx-4014、ササンリマブ、ブディガリマブ、BI754091、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、ジンベレリマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、INCMGA00012、AMP-224、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、JS001およびAMP-515の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、放射線療法と組み合わせて投与されるセミプリマブ（Libtayo（登録商標））であり、前記がんは、膵臓、肺、中皮腫、胃、食道、肝臓、胆道、膀胱、頭頸部、口腔、鼻咽頭、成体脳、結腸、直腸、結腸直腸、前立腺、卵巣、子宮頸部、子宮、精巣、リンパ腫、白血病、皮膚、乳房、腎臓、神経芽細胞腫、メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
JP2022554769A 2020-03-13 2021-03-12 ６－チオ－ｄＧ、チェックポイント阻害剤および放射線療法を使用するがんの逐次処置 Pending JP2023517671A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062989041P 2020-03-13 2020-03-13
US62/989,041 2020-03-13
PCT/US2021/022090 WO2021183873A1 (en) 2020-03-13 2021-03-12 Sequential treatment of cancers using 6-thio-dg, checkpoint inhibitors and radiation therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023517671A true JP2023517671A (ja) 2023-04-26
JPWO2021183873A5 JPWO2021183873A5 (ja) 2024-03-05

Family

ID=77671975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022554769A Pending JP2023517671A (ja) 2020-03-13 2021-03-12 ６－チオ－ｄＧ、チェックポイント阻害剤および放射線療法を使用するがんの逐次処置

Country Status (11)

Country Link
US (1) US12097213B2 (ja)
EP (1) EP4117667A4 (ja)
JP (1) JP2023517671A (ja)
KR (1) KR20220154134A (ja)
CN (1) CN115397428A (ja)
AU (1) AU2021233023A1 (ja)
BR (1) BR112022018238A2 (ja)
CA (1) CA3170930A1 (ja)
IL (1) IL296403A (ja)
MX (1) MX2022011331A (ja)
WO (1) WO2021183873A1 (ja)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2630255B1 (en) * 2010-10-22 2014-09-10 Roche Diagnostics GmbH A conjugate between a thiophilic solid phase and an oligonucleotide comprising a thiooxonucleotide
CN110339203A (zh) 2013-04-08 2019-10-18 得克萨斯系统大学评议会 用于改变端粒酶介导的端粒的巯基嘌呤核糖核苷类似物
CN108136025B (zh) * 2015-07-16 2022-09-06 比奥克斯塞尔医疗股份有限公司 一种使用免疫调节治疗癌症的新颖方法
WO2017165675A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Treatment of drug resistant proliferative diseases with telomerase mediated telomere altering compounds
AU2017271615A1 (en) * 2016-05-27 2018-12-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System 6-thio-2'-deoxyguanosine (6-thio-dG) results in telomerase dependent telomere dysfunction and cell death in therapy-resistant cancer cells
JP2019529418A (ja) * 2016-09-16 2019-10-17 バイオノミックス リミテッド 抗体およびチェックポイント阻害剤の併用療法
US11292842B2 (en) * 2017-02-21 2022-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PD-1 antibodies for treatment of lung cancer
WO2019152574A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for treating cancer or infection using a combination of an anti-pd-1 antibody, an anti-lag3 antibody, and an anti-tigit antibody
WO2019169130A2 (en) 2018-02-28 2019-09-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System USE OF 6-THIO-2'-DEOXYGUANOSINE (6-THIO-dG) TO TREAT MELANOMA
WO2019183482A1 (en) * 2018-03-22 2019-09-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System USE OF 6-THIO-dG TO TREAT THERAPY-RESISTANT TELOMERASEPOSITIVE PEDIATRIC BRAIN TUMORS

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021233023A1 (en) 2022-11-03
MX2022011331A (es) 2022-10-27
IL296403A (en) 2022-11-01
US12097213B2 (en) 2024-09-24
CA3170930A1 (en) 2021-09-16
BR112022018238A2 (pt) 2022-10-25
EP4117667A4 (en) 2023-11-15
WO2021183873A1 (en) 2021-09-16
CN115397428A (zh) 2022-11-25
US20210290652A1 (en) 2021-09-23
KR20220154134A (ko) 2022-11-21
EP4117667A1 (en) 2023-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200253979A1 (en) Therapeutic methods relating to hsp90 inhibitors
US10258625B2 (en) Method for treatment of metastatic and refractory cancers and tumors with an inducer that overcomes inhibition of T cell proliferation
US20190077856A1 (en) Method of treating diseases using kinase modulators
US20240009223A1 (en) 6-thio-2'-deoxyguanosine (6-thio-dg) results in telomerase dependent telomere dysfunction and cell death in various models of therapy-resistant cancer cells
KR20230059792A (ko) 암 치료를 위한 조합
CN114729358A (zh) 涉及miRNA-193a的新疗法
Franzese et al. Tumor immunotherapy: drug-induced neoantigens (xenogenization) and immune checkpoint inhibitors
TWI644667B (zh) 脲基氮芥於癌症治療上之用途
JP2022523423A (ja) ２’３’－環状ジヌクレオチドおよびそのプロドラッグ
CN114246864A (zh) Csf1r激酶抑制剂及其用途
JP2022523571A (ja) ３’３’－環状ジヌクレオチドおよびそのプロドラッグ
JP2023517671A (ja) ６－チオ－ｄＧ、チェックポイント阻害剤および放射線療法を使用するがんの逐次処置
JP2023515010A (ja) 免疫原性細胞死を促進するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ
KR20220035379A (ko) 암 치료를 위한 조합 요법
Tripathi et al. peer review: awaiting peer review
Bunz Cancer Therapy
Fu Tarloxotinib amplifies the anti-tumour efficacy of immune checkpoint inhibitors through multiple mechanisms
KR20230074195A (ko) 조혈 세포 이식 후에 혈액학적 신생물 재발의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 mdm2 억제제
JP2024503513A (ja) がんを処置するための併用療法スケジュール

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220930

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221227

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20230815

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240226

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240226