KR20180052612A - 유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법 - Google Patents

유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180052612A
KR20180052612A KR1020187005213A KR20187005213A KR20180052612A KR 20180052612 A KR20180052612 A KR 20180052612A KR 1020187005213 A KR1020187005213 A KR 1020187005213A KR 20187005213 A KR20187005213 A KR 20187005213A KR 20180052612 A KR20180052612 A KR 20180052612A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
human
inhibitor
ciepsc
Prior art date
Application number
KR1020187005213A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102142364B1 (ko
Inventor
홍쿠이 뎅
양 양
베이 리우
준 쉬
Original Assignee
베이하오 스템 셀 앤 리제너레이티브 메디슨 리서치 인스티튜트 씨오.,엘티디.
페킹 유니버시티
홍 구안 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이하오 스템 셀 앤 리제너레이티브 메디슨 리서치 인스티튜트 씨오.,엘티디., 페킹 유니버시티, 홍 구안 리미티드 filed Critical 베이하오 스템 셀 앤 리제너레이티브 메디슨 리서치 인스티튜트 씨오.,엘티디.
Publication of KR20180052612A publication Critical patent/KR20180052612A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102142364B1 publication Critical patent/KR102142364B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2311—Interleukin-11 (IL-11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2327—Interleukin-27 (IL-27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2331—Interleukin-31 (IL-31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

본 발명은 시험관내 배양 이후 분리된 만능 줄기 세포의 생체내 배아외 혈통을 발생시키는 능력을 연장시키는 인자, 본원에서는 만능성의 화학 연장제(CEP)에 관한 것이다. 또한 만능 세포의 배아 및 배아외 혈통을 발생시키는 능력을 연장시키는 방법에 관한 것이다. 재프로그래밍되는 세포는 유효량의 CEP와 세포를 화학적으로 유도된 연장 만능 세포(ciEPSC)로 재프로그래밍하기에 충분한 기간 동안 접촉된다. ciEPSC는 (i) 형태학적으로 및 (ii) 기능적으로 예를 들면, 생체내 TE 및 ICM 둘 다에 기여하는 이의 능력을 포함하는 특성을 기반으로 한 연장된 만능 세포로서 동정된다. ciEPSC는 배양되거나 목적하는 유형의 세포로 분화되도록 유도하고, 이것으로 제한되지는 않지만 세포 치료 및 조직 공학을 포함하는 다수의 적용에 사용될 수 있다.

Description

유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법
본 발명은 개략적으로 시험관내 배양된 만능 줄기 세포의 생체내 만능성(pluripotency)을 연장시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
초기 배아내 전능 세포(totipotent cell)는 모든 줄기 세포의 전구 세포이고, 태반 등의 배아외 조직을 포함하는, 전 유기체로 발달할 수 있다. 내세포괴(inner cell mass, ICM)내 만능 세포는 전능 세포의 자손이고, 배아외 조직을 제외한 신체의 어떠한 세포 유형으로라도 분화할 수 있다.
동물 발달은 난자를 정자로 수정하여 개시되고, 이후 유사 세포 분열 또는 분할이 즉시 후속되어 할구를 발생시킨다. 대부분의 동물에서, 세포형 다양화의 제1 단계는 1차 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 생성이다. 일반적으로, 내배엽은 위장관의 전구체이고, 이는 영양소 흡수에 필수적이고; 중배엽은 근육 및 혈구를 발생시키고, 이들은 각각 이동 및 심혈관 순환에 관련되고; 외배엽은 표피 및 뉴런으로 발달하고, 이들은 각각 환경으로부터의 보호 및 환경의 감지에 결정적이다. 따라서, 3개의 배엽의 형성은 동물 생명에 필수적인 다양한 조직을 발생시키기 위한 토대를 마련하고, 동물 발달 초기에 발생하는 진화적으로 보존된 이벤트이다.
그러나, 당해 상황은 포유동물, 구체적으로 마우스 및 사람 등의 진수류의 발달에 대하여 약간 상이하다. 포유동물 발달에서의 제1 세포 분화 이벤트는 3개의 배엽의 형성이 아니라, 2개의 별개의 세포 혈통(cell lineage): 영양외배엽(TE) 및 내세포괴(ICM)의 정착이다. TE는 어머니의 자궁과 직접 상호 작용함으로써 착상에 관여하고, 태반내 조직을 발생시킨다. 3개의 배엽이 ICM으로부터 형성되는 것은 착상 이후에만 되고, 이는 궁극적으로 동물 신체내 모든 조직들을 발생시킨다. 이는 문헌[참조: Marikawa, et al., Mol . Reprod . Dev., 76(11):1019-1032 (2009)]에 검토되어 있다.
ESC(배아 줄기 세포)는 배반포의 ICM에 존재하는 만능 세포의 시험관내 상대물이다. 발달 배아내 자연 만능 세포는 일시적으로 존재하는 한편, ESC는 시험관내 유지되어, 비제한적 미분화 세포원을 제공할 수 있다[참조: Tachiban, et al., Cell, 148(1-2):285-295 (2012)]. 분리된 시험관내 배양된 만능 줄기 세포의 하부스트림(downstream) 적용은 이의 효능(potency), 즉 다른 세포형으로 분화하는 이의 능력 및 이에 대한 용이성/ 시험관내 세포를 신속하게 연장시키는 능력에 좌우된다. 기형종 및 키메라 둘 다를 형성하는 세포의 생체내 분화는 세포의 발달 가능성을 평가하기 위한 기본적이지만 신뢰성 있는 도구이다. 몇 가지 연구로 배양된 만능 줄기 세포의 모든 3개의 배엽을 발생시키는 능력이 입증되었다[참조: Takashima, et al., Cell, 158:1254-1269 (2014); Chan, et al., Cell Stem Cell, 13:663-675 (2013); Theunissen, et al., Cell Stem Cell 15:471-487 (2014); Evans, et al., Nature, 292:154-156 (1981), Li, et al., Cell, 135:1299-1310 (2008); Buehr, et al., Cell, 135:1287-1298 (2008); Thomson, et al., Science, 282:1145-1147 (1998)]. 그러나, 시험관내 배양된 만능 줄기 세포는 예를 들면, 키메라 형성 및/또는 생체내 배아외 혈통 발생 불능성에 의하여 결정되는 바와 같은 제한된/한정된 세포 효능, 키메라 형성의 이의 불능성/비능률성에 의하여 결정되는 바와 같은 제한된 발달 가능성을 나타내고/내거나, 시험관내 세포를 신속하게 확장시키는 능력에 대한 제한을 제공하여, 배양시 세포를 안정하게 유지시키고, 이들 세포의 하부스트림 적용을 제한한다. 예를 들면, 나이브(naive) NHSM(나이브 사람 줄기 세포 배지)-hES(사람 배아 줄기) 세포 등의 만능 세포는 키메라 마우스 배아내 TE(영양외배엽) 및 ICM(내세포괴) 둘 다에 기여할 수 없음이 연구를 통해 나타나 있다(참조: Gafni, et al., Nature, 504(7479):282-6 (2013)). 배반엽상피 줄기 세포(EpiSC)는 즉시 기형종을 형성하나, 키메라를 거의 형성하지 않는다. 문헌[참조: Han, et al., Cell, 143:617-627 (2010)]에는 배양물 중의 약 99%를 구성하고(EpiSC) 키메라 기여를 나타내지 않는 EpiSC의 부분모집단이 기재되어 있다. 추가의 예로서, 세포 해리 후 사람 배아 줄기 세포의 불량한 생존률은 추가의 조작 및 발달을 저해한다.
따라서, 생체내 만능 줄기 세포의 세포 효능을 연장시키는 방법, 및 시험관내 세포를 신속하게 확장시키고 안정하게 유지시키는 방법이 요구된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 생체내 연장된 세포 효능을 갖는 만능 줄기 세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생체내 분리된 만능 줄기 세포의 세포 효능을 연장시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체내 분리된 만능 줄기 세포의 세포 효능을 연장시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 연장된 세포 효능을 갖는 만능 줄기 세포를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
인자들, 본원에서는 만능성의 화학 연장제(CEP)의 확인된 칵테일을 포함한 시험관내 배양물을 따라, 생체내 분리된 만능 세포(isPSC)의 세포 효능을 연장시키는 데 사용될 수 있는 인자들의 칵테일이 확인된 바 있다. CEP는 예를 들면, isPSC에 생체내 배아외 혈통 발생 능력을 부여함으로써 동일한 유기체로부터 수득한 상응하는 미처리 세포와 비교시, isPSC의 세포 효능을 연장시킨다.
CEPS는 (1) 시토카인; (2) 글리코겐 신타제 키나제(GSK) 억제제; (3) G 단백질 결합 수용체 억제제 아세틸콜린 수용체 길항제; 및 (4) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1(PARP1) 억제제를 포함한다. 바람직한 양태에서, 시토카인은 백혈병 억제 인자(LIF)("L)이고; GSK 억제제는 화학명 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴]의 CHIR99021("C")인, 아미노피리미딘이고; G 단백질 결합 수용체 억제제는 아세틸콜린 수용체 길항제, 보다 바람직하게는, mAChR(무스카린 아세틸콜린 수용체), 예를 들면, M2, DiM((S)-(+)-디메틴덴 말레에이트)("D")이고; PARP1 억제제는 MiH(미노사이클린 하이드로클로라이드)("M")이다. 유효량의 이러한 바람직한 CEP의 칵테일, 본원에서는 LCDM은 시험관내 만능 세포를 조건화하여, 배아 및 배아외 혈통을 발생시키는 이의 능력을 연장시키도록 할 수 있다.
또한, 본원에 개시된 CEP를 사용하여 공여 세포를 재프로그래밍(reprograming)함으로써 분리된 만능 줄기 세포의 생체내 세포 효능을 연장시키는 방법이 제공된다. 재프로그래밍되는 세포(즉, 공여 세포)는 충분한 시간 동안 CEP와 접촉하여 세포를 화학적으로 유도된/재프로그래밍된 연장 만능 줄기 세포(CiEPSC)로 재프로그래밍한다. 바람직한 양태에서, 세포는 초기에 CEP를 함유하는 재프로그래밍 배지에서 14-30일의 기간 동안 배양한다. 일부 양태에서, 세포는 세포를 CEPS와 접촉시키기 전에, Rho-결합, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase, ROCK)의 선택적인 억제제, 예를 들면, Y27632 [(+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드++ + 디하이드로클로라이드)]를 함유하는 배지에서 12 내지 48시간, 바람직하게는 24 내지 48시간, 가장 바람직하게는 24시간 범위의 기간 동안 배양된다. ciEPSC는 분리되고 추가로 배양될 수 있다. 당해 양태에서, ROCK 키나제 억제제는 계대배양전 최초 12시간 및 계대배양 후 12시간 동안 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 또 다른 양태에서, ROCK 억제제는 최초 수 개의 계대 동안, 예를 들면, 2-6 계대, 바람직하게는 최초 3-5 계대 동안 세포 배양 배지에 존재할 수 있다.
또한, ciEPSC가 개시된다. 본원에 개시된 바와 같은 CEP와 접촉된 재프로그래밍된 세포는 (i) 형태학적으로, (ii) 기능적으로: (a) 3개의 배엽의 조직으로 분화하는 세포의 능력; (b) CDX2, GATA6, HAND1 및 EOMES 등의 하나 이상의 배아외 표지자(marker)의 상향조절된 발현, (c) OCT4, NANOG, KL2, SOX2 및 UTF1(미분화 배아 세포 전사 인자) 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 하향조절; (d)TBX3 및 GBX2 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 상향조절; 및 (e) 생체내 배아 및 배아외 키메라 현상(chimerism)을 둘 다 형성하는 능력을 포함하는 특징들을 기반으로 한 연장 만능 줄기 세포로 동정된다. ciEPSC는 비-CEPS 처리 세포와 비교시, 이들 특성들중 하나 이상, 바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 전부를 갖는다는 점에서 본원에 개시된 CEPS에 노출된 적이 없는 세포와 상이하다. 상향조절 또는 하향조절은 이로부터 ciEPSC를 수득하는 상응하는 만능 줄기 세포내 측정된 인자 수준을 비교하여 결정된다.
본원에 개시된 ciEPSC는 적어도 이들을 발생시키는 데 사용되는 방법에 의하여, 즉 이의 기원에 의하여 사람 또는 마우스 ESC 또는 iPSC와 구별될 수 있다. ESC가 자연 발생 세포인 경우, ciEPSC가 본원에 기재된 바와 같이, 만능 세포를 소분자들의 조합으로 처리하여 수득되면, 다른 한편으로 ciEPSC는 자연 발생이 아니다(ciEPSC를 수득하는 상응하는 자연 발생 ESC에서 발견되지 않는 특징들의 소유에 의하여 입증된 바와 같음).
CEPSC는 배양되거나 유도되어 목적하는 유형의 세포로 분화할 수 있다. CEPSC 및 이의 자손은 이들로 제한되지는 않지만, 세포 치료 및 조직 공학을 포함하는, 다수의 적용에 사용될 수 있다.
도 1a는 스크리닝 화합물을 위하여 사용되는 전략을 나타내는 도면이다. 도 1b는 E10.5에서 키메라 검정의 요약을 나타내는 막대 그래프이다. 총 수태물: 회수된 E10.5 수태물의 총 수; Em(배아) & ExEm(배아외): 사람 세포가 Em 및 ExEM 조직 둘 다로 통합된 수태물의 수.
도 2a는 초회감작(primed) hES(n = 4, 생물학적 복제), 나이브 NHSM-hES(n = 4, 생물학적 복제) 및 hEPS(n = 4, 생물학적 복제) 세포내 배아외 유전자의 대표적인 상대 전사 수준을 나타낸다. 각각의 샘플에 대하여, RNA-seq로부터 유도된 유전자 발현 값은 초회감작 hES 세포내 상응하는 유전자의 평균값으로 정규화된다. 중심값(center value)은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준편차(s.d.)를 나타낸다. 도 2b 및 2c는 hEPS 세포(H1-EPS, H9-EPS), 초회감작 hES 세포(H1, H9), 및 나이브 hES 세포(H1-NHSM, H9-NHSM)에서의 선택된 배아외 유전자 발현의 Q-PCR 분석을 나타낸다. 각각의 샘플에 대하여, 유전자 발현값은 원래의 초회감작 H1 및 H9 세포내 값으로 개별적으로 정규화된다. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.(n = 2, 기술 복제)를 나타낸다. 도 2d는 hEPS 세포 및 hEPS 세포로부터 유도된 분화 EB(배양체) 세포내 배아외 유전자의 발현을 나타내는 Q-PCR(정량적 중합효소 연쇄 반응) 분석을 나타낸다. D0: EB 형성 검정전 수집된 hEPS 세포; D3: EB 형성 제3일에 수집된 hEPS 유도 세포. 유전자 발현값은 DO 세포로 정규화된다. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n = 2, 기술 복제).
도 3a는 초회감작 hES(n = 4, 생물학적 복제), hEPS(n = 4, 생물학적 복제) 및 나이브 NHSM-hES(n = 4, 생물학적 복제) 세포내 대표적 만능성 관련 유전자의 상대 전사 수준을 나타낸다. 각각의 샘플에 대하여, RNA-seq로부터 유도된 발현값은 초회감작 hES 세포내 평균 발현값으로 정규화된다. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다. 도 3b 및 3c는 hEPS 세포(H1-EPS, H9-EPS), 초회감작 hES 세포(H1, H9), 및 나이브 NHSM-hES 세포(H1-NHSM, H9-NHSM)내 선택된 만능성 유전자 발현의 Q-PCR 분석을 나타낸다. 각각의 샘플에 대하여, 유전자 발현값은 원래의 초회감작 H1 및 H9 세포내 값으로 개별적으로 정규화된다. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n = 3, 기술 복제). 도 3d 및 3e는 각각의 나타낸 유전자에 대한 바이올린 플롯으로서 나타낸 hEPS(n = 16, 생물학적 복제) 및 초회감작 hES 세포(n = 25, 생물학적 복제)의 단일-세포 qPCR 분석으로부터의 발현값의 도수 분포를 나타낸다. 비교를 위하여, 발현값은 ΔCT 값+20으로서 나타낸다. 백색 원은 각각의 샘플에 대한 유전자 발현값의 평균값을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 hES(n =2, 기술 복제) 및 hEPS(n = 2, 기술 복제) 세포내 모든 유전자 위의 H3K4me3 및 H3K27me3 염색질(chromatin) 표시의 프로파일을 나타낸다. 부위에 걸친 평균의 표준 오차(SEM)가 계산되고 평균 곡선 주위의 반투명 음영으로서 나타낸다. 도 4c 및 4d는 계대 7에서 상이한 조건하의 hEPS 세포내 선택된 유전자 발현의 Q-PCR 분석을 나타내는 막대 그래프이다. DiM(((S)-(+)-디메틴덴 말레에이트)(도 4c) 및 MiH(미노사이클린 하이드로클로라이드)(도 4d)를 LCDM[hLIF (사람 백혈병 억제 인자), CHIR99021, DiM, 및 MiH] 조건에서 동일한 표적에 대해 표적화하는 소분자로 대체시켰다. hEPS 세포는 LCM 조건하에 DiM(2μM), TH(5μM), DES(5μM)로부터 선택된 첨가된 소분자로 배양되거나, DMSO(디메틸 설폭사이드)로 각각 배양되거나, LCD 조건하에 MiH, BSI-201(5μM), NAM(100μM), PJ34(N-(6-옥소-5,6-디하이드로-페난트리딘-2-일)-N,N-디메틸아세트아미드.HCl)(5μM), 또는 DMSO로부터 선택된 첨가된 소분자로 배양되었다(도 4d). 발현값은 LCM + DiM(도 4c) 및 LCD + MiH(도 4d) 샘플의 평균값으로 정규화된다. LCM: 사람 LIF + CHIR99021 + MiH; LCD: 사람 LIF + CHIR99021 + DiM. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n = 3, 기술 복제). TH: 트리펠렌아민 HCL; DES: 데슬로라타딘; BSI: BSI-201; NAM: 니코틴아미드. 도 4e는 넉다운 후 계대 3에서 hEPS 세포내 선택된 유전자의 발현에 대한 PARP1 넉다운의 효과를 나타낸다. hEPS 세포는 LCD 조건하에 배양되었다. 발현값은 스크램블 제어(scramble control)의 평균값으로 정규화된다. 중심값은 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다 (n = 3, 기술 복제). 도 4f는 E12.5에서의 키메라 검정의 요약을 나타내는 막대 그래프이다. 막대 챠트는 회수된 E12.5 수태물 중에서 키메라의 백분율(회색, 배조직으로 통합(Em); 흑색, 배조직 및 태아외 태반 조직 둘 다로 통합(Em&ExEm))을 나타낸다. 도 4g는 8-세포 배아 단계에서의 단일-세포 주사의 키메라 검정의 요약을 나타내는 막대 그래프이다. 막대 챠트는 회수된 배반포 중에서 키메라의 백분율을 나타낸다. ICM & TE, ICM과 TE 둘 다로 마우스 세포가 통합된 배아.
도 5a는 기존의 TS 배지에서 배양된 세포내 대표적 TS 표시자 유전자의 상대적 발현을 나타낸다. LCDM 조건(TT2-6 p0 및 mc6-1 p0)에서 배양된 mEPS 세포 또는 2i 조건(TT2-2i p0 및 mc2i-1 p0)에서 배양된 mES 세포가 개별적으로 대조군으로서 사용되었다. 3개 이상의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 수득되었다. 오차 막대는 s.d.를 나타낸다(n = 3). 도 5b는 트랜스웰(Transwell)계 침습 검정의 개략도이다. 도 5c는 E17.5 태반 조직내 mEPS-유도 세포내 영양막 표지 유전자의 발현을 나타낸다. 2개의 샘플 배치를 분석하였다. Tdtomato(Td) 양성 세포는 FACS를 사용하여 정제되었다. 이들 세포내 영양 표지자의 발현을 분석하여 원래의 EPS 세포(TT2-6) 및 Td 음성 호스트 태반 세포와 비교하였다. 도 5d는 사람 미토콘드리아 DNA에 대한 정량적 PCR 분석이 E10.5 마우스 배아내 hEPS-유도 세포의 존재를 나타내었음을 나타낸다. 사람 DNA 대조군(H, 적색 막대) 및 사람-마우스 세포 희석물(청색 막대)을 사용하여 사람 세포 기여도를 평가하였다. 파선은 10,000개의 마우스 세포내 1개의 사람 세포의 희석에 상당한 사람 미토콘드리아 DNA의 검출도를 나타낸다. M, 비-주사 마우스 배아. 도 5e는 사람 미토콘드리아 DNA에 대한 정량적 PCR 분석이 8-세포 또는 배반포 단계에서 hEPS 세포의 주사 이후 E10.5에서 마우스 태반내 사람 세포의 존재를 나타내었음을 나타낸다. 사람 DNA 대조군(H, 적색 막대) 및 일련의 사람-마우스 세포 희석물(청색 막대)을 동시에 실행하여 사람 세포 기여도를 평가하였다. 파선은 10,000개의 마우스 세포내 1개의 사람 세포의 희석물에 상당한 사람 미토콘드리아 DNA의 검출도를 나타낸다. M, 비주사 마우스 태반.
도 6a 및 6b는 EPS 세포 및 공지된 만능 세포 유형으로부터의 RNA-seq 및 마이크로어레이 데이터의 PCA를 나타낸다. (6A)에 대하여, mEPS 세포(본 연구), mES 세포, 2C-유사 세포(Macfarlan et al.(2012)), 및 배반엽상피 줄기 세포(Najm et al. (2011))로부터의 데이터를 분석하였다. 데이터는 각각의 연구내 mES 세포로 정규화되었다. 총 17.243개의 유전자가 (a)에서 선택되었다. (6B)에 대하여, hEPS 세포(본 연구), 나이브 hPSC(Takashima et al. (2014), Chan et al. (2013), Gafni et al. (2013), and Theunissen et al. (2014)), 및 초회감작 hPSC로부터의 데이터를 분석하였다. 데이터는 각각의 연구에서 초회감작 hPSC로 정규화되었다. 총 15,958개의 유전자가 (6B)에서 선택되었다. 원형: RNA-seq 데이터; 삼각형: 마이크로어레이 데이터. 도 6c는 mEPS 세포의 키메라 능력에 대한 DiM 또는 MiH 치환의 영향의 분석을 나타낸다. Parp1 넉아웃 mEPS 세포(Parp1-KO)는 MiH(-MiH)의 부재하에 LCDM 조건에서 배양되었다. mEPS 세포는 주사전 5 이상의 계대에 대하여 상이한 조건하에 배양되었다. 다중 세포는 8-세포 배아가 주사되었으며, 이는 추가의 분석전 추가의 60시간 동안 배양되었다. 바 챠트는 회수된 배반포 중에서 키메라의 백분율을 나타낸다. ICM & TE, ICM과 TE 둘 다로 마우스 세포가 통합된 배아. 도 6d는 hEPS의 키메라 능력에 대한 DiM 또는 MiH 치환의 영향의 분석을 나타낸다. hEPS 세포는 5 이상의 계대에 대하여 상이한 조건하에 배양된 다음, 다중 세포는 8-세포 배아가 주사되었고, 이는 추가의 분석전 추가의 60시간 동안 배양되었다. 막대 챠트는 회수된 배반포 중에서 키메라의 백분율을 나타낸다. ICM & TE, ICM과 TE 둘 다로 마우스 세포가 통합된 배아. TH: 트리펠렌아민HCL; DES: 데슬로라타딘; NAM: 니코틴아미드. PD: PD0325901; SB: SB203580; SP: SP600125.
도 7a 및 7b는 mES (TT2-2i, mc2i-1) 및 mEPS 세포(TT2-6, mc6-1)(도 7a), 및 hEPS 세포 및 초회감작 hPSC(도 7b)에서 MAPK 시그널링에 관련된 단백질의 전체 인산화도에 대한 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 나타낸다. 3개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 수득되었다. 도 7c는 Parp1 넉아웃 mEPS 세포주의 세대를 나타내는 도식이다. gRNA는 각각 Parp1 유전자 좌내 엑손 1 및 2 내부의 서열에 표적화되며, 이들은 mEPS 세포로 공동-트랜스펙팅(co-transfecting)되었다. Cas9 단백질의 발현 후, 엑손 1에서 엑손 2로의 게놈 단편이 Parp1 유전자 좌로부터 결손되었다. 도 7d는 게놈 PCR 분석이 mEPS 세포주 TT2-6의 3개의 아클론(2B1, 2A1 및 1A5)내 Parp1 유전자 좌가 성공적으로 표적화됨을 확인하였음을 나타낸다. 야생형 mES TT2-2i 및 mEPS TT2-6이 대조군으로서 사용되었다. 도 7e 및 7f는 게놈 Q-PCR 및 QRT-PCR 분석이 Parp1 넉아웃 mEPS 아클론(Parp1 KO)내 Parp1 엑손(7e) 및 mRNA 발현(7f)의 부재를 확인하였음을 나타낸다. 야생형 mEPS 세포주 TT2-6이 대조군으로서 사용되었다. 도 7g는 Parp1 넉아웃 mEPS 클론(2B1, 2A1 및 1A5)내 PARP1 단백질 발현의 부재를 확인하는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 야생형 mEPS 세포주 TT2-6이 대조군으로서 사용되었다.
배아 및 배아외 혈통 둘 다를 발생시키는 능력이 개선/연장된, 연장 만능 줄기(EPS) 세포라고 하는, 사람내 신규한 줄기 세포의 유도를 가능하게 하는 화학 칵테일이 확인되었다. 중요하게는, 단일 사람 EPS(hEPS) 세포는 마우스 키메라 배아내 배아 및 배아외 혈통(특히 태반내 혈통) 둘 다에 기여하는 능력을 갖는다. 본원에 기재된 연구에 의하여 달성된 바와 같이, hEPS 세포는 NHSM (나이브 사람 줄기 세포 배지) 조건(나이브 NHSM-hES 세포)에 의하여 지지되는 초회감작 사람 배아 줄기(초회감작 hES) 세포 또는 나이브 사람 ES 세포시, 다중 배아외 유전자의 기본 mRNA 활성의 상향조절을 나내었다(참조: Gafni, et al., Nature, 504(7479):282-6 (2013)). 특히, hEPS 세포는 초회감작 hES 세포를 전환시키거나 신체 재프로그래밍에 의하여, 또는 배반포로부터 직접 발생될 수 있었다. 보다 중요하게는, 피그 EPS, 래트 EPS 및 마우스 EPS(mEPS) 세포들이 동일한 배양 조건을 사용하여 성공적으로 달성되었고, 단일 mEPS 세포는 배아일 10.5(E10.5) 및 E12.5에서 키메라 수태물내 배아외 및 배아 조직에 기여할 수 있다.
본원에 기재된 연구는 시험관내 배양된 세포, 예를 들면, 만능 줄기 세포의 세포 효능이 생체내에서 기존 수준을 넘어, 즉 본원에 개시된 인자들과 접촉된적이 없는 동일한 유기체로부터의 상응하는 세포내 수준을 넘어 연장될 수 있음을 입증한다. 추가로, EPS 세포는 신속하게 확장되고 안정적으로 유지될 수 있다. 따라서, EPS 세포는 예를 들면, 초기 발달을 연구하는 인간화(humanized) 동물 모델을 사용하고, 재생 의약용 환자-특이 세포를 발생시키는, 질환 리모델링에 대한 신규한 세포 자원을 제공한다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "세포 효능(cell potency)"은 세포의 다른 세포 유형으로의 분화 능력을 말한다. 세포가 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있으면, 이의 효능은 더 크다.
본원에서 사용된 용어 "화학적으로 유도된 만능 줄기 세포"(CiPSC)는 하나 이상의 트랜스펙팅된 유전자의 발현에 의해서가 아니라, 만능성이 아닌 세포, 즉 다능성 세포 또는 분화 세포를 화학적 화합물과 접촉시킴으로써 비-만능 세포로부터 유도된 만능 세포를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "화학적으로 유도된 연장 만능 줄기 세포("ciEPSC")"는 공여 세포를 화학적 화합물과 접촉시킴으로써, 유도시키기 전의 만능 줄기 세포와 비교시, 생체내 배아외 혈통을 발생시키는 능력이 개선된 만능 줄기 세포를 말한다. 예를 들면, 초회감작 사람 ESC로부터 유도된 ciEPSC는 비-CEPS-처리 초회감작 사람 배아 줄기 세포와 비교시, CEPS와 접촉 이후 생체내 배아외 조직을 발생시키는 능력이 개선됨을 나타낸다.
용어 "상응하는 세포"는 ciEPSC를 수득하는 공여 세포와 동일한 유형의 이와 동일한 유기체로부터의 세포를 말한다. 예를 들면, 마우스 배아 줄기 세포로부터 수득한 ciEPSC에 대한 상응하는 세포는 CEPS와 접촉/재프로그래밍된 적이 없는 마우스 배아 줄기 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "공여 세포"는 CEPS와 접촉하여 연장 세포 효능을 유도/기여하는 세포를 말한다.
ciEPSC와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "연장 세포 효능"은 ciEPSC의 상응하는 세포보다 하나 이상 많은 세포 유형으로의 분화 능력을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "후성적(epigenetic)"은 돌연변이 기반이 아니지만, 일부 경우 대대로 전해질 수 있는 DNA의 공유 변이를 말한다. DNA 서열의 어떠한 변화 없이 활성화되거나 억제된 유전자는 후성적으로 제어된다. 후성적 변이는 안정하지만, DNA 서열의 영구적 변화 없이 발생하는 유전자 발현의 잠재적으로 가역적인 변경이다. 다수 후성적 공정 유형이 확인된 바 있으며, 이들은 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틸화 및 히스톤의 서모일화와, DNA 메틸화를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 비-만능 세포로부터 인공적으로 유도된 만능 줄기 세포 유형이다. CiPSC는 iPSC이지만; 만능성을 부여하도록 유전자 조작되지 않는다는 점에서 일부 iPSC와 상이하다.
본원에서 사용된 용어 "인간화 동물 모델"은 기능적 사람 세포 또는 조직과 접합되거나 사람 이식유전자를 발현하는 사람이 아닌(non-human) 포유동물을 말한다.
본원에서 사용된 "개선된 생체내 배아외 혈통 발생 능력"은 예를 들면, 물질 및 방법하에 본원에 기재된 바와 같은 키메라 검정에서 미세주사 이후 영양외배엽 표지자의 발현 및/또는 영양외배엽(TE)과 ICM(내세포괴) 둘 다에 대한 기여를 측정함으로써 결정될 수 있다.
ciEPSC를 언급시 용어 "분리된" 또는 "정제된"은 비연장 만능 세포인 오염 세포 유형이 10%, 20% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 부재한 화학적으로 유도된 연장 만능 줄기 세포를 의미한다. 분리된 EPSC는 또한 가용성, 자연 발생 분자가 실질적으로 부재할 수도 있다.
본원에서 사용된 "배지" 및 "배양 배지"는 세포 배양 환경을 말한다. 배지는 통상적으로 등장성 용액이고, 예를 들면, 액상, 젤라틴상 또는 반고형이어서 세포 부착 또는 지지용 매트릭스를 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 배지는 세포를 배양하는 데 필요한 영양적, 화학적 및 구조적 지지용 성분들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "만능성(pluripotency)"(또는 pluripotent)은 3개의 배엽: 내배엽(예: 내위벽, 위장관, 폐), 중배엽(예: 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽(예: 상피 조직 및 신경계) 중의 어느 것으로 분화하는 가능성을 갖는 줄기 세포를 말한다. 다능성 줄기 세포는 덜 가소성이고 더 분화되고, 제시된 기관내 몇 가지 유형의 세포들 중의 하나가 될 수 있다. 예를 들면, 다능성 혈액 줄기 세포는 적혈구 전구세포, 백혈구 또는 혈소판 생성 세포로 발달될 수 있다. 성인 줄기 세포는 다능성 줄기 세포이다. 지방 유도 줄기 세포는 다능성이다.
본원에서 사용된 "만능 세포"는 "만능 줄기 세포"와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "재프로그래밍"은 하나의 특이 세포 유형의, 추가의/상이한 기능 및/또는 구조적 특징들을 갖는 또 다른 유형으로의 전환을 말한다. 예를 들면, 본원에서 정의된 ciEPSC가 아닌 세포는 시험관내 배양 이후, 생체내 배아외 혈통 발생 능력이 연장된 세포로 재프로그래밍될 수 있다.
용어 "소분자"는 분자량이 2,000달톤 미만, 보다 바람직하게는 1,500달톤 미만, 가장 바람직하게는 1,000달톤 미만인, 유기 또는 유기금속 화합물 등의, 분자를 말한다.
본원에서 사용된 "변환 성장 인자 베타(TGFβ) 수용체 억제제"는 TGFβ 수용체를 억제하는 제제를 말한다. TGFβ 수용체는 단일 통과 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. 3개의 TGF-β 수용체 유형은 I형, II형 및 III형 수용체, 즉 TGF-β 수용체 1, TGF-β 수용체 2 및 TGF-β 수용체 3을 포함한다.
본원에서 사용된 "2i"는 글리코겐 신타제 키나제-3 및 미토겐 활성화 단백질 키나제 시그널링의 이중 억제를 갖는 ESC 배양 배지, 예를 들면, 2i가 보충된 ESC 배양 배지(CHIR99021 및 PD0325901)를 말한다.
II. 조성물
시험관내 배양물, 본원에서는, 만능성의 화학 연장제(CEP) 이후, 생체내 분리된 만능 줄기 세포의 세포 효능을 연장하는 데 사용될 수 있는 인자들의 칵테일이 확인되었다. CEP는 미처리된 상응하는 세포와 비교시, 예를 들면, isPSC에 생체내 배아외 혈통 발생 능력을 부여함으로써, isPSC의 세포 효능을 연장시킨다. CEP는 비연장 만능 세포 등의 오염 세포 유형이 10%, 20% 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 부재한 ciEPSC의 분리 개체수를 제공하는 데 사용될 수 있다.
CEPS는 (1) 시토카인; (1) 글리코겐 신타제 키나제 (GSK) 억제제; (2) G 단백질 결합 수용체 억제제 아세틸콜린 수용체 길항제; 및 (3) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1(PARP1) 억제제를 포함하는 소분자를 포함한다. 당해 조성물은 유효량의 CEP를 포함하여 바람직하게는 시험관내 만능 세포를 공여 만능 세포로부터의 만능 세포와 비교시, 배아 및 배아외 혈통 발생 능력이 연장/강화된 세포로 재프로그래밍한다. 예를 들면, MiH 또는 DIM을 유사한 활성을 갖는 소분자로 치환하는 실험에서 본원에 예시된 바와 같은, 시험관내 검정을 사용하여, 속내 특정 종에 대하여 개시된 유효 농도를 기반으로 하여 시토카인, GSK 억제제, GPCR 길항제, 또는 PARP1 억제제 그룹내 기타 구성원에 대한 동등한 유효 농도를 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다(도 4c 및 4d).
본원에 개시된 방법에서 유용한 임의 화합물은 Rho-결합, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK), 예를 들면, 0.5 내지 20μM, 바람직하게는 5-15μM, 가장 바람직하게는 10μM 범위의 농도의, Y27632[(+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드++ + 디하이드로클로라이드)], 또는 동등한 농도의 파수딜(fasudil)의 선택적 억제제이다.
보다더 바람직한 양태는 악신-베타 카테닌 착체를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 소분자를 포함한다. 바람직한 분자는 엔도-IWR1(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드; CAS No. 1127442-82-3) 및 XAV939(3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온; CAS No. 284028-89-3)를 포함한다.
A. 만능성의 화학 연장제
1. 시토카인
바람직한 시토카인은 1-100ng/ml, 바람직하게는 1-50, 보다더 바람직하게는 1 내지 30ng/ml 범위의 농도의, 사람 백혈병 억제 인자(LIF)("L), 인터루킨 6급 시토카인이다. 구조적으로 관련된 시토카인 그룹인 IL-6은 IL-6, IL-11, IL-27, IL-31, 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 카디오트로핀-1, 뉴로포이에틴 및 카디오트로핀-유사 시토카인 인자 1(신규한 뉴로트로핀 1 및 B 세포 자극 인자-3으로도 공지됨), 및 IL-6의 2개의 바이러스 유사체를 포함하는, 뉴로포이에틴의 시조 구성원인 원형 사중 나선 번들 시토카인이다. 시토카인의 인터루킨 6 군의 이들 구성원은 본원에 개시된 조성물에, LIF에 대하여 개시된 동등한 농도로 사용될 수 있다.
2. 소분자
만능성을 연장시키는 화학적 화합물, 즉 만능성의 화학 연장제(CEP)는 분자량이 2,000달톤 미만, 보다 바람직하게는 1,500달톤 미만, 가장 바람직하게는 1,000달톤 미만인 소분자를 단독으로 또는 단백질과 함께 포함한다. 소분자는 분자량이 900달톤 이하, 또는 500달톤 이하일 수 있다. 더 큰 분자는 본원에서 동정된 소분자와 동일한 경로를 화학적으로 유도된 재프로그래밍하는 데, 바람직하게는 표적화하는 데 사용될 수 있다.
(i) PARP1 억제제
PARP1 억제제는 바람직하게는, 0.5-5μM의 범위의 농도로 사용되는, 강력한 PARP1 선택적 억제제인, MiH(미노사이클린 하이드로클로라이드)("M")이다. 예를 들면, 조성물 중의 MiH의 농도는 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 또는 5μM일 수 있다. 추가의 PARP1 억제제는 이들로 제한되지는 않지만 BSI-201(4-요오도-3-니트로벤즈아미드), NAM(니코틴아미드), 및 PJ34(N-(6-옥소-5,6-디하이드로-페난트리딘-2-일)-N,N-디메틸아세트아미드(pPARP1 및 PARP2 억제제); PARP 억제제 XIV; 4-[(1-메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌]-1,3(2H,4H)-이소퀴놀린디온(강력한 PARP1 억제제); 벨리파립; 2-[(2R)-2-메틸피롤리딘-2-일]-1H-벤즈이미다졸-4-카복스아미드 디하이드로클로라이드(강력한 PARP-1 및 PARP-2 억제제); 올라파립(1-(사이클로프로필카보닐)-4-[5-[(3,4-디하이드로-4-옥소-1-프탈라지닐)메틸]-2-플루오로벤조일]피페라진); 6-아미노-1H-벤즈[de]이소퀴놀린-1; 및 INH2BP(5-요오도-6-아미노-1,2-벤조피론; PARP 억제제 II)를 포함한다. PARP1 및/또는 PARP2 억제제를 포함하는 기타 공지된 PARP 억제제는 시판중이고, 세포를 ciEPSC로 재프로그래밍하기에 유효한 양으로 본원에 개시된 CEP 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 MiH를 TH 및 DES로 치환하거나 DIM을 NAM으로 치환하는 등의 실험에서 예시된 바와 같이, 시험관내 검정을 사용하여 기타 PARP1 억제제에 대한 동등한 농도를 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
(ii) GSK 억제제
GSK 억제제는 바람직하게는 GSK3을 억제하고, 바람직하게는, GSK3에 대하여 선택적이다. 적합한 GSK 억제제는 글리코겐 신타제 키나제 3 억제제인, 아미노피리미딘, CHIR99021("C")이다. CEP 조성물은 0.1 내지 5μM, 바람직하게는 1 내지 3, 보다더 바람직하게는 1.5 내지 3μM의 농도 범위로 CHIR99021을 포함한다. 예를 들면, CEP는 CHIR99021을 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5μM의 농도로 포함할 수 있다. 당업자는 필요한 유효량을 쉽게 미세 조정할 수 있으므로, 이 숫자에 속하는 농도들이 고려된다.
그러나, 기타 GSK 억제제가 시판중이며, 본원에 개시된 조성물에 사용될 수 있다. 예로는, 이들로 제한되지는 않지만, BIO-아세톡심; GSK 3I 억제제 XV; SB-216763; CHIR99021의 하이드로클로라이드 염인, CHIR 99021 트리하이드로클로라이드; GSK-3 억제제 IX[((2Z, 3E)-6'-브로모-3-(하이드록시이미노)-[2,3'-비인돌리닐리덴]-2'-온]; GSK 3 IX[6-브로모인디루빈-3'-옥심]; GSK-3β 억제제 XII[3-[[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]옥시]페놀]; GSK-3 억제제 XVI[6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-피리미딘-2-일아미노)에틸-아미노)-니코티노니트릴]; SB-415286[3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온]; 및 바이오[(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심]을 포함한다.
(iii) G 단백질 결합 수용체(GPCR) 억제제
가장 바람직한 GPCR 억제제는 1-5μM의 농도 범위로 사용되는 (S)-(+)-디메틴덴 말레에이트("D")이다. 디메틴덴 말레에이트는 아형 선택적 mAChR(무스카린 아세틸콜린 수용체) M2, mAChR M1, mAChR M3 및 mAChR M4 길항제, 및 히스타민 H1 수용체 길항제인 거울상이성체이다. 그러나, 기타 GPCR 억제제가 본원에 개시된 CEP 조성물에 포함될 수 있으며, 이는 이들로 제한되지는 않지만, 에틸렌디아민, 예를 들면, 트리펠렌아민 HCL(중심 및 주변 히스타민 H1 수용체를 경쟁적으로 차단하는, 히스타민 H1 길항제), 메피라민 및 안타졸린; 삼환식 또는 사환식 화합물, 예를 들면, 로라티딘 또는 이의 대사물, 데슬로라타딘(선택적 히스타민 H1 길항제)을 포함한다. 기타가 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이들로 제한되지는 않지만, 레보세티리진, 펙소페나딘, 아스테미졸, 케토티펜, 세티리진, 로라타딘, 루파타딘, 미졸라스틴, 아크리바스틴, 에바스틴, 빌라스틴, 베포타스틴, 테르페나딘, 퀴페나딘, 사이클리진, 클로르사이클리진, 하이드록신, 페니라민, 클로르페나민, 트리폴리딘, 디펜하이드라민, 카비녹사민, 브로마진 등을 포함한다.
특히 바람직한 칵테일은 (1) 시토카인; (1) 글리코겐 신타제 키나제(GSK) 억제제; (2) G 단백질 결합 수용체 억제제 아세틸콜린 수용체 길항제; (3) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1 (PARP1) 억제제; ROCK 억제제, 및 악신-베타 카테닌 착체를 안정화시킬 수 있는 소분자를 포함하는, 소분자의 배합물을 포함한다. 당해 양태에서, 칵테일은 바람직하게는 LCDM + 엔도-IWR1(0.5-10μM의 바람직한 농도 범위) 및 Y27632(2-5μM의 바람직한 농도 범위), 또는 LCDM + XAV939(0.5-10μM의 바람직한 농도 범위) 및 Y27632(2-5μM)를 포함한다.
B. 유도되는 세포(공여 세포)
연장 만능 줄기 세포는 만능 세포, 또는 어떠한 포유 동물, 예를 들면, 임의의 포유동물(예: 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 영장류), 바람직하게는 사람으로부터 수득한 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 유도하여 수득된다. 소스(source)는 골수, 섬유 아세포, 태아 조직(예: 태아 간 조직), 말초 혈액, 제대혈, 췌장, 피부 또는 임의의 기관 또는 조직을 포함한다.
바람직한 양태에서, ciEPSC는 만능 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 수득된다. iPSC는 유전 공학 및/또는 순수한 화학적 재프로그래밍에 의하여 수득된 세포를 포함한다. 기타 양태에서, ciEPSC는 배반포로부터 수득한다.
바람직하게는, iPSC는 화학적으로 유도된 섬유아세포, 지방 유도 줄기세포, 중성 줄기 세포 또는 장 상피로부터의 세포로부터 수득한다. 일부 양태에서, CiPSC는 화학적으로 유도된 신생아(예: 포피) 또는 성인 섬유아세포로부터 수득한다. 그러나, iPSC는 이들로 제한되지는 않지만, 다능성 줄기 세포, 혈액 기원의 세포, 배아 기원의 세포, 피부 유도 세포, 섬유아세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 간엽 세포, 실질 세포, 신경 세포, 및 결합 조직 세포를 포함하는 기타 세포 유형으로부터 수득할 수 있다.
배양물에 세포를 유지시키는 방법을 포함하는, 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있는 만능 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있고 기재되어 있다. 마우스 배아 줄기(ES) 세포는 배반포의 내세포괴로부터 분리되고, 백혈병 억제 인자(LIF)로 외인성 자극 및 ERK1/ERK2 및 GSK3β 시그널링의 소분자 억제(2i/LIF 조건이라고 함)를 제공함으로써 나이브 내세포괴 유사 형태로 시험관내 보존될 수 있다. 나이브 만능성의 특징은 이의 원위 인핸서(enhancer)에 의한 OCT4(Pou5f1로도 공지됨) 전사 유도, 예비-불활성화 X 염색체 상태 보유, 및 발달 조절 유전자 촉진자에 대한 DNA 메틸화 및 H3K27me3 억제 염색질 표지 부착의 전반적 감소를 포함한다. 2i/LIF의 철회시, 나이브 마우스 ES 세포는 착상후 배반엽상피와 유사한 초회감작 만능 상태 쪽으로 변이할 수 있다. 사람 ES 세포는 나이브 마우스 ES 세포와 몇 가지 분자 특징을 공유하지만, 또한 초회감작 뮤린 배반엽상피 줄기 세포(EpiSC)와 다양한 후성적 특징을 공유한다. 이들은 근위 인핸서 요소의 우세한 사용을 포함하여 OCT4 발현, 대부분의 여성 사람 ES 세포의 X 염색체 불활성화에 대한 현저한 경향, DNA 메틸화 증가 및 혈통 조절 유전자 상의 H3K27me3 및 2가 도메인 획득의 현저한 부착을 유지시킨다. 이미 정착된 초회감작 사람 ES 세포로부터, 유도 만능 줄기(iPS) 세포 재프로그래밍을 통한 체세포로부터, 또는 배반포로부터 직접 유전자 변형되지 않은 사람 나이브 만능 줄기 세포를 유도하는 것이 문헌[참조: Gafni, et al., Nature, 504(7479):282-286 (2013)]에 개시되어 있다.
공여 세포는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 세포원으로서 작용하는 적합한 기관 또는 조직을 분해하여 분리될 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 기관은 기계적으로 분해되고/되거나 인접 세포들 사이의 연결을 약화시키는 소화 효소 및/또는 킬레이트화제로 처리될 수 있어서, 조직은 분산되어 상당한 세포 파괴 없이 개별적인 세포들의 현탁물을 형성할 수 있다. 효소 해리는 조직을 민싱하고, 민싱된 조직을 하나 이상의 효소, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및/또는 히알루로니다제, DNase, 프로나제, 디스파제 등으로 처리하여 달성될 수 있다. 기계적 파괴는 또한 이들로 제한되지는 않지만, 그라인더, 블렌더, 씨브, 균질화기, 압력 셀, 또는 인소네이터의 사용을 포함하는 다수의 방법에 의하여 달성될 수 있다.
C. 화학적으로 유도된 연장 만능 줄기 세포(ciEPSC)
CiEPSC는 (i) 형태학적으로-마우스 ESC 유사 형태를 포함하는 특징들을 기반으로 하고, (ii) 기능적으로 (a) 3개의 배엽의 조직들로 분화하는 세포의 능력; (b) 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절된 발현, (c) 만능성에 대한 하나 이상의 표지자들의 상향조절 및/또는 하향조절; 및 (d) TE와 ICM 둘 다에 대한 생체내 기여를 기반으로 한 연장 만능 세포로서 확인된다. ciEPSC는 상응하는 세포와 비교시 생체내 연장 세포 효능을 나타낸다. 바람직한 양태에서, ciEPSC는 생체내 하나 이상의 배아외 혈통을 발생시키고/이에 기여한다. 하나 이상의 생체내 혈통에 대한 ciEPSC 기여는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하는 생체내 이식 이후, 실시예에 기재된 바와 같이, 배아외 표지자의 하나 이상의 표지자의 존재를 결정함으로써 결정될 수 있다(아래 논의됨).
1. 형태
사람 공여 세포로부터 수득한 ciEPSC는 마우스 배아 줄기(ES) 세포와 형태학적으로 유사하다. 사람 EPS 세포는 마우스 배아 줄기 세포와 유사한 돔형 콜로니를 형성한다. 마우스 EPS 세포는 마우스 배아 줄기 세포와 형태학적으로 동일하다.
2. 3개의 배엽의 조직들로 분화하는 능력
ciEPSC는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 3개의 배엽, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 각각으로부터 하나 이상의 세포/조직으로 분화하는 능력을 갖는다.
외배엽은 배아의 외층을 발생시키고, 배아의 배반엽상피으로부터 형성한다. 외배엽은 표면 외배엽, 신경 능선 및 신경관으로 발달한다. 표면 외배엽은 표피, 모발, 손톱, 눈의 렌즈, 피지선, 각막, 치아 에나멜, 입과 코의 상피를 발달시킨다. 외배엽의 신경 능선은 말초 신경계, 부신 수질, 멜라노사이트, 안면 연골로 발달한다. 외배엽의 신경관은 뇌, 척수, 뇌하수체 후엽, 운동 뉴런 및 망막으로 발달한다.
내배엽은 처음에는 편평 세포로 이루어지고, 이는 후속적으로 원주형이 된다. 이는 입과 인두의 일부 및 직장의 말단부(외배엽의 퇴화에 의하여 라이닝됨)를 제외한 전체 소화관의 상피 표면을 형성한다. 이는 또한 간 및 췌장; 청각관 및 고실의 상피; 폐의 기관, 기관지 및 폐포; 방광 및 요도의 일부; 및 갑상선 및 흉선의 소포 내층의 선들을 포함하는, 소화관으로 개방하는 모든 선의 표피 세포를 형성한다. 내배엽은 위, 결장, 간, 췌장, 방광, 기관의 상피 부분, 폐, 인두, 갑상선, 부갑상선 및 장을 형성한다.
중배엽은 결합 조직, 근육(평활근 및 횡문근), 림프계, 골, 장막, 연골, 지방 조직, 순환계, 피부, 비뇨생식계 및 척색을 형성한다.
3. TE 및 ICM 둘 다에 대한 생체내 기여/배아외 표지자의 상향조절
상응하는 세포가 기여할 수 없는 TE 및 ICM 둘 다에 생체내 기여하는 능력은 생체내 배아외 혈통을 발생시키고/이에 기여하는 개선된 능력의 표시이다. 예를 들면, 3개의 배엽 각각으로부터의 하나 이상의 세포/조직으로 분화할 수 있는 사람 배아 줄기(hES) 세포의 세포 효능은 본원에 개시된 바와 같은 CEPS와 접촉된 hES에 생체내에서 TE 및 ICM 둘 다에 기여하는 능력을 부여함으로써 개선/연장된다. 생체내 TE 및 ICM에 기여하는 세포의 능력은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 양태에서, TE 및 ICM에 기여하는 능력은 실시예에 개시된 바와 같이 ciEPSC를 마우스 E2.5 또는 E3.5 배아로 미세주사하고, 생체내 E10.5 배아로 발달시키고, 주사된 세포의 TE 및 ICM에 대한 기여를 결정함으로써 결정된다.
ciEPSC는 상응하는 유기체로부터 분리된 미처리된 시험관내 배양된 상응하는 세포와 비교시, CDX2, GATA6, HAND1 및 EOMES 등의 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절된 발현을 나타낸다. 예를 들면, ciEPSC는 초회감작 hESC로부터 발생된 경우, 초회감작 hESC과 비교시 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절을 나타내고, 나이브 hESC로부터 발생된 경우, 나이브 hESC 등과 비교시 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절을 나타낸다. 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절은 생체내 배아외 혈통을 발생시키는 개선된 능력의 표시이다. 바람직한 양태에서, 배아외 유전자의 mRNA 기초 활성은 CiEPSC에서 상향조절된다.
4. 만능성의 표지자의 상향 및/또는 하향조절
ciEPSC는 상응하는 유기체로부터 분리된 미처리된 상응하는 세포(즉, 본원에 개시된 바와 같은 CEPS와 접촉되지 않은 상응하는 세포)와 비교시, TBX3 및 GBX2 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 상향조절을 나타낸다. OCT4, REX1, DPPA3, TBX3, 및 GBX2를 포함하는 몇 가지 만능성 표지 유전자의 mRNA 발현은 비-CEP-처리된 초회감작 hES 세포보다 hEPS 세포 중에서 더 균질하였다.
ciEPSC는 동일한 유기체로부터 분리된 미처리된 상응하는 세포와 비교시, OCT4, NANOG, KL2, SOX2, 및 UTF1(미분화 배아 세포 전사 인자) 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 하향조절을 나타낸다. 이는 예를 들면, NANOG, UTF1 및 SOX2 등의 표지자의 상향조절을 나타내는, 문헌[참조: Hou, et al., Science, 341(6146):651-4 (2013)]에 개시된 세포인 iPSCS와 대조적이다.
ciEPSC는 비-CEPS 처리된 상응하는 세포와 비교시, 이들 특징들중 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4개 또는 전체를 갖는다는 점에서 미처리된 상응하는 시험관내 배양 세포와 상이하다. 예를 들면, ciEPSC는 본원에 개시된 형태를 가지며, 모든 3개의 배엽으로부터의 하나 이상의 세포/조직으로의 분화 능력을 갖고, 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절을 나타내거나, 추가로, TE 및 ICM 둘 다에 생체내 기여할 수 있거나, 추가로, 본원에 개시된 바와 같은 만능성의 하나 이상의 표지자의 상향조절 및/또는 하향조절을 나타낸다. 예를 들면, 2i 조건에서 마우스 배아 줄기 세포 배양물과 비교하여, 마우스 EPS 세포는 배아 및 배아외(특히 태반) 둘 다의 생체내 키메라 현상, OCT4의 단백질 발현의 하향조절, Cdx2 및 Eomes 등의 배아외 유전자의 유전자 좌내 억제 후성적 표지자 H3K27me3의 하향조절에 기여하는 것으로 나타난다. LIF 시그널링 및/또는 GSK3β 인산화 등의 추가의 특징이 ciEPSC로서 세포들을 추가로 동정하고 구별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 초회감작 hES 세포와 비교시, hEPS 세포는 LIF 시그널링의 활성화를 나타내고, 이는 예를 들면, GP130, STAT3 및 -p-STAT3의 수준을 측정하여 결정될 수 있다. 또한, GSK3β 인산화는 hES와 비교시 hEPS 세포내에서 감소된다. LIF 시그널링 및 GSK3β 시그널링의 활성화는 추가로 어떠한 유기체로부터 수득한 ciEPSC를 동정하고 기타 분리된 만능 줄기 세포로부터 ciEPSC를 구별하는 데 사용될 수 있다.
초회감작 hPSC와 비교하여 hEPS 세포에서 상향조절된 추가의 유전자는HOXA1(호메오박스 A1), MIXL1(Mix1 호메오박스-유사 1), 및 DERA(데옥시리보스-포스페이트 알돌라제) 유전자를 포함한다. hEPS 세포 내에서 독점적으로 상향조절되지만 기타 hPSC 유형에서는 그렇지 않은 유전자는 예를 들면, CHD7(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7)), CHD4(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 4), MIXL1 및 LEF1(림프성 인핸서-결합 인자 1)을 포함한다.
III. 제조방법
A. 만능 줄기 세포내 연장된 만능성 유도
ciEPSC는 유도/재프로극래밍되는 세포(본원에서는 공여 세포)를 CEP를 함유하는 배양 배지와 충분한 기간 동안 접촉시켜 세포를 화학적으로 유도된 연장 만능 줄기 세포(ciEPSC)로 재프로그래밍시킴으로써 생성된다.
공여 세포는 세포의 연장 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍을 유도하고/하거나 강화하기에 유효한 양으로 본원에 개시된 CEP와 접촉시킨다. 당업자는 아래 실시예에 약술된 방법, 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 방법을 사용하여, 완전한 재프로그래밍을 제공하는 데 필요한 본원에 개시된 CEP 화합물의 농도를 즉시 결정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 공여체는 예를 들면, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로서의 만능 줄기 세포이다. iPSC는 유전 공학 및/또는 순수한 화학적 재프로그래밍에 의하여 수득된 세포를 포함한다. 기타 양태에서, ciEPSC는 배반포로부터 수득된다.
공여 세포가 초회감작 사람 배아 줄기 세포(hESC)인 예시적인 방법에서, 세포는 단세포 또는 소 콜로니로서 영양 세포(feeder cell)로 씨딩될 수 있다. hESC는 바람직하게는 통상적인 hES 배양 배지 상에서 최종 계대 이후 CEPS와 접촉 전에 3 내지 6일 동안, 예를 들면, 3일, 4일, 5일 또는 6일 동안 배양된다. 세포가 단세포로서 씨딩되는 양태에서, Rho-결합의 선택적 억제제, 코일드 코일 함유 단백질 키나제 (ROCK) 억제제, 예를 들면, Y27632는 배양 배지에 5-20μM, 바람직하게는 5-15μM, 보다 바람직하게는 10μM의 농도 범위로 전환 전 12 내지 48시간 동안, 바람직하게는 24 내지 48시간 동안, 가장 바람직하게는 24시간 동안 임의로 첨가된다. 당해 양태에서, ROCK 키나제 억제제는 계대배양전 최초 12시간 및 계대배양후 12시간 동안 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 기타 양태에서, ROCK 억제제는 최초 수 계대 동안, 예를 들면, 2-6 계대, 바람직하게는 최초 3-5 계대 동안 세포 배양 배지 중에 존재할 수 있다.
세포는 본원에 개시된 바와 같은 형태학적으로 및 기능적으로 결정된 연장 만능성을 유도하기에 유효한 기간인, 1-5 계대, 바람직하게는 3-5 계대 동안 본원에 개시된 농도로 CEPS, 바람직하게는 LCDM에 배양된다.
계대배양전 배양에 3-4일이 필요한 세포에 대하여, 이러한 기간은 LCDM에서는 3-20일, 가장 바람직하게는 9-20일 배양으로 해석한다. 일부 양태에서, 공여 세포는 나이브 ESC이다. 이러한 양태에서, 세포는 씨딩 이후 LCDM과 12시간 또는 24시간 접촉될 수 있다. 기타 양태에서, 공여 세포는 배반포로서 제공된다. 이들 양태에서, 배반포는 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 씨딩되고, 그 이후 세포는 (바람직하게는, 투명대(zona pellucid)가 제거된 후) 4-7일 범위의 기간 동안 LCDM을 함유하는 세포 배양 배지 중에서 배양되고, 그 후 초기 증식물이 보인다. 예를 들면, 배반포는 LCDM에서 초기 증식물이 보이기 전 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 배양될 수 있다.
LCDM 중에서의 배양은 본원에서 개시된 바와 같은 연장 만능성을 유도하기에 유요한 시간 동안 지속된다. 일부 바람직한 양태에서, 세포는 LCDM 중에 10 계대 이상 동안(약 40일) 배양된다. 배양된 배반포는 작은 조각 또는 단세포로의 해리, 영양 세포 상의 재씨딩, 및 예를 들면, 트립신-EDTA를 사용한 계대배양일 수 있다. 새로이 정착된 세포주는 EPSC를 배양하는 데 대하여 본원에서 개시된 방법을 사용하여 유지된다.
수득한 세포는 세포의 3개의 배엽의 조직으로의 분화 능력; (b) CDX2, GATA6, HAND1 및 EOMES 등의 하나 이상의 배아외 표지자의 상향조절된 발현, (c) OCT4, NANOG, KL2, SOX2 및 UTF1(미분화 배아 세포 전사 인자) 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 하향조절; (d) TBX3 및 GBX2 등의 만능성에 대한 하나 이상의 표지자의 상향조절; 및 (e) 키메라 배아를 형성하는 능력과 같은 특징들을 사용하여, 형태학적으로 및 기능적으로 ciEPSC로 동정된다.
섬유아세포 등의 체세포로부터의 EPS 세포를 발생시키는 데 대한 일부 양태에서, 체세포는 세포를 LCDM 중에서 돔형 콜로니를 수득하기에 충분한 기간 동안 배양함으로써 EPS 세포로 직접 유도될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 LCDM 조건에서 추가로 확장된다.
B. ciEPSC의 분리
예를 들면, 배양원으로부터의 추출(예를 들면, 밀도 구배 원심분리 및/또는 유동 세포계측을 통하여)에 의하여, ciEPSC의 실질적으로 정제된 개체수가 수득될 수 있다. 순도는 어떠한 적합한 방법에 의해서라도 측정될 수 있다. 만능 세포는 예를 들면, 유동 세포계측(예: FACS 분석)에 의하여 99%-100% 정제될 수 있다. 사람 유도 연장 만능 줄기 세포는 예를 들면, 유도 만능 줄기 세포 상의 표지자 또는 표지자들의 조합에 결합하는 분자(예: 항체, 항체 유도체, 리간드 또는 Fc-펩티드 융합 분자)를 이용하여, 분자를 결합시키는 세포를 양성으로 선택(즉, 양성 선택)함으로써 분리될 수 있다. 양성 선택의 기타 예는 목적하거나 목적하지 않는 세포 유형의 혼합 개체군내 목적하는 세포 유형의 성장을 바람직하게 촉진시키는 방법을 포함한다. 대안적으로, 목적하는 세포 유형 상에 존재하지 않지만 목적하지 않는 세포 유형 상에는 존재하는 표지자를 결합시키는 분자를 사용함으로써, 이러한 표지자를 함유하는 목적하지 않는 세포는 목적하는 세포로부터 제거될 수 있다(즉, 음성 선택). 기타 음성 선택 방법은 바람직하게는 목적하거나 목적하지 않는 세포 유형의 혼합 개체군내 목적하지 않는 세포 유형의 성장을 죽이거나 억제함을 포함한다. 따라서, 음성 선택, 양성 선택, 또는 이들의 조합을 사용함으로써, 줄기 세포의 보강된(enriched) 개체군이 제조될 수 있다.
분리 절차는 항체 피복된 자기 비드(magnetic beads)를 사용한 자기 분리, 친화 크로마토그래피, 모노클론 항체에 접합된 세포 독성제, 또는 모노클론 항체와 함께 사용되는 이러한 제제, 예를 들면, 보완물 및 세포독소, 및 고체 매트릭스(예: 플레이트)에 부착된 항체로 "패닝(panning)", 또는 기타 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 다양한 정교화도, 예를 들면, 복수의 색상 채널, 낮은 각도 및 둔한 광 산란 검출 채널 및 임피던스 채널을 가질 수 있는, 형광 활성 세포 분리기를 포함한다. 항체는 표지자, 예를 들면, 직접 분리를 감안한 자기 비드, 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거될 수 있는 비오틴, 또는 형광 활성화 세포 분리기와 사용될 수 있는 형광색소과 결합되어, 특정 세포 유형의 분리를 용이하게 할 수 있다. 유도 만능 줄기 세포의 생존력에 지나치게 유해하지 않은 어떠한 기술이라도 이용될 수 있다. 일 양태에서, 세포는 표지자에 대한 항체(예: TRA-1-81 항체)와 배양되고, 표지에 양성으로 착색하는 세포가 수동으로 선택되어 계대배양된다.
농축 방법의 조합이 사용되어 정제 또는 보강의 시간 또는 효율성을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 목적하는 세포 유형의 표시가 아닌 표지자를 갖는 세포를 제거하는 보강 단계 이후, 세포는 형광 활성화 세포 분리기(FACS) 또는 높은 특이성을 갖는 기타 방법론에 의하여 추가로 분리되거나 보강될 수 있다. 다색 분석이 FACS와 이용될 수 있다. 세포는 특정 항원에 대한 착색도 또는 이의 결핍을 기반으로 분리될 수 있다. 형광색소는 특정한 항원에 대하여 특이적인 항체를 라벨링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 형광 색소는 피코빌리단백질, 예를 들면, 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레신 및 텍사스 레드를 포함한다.
C. ciEPSC(및 이의 자손)의 배양 및 보존
ciEPSC는 배양시 확장되고 이후의 재생 및 사용을 위하여 저장될 수 있다. 일단 세포의 배양물 또는 줄기 세포의 혼합 배양물이 정착되면, 세포 밀도는 조직 형성이 되거나 되지 않는, 세포 증식에 기여하는 조건하에 좌우됨에 따라, 세포의 개체군은 새로운 배지로의 계대에 의하여 유사분열로 시험관내 확장된다. 이러한 배양 방법은 예를 들면, 분화를 유도하는 특정한 성장 인자들(예: IGF, EGF, FGF, VEGF 및/또는 기타 성장 인자)이 부족한 배양 배지에서 세포를 계대배양함을 포함할 수 있다. 배양된 세포는 충분한 세포 밀도에 이를 때 새로운 배지로 옮겨질 수 있다.
바람직한 양태에서, ciEPSC를 유지시키기 위한 세포 배양 배지는 연장된 만능성을 유도하는 데 사용되는 동일한 농도의, 예를 들면, 본원에 개시된 CEPS, 바람직하게는, LCDM이 보충된, N2B27 배지이며, 즉, 본원에 개시된 CEP는 세포내 만능성을 연장시키고, 연장된 만능성을 유지시키는 데 사용된다. 예를 들면, ciEPSC를 유지시키기 위한 세포 배양 배지는 N2B27 배지(BSA 부재), 5% KSR(넉아웃 혈청 대체물)이 보충된 N2B27 배지(BSA 무함유)일 수 있다. 기타 기본 배지, 예를 들면, 20% KSR이 보충된 DF12 배지가 사용될 수도 있다. 이러한 기본 배지는 위에서 개시된 CEP가 보충된다. 본 발명의 일부 양태에 따라, LCDM은 배양시 비분화 및 연장 만능 상태에서 2 내지 100 계대 넘게 ciEPSC를 유지시킬 수 있다. 예를 들면, LCDM은 배양시 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 계대 동안, 바람직하게는 배양시 10 계대 초과, 예를 들면, 약 20 계대, 예를 들면, 배양중 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75 및 약 80 계대 이상 동안 비분화 및 연장 만능성 상태로 ciEPSC를 유지시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, ciEPSC는 배양시 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 초과, 예를 들면, 약 20 계대 동안, 예를 들면, 배양중 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75 및 약 80 계대 이상 동안 정상 핵형을 유지시킨다. 일부 양태에서, CiEPSC 증식 및 단일-콜로니 형성을 촉진시키기 위한 세포 배양 배지는 저 농도의 ROCK 억제제, 예를 들면, 2-5μM의 Y27632를 포함한다.
세포는 예를 들면, 문헌[참조: Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester]에 기재된 것과 같은, 공지된 방법에 따라 저장을 위하여 냉동보존될 수 있다. 예를 들면, 세포는 5-10% 글리세롤의 존재 또는 부재하에, 15-20% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 배양 배지와 같은 "냉동 배지"에 예를 들면, 약 4-10×106 세포/ml의 밀도로 현탁될 수 있다. 세포는 유리 또는 플라스틱 바이얼로 분배되고, 그 다음 프로그램 가능하거나 수동성인 냉동고로 옮긴다. 최적 냉동률은 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 융합열을 통하여 -1℃/min의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램이 사용될 수 있다. 일단 세포를 함유하는 바이얼이 -80℃에 이르면, 액체 질소 저장소로 옮긴다. 냉동보존된 세포는 수십년 동안 저장될 수 있다.
IV. 사용 방법
목적하는 세포 유형 또는 형태를 발생시킬 수 있는 줄기 세포의 쉽게 입수 가능한 소스의 동정은 치료적 처치, 조직 공학 및 연구에 중요하다. 줄기 세포의 이용성은 이식, 조직 공학, 혈관신생 조절, 혈관형성, 기관 재생, 인간화 동물 모델, 세포 대체 또는 세포 치료와, 질환의 예방 등에 지극히 유용할 것이다. 이러한 줄기 세포는 유전자 치료 요법의 일부로서 유전자를 피검체로 도입하는 데 사용될 수도 있다.
A. 분화 체세포(재-분화 세포) 제공
일단 정착된, 줄기 세포 배양물을 사용하여 자손 세포, 예를 들면, 새로운 조직을 생성할 수 있는 섬유아세포를 생성할 수 있다. ciEPSC는 도입되어 3개의 배엽 중의 어느 하나로부터의 세포, 예를 들면, 상피 세포, 케라티노사이트, 멜라노사이트, 지방 세포, 골 형성 세포를 포함하는 피부 및 모 세포, 근육 및 결합 조직, 예를 들면, 근세포, 연골 세포, 골 세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예를 들면, 간 세포, 신장 세포, 부신 세포, 및 아일렛 세포, 혈구, 망막 세포(및 감각 지각에 관련된 기타 세포, 예를 들면, 귀내 모 세포 또는 혀 상의 미뢰를 형성하는 세포), 및 신경을 포함하는 신경 조직으로 분화할 수 있다.
일 양태에서, ciEPSC는 세포를 "외배엽 분화" 배지에 노출시킴으로써 외배엽 기원의 세포로 분화하도록 유도된다. 또 다른 양태에서, ciEPSC는 세포를 "중배엽 분화 배지"에 노출시킴으로써 중배엽 기원의 세포로 분화하도록 유도된다. 역시 또 다른 양태에서, ciEPSC는 세포를 "내배엽 배지"에 노출시킴으로써 내배엽 기원의 세포로 분화하도록 유도된다. "내배엽", "중배엽" 및 "외배엽" 배지의 성분들은 당업자에게 공지되어 있다. 공지된 세포 표면 표지자는 세포가 확실히 상응하는 세포 배양 배지의 혈통의 세포로 분화하는지를 확인하는 데 사용될 수 있다. 3개의 배엽의 분화를 확인하는 데 가장 일반적으로 허용되는 표지자는 내배엽 세포에 대한 알파 태아성 단백질, 중배엽에 대한 알파 평활근 액틴, 및 외배엽에 대한 베타-III 튜불린의 발현이며, 이들 전부는 이들 조직의 발달의 매우 초기에 정상적으로 발현된다.
줄기 세포의 섬유아세포 또는 기타 세포 유형으로의 분화 이후 이로부터의 조직의 생성은 특정 외인성 성장 인자에 의하여, 또는 줄기 세포 배양의 배양 조건(예: 밀도)를 변화시켜 촉발될 수 있다. 세포의 목적하는 세포 유형의 세포로의 분화를 유도하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, ciEPSC는 물질(예: 성장 인자, 효소, 호르몬, 또는 기타 시그널링 분자)을 세포의 환경에 가하여 분화하도록 유도될 수 있다. 분화를 유도하는 데 사용될 수 있는 인자들의 예는 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자, 예를 들면, GM-CSF, G-CSF, 또는 M-CSF, 인터루킨, 예를 들면, IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, 백혈병 억제 인자(LIF), 또는 강 지수(Stl), 조직 수임 세포와의 공동배양, 또는 줄기 세포를 특정한 혈통으로 수임되도록 유도하는 기타 혈통 수임 세포 유형을 포함한다.
분화 세포는 배양시 확장되어 이후의 재생 및 사용을 위하여 저장될 수 있다.
B. 세포 치료
유도 만능 줄기 세포의 치료 용도는 유도 만능 줄기 세포, 줄기 세포 개체군 또는 이의 자손을 개체로 이식하여 암, 창상, 신생물, 상해, 바이러스성 가염, 당뇨병 등으로 인한 질환 및 장애를 포함하는 다양한 병리학적 상태를 치료함을 포함한다. 치료는 현재 당해 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 따라, 새로운 조직을 생성하는 세포의 용도, 및 이렇게 생성된 조직의 용도를 수반할 수 있다. 세포는 생체내 새로운 조직을 생성하도록 조직 손상 부위에 직접 이식, 주사 또는 투여될 수 있다. 일 양태에서, 투여는 유전자 변형 ciEPSC 또는 이의 자손의 투여를 포함한다.
바람직한 양태에서, ciEPSC는 자가 세포로부터 수득되며, 즉 공여 세포는 자가유래성이다. 그러나, 세포는 이종 세포로부터 수득될 수 있다. 일 양태에서, 공여 세포는 수령자(recipient)에 유전자 관련된 공여자로부터 수득한다. 또 다른 양태에서, 공여 세포는 수령자에 유전자 관련되지 않은 공여자로부터 수득한다.
사람 ciEPSC가 수혜 피검체(recipient subject)와 비교하여 이종(비-자가/동종이형) 소스로부터 유도되는 경우, 수반 면역억제 요법이 통상적으로 투여되며, 예를 들면, 면역억제제 사이클로스포린 또는 FK506이 투여된다. 그러나, 사람 유도 만능 줄기 세포의 미숙 상태로 인하여 이러한 면역억제 요법은 필요하지 않을 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 사람 유도 만능 줄기 세포는 면역조절(예: 면역억제) 요법의 부재하에 수령자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 세포는 막내 캡슐화될 수 있으며, 이는 유체의 교환을 허용하지만 세포/세포 접촉을 방지한다. 마이크로캡슐화 세포의 이식은 당해 기술분야에 공지되어 있다[예를 들면, 참조: Balladur et al., Surgery, 117:189-94, 1995; and Dixit et al., Cell Transplantation 1:275-79 (1992)].
(i) 당뇨병
당뇨병(DM)은 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 않거나, 세포가 생성되는 인슐린에 반응하지 않기 때문에, 피검체가 고혈당을 갖는 대사 질환 그룹이다. 인슐린 요법에 대한 유망한 대체 요법은 인슐린이 필요한 환자에게 아일렛 세포를 제공하는 것이다. 문헌[참조: Shapiro et al., N Engl J Med., 343(4):230-8 (2000)]에는 베타 세포/아일렛의 이식이 당뇨병 환자에 대한 치료를 제공함이 입증되어 있다. 다수의 인슐린 유형이 시판중이지만, 이들 제형은 주사용으로 제공되어 있다. 사람 유도 만능 줄기 세포는 아일렛 세포의 대체 소스를 제공하여 당뇨병을 예방하거나 치료한다. 예를 들면, 유도 만능 줄기 세포는 분리되고 췌장 세포 유형으로 분화되어 피검체에게 전달될 수 있다. 대안적으로, 유도 만능 줄기 세포는 피검체의 췌장에 전달되어 생체내 아일렛 세포로 분화될 수 있다. 따라서, 세포는 당뇨병의 발생을 예방하거나 치료하기 위한 이식에 유용하다. 췌장 아일렛 세포의 생존력 및 효능에 영향을 미치지 않고 시토카인 노출 후 염증을 감소시키는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제8,637,494호(Naziruddin, et al.)에 개시되어 있다.
(ii) 신경변성 장애
신경변성 장애는 질환, 유전적 상태 또는 상해, 예를 들면, 외상성 또는 허혈 척수 또는 뇌 손상의 결과로 뉴런의 열화를 수반하는 상태를 특징으로 한다. 신경변성 상태는 뉴런의 손상 또는 열화를 수반하는 어떠한 질환 또는 장애 또는 증상 또는 이의 원인 또는 효과라도 포함한다. 신경변성 상태는 이들로 제한되지는 않지만, 알렉산더(Alexander) 질환, 알퍼(Alper's) 질환, 알츠하이머 질환, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관 확장실조증, 카나반(Canavan) 질환, 코카인 증후군, 피질기저 변성, 크로이펠츠-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 헌팅턴(Huntington) 질환, 케네디(Kennedy's) 질환, 크라베(Krabbe) 질환, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 마카도-조셉(Machado-Joseph) 질환, 다발성 경화증, 파킨슨(Parkinson) 질환, 펠리체우스-메르츠바허(Pelizaeus-Merzbacher) 질환, 니먼-픽(Niemann-Pick's) 질환, 일차성 측삭 경화증, 레프섬(Refsum's) 질환, 샌드호프(Sandhoff) 질환, 쉴더(Schilder's) 질환, 스틸-리처드슨-올스제브스키(Steele-Richardson-Olszewski) 질환, 척수로, 또는 손상된 유론과 연관된 기타 상태를 포함한다. 기타 신경변성 상태는 외상 척수 손상, 허혈 척수 손상, 발작, 외상성 뇌 손상 및 유전적 상태를 포함하거나 이로 인한 것일 수 있다.
특히, 개시된 방법은 이를 필요로 하는 피검체에 세포가 신경변성 상태를 개선할 수 있도록 시험관내 확장된 NSC, 중성 전구 세포, 또는 중성 전구체를 이식함을 포함한다. 확장된 중성 줄기 세포의 이식은 강직성, 경직성, 발작, 마비 또는 기타 근육의 과다활동 증상을 갖는 다양한 형태의 골수증을 앓는 피검체의 보행 기능을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 상이한 신경변성 상태의 치료를 위한 중성 세포 및 중성 전구 세포를 확장시키고 이식하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제8,236,299호(Johe, et al.)에 개시되어 있다.
(iii) 암 치료
ciEPSC 및 이의 자손의 치료 용도는 유도 만능 줄기 세포, 줄기 세포 개체군, 또는 이의 자손을 개체에 이식하여 암 관련 증상을 치료하고/하거나 개선함을 포함한다. 예를 들면, 일 양태에서, ciEPSC는 피검체의 세포를 죽이고 감소시키고 손상시키는 화학요법을 받은 암 환자들에게 투여될 수 있다. 암에 대한 통상적인 줄기 세포 이식에서, 종종 방사선 요법과 함께, 매우 높은 용량의 화학요법이 사용되어, 모든 암 세포를 파괴시키려는 시도를 한다. 이러한 치료는 또한 골수내 줄기 세포를 죽인다. 치료 직후, 줄기 세포를 제공하여 파괴된 줄기 세포를 대체시킨다.
또 다른 양태에서, ciEPSC는 (탈-분화 인자 이외에)하나 이상의 추가의 치료 인자로 트랜스펙팅되거나 변형될 수 있다. 예를 들면, 일단 ciEPSC가 분리되면, 세포는 치료 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 변형된 다음, 피검체에 이식되거나 투여될 수 있거나, 목적하는 세포 유형으로 분화되고 피검체에 이식되거 전달될 수 있다. 이러한 조건하에 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 생성물의 전달을 위하여 피검체 내에서 발현된다.
(iii) 조직 공학
ciEPSCs 및 이의 자손은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 조직 가공된 구성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 조직 가공된 구성물은 손상된 기관 또는 조직의 복구 또는 대체를 위한 보철 장치를 포함한 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 이는 또한 단백질 또는 구성물의 세포에 의하여 분비된 기타 분자들에 대한 생체내 전달 시스템으로서 또는 일반적인 약물 전달 시스템으로서 작용할 수도 있다. 조직 가공된 구성물은 또한 조직 기능의 시험관내 모델로서 또는 다양한 치료 또는 약제의 효과를 시험하기 위한 모델로서의 용도가 밝혀졌다. 줄기 세포의 이식을 위하여 가장 일반적으로 사용되는 생체물질 스캐폴드는 문헌[참조: Willerth, S.M. and Sakiyama-Elbert, S.E., Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery (July 09, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook]에 검토되어 있다. 조직 공학 기술은 조직 성장을 지속시키고 촉진시키는 적합한 배양 기질의 선택을 종종 수반한다. 일반적으로, 이러한 기질은 3차원이어야 하고 관심있는 조직에 대한 목적하는 형상의 스캐폴드를 형성하도록 가공성이어야 한다.
미국 특허 제6,962,814호에는 조직 가공된 구성물 및 가공된 나이브 조직을 생성하기 위한 방법이 일반적으로 개시되어 있다. 특정 예에 관하여, 미국 특허 제7,914,579호(Vacanti, et al.)에는 조직 가공된 인대 및 건이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,716,404호에는 중합체성 매트릭스와 함께 이식된 해리된 근육 세포를 사용하는 유방 조직의 재구성 또는 확대를 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 제8,728,495호에는 자기 피부 섬유아세포를 사용하는 연골의 복구가 개시되어 있다. 미국 특허원 공개 제20090029322호(Duailibi, et al.)에는 치아 대체물에 사용하기 위한 치아 조직을 형성하는 줄기 세포의 용도가 개시되어 있다. 미국 특허원 공개 제2006/0019326호에는 두개내 동맥류의 치료용 세포-씨드 조직-가공된 중합체가 개시되어 있다. 미국 특허원 공개 제2007/0059293호(Atala)에는 손상 기관, 예를 들면, 신장, 심장, 간, 비장, 췌장, 방광, 요관 및 요도를 대체시키는 데 사용될 수 있는 조직 가공된 구성물(및 이러한 구성물의 제조방법)이 개시되어 있다.
(ii) ciEPSC로부터 생성된 세포(자손)
ciEPSC는 3개의 배엽중 어느 하나, 예를 들면, 상피 세포, 케라티노사이트, 멜라노사이트, 지방 세포, 골 형성 세포, 근육 및 결합 조직, 예를 들면, 근세포, 연골 세포, 골 세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예를 들면, 간 세포, 신장 세포, 부신 세포, 및 아일렛 세포(예: 알파 세포, 델타 세포, PP 세포, 및 베타 세포), 혈구(예: 백혈구, 적혈구, 대식세포 및 림프구), 망막 세포(및 감각 지각에 수반된 기타 세포, 예를 들면, 귀내 모 세포 또는 혀 상의 미뢰를 형성하는 세포), 및 신경을 포함하는 신경 조직을 포함하는 피부 및 모 세포로부터 세포로 분화하도록 유도될 수 있다.
(iii) 치료 조성물
ciEPSC는 피검체, 조직 또는 세포에 투여, 전달 또는 접촉하여 생체내 또는 시험관내/생체외 탈-분화를 촉진하기 위하여 제형화될 수 있다. 추가의 인자, 예를 들면, 성장 인자, 분화 또는 탈분화를 유도하는 기타 인자, 분비 생성물, 면역조절제, 소염제, 회귀 인자, 신경분포, 혈관화를 촉진시키거나 림프선 네트워크를 강화시키는 생물학적 활성 화합물, 및 약물이 혼입될 수 있다.
유도 만능 세포는 ciEPSCs 또는 ciEPSC 자손의 개체군을 단독으로 또는 담체 또는 지지 구조물 상부 또는 내부에 포함하는 조성물을 거쳐 환자에게 투여될 수 있다. 다수의 양태에서, 어떠한 담체도 필요하지 않다. 세포는 세포가 필요한 부위 상으로 또는 내부로 주사에 의하여 투여될 수 있다. 이러한 경우, 세포는 통상적으로 세척되어 배양 배지를 제거하고, 생리학적 완충제에 현탁된다.
기타 양태에서, 세포는 지지 구조물이 제공되거나 지지 구조물 상부로 또는 내부로 혼입된다. 지지 구조물은 메쉬, 고형 지지체, 스캐폴드, 관, 다공성 구조물 및/또는 하이드로겔일 수 있다. 지지 구조물은 전체적으로 또는 부분적으로 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 중합체, 금속, 예를 들면, 티탄, 골 또는 수산화인회석, 또는 세라믹으로 형성될 수 있다. 천연 중합체는 콜라겐, 히알루론산, 다당류 및 글리코스아미노글리칸을 포함한다. 합성 중합체는 폴리하이드록시산, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이들의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 예를 들면, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리우레탄, 폴리카보네이트 및 폴리에스테르를 포함한다. 이들은 이식편, 관, 메쉬 또는 하이드로겔의 형태일 수 있다.
고형 지지체
지지 구조물은 느슨한 제직 또는 부직 메쉬일 수 있으며, 여기서 세포는 메쉬 내부 및 상부에 씨딩된다. 구조물은 고형 구조 지지체를 포함할 수 있다. 지지체는 관, 예를 들면, 신경 축색돌기의 재성장용 신경관일 수 있다. 지지체는 스텐트 또는 밸브일 수 있다. 지지체는 다공성 구조물로의 세포의 내성장 및/또는 세포의 씨딩을 가능하게 하는 다공성 계면을 갖는, 무릎 또는 엉덩이 등의 보철 관절, 또는 이의 일부일 수 있다. 지지 구조물의 다수의 기타 형태도 가능하다. 예를 들면, 지지 구조물은 스폰지, 발포체, 산호 또는 내부 기공을 갖는 생체적합성 무기 구조물, 또는 교직 중합체 섬유의 메쉬 시트로부터 형성될 수 있다. 이들 지지 구조물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
지지 구조물은 하이드로겔-세포 혼합물을 성형하고 지지하는 기공 유사 공동 또는 간극을 갖는 투과성 구조물일 수 있다. 예를 들면, 지지 구조물은 다공성 중합체 메쉬, 천연 또는 합성 스폰지, 또는 금속 또는 골 또는 수산화인회석 등의 물질로 형성된 지지 구조물일 수 있다. 지지 구조물의 다공도는 영양소가 구조물로 확산되어, 내부의 세포에 유효하게 이를 수 있고, 세포에 의하여 생성된 폐 생성물이 구조물 외부로 확산될 수 있도록 하여야 한다.
지지 구조물은 새로운 조직이 필요한 공간에 맞도록 한 형태일 수 있다. 예를 들면, 지지 구조물은 연소된 피부 면적 또는 손실된 연골 또는 골 일부의 형태에 맞춘 형태일 수 있다. 이를 제조한 물질에 따라, 지지 구조물은 절단, 성형, 주조 또는 목적하는 형상을 생성하는 기타 방법에 의하여 성형할 수 있다. 지지물은 아래에 기재된 바와 같이, 지지 구조물이 세포로 씨딩되거나 하이드로겔-세포 혼합물로 충전되기 전 또는 후에 형성될 수 있다.
적합한 중합체의 예는 폴리글락틴이며, 이는 글리콜라이드와 락티드의 90:10 공중합체이고, VICRYL™ 흡수성 봉합사(braided absorbable suture)(Ethicon Co., Somerville, N.J.)로서 제조된다. 중합체 섬유(예: VICRYL™)는 펠트형 중합체 시트로 제직되거나 압축될 수 있으며, 이는 그 다음 어떠한 목적하는 형상으로도 절단될 수 있다. 대안적으로, 중합체 섬유는 이를 지지 구조물에 대하여 목적하는 형상으로 주조하는 금형에서 함께 압축시킬 수 있다. 일부 경우, 추가의 중합체는 성형되어 섬유 메쉬를 변경시키거나 섬유 메쉬에 추가의 구조를 부여하므로, 이를 중합체 섬유에 가할 수 있다. 예를 들면, 폴리락트산 용액은 폴리글리콜 섬유 메쉬의 이러한 시트에 가할 수 있고, 조합은 함께 성형되어 다공성 지지 구조물을 형성할 수 있다. 폴리락트산은 폴리글리콜산 섬유와 가교결합하여, 이들 개별적 섬유를 피복하고 성형된 섬유의 형상을 고착시킨다. 폴리락트산은 또한 섬유들 사이의 공간에 충전된다. 따라서, 다공도는 지지체로 도입된 폴리락트산의 양에 따라 변화될 수 있다. 섬유 메쉬를 목적하는 형상으로 성형하는 데 필요한 압력은 꽤 작을 수 있다. 필요한 전부는 섬유가 폴리락트산의 결합 및 피복 작용을 발생시키기에 충분히 길게 위치에서 유지되도록 하는 것이다.
대안적으로, 또는 추가로, 지지 구조물은 당해 기술분야에 공지된 기술에 의하여 생성된 기타 중합체 섬유 또는 중합체 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 얇은 중합체 필름이 중합체 용액으로부터 용매를 증발시켜 수득될 수 있다. 이러한 필름은 중합체 용액이 목적하는 형상의 릴리프 패턴을 갖는 금형으로부터 증발되는 경우, 목적하는 형상으로 주조될 수 있다. 중합체 겔은 또한 당해 기술분야에 공지된 압축 성형 기술을 사용하여 얇은, 투과성 중합체 구조물로 성형될 수도 있다.
하이드로겔
또 다른 양태에서, 세포는 하이드로겔과 혼합되어 세포-하이드로겔 혼합물을 형성한다. 하이드로겔은 주사 또는 카테터에 의하여, 또는 기타 지지 구조물의 착상시 투여될 수 있다. 가교결합은 투여 전, 투여 동안, 또는 투여 후 발생할 수 있다.
D. 동물 모델 및 기관 재생
분리된 ciEPSC는 ciEPSC를 목적하는 종(공여체)으로부터 동일하거나 상이한 종의 제2 동물(수령자)로 혼입시키는 동물 모델을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 공여 동물은 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 래트, 돼지, 캐틀, 양, 염소, 말, 개, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이, 마모셋 등일 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 공여 포유동물은 사람이고, 수혜 포유동물은 인간화 동물 모델을 제공하는 데 사용되는, 비-사람이다. 기타 양태에서, 공여 및 수혜 동물은 크기 매칭된다. 수령자는 사람 이외의 어떠한 동물이라도 될 수 있으며, 예를 들면, 돼지, 래트, 마우스, 캐틀, 양, 염소, 말, 개, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이, 마모셋 및 보노보일 수 있다. ciEPSC는 사람이 아닌, 포유동물내 기관 재생을 위하여 사용될 수 있고; ciEPSC는 포유동물이 발달 단계에서 기관의 발달 부족과 관련된 이상이 있는, 포유동물내 목적하는 기관을 생성하는 데 사용될 수 있다.
당해 방법은 ciEPSC를 사람이 아닌 수혜 포유동물의 배반포 단계 수정란으로 이식하고; 사람이 아닌 대리모(surrogate parent) 포유동물의 자궁에서 수정란을 발달시켜 리터(litter)를 수득하고, 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 리터로부터 장기를 수득함을 포함한다. 생성될 수 있는 장기의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 고정 형상의 고형 기관, 예를 들면, 신장, 심장, 췌장, 소뇌, 폐, 갑상선, 모발 및 흉선을 포함한다. 수혜 배아는 사람 이외의 어떠한 동물로부터라도, 예를 들면, 돼지, 래트, 마우스, 캐틀, 양, 염소, 말, 개, 침펜지, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이, 마모셋 등으로부터의 배아일 수 있다.
인간화 마우스 모델을 발생시키기 위한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며(미국 특허 제20110258715호), 예를 들면, 문헌[참조: Ito, et al., Cellular & Molecular Immunology, 9:208-214 (2012)]에서 검토되어 있다. 관심있는 기관의 발달과 관련된 이상을 갖고, 기관을 재생하는 데 사용될 수 있는 수혜 배아의 예는, 발달 단계에서 신장의 발달 부족과 관련된 이상이 있는 Sall1 넉아웃 동물(참조: Nishinakamura, et al., Development, 128: 3105-3115 (2001); 발달 단계에서 췌장의 발달 부족과 관련된 이상이 있는 Pdx1 넉아웃 동물(참조: Offield, et al., Development, 122: 983-995 (1996); 발달 단계에서 소뇌의 발달 부족과 관련된 이상이 있는 Wnt-1(int-1) 넉아웃 동물(참조: McMahon, et al., Cell, 62:1073-1085, (1990); 발달 단계에서 폐 및 갑상선 발달 부족과 관련된 이상이 있는 T/ebp 넉아웃 동물(참조: Kimura, et al., Genes and Development, 10:60-69, 1996)을 포함하거나; 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체(FGFR)의 세포내 도메인의 결핍을 과발현하고, 신장 및 폐 등의 다중 기관의 결핍을 유발하는, 우세한 음성 유형 트랜스제닉 돌연변이 동물 모델(참조: Celli, et al., EMBO J., 17:1642-655, (1998))이 사용될 수 있다. 대안적으로, 누드 마우스가 모발 또는 흉선을 생성하는 데 사용될 수 있다. 미국 특허 제20110258715호에 기재된 "시조" 동물이 또한 사용될 수 있다.
V. 키트
본원에 개시된 연장 만능성(CEP)의 화학적 유도제를 포함하는 키트가 제공된다. CEP는 위에서 기재된 바와 같다. 이는 세포 배양 배지에 대한 첨가를 촉진시켜 목적하는 농도를 생성하는 소정의 농도를 갖는 형태일 수 있다. 키트는 공여 세포 유형을 기반으로 한 목적하는 농도 범위 및 투여 시간을 제공하는 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 공여 세포의 배양을 위하여 CEP와 예비 혼합되어 연장 만능성을 유도하는 세포 배양 배지를 포함할 수도 있다.
본 발명은 다음 비제한적인 실시예를 참조하여 추가로 이해된다.
실시예
방법
소분자 라이브러리
스크린을 위하여 사용되는 소분자 라이브러리를 표 1에 기재된 바와 같이 구입하거나 인-하우스에서 발생시켰다.
스크린에 사용된 소분자 화합물 라이브러리
라이브러리 출처 화합물 수
토크리스크린™ 토탈(Tocriscreen™ Total) Tocris 1,120
단백질 키나제 억제제 라이브러리 I, II, III Millipore 324
스템셀렉트(StemSelect) 소분자 조절제 Calbiochem 303
핵 수용체 리간드 라이브러리 Enzo 76
선택된 소분자* 본 발명자들의 실험실 108
* 만능성 또는 후성적 변이에 관한 108개의 선택된 소분자를 포함하는, 본 라이브러리는 인-하우스에서 발생되었다.
루시퍼라제 리포터 검정을 기반으로 한 화학적 스크리닝
초기에는 사람내 나이브 만능성을 지지하는 신규한 소분자를 동정하는 데 중점을 두어 노력하였다. 마우스내 나이브 만능성을 지지하는 2i + LIF 조건을 기반으로 하여(ERK 억제제 PD0325901, GSK3β 억제제 CHIR99021, 및 사람 LIF (hLIF)), 초기 스크리닝을 수행하여, 초회감작 hES 세포를 사용하여 나이브 만능성 표지자 OCT4 원위 인핸서(DE)를 활성화시킬 수 있는 화학적 화합물을 동정하였다[참조: Yeom, et al., Development, 122:881-894 (1996); Tesar, et al., Nature, 448:196-199 (2007)](도 1a 및 표 1).
Oct4는 만능 세포내 만능성 조절 계층의 최상부에 있다. OCT4 유전자의 전사 개시 부위의 상부스트림 부분은 유전자 전사에 대한 3개의 조절 요소: 원위 인핸서(DE), 근위 인핸서(PE) 및 TATA-덜 근위의 프로모터(PP)를 함유한다. 각각의 인핸서는 OCT4 발현을 활성화하거나 억제할 수 있는 전사 인자에 대한 다중 잠재 결합 부위를 함유한다.
정착된 초회감작 hES H9 세포(사람 배아 줄기 세포주 H9)를 사용하여 제1 스크린을 수행하여, OCT4 DE를 활성화시키는 소분자를 동정하였다. 초회감작 hES/hPS(사람 만능 줄기) H9 세포를 ACCUTASE®(세포 탈착 용액)(Millipore) 중에서 해리시켰다. 그 다음, OCT4-DE 루시퍼라제 플라스미드(Addgene)를 뉴클레오펙션(neucleofection)(4D-Nucleofector™ System, Lonza)에 의하여 H9 세포로 트랜스펙팅시켰다. 대조 벡터 pGL4.74[hRluc/TK](Promega, E6921)를 정규화를 위하여 공동 트랜스펙팅시켰다.
트랜스펙션 후, 초회감작 hES/hPS H9 세포를 웰당 2×104 세포의 밀도로 마트리겔 피복된 24 웰 플레이트로 씨딩하고, 통상적인 사람 배아 줄기 세포(ES) 배지(DF12 + 20% KSR, 상세한 제형은 아래에 제공됨) + Y27632[(+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드++ + 디하이드로클로라이드)], Rho-결합의 선택적 억제제, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK)(10㎛)에서 배양하였다.
12시간 후, 배지를 hLIF(사람 백혈병 억제 인자) +2i(10 ng/mL hLIF(Peprotech), 1㎛ ERK(세포외 신호 조절 키나제) 억제제 PD0325901(Tocris), 및 3㎛ GSKβ 억제제 CHIR99021(Tocris)(N2B27 배지의 상세한 제형은 아래에 제공되어 있다)이 보충된 N2B27 배지로 대체시켰다. 라이브러리로부터의 단일 화합물을 각각의 웰에 각각 가하였다. 표 1의 모든 화합물을 시험하였다. 6일 동안 치료한 후, H9 세포를 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega, E1960)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 검출하기 위하여 용해시켰다.
화학 물질은 초회감작 hES 세포 대조군과 비교하여, DE 루시퍼라제 활성의 2배 상향 조절을 기반으로 한 양성 후보 물질로서 동정되었다. 스크리닝 후, 100개 초과의 후보 물질을 수득하였으며, 이는 OCT4 DE 활성을 기존의 초회감작 hPSC 배지에서 배양된 세포와 비교하여 2배 초과로 강화시킬 수 있었다.
돔형 hES 세포 콜로니 형성을 지지하는 소분자의 동정
초회감작 hES는 평평한 콜로니이다. 대조적으로, 나이브 사람 만능 세포는 돔형 콜로니이다. 그러므로, 어떠한 수득한 사람 EPS 세포라도 초회감작 사람 만능 줄기 세포로부터 형태학적으로 구별될 수 있다.
위의 제1 스크린으로부터의 양성 후보 물질은 추가로 스크리닝하여 hES 세포의 TGFβ 시그널링-독립적 자체-재생을 지지하는 소분자를 동정하였다(참조: Tesar, et al., Dev., 448:196-199 (2007); James, et al., Dev., 132:1273-1282 (2005); Vallier, et al., J. Cell. Sci., 118:4495-4509 (2005)). TGFβ 억제제 SB431542는 이후 치료 단계에서 화학 칵테일(2i+LIF+ 후보 물질)에 가하였다.
구체적으로, 초회감작 hES/hPS H9 세포는 ACCUTASE®(세포 탈착 용액)를 사용하여 단세포로 소화되고, 통상적인 hES 배지 + Y27632 중에서 제0일에 마트리겔 피복된 24-웰 플레이트(웰당 1×104 세포)로 씨딩되었다. 제1일에, 통상적인 hES 배지를 hLIF+2i 베이스가 보충된 N2B27 배지로 대체시키고, 제1 라운드 스크린으로부터의 후보 물질을 각각의 웰에 개별적으로 가하였다. 배지를 2일마다 변경하고, hLIF + 2i가 보충된 새로운 N2B27 배지로 대체시켰다. 6일 후(즉 제7일), TGF(변환 성장 인자) β 억제제, SB431542(10㎛, Tocris)를 비-분화 세포를 포함한 웰로 또 다른 6일 동안 가하였다. 이 스크리닝 후, 단기간에 TGF-베타-시그널링-독립적 자체-재생을 지지하는 30개 초과의 후보 물질이 수득되었다.
초회감작 hES/hPS 및 나이브 NHSM-hES 세포의 배양
다음의 이미 정착된 초회감작 hES/hPS 세포주를 사용하였다(EPS 전환에 대하여 고려된 세포주의 계대 수를 괄호 안에 표시함): H1(계대 30), 0227E(대략적인 계대 20), HSF1(대략적인 계대 50) 및 HSF6(대략적인 계대 60) 및 H9(계대 40). hES/hPS 세포주 H1(WA01) 및 H9(WA09)를 WiCell로부터 입수하였고, 핵형 분석에 의하여 인증되었다. 초회감작 hES 세포는 통상적인 hES/hPS 세포 배지: 20% 넉아웃 혈청 대체물(KSR)(Invitrogen), 1mm 글루타민(Invitrogen) 또는 1% GlutaMAX(Invitrogen, 35050), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1mm β-머캅토에탄올(Invitrogen), 및 4-10ng/ml bFGF(기준 섬유아세포 성장 인자)(Peprotech)가 보충된 DMEM-F12(Invitrogen) 중의 미토마이신 C-불활성화 MEF 영양 세포(2×104/cm2) 또는 마트리겔 피복된 디시 상에서 20% O2, 5% CO2 조건에 유지시켰다. 세포주를 디스파제를 사용하여 5-7일마다 1:3 내지 1:5의 분할비로 계대배양하였다. 나이브 NHSM-hES 세포를 이전의 보고서(참조: Gafni, et al., Nature, 504(7479):282-6 (2013))에 따라 배양하였다.
마우스 나이브 ES 세포의 배양
마우스 나이브 ES 세포를 10ng/mL hLIF(Peprotech), 3㎛ CHIR99021(Tocris) 및 1㎛ PD0325901(Tocris)이 보충된 혈청 부재 N2B27 배지를 함유하는 2i 배지 중에서, 미토마이신 C-불활성화 MEF 영양 세포 또는 젤라틴 피복 디시 상에서 20% O2, 5% CO2 조건에서 유지시켰다. 세포를 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen)에 의하여 2-4일마다 계대배양하였다.
비-hEPS 세포의 hEPS 세포로의 전환
N2B27-LCDM 배지의 제조
DMEM/F12(둘벡코(Dulbecco's) 변형 이글 배지/영양소 혼합물 F-12)(Invitrogen, 11320) 240ml, NEUROBASAL® 배지(기본 세포 배양 배지)(Invitrogen, 21103-049) 240ml, N-2 보충물(Innvitrogen, 17502048) 2.5ml, B-27 보충물(Invitrogen; 17504010) 5ml, 글루타민 또는 GlutaMAX™(Invitrogen) 1mm, 1% 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1mm β-머캅토에탄올(Invitrogen), 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen), (임의의) 5 mg/mL BSA(소 혈청 알부민)(Sigma),및 아래와 같은 소분자 억제제를 포함시켜, N2B27 배지 500ml를 발생시켰다.
소분자 및 시토카인(제조원: Peprotech, Tocris 또는 Santa Cruz)을 다음 최종 농도로 표시된 바와 같이 보충하였다: hLIF: 10 ng/mL; CHIR99021: 마우스 EPS 세포에 대하여 3㎛ 및 사람 EPS 세포에 대하여 1-1.5㎛; (S)-(+)-디메틴덴 말레에이트 (DiM): 2㎛; 모노사이클린 하이드로클로라이드(MiH): 2㎛. 소분자 및 시토카인이 보충된, N2B27 배지를 N2B27-LCDM이라고 명명하였다. 마이코플라스마 오염에 대한 시험을 제조자의 권고에 따라 PCR-계 접근 또는 마이코얼러트(MycoAlert) 마이코플라스마 검출 키트(Lonza)를 사용하여 모든 세포주에 대하여 수행하였다.
(a) 초회감작 hES/hPS 세포의 hEPS 세포로의 전환
초회감작 hES/hPS 세포의 최종 계대 이후 통상적으로 제3일 또는 제4일에 전환을 수행하였다(5-6일마다 계대배양되는 경우). 콜로니는 통상적으로 60-70% 컨플루언스에 이르렀다.
전환 전, 초회감작 hES 세포를 비분화 상태에서 유지시켰고, 이는 전환 당일 과성장하지 않았다
미토마이신 C-불활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포를 초회감작 세포의 계대배양 전일에 씨딩하였다(3×104 세포/cm2).
초회감작 hES/hPS 세포를 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 사용하여 단세포로 소화시켰다. 소화 후, 세포는 1:3 내지 1:4의 분할 비로 사람 ES 배지에서 정상적으로 씨딩되었다. 후속적으로, 사람 ES 배지에서 접종 후 12시간에, 사람 ES 배지를 N2B27-LCDM 배지로 대체시켰다. N2B27-LCDM 배지는 매일 바꾸었다. 단세포 계대배양 후 거의 생존할 수 없는 초회감작 hES 세포주에 대하여, 전환 전 24시간에 Y27632(1-10㎛)를 배지 내에 가하고, 최초 수 계대에서(3-5 계대) LCDM 배지 내에 유지시켰다. 대안적으로, 초회감작 hES 세포를 디스파제를 사용하여 작은 콜로니로 소화시키고, 통상적인 hES 배지를 사용하여 씨딩하였다. 12 또는 24시간 이후, hES 배지를 LCDM-함유 배지로 대체시켰다. 임의로, 초회감작 사람 PS 세포는 Y27632 치료 후 단세포 소화에 내성이 있는 경우, 초회감작 사람 PSC는 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 단세포로 소화될 수 있다. Y27632는 계대배양전 최초 12시간 동안 및 계대배양 후 12시간 동안 배지에 가하여야 한다.
돔형 콜로니가 이 기간 동안 점진적으로 나타난다. 그 다음, 3-6일 후, 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen, 25300)를 사용하여 배양기에서 37℃에서 3분 동안 세포를 트립신화하였다. MEF 배지를 사용하여 트립신화를 중단하였다. 배지를 서서히 위 아래로 피펫팅하여 세포를 디시의 표면에서 세척해 내었다: 세포는 대략적인 크기의 관에 수집하고, 실온에서 3분 동안 1,200-1,600rpm(250-450xg)에서 원심분리하였다. 세포를 적당 용적의 N2B27-LCDM 배지에 재현탁시키고(세포주 및 성장 비에 따라), MEF 피더로 플레이트에 씨딩하였다. 하나의 6-웰 플레이트에 대하여, 웰당 약 50,000-100,000개의 세포를 씨딩하였다. 분할 비는 통상적으로 1:3 내지 1:10이었다. 그 다음, 세포를 37℃, 20% O2, 5% CO2에서 배양하였다. 세포가 계대배양 후 생존하기 여전히 곤란한 경우, 최초 수 계대(3-5 계대) 동안 Y27632를 가하여 성공적인 전환을 확실히 하였다: 계대배양 전 최초 12시간 및 계대배양 후 12시간 동안 첨가를 수행하였다. 세포가 단세포 계대배양 후 서서히 성장하는 경우, 최초 수 계대(3-5 계대) 동안 분할 비(2:1 내지 1:3)를 감소시키는 것이 권장되었다. 수 계대 이후, LCDM 배지에 배양된 세포는 점진적으로 잘 증식될 수 있었다.
키메라 실험에 대하여, 계대가 더 높은(전환 후 계대>10) 초회감작 hPSC-유도 hEPS 세포가 사용되어 사람 EPS 세포가 연장 만능 상태로 재프로그래밍되는 것을 보장하도록 권장되었다. 본 발명자들의 실험에서, 계대 10에서의 전환된 돔형 콜로니는 키메라 실험에서 양잠재력을 나타내어, 전환에 대한 최소 배양 기간이 10 계대일 수 있음을 제시하였다(약 40일). 사람 초회감작 만능 줄기 세포의 EPS 세포로의 전환은 본 발명자들의 실험실에서 20개 이상의 독립적인 실험에서 6명의 다른 동료들에 의하여 반복되었다.
(b) 배반포로부터의 사람 EPS 세포 유도
임상적 목적으로 시험관내 수정에 의하여 생성된 배반포 단계에서의 사람 배아를 통지된 서면 동의 및 승인과 함께 입수하였다. 전체 배아를 미토마이신 C-불활성화 MEF 영양 세포(4×104/cm2)로 씨딩하고, 투명대를 프로테아제(Sigma, P8811)에 의하여 제거한 후, LCDM 배지에서 배양하였다. MEF 세포 배양 배지를 배아를 씨딩하기 30분 이상 전에 FBS-LCDM 배지로 변경하였다.
10% 넉아웃 혈청 대체물(KSR)(Invitrogen, 10828010), 10% FBS(Hyclone, SH30070.03E), 1% GlutaMAX(Invitrogen, 35050), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen, 21103) 및 0.1mm β-머캅토에탄올(Invitrogen, 21985)이 보충된 넉아웃 DMEM(10829-018, Invitrogen), 및 LCDM(10ng/mL; 각각 1.5μM, 2μM; 및 2μM)를 포함시켜 FBS-LCDM 배지를 제조하였다. 일부 실험에서의 배아의 생존력을 강화시키기 위하여, Y27632(10μM, Tocris, 1254)를 FBS-LCDM 배지로 가하였다.
비탈출(unhatched) 배반포에 대하여, 프로테아제(Sigma, P8811)에 의하여 투명대를 제거하였다. 프로테아제의 치료 시간은 상이한 배반포 중에서 30초 내지 5분으로 변화되었다. 투명대가 점진적으로 소멸되기 시작하면, 배반포는 초기에 제조된 G2 PLUS 배지로 옮겨졌다. 배아를 3 내지 5회 세척하여 잔여 프로테아제를 가능한 한 많이 제거한 다음, 제조된 MEF 피더로 씨딩하였다. 2일 후, 배아가 MEF 영양 세포로 부착된 경우, FBS-LCDM 배지를 N2B27-LCDM 배지로 변경하였다. 그렇지 않으면, 배양된 FBS-LCDM 배지의 반을 제거하고 N2B27-LCDM 배지로 변경하였다.
초기 증식물은 4 내지 7일 후 가시적이었고, 작은 조각으로 기계적으로 해리시키고 MEF 영양 세포 상에 FBS-LCDM 배지로 재씨딩하였다. 새로이 정착된 세포주는 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 사용하여 추가로 계대배양한 다음, 냉동시키거나 추가의 분석을 위하여 사용하였다.
최초의 수 개의 계대(3-5 계대) 동안, 콜로니는 기계적으로 해리되고, 씨딩한 후 최초 2일 동안 Y27632(10μM)가 보충된 FBS-LCDM 배지에서 배양하였다. FBS-LCDM 배지는 이후 N2B27-LCDM 배지로 변경하였다. 형태학적으로 마우스 ES 콜로니와 유사한 콜로니가 점진적으로 나타났다. 이들 콜로니가 생존하고 잘 증식되는 경우, 0.05% 트립신-EDTA가 세포를 소화시키는 데 사용될 수 있었다. 새로이 정착된 세포주는 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 사용하여 추가로 계대배양한 다음, 냉동시키거나 추가의 분석을 위하여 사용하였다.
(c) 체세포 및 세포 감염의 재프로그래밍
사람 배아 섬유아세포를 임상 연구 윤리 위원회(Clinical Research Ethics Committee)에 의한 통지된 서면 동의서 및 승인과 함께 입수하고, 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 보장하는 데 사용하였다.
oriP/EBNA1계 에피좀 벡터로 재프로그래밍하기 위하여, pCXLE-hOCT3/4(삽입물: 사람 OCT3/4), pCXLE-hSK(삽입물: 사람 SOX2 및 LKF4), pCXLE-hUL(삽입물: 사람 L-MYC) 및 pCXLE-EGFP(삽입물: eGFP) (Addgene 27076, 27078, 27080, 27082)를 포함하는 에피좀 플라스미드(참조: Okita, et al., Nat. Methods, 8(5):409-12 (2011))를 뉴클레오펙션(4D-Nucleofector™ System, Lonza)을 통하여 섬유아세포로 공동-트랜스펙팅시켰다.
트랜스팩팅된 섬유아세포(뉴클레오펙션당 약 1.0×106 세포)를 10% 소 태아 혈청(Invitrogen)을 함유하는 1 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM; Hyclone) 중의 3개의 10cm 피더-씨딩된 디시로 직접 플레이팅하였다. 섬유아세포를 감염 7일 후 재플레이팅하고, 10% 소 태아 혈청을 포함한 넉아웃 DMEM(Gibco)과 50 ng/ml bFGF(Origene), 3㎛ CHIR99021, 10ng/ml 사람 LIF(Peprotch), 10㎛ 포르스콜린(Forskolin)(Tocris)을 함유하는 10% KSR에서 배양하였다. 배양 배지를 2일마다 변경하였다. 트랜스펙션 후 제12일에, 배지를 LCDM 배지로 대체시켰다. EPS 콜로니와 유사한 형태를 갖는 콜로니는 트랜스펙션 후 제15일에 가시적이 되었다. 콜로니를 선택하고 추가의 분석을 위하여 0.05% 트립신-EDTA에 의하여 계대배양하였다.
마우스들
모든 마우스 작업은 제도적 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의하여 승인된 것이었다. 이 연구에서 사용되는 마우스들의 균주는 STOCK Tg(Sox2-cre)1Amc/J와 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 사이에 C57BL/6J-Tg(GOFGFP)11Imeg/Rbrc(OG), C57BL/6NCrlVr(C57), ICR, 및 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입한 F1 하이브리드, C57BL/6NCrlVr (C57)와 129 사이의 F1 하이브리드 또는 C57BL/6NCrlVr(C57)과 DBA 사이의 F1 하이브리드를 포함하였다. 기형종 형성 검정에 대하여 사용된 면역결핍 마우스들은 상업적으로 구입되었다.
마우스 EPS 세포의 정착 및 배양
배반포로부터 직접 유도된 mEPS 세포에 대하여, OG, C57, ICR, 또는 STOCK Tg(Sox2-cre)1Amc/J와 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스들 사이의 F1 하이브리드, 또는 C57BL/6NCrlVr(C57)와 129 사이의 F1 하이브리드를 LCDM 배지를 포함한 MEF 피더 상에서 씨딩하였다. 4일 후, 증식물이 관찰되고, 단세포로 절개되었다. mEPS 세포는 2-3일마다 계대배양되고, 냉동되거나 추가의 분석을 위하여 사용되었다.
마우스 나이브 ES 세포 TT2-2i, 마우스 나이브 ES 세포로부터 직접 전환된 mEPS 세포에 대하여, 2i 배지를 씨딩 후 12시간에 LCDM 배지로 대체시켰다. 2-3일 후, 콜로니를 추가의 분석을 위하여 계대배양하였다.
사람 및 마우스 연장 만능 줄기 세포의 배양
사람 및 마우스 연장 만능 줄기 세포를 20% O2, 5% CO2 조건에서의 혈청 부재 N2B27-LCDM 배지에서 배양하였다. 미분화 상태에서 사람 EPS 세포를 유지시키기 위하여, 다음 기준이 사용되었다: a) 사람 EPS 세포를 지나치게 산재하게 플레이딩하는 것을 방지; b) 새로이 제조된 MEF 영양 세포의 적합한 양의 사용; 및 c) 사람 EPS 사람을 과성장하도록 하지 않음(예를 들면, 90% 초과의 컨플루언스에 도달하지 않도록 함; 바람직하게는 세포는 90% 컨플루언스 미만이어야 함). 따라서, 사람 및 마우스 EPS 세포는 미토마이신 C-불활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포(3×104 세포/cm2) 상에서 배양되고, 2-4일마다 단세포 트립신화(0.05% 트립신-EDTA, Invitrogen)에 의하여 계대배양되었다(통상적으로 1:6 내지 1:10의 분할 비에서). EPS 세포의 계대 수는 연장 만능 상태의 획득 후 계수되는 계대의 수를 나타낸다. N2B27-LCDM 배지는 새로운 LCDM 배지로 매일 변경되었다.
마우스 배아 미세조작, 전조직 표본 착색 및 이미징
교차-종 키메라 검정은 윤리 위원회(Ethics Committee)에 의하여 승인되었다.
키메라 실험을 위하여, 사람 및 마우스 EPS 세포가 계대배양하기 1일 전에 사용되었고; 이들 세포는 최적의 미분화 형태를 나타내고 기하급수적으로 증식되었다. 이 시점에서 콜로니는 하위융합 밀도(subconfluent density)(약 70% 밀도)에서 존재하여야 한다.
hEPS 세포 주사에 대하여, hEPS 세포는 트립신화되고(0.05% 트립신-EDTA에 의하여), 소화된 세포는 세포 스트레이너(strainer)(40㎛)를 통하여 여과하였다. 그 후, 세포를 실온에서 3분 동안 1, 200-1, 500rpm(250-390xg)에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 적합한 밀도(2-6*105 세포/mL)에서 배양 배지에 재현탁시켰다. 사람 세포 주사를 위하여, 10μM Y27632은 현탁물에 첨가되는 것이 권장된다. 현탁물은 주사전 20-30분 동안 얼음 위에 위치시키고, ICR 2배체 마우스 배아의 E2.5 또는 E3.5 배아(배아당 10-15개 세포)미세주사하였다. 약 15개의 주사된 배아를 0.5 또는 2.5일의 교배후 허위-임신 암컷(pseudo-pregnant female)의 각각의 자궁각으로 옮겼다.
Tdtomato-라벨링된 mEPS 세포 및 통상적인 나이브 마우스 ES 세포의 주사를 위하여, mEPS 및 나이브 마우스 ES 세포를 트립신화하고, Y27632가 현탁물로 첨가되지 않음을 제외하고 hEPS 세포에 대해서와 동일한 방법으로 미세주사하였다.
수태물을 전조직 표본 착색 프로토콜(제조원: Abcam)에 따르는 항-GATA4(sc-1237, 1:200; Santa Cruz) 또는 항-SOX2(1:200, sc-17320; Santa Cruz) 항체로 공동 착색된, 항-사람 핵 항체(클론 235-1, 1:300; Millipore)으로 착색하는 전조직 표본에 대한 E10.5 발달 단계에서 절개하였다.
공초점 분석을 위하여, 표본 배아를 UltraVIEW VoX 시스템(PerkinElmer)에 의하여 이미징하였다.
수태물을 E12.5 발달 단계에서 절개하고 Tdtomato+ 세포 국소화를 검출하기 위한 면역형광 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. 때로는, 이들 마우스들로부터 마우스 배아가 수득되지 않은 경우, 몇 개의 임신한 마우스들은 추가의 분석으로부터 배제시켰다.
조직 부분의 면역염색을 위하여, 배아 및 태반을 E10.5 수태물로부터 분리한 다음, 매립하고, 냉동시키고, 시상봉합 측면으로부터 슬라이싱(두께 5㎛)하였다. Tdtomato 리포터 라벨링된 사람 세포가 주사된 배아를 항-NANOG(1:200, ab80892; Abcam) 및 항-Tdtomato/RFP (1:400, ab62341; Abcam)로 착색시키고, 태반을 항-Tdtomato/RFP(1:400, ab62341; Abcam), 항-CK8(1:50, sc-52324; Santa Cruz) 및 항-hCGβ(1:200, ab131170; Abcam)으로 착색시켰다. 일부 배아를 시상봉합 측면으로부터 슬라이싱하였다(두께 5㎛). 배아를 항-FOXA2(ab108422, 1:50; Abcam) 및 항-사람 핵 항체(클론 5-1, 1:300; Millipore)로 착색시켰다. 모든 이들 샘플은 ImageXpress 마이크로 고효율 스크리닝 시스템(MolDev)에 의하여 이미징화되었다.
E10.5 키메라 마우스 수태물로부터의 태반 및 난황낭내 hEPS-유도 세포의 검출
hEPS 세포의 배아외 키메라 현상을 검출하기 위하여, 태반 및 난황낭을 E10.5 수태물로부터 분리하고, 콜라게나제 IV를 사용하여 소화시켰다. 분리된 일차 세포를 24-웰 플레이트로 씨딩하고, 추가의 분석전 3-4일 동안 10% FBS 및 10% KSR이 보충된 넉아웃 DMEM에서 배양하였다.
단세포 미세주사의 키메라 검정
이 실험에서 사용된 세포를 배양하고, 다중-세포 미세주사와 유사한 방법으로 제조하였다. 세포 현탁물을 주사전 20-30분 동안 얼음 위에 위치시켰다. 얼음 위에 위치한 후, 소화된 단세포를 1시간 이내에 주사를 위하여 사용하였으며: 즉 전체 주사 공정은 30분 넘게 걸리지 않아야 한다. 그 후, 주사 배아는 37℃에서 5% CO2로 습윤화 배양기에서 1-2시간 동안 회수된다. 세포가 1시간 넘게 얼음 위에 위치하는 경우, 또 다른 세포 욕이 잔여 주사에 대하여 소화되었다. 단세포(Tdtomato-라벨링된 사람 세포, 라벨링되지 않은 사람 세포, Tdtomato-라벨링된 mEPS 및 나이브 마우스 ES 세포)는 8-세포 단계 ICR 2배체 마우스 배아로 미세주사되었고, E5.0까지 생체외에서 발달하도록 하였다(보충된 KSOM(K(칼륨)-보충된 심플렉스 최적화 배지)에서 60시간)[참조: Summers, et al., J. Assist Reprod. Denet., 30(8):995-999 *(2013)]. 다른 실험에서, 키메라 배반포의 발생을 위하여, 주사된 배아를 최초 4시간 동안 N2B27-LCDM 배지에서 배양한 다음(10μM Y27632(Tocris, 1254)가 단일 hEPS 세포가 주사된 키메라 배아의 배양을 위하여 첨가되는 것이 권장되었음), G2 PLUS 배지(Vitrolife, 10131)로 변경되었다. 60시간 후, 배아는 고정되고 면역염색되었다.
그 다음, 배아는 고정되고 면역염색되었다. Tdtomato-라벨링된 사람 세포가 주사된 배아에 대하여, 항체는 OCT4(sc-5279; Santa Cruz 또는 ab181557; Abcam) 및 CDX2(ab74339; Abcam 또는 CDX2-88, AM392; Biogenex)를 포함하였다. 라벨링되지 않은 사람 세포에 대하여, 항체는 항-사람 핵 항체(MAB1281; Millipore), CDX2(sc-19478; Santa Cruz) 및 OCT4(Ab18976-100; Abcam 또는 ab181557; Abcam)를 포함하였다. mEPS 및 나이브 마우스 ES 세포의 주사를 위하여, 세포는 Tdtomato 리포터로 구성적으로 라벨링되었다. 미세주사 및 면역염색을 위와 동일하게 수행하였다. 항체는 CDX2(CDX2-88, AM392; Biogenex), OCT4(Ab18976-100; Abcam)를 포함하였다.
단일 mEPS 세포의 생체내 키메라 능력을 검사하기 위하여, 단일 mEPS 세포가 주사된 키메라 배아를 37℃에서 5% CO2로 습윤화 배양기에서 1-2시간 동안 회수하도록 하고, 0.5 또는 2.5일의 교배 후 허위-임신 암컷의 자궁각으로 옮겼다. 수테물을 E10.5, E12.5 또는 E17.5 발달 단계에서 절개하고, Tdtomato+ 세포 국소화를 검출하기 위하여 면역형광 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. 태반을 E10.5 수태물로부터 분리한 다음, 매립하고, 냉동하고, 시상봉합 측면으로부터 슬라이싱(두께 5㎛)한 다음, CK8(1:50, sc-52324; Santa Cruz), PROLIFERIN(1:50, sc-47345; Santa Cruz) 및 TPBPA(1:100, ab104401; Abcam)로 착색하였다. 샘플을 ImageXpress 마이크로 고효율 스크리닝 시스템(MolDev)에 의하여 추가로 분석하였다.
단일-mEPS-키메라화-배아로부터의 영양 줄기(TS)-유사 및 ES-유사 세포의 유도
단일 Tdtomato-라벨링된 mEPS 세포를 8-세포 마우스 배아로 주사하고, N2B27-LCDM 배지에서 4시간 동안 배양하였다. 주사된 배아를 G2 PLUS 배지로 옮기고, 추가로 56시간 동안 배양하였다. 동일한 키메라 배아를 사용하여 이의 반을 기존의 mES 유도 배지로 씨딩하는 한편, 다른 반을 기존의 TS 유도 배지13로 씨딩함으로써, ES와 TS 둘 다의 세포주를 발생시켰다. ES-와 TS-유사 콜로니 둘 다 동일한 키메라 배아로부터 동시에 유도되었다. Tdtomato-라벨링된 기존의 마우스 ES TT2 및 mc2i-1은 이 검정에서 개별적으로 대조군으로서 사용되었고, 각각의 8-세포 배아는 10-15개의 세포가 주사되었다.
TS-유사 및 ES-유사 세포의 키메라 검정
정착된 TS-유사 또는 ES-유사 세포주의 10-15개의 세포를 8-세포 마우스 배아로 주사하였다. 시험관내 키메라 검정을 위하여, 주사된 배아를 G2 PLUS 배지에서 60시간 동안 배양하였다. 그 다음, 이는 고정되고 면역염색되었다. 생체내 키메라 검정을 위하여, 수태물은 E13.5 발달 단계에서 절개되고, 형광 양성 세포의 존재를 검출하기 위하여 면역형광 입체현미경을 사용하여 관찰되었다.
면역형광
세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 실온에서 45분 동안 0.2% Triton X-100 및 3% 정상 당나귀 혈청(Jackson Immuno Research)을 함유하는 PBS로 차단하였다. 세포를 4℃에서 밤새 일차 항체와 배양하였다. 이차 항체(Jackson Immuno Research)는 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 핵은 DAPI(Roche)로 착색되었다. 항체 세부사항은 아래에 제공되었다.
사람 세포에 대하여, 사용된 항체는 다음과 같다: 항-OCT4 항체(Ab18976-100; Abcam; sc-5279; Santa Cruz), 항-사람 NANOG 항체(AF1997; R&D), 항-SOX2 항체(sc-17320; Santa Cruz), 항-트리메틸-히스톤 H3(Lys27) 항체(07-449; Millipore) 및 KLF4 (sc-20691; Santa Cruz). 마우스 세포에 대하여, 항체는 다음과 같았다: 항-NANOG(ab80892; Abcam), 항-KLF(kruppel-유사 인자) 4(sc-20691; Santa Cruz), OCT4(Ab18976-100; Abcam), SALL4(ab29112; Abcam) 및 SOX2(sc-17320; Santa Cruz).
키메라 배반포의 면역형광 분석을 위하여, 사용된 항체는 다음을 포함하였다: OCT4(ab181557; Abcam), GATA3(ab199428; Abcam), NANOG(ab80892; Abcam) 및 CDX2(CDX2-88, AM392; Biogenex). TS 배지에서 배양된 TS-유사 세포, ES-유사 세포 또는 세포들의 면역형광 분석을 위하여, 사용된 항체는 다음을 포함하였다: OCT4(sc-5279; Santa Cruz), NANOG(ab80892; Abcam), SOX2(sc-17320; Santa Cruz), CDX2(CDX2-88, AM392; Biogenex) 및 EOMES(ab23345; Abcam).
유동 세포계측
배아, 난황낭 및 태반의 키메라 조직을 분리하고, 콜라게나제 IV를 사용하여 단세포로 소화시켰다. 현탁물을 세포 스트레이너(40㎛)를 통하여 여과하였다. 그 다음, 샘플을 BD LSRFortessa 기기 상에서 분석하였다. 데이터 분석을 FlowJo 소프트웨어(Ashland)를 사용하여 수행하였다.
mEPS-유도 태반 세포내 영양 표지자 유전자 발현의 분석
키메라 태반 조직을 분리하고, 콜라게나제 IV를 사용하여 소화시켰다. 일차 Tdtomato+ 및 Tdtomato- 태반 세포 둘 다를 FACS를 사용하여 정제하였다. 정제된 세포의 전체 RNA를 트리졸(Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. cDNA는 위에서 기재된 바와 같이 제조하였다31. 증폭된 cDNA 생성물을 qPCR 주형에 의하여 필요한 만큼 10배로 희석하였다. 정량적 PCR 분석을 Bio RAD CFX 커넥트 리얼-타임 시스템(Connect Real-Time System)상 KAPA SYBR ® FAST qPCR 키트를 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR에 사용되는 프라이머는 표 2에 열거되어 있다.
트랜스웰계 침습 검정
키메라 태반 조직을 분리하고, 콜라게나제 IV를 사용하여 소화시켰다. 하나의 키메라 태반 또는 그 반으로부터의 일차 태반 세포를 24-웰 플레이트내 마트리겔™-피복된 필터(8㎛ 기공 크기; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 씨딩하였다. 간단히, 세포를 혈청 부재 DMEM/F12 배지내 트랜스웰의 상부 챔버로 씨딩하였다. 트랜스웰의 하부 챔버를 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12 배지로 충전시켰다. 챔버를 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료시, 필터의 상부 표면상 세포를 면봉을 사용하여 제거하였다. 필터를 통하여 하부 표면으로 침입하는 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정하고, 면역형광에 의하여 추가로 분석하였다. 다음 항체를 면역형광을 위하여 사용하였다: CK8(1:200, sc-52324; Santa Cruz), CK7(1:40, MA5-11986; Thermo Scientific), 및 Tdtomato/RFP(1:400, ab62341; Abcam).
사람 OCT4 전사 조절의 평가
검출된 사람 세포주의 사람 OCT4 전사 조절을 평가하기 위하여, OCT4-DE 루시퍼라제 플라스미드(Addgene)를 뉴클레오펙션(4D-Nucleofector™ System, Lonza)에 의하여 세포로 트랜스펙팅시켰다. 대조 벡터 pGL4.74[hRluc/TK](Promega, E6921)를 정상화를 위하여 공동-트랜스펙팅시켰다. 기준선 활성은 빈 벡터로 트랜스펙팅시켜 분석하였다. 트랜스펙션 후, 세포주를 웰당 5*103 세포의 밀도로 마트리겔-피복된 96-웰 플레이트로 씨딩하였다. 그 다음, 48시간 후, 세포를 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega, E1960)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 검출하기 위하여 용해시켰다.
EB 형성 검정
마우스 및 사람 EPS 세포를 단세포로 트립신화시키고, 젤라틴-피복된 플레이트 상에 예비-플레이팅하여 MEF 영양 세포로부터 분리하고, 15% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 IMDM(인코브(Iscove's) 변형 둘벡코 배지)(Gibco)내 초저 부착 플레이트(Corning) 상에서 6일 동안 배양하였다. 그 다음, EB를 회수하고, 동일한 배지에서 6일 동안 마트리겔-피복된 플레이트 상에서 플레이팅하고, 고정 및 검출하였다. 사람 세포에 대하여, 항체는 다음을 포함한다: 항-SOX17 항체(AF1924; R&D), 항-FOXA2 항체(ab108422; Abcam), 항-LHX5 항체(sc-130469; Santa Cruz), 항-α-SMA 항체(CBL171; Millipore), 항-CDX2 항체(ab74339, Abcam) 및 항-GATA6 항체(sc-9055, Santa Cruz). 마우스 세포에 대하여, 항체는 다음을 포함한다: 항-FOXA2 항체(ab60721; Abcam), 항-β-III TUBULIN 항체(sc-80016; Santa Cruz), 항-α-SMA 항체(CBL171; Millipore) 및 항-CDX2 항체(CDX2-88, AM392; Biogenex).
기형종 검정
사람 및 마우스 EPS 세포를 주사전 트립신화에 의하여 수집하였다. 약 106개의 세포를 면역결핍 마우스로 피하 주사하였다. 기형종은 일반적으로 2-6주 내에 발달하였고, 동물들은 종양 크기가 직경 1.5cm를 초과하기 전에 죽였다. 그 다음, 기형종을 파라핀에 매립하고, 헤마톡실린 및 에오신 착색을 위하여 가공하였다.
기형종 검정에서의 hEPS 세포의 배아외 분화 가능성을 분석하기 위하여, 면역화학 검정을 적용하였다. hEPS- 또는 초회감작 hPSCs-유도 기형종을 고정시키고 배립한 후, 5㎛ 두께의 부분을 면역조직화학 착색을 위하여 사용하였다. 탈랍 및 수화 이후, 3% H2O2를 사용하여 내인성 퍼옥시다제를 차단하였다. 후속적으로, 조직은 2차 항체 동물 기원의 10% 정상 혈청에 의하여 차단되었다. 샘플을 일차 항체 hCGβ(ab131170; Abcam)와 4℃에서 배양하고, 추가로 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 결합된 이차 항체와 실온에서 30분 동안 배양하였다. 디아미노벤즈이딘(DAB)에 의한 가시화 이후, 조직을 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)으로 착색하였다.
비교용 게놈 하이브리드화(CGH) 분석
CGH 실험을 위하여, 게놈 DNA를 추출하고 참조로서 초기 계대에서 세포주를 사용한 이매진(Imagene)에 의하여 커스텀 슈어프린트(Custom SurePrint) G3 8x60K 사람 전-게놈 AGI-CGH 어레이로 하이브리드화시켰다.
핵형 분석
G-밴드 염색체 분석을 보고된 바와 같이 수행하였다(참조: Longo, et al., Transgenic Res., 6:321-328 (1997).
배가 시간 계산
세포를 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 사용하여 플레이트로부터 제거하였다: 이는 계수하고, Y27632가 부재한 적합한 배지중 웰당 10,000 세포의 밀도에서 영양 세포가 예비-접종된 24-웰 플레이트로 플레이팅하였다. 성장률을 시간의 함수로서 혈구계를 사용하여 세포의 수를 계수하여 결정하였다. 성장 지수기로부터의 데이터(48 및 72시간의 시점)를 사용하여 지수 성장 곡선을 수득하였다. 배가 시간은 다음 식에 따라 계산하였다:　DT=48*[lg2/(lgNt(제4일의 세포 수)-lgNo(제2일의 세포 수))].
RNA seq 및 데이터 분석
전체 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 초회감작 hES 세포, hEPS 세포 및 나이브 NSHM-hES 세포, mES 세포 및 mEPS 세포로부터 분리하였다. RNA 서열 라이브러리를 NEBNext®Ultra™ RNA 라이브러리 프렙 키트 포 일루미나®(Library Prep Kit for Illumina®)(NEB, USA)를 사용하여 구성하였다. 분열되고 무작위로 초회감작 200-bp 페어드-엔드(paired-end) 라이브러리를 Illumina HiSeq 2000을 사용하여 시퀀싱하였다. 유전자 발현도를 FPKM(백만 맵핑된 판독치당 전사물의 킬로베이스당 단편)으로서 계산하였다. 다른 실험에서는, 발생된 시퀀싱 판독치를 TopHat 정렬 소프트웨어 도구를 사용하여 사람에 대한 사람 게놈 빌드 hg19 및 마우스에 대한 GRCm38/mm10에 대하여 맵핑하였다. 각각의 유전자에 대한 판독치 카운트를 계산하고, 각각의 유전자의 발현값을 RPKM(백만 맵핑된 판독치당 전사물의 킬로베이스당 단편)을 사용하여 정규화하였다.
전사체 판독치를 TopHat2 프로그램을 사용하여 맵핑시켰다. 정규화된 차별적으로 발현된(DE) 유전자가 검출되었다. 제공된 P 값(프와송 분포)은 차별적 유전자 발현 시험에 상응한다. 위 양성(false positive)(I형) 및 위 음성(false negative)(II형) 오류에 대한 정정을 FDR(위 발견률) 방법을 사용하여 수행하였다. FDR < 0.01 및 log2 비 > 1의 절대값을 유전자 발현 차이가 현저한 것으로 단언하기 위한 역치로서 사용하였다.
DE 유전자의 유전자 온톨로지 분석은 DAVID 프로그램(참조: Huang, et al., Nature Protocols, 4:44-57 (2009))을 사용하여 수행하였다. 0.01 미만의 P-값을 갖는 용어는 상당히 강화된 것으로 정의되었다.
상이한 샘플내 전사물의 전체 발현 프로파일의 클러스터링(clustering)에 대하여, FPKM ≥ 0.1인 샘플들 중의 하나 이상에 발현된 전사물 전체가 사용되었다. 클러스터링에서 상이한 세포주의 유전 배경의 잠재적 영향을 최소화하기 위하여, 상이한 세포주로부터의 발현값을 상대적 풍부 값으로 변환되었고, 이는 각각의 전사물의 발현값을 샘플에 걸쳐 동일한 전사물내 발현값의 평균에 정규화시켜 발생시켰다. 수득한 발현 매트릭스는 계층적 클러스터링시켰다(Spearman 상관 관계, 평균 연결).
EPS 세포를 다른 만능 세포와 비교하기 위하여, 사람 리셋 PSC, 사람 3iL hESC, 사람 나이브 PSC, 사람 초회감작 ESC, 마우스 EpiSC, 마우스 2C-유사 세포 및 마우스 ESC의 공개 데이터를 포함시켰다. 생물정보 분석은 각각의 샘플에 의하여 의문시된 유전자로 제한되었다. 문헌[참조: Takashima et al. (2014) and Chan et al. (2013)]에 공개된 사람 리셋 PSCs, 3iL hESCs, 및 통상적인 PSC의 발현 프로파일에 대하여, 어레이익스프레스(ArrayExpress) 데이터베이스로부터의 원료 시퀀싱 판독치(E-MTAB-2857) 및 (E-MTAB-2031)를 재맵핑시키고 위에서 기재된 바와 같이 가공하였다. 문헌[참조: Gafni et al. (2013); Theunissen et al. (2014)]에 공개된 사람 나이브 PSC 및 사람 초회감작 ESC의 발현 프로파일에 대하여, NCBI GEO 데이터베이스내 GSE46872 및 GSE59430하의 정규화 마이크로어레이 데이터를 각각 다운로드하고 병합하였다. 문헌[참조: Najm et al. (2011)]에 공개된 마우스 ESC(GSM659549, GSM659550) 및 EpiSC(GSM659551, GSM659552, GSM659553, GSM659554)의 발현 프로파일에 대하여, 정규화 발현 표를 다운로드하고 병합하였다. 문헌[참조: Macfarlan et al.(2012)]에 공개된 2C-유사 세포의 발현 프로파일에 대하여, 정규화 발현 표를 다운로드하고 병합하였다. 문헌[참조: Macfarlan et al.(2012)]에 공개된 2-C 유사 세포의 발현 프로파일에 대하여, 2C::tomato+ 세포 및 2C::tomato- 세포(GSM8351954, GSM8351998)의 정규화 발현 데이터를 위에서 기재된 것과 동일한 방식으로 다운로드하고 처리하였다.
EPS 세포를 배아 예비착상 세포와 비교하기 위하여, 사람 및 마우스 배아 예비착상 세포의 공개 데이터를 사용하였다[참조: Tang, et al., PLoS One, 6:e21208 (2011); Yan, et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 20:1131-1139 (2013)]. 동일한 유전자의 프로브세트를 단일 값으로 붕괴시켜 평균값을 선택함으로써 유전자를 나타내었다. 플랫폼 및 상이한 데이터세트 중에서 배치 효과를 설명하기 위하여, 공개된 데이터와 본 발명자들의 데이터로부터의 발현값을, 원래의 데이터를 이의 ES 세포 샘플의 평균값에 정규화시켜 재계산하였다(사람에 대한 초회감작 hPSC 및 마우스에 대한 마우스 ESC).
유전자 발현의 후속적인 분석을 위하여, 유전자는 하나 이상의 샘플에 발현되는 경우, RPKM >5 역치를 사용하여, 두 데이터세트 모두에 보유되었다(참조: Blakeley, et al., Dev., 142:3151-3156 (2015)). 차별적으로 발현된(DE) 유전자는 R 소프트웨어내 패키지 DESeq2에 의하여 검출되었다. 조정된 p-값 < 0.05 및 log2 비 >1의 절대값이 유전자 발현 차이가 현저한 것으로 단언하기 위한 역치로서 사용되었다.
공분산 행렬을 기반으로 한 R 상태 패키지에 프린컴프(princomp) 함수를 사용하여 원리 성분 분석을 수행하였다. 각각의 연구에서 배아-유도 PSC로 정규화된 발현도를 사용하여 위에서 기재한 바와 같은 상이한 실험 및 플랫폼으로 인한 기술적 차이를 감소시켰다. R 소프트웨어내 p히트맵 패키지를 사용하여 히트맵(heatmap)을 발생시켰다.
RNA-seq 및 ChIP-seq 데이터는 연속 수탁 번호 GSE68782로 유전자 발현 옴니버스에 기탁되었다.
염색질 면역침전(ChIP), 시퀀싱 라이브러리 제조, 시퀀싱 및 데이터 분석
ChIP는 제조자의 프로토콜에 따라 EZ-Magna ChIP A/G 키트(Millipore)를 사용하여 수행하였다. 항-H3K27me3(항-트리메틸-히스톤 H(Lys27)(07-449, Millipore) 및 항-H3K4me3(항-히스톤 H3(트리메틸 K4)(ab8580, Abcam) 항체를 사용하였다. 정제 ChIP DNA를 사용하여 일루미나 다중화 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 일루미나 시퀀싱에 대한 라이브러리는 일루미나 1 TruSeq DNA 샘플 제조 v2 키트 프로토콜에 따라 제조하였다. 그 다음, 증폭된 라이브러리를 100 내지 500bp의 단편을 포획하도록 설정된 피핀 프렙 시스템(Pippin Prep system, 제조원: Sage Science)에서 2% 겔 카세트를 사용하여 크기 선택하였다. 별개의 TruSeq 색인을 갖는 라이브러리는 페어드 리드 모드(paired read mode)에서 100개의 베이스에 대하여 등몰 비로 혼합하고 일루미나 HiSeq 2500상 레인에서 함께 실행하여 다중화시켰다. 보타이(Bowtie) 소프트웨어 버전 2.0을 사용하여 사람 판독치를 사람 참조 게놈 hg19(UCSC, February 2009)으로 정렬시켰다. 추가의 분석을 위하여, 2개 이하의 미스매치를 갖는 게놈에 유일하게 정렬된 판독치만이 고려되었다. 염색질 프로파일은 ngs 플롯을 사용하여 모든 RefSeq 유전자에 대하여 계산되어 TSS에 상부스트림인 2 kb와 TES에 하부스트림인 2 kb 사이의 판독 밀도를 분석하였다. 사람 샘플의 프로파일은 초회감작 및 hEPS 세포의 평균 및 오차 막대를 나타낸다. MACS 버전 2.0(ChIP-Seq의 모델 기반 분석) 피크 발견 알고리즘을 사용하여 배경 위의 ChIP-Seq 보강의 부위를 확인하고, BAMPE 서열 Model을 사용하여 피크를 찾아내고, FDR<0.05을 사용하여 유의한 피크를 선택하였다. 최종적으로, 호머(Hommer) 및 R을 사용하여 피크에 주석을 달아서, 유전자 함수 요소내 피크의 분포 및 유전자 및 피크에 관한 유전자 온톨로지, 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics) 경로를 분석하였다.
웨스턴 블롯
전체-세포 단백질 추출물을 프로테아제 억제제 칵테일(78443; Thermo Fisher Scientific) 및 포스파타제 억제제 칵테일(78428; Thermo Fisher Scientific)이 보충된 RIPA(방사성-면역침전 검정) 용해 완충제(P0013B; Beyotime)를 사용하여 초회감작 hES 세포 및 hEPS 세포로부터 분리하였다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 2% BSA(A1470; Sigma-Aldrich)/TBST에서 배양한 다음, 4℃에서 밤새 5% BSA 또는 5% 탈지분유(P1622; Applygen)/TBST(0.1% Tween-20을 포함한 트리스 베이스 염수 완충제)에서 다음 항체와 배양하였다: 항-p-STAT3(포스포-STAT(신호 변환기 및 전사 활성제) 3(Tyr705)(9145S; Cell Signaling Technology), 항-STAT3(sc-482; Santa Cruz), 항-GP(당단백질)130(3732S; Cell Signaling Technology), 항-GSK-3β(AG751-1; Beyotime), 항-p-GSK-3β(Ser9)(9322S; Cell Signaling Technology), 항-PARP1(sc-7150; Santa Cruz), 항-TBX3(ab89220, Abcam), 항-GBX2(sc-22230; Santa Cruz) 및 항-β-ACTIN(A1978; Sigma).
MAPK 경로를 검출하기 위해, 사람 및 마우스 세포를 동일한 항체: ERK1/2(AM076-1; Beyotime), p-ERK1/2(AM071-1; Beyotime), JNK(AM7518-1; Beyotime), p-JNK(AM7516-1; Beyotime), p38(9212S; Cell Signaling Technology) 및 p-p38(9215S; Cell Signaling Technology)과 사용하였다.
이차 항체는 항-래빗 IgG, HRP(호스래디시 퍼옥시다제) 결합 항체(7074S; Cell Signaling Technology) 및 항-마우스 IgG, HRP-결합 항체(7076S; Cell Signaling Technology)였으며, 이들은 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 블롯을 BeyoECL Plus(P0018; Beyotime)를 사용하여 발달시켰다.
정량적 PCR 분석
배양 세포의 전체 웰로부터의 전체 RNA를 RNeasy 플러스 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 분리하였다. RNA는 전사 제1 스트랜드 cDNA 합성 수퍼믹스(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix)(TransGen Biotech)를 사용하여 cDNA로 전환되었다. PCR은 ABI 프리즘 7300 서열 검출 시스템(ABI Prism 7300 Sequence Detection System) 상에서 파워 SYBR® 그림 PCR 마스터 믹스(Power SYBR® Green PCR Master Mix)(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 데이터를 델타-델타 CT 방법을 사용하여 분석하였다. 실시간 PCR을 위하여 사용되는 프라이머를 표 2에 열거한다.
[표 2] 이 연구에서 사용되는 PCR 프라이머 및 shRNA 서열의 요약
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
게놈 PCR 및 사람 미토콘드리아 PCR 검정
세포, 배아 및 태반의 전체 DNA를 DNeasy 혈액 및 조직 키트(QIAGEN)를 사용하여 분리하였다. 게놈 PCR을 이지택 PCR 수퍼믹스(EasyTaq PCR SuperMix)(TRANSGEN BIOTECH)를 사용하여 수행하였다. Q-PCR에 의하여 사람 특이적 미토콘드리아 DNA 요소를 검출하기 위하여, 샘플당 전체 DNA 70ng을 사용하였다. 데이터를 델타-델타 CT 방법을 사용하여 분석하였으며, 이는 우선 사람-마우스 보존 미토콘드리아 DNA 요소의 값으로 정규화되었다. 그 다음, 상대 발현값은 비-주사 야생형 마우스 조직으로부터 분리된 대조 샘플로부터 발생된 값으로 추가로 정규화되었다. 게놈 PCR을 위하여 사용된 프라이머를 표 2에 열겨한다.
단세포의 정량적 PCR 분석
우선, 세포를 0.5% 트립신-EDTA를 포함한 하나의 단세포 현탁물(1% BSA-PBS)로 분해한 다음, 각각의 세포를 손으로 채취하고, 저장성 용해 완충제를 함유하는 0.2ml PCR 관으로 옮겼다. 두번째로, 단세포 cDNA를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(참조: Picelli, et al., Nature Protocols, 9:(171-181 (2014). 증폭된 cDNA 생성물을 qPCR 주형에 의하여 필요한 만큼 10배 희석하였다. Bio RAD CFX 커넥트 리얼-타임 시스템상 KAPA SYBR ® FAST qPCR 키트를 사용하여 정량적 PCR 분석을 수행하였다. 실시간 PCR을 위하여 사용되는 프라이머를 표 2에 열거한다.
RNAi
shRNA 렌티바이러스 벡터(Sigma-Aldrich)를 사용하여 PARP1 넉다운을 달성하였다. shRNA 서열을 표 2에 열거한다. hEPS 세포를 이들 벡터로 각각 트랜스펙팅시키고, 분석전 3 계대 동안 배양하였다.
Parp1 넉아웃 mEPS 세포주의 발생
가이드 RNA 서열을 플라스미드 px330(Addgene)으로 클로닝하였다. Px330 함유 gRNA는 뉴클레오펙션(4D-Nucleofector™ System, Lonza)에 의하여 소화된 단일 mEPS 세포로 공동-트랜스펙팅되었다. 단일 콜로니를 채취하였고, 개별적으로 확장시켰다. 콜로니의 게놈 DNA를 DNeasy 혈액 & 조직 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출하였고, 이는 게놈 PCR에 의하여 추가로 분석되었다. Parp1 유전자 좌의 엑손 1 및 엑손 2가 결손된 콜로니를 동정하였다.
결과 및 고찰
2개의 소 분자, (S)-(+)-디메틴덴 말레에이트(DiM) 및 미노사이클린 하이드로클로라이드(MiH)는 마우스 배아 줄기(ES) 세포와 형태학적으로 유사한 이러한 조건하에 돔형 hES 콜로니 형성을 지지하는 것으로 밝혀졌다. 이들 소 분자의 추가의 조합 및 시험 후, hLIF, CHIR99021, DiM 및 MiH를 함유하는, LCDM으로 명명된 새로운 처리 조합이 정착되었다(도 1a). 이러한 처리 조합하에, 마우스 ES 세포와 형태학적으로 유사한 세포주는 초회감작 hES 세포(데이터는 나타내지 않음), 배반포로부터 직접 유도된 세포(데이터는 현재 나타나 있음)의 전환에 의하여 발생될 수 있거나, 만능성 인자를 갖는 신체 재프로그래밍(데이터는 나타내지 않음)에 의하여 발생될 수 있다. LCDM-지지 세포는 시험관내 분화 및 생체내 기형종 형성 둘 다에서 3개의 배엽으로 분화하는 능력을 나타내었다(표 3, 데이터는 나타내지 않음).
[표 3] 정착된 사람 및 마우스 연장 만능 줄기 세포의 요약
Figure pct00005
이들 세포는 단세포로의 트립신화 이후 활발하게 확장될 수 있었고, 50 계대 초과 이후 정상 핵형을 나타내었다(표 3, 데이터는 나타내지 않음). 그러므로, LCDM 조건은 마우스 ES 세포와 형태학적으로 유사한, 만능 분화 가능성을 갖는 사람 줄기 세포의 안정성 개체군의 발생을 지지하였다.
hEPS 세포는 배아외 잠재성을 나타내기 때문에, 이들 세포내 배아외 표지자의 발현이 연구되었다(도 2a 및 도 2b-c). 다중 배아외 유전자, 예를 들면, CDX2(2 내지 3배), GATA6(2.5배), HAND1(8배) 및 EOMES(1.5배)는 초회감작 hES 또는 나이브 NHSM-hES 세포와 비교하여 hEPS 세포가 상향 조절되었다(도 2c 및 도 2d-e). 단세포 분석은 이들 유전자의 발현에서 세포 대 세포 변화가 초회감작 hES 세포에서보다 hEPS 세포에서 더 낮음을 나타내어(데이터는 나타내지 않음), hEPS 세포에서의 배아외 유전자 발현 증가가 EPS 세포가 안정적으로 유지됨을 나타내는 세포의 아집단으로부터 발생하지 않음을 제시한다. 추가로, hEPS 세포에서의 대표적인 배아외 표지자(COX2, EOMES 및 SOX17)의 발현은 mRNA 수준상 hEPS 세포로부터 유도된 분화 세포의 이들 표지자의 발현보다 낮은 규모(CDX2, 30배 낮음; EOMES, 60배 낮음; SOX17, 41배 낮음)였으며(도 2d), 이는 단백질 수준상 면역형광을 사용하여 검출될 수 없었다(데이터는 나타내지 않음). 그러므로, 이들 데이터는 배아외 유전자의 mRNA 기초 활성이 hEPS 세포에서 상향조절됨을 나타낸다. hEPS 세포내 만능성 표지자 유전자 발현이 추가로 분석되었다. 면역형광 분석은 만능성 표지 유전자, 예를 들면, OCT4, NANOG 및 SOX2가 hEPS 세포에서 발현됨을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 초회감작 hES 및 나이브 NHSM-hES 세포와 비교하여, 몇 가지 만능성 유전자, 예를 들면, NANOG, OCT4 및 UTF1이 hEPS 세포에서 하향조절되었다(도 3a-3c). 한편, 기타 만능성 유전자, 예를 들면, TBX3 및 GBX2가 상향조절되었다(도 3a-3c, 데이터는 나타내지 않음). 특히, OCT4, REX1, DPPA3, TBX3 및 GBX2를 포함하는, 몇 가지 만능성 표지 유전자의 mRNA 발현은 초회감작 hES 세포에서보다 hEPS 세포에서 더 균질하였다(도 3d-3e). 종합하면, 이들 데이터는 hEPS 세포가 초회감작 hES 또는 나이브 NHSM-hES 세포와 비교하여 몇 가지 독특한 분자 특징을 가짐을 제시한다.
hEPS 세포의 후성적 특징은 H3K4me3 및 H3K27me3 표지의 게놈-광범위한 분포를 분석함으로써 그 다음 검사하였으며, 이는 염색질의 활성 및 억제 후성적 상태를 각각 나타낸다. 초회감작 hES 세포와 비교하면, hEPS 세포는 H3K27me3 및 H3K4me3 수준의 전반적 감소를 나타내었다(도 4a-4b). 특히, H3K27me3의 감소가 CDX2, GATA4, GATA6 및 EOMES 등의 배아외 표지자의 게놈 유전자 좌에서 관찰되었으며(데이터는 나타내지 않음), 이는 배아외 유전자의 기본 mRNA 활성의 상향조절과 일치한다. 한편, GBX2, TBX3 및 LIFR을 포함하는, 몇 개의 나이브 만능성 관련 유전자는 hEPS 세포내 증가된 H3K4me3 및 감소된 H3K27me3을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, 이전의 연구는 나이브 NHSM-hES 세포 또한 초회감작 hES 세포와 비교하여 H3K4me3 및 H3K27me3 수준 둘 다의 전반적 감소를 보임을 나타내었다(참조: Gafni, et al., Nature, 504(7479):282-6 (2013)). 그러므로, 나이브 NHSM-hES 세포와 유사하게, hEPS 세포는억제 및 활성의 후성적 랜드마크 둘 다를 전반적으로 소시키는 경향을 나타내었으며, 이는 hEPS 세포의 후성적 상태를 초회감작 hES 세포와 구별시킨다.
초회감작 hES 세포와 비교시, hEPS 세포는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 단백질 수준인, GP130, STAT3 및 -p-STAT3의 수준을 측정함으로써 결정되는 LIF 시그널링의 활성화를 나타내었다. 데이터는 초회감작 hEPS와 비교시, hEPS 세포의 이러한 단백질 수준의 상향조절을 나타내었다. 또한, GSK3β 인산화는 웨스턴 블롯 분석에 의하여 결정되는 바와 같이 hEPS 세포에서 감소되었다(데이터는 나타내지 않음).
LCDM-세포의 유도가 종-특이적인지 결정하기 위하여, LCDM-세포가 마우스들(mEPS), 래트 및 돼지에서 정착될 수도 있는지를 검사하는 실험을 수행하였다. 마우스 LCDM-세포는 LCDM 조건을 사용하여 배반포로부터 성공적으로 정착되었다(데이터는 나타내지 않음). 만능성 표지자의 분석은 마우스들로부터의 LCDM-세포가 NANOG, KLF4, SALL4 및 SOX2 등의 만능성 표지 유전자를 발현하였고; 돼지로부터의 LCDM-세포가 SOX2, REX1 및 OCT4 를 발현하였음(데이터는 나타내지 않음)을 나타낸다. 이들 세포는 모든 3개의 배엽을 발생시키는 능력을 나타내었고(데이터는 나타내지 않음), 정상 핵형을 유지시켰다(데이터는 나타내지 않음). 또한, 마우스 LCDM-세포는 또한 생식세포 투과로 키메라를 발생시켰고, 4배성 상보성을 통하여 마우스 발생을 허용하였다(데이터는 나타내지 않음).
배아(Em) 조직 이외에, 키메라 검정을 사용하는 마우스 LCDM-세포의 생체내 발달 가능성을 검사하는 동안, LCDM-mES-유도 세포의 배아외(ExEm) 조직으로의 통합, 예를 들면, 태반 및 난황낭(24/60 회수된 E12.5 수태물)이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이는 배아 키메라 현상(31/78 회수된 배아)(도 4f, 데이터는 나타내지 않음) 및 난황낭으로 통합하는 능력을 나타내지만 태반에 기여할 수 없는(0/78 회수된 수태물) mES 세포와 대조적이며, 결과는 이전의 보고서[참조: Beddington, et al., Dev., 105:733-737 (1989)]와 일치한다. 이들 결과는 LCDM-mES 세포가 ExEm 혈통에 대한 연장된 발달 효능을 획득하였으며, 이하 본 발명자들은 이를 연장 만능 줄기 세포, 또는 EPS 세포라고 한다.
mEPS 세포의 발달 효능을 명백히 입증하기 위하여, 매우 엄격한 검정을 채용하여 단일 공여 세포의 키메라 형성 능력을 검사하였다. 이를 위하여, 단일 형광-라벨링된 mEPS 세포를 8-세포 단계 마우스 배아로 주사하고, 이의 키메라 기여는 시험관내 배양 60시간 후 검사하였다. 특히, 회수된 배반포의 33.2%(86/259)는 키메라 배반포내 영양외배엽(TE) 및 내세포괴(ICM) 둘 다에 대한 단일 mEPS 세포의 동시 분화를 나타내었으며(도 4g 및 표 6), 이는 tdTomato를 배반포의 외층내 TE 표지자 CDX2 또는 GATA3, 및 ICM내 만능성 표지자 OCT4 또는 NANOG와 공동 발현시켜 입증되었다(데이터는 나타내지 않음).
[표 6]
Figure pct00006
지속적으로, 단일 mES 유도체는 TE와 ICM 둘 다에 기여하지 않았다(0/138 회수된 배반포).
예비착상 단계 이후의 단일 mEPS-유도 키메라 수태물을 E10.5, E12.5 및 E17.5를 포함하는 개별적인 실험에서 분석하고, E10.5(21/90 회수된 수태물) 및 E12.5(10/63 회수된 수태물) 수태물내 Em and ExEm 조직 둘 다에서의 단일-공여체 mEPS 세포 유도체의 통합이 관찰되었다(표 8).
[표 8] 단일 mEPS 세포 주사를 기반으로 한 E10.5, E12.5 또는 E17.5에서 분석된 키메라 검정의 요약
Figure pct00007
종합하면, 이들 결과는 LCDM 조건이 또한 마우스들의 EPS 세포의 정착을 지지함을 나타낸다.
단일 mEPS 세포의 배반포 유도체를 기능적으로 평가하기 위하여, ES 및 영양 줄기(TS) 세포 유도(참조: Tanaka, et al., Science, 282:2072-2075 (1998))를 그 다음 시험하였다. 이를 위하여, TE 및 ICM 둘 다로 mEPS-유도된 세포가 기여된 키메라 배아가 ES 및 TS 세포주의 유도에 동시에 사용되었다. TE 및 ICM 둘 다로의 단일 mEPS-유도된 세포가 기여된 키메라 배반포는 씨딩되고 2i 및 TS 배지로 추가로 계대배양되고(위의 방법에서 논의한 바와 같음), 이는 Tdtomato+ mEPS-유도된 ES(EPS-ES) 및 TS(EPS-TS) 콜로니의 유도를 동시에 성공적으로 지지하였다. ES(EPS-ES) 및 TS(EPS-TS) 세포 둘 다는 동일한 키메라 배반포로부터 유도될 수 있었다(표 9, 데이터는 나타내지 않음).
[표 9] 동일한 키메라 배아로부터 TS 및 ES 유도
Figure pct00008
대조군으로서, mES 세포주(2i-ES)가 또한 다중 Tdtomato+ mES 세포가 주사된 8-세포 배아로부터 발달된 키메라 배반포로부터 정착되었다(데이터는 나타내지 않음). 10-15 Tdtomato-라벨링된 mES 세포는 하나의 마우스 8-세포 배아로 미세주사되었고, 추가로 60시간 동안 배양되었다. 키메라 배아는 ES 또는 TS 유도 배지로 각각 씨딩되었다. mEPS 세포와 대조적으로, Tdtomato+ TS-유사 콜로니는 mES 세포가 주사된 8-세포 배아로부터 유도된 배반포를 사용하여 정착될 수 없었다(0/48). ES(2i-ES) 세포만이 유도될 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).
EPS-ES 세포는 만능성 표지자 OCT4 및 NANOG를 발현하였지만, TS 표지자 CDX2 및 EOMES는 발현하지 않았고(데이터는 나타내지 않음); EPS-ES 세포는 또한 SOX2를 발현하였다. EPS-ES 세포는 배반포의 ICM에만 기여하였고(데이터는 나타내지 않음), 키메라 배아내 배조직을 발생시켰지만 태반은 발생시키지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 다른 한편으로, EPS-TS 세포는 통상적인 TS 표지자(EOMES 및 CDX2)를 발현하였지만 만능성 표지자 OCT4 및 NANOG를 발현하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). EPS-TS는 또한 SOX2를 발현하였다. EPS-TS 세포는 배반포내 TE 층으로 통합되었지만(데이터는 나타내지 않음), 키메라 배아내 태반 조직에 독점적으로 기여하였다(데이터는 나타내지 않음).
EPS 세포가 TS 배지내 TS 세포로 직접 전환될 수 있는 가능성을 배제시키기 위하여, mEPS 세포를 3 계대 동안 TS 배지에서 배양하였고, TS 표지의 수준을 결정하였다. LCDM 조건(TT2-6 p0 및 mc6-1 p0)에서 배양된 mEPS 세포 또는 2i 조건(TT2-2i p0 및 mc2i-1 p0)에서 배양된 mES 세포는 개별적으로 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 TS-배양된 mEPS 세포가 TS 표지자를 상향조절하지 않았고(도 5a, 데이터는 나타내지 않음), 여전히 NANOG 발현을 유지시켰음(데이터는 나타내지 않음)을 나타낸다. 이들 결과는 EPS-TS가 직접 전환을 통해서보다는 EPS-분화된 TS 세포로부터 유도된다는 결론을 지지한다. 종합하면, 이들 데이터는 예비착상 마우스 발달 동안 ICM 및 TE 혈통 둘 다에 대한 단일 mEPS 세포의 발달 가능성을 입증한다.
FACS 분석은 E10.5 키메라 배아, 난황낭 및 태반에서의 단일 mEPS-유도된 세포의 광범위한 통합을 추가로 확인하였다(표 10).
[표 10] E10.5 키메라 수태물내 단일 mEPS -유도된 키메라 세포의 백분율의 FACS 분석의 요약
Figure pct00009
대조적으로, 단일 mES 세포의 주사에 의하여 발생된 E10.5 키메라(0/44 회수된 배아)가 수득되지 않았다(표 8). 특히, 단일 mEPS-유도된 세포는 키메라 태반의 영양막 층으로 통합되었고, 영양 표지자 CK8을 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). 이들 세포는 또한 영양막 거대 세포(TGC)의 층 및 해면영양막에서 관찰되었고, TGC 표지자 PLF(PROLIFERIN) 및 해면영양막 표지자 TPBPA를 각각 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). 단일 mEPS-유도된 세포는 또한 임신 말기 E17.5 수태물내 Em 및 ExEm 조직 둘 다를 키메라화하였고(13/94 회수된 수태물)(표 8, 데이터는 나타내지 않음), E17.5 키메라 태반에 기여된 단일 mEPS 세포 유도체의 백분율은 19% 이하일 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). 단일 EPS-유도 영양막의 기능을 추가로 평가하기 위하여, 이의 침습 능력을 트랜스웰계 침습 검정을 사용하여 시험하였는데(도 5b), 이는 영양막의 가장 유망한 기능적 특징들 중의 하나가 탈락된 자궁을 침습하는 이의 능력이다. 영양 표지자 CK8 또는 CK7을 발현한, Tdtomato+ 단일 mEPS-유도 태반 세포는 막 기공을 통하여 이동할 수 있었고, 막의 기저 표면에 이르러(데이터는 나타내지 않음), 이의 침습 특성을 강조하였다. 추가로, 다중 영양 표지자의 mRNA 발현은 mEPS 세포와 비교시 mEPS-유도된 태반 세포에서 현저히 상향조절되었다(도 5c).
추가의 실험은 단일 mEPS-유도된 생후 키메라 마우스들을 수득하는 것이 가능한지를 시험하였으며, 이는 진정한 만능성을 입증하기 위한 절대 표준(golden standard)으로서 간주된다(참조: De Los Angeles, Nature, 525:569-478 (2015)). 87마리의 태어난 새끼동물(pup)들 중에서, 43개의 단일 mEPS-유도된 키메라(49.4%)가 수득되었고, 이중에서 24개가 털 색상으로 판단하여 고도의 키메라 현상을 나타내었다(표 11, 데이터는 나타내지 않음).
[표 11] 상이한 새끼동물들로부터의 키메라 수준
Figure pct00010
종합하면, 이들 데이터는 EPS 세포의 진정한 만능성 및 단세포 수준에서 Em 및 ExEm 혈통 둘 다에 대한 이의 키메라 수행능력을 입증한다.
mEPS 세포의 키메라 형성 능력은 추가의 실험으로 이어져 hEPS 세포가 이종간 사람-마우스 수태물을 또한 발생시킬 수 있는지 검사한다. 단일 형광-라벨링된 hEPS 세포를 8-세포 단계 마우스 배아로 주사하였고(데이터는 나타내지 않음), 이의 키메라 공헌을 TE(CDX2, GATA3) 및 ICM(OCT4, NANOG) 표지자로 공동-착색시켜 시험관내 배양 60시간 후 검사하였다. 결과는 키메라 배반포에서 단일 hEPS 세포의 TE 또는 ICM 표지자를 발현하는 세포로의 각각의 동시 분화(51/345 회수된 배아, 14.7%)를 나타내었다(표 12-15, 데이터는 나타내지 않음). 대조군으로서, 초회감작 hPSC는 단세포 주사 이후 키메라 배반포를 형성할 수 없었고(0/143 회수된 배아)(표 12, 13a, 13b 및 13c, 데이터는 나타내지 않음), 이는 영장류 초회감작 PSC의 이전에 보고된 불량한 키메라 현상과 일치한다(참조: Gafni, et al., Nature, 504:282- (2013); Tachibana, et al., Cell, 148:285-295 (2012); James, et al., Dev. Biol., 295:90-102 (2006)).
[표 12]
Figure pct00011
[표 13a] 단일 hEPS 세포의 8-세포 배아로의 주사에 의한 사람-마우스 키메라 검정의 요약
Figure pct00012
[표 13b] 모든 10,000개의 마우스 세포에 대한 약 1개의 사람 세포의 검출 역치를 사용한 민감성 사람 미토콘드리아 PCR 검정을 기반으로 한 시험된 배아 및 양성 배아의 요약 (중간 및 하부 표)
Figure pct00013
[표 13c]
Figure pct00014
후-착상 E10.5 마우스 수태물내 hEPS 세포의 키메라 수행능력을 또한 검사하였다. 마우스 수태물 중의 사람 세포의 존재는 항-사람 핵(hN) 항체로 면역염색하거나, 형광-라벨링된 hEPS 세포로부터 형광 신호를 검출하여 동정하였다. hEPS 세포로 E10.5 배아에서 종간 키메라 현상을 관찰하였지만, 초회감작 hPSC(데이터는 나타내지 않음) 또는 비-주사 대조군(데이터는 나타내지 않음)으로는 관찰되지 않았다. 44개의 회수된 키메라 E10.5 수태물 중에서, 17개의 수태물(38.6%)은 사람 세포의 배아 및 배아외 조직 둘 다로의 통합을 나타내었다(도 1b).
키메라 배아내 hEPS 유도체는 만능성 표지자 NANOG의 발현을 손실하고(데이터는 나타내지 않음), SOX2, GATA4 및 FOXA2를 포함하는 적합한 혈통-특이 표지자를 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, hEPS-유도된 세포의 태반 및 난황낭 등의 ExEm 조직으로의 통합이 또한 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이는, 사람 및 마우스 태반이 구조적으로 상이하므로, 아마도 이시성 및/또는 확산성 태반 발달 프로그램의 결과로서 예상되지 않은 것이었다(참조: Rossant, et al., Nat. Rev. Gen., 2:538-548 (2001)). 이들 세포는 영양막 층으로 통합된 것으로 밝혀졌고, 영양 표지자 CK8을 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). 추가로, hEPS 세포로부터 유도된 기형종에서 검출되는 것과 같이(데이터는 나타내지 않음), 또 다른 사람 영양막-특이 표지자 hCGβ의 발현이 또한 이들 세포에서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 초회감작 hPSC가 주사된 마우스 태반내 사람 세포의 존재가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
종간 키메라 현상을 추가로 확인하기 위하여, 매우 민감한 미토콘드리아 PCR 검정을 사용하여 사람-마우스 키메라 수태물내 사람 EPS 세포의 기여도를 정량적으로 분석하였다(참조: Theusen, et al., Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2016.06.11). 특히, 회수된 hEPS-유도된 마우스 배아의 35.5%(42/118 회수된 배아)는 사람 세포를 함유하였다(10,000개의 마우스 세포내 하나의 사람 세포가 역치로서 사용되었다). 사람 세포의 백분율은 다양하였고 일부 경우 1% 초과에 이르렀다(도 5d 및 표 12a-12c). 또한, 회수된 hEPS-유도된 마우스 태반의 17.6%(24/136 회수된 태반)는 사람 세포 기여를 나타내었고(도 5e 및 표 12a-12c), 이의 백분율은 0.1% 초과에 이를 수 있었다. 54개의 분석된 마우스 수태물 중에서, 9개(16.6%)는 마우스 배아 및 태반 둘 다에 대한 hEPS 유도체이 이중 기여를 나타내었다(표 12a-12c). 대조군으로서, 초회감작 hPSC는 마우스 배아 또는 태반에 대한 기여를 나타내지 않았다(0/54 분석된 마우스 수태물)(표 12a-12c). mEPS 세포와 비교하여, 마우스 수태물 중의 hEPS 세포의 키메라 효율은 여전히 제한되며, 이는 부분적으로 발달 차이에 특이적인 종에 기인할 수 있다(참조: Malassie, et al., Human Reprod. Update, 9:531-539 (2003)). 이들 데이터는 hEPS 세포가 종간 키메라 수행능력을 나타내고, 생체내 영양막 페이트를 채택할 수 있다.
EPS 세포의 분자 특징을 특징화시키기 위하여, mEPS 세포, mES 세포, 2C-유사 mES 부분모집단의 전사체를 평가하고(참조: Macfarlan, et al., Nature, 487:57-63 (2011)), 배반엽상피 줄기 세포를 평가하였다(참조: Najm, et al., Cell Stem Cell, 8:318-325 (2011)). 원칙적인 성분 분석은 다른 세포 유형과 구별되는mEPS 세포의 전반적인 유전자 발현 패턴을 밝혀내었다(도 6a). 또한, hEPS 세포는 나이브 hPSC(참조: Takashima, et al., Cell, 158:1254-1269 (2014); Chan, et la., Cell Stem Cell, 13:663-675 (2013); Theunissen, et al., Cell Stem Cell, 15:471-487 (2014); and Gafni, et al., Nature, 504:282 (2013)) 및 초회감작 hPSCs에 대한 별개의 전사체 특징을 나타내었다(도 6b). 추가의 실험에서는 mEPS와 mES 세포 사이의 상이하게 발현된 유전자, 2개의 별개의 유전자 모듈(모듈 A 및 B)이 mEPS 세포에서 상향조절된 유전자 중에서 두드러지는지를 검사하였다(나타낸 데이터). 마우스 배아 세포를 초기 예비착상 발달과 비교하면(참조: Tang, et al., PLoS One, 6:e21208 (2011)), 모듈 A는 mEPS 세포에 유일하게 제시되었고, 이의 기능은 염색질 조직 및 전사 조절에 연관된다. 특히, 모듈 B로부터의 유전자는 또한 2-세포 단계에서 배아 세포에 발현되었다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, 모듈 B로부터의 유전자의 발현 수준은 2-세포 단계로부터 배반포 단계로 점진적으로 하향조절되었다.
유사한 분석을 수행함으로써, 2개의 유전자 모듈(모듈 C 및 D라고 함)은 초회감작 hPSC과 비교하여 hEPS 세포에서 상향조절된 유전자들 중에서 동정되었다(데이터는 나타내지 않음). 모듈 A와 유사하게, 모듈 C로부터의 유전자는 염색질 조직 및 전사 조절에 연관되었고, 이들중 상당수는 검사된 나이브 hPSC 중에서 공유되었다. 특히, 모듈 D로부터의 상당수의 유전자는 또한 난모세포로부터 상실기까지의 사람 배아 세포(참조: Yan, et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 20:1131-1139 2013), 예를 들면, GBX2(Gastrulation Brain 호메오박스 2), HOXA1(호메오박스 A1), MIXL1(Mix1 호메오박스-유사 1), 및 DERA(데옥시리보스-포스페이트 알돌라제)(데이터는 나타내지 않음) 유전자에서 발견되었다. 추가의 연구는 hEPS 세포에서 독점적으로 상향조절되지만 기타 hPSC 유형, CHD7(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7)), CHD4(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 4), MIXL1 및 LEF1(림프성 인핸서-결합 인자 1)에서는 조절되지 않는 모듈 E의 동정으로 이어졌다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, GO 분석으로 모듈 E로부터의 유전자가 전사 조절 및 세포 주기 등의 생물학적 공정에 연관됨이 밝혀졌으며, 이는 또한 난모세포로부터 4-세포(4C)-단계까지 사람 배아 세포를 표시한다(참조: Nat. Struct. Mol. Biol., 20:1131-1139 2013)). 종합하면, 이들 데이터는 EPS 세포가 공지된 PSC 유형과 별개인 독특한 분자 특징을 가짐을 제시한다.
최종적으로, EPS 세포를 유지시키는 데 있어서의 DiM 및 MiH의 역할을 연구하였다. DiM 또는 MiH의 철회는 플레이팅 후 수 일 내에 hEPS 세포의 신속한 분화가 이어져(데이터는 나타내지 않음), 소분자 둘 다 hEPS 세포의 유지에 필요함을 제시하였다. DiM 또는 MiH의 철회는 또한 키메라 배반포(도 6c, 데이터는 나타내지 않음)에서 mEPS 세포의 발달 효능을 상당히 손상시켰다. DiM은 히스타민 및 무스카린 수용체를 포함하는 G 단백질 결합 수용체를 억제하는 것으로 보고된 바 있는 한편(참조: Pfaff, et al., Eur. J., Phamacol., 286-229-240 (1995)), MiH는 PARP1을 억제하는 것으로 공지되어 있다(참조: Alano, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U S A, 103:9685-9690 (2006)). 특히, DiM 또는 MiH는 hEPS 세포의 유지에 대한 동일한 표적을 표적화하는 기타 억제제(트리펠렌아민HCL; 데슬로라타딘; 또는 니코틴아미드; BSI-201 (4-요오도-3-니트로벤즈아미드))로 대체시킬 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). 확실히, DiM을 히스타민 수용체와 무스카린 억제제 둘 다를 표적으로 하는 억제제로 대체시키면 hEPS 세포의 형태 및 확장이 지지되었을뿐만 아니라(데이터는 나타내지 않음), hEPS 세포에서 상향조절되는 유전자, 예를 들면, GBX2, TBX3, CDX2 및 GATA6의 발현이 유지되었다(도 4c). MiH를 다른 PARP1 억제제로 대체시키면 또한 hEPS 확장 및 hEPS 세포 중에서 상향조절되는 표지 유전자가 유지되었다(도 4d, 데이터는 나타내지 않음). 추가로, MiH가 hEPS 세포 중의 PARP1의 넉다운으로 대체될 때 유사한 결과가 수득되었다(도 4e). 중요하게는, mEPS 및 hEPS 세포 둘 다 이러한 조건하에 배반포내 TE 및 ICM 둘 다에 기여하는 이의 능력을 여전히 보유하였다(도 6c, 6d, 데이터는 나타내지 않음).
EPS 세포 중의 DiM 및 MiH에 의하여 조절되는 분자 표적을 그 다음 조사하였다. MAPK 시그널링은 히스타민 및 무스카린 수용체 시그널링의 주요 하부스트림인 것으로 보고되어 있고(참조: Morse, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296:1058-1066 (2001) and Ockenga, et al., Genes (basel), 4:171-79 (2013)), MAPK 시그널링 활성의 하향조절이 mEPS 및 hEPS 세포 둘 다에서 관찰되었다(도 7a-b). 그러나, DiM을 MAPK 시그널링을 표적화하는 억제제(PD0325901; SB203580; SP600125)로 대체시키는 것으로 hEPS 세포가 유지될 수 없었고(데이터는 나타내지 않음), mEPS 세포의 발달 효능이 보존될 수 없었다(도 6c, 데이터는 나타내지 않음). MiH, Parp1의 역할을 추가로 검사하기 위하여, MiH의 제안된 분자 표적을 mEPS 세포주에서 넉 아웃시켰다(도 7c-g). 중요하게는, Parp1 결핍 mEPS 세포는 MiH의 부재하에서도 TE 및 ICM 둘 다로 여전히 분화할 수 있었다(도 6c). 상이한 조건하에서 배양된 세포들의 키메라 분석의 요약을 표 14에 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00015
이 결과는 Parp1이 EPS 발달 효능의 유지에 중요한 조절제임을 제시한다.
이 연구는 만능 줄기 세포의 발달 효능이 배아 및 배아외 혈통 둘 다로 연장될 수 있다는 원칙 증명 증거를 제공한다. 마우스내 배아외 잠재성을 갖는 보고된 불안정성 만능 개체군과는 달리(참조: Macfarlan, et al., Nature, 487:57-63 (2012); Morgani, et al., Cell Rep., 3:1945-4957 (2012); and Abad, et al., Nature, 502:340-345 (2013), EPS 세포는 시험관 내에서 장기간 유지될 수 있는 한편, 이의 배아 및 배아외 발달 효능을 유지시킬 수 있다. EPS 세포는 또한 기존의 만능 줄기 세포를 능가하는 몇 개의 잠재적 이점을 갖는 신규한 줄기 세포 자원을 나타낸다. 제1 마우스 ES 세포주는 34년 전 정착되었지만(참조: Evans, et al., Nature, 292:154-156 (1981); Martin, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 78:7634-7638 (1981)), 다른 포유동물로부터의 키메라 능력을 갖는 만능 줄기 세포의 유도는 여전히 주요한 도전이다. 상이한 포유동물 종의 만능 줄기 세포를 정착시키기 위한 활발한 방법이 여전히 부족하다. EPS 세포는 동일한 배양 조건을 사용하여 상이한 포유동물 종에서 발생될 수 있어서, 포유동물 중에서의 이러한 신규한 세포 상태의 전환을 제시한다. 그러므로, EPS 세포의 발견은 포유동물의 발달 효능이 연장된 줄기 세포를 활발하게 정착시키는 하나의 보편적인 방법을 개발하는 기회를 제공한다. 추가로, EPS 세포의 종간 키메라 수행능력으로 EPS 세포는 이종 키메라 현상 및 포유동물 초기 발달을 연구하는 데 특히 귀중하게 된다. 최종적으로, EPS 세포는 또한 질환 모델링, 약제 발견 및 재생 의약용 기능적 세포 발생에 대한 신규한 세포 자원을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> PEKING UNIVERSITY <120> INDUCED EXTENDED PLURIPOTENT STEM CELLS, METHODS OF MAKING AND USING <130> IP160303 <150> PCT/CN2015/086854 <151> 2015-08-13 <160> 83 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 1 cggagtcttc ggataagctc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 2 tttccatcaa acatgggcga c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 3 cccggttcca cattgtaaga g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 4 gtatgcagtc acagcgatga at 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 5 gacgagtcaa aggtggaaga c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 6 gattgtcatc cgagctgtag tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 7 cagtcgctac atcaccatcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 8 tttcctctcc tttgctctgc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 9 ctcagttcct acgcttcgca t 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 10 gtcgaggtca gtgaacagca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 11 cgccaccaaa ctgagatgat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 12 cacattgtag tgggcagtgg 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 13 aactcaagaa ggcggatgg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 14 cggtgcgtcc tttaatcct 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 15 gctcgagaag gatgtggtcc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 16 cgttgtgcat agtcgctgct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 17 gcagaaggcc tcagcaccta 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 18 aggttcccag tcgggttca 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 19 gtggaccgca cggaatttg 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 20 ggagattcac accggagtca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 21 cgagatccct ccaaaatcaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 22 atccacagtc ttctgggtgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 23 cttctgcttc aggagcttgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 24 gaaggagaag ctggagcaaa 20 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 25 gtgcaccgag ctggagg 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 26 gcacgtcctg gcctctc 17 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 27 gacgagtcaa aggtggaaga c 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 28 gattgtcatc cgagctgtag tc 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 29 gaaactcctt ctccagctcc 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 30 gaacctgtgc gagtggatg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 31 ctgcttcatg gatccctacc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 32 gatggacgtc ttggagaagg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 33 cacattgtag tgggcagtgg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 34 cgccaccaaa ctgagatgat 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 35 tagcgaatct gtttcccctc t 21 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 36 ctgctgtaaa gccactcatc tt 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 37 gccttatgtg atggctatgt gt 22 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 38 accccttatg acgcattcta tgt 23 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 39 gctccactcg ttggaggtaa 20 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 40 cttagcgcac ccatccc 17 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 41 gacagcagtc ggttggagcg 20 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> qRT-PCR primers of human <400> 42 gggacttcct gtaacaacgc atc 23 <210> 43 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PARP1 shRNA #1 <400> 43 ccggccgaga aatctcttac ctcaactcga gttgaggtaa gagatttctc ggttttt 57 <210> 44 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PARP1 shRNA #2 <400> 44 ccgggcttca catatcagca ggttactcga gtaacctgct gatatgtgaa gcttttt 57 <210> 45 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Scramble <400> 45 ccggcaacaa gatgaagagc accaactcga gttggtgctc ttcatcttgt tgttttt 57 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 46 cggcaaagcg gacaataaca 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 47 ggagccagtg ttaggagatt c 21 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 48 ctacagtccg ctggtgctgg 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 49 ggtcacagaa ggatgcgttg g 21 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 50 ggcagcctga tgttgaggt 19 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 51 gcgtactccg ctaaaaagtc ac 22 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 52 ccgtgaaggt gcaaacgtc 19 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 53 ccctgctacg agttctggtg 20 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 54 ctaccagtta catcgcctac ttg 23 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 55 accaccatcc gtctttttga g 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 56 tcctggatac tgctcctact act 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 57 gaccattcct cattgcacac a 21 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 58 cacagtagcg aaaatgacca gg 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 59 tcctcctctt caaacattgg gt 22 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 60 cattgccagt tgacaacaca ag 22 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 61 atagccttca tttcgccaat ca 22 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 62 ccaacgtgtg attgtggtgt c 21 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 63 caggccatag gtccaagctg 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 64 ggcaccacac cttctacaat g 21 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 65 gtggtggtga agctgtagcc 20 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 66 gtaccacttc tcctgcttct gga 23 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 67 ggccgtcttc ttgaccttct g 21 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 68 aagagcgacg cttattactg tactg 25 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 69 ctttggagtt acccattcct ttc 23 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 70 cgggttctgc tcattctctt gga 23 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 71 cgctttgctc tcgtgtttct ctca 24 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 72 caccgcgagt ggagtacgcg aagag 25 <210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 73 aaacctcttc gcgtactcca ctcgc 25 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 74 caccgcacca tgatggccat gcgg 24 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 75 aaacccgcat ggccatcatg gtgc 24 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 76 caccgggact ttcccatcga acat 24 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 77 aaacatgttc gatgggaaag tccc 24 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 78 caccgtcaag aagacggccg aggc 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 79 aaacgcctcg gccgtcttct tgac 24 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 80 cgggagctct ccatgcattt 20 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 81 gacagatact gcgacatagg gt 22 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 82 gctaagaccc aaactgggat t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primers <400> 83 ggtttgctga agatggcggt a 21

Claims (35)

  1. 다음 그룹 각각으로부터의 만능성의 화학 연장제(CEP)를, 미처리 세포의 연장 만능 세포로의 재프로그래밍을 유도하기에 유효한 양으로 포함하는, 분리된 만능 세포의 세포 효능을 연장시키기 위한 세포 배양 배지 조성물:
    (1) 시토카인,
    (2) 글리코겐 신타제 키나제(GSK) 억제제,
    (3) G 단백질 결합 수용체(GPCR) 억제제,
    (4) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1(PARP1) 억제제, 및
    (5) 임의로, Rho-결합, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK) 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시토카인이 사람 억제 인자(LIF, "L"), 인터루킨(IL)-6, IL-11, IL-27, IL-31, 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 카디오트로핀-1, 뉴로포이에틴 및 카디오트로핀-유사 시토카인 인자 1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GSK 억제제가 GSK3 억제제인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 GPCR 억제제가 아세틸콜린 수용체 길항제인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PARP1 억제제가 MiH(미노사이클린 하이드로클로라이드)("M), BSI-201(4-요오도-3-니트로벤즈아미드), NAM(니코틴아미드), PJ34(N-(6-옥소-5,6-디하이드로-페난트리딘-2-일)-N,N-디메틸아세트아미드; PARP 억제제 XIV; 4-[(1-메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌]-1,3(2H,4H)-이소퀴놀린디온; 벨리파립; 2-[(2R)-2-메틸피롤리딘-2-일]-1H-벤즈이미다졸-4-카복스아미드 디하이드로클로라이드; 올라파립(1-(사이클로프로필카보닐)-4-[5-[(3,4-디하이드로-4-옥소-1-프탈라지닐)메틸]-2-플루오로벤조일]피페라진); 6-아미노-1H-벤즈[de]이소퀴놀린-1; 및 INH2BP(5-요오도-6-아미노-1,2-벤조피론)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 GSK 억제제가 CHIR99021("C")[6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴]; BIO-아세톡심; GSK 3I 억제제 XV; SB-216763; CHIR 99021 트리하이드로클로라이드; GSK-3 억제제 IX[((2Z, 3E)-6'-브로모-3-(하이드록시이미노)-[2,3'-비인돌리닐리덴]-2'-온]; GSK 3 IX[6-브로모인디루빈-3'-옥심]; GSK-3β 억제제 XII[3-[[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]옥시]페놀]; GSK-3 억제제 XVI[6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-피리미딘-2-일아미노)에틸-아미노)-니코티노니트릴]; SB-415286[3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온]; 및 바이오[(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심]로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 시토카인이 사람 억제 인자(LIF, "L")이고; 상기 GSK 억제제가 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴]("C")이고; 상기 GPCR 억제제가 DiM((S)-(+)-디메틴덴 말레에이트)("D"), BSI-201, 니코틴아미드 및 PJ34((N-(6-옥소-5,6-디하이드로-페난트리딘-2-일)-N,N-디메틸아세트아미드. HCl)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 PARP1 억제제가 MiH(미노사이클린 하이드로클로라이드) ("M"), 데슬로라타딘 및 트리펠렌아민 HCL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 GPCR 억제제가 DiM((S)-(+)-디메틴덴 말레에이트)("D")인 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, LCDM을 포함하며, L이 1-100ng/ml의 농도 범위로 존재하고; C가 0.5-5μM의 농도 범위로 존재하고; D가 1-5μM의 농도 범위로 존재하고; M이 0.5-5μM의 농도 범위로 존재하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 0.2 내지 20μM의 범위의 농도로 존재하는, Y27632[(+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드++ + 디하이드로클로라이드)] 또는 파수딜인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 및 임의로 엔도-IWR1(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드) 또는 XAV939(3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온을 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 키트 내에서, 상기 소분자량 화합물이 상대적인 양으로 존재하여 분화 세포에 대한 세포 배양 배지로 넣어져서 연장 만능성을 유도하는 조성물.
  13. 만능성의, 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포로부터 선택된 공여 세포에 연장된 만능성을 유도하는 방법으로서,
    상기 공여 세포를 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 조성물과 연장 만능성을 유도하기에 유효한 시간 동안 배양함을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공여 세포가 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 혈액 기원 세포, 배아 기원 세포, 피부 유도 세포, 섬유아세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 간엽 세포, 실질 세포, 신경 세포 및 결합 조직 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 공여 세포가 마우스 배아 줄기 세포, 사람 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 공여 세포가 CEP를 포함하는 재프로그래밍 배지에서 9-20일 범위의 기간 동안 배양되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 공여 세포가 단세포 또는 소 콜로니로서 씨딩되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 공여 세포가 단세포로서 씨딩되고, LCDM을 포함하는 배지에서 배양하기 전에, 상기 ROCK 억제제를 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 세포를 12 내지 48시간, 바람직하게는 24 내지 48시간 범위의 시간 동안 배양함을 추가로 포함하는 방법.
  19. 상응하는 세포와 비교시, 세포 효능이 연장된, 분리된 화학적으로 유도된 연장 만능 세포(ciEPSC).
  20. 제13항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 수득된 ciEPSC.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, TBX3 및 GBX2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 표지자의 발현이 상기 공여 세포와 동일한 유기체로부터 분리된 상응하는 미처리 세포와 비교시 상향조절되거나, HOXA1(호메오박스 A1), MIXL1(Mix1 호메오박스-유사 1), DERA(데옥시리보스-포스페이트 알돌라제), CHD7(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7), CHD4(크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 4), MIXL1 및 LEF1(림프성 인핸서-결합 인자 1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 유전자가 미처리 세포와 비교시 상향조절되는 세포.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, OCT4, NANOG, KLF2, SOX2 및 UTF1(미분화 배아 세포 전사 인자)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 표지자의 발현이 상기 공여 세포로서 상응하는 유기체로부터 분리된 상응하는 미처리 세포와 비교시 하향조절되는 세포.
  23. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, LIF 시그널링이 상기 공여 세포로서 상응하는 유기체로부터 분리된 상응하는 미처리 세포와 비교시 강화되는 세포.
  24. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 마우스 배아로의 생체내 이식 이후 배아 및 배아외 혈통 둘 다에 공헌할 수 있는 세포.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, CDX2, GATA6, HAND1 및 EOMES로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 배아외 표지자의 기본 수준이 mRNA 수준에서 상향조절되는 세포.
  26. 제19항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따르는 분리된 세포를 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 포함하는 ciEPSC의 분리된 개체군.
  27. 주사, 보철 장치의 착상 또는 조직 공학 매트릭스에 의하여 개인에게 투여용으로 제형화된, 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 ciEPSC를 포함하는 치료 조성물.
  28. 제19항 또는 제20항에 따르는 분리된 ciEPSC와, (1) 시토카인, (2) 글리코겐 신타제 키나제(GSK) 억제제, (3) G 단백질 결합 수용체(GPCR) 억제제, (4) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제-1(PARP1) 억제제 및 (5) 임의로, Rho-결합, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK) 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 배양 배지가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 계대 이상에 대하여 비분화 및 연장 만능 상태로 상기 ciEPSC를 유효하게 유지시키는, 세포 배양물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 CiEPSC가 배양물 중의 정상 핵형을 유지시키는 세포 배양물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 세포가 50 계대 이상 이후 정상 핵형을 유지시키는 세포 배양물.
  32. 발달 단계에서 표적 기관의 발달 부족과 연관된 이상을 갖는, 사람이 아닌 수혜 포유동물의 기관을 생성하는 방법으로서, a) 공여 포유동물로부터 유도된 ciEPSC를 제조하고; b) 상기 ciEPSC를 상기 수혜 포유동물의 배반포 단계 수정란으로 이식하고; c) 사람이 아닌 대리모 포유동물의 자궁에서 수정란을 발달시켜 리터를 수득하고; d) 리터로부터 표적 기관을 수득함을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 생성되는 상기 기관이 췌장, 신장, 흉선 및 모발로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 수혜 포유동물이 Sall1 넉아웃 마우스, Pdx1-Hes1 형질전환 마우스, Pdx1 넉아웃 마우스 및 누드 마우스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마우스인 방법.
  35. 제32항의 방법에 따라 생성된 사람이 아닌 포유동물.
KR1020187005213A 2015-08-13 2016-08-12 유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법 KR102142364B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2015086854 2015-08-13
CNPCT/CN2015/086854 2015-08-13
PCT/CN2016/094828 WO2017025061A1 (en) 2015-08-13 2016-08-12 Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180052612A true KR20180052612A (ko) 2018-05-18
KR102142364B1 KR102142364B1 (ko) 2020-08-07

Family

ID=57983057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187005213A KR102142364B1 (ko) 2015-08-13 2016-08-12 유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11028369B2 (ko)
EP (1) EP3334820B1 (ko)
JP (1) JP6780870B2 (ko)
KR (1) KR102142364B1 (ko)
CN (1) CN108884436B (ko)
AU (1) AU2016305705B2 (ko)
CA (1) CA2994192C (ko)
WO (1) WO2017025061A1 (ko)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
WO2017007994A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 American Gene Technologies International Inc. Hiv pre-immunization and immunotherapy
AU2017207906B2 (en) 2016-01-15 2021-03-11 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
US10767183B2 (en) 2016-03-09 2020-09-08 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
US11976292B2 (en) 2016-06-08 2024-05-07 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
CA3028982A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 American Gene Technologies International Inc. Hiv pre-immunization and immunotherapy
JP7176756B2 (ja) * 2016-07-21 2022-11-22 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド パーキンソン病を処置するためのウイルスベクター
CA3057142A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 American Gene Technologies International Inc. Compositions and methods for treating phenylketonuria
CN111164209A (zh) * 2017-06-19 2020-05-15 公益财团法人神户医疗产业都市推进机构 多能干细胞的分化能力的预测方法和用于该预测方法的试剂
CN111566202A (zh) * 2018-01-12 2020-08-21 加利福利亚大学董事会 稳定的多能牛胚胎干细胞的高效衍生
WO2019204530A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 University Of Maryland, College Park Generation of human endodermal organs in pig model using lineage restricted endodermal precursors
US11547440B2 (en) 2018-11-26 2023-01-10 International Business Machines Corporation Cranial access device
CN109439617A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 成都赋智健康科技有限公司 一种干细胞无血清培养基及其制作方法
SG10201905939WA (en) * 2019-06-26 2021-01-28 Cell Mogrify Australia Pty Ltd Cell culture methods and compositions
CN114555101A (zh) * 2019-08-27 2022-05-27 河北医科大学第三医院 多潜能关节祖细胞、其组合物及制备方法
US20230115640A1 (en) * 2019-10-03 2023-04-13 Salk Institute For Biological Studies Blastocyst-like structures from extended pluripotent stem cells
JP2022553792A (ja) * 2019-10-30 2022-12-26 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Ｉｐｓｃ由来肺胞細胞のハイスループット培養
IL293190A (en) * 2019-11-25 2022-07-01 Lonza Walkersville Inc An end-to-end platform for the production of multipotential human stem cells
CN111243671A (zh) * 2020-01-07 2020-06-05 广州基迪奥生物科技有限公司 一种动态交互的单细胞测序数据质控分析平台及方法
CN111269878B (zh) * 2020-01-19 2022-02-11 深圳市北科生物科技有限公司 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用
CN113151147B (zh) * 2020-01-23 2023-07-25 北京大学 功能性肝实质细胞及其制备方法
JP7339192B2 (ja) * 2020-03-11 2023-09-05 株式会社日立製作所 細胞培養方法および自動細胞培養装置
CN112760225A (zh) * 2021-01-27 2021-05-07 西北农林科技大学 一种牛胚胎体外早期着床培养体系
CN114836372B (zh) * 2021-02-01 2024-02-02 内蒙古大学 小鼠上胚层干细胞向新型多能干细胞转化的培养方法
CN113144221B (zh) * 2021-03-17 2022-11-15 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 外泌体制剂及其制备方法和应用
CA3213219A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Hongkui Deng Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells
CN113249310B (zh) * 2021-05-17 2022-10-11 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CN115074388B (zh) * 2021-06-29 2023-04-28 北京大学深圳医院 母源因子诱导的2c样全能干细胞及其转化应用
CN114317549B (zh) * 2022-01-08 2022-08-19 河南大学 毒蕈型c型乙酰胆碱受体在飞蝗防治中的应用
CN115029302B (zh) * 2022-06-10 2023-07-11 安徽大学 一种维持小鼠胚胎干细胞干性的培养方法
WO2024030443A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Bovine blastocyst like structures and uses thereof
WO2024030501A2 (en) * 2022-08-02 2024-02-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Bovine trophoblast stem cells and uses thereof
CN115305234B (zh) * 2022-09-28 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用
WO2024078119A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Peking University Methods for chemical reprogramming and pluripotent stem cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018655A2 (en) * 2002-08-26 2004-03-04 Neuronova Ab Method for culturing stem cells
WO2011056971A2 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
WO2014174470A1 (en) * 2013-04-23 2014-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Isolated naive pluripotent stem cells and methods of generating same

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716404A (en) 1994-12-16 1998-02-10 Massachusetts Institute Of Technology Breast tissue engineering
US6123727A (en) 1995-05-01 2000-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Tissue engineered tendons and ligaments
WO2002014480A2 (en) 2000-08-16 2002-02-21 Duke University Decellularized tissue engineered constructs and tissues
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
DE602004022508D1 (de) 2003-01-16 2009-09-24 Gen Hospital Corp Verwendung von dreidimensionalen, mikrogefertigten, mittels gewebetechnologie hergestellten systemen für pharmakologische anwendungen
BRPI0402659A (pt) 2004-06-23 2006-01-31 Univ Fed Sao Paulo Unifesp Uso de células tronco, método de engenharia tecidual, usos de tecidos dentais e substituto biológico do dente
EP2913393B8 (en) 2004-11-17 2020-02-26 Seneca Biopharma, Inc. Transplantation of human neural cells for treatment of neurodegenerative conditions
AU2007212085B2 (en) 2006-02-07 2011-11-17 Spinalcyte, Llc Methods and compositions for repair of cartilage using an in vivo bioreactor
WO2010021390A1 (ja) 2008-08-22 2010-02-25 国立大学法人 東京大学 ｉＰＳ細胞とＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＴＩＯＮを利用した臓器再生法
WO2010033138A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Shiloh Laboratories, Inc. Growth factor supplement for stem cell cultures
JP5843111B2 (ja) * 2010-02-16 2016-01-13 学校法人 埼玉医科大学 人工多能性幹細胞の製造方法
US8637494B2 (en) 2010-06-14 2014-01-28 Baylor Research Institute Method of achieving normoglycemia in diabetics by administration of Withaferin A
AU2010365057B2 (en) * 2010-12-08 2016-12-22 Viacyte, Inc. Agents and methods for inhibiting human pluripotent stem cell growth
US9347042B2 (en) 2011-10-06 2016-05-24 Keio University Method for producing corneal endothelial cell
US8851360B2 (en) * 2011-11-15 2014-10-07 Esselte Corporation Envelope with integral seal strip
EP2794860B1 (en) 2011-12-19 2017-05-03 Kyoto University Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004018655A2 (en) * 2002-08-26 2004-03-04 Neuronova Ab Method for culturing stem cells
WO2011056971A2 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
WO2014174470A1 (en) * 2013-04-23 2014-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Isolated naive pluripotent stem cells and methods of generating same

Also Published As

Publication number Publication date
CN108884436B (zh) 2021-11-05
AU2016305705A1 (en) 2018-02-01
EP3334820B1 (en) 2024-05-15
KR102142364B1 (ko) 2020-08-07
JP6780870B2 (ja) 2020-11-04
EP3334820A4 (en) 2019-01-02
EP3334820A1 (en) 2018-06-20
CA2994192A1 (en) 2017-02-16
AU2016305705B2 (en) 2019-06-13
CA2994192C (en) 2020-06-16
JP2018527024A (ja) 2018-09-20
US20180195046A1 (en) 2018-07-12
EP3334820C0 (en) 2024-05-15
WO2017025061A1 (en) 2017-02-16
US11028369B2 (en) 2021-06-08
CN108884436A (zh) 2018-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102142364B1 (ko) 유도 연장 만능 줄기 세포, 이의 제조방법 및 사용 방법
US20220025321A1 (en) Methods for reprograming non-pluripotent cells into pluripotent stem cells
CA2917065C (en) Compositions and methods for reprograming non-pluripotent cells into pluripotent stem cells
US20170191038A1 (en) TGFß SIGNALING INDEPENDENT NAÏVE INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, METHODS OF MAKING AND USE
US9926532B2 (en) Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells
CN116981768A (zh) 将人类体细胞化学重编程为多能细胞
Saxena et al. Role of stem cell research in therapeutic purpose--a hope for new horizon in medical biotechnology.
KR20150009682A (ko) RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법
Chang et al. Derivation of patient specific pluripotent stem cells using clinically discarded cumulus cells
Nayak Elucidation of Mechanisms of in vitro Myogenesis of Human Induced Pluripotent Stem Cells with Functional Validation in vitro and in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant