CN107922321A - 脲基氮芥(bo‑1055)在癌症治疗上的用途 - Google Patents

Abstract

使用脲基氮芥(BO‑1055，一种水溶性DNA交联剂)治疗癌症的方法，癌症选自由各种类型的人类白血病[例如急性骨髓性白血病(ALL)和急性B淋巴母细胞白血病(B‑ALL)]、淋巴瘤、小细胞肺癌(SCLC)、肉瘤、及其他癌症所组成之群组。

Description

脲基氮芥(BO-1055)在癌症治疗上的用途

技术领域

本发明涉及一种脲基氮芥在癌症治疗上的用途。

背景技术

自从尼克松总统1971年宣告「癌症战争」以来，一套假说主导着癌症治疗超过40年。「癌症战争」为有力动人的口号，却带来适得其反、甚至有潜在危险的细胞灭杀治疗模式(Oronsky等人，2015年)。制药产业仍发展癌症药物来实现最高耐受剂量(MTD)，以试图达到最全面和快速的细胞灭杀。

化疗和放疗是对抗癌细胞的最终武器，但会导致非设想中的「适者生存」反应；亦即以消灭肿瘤的化疗，实际上可能会有反效果。这是因为当对化疗敏感的癌细胞被杀死了，而竞争些微空间和资源的耐化疗癌肿瘤细胞则以达尔文方式，适应环境并通过克隆性扩增和遗传多样性发展形成肿瘤(Greaves&Maley 2012)。这种选汰压力的代价造成抗药性的出现和治疗失败，使得积极治疗成为弄巧成拙的过程。

因此，需要有治疗癌症的有效方法，该方法不会对非恶性组织产生明显毒性。

烷化剂是一组抗癌化合物。脲基氮芥(也称为BO-1055)是一种选择性烷化剂，被叙述于美国专利第8,222,297 B2号中，其结构式如下：

虽然脲基氮芥先前被建议作为某些癌症的抗肿瘤剂，但仍明显需要使用此化合物治疗其它癌症的方法。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供在需要癌症治疗的患者身上治疗癌症的方法，包含对该患者投予治疗有效量的脲基氮芥，其中癌症系选自由白血病、淋巴瘤、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌、神经胶质母细胞瘤、及肉瘤所组成之群组。

脲基氮芥(贯穿本申请全文也称为「BO-1055」)具有以下结构式：

美国专利第8,222,297号描述脲基氮芥、以及制造此化合物的方法。

术语「脲基氮芥」还含括BO-1055的医药上可接受盐、该化合物的异构物、镜像异构物、及消旋混合物。

在较佳的实施例中，癌症系选自由白血病、淋巴瘤、SCLC、及肉瘤所组成之群组。

在一个实施例中，白血病包含急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或急性淋巴或淋巴母细胞白血病(ALL、T细胞或B细胞亚型)、双表型白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL、T细胞或B细胞亚型)及慢性骨髓性白血病(CML)。

在较佳的实施例中，治疗系有效实现治疗上明显减少的癌细胞数目而不会对非恶性组织产生明显毒性。

附图说明

图1绘示脲基氮芥剂量vs人类脐带血(CB)造血祖细胞(HPC/wk2-CAFC)与造血干细胞(HSC/wk5-CAFC)的曲线图。

图2绘示脲基氮芥剂量vs正常细胞类型与人类急性骨髓性白血病(AML)细胞株(MA-10)的相对荧光强度之曲线图。

图3绘示对小鼠投予脲基氮芥(BO-1055)、卡铂、欧洲紫杉醇、及对照物后42天取出的不同器官之病理检查照片。

图4绘示脲基氮芥的DNA交联凝胶移位试验的照片。

图5绘示在脲基氮芥治疗后非小细胞肺癌H1299细胞的流式细胞量测术细胞周期分布。

图6绘示脲基氮芥结合到hERG受体的hERG荧光偏振试验之图形表示。

图7绘示脲基氮芥与血浆蛋白结合vs时间的图。

图8绘示在72小时BO-1055对各种白血病细胞株和正常脐带血CD34+HSC/HPC的细胞毒性的阿尔玛蓝荧光强度剂量-反应曲线。

图9绘示脲基氮芥剂量vs生长因子依赖性MA-10-W51细胞的相对荧光强度之曲线图。

图10A绘示注射有1×10³-3×10⁶个GFP-荧光素酶转导的THP-1AML细胞且未进一步治疗的四只小鼠的生物摄像照片组。

图10B绘示注射有1×10³-1×10⁶个GFP-荧光素酶转导的THP-1AML细胞而且还在肿瘤注射时皮下植入每天释放1μg的人类GM-CSF超过40天的渗透性微型泵的四只小鼠的生物摄像照片组。

图11描绘各五只小鼠的六个生物摄像照片组。左侧三组显示只注射MV4-11-GFP荧光素酶细胞的小鼠；而右侧三组显示注射MV4-11-GFP荧光素酶细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

图12描绘移植有表现GFP/荧光素酶的MA10细胞且：a)无细胞介素支撑(在左)和b)通过微型泵植入物投予人类GM-CSF(右)的小鼠之生物摄像照片。

图13描绘六只各移植MA-10-W51-GFP荧光素酶细胞的小鼠之生物摄像照片；左侧的三只小鼠接受对照物注射，而右侧的三只小鼠接受脲基氮芥注射。

图14描绘各五只小鼠的六个生物摄像照片组。左侧三组显示只注射AML-2-CD34+-GFP-荧光素酶细胞的小鼠；而右侧三组显示注射AML-2-CD34+-GFP-荧光素酶细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

图15为投予脲基氮芥后的天数vs植入原发性患者衍生的AML-2CD34+细胞的存活小鼠的数量之曲线图。

图16绘示在72小时BO-1055对原发性患者pre-B ALL白血病与正常脐带血CD34+HPC/HSC相比的细胞毒性之阿尔玛蓝荧光强度剂量-反应曲线。

图17绘示在脲基氮芥治疗后表现CD19及/或CD34的pre-B-ALL细胞之流式细胞量测术分布。

图18绘示各三只小鼠的四个生物摄像照片组。左侧三组显示只注射Pre-B-ALLCD34-GFP-荧光素酶细胞和对照培养液的小鼠；而右侧三组显示注射Pre-B-ALL CD34-GFP-荧光素酶细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

图19绘示植入pre-B-ALL细胞并使用脲基氮芥和对照物治疗的小鼠之存活分析图。

图20绘示各五只小鼠的八个生物摄像照片组。左侧四组显示只注射GFP-Lu-SCLCH526细胞和对照培养液的小鼠；而右侧四组显示注射SCLC H526细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

图21绘示GFP-Lu-SCLC H526细胞在图20描绘的小鼠体内的生长对数图。

图22A为在不同荷SCLC H526异种移植物小鼠体内植入肿瘤(皮下)后、静脉注射脲基氮芥或伊立替康或依托泊苷后的平均肿瘤大小vs天数之图。

图22B为在相同小鼠体内植入肿瘤后平均体重变化vs天数之图。

图23A在使用脲基氮芥和阿霉素(DOXO)治疗的DLBCL(ABC亚型)OCY-LY3癌细胞上通过GraphPadPrism获得的增殖抑制曲线和IC₅₀。

图23B描绘通过GraphPadPrism在相同细胞上获得的Fa-Ci图。

图23C描绘通过GraphPadPrism在相同细胞上获得的等效线图；左侧的组描绘BO1055Cte+DOXO Var；而右侧的组描绘DOXO Var+BO1055Cte。

图24绘示各五只小鼠的六个生物摄像照片组。左侧三组显示只注射JEKO-1-GFP-Luc外膜细胞淋巴瘤细胞和对照培养液的小鼠；而右侧三组显示注射JEKO-1-GFP-Luc外膜细胞淋巴瘤细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

图25A绘示在脲基氮芥治疗后A673尤文氏肉瘤和A204横纹肌肉瘤细胞株的流式细胞量测术细胞周期分布。

图25B绘示在脲基氮芥治疗后凋亡和死亡的A673细胞之百分比。

图25C绘示在脲基氮芥治疗后A673细胞中的半胱天冬酶活性之曲线图。

图25D绘示在脲基氮芥治疗后死亡A673细胞的百分比之图形表示。

图25E绘示在脲基氮芥治疗后凋亡A673细胞的百分比之图形表示。

图26A为绘示使用各种浓度的脲基氮芥或4-氢过氧环磷酰胺治疗之后在甲基纤维素培养物中抑制A673尤文氏肉瘤肿瘤球形成之曲线图。

图26B为显示甲基纤维素中形成肿瘤球之影像。

图27A绘示通过GraphPad棱镜在使用脲基氮芥与托泊替康的组合治疗的A673尤文氏肉瘤细胞上获得的等效线图。

图27B绘示使用脲基氮芥与SN-38的组合治疗的相同细胞之等效线图。

图27C绘示使用脲基氮芥与阿霉素的组合治疗的相同细胞之等效线图。

图27D绘示使用脲基氮芥与一种HSP90抑制剂PU-H71的组合治疗的相同细胞之等效线图。

图28A绘示肿瘤体积vs从荷A673尤文氏肉瘤异种移植物并使用不同剂量的脲基氮芥治疗的NSG小鼠开始治疗的天数之曲线图。

图28B绘示相同小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图28C绘示小鼠重量vs从相同小鼠开始脲基氮芥治疗的天数之曲线图。

图28D绘示肿瘤大小vs从荷A204横纹肌肉瘤异种移植物并使用脲基氮芥治疗的NSG小鼠开始治疗的天数之曲线图。

图28E绘示小鼠重量vs从相同小鼠开始脲基氮芥治疗的天数之曲线图。

图29绘示肿瘤大小vs从荷原发性尤文氏肉瘤异种移植物且先每天注射环磷酰胺3天、并在逐渐肿瘤生长之后使用4次脲基氮芥注射治疗的NSG小鼠开始治疗的天数之曲线图。

具体实施方式

如本文中和所附申请专利范围中使用的，单数形式「一」和「该」包括复数的指称物，除非上下文另有明确说明。因此，举例来说，提及「一个细胞」包括复数个这样的细胞及所属技术领域中具有通常知识者习知的该细胞之均等物等等。同样地，术语「一」、「一个或更多个」及「至少一个」在本文中可以互换使用。还应注意的是，术语「包含」、「包括」、及「具有」可以互换使用。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者一般理解的相同的含义。虽然任何与本文所述类似或均等的方法和材料都可被用来实施或测试本发明，但现在描述的是较佳的方法和材料。为了描述和揭示在可能与本发明结合使用的出版物中报告的化学药品、细胞株、载体、动物、仪器、统计分析及方法的目的，将本文中提及的所有出版物都以引用方式并入本文中。本文中没有什么可以被解读为承认本发明由于先前的发明而没有资格先于该等揭示内容。

在一个实施例中，本发明提供一种在需要癌症治疗的患者身上治疗癌症的方法，包含投予该患者治疗有效量的脲基氮芥，其中癌症系选自由白血病、淋巴瘤、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、结肠直肠癌、前列腺癌、肾癌、神经胶质母细胞瘤、及肉瘤所组成之群组。

较佳的是，脲基氮芥被配制在医药组合物中。

脲基氮芥(贯穿本申请全文也称为「BO-1055」)具有以下结构式：

美国专利第8,222,297号描述脲基氮芥、以及制造此化合物的方法。

术语「脲基氮芥」还含括BO-1055的医药上可接受盐、化合物的异构物、镜像异构物、及消旋混合物。本发明还包括治疗不同癌症的方法，包含投予脲基氮芥的代谢物。术语「代谢物」意指任何从脲基氮芥的新陈代谢或代谢过程产生的物质。

在一较佳的实施例中，癌症系选自由白血病、淋巴瘤、SCLC、及肉瘤所组成之群组。

在一个实施例中，白血病包含急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或急性淋巴或淋巴母细胞白血病(ALL、T细胞或B细胞亚型)、双表型白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL、T细胞或B细胞亚型)及慢性骨髓性白血病(CML)。

在较佳的实施例中，治疗系有效实现治疗上明显减少的癌细胞数目而不会对非恶性组织产生明显毒性。

在一个实施例中，脲基氮芥的治疗有效剂量依患者的重量介于约3和约4mg/kg之间。

在一些实施例中，本发明的方法进一步包含对正使用脲基氮芥治疗的患者共同投予另一种抗癌活性剂。

本文中定义的「接触」意指将本发明中使用的抗肿瘤化合物引入在试管、烧瓶、组织培养皿、芯片、排列、盘、微孔盘、毛细管、或类似物中含有受体的样本中，并在足以允许抗肿瘤化合物与受体结合的温度和时间下培育。使样本与抗肿瘤化合物或其他特异性结合成分接触的方法是所属技术领域中具有通常知识者习知的，而且可以视运作的试验方案类型来选择。培育方法也是标准的并且是所属技术领域中具有通常知识者习知的。

在另一个实施例中，术语「接触」意指将本发明中使用的抗肿瘤化合物引入接受治疗的患者体内，并在体内允许化合物进行接触。

本文中使用的术语「治疗」包括预防性以及病症忽轻忽重的治疗。本文中使用的术语「降低」、「压制」及「抑制」具有一般理解的减轻或减少的含义。本文中使用的术语「进展」意指范围或严重性增加、促进、成长或变得更坏。本文中使用的术语「复发」意指疾病缓解之后重新发生。

本文中使用的术语「投予」是指使患者、组织、器官或细胞与抗肿瘤化合物接触。如本文中使用的，投予可以在体外(即在试管中)、或在体内(即在活体生物(例如人)的细胞或组织中)完成。在某些实施例中，本发明包括对患者或受试者投予本发明中有用的化合物。本文中等同使用的「患者」或「受试者」是指哺乳动物，较佳是人，并且属于以下任一者：(1)具有通过投予脲基氮芥可补救或可治疗的病症或(2)易患有可通过投予脲基氮芥来预防的病症。

如本文中使用的，「医药组合物」意指与适当的稀释剂、防腐剂、助溶剂、乳化剂、及佐剂(统称「医药上可接受的载体」)一起的治疗有效量抗肿瘤化合物。如本文中使用的，术语「有效量」和「治疗有效量」是指足以产生期望的治疗反应而没有不适当的不良副作用(例如毒性、刺激性、或过敏反应)的活性治疗剂的量。具体的「有效量」将明显地随着如被治疗的特定症状、患者的身体状况、被治疗动物的种类、治疗的持续时间、并行治疗的性质(若有的话)、以及采用的具体制剂与化合物或其衍生物的结构等等因素而改变。在这种情况下，假使某量产生以下中之一者或更多者则该量将被视为是治疗有效的：(a)疾病(例如胰脏癌、乳癌)的预防；及(b)此类疾病的逆转或稳定化。最佳有效量可由所属技术领域中具有通常知识者使用例行实验轻易决定。

医药组合物是液体或冻干的或其它干燥制剂，并包括各种缓冲内容物的稀释剂(例如Tris-盐酸、乙酸、磷酸)、pH和离子强度添加剂例如白蛋白或明胶以防止吸附于表面、去污剂(例如吐温(Tween)(聚山梨醇酯)20、吐温80、普朗尼克(Pluronic)F68、胆汁酸盐)、助溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏二亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、芐醇、对羟基苯甲酸酯)、填充物质或张力调节剂(例如乳糖、甘露醇)、诸如聚乙二醇的聚合物对蛋白质的共价附接、与金属离子复合、或材料掺入或掺到诸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的聚合化合物的微粒制剂上、或到脂质体、微乳剂、微胞、单层或多层囊泡、红细胞残骸、或球形质体上。这样的组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率、及体内清除速率。控释或缓释组合物包括在亲脂性贮存场所(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。

本发明还包括的是投予涂覆有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)的微粒组合物的方法。组合物的其他实施例合并微粒形式的保护涂层、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂用于各种投药途径，包括局部、肠胃外、肺、鼻和口服。在一个实施例中，医药组合物被肠胃外、癌周围、经黏膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内及肿瘤内投予。

另外，本文中使用的「医药上可接受载体」是所属技术领域中具有通常知识者众所周知的，并且包括但不限于0.01-0.1M、而且较佳0.05M的磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。此外，这样的医药上可接受载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、及乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。

肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液及固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖的那些，及类似物。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、凝集剂、惰性气体等。

依据本发明的控释或缓释组合物投药包括在亲脂性贮存场所(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明还包含的是涂覆有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)的微粒组合物及耦接到针对组织特异性受体、配位体或抗原的抗体或耦接到组织特异性受体的配位体的化合物。

依据本发明投药的组合物之其他实施例包含微粒形式、保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂用于各种投药途径，包括肠胃外、肺、鼻及口服。

在依据本发明的又另一个方法中，医药组合物可被以控释系统递送。例如，试剂可以使用静脉内输注、可植入渗透泵、经皮贴剂、脂质体、或其它投药模式投药。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人，Surgery 88:507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一个实施例中，可以使用聚合材料。在又另一个实施例中，控释系统可被放在治疗标靶(例如肝脏)附近，因此仅需要一部分的全身剂量(参见例如Goodson，在控释的医疗应用中(inMedical Applications of Controlled Release)，同上，第2卷，第115-138页(1984)。其它控释系统在回顾中由Langer讨论(科学(Science)249:1527-1533(1990)。

医药制剂可以单独包含抗肿瘤化合物，或可以进一步包括医药上可接受载体，而且可以处于固体或液体的形式，例如片剂、粉剂、胶囊、丸剂、溶液、悬浮液、酏剂、乳剂、凝胶、霜剂或栓剂，包括直肠和尿道栓剂。医药上可接受载体包括胶、淀粉、糖、纤维素材料、及上述之混合物。含有抗肿瘤化合物的医药制剂可以通过例如皮下植入丸剂来投予给患者。在进一步的实施例中，丸剂在一段期间提供控释的抗肿瘤化合物。制剂也可以经由静脉内、动脉内、或肌肉内注射液体制剂、口服投予液体或固体制剂、或经由局部施用来投药。投药也可以通过使用直肠栓剂或尿道栓剂来完成。

可通过本发明投药的医药制剂可以通过习知的溶解、混合、造粒或片剂成型制程来制备。对于口服投药，可以将抗肿瘤化合物与为此目的常用的添加剂(例如载体、稳定剂、或惰性稀释剂)混合，并通过常规方法转化成适当的投药形式，例如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、水性、醇性或油性溶液。适当的惰性载体的实例是传统的片剂基质，例如与诸如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等黏结剂组合的乳糖、蔗糖、或玉米淀粉，并具有崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸，或具有润滑剂，例如硬脂酸或硬脂酸镁。

适当的油性载体或溶剂的实例是植物油或动物油，例如葵花油或鱼肝油。制剂作为干和湿颗粒都可以达到目的。对于肠胃外投药(皮下、静脉内、动脉内或肌肉内注射)来说，抗肿瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如盐、酯、N-氧化物、及类似物)被转变成溶液、悬浮液、或排出(假使是此目的惯常且适用的物质所需的)，例如助溶剂或其它助剂。实例是无菌液体，例如有或没有添加界面活性剂和其它医药上可接受佐剂的水和油。说明性的油是石油、动物油、植物油或合成的来源，例如花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液及有关的糖溶液和二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是较佳的液体载体，特别是用于可注射溶液。

含有活性成分的医药组合物的制备是所属技术领域中众所了解的。这种组合物可以被制备成喷雾剂被递送到鼻咽或作为注射剂，可作为液体溶液或是悬浮液；然而，也可以制备适合在注射之前溶于或悬浮于液体的固体剂形。制剂也可以被乳化。活性治疗成分经常与医药上可接受并且与活性成分兼容的赋形剂混合。适当的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、或类似物、或上述之任何组合。

此外，组合物可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、增强活性成分功效的pH缓冲剂。

活性成分可被配制成组合物，如中和的医药上可接受盐形式。医药上可接受盐包括使用无机酸或有机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸或磷酸，有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸、及类似物。从游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱和有机碱，无机碱例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组胺酸、普罗卡因、及类似物。

对于使用例如霜剂、凝胶、滴剂、及类似物局部投药到身体表面来说，抗肿瘤化合物或其生理上耐受的衍生物(例如盐、酯、N-氧化物等)被制备并在有或没有医药载体的生理上可接受稀释剂中作为溶液、悬浮液、或乳剂被施加。

在依据本发明的另一个方法中，活性化合物可被以囊泡递送，特别是脂质体(参见Langer，科学249:1527-1533(1990)；Treat等人，在传染病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss,N.Y.，第353-365(1989)；Lopez-Berestein同上，第317-327页；大致参见以上出处)。

对于在药物中的使用，抗肿瘤化合物的盐可以是医药上可接受盐。然而，其它的盐在依据本发明的化合物或其医药上可接受盐的制备中可以是有用的。化合物的适当医药上可接受盐包括酸加成盐，酸加成盐例如可以通过混合依据本发明的化合物的溶液与医药上可接受酸的溶液形成，医药上可接受酸例如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

本文中提供以下实施例来说明本发明，而且该等实施例不应被以任何方式解读为限制本发明。

实施例

实施例1

脲基氮芥的细胞毒性

在一组人和鼠良性组织类型中测定脲基氮芥(BO-1055)的毒性。

为了测定BO-1055对非恶性组织的毒性，发明人使用MTT法和阿尔玛蓝试验(Hamid等人，2004)在29个不同的正常人、鼠或灵长类动物的细胞和组织类型(表1)上量测IC₅₀值。在全部29个正常组织上评估BO-1055。其中，24/29是高抗性的(IC₅₀≥10.0≥100.0μm)，5个是中抗性的(IC₅₀ 8.80-9.48μM)。后组包括输卵管上皮、胎儿骨髓基质、在血清替代培养液中的脐带血CD34+造血干/祖细胞、CAFC 2周祖细胞和CAFC 5周造血干细胞。

表1.水溶性脲基氮芥(BO-1055)在体外*对各种人、鼠和灵长类动物正常组织的细胞毒性。72小时的细胞毒性(IC₅₀，μM)。

*表1中使用的良性细胞之说明。

MSC：Castro-Malaspina等人1980年(第一次描述人类间质干细胞及其后代)。初始用语CFU-F，目前替代命名间质基质细胞(因为只有一小部分的细胞群体具有自身复原的干细胞特征)。BMEC-hTERT：人类骨髓微血管内皮细胞-hTERT无限增殖(Franco等人，2001年)。MSC-hTERT：人类hTERT无限增殖的骨髓MSC(MacKenzie等人，2000年)。MRC5：使用hTERT无限增殖的人类胚胎肺纤维母细胞(Franco等人2001年，Wen等人2006年)。肺基部上皮细胞：使用hTERT或SV40无限增殖(16HBE SV40+、BCI-NSI hTERT、BEAS2B SV40T、CCD-33Lu、NL31-PE)(Shaykhiev等人2013年，Walters等人2013年)。NOSE：正常人类卵巢上皮细胞。HS5、HS27A：使用乳头状瘤病毒无限增殖的成人骨髓基质细胞(Roecklein和Torok-Storb，1995年)。以非洲绿猴(草原猴)劳氏肉瘤转化的肾细胞株(CV1)表示肾纤维母细胞(Jensen等人，1964年)。CB CD34+：人类脐带血CD34+细胞(Mulloy等人，2003年)。CB CFC：在半固体菌落试验中的脐带血造血祖细胞(CFC)(Chung等人，2005年)。SVGp12：星状细胞，一种SV40转化的人类胎儿神经胶质细胞株。

方法

(i)CFC试验

通过培养每ml的Iscove氏改良Dulbecco培养液(IMDM)中含500个纯化的人脐带血CD34⁺细胞以一式三份测定BO-1055和其它化合物对人造血祖细胞、菌落形成细胞(CFC)的毒性，IMDM含有1.2％的甲基纤维素、20ng/ml的人c-Kit配位体(KL)、20ng/ml的人IL-3、20ng/ml的人G-CSF、6单位/ml的人EPO、80μm的2-巯基乙醇、2mM的L-谷胺酰胺、50单位/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素、0.125mM的氯化血红素(Sigma)、及20％的血清替代物(生命技术，格兰德岛，NY)且存在或不存在各种剂量的BO-1055。14天后，将在显微镜下每个CFC菌落中含有超过50个细胞的菌落评为CFC，并将数据表示为平均值±标准偏差，n＝3。

(ii)CAFC试验

使用鹅卵石区形成试验(CAFC)测定BO-1055在体外对人造血干细胞(HSC)的毒性(Breems等人，1994年，Jo等人，2000年)。在MEM阿尔法培养液中建立200个纯化人脐带血CD34+细胞和MS-5细胞(鼠基质细胞)的共培养物，MEM阿尔法培养液中含12.5％的胎牛血清、12.5％的马血清、10^-4M的单硫代甘油、10^-6M的氢化可的松、50μg/ml的庆大霉素、及2mM谷胺酰胺且含有或没有各种剂量的试验化学品。每周使用新鲜培养液补充一半的培养液一式三份。5周后，将共培养物的CAFC成员在相差显微镜下评分为在基质单层下方≥8个相位暗细胞的区域。为了测定白血病干细胞(LSC)，使用相同的试验，但培养物在2周前打进鹅卵石区。利用解离鹅卵石区形成细胞二次再传代到新鲜基质上来确认HSC和LSC两者的自身恢复能力。

(iii)BO-1055对正常人组织和人癌组织的影响

在含有10％FCS且存在或不存在各种剂量的BO-1055的IMDM培养液中培养2,000～4,000个悬浮细胞或1,000～2,000个黏附肿瘤细胞/孔(在96孔或384孔盘中)一式三份。72小时后，将培养物用阿尔玛蓝脉冲整夜，并通过Synergy H1盘式分析仪(BioTek公司)量测所得培养物的荧光强度。悬浮细胞包括纯化的CB CD34+细胞、原生人白血病CD34+细胞、人类白血病和小细胞肺癌细胞株。黏附细胞是正常的人脐内皮细胞(HUVEC)、人骨髓内皮细胞(BMEC)、人骨髓间质干细胞及各种的人实体瘤细胞株。当使用人CD34+细胞进行药物筛选时，在添加阿尔玛蓝之前在20ng/ml的KL、20ng/ml的IL-3、20ng/ml的G-CSF及6单元/ml的EPO存在下培养500～1,000个细胞/孔7-10天。

如表1所示，脲基氮芥对一组正常人和鼠的组织和细胞类型具有相对低的毒性。该组包括四个支气管上皮细胞株，其中三个通过使用hTERT或SV40T抗原(IC₅₀>10.0-40.0μM)转导而无限增殖。从正常人卵巢表面上皮细胞和输卵管基部上皮细胞取得的上皮细胞株也抗BO-1055(IC₅₀≥10.0-80.0μM)。内皮细胞由骨髓微血管内皮细胞株和正常脐带衍生的血管内皮细胞代表，两者皆抗BO-1055(IC₅₀>10-60.5μM)。间质基质/干细胞(MSC)和肌纤维母细胞由14个细胞株代表。鼠和人胎儿和成人骨髓或肺衍生的MSC、胎儿皮肤MSC、脂肪组织衍生的MSC及灵长类动物肾纤维母细胞是相对抗BO-1055的(IC₅₀ 8.48>100μM)。

由乳头状瘤病毒无限增殖的良性人骨髓基质细胞株HS5和HS27A也抗BO-1055细胞毒性(IC₅₀>20-35.3μM)。在筛选组的正常人类造血细胞包括在无血清或含胎牛血清的悬浮培养物中(IC₅₀ 9.01-15.0μM)、或在用于造血祖细胞/HPC的半固体培养液菌落形成试验中(CFU-GM、BFUE、CFU-混合(IC₅₀ 19.0μM)的纯化脐带血CD34+细胞。使用鹅卵石区形成试验(Breems等人，1994年，Jo等人，2000年)进行第2周CAFC(HPC)的定量与对BO-1055的相对抗性的建文件(平均IC₅₀ 9.20μM，在n＝4个独立的脐带血样本中)。在第5周的CAFC试验中的脐带血造血干细胞/HSC也是相对抗BO-1055的(平均IC₅₀ 9.10μM，在n＝4个独立的脐带血样本中)。

实施例2

在人类和小鼠正常组织类型组中测定烷化药物卡铂、顺铂、替莫唑胺、马法兰、苯达莫司汀及环磷酰胺(活性代谢物4-HC)的毒性

将用以测定BO-化合物之细胞毒性的19种良性组织类型的组也用来筛选六种常用烷化药物卡铂、顺铂、替莫唑胺、马法兰、苯达莫司汀及4-HC(环磷酰胺的活性代谢物)的毒性(表2)。

使用卡铂筛选七种组织，有一种是中度敏感的(IC₅₀ 1.70μM)且6/7是高抗性的(IC₅₀ 32.8>1000μM)。12/14的株抗顺铂(IC₅₀≥20.0>100μM)，但2/3的支气管株是敏感的(IC₅₀ 3.60-4.10μM)因为是脐带血造血祖细胞(IC₅₀ 1.80μM)。

在7种组织上评估替莫唑胺，其中5种组织高度抗药(IC₅₀ 20.0->100.0μM)，一种鼠MS5基质株显示弱抗药性(IC₅₀ 5.5μM)，而另一种HUVEC内皮细胞中度敏感。

MS5对其它的烷化剂也相当敏感，包括马法兰(IC₅₀ 1.64μM)和苯达莫司汀(IC₅₀2.24μM)，这是相对于测试的13种其它组织的马法兰抗药性(IC₅₀ 7.0-320.0μM)。

苯达莫司汀对SV40无限增殖的支气管上皮细胞(16HBESV40+IC₅₀ 3.55μM)和鼠骨髓基质(MS-5IC₅₀ 2.24μM)有细胞毒性，但对测试的10种其它组织则无(IC₅₀ 20.0-400.0μM)。

4-HC(环磷酰胺的毒性代谢物)对2种正常组织有中度毒性(IC₅₀ 0.30-2.01μM)，而5种有抗药性(IC₅₀ 12.5-47.0μM)。

表2.烷化药物卡铂、顺铂、替莫唑胺(TMZ)、马法兰(Melp)、苯达莫司汀及4-HC(环磷酰胺的活性代谢物)对各种正常的人、灵长类动物及小鼠组织和端粒酶或SV40无限增殖正常组织的体外72小时细胞毒性(IC₅₀μM)。

*以72hr阿尔玛蓝试验测定IC₅₀的试验。nd＝未测定

筛选的所有正常细胞株都对卡铂有抗药性(7/7 IC₅₀ 23.0-1,000.0μM)。

实施例3

正常良性鼠细胞和人脐带血CD34+细胞、造血祖细胞(HPC)及造血干细胞(HSC)对脲基氮芥(BO-1055)细胞毒性的抗药性

图1显示脲基氮芥对于由第2周CAFC试验测定的人脐带血CD34+HPC增殖及由第5周CAFC试验测定的造血干细胞增殖(IC₅₀ 7.5-8.2μM)的影响。在独立的脐带血测试样本间有敏感度变化，第2周CAFC的平均IC₅₀为9.20μM(祖细胞)，第5周CAFC的平均IC₅₀为9.10μM(HSC)(表2)。

图2显示与人急性骨髓性白血病(AML)细胞株相比脲基氮芥对各种正常细胞类型的增殖的影响。

正常细胞：人脐带血CD34+细胞(hu-CB-CD34+)。这个亚群富含造血祖细胞(HPC～30％)和造血干细胞(HSC～5％)。骨髓衍生的内皮细胞(BMEC)。人类间质基质细胞(MSC)、鼠MS-5(BM-MSC)及鼠OP9(BM-MSC)细胞。人类AML MA-10细胞：(使用MLL-AF9融合基因转导的hu-CB-CD34细胞，细胞因子相关)。相对荧光强度表示在脲基氮芥存在下的荧光强度除以在没有脲基氮芥存在下的荧光强度。

图2显示与MLL-AF9转化的白血病细胞株相比，在各种正常鼠和人的组织类型上测得的连续稀释BO-1055之细胞毒性。正常对照组织，包括人类骨髓内皮细胞(BMEC)、人MSC细胞及鼠MS-5和OP9骨髓基质细胞为抗BO-1055细胞毒性(IC₅₀>10μM)，因为是正常的脐带血CD34+细胞(IC₅₀>10μM)。这种化学抗性与从使用MLL-AF9白血病易位基因反转录病毒转染得到的正常脐带血CD34+细胞衍生的MA-10细胞株看到的化学敏感性相对(IC₅₀ 0.35μM)(Mulloy等人，2003年，Wunderlich及Mulloy，2009年)。将单白血病基因引入正常HSC/HPC将BO-1055的毒性提高>30倍。

实施例4

BO-1055治疗对正常C57Bl/6小鼠之外周血血液学参数的体内作用

使用静脉注射的MTD剂量(30mg/kg)和频率(隔日x5)对正常健康小鼠投予BO-1055。发现这个剂量和药物投予的时间表在裸鼠和NSG鼠体内产生肿瘤细胞株移植瘤的消退。在评估的23/24血液学参数(表3)的任何参数中没有显著抑制。这在嗜中性白血球、红血球和血小板的情况下特别引人注目，嗜中性白血球、红血球和血小板的水平在烷化药物治疗的临床评估中是最常见的剂量限制毒性。单核细胞有3-4倍的增加。唯一的负面影响是在BO治疗组中WBC数由于在第10天的温和淋巴细胞而适度减少。

表3.在健康C57BL/6小鼠体内的全血细胞计数。对照PBS组n＝4或使用30mg/kg静脉内BO-1055治疗，在第1、3、5、8、10天，n＝4。RBC值是10⁶/μL，所有其他值都是10³/μL。

实施例5

停止BO-1055治疗后取得的、带有前列腺22Rv/HL2移植瘤的小鼠之各种组织的病理学评估

图3绘示药物治疗开始后42天来自脲基氮芥(BO-1055)、卡铂、及欧洲紫杉醇治疗小鼠的不同器官之病理检查结果。

本发明人已经研究了BO-1055和两种正对照化合物(卡铂、欧洲紫杉醇)在带有前列腺22Rv/HL2肿瘤异种移植物(垂直植入裸鼠体内)的裸鼠身上的主要毒性。停止BO-1055治疗后，经药物治疗的小鼠的平均体重在第35-40天恢复，表示脲基氮芥对宿主具有低毒性。我们还检查了这些经治疗小鼠的病理变化(图3)。在投药开始后第42天将经治疗小鼠的不同器官移出、固定、及染色，以进行病理检查。

在对照组与药物治疗组之间心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏没有明显的病理变化，表示脲基氮芥和两种正对照化合物(卡铂、欧洲紫杉醇)对宿主具有非常小的毒性，而且经治疗小鼠在停止药物治疗后迅速恢复体重。

实施例6

垂直植入前列腺细胞株22Rv/HL2的裸鼠在BO-1055治疗(每隔一天30mg/kg，持续42天)之后24小时的血液化学和全血细胞计数

在带有前列腺22Rv/HL2(垂直植入)的小鼠(n＝3)最后一次治疗后24小时收集血液以进行血液化学测试(表4)和全血细胞计数(表5)。结果显示，在所有使用卡铂、欧洲紫杉醇、及BO1055治疗的小鼠中AST(天冬胺酸转胺酶)增加了(表4)。在BO-1055治疗的小鼠中血尿素氮(BUN)略有增加，但没有改变尿酸(UA)在血液中的水平。

表4.血液化学测试结果：在小鼠(n＝3)的最后药物治疗后24小时收集血液。

全血细胞计数(表5)显示BO-1055及卡铂与欧洲紫杉醇皆减少白血球(WBC)、嗜中性白血球(NEU)以及血小板(PLT)计数。然而，在使用三种化合物治疗所产生的白血球减少症的程度上没有明显的差异。

表5.在具有垂直植入的人类前列腺癌细胞株22Rv/HL2并使用BO-1055、卡铂或欧洲紫杉醇治疗的裸鼠体内的全血细胞计数。(血液在最后的药物治疗后24小时收集，n＝3)。

	WBC	NEU	LYM	MONO	EOS	BASO	RBC	PLT
									载体	5.10*	1.89	2.86	0.05	0.16	0.05	9.64	897
卡铂	1.97	1.13	0.60	0.07	0.13	0.03	9.37	369
									BO-1055	2.98	0.83	1.52	0.08	0.14	0.06	9.52	195
欧洲紫杉醇	2.49	1.34	0.66	0.04	0.12	0.08	7.55	308

*RBC值是10⁶/μL，所有其他值都是10³/μL。

实施例7

BO-1055药物动力学曲线的测定

在单次静脉内和口服投予BO-1055之后的健康雄性斯泼累格多雷(SpragueDawley)大鼠体内评估脲基氮芥的药物动力学(PK)(表6)。经由颈静脉中的留置导管以1.0mg/kg的剂量水平对1组2只雄性大鼠投予单次静脉内剂量。将制剂制备成5.0％w/v的DMSO溶液且蒸馏水中有10％w/v的聚氧乙烯蓖麻油。经由口服强饲以10mg/kg的剂量水平对另一组2只雄性大鼠投予测试化合物BO-1055一次。将制剂制备成在蒸馏水中的0.5％w/vCMC溶液。给药后从各组中所有动物的颈静脉导管收集连续的血液样本长达24小时。使用有效的LC-MS/MS试验测定血浆中的BO-1055浓度水平，定量的下限(LLOQ)为2.5ng/mL。使用验证的程序WinNonlin^TM、版本5.2.1将每个剂量水平下高于LLOQ的血浆浓度-时间数据用于计算BO-1055的药物动力学参数。

将药物动力学参数总结于表6。

从本研究的毒性动力学部分的关键观察是：(i)在口服投予10mg/kg(LLOQ：2.5ng/mL)之后在BO-1055的任意取样时间没有发现可定量水平；(ii)在口服投予BO-1055之后没有口服吸收；(iii)BO-1055表现出低血浆清除(平均CL：18.00mL/min/kg)；(ⅳ)在稳态时平均表观分布体积为0.15L/kg；(v)在大鼠模型中BO-1055具有t_1/2＝0.58h的半衰期(n＝2)。

表6.在对大鼠静脉注射或口服给药之后BO-1055(脲基氮芥)的药物动力学参数总结(Chien等人，2013年)。

ND:未测得。数据不适合用于决定该组的PK参数。

本发明人进一步研究BO-1055的PK。

使用BO-1055作为单静脉内投药通过推注(超过1分钟)经由股静脉以10mg/kg溶于0.9％生理食盐水(NS)的剂量水平治疗雄性Sprague-Dawley大鼠(6周，5只雄性大鼠)。给药后在0、5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240、300、360分钟从颈静脉收集连续的血液样本。使用验证过的HPLC-光电二极管数组检测试验在血浆中测定BO-1055的浓度水平(Lin等人，2008年)。使用WinNonlin标准版1.0版(Scientific Consulting Inc.,Apex,NC,USA)进行所有的药物动力学分析。结果显示BO-1055的平均表观消除半衰期(t_1/2)为0.77小时(46.4分钟)(表7)。曲线下的面积(AUC)、清除率(Cl)及最大浓度(Cmax)分别为267±65.3minμg/mL、每kg39.4±10.6mL/min及13.4±6.17μg/mL。结果显示BO-1055具有可接受的PK曲线且在投药后(10mg/kg，静脉注射)在大鼠体内迅速分布并缓慢消失。在10mg/kg剂量的短暂静脉内投药时间之后，发现脲基氮芥被迅速分布到大鼠体内的所有器官，而且主要累积在肾，只在脑中检测到有限的量(Chien等人，2013年)。

表7.经由在大鼠(n＝5)静脉注射给药后(10mg/kg)BO-1055(脲基氮芥)的药物动力学参数(Chien等人，2013年)

药物动力学参数
		t1/2	46.4±13.1min
AUC	267±65.3minμg/mL
		Cl	39.2±10.6mL/min每kg
Cmax	13.4±6.17μg/mL

t_1/2：半衰期；AUC：曲线下的面积；

Cl：清除率；Cmax：最大浓度

实施例8

脲基氮芥的作用机制

(ⅰ)脲基氮芥诱导DNA链间交联(Kapuriya等人2011年)

通过碱性琼脂糖凝胶移位试验研究脲基氮芥的作用机制并与烷化药物马法兰比较。凝胶显示脲基氮芥能够诱导DNA链间交联，表示DNA交联可以是此试剂的主要作用机制。

图4显示在指示的各种浓度下的脲基氮芥(BO-1055)之代表性DNA交联凝胶移位试验。对照道显示单链DNA(SL)，而在所有测试道显示的交联(CL)是DNA双链交联。使用马法兰(1和10μM)作为正对照。

(ii)脲基氮芥诱导G2M遏制(Kapuriya等人2011年)

在人类非小细胞肺癌H1299细胞上研究脲基氮芥对细胞周期分布的抑制作用。脲基氮芥治疗在这些细胞中诱导明显的G2M遏制。此外，发明人还在脲基氮芥治疗之后发现增加的子G1群体(图5)。

图5显示通过使用脲基氮芥治疗在人类非小细胞肺腺癌H1299的细胞周期抑制。

(iii)BO-1055的吸收、分布、代谢、及消除(ADME)研究

进行ADME研究并总结于表8。Caco-2肠细胞渗透测试表示，化合物BO-1055不能穿透肠细胞，而药物动力学研究表示，药物不能在口服投药后被施用和吸收。药物/蛋白结合率高(99％)，表示这可以提供允许缓慢药物释放的药物储备。微粒体稳定性测试是75％，表示化合物可经由肝代谢去除。少的hERG结合表示测试化合物不可能产生心脏毒性。

表8.脲基氮芥的早期ADME研究总结

实施例9

脲基氮芥的临床前体内研究(BO-1055)

(i)在ICR小鼠静脉注射之后脲基氮芥的非-GLP急性14天毒性

本发明人在ICR小鼠研究了脲基氮芥的急性静脉注射14天毒性，以确定在肿瘤异种移植小鼠体内的最大耐受剂量(MTD)并优化药物治疗条件(例如剂量和时间表)。将不同剂量(二次蒸馏水中50、60、70、80、及100mg/kg)的脲基氮芥和载体对照组投予每组六只ICR小鼠。观察小鼠14天并记录死亡率和体重以及测定脲基氮芥的半数致死剂量(LD₅₀)(表9)。以70mg/k投药后<1小时第一次看到急性死亡率(1/6小鼠)，而且在80mg/kg下所有小鼠皆在<1小时死亡。在这些正常小鼠中BO-1055的LD₅₀是70mg/kg。

表9.脲基氮芥在正常ICR小鼠的急性静脉注射14天毒性

aN/N：发现死亡的小鼠数量/观察的小鼠数量。给药后(小时)栏显示在药物注射之后第1小时内或在随后的3小时内发生死亡的数量。SD＝注射BO-1055之后的研究日数。

bLD50：半数致死量。LD₅₀经计算为70mg/kg，具有95％的58.8～107.2mg/kg可信区间。公式为对数剂量＝1.73+0.0233概率K。

c载体：dd水

(ii)hERG抑制的研究和脲基氮芥的早期ADME研究

本发明人使用hERG FP试验研究脲基氮芥的心脏安全性[Deacon等人，2007年]。人类醚-a-go-go相关基因(hERG)在涉及心脏复极化的心脏(IKr)中编码内向整流电压闸控钾信道。hERG电流的抑制导致QT间期延长，从而产生潜在致命的心室性心律不整。由于这些心毒性作用，许多药物已被从后期临床试验撤回；因此，在药物探索早期鉴定抑制剂是很重要的。

使用hERG荧光偏振试验研究hERG抑制来量测脲基氮芥对hERG受体的结合。该试验是基于测试化合物显示来自hERK受体(PredictorTM hERG膜)的荧光追踪剂从而产生光讯号变化的能力。在黑色383孔试验盘中通过从测试化合物与荧光追踪剂的竞争性结合测定剂量-反应结合曲线来进行试验。脲基氮芥的hERG特异性结合的IC₅₀是12.6±1.64μM(n＝3)对比阿斯咪唑(IC₅₀ 0.007μM)，表示弱或无抑制及可能性极低的心脏心律不整副作用。将脲基氮芥的浓度-反应曲线显示于图6。

图6显示以hERG抑制评估所评估的BO-1055心脏毒性结果。基于BO-1055的结合抑制(IC₅₀ 12.6μM)并与阿霉素(IC₅₀ 0.03±0.03，一种具有众所周知的心脏毒性剂量限制毒性的药物)相比，确定不太可能的是BO-1055将呈现心脏心律不整的副作用。

实施例10

通过脲基氮芥研究Caco-2渗透性及P-糖蛋白(P-gp)在Caco-2细胞单层中介导的外排(表8)

(ⅰ)P-糖蛋白(P-gp)在Caco-2细胞单层中介导的外排

P-糖蛋白(P-gp，渗透性的糖蛋白)是多抗药基因(MDR)亚家族很好调查的外排泵。P-gp是涉及数种药物外排的能量依赖性转运蛋白并阻碍该等药物的细胞内吸收。利用穿透Caco-2细胞单层的渗透性来预测候选药物的人渗透性，以进行深入的机制和吸收研究，并研究转运体对渗透率和转运介导的药物-药物相互作用的影响。

Caco-2渗透性试验被视为是体外预测人体内肠道渗透性和口服药物的生物利用率的业界黄金标准。Caco-2渗透性试验使用所建立的方法通过量测横跨邻接的Caco-2细胞单层的传输速率来预测治疗化合物横跨GIT的吸收。量测横跨细胞单层从顶端到底侧(A→B)和从底侧到顶端(B→A)的传输使得外排比率能够被计算并判断化合物是否进行主动外排。Caco-2试验量测测试化合物从供体室通过多孔膜传代进入受体室，其中融合的Caco-2单层在多孔膜上形成细胞障壁。

Caco-2渗透性试验的结果显示，未检测到BO-1055在A→B方向的帕普系数。在B→A方向的帕普系数为7.05×10^-6cm/sec。BO-1055在A→B和B→A方向上的质量均衡为<50％。>80％的质量均衡给出可接受近似的帕普。明显部分的BO-1055在传输实验过程中消失，不良的质量均衡产生而且所得的Papp变成不可靠的。

这项研究的结果是，脲基氮芥被认为是渗透性非常低的药物，表示此剂具有不良的口服吸收。此外，脲基氮芥在Caco-2细胞单层的P-gp介导外排的研究显示，P-gp的外排比(B→A/A→B)为>>2，表示此试剂不能抑制P-gp。研究表示，脲基氮芥不适合用于口服投药。

(ii)微粒体的稳定性

药物代谢或外源性生物转化在药物发现中扮演重要的角色，因为会影响清除率、半衰期及口服生物利用率。肝脏是参与外源物代谢的主要器官。肝微粒体是主要包含内质网的亚细胞部分，内质网含有细胞色素P450酶、黄素单加氧酶、羧酸酯酶及环氧化物水解酶，因此提供第一阶段代谢的有用模型。第一阶段反应包含氧化、还原及/或水解并需要NADPH作为辅因子。因此，使用肝微粒体培育潜在的候选药物可以对这些酶提供固有代谢易损性的量测。

使用7-乙氧基香豆素(7-EC)作为正对照研究BO-1055在大鼠肝微粒体(RLMs)的代谢稳定性。将结果显示于表10。表10显示BO-1055和7-EC在RLM中的表观半衰期分别是29.7和23.5min。在汇集的RLM中BO-1055比7-EC更稳定。

表10.在大鼠肝微粒体中培育60分钟的BO-1055和7-乙氧基香豆素之代谢稳定性参数总结。

MR：代谢率(MR(nmol/min/mg蛋白)＝λ*C0/C蛋白)

¹7-EC：7-乙氧基香豆素。

²RLM：汇集的大鼠肝微粒体。

实施例11

BO-1055(脲基氮芥)的血浆稳定性与蛋白结合

在药物探索中，药物-血浆蛋白结合的信息在评估和理解吸收、分布、代谢及排泄(ADME)相关的性质与候选药物的药物动力学曲线中是有价值的。通过将BO-1055(20μM)搀入大鼠血浆来研究BO-1055对大鼠血浆蛋白的结合并对缓冲液透析直到达到平衡。测定BO-1055在血浆和缓冲液中的浓度来计算未结合或结合至血浆蛋白的药物之百分比。

将结果显示于图7和表11。在20μM的标称搀入浓度下2、4、6及24小时培育时间的平均结合值分别为99.68、99.69、92.01、及75.17％(图7和表11)。图7显示使用多平衡透析法BO-1055结合到大鼠血浆蛋白达到平衡的时间进程。

表11.BO-1055在大鼠血浆的平均结合分率测定

培育时间(小时)	结合％	CV(％)
			2	99.68	0.01
4	99.69	0.04
			6	92.01	0.66
24	75.17	3.87

实施例12

BO-1055(脲基氮芥)具有广范围的抗肿瘤活性

检查脲基氮芥对各种人实体瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤细胞株的细胞毒性。如表12所示，在30％脲基氮芥对测试细胞株的IC₅₀值在次μM范围中。而在一组29个良性细胞类型中没有一个具有<5.00μM的IC₅₀值，而27％具有>20>100μM的IC₅₀值。

表12.用于细胞毒性评估的人癌细胞株、原发性患者的肿瘤样本及多种类型的正常组织的组。每种癌类型/子类型的细胞株总数和一些单独的栏显示每组对BO-1055细胞毒性敏感(IC₅₀<1.00μM)或具有中间敏感性(IC₅₀1.00-4.99μM)、低抗药性(IC₅₀ 5.00-9.99μM)及高抗药性(IC₅₀≥10μM)的细胞株数。

实施例13

在异种移植模型中BO-1055在体外和体内对人类癌症细胞株和原发性人类肿瘤样本的细胞毒性(IC₅₀μM)

在体外对多组人类癌细胞株评估BO-1055的细胞毒性。使用其它治疗烷化剂和传统化疗剂进行比较。进行体内研究时，在裸鼠或NSG小鼠中使用异种移植模型在有和无BO-1055治疗之下以肿瘤生长动力学呈现数据。

基于肿瘤类型和亚型以字母顺序呈现数据。

实施例13A

白血病

据估计，在2012年世界各地有352,000个所有类型的白血病的案例和265,000个死亡，且发病率和死亡率在世界各地不同。

(i)白血病亚型

白血病可细分为急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴或淋巴母细胞白血病(ALL、T细胞或B细胞亚型)、双表型白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL、T细胞或B细胞亚型)及慢性骨髓性白血病(CML)。后者具有慢性期和急性期芽球危象。慢性骨髓单核球白血病(CMML)是另一种呈现骨髓造血不良症候群的变体形式，该变体形式之特征在于异常无性骨髓增殖和进展为急性骨髓性白血病(AML)。一个CMML子组的特征在于t(5；12)(q33；p13)平衡的染色体易位，该染色体易位将PDGFRβ融合到ets样基因tel(Golub等人，1994年)。基于形态学的FAB分类认可8种白血病亚群，但最近的子分类是基于分子的功能。

大多数形式的急性骨髓性白血病(AML)的有效治疗策略的发展在过去几十年已被搁置。其中有许多的原因，包括此病相当大的异质性和缺乏可用于预测临床结果和对不同疗法的响应性的分子标记。

本发明人评估了脲基氮芥对一种子株人类T细胞白血病株CCRF-CEM、抗药性为紫杉醇的330倍的CCRF-CEM/紫杉醇、及抗药性为长春碱的680倍的子株CCRF-CEM/VBL之细胞毒性。如表13所示，与母CCRF-CEM细胞株的相应IC₅₀相比，BO-1055对CCRF-CEM/紫杉醇和CCRF-CEM/VBL仅分别具有9.4或6.2倍减少的细胞毒性，表示此剂对紫杉醇或长春碱没有明显的交叉抗药性。这个数据也支持其它显示BO-1055既不是膜多重抗药性转运体(即p-糖蛋白)的良好基质也不与突变的微管蛋白相互作用的证据。

表13.脲基氮芥(BO-1055)对人类T细胞白血病细胞株CCRF-CM及抗太平洋紫杉醇(CCRF-CEM/紫杉醇)或抗长春碱(CCRF-CEM/VBL)子株的毒性(IC₅₀μM)

a CCRF-CEM/Tax的抗药性是母系胞株CCRF-CEM的330倍；

b CCRF-CEM/BVL的抗药性是母系胞株CCRF-CEM的980倍；

c括号中的数字是通过比较母细胞株的相应IC₅₀所判断的交叉抗药性倍数。

(ii)MLL-AF9-无限增殖人类造血细胞株的发展

MLL基因的染色体重排与高风险的婴儿、儿童、成人、及治疗引起的急性白血病有关。到目前为止，约80种不同的直接MLL融合和大约120种往复MLL融合已经被特征化在分子水平。MLL-AF9融合基因源自易位t(9；11)(p22；q23)，并与婴儿的骨髓和淋巴谱系两者的侵略性白血病相关，而在成人中，这种易位主要与急性骨髓性白血病相关。取决于外在线索，人类新生儿CD34⁺细胞在MLL-AF9表现时轻易地沿着骨髓或淋巴谱系无限增殖并在免疫受损的小鼠体内引起主要淋巴白血病。与此相反，成人骨髓CD34⁺细胞的无限增殖更难以实现，而且是偏骨髓的，即使是在纯化造血干细胞(HSC)表现MLL-AF9时(Horton等人，2013年)。转录组分析确定富含HSC，但在MLL-AF9表现细胞中并非祖基因特征。

虽然在成人细胞没有观察到，但表现MLL-AF9的新生细胞富含与不良预后、化疗剂抗药性及MYC传讯相关的基因特征。这些结果表示，新生儿细胞本质上比成人细胞更易于MLL-AF9介导的无限增殖(Horton等人，2013年)。Mulloy和同事(Wei等人，2008年)已经证明MLL-AF9在人类CD34+细胞的表现在免疫缺陷小鼠体内诱导急性骨髓、淋巴、或混合系白血病。某些白血病干细胞(LSC)具有多种能力，而且可以是通过改变鼠的生长因子或受体菌株、彰显微环境讯号的重要性来导向的谱系。其他LSC进行严格的谱系提交，表示干细胞室在MLL疾病中的异质性。

通过药物或遗传手段定位Rac传讯路径导致MLL-AF9细胞的快速和特异性凋亡，表示Rac传讯路径可以是MLL重置AML的有效治疗标靶。如永生细胞预期的，我们测试的所有细胞株都是端粒酶阳性。

MLL-AF9蛋白是自身活化hTERT表现/活性亦或是促进通常表现hTERT的细胞的生长仍有待确定。与其他涉及MLL的基因变化相比，据信MLL t(9；11)在预知上有利于AML-M5。MLL是一种被视为基因转录的积极全面调节剂的组织蛋白甲基转移酶。这种蛋白质属于包含转活化域9aaTAD并涉及转录表现记忆后生维护的组织蛋白修饰酶组。

(iii)用于评估BO-1055细胞毒性的MLL-AF9细胞株

a)生长因子依赖性&细胞密度生长依赖性细胞株。使用MLL-AF9基因转导的人类脐带血CD34+细胞：MA-10、MA-18。使用MLL-AF9基因转导的人类骨髓CD34+细胞：MA-23。使用MLL-AF9和N-ras基因转导的人类脐带血CD34+细胞：MA-9.3、MA-9.6。

b)生长因子独立性白血病细胞株。使用Flt3ITD(W51)转导的人类MA-10细胞适应在没有生长因子之下在体外增殖(摩尔实验室)。人AML细胞株THP-1(MLL-AF9)；MOLM-13(MLL-AF9&Flt3ITD)；Kasumi(AML1-ETO)；MV4；11(MLL-AF4&Flt3ITD)；Set2(Jak2V617)；HEL(Jak2V617)。

(ⅳ)BO-1055对急性骨髓性白血病细胞株有高细胞毒性，但对于具有突变JAK2T的白血病细胞株则无

如表14和图8所示，BO-1055对3/7的AML细胞株有高度细胞毒性(IC₅₀ 0.18-0.45μM)，对一个有中度细胞毒性(IC₅₀ 1.50μM)，两个JAK2V617突变株有高抗药性(IC₅₀≥10μM)，而一个AML-ETO AML株有高抗药性(IC₅₀ 80.0μM)。通过将MLL-AF9转导进入正常CB CD34+细胞(MA10、MA18)或成人BM CD34+细胞(MA23)所开发的细胞株对BO-1055皆一致高度敏感(IC₅₀ 0.25-0.40μM(图8)。使用两种致癌基因转导的正常CB CD34+细胞也对BO-1055高度敏感，无论是MLL-AF9+Flt3ITD转导的(IC₅₀ 0.40μM)或是MLL-AF9+N-RASmut(IC₅₀ 0.81-2.91μM)。相较于对正常的CB CD34⁺的细胞毒性(IC₅₀ 9.9-10.2μM)可以得出的结论是，引入MLL-AF9致癌融合基因到正常CB或BM CD34+细胞中增加了25-40倍的BO-1055细胞毒性。加入第二种致癌基因(Flt3ITD或N-Ras)并没有将对BO-1055的敏感度进一步增强超过仅使用MLL-AF9所观察到的。

(ⅴ)BO-1055对一些分子亚型的急性骨髓性白血病干细胞有高度细胞毒性但对其他分子亚型则无

使用不同分子亚型的六种主要小儿AML样本测定BO-1055对白血病干细胞(LSC)的细胞毒性。使用MS5共同培养试验量测第2周鹅卵石区形成细胞来进行LSC试验(Schuringa等人，2004年，Chung等人，2005年，Moore等人，2007年)。如表14所示，来自三个患者样本的白血病干细胞对BO-1055非常敏感(IC₅₀ 0.12-0.90μM)。这些实例是预后不良的分子亚型(单染色体7、MLL-AF9及Flt3ITD)，表示BO-1055可以有效治疗这个预后非常差的AML组。患有del17和预后良好的NPM1突变与反转16的患者对BO-1055(IC₅₀ 6.25-7.0μM)比正常造血干细胞更敏感，但治疗窗狭窄。

表14.BO-1055、替莫唑胺(TZM)及马法兰对一组27种白血病细胞株的IC₅₀(μM)，27种白血病细胞株包括AML、T-ALL及不同分子亚型的AML的主要患者样本和使用MLL-AF9±NRAS或Flt3ITD转化的HSC。

(ⅵ)比较正常CB CD34+细胞与AML和A.Mon.L细胞株及致癌基因转导的CD34+细胞的BO-1055细胞毒性之剂量-反应分析

如图8和表14所示，正常造血祖细胞(CB CD34+FBS或SF)对BO-1055有抗药性(IC₅₀9.9-10.2μM)。与此相反，A.Mon.L细胞株THP1和MOLM13是高度敏感的(IC₅₀ 0.18-0.45μM)。CB衍生的MLL-AF9转导株MA-10和MA-18及BM-衍生的MLL-AF9转导株MA-23对BO-1055细胞毒性是高度敏感的(IC₅₀ 0.25-0.40μM)。MA10W51细胞株(CB MLL-AF9+Flt3ITD)被保持为生长因子独立和生长因子(hGM-CSF或hIL-3)依赖的子株。前者(IC₅₀～10μM)比后者(IC₅₀ 0.28-0.40μM)更抗BO-1055细胞毒性。MA-9.3和MA-9.6CB MLL-AF9+NRAS株对BO1055的敏感度不同，前者是高度敏感(IC₅₀ 0.81μM)，后者敏感度较低(IC₅₀ 2.91μM)。

图9显示BO-1055对生长因子依赖性MA-10-W51细胞(使用MLL-AF9融合基因和突变Flt3ITD转导的正常CD34+)的增殖影响。BO-1055和BO-1978对生长因子依赖性MA-10-W51细胞的剂量滴定比较显示，这两种化合物都具有高度毒性，且BO-1978比BO-1055更高。

(vii)BO-1055、四种烷化药物、微管结合药、拓扑异构酶抑制剂、HSP90抑制剂及蒽环类抗肿瘤抗生素的「治疗窗」，通过比较对5种正常人组织和三种恶性白血病(AML细胞株、原发性AML及原发性B-ALL)的IC₅₀所测

使用BO-1055在MV4获得治疗窗；11种AML细胞株和原发性儿科AML-2和B-ALL细胞强调BO-1055s在正常的支气管上皮细胞(Bci-NSI)、输卵管上皮细胞(FTEC)、内皮细胞(HUVEC)、骨髓间质基质(huMSC)、以及正常脐带血造血祖细胞(CD34+细胞,CFC)上缺乏毒性。这与BO-1055对白血病的高细胞毒性形成对比(表15)。值得注意的是，使用烷化药物4-HC(环磷酰胺的活性代谢物)、苯达莫司汀、顺铂、拓扑异构酶抑制剂依托泊苷和SN38、HSP90抑制剂PU-H71、蒽环类抗肿瘤抗生素(阿霉素)及微管结合生物碱(长春新碱)缺乏治疗窗，这主要是由于上述药物对正常CFC的毒性。

表15.BO-1055、烷化药物及其它化疗药物的治疗窗测定，比较上述药物对5种正常人组织类型的毒性(IC₅₀μM)与对AML细胞株(MV4；11)，一种原发性AML(AML-2)和原发性B-ALL的毒性。

(viii)有和没有外源性hGM-CSF投予的THP-1单核细胞白血病异种移植物中的肿瘤起始细胞频率测定

为了测定需要的白血病细胞数量以确保植入，将NSG小鼠静脉注射，且将从1x10³-3×10⁶GFP-荧光素酶转导的THP-1 AML细胞注入8只NSG小鼠。

四只植入小鼠不进一步治疗(图10A)，而四只在肿瘤注射时皮下植入渗透性微型泵(Alzet)，该渗透性微型泵每天释放1μg的人类GM-CSF超过40天(图10B)。两组的小鼠都在7周时进行生物摄像。

如图10A和图10B所示，在没有外源性人类GM-CSF存在下，只在最高剂量(3×10⁶)的THP-1细胞检测到植入物。在使用hGM-CSF处理的小鼠身上有明显增加的植入物，且在此细胞株中检测肿瘤起始细胞1×10⁶和1×10⁵都有30倍的增加。

(ix)具有人类MLL-AF9-易位AML细胞株MV4；11移植的NSG小鼠之BO-1055治疗

MSG小鼠移植有10⁵个MV4；11-GFP/荧光素酶转染细胞，转染细胞被静脉注射到10只雄性12周龄NSG小鼠中的每只。在5只NSG小鼠中测定BO-1055的细胞毒性(30mg/kg，每隔一天，在第14天开始，×5)，且5只对照小鼠仅获得培养液。

图11显示此实验的结果。左侧三组显示只注射MV4-11-GFP-荧光素酶细胞的小鼠；而右侧三组显示注射MV4-11-GFP荧光素酶细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

如图11所示，4/5的对照小鼠(左侧组)在第28天显现迅速生长的肿瘤，只有1只小鼠有少的植入物。此时在BO-1055治疗组(右侧组)中，与一周前2只小鼠没有检测到肿瘤且3只小鼠残留非常小的肿瘤相比，有非常明显的肿瘤植入物减少。在第28天在5只BO-1055治疗小鼠的任1只中没有明显可检测到的肿瘤。此时在对照组中，2只小鼠由于大量肿瘤已被安乐死，而剩余的小鼠显现大量的肿瘤，在第28天摄像后不久将需要安乐死。

(x)移植有表现GFP/荧光素酶的人类MA10细胞的NSG小鼠之BO-1055治疗

MA10是通过MLL-AF9融合致癌基因的反转录病毒转导和活化Flt3突变(FltITD)进入正常人类CD34+造血干细胞和祖细胞所开发的hGM-CSF依赖性AML细胞株。在体外或在NSG小鼠体内没有GM-CSF之下，MA10细胞没有增殖。GM-CSF是限制物种的，人类细胞因子在小鼠体内没有活性而且小鼠GM-CSF对人体细胞没有活性。

发明人证明，每天将1μg的人类GM-CSF腹腔注入移植有MA10细胞的NSG小鼠将支持MA10细胞的植入和扩张(未示出数据)。本发明还证明的是，皮下植入释放1μg/天的人类GM-CSF持续42天的渗透性微型泵(Alzet)将维持MA10细胞的不断扩张。

图12展示在无细胞因子支持(左)或通过微型泵植入物投予人类GM-CSF(右)的NSG小鼠体内静脉注射移植表现GFP/荧光素酶的一百万个MA10细胞的结果。生物摄像在第28天进行。

图12显示在静脉注射一百万个细胞后在第18天比较有或没有微型泵的MA10植入。在第18-25天有明显的白血病植入，由只在GM-CSF存在下的荧光素酶生物摄像证明(右侧两只老鼠)，没有hGM-CSF之下没有植入(左侧两只老鼠)。这个人类白血病异种移植物对BO-1055单一疗法的戏剧性反应特别明显，因为相对于裸鼠异种移植物，没有可以在通过化疗剂进行药物减积之后促进肿瘤根除的功能性NK细胞或残余T或B细胞功能。

(xi)在移植有MA-10-W51脐带血CD34+细胞、用MLL-AF9转导和组成型活性Flt3内部串接复制(W51)及使用单剂量BO-1055治疗的NSG小鼠的BO-1055异种移植研究

将NSG小鼠(六组)皮下植入产生hGM-CSF的微型泵并静脉注射表现预后不良白血病的10⁶个MA-10-W51细胞，该预后不良白血病是通过使用MLL-AF9和Flt3ITD致癌基因转导脐带血CD34+细胞发展的。在白血病细胞注射后10天，将30mg/kg的单剂量BO-1055投予一半的小鼠，其余仅注射培养液。

如图13所示，此白血病生长缓慢，但在第50天所有的对照小鼠被明显植入(左侧)，而在BO-1055治疗的小鼠(右侧)是不可检测或最多植入边缘。这种肿瘤抑制效果特别明显，因为只使用单一剂量的30mg/kgBO-1055获得。

(xii)BO-1055针对原发性(MLL-AF9+)小儿AML的体外和体内细胞毒性

在诊断时获得来自患有MLL-AF9+AML的儿科患者的骨髓样本，并使用表现GFP/荧光素酶融合基因的慢病毒载体转导。通过FACS分离GFP+CD34+细胞，并将10⁵个细胞静脉注入6只12周龄NSG小鼠中的每一只。每隔一段时间拍摄小鼠并在初始植入后第35天一半小鼠开始BO-1055的治疗(每隔一天30mg/kg×5)，并且一半获得对照培养液。

如图14所示，在治疗的小鼠中没有可检测的白血病，而所有的对照小鼠已逐渐生长白血病。治疗组中1只小鼠在治疗开始后24小时死亡，但与治疗无关。BO-1055治疗的小鼠表现出肿瘤消退，在第47天没有可检测到的肿瘤(最后药物治疗后4天)。

(xiii)移植有第二代MLL-AF9+AML-2的NSG小鼠之卡普兰-迈耶存活分析

如图15所示，静脉注射来自患有MLL-AF9+白血病的儿科患者的原发性AML样本的6×10⁶个细胞的NSG小鼠在160天内全部死亡，而在白血病细胞注射后第7天开始使用BO-1055(30mg/kg Q10D2×)治疗的组多活48天。鉴于相对大量的注射白血病细胞和白血病的不良预后表型，这个反应尤其明显。

(xiv)BO-1055对原发性小儿B-ALL的体外和体内细胞毒性

在存在或不存在于0.001-20.0μm的剂量范围间滴定量测的BO-1055之下体外培养来自患有B-ALL的小儿患者的骨髓样本。

将剂量反应曲线与使用正常脐带血CD34+细胞得到的进行比较，正常脐带血CD34+细胞被保持在含FBS的培养液中或无血清培养液中(图16)。BO-1055对B-ALL细胞有高度细胞毒性(IC₅₀ 0.30μM)，而在含FCS培养液或在无血清培养液(具有补充剂的「血清替代」培养液)中的正常脐带血CD34+细胞相对抗BO-1055毒性(IC₅₀ 8.5-10.5μM)。然后用表现GFP/荧光素酶融合基因的慢病毒载体转导B-ALL细胞，并且通过FACS选择GFP+CD34+细胞(图17)。

(xv)原发性B-ALL的FACS分析

图17展现实验结果，从而通过Ficoll密度梯度分离原发性B-ALL细胞，并通过CD34亲和柱进一步选择轻密度细胞，然后分析FACS用于CD34和CD19的表现。

通过在FACS分析中结合CD34与B细胞标记CD19，原发性样本中19.3％的细胞是CD34。绝大多数的这些CD34细胞是CD34+CD19+双阳性的。亲和柱分离之后，100％是CD34+而98.4％是双阳性CD34+CD19+(图17)。

(xvi)在NSG小鼠移植后原发性小儿B-ALL细胞的器官分布

将NSG小鼠移植2百万个CD34+B-ALL细胞或2百万个未分离细胞。植入之后，通过FACS分析使用单株抗体对人CD34和人CD19测定器官分布(表16)。巨大的脾脏肿大是明显的，有310-400百万个细胞的脾细胞密度，细胞密度比正常NSG小鼠增加30-40倍。这个增加的63-74％是由于人CD19+细胞扩增，而且这些中50-54％是CD34+B-ALL细胞。植入的细胞也广泛渗入骨髓中，且每个股骨有37-56百万个细胞，而且这些中92-96％是人CD19+，而68-81％是人CD34+CD19+。B-ALL细胞也存在于末梢血液中(1％的人CD34+CD19+和2％的CD34-CD19+细胞)。

表16.在NSG小鼠体内移植后人类原发性B-ALL细胞的植入物和组织分布。

组织	细胞数量	hCD34+CD19+	hCD34-CD19+
				#1*脾	370百万	50.17％	12.62％
#1BM	40百万	81.18％	14.68％
				#2*脾	310百万	53.53％	12.24％
#2BM	37百万	74.44％	20.97％
				#3*脾	390百万	46.59％	20.67％
#3*BM	41百万	79.13％	16.02％
				#4脾	310百万	48.95％	17.73％
#4BM	38百万	68.20％	27.64％
				#5脾	400百万	50.43％	23.44％
#5BM	56百万	68.22％	24.33％

*:#1-#3获得2百万个CD34+细胞，#4-#5获得2百万个未结合细胞。

(xvii)BO-1055对静脉注射移植有原发性Pre-B-ALL-GFP-Lu细胞的NSG小鼠的作用

图19中使用的6只移植有原发性Pre-B-ALL细胞的小鼠表现出快速肿瘤生长及在开始BO-1055治疗7天内的肿瘤生长抑制(在第7天开始Q10D×2)(图18)。

图18显示四组生物摄像照片，每组都有3只小鼠。左侧的3组显示只有注射Pre-B-ALL CD34-GFP-荧光素酶细胞和对照培养液的小鼠；而右侧的3组显示注射Pre-B-ALLCD34-GFP-荧光素酶细胞并被进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

在71天之前，对照小鼠具有广泛的肿瘤浸润，主要在脊柱和颅骨的骨髓内，而2只幸存的BO-1055治疗小鼠中的一只没有可检测到的肿瘤，而另一只主要在股骨和肱骨的头部具有小白血病病灶。第三只小鼠因为与肿瘤发展或治疗无关的原因而死亡。此数据显示在BO-1055治疗小鼠中肿瘤生长有明显的对数2的减少。

将在有或没有BO-1055治疗的异种移植研究中为原发性B-ALL荷瘤小鼠计算出的卡普兰-迈耶存活曲线显示于图19。这个BO-1055的时间表对荷瘤小鼠的总存活率有非常明显的影响，且药物治疗组的存活比对照治疗组长～100天。

实施例13B

肺癌

在2014年全世界有160万个肺癌病例。在美国有224,210个新病例且159,260人死亡，而且5年存活率为16.8％。假使在早期(IA)诊断，则5年存活率为49％，但假使在第四阶段诊断，则5年存活率为1％。

(ⅰ)肺癌亚型

肺癌是大的和极其异类的恶性肿瘤家族。在2004年修订的世界卫生组织(WHO)输入系统中明确认定超过50种不同的组织变体(Brambilla等人，2001年)。肺癌依组织学类型被大致分类成非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。

(ii)非小细胞肺癌(NSCLC)

非小细胞肺癌可被细分为腺癌、大细胞癌和鳞状细胞癌。腺癌是最常见的(所有肺癌的40％)，接着是鳞状(30％)、小细胞(13-15％)、及大细胞(9-10％)(Travis等人，2004年)。罕见的亚型是巨细胞癌、肉瘤样癌、横纹肌癌及乳头状腺癌。支气管肺泡癌是更频繁发生在女性非吸烟者和有较好预后的腺癌的一个亚型。许多细胞株已经从这些亚型衍生出，而且有一些细胞株可以具有超过一种亚型的特征，例如腺鳞状线。K-Ras致癌基因突变是10-30％肺腺癌的原因，而约4％的非小细胞肺癌涉及EML4-ALK酪胺酸激酶融合基因(Sasaiki等人，2010年)。突变和表皮生长因子受体(EGFR)的扩增在NSCLC是常见的，并为使用EGFR抑制剂治疗提供依据。Her2/neu较少受到影响(Dempke等人，2010年)。其它时常突变或扩增的基因是c-MET、NKX2-1、LKB1、PIK3CA及BRAF(Dempke等人，2010年，Dela Cruz等人，2011年)。

(ⅲ)在一组43个NSCLC细胞株上BO-1055与四种烷化药物相比的细胞毒性

收集大量的NSCL细胞株组来含括形态亚型，包括腺癌(30株)、腺鳞状癌(4株)和鳞状癌(9株)。

表17显示在一组代表非小细胞肺癌腺癌、鳞状细胞癌及显示混合的腺和鳞状形态的细胞株的45个人类细胞株上BO-1055与四种其他的烷化化疗剂-烷化铂药物卡铂和顺铂、及烷化药物马法兰和BCNU(苯达莫司汀)相比的IC₅₀值。这些中，38株被用于评估BO-1055的细胞毒性，而18株被发现有抗药性(IC₅₀≥10μM)，6株呈弱抗药性(IC₅₀ 5.0-9.9μM)，13株是弱敏感的(IC₅₀ 1.0-4.9μM)，只有1株是高度敏感(IC₅₀<1.0μM)。在腺癌组中，9/26的株是在中度至高度BO-1055化学敏感组中，包括在EGFR、KRAS(×2)HER2/4、EML4-ALK(×2)、TP53、BRAF有突变并删除SMARCA4的株。在鳞状和腺鳞状组中，5/12的株是中度敏感的，而7/12是中度到高度抗BO-1055的。在中度敏感组中上调或突变的致癌基因包括PIK3C、KRAS、FGFR、CDKN2A、及TP53。

从这些观察可以得出的结论是，BO-1055的细胞毒性未通过癌症的突变状态明显确定，因为具有相同突变的细胞株可以是敏感或有抗药性的。肺癌细胞株中对BO-1055的差异敏感度的分子基础仍有待确定。

表17.在30个非小细胞肺癌腺癌、4个肺腺鳞状细胞株、及9个肺鳞状细胞癌株上BO-1055与4种烷化药物卡铂、顺铂、马法兰、及BCNU相比的细胞毒性(IC₅₀μM)。

*癌症的体细胞突变COSMIC目录

(iv)大细胞肺癌(LCLC)

非小细胞肺癌中，这种类型通常是在稍后的阶段发现。大细胞肺癌倾向于快速生长，并蔓延到附近的淋巴结进入胸壁。大细胞肺癌还可蔓延到更远的器官，即使当肺中的肿瘤是相对较小时。在美国每年大约有20,000个新病例。

LCLC的一种临床重要亚型是「大细胞神经内分泌癌」(LCNEC)，大细胞神经内分泌癌被认为是由神经内分泌细胞衍生的。此外，被称为「联合大细胞神经内分泌癌」(或C-LCNEC)的「子变体」被认定在新的WHO分类下。要被称为c-LCNEC时肿瘤必须含有至少10％的LCNEC细胞，并与至少10％其他形式的非小细胞肺癌结合。

(v)BO-1055对4个大细胞肺癌株的细胞毒性

发明人已经评估了BO-1055对四种大细胞肺癌细胞株(H1299、H299、H460、及SHP77)的细胞毒性。如表18所示，测试的细胞株对BO-1055有中度到高度的化学敏感度。

表18.BO-1055对四种大细胞肺癌细胞株的细胞毒性(IC₅₀μM)。(注意，*SHP77被认为是SCLC的衍生物或混合的SCLC/LCLC)

(vi)小细胞肺癌(SCLC)

这种肺癌是衍生自小支气管的神经上皮或神经内分泌细胞，并可以表现CD44。该细胞含有密集的神经分泌颗粒，从而给予这种肿瘤内分泌/肿瘤相关症候群。大多数病况出现在较大气道中、成长快速、而且在病程早期蔓延，在表现时有60-70％的转移。

(vii)联合小细胞肺癌(c-SCLC)

依据目前世界卫生组织的肺肿瘤分类方案c-SCLC被认为是SCLC的变体。c-SCLC是一种多相肺癌，含有与非小细胞肺癌中的一个(或更多个)组分混合的SCLC组分。虽然c-SCLC的真正发病率是未知的，但病例系列表明c-SCLC可能占SCLC所有病例的多达25％至30％，并占所有肺癌病例的4％至6％。在「纯」SCLC中EGFR突变是非常罕见的(<5％)，但EGFR突变在c-SCLC中是相当多见的(约15％-20％)。这些阳性肿瘤更可能响应EGFR-TKI的治疗。在高(50％-67％)比例的病例中，c-SCLC出现来表现女性激素(即雌激素及/或孕激素)受体，类似于乳癌。

然而，目前未知这些受体的阻断是否影响c-SCLC的生长。

(ⅷ)BO-1055在变体形式的小细胞肺癌细胞株上的细胞毒性

由NCI细胞株H82、H211及H526提供变体形式的SCLC的三个实例。如表19所示，两个细胞株对BO-1055是高度敏感的(IC₅₀ 0.34-0.39μM)，而一个是中度敏感的(IC₅₀ 2.00μM)。

表19.BO-1055在三种不同小细胞肺癌细胞株上的细胞毒性(IC₅₀μM)(IC₅₀μM±标准偏差)

(ⅸ)BO-1055在一组SCLC株上的细胞毒性与其它烷化药物和化疗剂的毒性相比

使用阿尔玛蓝试验评估11种SCLC株(包括典型和变体形式的SCLC)的BO-1055 72小时细胞毒性(表20)。包括3种典型和3种变体的6种株是非常敏感的(IC₅₀ 0.05-0.39μM)，具有25-200的治疗指数(TI)范围。一种是中度敏感的(IC₅₀ 2.00μM)，TI是5，包括2种典型和2种变体的4种株具有抗药性(IC₅₀ 20-40μM)，且TI为0.4-1.6。三种烷化剂(顺铂、马法兰和BCNU(卡莫司汀))也对一些株表现出高细胞毒性，而其他具有抗药性。

使用顺铂治疗，3/19的株是高度敏感的(IC₅₀<1.0μM)，14/19是中度敏感的(IC₅₀1.0-4.9μM)，而2/19是高抗药性的(IC₅₀>10.0μM)。

类似地，使用马法兰，4/16的株是高度敏感的，5/16是中度敏感的，2/16有中度抗药性，而5/16有高度抗药性。测试的所有株都对BCNU/卡莫司汀有高度抗药性。蒽环类抗肿瘤抗生素阿霉素对测试过的17个株有高度毒性。阿霉素不是任何用于SCLC联合化疗的主要方案的组成部分，可能反映潜在的严重副作用，尤其是心毒性。长春新碱对16/17的株有高细胞毒性，一个是中度敏感的。VP-16/依托泊苷表现出混合模式的毒性，且6/16的株是高度敏感的，5/16是中度敏感的，2/16有中度抗药性，3个有高度抗药性。在烷化剂与BO-1055之间没有交叉抗药性的证据。例如，H82株对BO-1055非常敏感，但对顺铂、马法兰和BCNU以及依托泊苷有高度抗药性，而且是所有测试的株中对阿霉素最有抗药性的。

表20.BO-1055与在一组21个包括典型和变体实例的小细胞肺癌细胞株上筛选的三种烷化药物(顺铂、马法兰、BCNU/卡莫司汀)、蒽环抗肿瘤抗生素(阿霉素/阿德力霉素)、长春花生物碱微管蛋白黏结剂、及细胞周期抑制剂(长春新碱/安可平)以及拓扑异构酶II抑制剂(VP-16/依托泊苷)相比的细胞毒性(IC₅₀μM)。

(x)BO-1055与其它烷化药物和化疗剂相比在SCLC细胞株H526上的治疗窗测定

从BO-1055对恶性细胞株的体外细胞毒性测定(IC₅₀值)与在一组正常人体组织上的细胞毒性相比来计算「治疗窗」(TW)，在本实施例(表20)中该恶性细胞株是SCLC变体株H526。良性组织包括：(a)人脐带作为新生儿源的内皮细胞(HUVEC)；(b)成人骨髓间质细胞(huMSC)；(c)通过hTERT的反转录病毒转导无限增殖的正常人肺支气管上皮细胞(Bci-NSI)；(d)通过hTERT的反转录病毒转导无限增殖的正常人输卵管基部上皮细胞(FTEC)及(e)人脐带血衍生的CD34+造血细胞，包含红血球的、颗粒细胞/单核细胞、巨核细胞及B淋巴细胞谱系的造血干细胞(HSC 5％)和造血祖细胞(CFC 95％)的群体。

BO 1055在其对抗H526的毒性和缺乏对抗筛选的正常组织组的毒性之间有100-533倍的优异治疗窗。这在与其它药物相比证明的明显较小治疗窗上有明显的对比，其它药物包括烷化药物4-羟基环磷酰胺(4-HC)、苯达莫司汀、马法兰及顺铂、而且还有拓扑异构酶抑制剂依托泊苷、SN38、HSP90抑制剂PUH71及微管结合生物碱长春新碱。

表21.与缺乏在正常上皮细胞、内皮细胞、间质基质及正常造血祖细胞(CFC)上的毒性相比，使用BO-1055在H526变异SCLC细胞株上获得的治疗窗(TW)。数据被标准化到对于H526为1.00的值。

化学药品	CD34+	HUVEC	huMSC	Bci-	FTEC	H526
							BO-1055	100.0	333.33	133.33	266.67	533.33	1.00
4-HC	1.68	33.75	33.75	15.00	10.42	1.00
							苯达莫司汀	1.60	24.00	48.00	24.00	64.00	1.00
马法兰	1.20	10.00	4.00	6.00	20.00	1.00
							顺铂	33.33	58.33	75.00	83.33	1041.7	1.00
阿霉素	0.23	0.90	180.00	1.28	512.82	1.00
							依托泊苷	0.75	5.83	10.50	25.00	1333.3	1.00
PUH71	0.70	40.00	20.00	50.00	200.00	1.00
							SN-38	8.67	0.93	23.33	740.74	925.93	1.00

(xi)使用BO-1055治疗异种移植小细胞肺癌细胞株H526的NSG小鼠之体内研究

通过皮下注射50,000个肿瘤细胞在10只12周龄的NSG雄性小鼠的组中建立GFP/荧光素酶标记的H526的异种移植物。在第12天进行荧光素酶生物摄像，然后将5只小鼠静脉注射30mg/kg的BO-1055，并且5只小鼠注射培养液作为对照。从第12天至第30天每隔一天重复BO-1055或对照培养液的注射，并在第12天在基线及在药物治疗过程中在第21天、第26天和第30天进行生物摄像。

图20显示八组、每组五只小鼠的生物摄像照片。左侧的四组显示只被注射GFP-Lu-SCLC H526细胞和对照培养液的小鼠；而右侧的四组显示被注射SCLC H526细胞并进一步使用脲基氮芥治疗的小鼠。

如图20中可以看出的，从第12天到第30天在4/5的对照小鼠中看到发展中的肿瘤生长(1只小鼠在基线具有移植的肿瘤，但并没有表现出发展中的肿瘤生长。在BO-1055治疗的小鼠中在第26天未检测到肿瘤，而且在第30天3/5被治疗的小鼠仍然无肿瘤。

在图21中将数据表示为总光子发射，图21显示在第20天和第30天之间在治疗与对照小鼠之间有对数2的总光子发射差。

(xii)带有SCLC H526异种移植物且使用BO-1055治疗的裸鼠之体内研究

本发明人还评估了BO-1055在带有SCLC H526异种移植物的裸鼠体内的治疗功效。使用经由静脉注射以40mg/kg BO-1055治疗四只小鼠，每2天1次，共4次。使用伊立替康(30mg/kg，每天1次共6次，静脉注射，n＝4)和依托泊苷(30mg/kg，每2天1次共6次，静脉注射，n＝4)作为正对照组。如在图22A和图22B所示，BO-1055比伊立替康或依托泊苷更有效。

当肿瘤体积大于2000mm³时将荷瘤小鼠牺牲。在第47天将对照和正对照小鼠牺牲；BO-1055治疗的小鼠(n＝4)：在第28天3/4完全缓解(CR)，在第32天2/4CR；在第77天1/4CR。

实施例13C

淋巴瘤

淋巴瘤是淋巴系统的肿瘤，而且占所有癌症的3-4％，在成人中是第7最常见形式的癌症，而在儿童中是第3最常见的。在2012年全球有566,000个病例和305,000人死亡。

有几十种淋巴瘤亚型，一些被认为是可治愈的，而其他的预后则非常差。治疗选择包括一些化疗、放疗、标靶疗法及手术的组合。

在下面讨论其中一些亚型。

(ⅰ)霍奇金淋巴瘤(HL)

这种形式的淋巴瘤是通过里德-斯特恩伯格细胞的存在所标示。有两种主要的霍奇金淋巴瘤类型，最常见的是大多在青壮年中发现的结节硬化形式。第二个最常见的形式是混合细胞型亚型，男性最常见，更可能被诊断出时已是晚期。这些病例中70％涉及Epstein-Barr病毒。

(ⅰi)非霍奇金淋巴瘤(NHL)

在2014年在美国有70,800个新的非霍奇金淋巴瘤病例，其中10％是T细胞淋巴瘤，而90％是B细胞淋巴瘤。有一些B细胞非霍奇金淋巴瘤的亚型具有不同的预后和治疗反应。

(iii)滤泡性淋巴瘤

滤泡性淋巴瘤在美国和欧洲是第二最常见形式的淋巴瘤，且在2014年有14,160个新病例。滤泡性淋巴瘤发生在老年人，通常涉及淋巴结、骨髓及脾，与过度表现Bcl-2的t(14；18)易位相关。最常见是无痛，而且生长非常缓慢。没有已知的治愈；然而，超过85％的患者在确诊后活至少五年，而且50％的患者活超过12年。诸如通常与利妥昔单抗组合的苯达莫司汀(Treanda)和来那度胺(Revlimid)药物已被证明对这种亚型是有效的，而且可以用来作为一线治疗的一部分。随着时间的推移，滤泡性淋巴瘤可能变成DLBCL，然后需要更积极的治疗。

(iv)原发性纵隔B细胞淋巴瘤

这种淋巴瘤主要影响十几岁到30岁出头的人。许多患者使用化疗和放射治疗的组合治愈。然而，即使有这种治疗，约20％的患者仍具有发展中的疾病。

(ⅴ)未另作指定的周边T细胞淋巴瘤

这是最常见的T细胞淋巴瘤，而且通常表现为小到大CD3+淋巴细胞的混合物并具有不规则的核轮廓。可以被进一步细分成几种罕见变体，但所有常常都是弥散性的而且通常是攻击性的肿瘤。

(vi)霉菌病蕈状肉芽肿

这是最常见的皮肤淋巴恶性肿瘤，呈现局部或更一般化的皮肤淋巴细胞浸润且通常无痛。在较攻击性的变体塞扎里氏病(Sezary’s disease)中，有皮肤红斑和末梢血液参与。5年的总生存率为75％。

(vii)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)

这是最常见形式的淋巴瘤。在北美包含～35％的NHL，并占所有攻击性病例的60％。在2014年美国有21,240个新病例。DLBCL可以细分为具有生长中心B细胞(GCB)起源和具有活化B细胞(ABC)起源的。DLBCL是NHL的攻击性形式，约40％的时间涉及淋巴结以外的其他器官。

(viii)结合代表ABC和GBC子组的人类DLBCL细胞株的淋巴瘤细胞株组的建立；人外膜细胞淋巴瘤株和鼠B细胞淋巴瘤

(a)细胞株和方法：在IMDM培养液中培养弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株LY1、Ly8、Ly10、Ly18，并在RPMI中培养Ly3、Ly19、SUDHL-4、SUDHL-6、Pfeifer、Farage、Toledo、Karpas-422、HBL1、U2932。在RPMI培养液中例行培养外膜细胞淋巴瘤(MCL)细胞株JEKO-1、Mino、Granta-519、NECB-1、Z-138、REC-1及HBL2。所有培养液都补充了10％FBS、1％L-谷胺酰胺、1％青霉素和链霉素。在GRCF DNA Services(马里兰州巴尔的摩市的约翰·霍普金斯大学)使用分析套组(PowerPlex 16HS)通过STR分析验证之后从美国菌种中心(ATCC，马纳萨斯，VA，USA)或从MSKCC调查者取得细胞株。

(b)自发性鼠B细胞淋巴瘤:我们还通过NSG小鼠的重复传代按照腹膜内或皮下注射加基质胶或通过静脉注射任一者保持了在裸鼠体内自发形成的CD19+B细胞淋巴瘤。这个原发性淋巴瘤类似于人的DLBCL，并被用于测定BO化合物在体外长期保持淋巴瘤细胞所必需的鼠MS5基质细胞存在或不存在下进行体外治疗的细胞毒性。

(ⅸ)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株的表型和分子特征

如表25所示，用以评估BO-1055细胞毒性的十二种人类非霍奇金淋巴瘤细胞株是可基于从生长中心B细胞(GCB)或活化B细胞(ABC)的衍生被进一步细分为亚型的DLBCL实例。其中八个株有TP53突变，而七个有BCL2t(14；18)易位。这种易位存在于～70％的滤泡性淋巴瘤和～30％的弥漫性大B细胞淋巴瘤中。其他类型的BCL2基因重排或扩增在两个株中发现，而三个株具有野生型(wt)BCL2。BCL6基因在5/10的株是野生型，在3/10扩增，在一个易位，并且在一个被删除。

BCL6基因状态被匹配到由每个细胞株产生的BCL6蛋白水平。Myc在4/12的株中被扩增或重新排列。

表22还显示了患者在为了细胞株生产取得细胞时的临床状态。五个株在第一次确诊时取得而七个株在复发时取得。细胞株的细胞遗传学研究显示，3例具有正常数量的染色体，5例为超二倍体，3例为近四倍体或超四倍体。

表22.生长中心B细胞(GCB)亚型或活化B细胞(ABC)亚型的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株之起源与分子特征。

Mut＝突变基因，Wt-野生型基因，Amp＝扩增基因，Rea＝重新排列，Del＝剔除基因，Trans＝易位，Dx＝诊断时，Rel＝复发时，nd＝未测得。

(x)BO-1055在淋巴瘤细胞株的细胞毒性

测定BO-1055的体外细胞毒性：(a)16种人类DLBCL细胞株，12种属于GCB子组，4种属于ABC子组：(b)7种人外膜细胞淋巴瘤株以及(c)一种在支撑的基质单层存在或不存在下的原发性鼠B细胞淋巴瘤(表23)。

基于评估的21-25株，在整体药物反应中三个淋巴瘤子组和鼠B细胞淋巴瘤没有明显发散。

表23.对24种淋巴瘤株筛选的BO-1055之细胞毒性(IC₅₀μM)比较，淋巴瘤株包括人类DLBCL亚型GBC和ABC、外膜细胞淋巴瘤及自发性鼠B细胞淋巴瘤的实例。

数据显示BO-1055的IC₅₀μM。灰色底色的值≥8.00μM。

(xi)BO-1055和33种化疗剂对40种淋巴瘤细胞株筛选的细胞毒性之比较，化疗剂包括路径靶向剂、HSP90和HSP70抑制剂、蛋白酶体抑制剂、顺铂、阿霉素及硼替佐米

将BO-1055的细胞毒性(IC₅₀μM)与一组抗癌药物-化合物的细胞毒性相比，该组抗癌药物-化合物包括路径靶向剂、HSP90和HSP70抑制剂、蛋白酶体抑制剂、顺铂、阿霉素、及硼替佐米。这些被评估用于针对各种淋巴瘤细胞株的细胞毒性，包括人类DLBCL GBC和ABC亚型、外膜细胞淋巴瘤，如表24所示。

此表显示在公众可访问网站上可取得的数据(IC₅₀μM)(Broad研究所，桑格研究所)以及由Drs T.L.Su和台湾中央研究院的Lee、及Dr M.A.S.Moore和他在MSKCC的同事产出的数据。

(a)评估用于与表24的BO-1055比较细胞毒性的化合物性质。

ARN：ARN-231卵巢癌干细胞抑制剂(Moore MA未公开)

TT46HSP70抑制剂(Kang等人，2014年)。

PUH71：HSP90抑制剂(Ambati等人2014年，Jhaveri等人2014年)。

17-AAG/坦螺旋霉素：HSP90抑制剂(Jhaveri等人，2014年)。

Bort：硼替佐米/万珂：蛋白酶体抑制剂。

Cisp：顺铂烷化剂铂类药物。

Doxo：阿霉素，一种蒽环类抗肿瘤抗生素。

TK：TKI258、Dovitinib、EGFR、FGFR1、PDGFRβ、VEGFR-1、KDR抑制剂、诺华三期。

AEW：AEW541，一种IGFR抑制剂，临床前，诺华。

SOR：索拉非尼/多吉美、Flt3、c-KIT、PDGFRβ、RET、Raf激酶B、Raf激酶C、VEGFR-1、KDR、FLT4抑制剂，FDA2005年批准，拜耳。

TOPO：拓扑替康/癌康定，拓扑异构酶1抑制剂。FDA1996年核准，葛兰素史克。

(b)在(xiii)(a)描述的各种化合物在各种代表不同肿瘤子组的人淋巴瘤细胞株的组上的细胞毒性

10个株是高度敏感的(IC₅₀ 0.11-0.87μM)，6个株是中度敏感的(IC₅₀ 1.95-4.14μM)，6个株有中度抗药性(IC₅₀ 5.06-8.95μM)，只有1个株有高抗药性(IC₅₀ 12.5μM)。

使用BO-1055筛选的27个株中，11个株是高度敏感的(定义为IC₅₀<1μM)，具有IC₅₀0.12-0.84μM。14个株是中度敏感的(定义为IC₅₀ 1.00-4.99μM)，具有从1.08-4.90μM(TI2.04-9.03)的IC₅₀。两个株有抗药性(IC₅₀>10.0μM)。将DLBCL株细分为ABC和GBC类型评估BO-1055细胞毒性没有发现明显差异。在4个株的ABC组中，一个株是非常敏感的(IC₅₀<1.0μM)，而三个株是中度敏感的(IC₅₀ 1.0-4.9μM)。

在GBC组的10个株中，4个非常敏感的，4个中度敏感，1个有中度抗药性，而一个对BO-1055有高抗药性。TP53状态似乎并没有确定BO-1055的敏感性，因为八个具有TP53突变的株有一个范围的IC₅₀值(0.29-4.90μM)，4个TP53野生型株也是(IC₅₀ 0.12-7.02μM)。BCL2突变状态同样没有确定BO-1055的毒性，因为具有WT Bcl2的株有0.12至>10.0μM的IC₅₀范围，而突变/重排/扩增的BCL2株也有类似的范围(IC₅₀ 0.29-4.9μM)。

表24.BO-1055与各种抗癌剂相比的细胞毒性(IC₅₀μM)，该抗癌剂包括对各种淋巴瘤细胞株筛选的路径靶向制剂、HSP90和HSP70抑制剂、蛋白酶体抑制剂、顺铂、阿霉素、硼替佐米，该淋巴瘤细胞株包括人类DLBCL GBC和ABC亚型、外膜细胞淋巴瘤。

nd＝未测得灰色底色的值≥8.00μM。*起源于NOD-SCID-IL2Rγnull小鼠的自发性B细胞淋巴瘤。在没有基质支撑的淋巴瘤细胞上测得的细胞毒性。在照射MS5基质的共培养液上BO-1055的细胞毒性(IC₅₀)为0.80μM，顺铂的是>10.0μM*BO-1055的数据由MSKCC的DrM.A.S Moore和中央研究院的Dr T.L.Su产出。ARN的数据由Dr M.A.S Moore和在MSKCC的同事产出。TT46和PUH71的数据来自MSKCC的Drs G.Chiosis、M.A.S.Moore及E Caldas。由Dr SDanishefsky和在MSKCC的同事合成的Isofludalone的数据是由Dr M.A.S Moore和在MSKCC的同事产出。MSKCC首先开发的SAHA的数据来自多个来源。

(xii)BO-1055与阿霉素的组合对DLBCL(ABC亚型)细胞株OCY-LY3的细胞毒性

使用Chou-Talalay法(Chou和Talaley，1984年)计算组合指数(CI)，其中约定CI>1表示拮抗作用，CI＝1表示加成效果，而CI<1表示协同作用。多项研究确立，Chou-Talalay分析适用于药物之间的相互作用(Chou，2010年)。培育OCY-LY3细胞72小时，且药物浓度增加(从20μM-0.02μM8倍连续稀释)作为单一药物或药物组合(Cte对应于各别药物的IC₅₀)。处理后，通过阿尔玛蓝评估细胞。

图23A：通过GraphPad棱镜获得的增殖抑制曲线和IC₅₀。BO-1055或阿霉素在DLBCL(ABC亚型)细胞株OCI-LY3上作为单一疗法或组合的细胞毒性。

图23B：通过标准化GraphPad棱镜C.获得的增殖抑制曲线和IC₅₀。Fa-Ci图：作用导向的。

图23C：BO-1055与阿霉素组合的等效线图：左：BO1055Cte+DOXO Var。右：DOXO Var+BO1055Cte(Chou，2010年)。剂量导向–其中CI<1＝协同作用；CI＝1＝加成；CI>1＝拮抗作用。值通过CompuSyn软件(Chou和Talalay 1984年，Chou 2010年)计算。

等效线图：

(xiii)在DLBCL(GBC)细胞株上测定BO-1055与HSP抑制剂(PUH71、TT46)、硼替佐米、及阿霉素组合的细胞毒性

在药物的IC₅₀以7-9种不同的浓度滴定与BO-1055组合的药物，或将药物以对应于每个的IC₅₀的剂量加入并与7-9种不同浓度的BO-1055组合。标靶细胞株是GBC子组的12种人DLBCL细胞株。

在DLBCL(GBC)细胞株上使用以下组合的组合研究结果：1)BO-1055和HSP90抑制剂PUH71；及2)BO-1055和HSP70抑制剂TT46列于表25，表25给出每种药物在单剂治疗的IC₅₀数据及联合治疗的组合指数，其中一种药物在其IC₅₀μM下使用，而其它药物被滴定超过8次连续稀释(Chou 2010年)。

在组合1，BO-1055是变数，而HSP抑制剂在它们的IC₅₀μM剂量下使用。在组合2，PUH71或TT46是变数，而BO-1055在其IC₅₀μM剂量使用。表25的上段呈现PUH71的数据，而表25的底部部分呈现TT46的数据。

在BO-1055和PUH71的11个可评估数据组中，PUH71与BO-1055在对抗Z-138的两种组合中都是协同的，但与此相反，TT46在对抗同一细胞株的两种组合中都是拮抗的。PUH71对GRANTA是双重拮抗的，而TT46在组合-1对GRANTA是协同的，在组合2是拮抗的。两种HSP抑制剂与BO-1055组合对REC-1都是拮抗的。PUH71与BO-1055对MINO有双重协同作用，而TT46与BO-1055对此细胞株只在组合1是协同的，在组合2是拮抗的。PUH71和TT46与BO-1055对NECB1在组合1都是协同的，在组合2都是拮抗的。

表25.B0-1055与PUH71、TT46、硼替佐米、及阿霉素在DLBCL(GBC)细胞株上测定的潜在加成或协同细胞毒性

(xiv)外膜细胞淋巴瘤(MCL)

MCL为最稀有的非霍奇金淋巴瘤(NHLS)之一，包含约6％的NHL病例(在2014年有4960个新病例)。最常出现在60岁以上的人，而且男性比女性更常见，比率为4比1。在美国目前有～15,000位MLC患者。

它是从围绕正常淋巴结生长中心滤泡的外膜区内的CD5阳性抗原原始预生长中心B细胞恶性转化产生的。在人类中，CD5基因位于染色体11的长臂。CD5用于减轻来自BCR的活化讯号，使得B-1细胞只能被非常强的刺激(例如细菌蛋白)、而不是由正常组织蛋白活化。MCL细胞可以转移到其他淋巴结或组织，例如骨髓、肝脏和肠胃道。由于在t(11；14)(q13；q32)的易位，MCL是由周期蛋白D1蛋白的过度表现识别。涉及p53途径的其他基因异常对于疾病的发生和发展是重要的(参见表25)。MCL难以治疗，而且很少被视为治愈。中位存活时间是约3年左右，但现在新的患者被估计为接近6年。

(xv)BO-1055、环磷酰胺、阿霉素、太平洋紫杉醇及帕比司他对外膜细胞淋巴瘤细胞株的细胞毒性

如表26所示，BO-1055在各种MCL细胞株上的平均IC₅₀±SD(μM)值如下：

JEKO-1(0.266±0.27)，

Z-138(0.182±0.15)，

HBL2(0.161±0.34)。

本发明人的结果表示，BO-1055在其针对人B细胞淋巴瘤和各种正常人类细胞类型的毒性之间具有明显治疗窗(50-100倍)。使用BO-1055治疗导致在S相的细胞积累及参与DNA修复的蛋白上调[MRE11、p-P95/NBS1(ser343)、RAD50、p-ATR(ser428)]，而一个重要的B细胞淋巴瘤生物标记物Bcl-6被下调。

表26.BO-1055在一组7种人类外膜细胞淋巴瘤细胞株上的细胞毒性(IC₅₀μM)。为了比较，显示阿霉素(DNA嵌入蒽环)、太平洋紫杉醇(微管结合药物)、顺铂(烷化铂药物)、及帕比司他(HDAC抑制剂)的细胞毒性数据。

(xvi)BO-1055、4种烷化药物及四种其他化疗剂在MCL株JEKO-1上与五种正常组织相比的治疗窗量测

从表26呈现的IC₅₀数据计算治疗窗(TW)，表26显示使用11种化合物对抗一组良性组织和MCL细胞株JEKO-1得到的72小时细胞毒性(IC₅₀uM)。

表27显示各化合物的计算治疗窗。表27的上部显示十种化合物对五种正常人体组织和MCL细胞株JEKO-1的IC₅₀μM值。表的下部将数据表示为良性组织相对于Jeko-1上的IC₅₀之间的IC₅₀值倍数差异。

当使用正常造血细胞毒性作为潜在剂量限制毒性的决定因素时，BO-1055具有所有筛选药物的最佳TW。比较MCL数据与非造血正常组织的TW进一步支持BO-1055作为在对恶性细胞有高毒性的药物剂量下具有明显选择性且对正常组织伤害最小的高活性抗恶性肿瘤药物的位置。在比较其他良性组织与MCL株时观察到，由于对正常上皮细胞、内皮细胞、及间质基质缺乏明显毒性，BO-1055的TW也同样优异。

由于烷化药物4-HC、苯达莫司汀和顺铂、以及依托泊苷、HSP90抑制剂PU-H71和拓扑异构酶抑制剂SN38对正常造血祖细胞的毒性，这些药物也缺乏治疗窗。

在脐带血造血祖细胞(CD34+细胞、CFC)、内皮细胞(HUVEC)、骨髓间质干细胞(huMSC)、人hTERT无限增殖的肺支气管(Bci-NSI)和输卵管(FTEC)上皮细胞上测定IC₅₀(μM)。

表27.BO-1055在MCL株JEKO-1上的治疗窗(TW)量测，与阿霉素、依托泊苷、PUH71、SN-38、长春新碱、及四种烷化药物的TW相比。

表27显示的数据(下组)确定对恶性细胞有毒的、但对测试的正常细胞无毒的药物剂量之间的治疗窗(TW)。BO-1055的这个范围是从30-296倍，是筛选的11种药物中骨髓毒性最少的。

4-HC，环磷酰胺的活性代谢物，也对CD34+细胞和正常上皮和间质细胞具有高毒性。

苯达莫司汀和马法兰对正常上皮细胞、内皮细胞和间质具有高TW值，但当针对CD34+细胞评估时只有有限的窗(1.60-6.36倍)。

顺铂在上皮细胞与间质细胞上具有有限窗(1.6-8.0)，在内皮细胞上有小幅窗(50倍)，但被造血毒性明显限制。

当用于诸如卡波西氏肉瘤、尤文氏肉瘤、肺癌、睾丸癌、淋巴瘤、骨髓性白血病、及神经胶质母细胞瘤等癌症的化疗时，拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷也受限于对CD34+细胞的高毒性，如通过其记录的骨髓抑制副作用确认(Hande，1998年)。依托泊苷也已被用于骨髓或造血干细胞移植前的处理方案。

SN-38是天然生物碱喜树碱的半合成类似物伊立替康的活性代谢物，是一种有效的拓扑异构酶1抑制剂(比伊立替康本身有效1000倍以上)。体外细胞毒性试验显示，SN-38相对于伊立替康的效力从2倍变化到2000倍(Pommier等人，2010年)。SN-38对非造血组织的TW是250-2,500，但是对CD34+细胞只有8.75，这与SN-38代谢物是引起～25％服用伊立替康的患者经历的腹泻、骨髓抑制及极度免疫抑制等症状的原因的观察一致。

HSP90抑制剂PUH71的TW测定表示造血细胞和血管内皮细胞毒性问题的可能性，尽管假使能选择地抑制肿瘤血管生成后者可以是正面的特征。

长春花生物碱长春新碱是微管蛋白结合药物，抑制微管结构的装配和区块中期复制。它被用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤作为CHOP化疗方案的一部分，以及用于霍奇金氏淋巴瘤作为MOPP、COPP及BEACOPP的一部分。它也被用于治疗多发性骨髓瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、和肾母细胞瘤。它也可用于在使用地塞米松和L-天冬酰胺酶的ALL中诱导缓解，并与强的松(prednisone)组合来治疗儿童白血病。它已被用作治疗慢性特发性血小板减少性紫癜的免疫抑制剂。造血细胞和内皮细胞的TW都暗示药物的骨随抑制和血管破坏潜力。主要的副作用是化疗引起的、会愈来愈严重且不可逆转的周边神经病变。20-75％的治疗患者发生毛发脱落，而且它也是骨髓抑制的，并诱导白血球减少症和血小板减少症。

(xvii)BO-1055与硼替佐米、阿霉素、HSP90-和HSP-70抑制剂对外膜细胞淋巴瘤细胞株的药物组合细胞毒性研究

对一组由Jeko-1、HBL2、Z-138、REC-1、Granta、Mino、及NECB1代表的人外膜细胞淋巴瘤(MLC)细胞株测定BO-1055与硼替佐米/万珂、阿霉素、及热休克蛋白抑制剂PUH71(HSP90抑制剂)和TT46(HSP70抑制剂)组合可能的加成或协同细胞毒性作用。将这些数据显示于表28和29。

通过将BO-1055保持在对应于作为单一药剂时对细胞株测得的IC₅₀的单一浓度获得一组数据，然后通过组合BO-1055与在7-9倍范围的药物浓度间的滴定浓度的每个药物来评估相互作用的细胞毒性持续72小时，并且通过阿尔玛蓝试验测定细胞毒性/代谢活性的抑制作用(IC₅₀)。

通过组合一种在其作为单剂时的IC₅₀的药物与在药物剂量的7-9倍范围间滴定的BO-1055并在72小时进行IC₅₀测定来获得第二组数据。

使用5种可评估的株，BO-1055与万珂在对2种株(Z-138、MINO)的两种组合都是协同细胞毒性的，对1种株(REC-1)两种组合都是拮抗的，而且对2种株(RANTA、NECB1)组合1是协同的，组合2是拮抗的。使用BO-1055和阿霉素，两种组合对2种株(Z-138、MINO)都是协同的，两种组合对1种株(REC-1)都是拮抗的，而且2种株使用组合1是协同的，并且对组合2是拮抗的(RANTA、NECB1)。

因此，个别的MCL株显示响应药物组合的明显变化，但它们对万珂和硼替佐米的反应是相同的。与此相反，相同的MCL细胞株组对HSP90抑制作用显示与HSP70抑制作用相比不同的反应(表29)。PUH71与BO-1055在对Z-138的两种组合都是协同的，但与此相反，TT46在两种组合中对同一细胞株是拮抗的。PUH71对GRANTA是双重拮抗的，而TT46对GRANTA在组合1是协同的，在组合2是拮抗的。两种HSP抑制剂在与BO-1055的两个组合中对REC-1都是拮抗的。PUH71与BO-1055对MINO是双重协同的，而TT46与BO-1055对此细胞株只在组合1是协同的，而在组合2是拮抗的。PUH71和TT46与BO-1055对NECB1在组合1都是协同的，在组合2都是拮抗的。

表28.使用BO-1055和阿霉素或万珂(硼替佐米)组合治疗外膜细胞淋巴瘤株的功效

IC₅₀(uM)值是指个别单一药物或药物组合治疗。

协同作用：CI<0.9，加成：0.90≤CI≤1.10，拮抗作用：CI>1.10

表29.使用BO-1055与HSP90抑制剂PUH71或HSP70抑制剂TT46组合治疗外膜细胞淋巴瘤细胞株的功效

IC50(μM)值是指个别单一药物或药物组合治疗。

协同作用：CI<0.9，加成：0.90≤CI≤1.10，拮抗作用：CI>1.10

(xviii)外膜细胞淋巴瘤的异种移植模型与BO-1055产生的肿瘤抑制

使用GFP/荧光素酶标记JAKO-1外膜细胞淋巴瘤细胞株，并将500,000个细胞静脉注射到10只12周龄NSG雌性小鼠中的每一只。IVIS荧光素生物摄像是在第15天进行的，在该时间点5只小鼠每隔一天被静脉注射BO-1055(30mg/kg)持续10天，5只小鼠接受类似时间表的安慰剂(培养液)投予。每隔一段时间对动物摄像，如图24所示。

在肿瘤移植后对照组显现进行的肿瘤生长长达7周(在此对照组中一只小鼠在第32天之前死亡，但这个死亡可能与肿瘤无关)。BO-1055治疗的小鼠显现急剧抑制的肿瘤生长，而且在第7周(药物治疗结束25天后)在五只小鼠的任一只上没有可大略观察到的肿瘤。在治疗组中通过敏感性生物摄像检测到肿瘤逐渐复发，在第41天开始(图24)。所有对照小鼠在第7周都因肿瘤负担而被安乐死。在研究终止时，BO-1055治疗的小鼠在第75天都活着。

实施例14

肉瘤

在2013/14年据估计世界各地有60,000个肉瘤病例，在美国每年有3,020个新发病例，且1,460人死亡，5年存活率为66.6％。发展肉瘤的终生风险是0.1％。有超过70种病理肉瘤亚型。任何特定肉瘤的进展和预后皆取决于亚型以及阶段。两种主要的分支是骨肉瘤(病例的20％)和软组织肉瘤(病例的80％)。

(ⅰ)骨肉瘤

这是一种攻击性的恶性肿瘤，源自原始间质细胞并表现出骨母细胞分化和恶性类骨质产生。骨肉瘤在小儿患者中占所有恶性肿瘤的2.4％，并且占所有原发性骨癌的约20％。它是儿童癌症中第八常见的形式，而且在儿童和年轻成人中是最常见组织学形式的原发性骨癌。它是一种罕见的疾病，在欧洲和美国每年只有约1,000个体被确诊，每年约有300人死亡。

(ii)滑膜细胞肉瘤

这个肉瘤好发于青壮年，最常见于关节旁的手臂或腿，但他们很少侵入关节本身。最常见的部位是邻近膝盖。不像其他的软组织肉瘤，滑膜细胞肉瘤往往是痛苦的。治疗通常包括使用放射线根本切除与化疗或截肢结合化疗。

(ⅲ)横纹肌肉瘤

这些纹状或骨骼肌的癌性肿瘤是最常见的软组织肉瘤类型之一，而且在儿童中占确诊的软组织肉瘤的一半左右。它们最常生长在手臂或腿，但也会在头部或颈部或在泌尿或生殖器官中发展。有几种不同的类型，包括多形性的、泡状的、胚胎的及葡萄状的。

(iv)平滑肌肉瘤(平滑肌肉肿瘤)和子宫肉瘤

这些肉瘤是平滑肌的癌性肿瘤。他们最常发生在器官(例如肠胃道和子宫)。患者的平均年龄是60岁。在肠胃道中出现的肿瘤中61％发生于胃，29％在小肠，并且10％在结肠中。肠胃道或子宫平滑肌肉瘤的症状是大量出血和疼痛。转移发生在超过一半的患者身上。转移通常发生在肺部，肠胃道肿瘤除外，肠胃道肿瘤往往转移到肝脏。子宫平滑肌肉瘤的治疗是腹式子宫切除术。

(v)胃肠肉瘤，另外称为肠胃道间质瘤(GIST)

GIST发展于胃和肠道的基质，其特征是活化的c-Kit突变。可使用治疗。

(vi)卡波西氏肉瘤

卡波西氏肉瘤是在内衬口、鼻、肛门的皮肤或黏膜下方的组织中发现癌细胞的疾病。卡波西氏肉瘤有三组患者。第一组通常包括犹太人、意大利或地中海遗传的老年男性。这种类型的卡波西氏通常在10-15年间进展缓慢。患者共同在小腿的前部发展出蓝色病变，这通常蔓延成多重器官损伤。一段时间后，疾病会扩散到其他器官。卡波西氏肉瘤的第二组发生在接受器官移植的患者。由于移植后的免疫抑制治疗，患者的免疫系统被削弱因而更容易受到感染。卡波西氏肉瘤的第三组在艾滋病患者中发现。这组被称为流行性卡波西氏肉瘤。由于免疫系统被HIV病毒削弱，感染和其他诸如卡波西氏症的疾病会侵入人体。卡波西氏肉瘤在患有艾滋病的人身上通常扩散更迅速，而且可以在身体的许多部位发现。放射疗法通常是卡波西氏症治疗；然而，当病变已扩散到器官，往往也可使用化疗。

(vii)脂肪肉瘤

这是最常被诊断的软组织肿瘤，而且是在报导肉瘤的最大类别中。这些肿瘤通常在深部脂肪组织发展。它们最常发生在大腿、膝盖后面、腹股沟、臀肌区或腹膜后。脂肪肉瘤通常是恶性的，很少是来自预先存在的脂肪瘤，脂肪瘤是一种非癌肿瘤。他们最常在30至60岁之间的成人中发现，而且男性比女性稍微常见。转移到淋巴结发生在约10％的病例中。

(viii)软骨肉瘤

这些肿瘤从软骨细胞发展。

(ix)尤文氏肉瘤(ES)

尤文氏肉瘤家族肿瘤(ESFT)是主要在青少年和青壮年中发现的骨或软组织肉瘤，尖峰发生率在年龄10和20之间(Burchill，2008年)。ES的基因特征在于涉及尤文氏肉瘤断点区1(EWSR1)基因的染色体易位。染色体22上的EWSR1易位到染色体11发生在85％的ES病例中，形成了融合蛋白产物EWS-FLI1(de Alava&Gerald，2000年)。此外，融合产物EWS-ERG在10％的病例中确定。EWSR1断点似乎是遗传易位的热点，而且可以杂乱地结合其他肉瘤亚型中的C-末端基因例如透明细胞肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤等。FLI1、ERG及其他ETS基因含有DNA结合域，而EWS-FLI1蛋白的功能是作为调节恶性转化到ES的异常转录因子。患有转移性尤文氏肉瘤的患者预后仍然惨淡，尽管有全身治疗的发展，5年存活率通常不会超过30％(Jiang等人，2015年)。

(x)平滑肌肉瘤。这些肿瘤从腹部和骨盆区器官的平滑肌及血管发展

BO-1055在一组28种人的肉瘤细胞株中的细胞毒性

DNA交联剂持续是儿科肉瘤的化疗的重要部分。在目前的研究中，本发明人发现，BO-1055在体外和肿瘤异种移植模型中对各种肉瘤细胞株的细胞生长表现出明显的细胞毒性。发明人测定BO-1055在尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、及结缔组织增生性小圆蓝细胞瘤(DSRCT)细胞株中介导细胞毒性的功效，并与帝盟多、马法兰、及阿霉素相比。(表30)(Ambati等人，2014a,b)。

BO-1055对8/9的尤文氏细胞株是高毒性的(IC₅₀ 0.14-0.61μM)，而对1/9是中等毒性的(IC₅₀ 1.04μM)。同样地，BO-1055对4/5的横纹肌肉瘤株是高毒性的(IC₅₀ 0.08-0.40μM)，但对一个株(SMS-CTR胚胎型)有高抗药性(IC₅₀≥10.0μM)。两种结缔组织增生性小圆细胞瘤株对BO-1055是中度敏感的(IC₅₀ 2.41-3.74μM)。相比之下，5种骨肉瘤株中有3种对BO-1055有高度抗药性(IC₅₀≥10.0-≥100.0μM)。一个株是高度敏感的(IC₅₀ 0.45μM)，而一个是中度敏感的(IC₅₀ 2.67μM)。

在9种株上测定替莫唑胺(TMZ)毒性，其中3种是尤文氏肉瘤并且有高抗药性(IC₅₀245.0-405.0μM)，5/6的横纹肌肉瘤株亦如此(IC₅₀ 191.0>1,000.0μM)。RH30(滤泡型)横纹肌肉瘤株对TMZ有中度抗药性(IC₅₀ 9.0μM)，但对BO-1055高度敏感(IC₅₀ 0.24μM)。马法兰对所测试的8种尤文氏和横纹肌肉瘤株有高度细胞毒性(IC₅₀ 0.0001-0.020μM)。

阿霉素对其筛选的所有株都有高细胞毒性，包括三种尤文氏肉瘤(IC₅₀ 0.005-0.38μM)。对BO-1055有高抗药性的两种骨肉瘤株对阿霉素是高度敏感的(IC₅₀ 0.025-0.090μM)，测试的一种横纹肌肉瘤株亦同(IC₅₀ 0.011μM)。结果证明，BO-1055比TMZ更具细胞毒性，但对测试的肉瘤细胞株的细胞生长的影响比马法兰和阿霉素低。

表30.在一组代表4种肿瘤亚型的28种人肉瘤细胞株中测定BO-1055的细胞毒性活性，4种肿瘤亚型为：结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)n＝2，尤文氏n＝11，骨肉瘤n＝5，横纹肌肉瘤n＝9

¹DSRCT＝结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；²TMZ＝Temozolomide，²Melph＝马法兰，²Doxo＝阿霉素。³ND＝未测得；⁴混合的结缔组织和软组织，纤维母细胞

(xi)BO-1055在A673尤文氏肉瘤细胞和A204横纹肌肉瘤细胞中诱导在G2/M期的细胞周期阻滞

通过流式细胞术测定BO-1055在A673尤文氏肉瘤细胞株和A204横纹肌肉瘤细胞株中诱导的细胞周期抑制和凋亡(图25A)。图25A显示在12、24、48及72小时使用7-AAD(用于生存力测试)和Annexin V-APC(用于凋亡)染色、在指定浓度的BO-1055下A673细胞株的流式细胞术分析结果。

结果显示，BO-1055在两种细胞株中在G2/M期以剂量依赖和时间依赖的方式诱导细胞周期阻滞。

图25B显示在BO-1055治疗后在不同时间点的凋亡及死亡细胞百分比的图形表示。

图25C显示使用BO-1055治疗后48h和72h在A673细胞中的半胱天冬酶3/7活性之曲线图。

图25D为在施加不同剂量的BO-1055之后12、24、48及72小时死亡A673细胞的百分比之图形表示。

图25E为在施加不同剂量的BO-1055之后12、24、48及72小时凋亡A673细胞的百分比之图形表示。

(xii)BO-1055在甲基纤维素培养物肿瘤球形成试验中抑制A673尤文氏肉瘤

本发明人通过肿瘤球形成试验研究在甲基纤维素培养物中抑制A673尤文氏肉瘤(图26A和图26B)。

图26A显示使用各种浓度的BO-1055或4-氢过氧环磷酰胺治疗之后在甲基纤维素培养物中抑制A673尤文氏肉瘤肿瘤球形成。使用1.00μM的4-HC和<0.10μM的BO-1055看到50％的球形成抑制。

图26B显示甲基纤维素中形成肿瘤球。

结果显示，BO-1055比用作正对照的4-氢过氧环磷酰更具细胞毒性。

(xiii)BO-1055与不同化疗剂组合对A673尤文氏肉瘤细胞株的体外协同细胞毒性

本发明人评估使用BO-1055与不同化疗剂例如拓扑替康、SN-38、阿霉素、及PU-H71的组合BO-1055在A673尤文氏肉瘤细胞株上的细胞毒性作用。

如图27A-D所示，通过组合BO-1055与不同的测试化疗剂，BO-1055对A673尤文氏肉瘤细胞株有协同细胞毒性。

具体来说，在96孔盘中以格子形式同时施加改变浓度的BO-1055和第二药物并使用阿尔玛蓝细胞增殖试验定量细胞毒性。然后，使用Compusyn软件为每个组合产生Fa组合指数(CI)图和标准化等效线图。

图27A显示BO-1055与托泊替康组合的等效线图；

图27B显示BO-1055与SN-38组合的等效线图；

图27C显示BO-1055与阿霉素组合的等效线图；以及

图27D显示BO-1055与PU-H71组合的等效线图。这个组合展现体外对尤文氏肉瘤细胞的协同作用。

(xiv)BO-1055对NSG鼠体内的尤文氏肉瘤肿瘤移植物展现有效的治疗效果

测定BO-1055在荷尤文氏肉瘤异种移植物的NSG鼠中的治疗效果。如图31A-E所示，BO-1055以30mg/kg的剂量在裸鼠体内导致肿瘤生长完全消退，四剂通过尾静脉注射。在治疗组中注意到肿瘤完全消退。

通过尾静脉注射以10mg/kg、20mg/kg及30mg/kg的剂量给予荷有大小约100mm³的A673尤文氏肉瘤异种移植物的NSG小鼠(每组n＝5)5剂的BO-1055。將结果顯示于图28A-C。

图28A显示一周量测两次的肿瘤体积曲线图。

图28B显示小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图28C显示治疗小鼠的重量曲线图。

使用BO-1055通过尾静脉注射以30mg/kg的剂量隔日治疗每组荷A204横纹肌肉瘤异种移植物的裸鼠(n＝5)持续5剂。将结果显示于图28D和图28E。

图28D显示肿瘤尺寸图。

图28E显示经治疗小鼠的重量曲线图。

在治疗组中注意到肿瘤完全消退。

(xv)BO-1055有效抑制尤文氏肉瘤异种移植物，一种在NSG小鼠体内的抗环磷酰胺异种移植物

使用BO-1055对抗皮下移植到NSG小鼠体内的尤文氏肉瘤原发性患者肿瘤样本之抗环磷酰胺异种移植物。当肿瘤在NSG小鼠体内达到100mm³时，将小鼠随机分成对照组和药物治疗组。对照组小鼠接受PBS注射剂，药物治疗组的小鼠接受MTD剂量的环磷酰胺(70mg/kg)，隔日腹腔注射持续3剂(在图29中以较短的箭头图示)。肿瘤生长在环磷酰胺治疗小鼠中没有被抑制。当肿瘤达到≥500mm³时，开始使用BO-1055治疗，剂量为30mg/kg，隔日静脉注射4剂(以较长的箭头图示)。注意到使用BO-1055治疗后，环磷酰胺难治的肿瘤消退了。

将结果绘示于图29。如可以看到的，BO-1055抑制了来自已使用两种烷化剂治疗作为前期治疗的复发尤文氏肉瘤患者、在NSG小鼠(二次传代)体内建立的抗环磷酰胺异种移植物。

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Claims (8)

1.一种在需要癌症治疗的患者身上治疗癌症的方法，其包含投予所述患者治疗有效量的脲基氮芥，其中，所述癌症选自由白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、神经胶质母细胞瘤及肉瘤所组成之群组。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为白血病。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为淋巴瘤。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为小细胞肺癌。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为肉瘤。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法产生治疗上明显减少的癌细胞数目而且不会对非恶性组织产生明显毒性。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述脲基氮芥被配制成医药组合物。

8.如权利要求1所述的方法，进一步包含对所述患者投予另一种抗癌活性剂。