KR20180011317A - 췌장암 및 기타 암에 대한 사용을 위한 면역요법 및 골격의 생성 방법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합 - Google Patents

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KR20180011317A
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cells
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안드레아 마르
토니 바인쉥크
올리버 슈르
옌스 프리체
하르프레트 싱
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이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 면역요법 방법에서의 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 또는 세포를 생체외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양 연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또한 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.

Description

췌장암 및 기타 암에 대한 사용을 위한 면역요법 및 골격의 생성 방법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합
본 발명은 면역요법에 사용되는 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 종양 연관 T 세포 에피톱을 단독으로 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 또는 T 세포를 생체외 자극하여 환자에게 이전하는 것과 관련된다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.
본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 백신 조성물에 또는 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발에 필요한 표적으로서 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 분자로부터 유래하는 몇몇 신규 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들에 관한 것이다.
췌장암은 세계에서 가장 공격적이고 치명적인 암의 하나이다. 2012년에, 췌장암은 세계적으로 남자에서는 178,000건이 발생하여 12번째로 가장 흔한 암이었으며, 여자에서는 160,000건으로 11번째로 가장 흔한 암이었다. 같은 해에 330,000건의 사망이 보고되었으며, 이에 따라 췌장암은 암 사망 원인 중 7위이다(World Cancer Report, 2014).
췌장암은 단일의 암 객체가 아니라 여러 뚜렷한 아형을 구별해야 한다. 외분비 종양이 모든 췌장암의 약 95%를 차지하며, 이에는 췌관 및 선방형 선암종, 췌관내 유두상 점액 종양(IPMN), 고형 가유두상 종양, 점액성 낭성 선암 및 장액성 낭선종이 포함된다. 모든 췌장암의 나머지 5%는 췌장 신경내분비 종양의 하위군에 속한다(World Cancer Report, 2014).
침윤성 췌관 선암종은 가장 공격적인 췌장암의 형태를 나타나며, 높은 빈도로 인해(모든 췌장암의 90%) 역학 데이터는 주로 이 특정한 아형을 반영한다(World Cancer Report, 2014).
2012년에, 모든 신규 사례의 68%는 선진 국가에서 발생했으며, 중부 및 동부 유럽, 북미, 아르헨티나, 우루과이 및 호주에서의 발생률이 가장 높았다. 반대로 아프리카와 동아시아 지역의 대부분 국가에서는 낮은 발생률을 보인다. 세계적으로 발생률은 두 성별에서 시간이 지남에 따라 다소 안정성 있게 나타났다(World Cancer Report, 2014).
췌장암은 구체적인 증상의 결여로 인해 전형적으로 진행성 단계 및 흔히 이미 전이된 단계에서 진단된다. 진단 시점에서 예후는 매우 불량하여 5년 생존율은 5% 및 사망률 대 발생률 비는 0.98이다(World Cancer Report, 2014).
췌장암 발병의 위험을 증가시키는 여러 요인이 보고되어 있으며, 대부분의 환자가 진단 시 65세 이상인 것에 따른 고령 및 미국의 경우 흑인이 백인에 비해 위험이 1.5배 높다는 것에 따른 인종이 포함된다. 다른 위험 요인으로는 흡연, 체지방, 당뇨병, 비-0 AB0 혈액형, 췌장염 및 췌장암의 가족력이 있다(World Cancer Report, 2014).
모든 췌장암 사례의 최대 10%는 가족성 기반으로 사료된다. 다음 유전자에서 생식세포계 돌연변이는 췌장암 발생의 위험 증가와 연관이 있다: p16/CDKN2A, BRCA2, PALB2, PRSS1, STK11, ATM 및 DNA 불일치 복구 유전자. 그 밖에 췌장암의 산재성 사례는 다른 종양유전자 및 종양 억제 유전자의 돌연변이의 특징을 가진다. 췌관 선암종에서 가장 흔한 돌연변이는 종양유전자 KRAS(95%), AIB1(최대 60%) 및 종양 억제 유전자 TP53(75%), p16/CDKN2A(95%) 및 SMAD4(55%)에서 발생한다(World Cancer Report, 2014).
췌장암 환자에 대한 치료 옵션은 매우 제한되어 있다. 효과적인 치료에 대한 하나의 주요 문제는 진단 시 대개 진행성인 종양 병기이다. 그 밖에도 췌장암은 화학요법에 대한 내성이 꽤 높으며, 이는 치밀하고 저혈관성 결합조직형성 종양 기질에 의한 것일 수 있다.
독일 암 협회, 독일 암 방지협회 및 독일 의학협회가 공개한 지침에 따르면, 유일하고 가능한 근치적 치료 옵션은 종양 절제이다. 종양이 췌장으로 제한되거나 전이가 주위 기관으로 제한되는 경우 절제가 권장된다. 만약 종양이 원격 부위로 퍼졌다면 절제가 권장되지 않는다. 절제 후에는 6개월 동안의 젬시타빈 또는 5-플루오로우라실 +/- 류코보린을 사용한 보조 화학요법을 실시한다(S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
진행성 병기에 있는 수술 불가능한 환자는 화학요법과 방사선-화학요법의 병용으로 치료할 수 있다(S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
고식적 화학요법을 위한 표준요법은 단독요법 또는 EGF 수용체 티로신 키나아제 억제제인 엘로티닙과의 병용요법으로 사용하는 젬시타빈이다. 대체 옵션에는 5-플로오로우라실, 류코보린, 이리노테칸 및 옥살리플라틴의 병용(FOLFIRINOX 프로토콜이라고도 알려짐) 또는 젬시타빈과 냅-파클리탁셀의 병용이 있으며, 후자는 MPACT 연구에서 젬시타빈 단독요법에 비해 우월한 효과를 보였다(Von Hoff et al., 2013; S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 2013).
췌장암에서 높은 사망률 대 발병률 비는 더 효과적인 치료 전략 이행의 긴급한 필요를 반영한다.
이미 여러 다른 암 객체에서 효율적인 것으로 나타난 바 있는 표적 요법은 흥미로운 옵션을 나타낸다. 이에 따라 진행성 췌장암에서의 표적 요법의 이익 평가를 위해 여러 연구가 수행되었으나, 불행하게도 성공은 매우 제한적이었다(Walker and Ko, 2014). 그럼에도 불구하고 췌장암의 유전적 다양성은 개인화 요법의 가능성을 제안할 수 있는데, 이는 BRCA2 또는 PALB2의 양측 대립유전자 비활성화를 가진 침입성 췌관 선암종이 폴리(ADP-리보스) 중합효소 억제제 및 미토마이신 C 치료에 더 민감한 것으로 나타났기 때문이다(World Cancer Report, 2014).
종양 기질의 표적화는 췌장암의 새로운 치료 개발에 대한 대체 접근 방식을 성립시킨다. 전형적으로 치밀하고 저혈관성의 기질은 화학요법에 대한 장벽으로 기능할 수 있으며 종양의 증식, 침입 및 암 줄기세포의 유지를 촉진시키는 신호를 전달하는 것으로 나타났다. 그리하여 기질 소모 및 비활성화의 효과 분석을 위한 여러 전임상 및 임상 연구가 설계되었다(Rucki and Zheng, 2014).
면역접종 전략이 췌장암의 치료에 대한 더욱 혁신적이고 유망한 대안으로서 조사되고 있다. KRAS 변이를 표적하는 펩티드 기반 백신, 반응성 끝분절 효소(telomerase), 가스트린, 서바이빈(surviving), CEA 및 MUC1은 임상 시험에서 이미 평가된 바 있으며, 부분적으로 유망한 결과를 나타냈다. 더욱이 췌장암 환자에서 수지상 세포 기반 백신, 동종이형 GM-CSF-분비 백신 및 알젠판투셀-L에 대한 임상 시험은 면역요법의 유익한 효과도 드러냈다. 여러 백신 프로토콜의 효율성을 조사하는 추가 임상 시험이 현재 진행 중이다(Salman et al., 2013).
암 치료와 연관된 중증의 부작용과 비용을 비교하면, 일반적인 암, 특히 췌장암의 치료에서 사용가능한 요인들을 동정할 필요가 있다. 또한 일반적인 암, 특히 췌장암에 대한 암의 보다 나은 진찰과 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 초래하는 바이오마커를 나타내는 요인들을 동정할 필요도 있다.
암의 면역요법이란 부작용은 최소화하면서 암 세포에 특이적으로 표적화하는 옵션을 나타낸다. 암 면역요법에서는 종양 연관 항원을 이용한다.
종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다:
a) 암-고환 항원: 이미 확인되어 T 세포에 의해 인식된 첫 번째 TAA는 이 종류에 속하며, 이는 그 멤버들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에만 있으며, 때로는 태반에 있기 때문에 최초에 암-고환(CT) 항원이라고 불렸다. 고환 세포가 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원 및 NY-ESO-1이 있다.
b) 분화 항원: 이러한 TAA는 종양 및 종양이 발생한 정상 세포 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 많은 멜라닌 세포 계통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성과 관련되어 있으며 그러므로 종양 특이적은 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 흑색종을 위한 티로시나아제 및 Melan-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이에 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자 인코딩에서 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, T 세포의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1가 있다.
d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(β-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양 특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양-특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.
T 세포 기반의 면역요법은 종양-관련 또는 종양-특정 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양 특정 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC-분자에는 두 클래스가 있으며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 알파 중사슬과 베타-2-저분자글로불린, 알파와 베타 사슬의 MHC 클래스 II 분자로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다.
MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 그러나 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스-II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예: 세포내이입 동안), 이는 후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합물은 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 T 세포에 의해서 인식이 되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식이 된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양 연관 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱의 동정은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 사이토킨 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들면 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-제시 세포(APC), 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel J, et al.).
본 발명의 신장 펩티드는 HLA 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양-관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양-관련 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들면, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8-양성 T 림프구의 부재 하에서도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(IFN의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 억제 징후에 충분하다는 것이 보여졌다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 효과기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 격리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, Dengjel 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공 했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여함으로써, CD8+ T 세포(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양-관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에도 결합해야 한다. 이 프로세스는 MHC-분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정한 다형성에 의존한다. MHC-클래스-I-결합 펩티드는 대개 길이가 8-12개의 아미노산 잔기이며 대개 그 서열 내에 MHC-분자와 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 보존 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특정적으로 결합할 수 있는가를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 어떤 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양-특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서는 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다제시되어야 한다. 더욱이 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉, 세포마다 펩티드의 각각의 사본 번호). 종양-특정 및 종양-관련 항원은 흔히 기능 때문에(예: 세포 주기 관리 또는 아폽토시스의 억제) 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양-관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 중요하며, 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포반응을 유도해야 한다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하는 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성의 부재이다.
그러므로, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 격리될 수 있는 CTL의 사용에 기반되거나, 또는 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 소집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는 MHC 분자와 관련이 있게 나타나는 과발현된 또는 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본 발명에 따른 특정 TCR(예: 가용성 TCR) 및 항체 또는 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우, 제시가 결정요인이다.
본 발명의 제 1 양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88%, 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 MHC에 결합하였거나 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하며, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 ~ 100, 바람직하게는 8 ~ 30, 가장 바람직하게는 8 ~ 14의 아미노산이다.
다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드와 각각의 서열 식별 번호 및 이 펩티드의 유망한 소스(기저) 유전자가 나와 있다. 표 1 및 표 2의 모든 펩티드는 HLA-A*02에 결합한다. 표 2에 나와있는 모든 펩티드는 오류 비율이 높은 고처리량 선별의 결과로서 대규모 목록으로 이전에 공개되었거나 다른 알고리즘을 사용하여 계산된 바 있으나 이전에는 전혀 암과 연관된 적은 없다. 표 3의 펩티드는 본 발명에 따른 펩티드와의 병용에서 유용할 수 있는 추가의 펩티드이다. 표 4의 펩티드는 또한 해당되는 기저 폴리펩티드의 과발현이나 과다제시에 관여하는 다양한 기타 악성종양의 진단 및/또는 치료에 유용하다.
[표 1]
본 발명에 따른 펩티드
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 2]
이전에 알려진 암 연관이 없는 본 발명에 따른 추가 펩티드
Figure pct00004
[표 3]
예를 들어 개인화 암 요법에 유용한 펩티드
Figure pct00005
본 발명은 또한 예를 들어, 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장암 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁 내막암, 담낭암, 및 담관암과 같은 증식성 질병의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드와 일반적으로 관련이 있다.
특히 바람직한 것은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다. 보다 바람직한 것은 서열 식별 번호 1~ 서열 식별 번호 79로 구성된 군으로부터 선택된 단일 또는 조합의 펩티드(표 1 참조), 및 췌장암, 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장암 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁 내막암, 담낭암, 및 담관암, 바람직하게는 췌장암의 면역요법에서의 사용이다.
다음 표 4에 나와 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 많은 펩티드는 다른 종양 유형에서도 발견되며 따라서 다른 적응증의 면역요법에도 사용될 수 있다. 또한 도 1e와 실시예 1도 참조한다.
하기 표 4는 본 발명에 따른 펩티드 및 다른 증식성 질병에서 특히 다른 암 질병에서의 구체적인 사용을 나타낸다. 이 표는 펩티드가 발견된 추가의 종양 유형에서의 선택된 펩티드로서 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 과다제시되거나 정상 조직 대 종양의 기하학적 평균 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 제시된 펩티드를 나타낸다. 과다제시란 가장 높은 제시의 정상 샘플에 비해 종양 샘플에서의 더 높은 제시로서 정의된다.
[표 4]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
하기 표 4B는 본 발명에 따른 펩티드 및 다른 증식성 질병에서 특히 다른 암 질병에서의 구체적인 사용을 나타낸다(표 4의 개정). 이 표는 표 4와 같이 측정된 종양 샘플에서 5%가 넘게 과다 제시(특이적 제시 포함) 또는 정상 조직 대 종양의 기하학적 평균의 비율이 3보다 큰 측정된 샘플에서 5%가 넘게 제시를 보여주는 추가의 종양 유형에서 발견된 선택된 펩티드를 나타낸다. 과다제시란 가장 높은 제시의 정상 샘플에 비해 종양 샘플에서의 더 높은 제시로서 정의된다. 과다제시를 시험한 대상의 정상 조직은 다음과 같다: 지방 조직, 부신, 혈액 세포, 혈관, 골수, 뇌, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 신경, 췌장, 부갑상선, 복막, 뇌하수체, 흉막, 타액선, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 갑상선, 기관, 요관, 방광.
[표 4B]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
NSCLC= 비소세포 폐암, SCLC= 소세포 폐암, RCC= 신장암, CRC= 결장암 또는 직장암, GC= 위암, HCC= 간암, PrC= 전립선암, BRCA=유방암, MCC= 메르켈 세포 암종, OC= 난소암, NHL= 비호지킨 림프종, AML= 급성 골수성 백혈병, CLL= 만성 림프구성 백혈병.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 비소세포 폐암(NSCLC)의 치료를 위한 서열 식별 번호 4, 5, 8, 14, 19, 22, 29, 30, 31, 35, 37, 46, 60, 69, 70, 79, 85, 90, 92, 95, 101, 102, 118, 123, 124, 125, 128, 131, 136, 138, 142, 147, 149, 150, 151, 154, 158, 160, 167, 6, 9, 21, 84, 85, 94, 96, 99, 111, 113, 114, 116, 129, 134, 152, 159 및 169의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 소세포 폐암(SCLC)의 치료를 위한 서열 식별 번호 14, 19, 35, 46, 52, 59, 60, 62, 64, 75, 79, 80, 81, 90, 95, 102, 110, 114, 124, 125, 128, 129, 131, 136, 138, 143, 144, 145, 147, 148, 149, 150, 158, 160, 162, 163, 165, 167, 169, 4, 6, 23, 37, 94, 104 및 155의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 신장암의 치료를 위한 서열 식별 번호 13, 14, 29, 46, 84, 115, 147, 162, 175, 12, 30, 38, 75, 95, 99, 111, 130 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 뇌암의 치료를 위한 서열 식별 번호 16, 17, 29, 34, 39, 63, 67, 81, 93, 94, 98, 102, 104, 106, 113, 114, 115, 116, 122, 129, 138, 146, 151, 159, 161, 166, 167, 169, 172, 11, 14, 19, 70, 71, 83, 87, 99, 112, 123, 126, 132, 152 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 위암의 치료를 위한 서열 식별 번호 31, 32, 68, 84, 88, 95, 97, 117, 120, 121, 147, 174, 4, 9, 41, 77, 149 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 결장 및 직장암의 치료를 위한 서열 식별 번호 5, 28, 29, 30, 31, 37, 40, 41, 60, 85, 90, 92, 93, 94, 99, 114, 115, 120, 124, 125, 128, 131, 137, 142, 145, 148, 151, 152, 154, 157, 158, 159, 165, 4, 34, 84, 111, 146, 149 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 간암의 치료를 위한 서열 식별 번호 4, 5, 14, 19, 31, 35, 37, 48, 50, 51, 60, 64, 70, 73, 80, 85, 86, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 111, 114, 115, 116, 120, 123, 124, 125, 129, 131, 132, 135, 136, 137, 142, 145, 146, 148, 149, 150, 155, 158, 159, 160, 161, 165, 167, 169, 174 및 176의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 췌장암의 치료를 위한 서열 식별 번호 2, 8, 10, 22, 31, 39, 46, 79, 86, 104, 111, 123, 130, 142, 156 및 167의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 전립선암의 치료를 위한 서열 식별 번호 98, 102, 109, 111, 115, 142, 148, 151 및 167의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 백혈병의 치료를 위한 서열 식별 번호 7, 22, 48, 62, 71, 81, 83, 94, 95, 104, 110, 122, 144, 145, 147, 149, 150, 152, 154, 159, 160, 161, 171 및 176의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 AML의 치료를 위한 서열 식별 번호 3, 4, 21, 29, 30, 32, 52, 57, 65, 67, 84, 93, 99, 102, 103, 106, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 127, 128, 139, 140, 142, 143, 148, 151 및 158의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 CLL의 치료를 위한 서열 식별 번호 4, 6, 84, 91, 99, 107, 114, 118, 127, 130, 142, 155 및 158의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 유방암의 치료를 위한 서열 식별 번호 2, 4, 8, 9, 16, 22, 26, 31, 35, 37, 41, 59, 77, 79, 84, 90, 93, 99, 110, 137, 142, 150, 169, 175, 29, 42, 60, 69, 70, 75, 80, 82, 86, 95, 111, 120, 124, 127, 128, 129, 138, 144, 149, 151, 155, 158 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 메르켈 세포 암종(MCC)의 치료를 위한 서열 식별 번호 149, 81, 101, 116 및 124의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 흑색종의 치료를 위한 서열 식별 번호 14, 17, 19, 34, 37, 45, 46, 52, 85, 92, 95, 96, 107, 113, 114, 115, 118, 124, 131, 138, 146, 149, 150, 155, 157, 158, 161, 165, 169, 1, 5, 6, 9, 12, 16, 18, 21, 22, 23, 25, 28, 29, 31, 32, 44, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 75, 84, 87, 88, 90, 93, 94, 97, 99, 106, 111, 116, 117, 120, 121, 123, 127, 128, 129, 130, 132, 133, 134, 135, 137, 139, 142, 143, 156, 159, 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 난소암의 치료를 위한 서열 식별 번호 4, 14, 35, 37, 46, 52, 60, 70, 81, 85, 92, 94, 95, 101, 120, 124, 125, 129, 131, 132, 134, 136, 142, 146, 147, 149, 150, 154, 157, 158, 160, 162, 165, 167, 3, 47, 57, 84, 89, 99, 111, 138 및 148의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 식도암의 치료를 위한 서열 식별 번호 1, 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 19, 29, 35, 37, 40, 46, 50, 51, 52, 57, 58, 62, 63, 67, 70, 75, 77, 79, 85, 91, 92, 94, 95, 106, 114, 118, 120, 124, 129, 131, 132, 135, 136, 137, 142, 147, 148, 149, 154, 158, 165, 169, 1, 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 19, 29, 35, 37, 40, 46, 50, 51, 52, 57, 58, 62, 63, 67, 70, 75, 77, 79, 85, 91, 92, 94, 95, 106, 114, 118, 120, 124, 129, 131, 132, 135, 136, 137, 142, 147, 148, 149, 154, 158, 165 및 169의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 방광암의 치료를 위한 서열 식별 번호 3, 4, 20, 29, 37, 41, 42, 59, 60, 64, 82, 88, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 104, 106, 114, 115, 120, 122, 131, 135, 137, 142, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 160, 166, 169, 170, 171, 175, 1, 5, 6, 12, 14, 15, 19, 30, 31, 38, 46, 52, 57, 65, 67, 70, 71, 74, 84, 86, 89, 92, 94, 100, 103, 107, 109, 111, 113, 118, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 138, 148, 149, 158 및 159의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 자궁내막암의 치료를 위한 서열 식별 번호 41, 85, 94, 116, 120, 130, 143, 162, 165 및 166의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 담낭암 및 담관암의 치료를 위한 서열 식별 번호 8, 10, 19, 31, 73, 75, 94, 102, 115, 116, 122, 125, 131, 149, 4, 21, 22, 30, 46, 50, 69, 70, 80, 90, 95, 96, 103, 111, 120, 129, 142, 144, 145, 147, 152, 154, 156 및 160의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 자궁암의 치료를 위한 서열 식별 번호 4, 5, 6, 12, 14, 15, 19, 29, 37, 38, 39, 42, 46, 50, 56, 57, 60, 70, 74, 82, 84, 91, 95, 101, 103, 104, 106, 110, 111, 118, 123, 129, 132, 135, 146, 148, 149, 151, 156, 157, 158, 159, 160 및 161의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
그리하여 본 발명의 또 다른 양태는 췌장암, 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁내막암, 담낭암 및 담관암의 군으로부터 선택된 증식성 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 길이 변이체와 같은 긴 형태의 MHC 클래스-II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는(각각) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된 펩티드이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원-결합 항원-연관된 불변사슬(Ii)에 융합되거나 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있거나 발현하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료와 의학 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 MHC와의 복합체 및 이들을 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 가용성 TCR(sTCR) 및 상동성 또는 동종이형 T 세포로 조작된 복제된 TCR 및 이러한 수용체를 만드는 방법은 물론 상기 TCR을 함유하거나 상기 TCR과 교차반응하는 NK 세포 또는 기타 세포들에 관한 것이다.
항체 및 TCR은 즉시 가용한 본 발명에 펩티드의 면역치료적 사용의 추가 구현이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161, 바람직하게는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 79 또는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따라 생산된 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 항체, 또는 본 발명에 따른 다른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC-결합 분자를 약제로서 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다.
바람직하게는 상기 약제는 세포 요법, 백신 또는 가용성 TCR 또는 항체에 근거한 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암 세포는 췌장암, 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장암 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁 내막암, 담낭암, 및 담관암, 바람직하게는 췌장암 세포이다.
본 발명은 또한 여기서 "표적"이라 칭하며 암 바람직하게는 췌장암의 진단에 사용할 수 있는 본 발명에 따른 펩티드에 근거하는 바이오마커에 관한 것이다. 마커는 펩티드 자체의 과다 제시 또는 상응하는 유전자의 과발현일 수 있다. 또한 마커는 치료, 바람직하게는 면역요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 동정된 동일한 표적을 대상으로 하는 면역요법의 성공 확률을 예측하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 또는 가용성 TCR은 MHC와의 복합체에서 관심 있는 펩티드의 존재를 검출하기 위해 종양의 부분들 염색에 사용할 수 있다.
임의적으로 그 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 갖는다.
본 발명은 또 암 치료의 맥락에서 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
AAGAB는 클라트린 피막 수포의 전달에 관여하는 복합체의 감마-아답틴 및 알파-아답틴 하위단위와 상호작용하는 단백질을 인코딩한다. 이 유전자의 돌연변이는 I형 정상 수장족저 각피증과 연관된다(RefSeq, 2002). AAGAB는 miR-205의 표적이며, 이는 경부암에서 과발현된다(Xie et al., 2012). AAGAB의 넉다운(Knock-down)은 증가된 세포 분열 및 증식을 초래한다(Pohler et al., 2012).
ACTR2는 ARP2/3 복합체의 주요 성분인 ARP2 액틴 관련 단백질 2 상동체를 인코딩한다. 이 복합체는 세포 형상과 층상위족 액틴 조립체 및 돌출부를 통한 운동성에 필수적이다(RefSeq, 2002). 다른 단백질과 복합체에서 ARP2/3은 암세포 분열 및 이동에서 중대한 역할을 수행하는 것으로 나타났다(Nurnberg et al., 2011; Feldner and Brandt, 2002; Frugtniet et al., 2015; Kurisu and Takenawa, 2010; Kirkbride et al., 2011). WASP/WAVE 단백질 계열 구성원과 ARP2/3의 복합체는 유방암에서 세포 침입과 이동에 기여한다(Frugtniet et al., 2015). ARP2/3과 ArgBP2의 복합체는 췌장암 세포의 유착 및 이동이 조절되는 경우 항암 기능이 부여된다(Roignot and Soubeyran, 2009).
ADAM9는 ADAM(디신테크린 및 메탈로프로테아제 도메인) 계열의 한 구성원(구성원 9)을 인코딩한다. 이 계열의 구성원들은 세포-세포 및 세포-기질의 상호 작용에 참여한다(RefSeq, 2002). ADAM9 유전자 침묵은 식도 편평 세포 암종(ESCC)의 암 증식을 감소시킨다(Liu et al., 2015b). ADAM9는 흑색종의 증식 및 침입에서 중요한 역할을 수행한다(Ebrahimi et al., 2014). ADAM9는 골육종 세포, 근육 침윤성(MI) 방광암 세포, 비소세포 폐암, 췌장암, 결장암, 구강 편평 세포 암종, 경부암, 전립선암, 신장암, 위암, 림프절암 및 유방암에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Shaker et al., 2011; Vincent-Chong et al., 2013; Li et al., 2013; Ebrahimi et al., 2014; Zhang et al., 2014a; Jia et al., 2014; O'Shea et al., 2003; Jiang et al., 2014a; Zubel et al., 2009). ADAM9는 폐암의 뇌 전이에 관련된 바 있다(Sher et al., 2014; Lin et al., 2014a; Shintani et al., 2004).
AGAP9는 GTPase 도메인, 안키린(Ankyrin) 반복 및 PH 도메인 9에 포함된 ArfGAP를 인코딩하며, 10q11.22 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
AHCY는 아데노실호모시스티나아제를 인코딩한다. 이것은 메틸기 전이 반응에 중요한 것으로 사료되는 세포내 S-아데노실시스테인(SAH)을 조절한다(RefSeq, 2002). AHCY 하향조절은 종양 생성에 기여한다(Leal et al., 2008). AHCY는 세포자멸사를 촉진시킬 수 있다. 이것은 식도 편평 세포 암종 세포의 이동 및 유착을 억제하여 식도의 암 형성에서의 역할을 시사한다(Li et al., 2014b). AHCY 단백질 발현은 결장암에서 상향조절된다(Kim et al., 2009; Watanabe et al., 2008; Fan et al., 2011). AHCY는 난소암에서 잠재적 바이오마커일 수 있다(Peters et al., 2005).
AK2는 아데닐레이트 키나아제 2를 인코딩한다. AK2는 미토콘드리아 막간 공간에 국소화되며 세포자멸사에서 역할을 수행할 수 있다(RefSeq, 2002). AK2는 종양 생성에 관여할 수 있는 신규 내인성 세포자멸사 경로를 매개한다(Lee et al., 2007).
ANKLE2는 안키린 반복 및 LEM 도메인 함유 2를 인코딩한다. ANKLE2는 내부 핵막 단백질의 LEM 계열의 구성원을 인코딩한다. 이 쌓여진 단백질은 핵피막의 유사분열 후 형성을 통해 유사분열 조절인자로서 기능한다(RefSeq, 2002).
ANKRD1은 안키린 반복 도메인-1을 인코딩한다. 이것은 내피 세포의 핵에 국소화되며 IL-1 및 TNF-알파 자극에 의해 유도된다. 이 단백질과 근육원 섬유 단백질인 마이오팔라딘(myopalladin) 및 티틴(titin) 사이의 상호작용은 이것이 근원섬유 신장-센서 시스템에도 관여할 수 있음을 시사한다(RefSeq, 2002). ANKRD1의 자궁외 발현은 간암에서 집락 형성의 감소와 세포자멸사성 세포사의 강화를 유도한다(Park et al., 2005). 난소 암종에서 ANKRD1의 높은 발현은 불량한 생존율과 연관된다(Lei et al., 2015).
ANLN은 세포 성장 및 이동 및 세포질 분열에서 역할을 수행하는 액틴 결합 단백질을 인코딩한다. ANLN은 사구체의 구성요소인 발세포에서 액틴 세포골격 역학을 조절하는 것으로 사료된다. 이 유전자에서의 돌연변이는 국소성 분절성 사구체 경화증 8과 연관이 있다(RefSeq, 2002). ANLN은 유방암 조직 및 두경부 편평 세포 암종에서도 높게 발현되는 것으로 나타났다. ANLN의 넉다운(Knock-down)은 유방암 세포의 증식률, 집락 형성 능력 및 이동을 뚜렷이 억제했다(Zhou et al., 2015b). ANLN은 증식성 위암, 췌장 암종 및 호르몬 불응성 전립선암에서 과발현된다(Pandi et al., 2014; Tamura et al., 2007; Shimizu et al., 2007; Olakowski et al., 2009). ANLN은 간세포 암종의 바이오마커이다(Kim et al., 2013a). ANLN 발현은 신세포 암종 환자에서 우호적인 예후의 표지자이다(Ronkainen et al., 2011).
APOL6은 아포지질단백질 L, 6을 인코딩한다. APOL6은 아포지질단백질 L 유전자 계열의 구성원이다. 인코딩된 단백질은 세포질에서 발견되며, 여기서 지질의 움직임에 영향을 주거나 지질과 소기관의 결합을 허용할 수 있다(RefSeq, 2002). APOL6은 암세포에서 미토콘드리아 매개 세포 자멸사를 유도한다(Liu et al., 2005).
ARMC9(KU-MEL-1이라고도 함)는 멜라닌 세포에서 우선적으로 발현되며 이전에 분리된 흑색종 항원인 아마딜로 반복 함유 단백질을 인코딩한다. 이것은 보그트-고야나기-하라다병과 연관이 있다(Otani et al., 2006). ARMC9는 흑색종 세포주와 조직 샘플에서 강하게 발현된다. ARMC9에 대한 항원이 뇌암, 결장암 및 식도암의 치료를 받은 환자의 혈청에서 검출되었다(Kiniwa et al., 2001).
ASNS는 아스파라긴 합성효소를 인코딩한다. ASNS 유전자는 온도 민감 햄스터 돌연변이주 ts11에서 돌연변이를 보완하는데, 이는 증식불허 온도에서 세포 주기의 G1 기를 통한 진행을 차단한다(RefSeq, 2002). ASNS 발현은 포도당 박탈에 의해 유도되며 췌장암 세포를 세포자멸사로부터 보호한다(Cui et al., 2007). ASNS는 백혈병 및 자궁암에서 약물 내성과 연관이 있다(Lin et al., 2012; Zhang et al., 2013a). A375 세포에서 ASNS의 넉다운(Knock-down)은 CDK4, CDK6, 및 사이클린 D1의 발현 수준을 하향조절하고, p21의 발현을 상향조절한다(Li et al., 2015a). ASNS의 하향조절은 유방암에서 세포 주기 정지를 유도하고 세포 증식을 억제한다(Yang et al., 2014a). ASNS는 아교종에서 높게 발현된다(Panosyan et al., 2014). ASNS는 난소암에서 잠재적 바이오마커이다(Lorenzi et al., 2006; Lorenzi et al., 2008; Lorenzi and Weinstein, 2009).
ATP5F1은 ATP 합성효소, H+ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 아단위 B1, 미토콘드리아 ATP 합성효소의 아단위를 인코딩한다(RefSeq, 2002). ATP5F1은 B형 간염 바이러스 관련 간세포 암종에서 상향조절된다(Lee et al., 2008a).
BMS1은 BMS1 리보솜 생체발생 인자이며 10q11.21 염색체 상에 위치한다. 효모에서 유사한 단백질은 35S-rRNA 처리에 기능하는데, 40S 리보솜의 형성에 중대한 일련의 분할 단계가 포함된다(RefSeq, 2002; Perez-Fernandez et al., 2011).
BMS1P5는 BMS1 리보솜 생체발생 인자 위유전자 5를 인코딩하며 10q11.22 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
BRK1(C3orf10 또는 HSPC300이라고도 함)은 Wave 복합체의 가장 작은 아단위를 인코딩하며 배아 발육 및 세포 전환 동안 액틴 세포골격 역학에 연관된 Wave/Scar 경로의 중요한 조절인자이다(Derivery et al., 2008; Escobar et al., 2010). BRK1은 폐암 및 신세포 암종 등 다른 암 유형에서 종양유전자의 잠재성을 갖는다(Cascon et al., 2007; Cai et al., 2009; Escobar et al., 2010). BRK1은 전사 인자 Sp1 및 NRF-1에 의해 조절된다. 이것은 Arp2/3 조절 이후 Wave/Scar 경로에 연관되며 세포 증식 및 전환에 요구된다(Li et al., 2014a; van't Veer et al., 2006; Escobar et al., 2010; Wang et al., 2013c).
BTBD1은 BTB(POZ) 도메인 함유 1을 인코딩한다. 이 단백질의 C-말단은 국소 이성화효소 I에 결합한다. N-말단에는 프롤린이 풍부한 영역 및 BTB/POZ 도메인이 포함되며, 이 두 가지는 전형적으로 단백질-단백질 상호작용에 관여한다(RefSeq, 2002).
BUB1B는 방추 체크포인트(spindle checkpoint)에 관여하는 키나아제를 인코딩한다. 이 단백질은 동원체에 국소화되며 후기를 촉진하는 복합체/사이클로솜(APC/C)의 억제에서 역할을 수행하는데, 후기의 시작을 지연시키고 적절한 염색체 분리를 보장한다. 방추 체크포인트의 부전은 다수의 암 형태에서 나타났다(RefSeq, 2002). BUB1B는 종양억제 단백질이다. BUB1B는 방추 조립 체크포인트를 조절한다. BUB1B는 종양에서 비활성화되거나 하향조절된다. BUB1B에서의 돌연변이는 종양 발전에도 연계된다(Aylon and Oren, 2011; Fagin, 2002; Malumbres and Barbacid, 2007; Rao et al., 2009). BUB1B는 종양유전자 활성화를 통해 위 암 형성과 연관된다(Resende et al., 2010). BUB1B 돌연변이는 결장직장암의 원인 중 하나이다(Karess et al., 2013; Grady, 2004).
C11orf70은 정상 고환 조직과 비교하여 고환 생식 세포 종양에서 하향조절된다(Wang et al., 2015i). C11orf70은 정상 고환 조직과 비교하여 고환 생식 세포 종양에서 하향조절된다(Gonzalez-Exposito et al., 2015; Alagaratnam et al., 2009). C11orf70의 유전 영역은 구강 편평 세포 암종에서 DNA 복제 수의 이상을 표시하는데, 이는 구강암 특이적 사망률과 연관이 있다(Chen et al., 2015a).
C11orf80은 염색체 11 해독틀(open reading frame) 80을 인코딩하며 11q13.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
C1orf198은 염색체 1 해독틀 198을 인코딩하며 1q42.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
C20orf24는 염색체 20 오픈 리딩 프레임 24를 인코딩하며 20q11.23 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). C20orf24는 선종에서 암종으로의 염색체 불안정과 관련된 진행에서 중요한 역할을 수행한다. C20orf24는 선종에 비해 암종에서 유의하게 과발현된다. C20orf24는 결장직장암에 대하여 매우 특정적인 바이오마커로서 사용될 수 있다(Carvalho et al., 2009).
CAD는 카바모일인산 합성효소 2, 아스파르트산 카르바모일기 전이효소 및 디히드로오로타아제의 삼중기능성 단백질을 인코딩하며, 피리미딘 생합성 경로에서 첫 3가지 반응을 촉매한다(RefSeq, 2002). CAD 활성도는 간세포암, 육종 및 신장 선암종을 포함하여 여러 암 유형에서 증가하며 CAD 유전자의 증폭과 매우 빈번하게 연관된다(Smith et al., 1990; Aoki and Weber, 1981; Smith et al., 1997). CAD는 여러 종양유전자 및 MAPK, mTORC1 및 c-Myc와 같은 경로를 조절하는 종양 발생의 표적이다(Mac and Farnham, 2000; Graves et al., 2000; Sharma et al., 2014). CAD는 전립선 종양 세포에서 안드로겐 수용체의 핵 전위를 촉진하고 그 전사 활성도를 자극한다. 근처 전립선 적출술 이후, 높아진 CAD mRNA 수준은 국소적 종양 확장 및 암 재발과 연관이 있다(Morin et al., 2012).
CARM1은 공동 활성화 인자와 연관된 아르기닌 메틸전이효소 1을 인코딩한다. CARM1은 단백질 아르기닌 메틸전이효소(PRMT) 계열에 속한다. 인코딩된 효소는 단백질의 아르기닌 잔기에서 구아니딘 질소의 메틸화를 촉매한다. 이 효소는 유전자 발현에 관여한다(RefSeq, 2002). CARM1은 결장직장암, 전립선암, 흑색종 및 유방암에서 탈조절되는 것으로 나타난 바 있다. CARM1은 전립선 종양뿐만 아니라 전립선 상피내 종양(PIN)에서도 과발현된다. CARM1은 비소세포 폐암종(NSCLC)에서 유의하게 과발현된다. CARM1 발현은 간세포 암화 과정 도중 선종에서는 상승하며 암종에서는 이상하게 나타난다(Limm et al., 2013; Osada et al., 2013; Elakoum et al., 2014; Baldwin et al., 2014). CARM1은 염색질 재구성 인자 BAF155를 메틸화하여 종양 진행 및 전이를 강화한다(Wang et al., 2014a; Stefansson and Esteller, 2014).
CCNA2는 고도로 보전된 사이클린 계열의 구성원인 사이클린 A2를 인코딩한다. CCNA2는 CDC2 또는 CDK2 키나아제에 결합하여 이를 활성화하므로 세포 주기 G1/S 및 G2/M 전이를 모두 촉진한다(RefSeq, 2002). CCNA2의 과발현은 간세포 암종 세포의 증식을 억제한다. 자궁내막 선암종 세포에서 CCNA2의 과발현은 세포 성장을 감소시키고 세포자멸사를 증가시킨다. 흑색종 세포에서 CCNA2 발현은 종양 성장 및 전이를 감소시키고 동시에 종양에서 세포자멸사를 증가시킨다(Lau, 2011). CCNA2는 암 세포의 증식, 침입, 유착, 분화, 생존 및 전이를 촉진시킨다. 이는 혈관 형성 및 세포외 기질 생성에서 중요한 역할을 한다. CCNA2는 위 선암종 세포에서 과발현되는 경우 종양 성장을 촉진시키고 종양 혈관화를 증가시킨다. 췌장암 세포에서 CCNA2 발현의 침묵은 종양 성장을 감소시킨다. CCNA2는 전립선암 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다(Lau, 2011; Chen and Du, 2007). CCNA2 과발현은 상피-중간엽 이행을 유도하여 후두 종양 침입 및 전이를 초래한다(Liu et al., 2015e). CCNA2는 결장직장암에서 이상조절된다(Chang et al., 2014). CCNA2는 전립선암, 신경아교종, 췌장암 및 유방암에서 과발현된다. CCNA2는 유방암에서 증가된 공격성, 혈관화 및 에스트로겐 비의존성과 연관이 있으며 이는 유방암 진행에서 CCNA2의 주요 역할을 시사한다(Zuo et al., 2010).
CCND1은 사이클린 D1를 인코딩한다. 이는 고도로 보존된 사이클린 계열에 속하며, 그 구성원은 세포 주기에 걸쳐 단백질 풍부성에 있어서 극적인 주기성의 특징을 가진다. 세포 주기 진행을 변경시키는 CCND1의 돌연변이, 증폭 및 과발현은 다양한 종양에서 빈번히 관찰되며, 종양생성에 기여할 수 있다(RefSeq, 2002). CCND1은 구강 편평 세포 암종, 위장관 기질 종양, 비소세포 폐암, 뇌하수체 종양 및 유방암에서 림프절 전이의 사례에서 증폭되고 과발현된다(Noorlag et al., 2015; Dworakowska, 2005; Gautschi et al., 2007; Lambros et al., 2007; Yang et al., 2008; Yu and Melmed, 2001). CCND1은 외투세포 림프종, 췌장 신경내분비 종양, 부갑상선 선종 및 유잉 육종에서 과발현된다(Navarro et al., 2011; Sander, 2011; Capurso et al., 2012; Delas et al., 2013; Setoodeh et al., 2013; Sanchez et al., 2008; Westin et al., 2009). CCND1은 결장직장암의 위험을 증가시킬 수 있다(Yang et al., 2012b; Andersen et al., 2013). CCND1의 유전적 변이는 방광암을 유발할 수 있다(Zhang et al., 2003; Baffa et al., 2006).
CCT3은 chaperonin containing TCP1, 아단위 3(감마)인 분자 섀퍼론을 인코딩한다(RefSeq, 2002). CCT3은 간세포 암종에서 상승된다(Midorikawa et al., 2002; Skawran et al., 2008). CCT3는 난소암에서 잠재적으로 새로운 바이오마커이다(Peters et al., 2005).
CCT4는 셰퍼로닌(chaperonin) 함유 TCP1, 아단위 4를 인코딩한다. CCT4는 부분적으로 접힌 중간 형태의 ATP 주도 방출 및 재결합을 여러 번 반복하여 새로 번역된 폴리펩티드 기질의 접힘을 지원한다(RefSeq, 2002). CCT4 조절 완화는 식도 편평 세포 암종 및 폐 선암종을 유발한다(Wang et al., 2015j; Tano et al., 2010). CCT4는 위암에서 상향조절된다(Malta-Vacas et al., 2009).
CDC27은 세포 분열 주기 27을 인코딩한다. 이 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 후기 촉진 복합체(APC)의 구성요소이다. 이 단백질은 유사분열의 시점 제어에 관여될 수 있다(RefSeq, 2002). CDC27은 하향조절 시 삼중 음성 유방암 및 편평 세포 경부 암종의 증가된 방사선 저항성을 부여한다(Rajkumar et al., 2005; Ren et al., 2015). CDC27은 간세포 암종의 진행에서 중대한 역할을 하며, 또한 식도 편평세포 암종 및 췌장암에서 불량한 예후와 상관관계가 있다(Ahn et al., 2014; Wang et al., 2015h). CDC27 다형성은 세포의 유사분열 진행에 대한 영향을 통해 유방암의 감수성에 기여할 수 있다(Guo et al., 2015). CDC27 돌연변이는 전립선암에 관여한다(Lindberg et al., 2013). CDC27 돌연변이 및 하향조절은 여러 유방 및 결장 암종의 세포주에 관여한다(Fan et al., 2004; Roy et al., 2010; Pawar et al., 2010).
CDK12는 사이클린 의존 키나아제를 인코딩하며 17q12 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). CDK12 돌연변이는 난소, 유방, 전립선 및 장의 종양 등 다양한 종양에서 확인되었다(Vrabel et al., 2014).
CDK13은 사이클린 의존 세린/트레오닌 단백질 키나아제 계열의 구성원인 사이클린 의존 키나아제 13을 인코딩한다. 이 계열의 구성원들은 세포 주기 제어에서 마스터 스위치로서의 필수적 역할로 알려져 있다. 이들은 mRNA 처리에서 역할을 할 수 있으며 조혈의 조절에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002). CDK13은 췌장암 및 피부암과 연관이 있다(Ansari et al., 2015; Nelson et al., 1999; Chandramouli et al., 2007). CDK13은 간세포 암종에서 증폭된다(Kim et al., 2012b).
CDK2는 세포 주기 조절에 참여하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제인 사이클린 의존 키나아제 2를 인코딩한다. 이 단백질의 활성도는 G1에서 S기로의 전이 동안 특히 중대하다(RefSeq, 2002). CDK2 과발현은 세포 주기의 비정상적인 조절을 나타내며, 이것은 암 세포에서 과다증식과 직접 관련된 것이다(Chohan et al., 2015). CDK2는 백혈병, 결장직장 암종, 흑색종, 인간 유두종 바이러스 관련 자궁경부 신생물, 폐암, 유방암 및 전립선암과 연관되어 있다(Foster et al., 2001; Zajac-Kaye, 2001; Raso et al., 2013; He et al., 2013; Duensing and Munger, 2002; Hu and Zuckerman, 2014; Agarwal, 2000). CDK2는 외투 세포 림프종에서 고도로 발현된다(Rummel et al., 2004).
CDK5RAP3은 CDK5 조절 아단위 연관 단백질 3을 인코딩한다. CDK5RAP3은 전사 조절 및 세포 주기 진행을 지배하는 신호전달 경로에서 역할을 수행한다. 이것은 종양 생성 및 전이에서 기능할 수 있다(RefSeq, 2002). CDK5RAP3은 간세포 암종에서 과발현되며 전이를 촉진시킨다(Mak et al., 2011; Mak et al., 2012).
CDK7은 사이클린 의존 단백질 키아나제 계열의 구성원인 사이클린 의존 키나아제 7을 인코딩한다. 이것은 전사 인자 TFIIH의 필수 구성요소로서 전사 개시 및 DNA 복구에 관대하다. 이 단백질은 전사 조절과 세포 주기 사이의 직접적인 연결 역할을 하는 것으로 사료된다(RefSeq, 2002). CDK7의 유전적 다형성은 유전자-환경 또는 유전자-유전자 상호작용에 의해 개인이 유방암에 걸릴 성향을 초래한다(Yoo and Kang, 2003). CDK7은 췌장암에 대한 증가된 위험과 연관이 있다(Efthimiou et al., 2001). CDK7은 유방암과 연관된 바 있다(Cance and Liu, 1995).
CDK9는 사이클린 의존 단백질 키아나제 계열의 구성원인 사이클린 의존 키나아제 9를 인코딩한다. 이 단백질은 이의 조절 아단위 사이클린 T 또는 사이클린 K와 복합체를 형성하고 이에 의해 조절된다(RefSeq, 2002). CDK9는 근육 세포, 단핵구 및 뉴런과 같은 여러 가지 세포 유형의 분화 프로그램과 연관있는 것으로 보인다. CDK9는 단핵구에서 항세포자멸사 기능이 있는 것처럼 보인다. 세포의 여러 생리학적 과정에서 CDK9의 연관은 암 발현으로 이어질 수 있다(De and Giordano, 2002).
CELSR3은 EGF LAG seven-pass G형 수용체 3인 카드헤린(cadherin)을 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 접촉 의존 신경돌기 성장의 조절에 관여할 수 있으며 종양 형성의 역할을 할 수 있다(RefSeq, 2002). 마이크로어레이 스크리닝에 의해, CELSR3이 정상 구강 점막층에 비해 원발성 구강 편평 세포에서 과메틸화되었음이 밝혀졌다(Khor et al., 2014). CELSR3은 난소암 및 뇌 종양과 연관되어 있다(Asad et al., 2014; Katoh and Katoh, 2007). CELSR3은 췌장 및 간 종양의 성상 세포에서 상향조절된다(Erkan et al., 2010).
CEP97은 중심체 단백질 97kDa를 인코딩하며 3q12.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). CEP97은 유방암과 연관이 있다(Rappa et al., 2014).
CFL1은 코필린(cofilin) 1을 인코딩한다. 이것은 액틴-코필린 복합체의 세포질에서 핵으로의 전위에 관여한다(RefSeq, 2002). CFL1 돌연변이는 다발 내분비 선종양 1형 및 다형성 아교문 세포종과 연관이 있다(Solomon et al., 2008; Georgitsi, 2010). CFL1은 림프종, 백혈병, 신경모세포종, 난소암, 전립선암, 유방암, 폐암 및 증피종에서 과발현된다(Rana et al., 2008). CFL1은 고환 생식 세포 종양에서 하향조절된다(von Eyben, 2004).
CHD3은 크로모도메인 헬리카아제 DNA 결합 단백질 3을 인코딩한다. 이 단백질은 탈아세틸화 히스톤에 의한 염색질의 재조직에 참여하는 Mi-2/NuRD 복합체로 불리는 히스톤 탈아세틸화효소의 구성요소 중 하나이다(RefSeq, 2002). CHD3은 췌장 상피내 종양 및 췌장 암종에서 상향조절된다(Wang et al., 2011). CHD3 돌연변이는 위암 및 결장직장암과 연관이 있다(Kim et al., 2011a). CHD3은 급성 림프성 백혈병에서 과발현된다(Camos et al., 2006).
CHD4는 크로모도메인 헬리카아제 DNA 결합 단백질 4를 인코딩한다. 이것은 뉴클레오솜 재조직 및 탈아세틸화 효소 복합체의 주요 구성요소를 나타내며 후성유전체 전사 억압에서 중요한 역할을 수행한다. 이 유전자에서 체세포 돌연변이는 혈청 자궁내막 종양과 연관이 있다(RefSeq, 2002). CHD4는 급성 림프성 백혈병의 새로운 치료 표적이다(Sperlazza et al., 2015). CHD4는 EpCAM+ 간암 줄기 세포에서 유전자 조절 및 DNA 손상 반응을 후생유전적으로 제어한다(Nio et al., 2015). CHD4는 BRCA2 돌연변이주 암 세포에서 치료 반응을 변조시킨다(Guillemette et al., 2015). CHD4는 아교모세포종 및 결장암과 연관이 있다(Cai et al., 2014; Chudnovsky et al., 2014).
CHD5는 크로모도메인 헬리카아제 DNA 결합 단백질 5를 인코딩한다. CHD5는 신경모세포종의 발육에서 역할을 할 수 있는 잠재적 종양 억압인자이다(RefSeq, 2002). CHD5는 신경아교종 및 유방, 결장, 폐, 난소, 전립선의 암 등 다양한 기타 종양 유형에서 종양 억압 인자의 기능을 한다(Kolla et al., 2014).
CIRH1A(또는 시르힌(Cirhin)이라고도 함)는 핵소체에 국소화된 WD40 반복 함유 단백질의 경변 상염색체 열성 1A를 인코딩한다. 이것은 북미 인디언의 아동 경변을 유발시킨다(NAIC)(RefSeq, 2002). CIRH1A는 정준 NF-kappaB 효소를 상향조절할 수 있으며 NF-카파B 요소를 포함하는 다른 유전자의 조절에 참여할 수 있다. 이는 CIRH1A가 암 관련 NF-카파B 경로에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다(Yu et al., 2009).
COL1A1은 콜라겐, 1형, 알파 1을 인코딩한다. 1형은 대부분의 결합 조직에서 발견되는 원섬유 형성 콜라겐이며 뼈, 각막, 진피 및 힘줄에서 풍부하다. 이 유전자와 혈소판 유래 성장 인자 베타가 위치한 염색체 17 및 22 사이의 상호 전좌는 성장 인자의 조절되지 않는 발현으로부터 초래되는 융기 피부섬유육종이라 하는 특정한 유형의 피부 종양과 연관이 있다(RefSeq, 2002). COL1A1은 위암에서 차등적으로 발현된다(Yasui et al., 2004). COL1A1은 색소침착 융기 피부섬유육종과 연관이 있다(Zhang et al., 2013c).
COL1A2는 콜라겐, 1형, 알파 2를 인코딩한다. 1형은 대부분의 결합 조직에서 발견되는 원섬유 형성 콜라겐이며 뼈, 각막, 진피 및 힘줄에서 풍부하다(RefSeq, 2002). COL1A2는 위암과 연관이 있다(Yasui et al., 2004; Yasui et al., 2005).
COL6A1은 콜라겐, 6형, 알파 1을 인코딩한다. 콜라겐 VI은 미세원섬유의 주요 구조적 구성요소가다. 콜라겐 VI 아단위를 코딩하는 유전자의 돌연변이 상염색체 우성 장애인 베들렘 근병증을 초래한다(RefSeq, 2002). COL6A1은 거세저항성 전립선암의 반응성 기질에서 상향조절되며 종양 성장을 촉진시킨다(Zhu et al., 2015c). COL6A1은 CD166+암 세포보다 더 강력한 침습성 및 이동성 활성도를 보이는 CD166- 췌장암 세포에서 과발현된다(Fujiwara et al., 2014). COL6A1은 골 전이에서 고도로 발현된다(Blanco et al., 2012). COL6A1은 경부암 및 난소암에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Zhao et al., 2011; Parker et al., 2009). COL6A1은 성상세포종 및 아교모세포종에서 차등적으로 발현된다(Fujita et al., 2008).
COL6A3은 대부분의 연결 조직에서 발견되며 기질 구성요소를 조직하는데 중요한 염주 미세섬유 콜라겐인 VI형 콜라겐의 세 알파쇄 중 하나인 콜라겐, VI형, 알파 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). COL6A3에 대한 유전자는 대부분의 연결 조직에서 발견되며 기질 구성요소를 조직하는데 중요한 역할을 수행하는 염주 미세섬유 콜라겐인 VI형 콜라겐의 알파-3 사슬을 인코딩한다(RefSeq, 2002). COL6A3은 결장암, 방광암 및 전립선암에서 교대로 스플라이싱된다. COL6A3의 긴 아이소형은 암 샘플에서 거의 배타적으로 발현되며 새로운 암 표지자로서 잠재적으로 역할을 할 수 있다(Thorsen et al., 2008). COL6A3은 췌장관 선암종 조직에서 고도로 발현되며 종양 특이적 교대 스플라이싱을 거친다(Kang et al., 2014). COL6A3은 고등급 난소암과 상호관계가 있는 것으로 잘 나타났으며 시스플라틴 내성에 기여한다. COL6A3은 위암 조직에서 빈번하게 과발현되는 것으로 관찰되었다(Xie et al., 2014). COL6A3 돌연변이(들)는 결장직장 암종 환자에서 종양 분화 및 TNM 병기와 관계 없이 더 나은 전체 생존 기간을 유의하게 예측했다(Yu et al., 2015b). COL6A3 발현은 췌장암, 결장암, 위암, 점막표피양 암종 및 난소암에서 증가한 것으로 보고되었다. 엑손 3, 4 및 6 등을 포함한 암 관련 전사 변이체가 결장암, 방광암, 전립선암 및 췌장암에서 검출되었다(Arafat et al., 2011; Smith et al., 2009; Yang et al., 2007; Xie et al., 2014; Leivo et al., 2005; Sherman-Baust et al., 2003; Gardina et al., 2006; Thorsen et al., 2008). 난소암에서는 COL6A3 수준이 더 높은 종양 등급과 상관관계가 있었으며 췌장암에서는 COL6A3이 적절한 진단용 혈청 바이오마커를 대표하는 것으로 나타났다(Sherman-Baust et al., 2003; Kang et al., 2014).
COPG1(COPG라고도 함)은 골지에서 ER로의 역행 수송 및 골지내 수송을 매개하는 coatomer 단백질 복합체(COPI)의 감마 아단위를 인코딩한다. COPG1은 ARF-GAP에 결합한다(Waters et al., 1991; Watson et al., 2004). COPG1은 환자의 나이는 물론 신경아교육종의 더 높은 등급의 악성 종양 및 등급과 상관관계가 있다(Coppola et al., 2014). COPG1은 폐암 및 폐암 관련 내피 세포에서 풍부하게 발현되는 것으로 나타났다(Park et al., 2008).
CREB3L1은 cAMP 반응 요소 결합 단백질 3-유사 1을 인코딩한다. CREB3L1은 ER 스트레스에 대응하여 분리되며 방출된 세포질 전사 인자 도메인은 핵으로 전위된다. 이것은 그곳에서 box-B 요소에 결합함으로써 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다(RefSeq, 2002). CREB3L1 변이는 경화성 상피모양 섬유육종(SEF)에서 빈번히 발견된다(Prieto-Granada et al., 2015). CREB3L1은 인간 신경아교종 세포주에서 ER 스트레스에 의해 유도되며 접히지 않은 단백질 반응, 세포외 기질 생성 및 세포 이동에 기여한다(Vellanki et al., 2013). CREB3L1은 방광암에서 후성유전학적으로 침묵되어 종양 세포의 확산 및 이동을 원활하게 한다(Rose et al., 2014). CREB3L1은 유방암에서 종양 형성의 억제에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 전이성 표현형의 발생에는 발현의 손실이 요구된다(Mellor et al., 2013).
CSTF1은 절단 자극 인자인 3' pre-RNA, 아단위 1, 50kDa를 인코딩한다. 이것은 폴리아데일화 및 pre-mRNA의 3' 말단 절단에 관여한다(RefSeq, 2002). CSTF1의 변이는 BRCA2 돌연변이 보인자에서 유방암의 위험과 연관있는 것으로 나타났다(Blanco et al., 2015).
CTHRC1은 콜라겐 삼중 나선 반복 함유 1을 인코딩했다. CTHRC1은 동맥 부상에 대한 세포 반응에서 혈관 재조직에 대한 관여를 통해 역할을 수행할 수 있다. 이 유전자 자리에서의 돌연변이는 바렛 식도 및 식도 선암종과 연관되었다(RefSeq, 2002). CTHRC1은 위암 및 유방의 관암종에서 증가된 발현을 나타낸다(Kim et al., 2013b; Yu et al., 2015a; Song et al., 2015). CTHRC1은 결장직장암에서 상향조절된다(Yan et al., 2015a; Yan et al., 2015b). CTHRC1 발현은 B형 간염 바이러스로 감염된 환자에서 간세포 암종의 진행과 고도의 상관관계가 있다. CTHRC1은 간암 세포의 집락 형성, 이동 및 침입을 강화시킨다(Tameda et al., 2014; Zhang et al., 2015b). CTHRC1은 비소세포 폐암에서 과발현된다. 과발현은 종양의 공격성 및 불량한 예후와 연관이 있다(Ke et al., 2014b). CTHRC1은 식도 편평 세포 암종 및 바렛 선암종에서 상향조절된다(Timme et al., 2014). CTHRC1은 흑색종에서 세포 유착 및 생존을 촉진시킨다(Ip et al., 2011).
CXCL5는 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 5를 인코딩한다. 이 단백질은 G-단백질 결합 수용체 케모카인 C-X-C 모티프 수용체 2를 결합시켜 호중구 모집, 혈관생성 촉진 및 연결조직 재형성을 하는 것으로 제안된다. 이 단백질은 암 세포의 증식, 이동 및 침입에서 역할을 하는 것으로 사료된다(RefSeq, 2002). CXCL5는 신세포 암종의 생존, 성장 및 전이에서 중대한 역할을 수행한다(Parihar and Tunuguntla, 2014). CXCL5는 만성 염증에서 식도암 및 위암으로의 전이에 관여한다(Verbeke et al., 2012). CXCL5는 급성 골수성 백혈병과 연관이 있다(Kittang et al., 2010).
DCBLD2는 디스코이딘(discoidin), CUB 및 LCCL 도메인 함유 단백질 2를 인코딩하며 후자는 막횡단 공동수용체 단백질인 상피 및 평활근에서 유래하는 뉴로필린 유사 단백질이라고도 한다(RefSeq, 2002). DCBLD2는 아교모세포종과 두경부암(HNC)에서 상향조절되며 EGFR 자극에 의한 종양생성에 요구된다(Feng et al., 2014). 더욱이, DCBLD2는 고도의 전이성 폐암 하위 세포주와 조직 샘플에서 상향조절된다(Koshikawa et al., 2002). 이와 반대로 위암에서 DCBLD2의 발현은 그 촉진자의 과메틸화에 의해 침묵된다(Kim et al., 2008)DDX43은 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp) box 폴리펩티드 43을 인코딩한다. DDX43은 ATP 의존 RNA 헬리카아제이며 종양 특이적 발현을 나타낸다(RefSeq, 2002).
DDX43은 포도막 흑색종 세포 및 급성 및 만성 골수성 백혈병에서 과발현된다(Chen et al., 2011a; Lin et al., 2014b; Ambrosini et al., 2014). DDX43은 유방암 예후의 바이오마커이다(Wiese and Pajeva, 2014). DDX43은 신경아교종 세포주에서 발현된다(Akiyama et al., 2014).
DDX53은 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp) box 폴리펩티드 53을 인코딩한다. DDX53은 DEAD box 헬리카아제 단백질 계열의 구성원에서 발견되는 어려 도메인을 함유한다(RefSeq, 2002). 암/고환 항원 DDX53은 HDAC2를 통해 p53 발현에 대한 음성적 조절을 가하여 항암 약물에 대한 내성을 부여한다(Kim et al., 2010b). miR-200b 및 암/고환 항원 DDX53은 피드백 고리를 형성하여 미세관을 표적으로 하는 약물에 대한 암 세포주의 침입, 및 종양 형성 및 혈관형성 반응을 조절한다(Kim et al., 2013c). miR-217 및 DDX53은 피드백 고리를 형성하여 EGFR 및 HER2를 통해 항암 약물에 대한 반응을 조절한다(Kim et al., 2016). DDX53은 자궁 근종에서 비정상적 DNA 저메틸화 상태를 갖는 여러 유전자의 하나이다(Maekawa et al., 2011). 21 B세포 및 4 T 세포 악성종양에서 유래되는 세포주에서는, DDX53에 대해 광범위한 mRNA 발현 프로필이 관찰되었다(Liggins et al., 2010).
DNAJC7은 단백질의 DNAJ 열 충격 단백질(HSP) 40 계열의 구성원인 DnaJ(Hsp40) 상동체, 아계열 C, 구성원 7을 인코딩한다. 이 단백질은 섀퍼론 단백질 HSP70 및 HSP90을 ATP 의존 방식으로 결합시키며 공동 섀퍼론으로 기능할 수 있다(RefSeq, 2002). DNAJC7은 p53 및 MDM2 사이의 복합체 형성을 차단함으로써 p53 안정성과 활성도를 강화시킨다(Kubo et al., 2013).
DPP9는 디펩티딜 펩티드분해효소 9를 인코딩한다. DPP9는 그 기질의 활성도 조절에 관여하는 것으로 보이며 2형 당뇨병, 비만 및 암 등 다양한 질병에 연계된 바 있다(RefSeq, 2002). DPP9는 유방암과 난소암에서 잠재적 역할을 수행한다(Wilson and Abbott, 2012). DPP9는 세포 생존 및 증식 경로의 조절에서 중요한 신호전달 역할을 수행한다(Yao et al., 2011). DPP9 mRNA 수준은 고환 종양에서 상승된다(Yu et al., 2010). DPP9은 수막종에서 과발현된다(Stremenova et al., 2010).
DPYD(DPD라고도 알려짐)는 디히드로피리미딘 탈수소효소, 피리미딘 이화효소 및 우라실과 티미딘 이화작용의 경로에서 초기 및 속도 제한 인자를 인코딩한다. 이 유전자에서 돌연변이는 디히드로피리미딘 탈수소효소 결핍, thymine-uraciluria와 연관된 피리미딘 대사에서의 오류 및 5-플루오로우라실 화학요법을 받는 암 환자에서 독성의 위험 증가를 초래한다(RefSeq, 2002). DPYD 발현 수준은 위암에서의 화학요법 유효성에 대한 예측 인자로서 사용이 가능하다(Wan et al., 2016). DPYD 변이체 및 보조 플루오로우라실 기반 병용 화학요법으로 치료한 환자에서 3등급 이상의 플루오로우라실 관련 유해 사례의 발생률 증가 사이에서 통계적으로 유의한 연관이 발견되었다(Cavalcante et al., 2015; Lee et al., 2016; Boige et al., 2016). 결장직장암에서 DPYD 다형성과 KRAS 야생형 발현 사이에는 상관관계가 있다(Kleist et al., 2015). 결장직장암에서 DPYD 유전자 발현의 상향조절은 플루오로피리미딘 독성을 초래한다(Chai et al., 2015; Falvella et al., 2015; van Staveren et al., 2015; Nakamura et al., 2015; Chen et al., 2015c; Hu et al., 2015b). 두경부암, 췌장암, 식도 편평 세포 암종, 소화암, 위암, 간세포 암종 및 결장직장암의 환자에서 DPYD의 다형성 발현은 치료 반응의 결정에 중요할 수 있다(Kim et al., 2015; Toffoli et al., 2015; Ishizuka et al., 2015; Baba et al., 2015; Launay et al., 2016; Kikuchi et al., 2015; Li et al., 2016; Shimamoto et al., 2016; Bai et al., 2015; Dhawan et al., 2016).
DROSHA는 마이크로RNA 생합성에서 중대한 2개의 효소 중 하나이며, 위장관 종양, 유방암 및 자궁경부암 등 다수의 암에서 과발현되며, 종양 세포의 증식, 군락 형성 및 이동을 강화시키는 것으로 보인다(Avery-Kiejda et al., 2014; Havens et al., 2014; Zhou et al., 2013).
DSEL은 황산 데르마탄 에피머화효소 유사(dermatan sulfate epimerase-like)를 인코딩하며 18q22.1 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). DSE는 DSEL의 중요한 파랄로그(paralog)이다. DSE는 간세포 암종 및 결장직장 암종의 면역요법에 대한 면역원성 표적이다(Mizukoshi et al., 2011; Sasatomi et al., 2002).
DST(수포성 유전표창 항원 I(BPAG1)이라고도 알려짐)는 유착 연접판 단백질의 플라킨 단백질 계열 구성원인 디스토인(dystonin)을 인코딩한다. 전장 아이소형은 정의되지 않지만, 신경 및 근육 조직 또는 상피 조직에서 발현되는 여러 아이소형이 있으며, 신경의 중간 미세섬유를 액틴 세포골격에 고정시킨다(RefSeq, 2002; Bouameur et al., 2014; Li et al., 2007). DST는 유방암 전이와 관련이 있을 수 있다(Sun et al., 2006). DST에 대한 자가항체는 림프성 백혈구 및 소포 림프종에서 찾을 수 있다(Aisa et al., 2005; Taintor et al., 2007). DST는 비인두 암종에서 6-10B 세포(종양 형성 능력은 있으나 전이 능력은 결여됨)에 비해 5-8F 세포(높은 종양 형성 및 전이 능력)에서 상향조절된다(Fang et al., 2005). DST는 두경부 편평 세포 암종에서 고도로 발현된다(Lin et al., 2004). 신생물과 연관있는 종양수반성 천포창에는 DST에 대한 자가항체가 있다(Yong and Tey, 2013; Wang et al., 2005; Preisz and Karpati, 2007; Zhu and Zhang, 2007). 전립선암에서 DST 발현은 진행과 강력한 역 상관관계가 있다(Vanaja et al., 2003). 항DST 자가항체는 흑색종의 진단에 필요한 유망한 표지자이다(Shimbo et al., 2010). DST는 악액질암 환자의 소변에서 찾을 수 있다(Skipworth et al., 2010). DST는 폐의 선암종 및 편평 세포 암종에서 차등적으로 발현된다(McDoniels-Silvers et al., 2002). DST는 침습성 세포 성장의 시작과 함께 뚜렷하게 상향조절된다(Herold-Mende et al., 2001).
DYNC1H1은 미세관을 따른 역행 수송에 필요한 주 운동 단백질의 아단위인 디네인(dynein) 중쇄 1을 인코딩한다. 췌장의 췌관 내 유두상 점액 종양 환자에서의 전체 엑솜 시퀀싱 연구를 통해 DYNC1H1 유전자 내의 체세포 변이가 밝혀졌다(Furukawa et al., 2011).
EIF3C는 진핵 번역 개시 인자 3, 아단위 C를 인코딩하며 16p11.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). EIF3C는 인간 U-87 MG 세포에서 과발현되며 세포 증식을 촉진시킨다(Hao et al., 2015). EIF3C는 결장암에서 고도로 발현된다(Song et al., 2013). EIF3C mRNA는 고환 정상피종에서 과발현된다(Rothe et al., 2000).
EIF3CL은 진핵 번역 개시 인자 3, 아단위 C 유사를 인코딩한다. 이것은 염색체 16p11.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
EIF3E는 진핵 번역 개시 인자 3, 아단위 E를 인코딩하며 8q22-q23 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). EIF3E는 구강 편평 세포 암종의 암 형성에서 역할을 할 수 있다(Yong et al., 2014). EIF3E는 아교모세포종 세포의 증식 및 생존에 필수적이다(Sesen et al., 2014). EIF3E는 유방암 진행에서 종양유전자 역할을 한다. 감소된 EIF3E 발현은 유방 상피 세포에서 상피로부터 중간엽으로의 전이를 유발시킨다(Gillis and Lewis, 2013; Grzmil et al., 2010). EIF3E 발현 수준은 방광암에서 유의하게 증가된다(Chen et al., 2011b). EIF3E는 비소세포 암종에 관여한다(Marchetti et al., 2001).
EXT2는 황산 헤파린 생합성의 사슬 연장 단계에 관여하는 2개의 당전이효소 중 하나인 엑소스토신(exostosin) 당전이효소 2를 인코딩한다. 이 유전자의 돌연변이는 다발성 외골종의 II형을 유발한다(RefSeq, 2002). EXT2 돌연변이는 연골육종에서 역할을 수행한다(Samuel et al., 2014). EXT2 돌연변이는 다발성 골연골종 증후군을 유도한다(Jochmann et al., 2014). EXT2 돌연변이는 유전성 다발성 외골종을 유발하여 황산 헤파린 결핍에 이르게 한다(Huegel et al., 2013).
F2R(PAR1이라고도 알려짐)은 혈전 반응의 조절에 관여하는 막횡단 수용체인 응고 인자 II 트롬빈 수용체를 인코딩한다(RefSeq, 2002). F2R은 Etk/Bmx의 플렉스트린 상동성(pleckstrin homology, PH) 도메인에 결합한다. F2R 변이주는 PH 도메인에 결합할 수 없으며 유방 종양 및 융모외성 영양막세포의 침입을 감소시킨다(Kancharla et al., 2015). F2R은 종양 세포 이동, 혈관생성 및 숙주 혈관 세포와의 상호작용 원활화에 의해 암 침입 및 전이를 촉진시키는 것으로 사료된다(Wojtukiewicz et al., 2015). F2R의 하향조절은 암 세포사로 이어진다(Burns and Thevenin, 2015). F2R에서의 다형성은 직장암 환자에서 급성 부상과 연관이 있다(Zhang et al., 2015a). F2R은 구체적으로 ER-음성 유방암 환자에서 불량한 예후와 상관관계가 있다(Lidfeldt et al., 2015). F2R-결핍 생쥐는 결장선암종의 성장 감소를 보여준다(Adams et al., 2015). 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)-1은 F2R을 활성화하여 혈관생성을 유도한다(Fan et al., 2015). F2R은 폐암에서 PTEN 하향조절에 관여한다(Xu et al., 2015). F2R 활성화는 상피 중간엽 이행과 상관관계가 있는 Hippo-YAP 경로를 유도한다(Jia et al., 2015; Owens et al., 2015; Yang et al., 2015a; Fujimoto et al., 2015). HER-2 음성 유방암, 간세포 암종 및 위암에서 F2R 활성화의 억제는 세포 이동 및 침입을 감소시킨다(Mussbach et al., 2015; Wang et al., 2015g; Gonda et al., 2015).
FADS2는 지방산 탈포화효소 유전자 계열의 구성원인 지방산 탈포화효소 2를 인코딩한다. 탈포화 효소는 지방산 사슬의 정의된 탄소 사이에 이중 결합을 도입하여 지방산의 불포화를 조절한다(RefSeq, 2002). FADS2는 간세포 암종에서 상향조절된다(Muir et al., 2013). FADS2 활성도는 유방암 조직에서 증가된다(Pender-Cudlip et al., 2013). FADS2 발현은 유방암의 공격성과 연관이 있다(Lane et al., 2003). FADS2 억제는 내장의 종양 형성을 저해시킨다(Hansen-Petrik et al., 2002).
FADS3은 지방산 탈포화효소 3을 인코딩한다. 탈포화 효소는 지방산 사슬의 정의된 탄소 사이에 이중 결합을 도입하여 지방산의 불포화를 조절한다(RefSeq, 2002).
FAM83D는 서열 유사성 83, 구성원 D를 가진 계열을 인코딩하며 20q11.23 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). FAM83D의 상향조절은 간세포 암종 세포의 증식 및 침입에 영향을 미친다(Wang et al., 2015a; Liao et al., 2015). FAM83D는 유방암 세포주 및 원발성 인간 유방암에서 유의하게 상승한다(Wang et al., 2013e).
FN1은 피브로넥틴(fibronectin) 1을 인코딩하는데, 이것은 혈장에서 가용성 이합체 형태, 및 세포 표면 및 세포외 기질에서 이합체나 다합체 형태로 존재하는 당단백질이다. 이것은 배아 생성, 상처 치유, 혈액 응고, 숙주 방어, 전이 등 세포 유착 및 이동 과정에 관여한다(RefSeq, 2002). FN1은 중요한 종양 관련 혈액 형성 표적화 제제이다(Sollini et al., 2015). FN1은 췌장암의 여러 바이오마커 중 하나이다(Ansari et al., 2014). FN1은 유방암에서 내분비 내성에 책임이 있는 다수 인자 중 하나이다. FN1은 유방암에서 유의하게 탈조절되며 종양 진행 및 전이 확산을 촉진시킨다(Oskarsson, 2013; Zheng et al., 2014). 이것은 편평 세포 암종에서 상피-중간엽 이행의 바이오마커이다(Scanlon et al., 2013). FN1은 다발성 골수종에서 중요한 역할을 수행한다(Neri and Bahlis, 2012).
FUCA2는 분비된 인간 a-l-푸코시다아제 2로서, 1-푸코오스의 이전에 책임이 있는 주요 효소로서 확인되었다. 가수분해 효소는 인간 위암 세포에 대한 H. 파일로리(H. pylori) 유착에 필수적인 것으로 나타났으며, H. 파일로리 관련 위암의 진단용 표지자 및 치료용 표적으로서 상당한 잠재성을 보여준다(Liu et al., 2009).
GCG는 글루카곤을 인코딩한다. 이것은 글리코겐 분해 및 포도당 신생합성의 촉진에 의해 인슐린의 포도당 하강 작용을 저지시키는 췌장 호르몬이다. 이것은 그 신호전달 경로가 세포 증식을 제어하는 특이적 G-단백질 연결 수용체의 리간드이다(RefSeq, 2002). GCG 수용체 영상 촬영은 췌장 베타 세포 질량을 평가하는 가능한 도구로 보인다. 이것은 또한 가스트린종, 크롬친화세포종 및 갑상선 수질암과 같은 다른 종양의 촬영 표적이 될 수도 있다(Hubalewska-Dydejczyk et al., 2015). GCG는 결장 암 형성에서 주요 역할을 한다(Kannen et al., 2013). GCG는 신경 내분비 종양에 대해 떠오르는 추적자이다(Reubi and Maecke, 2008).
GFPT2는 글루타민 과당 6 인산 아미노전이효소 2를 인코딩하며 5q34-q35 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). GFPT2는 유방암 및 림프구성 백혈병에서 중요한 역할을 한다(Kuang et al., 2008; Simpson et al., 2012).
GPN1은 GPN 루프 GTPase 1을 인코딩하며 2p23.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). GPN1은 뉴클레오티드 절단 복구 신호전달 경로를 제어하는 중대한 인자인 DNA 복구 유전자 XPA의 핵 국소화에 관여한다(Nitta et al., 2000).
GRIK2는 글루탐산염 수용체, 이오노트로픽(ionotropic), 카이나이트(kainite) 2를 인코딩한다. 이 유전자의 돌연변이는 보통 염색체 열성 정신 지체와 연관 지어졌다(RefSeq, 2002). TRMT11-GRIK2는 전립선암에서 발견된 여러 융합 전사체의 하나이며 종양 공격성과 연관이 있다(Yu et al., 2014). GRIK2 SNP는 구강암의 증가된 위험이나 감수성과 연관이 있다(Bhatnagar et al., 2012). GRIK2는 폐암에 대한 잠재적 바이오마커이다(Rauch et al., 2012). 염색체 결손에 의한 GRIK2 비활성화는 T 세포 림프종 발현에 기여할 수 있다. GRIK2 비활성화는 위 암 형성에서 역할을 한다(Resende et al., 2011; Lopez-Nieva et al., 2012).
GRIK3은 글루탐산염 수용체, 이오노트로픽, 카이나이트 3을 인코딩한다. 이것은 글루탐산염 수용체 계열에 속하며, 포유동물 뇌에서 뚜렷한 흥분 신경전달물질 수용체로서 다양한 정상적 신경생리학적 과정에서 활성화된다(RefSeq, 2002). GRIK3은 폐선암종(메틸화, 기능적 변형), 소아 중추신경계 종양, 림프구성 백혈병 및 신경모세포종과 연관이 있다(Pradhan et al., 2013). GRIK3은 여러 중추 신경계의 소아 종양에서 차등적으로 발현된다(Brocke et al., 2010).
GSK3B는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 베타를 인코딩한다. 이것은 에너지 대사, 신경 세포 발육 및 신체 모양 형성에 관여한다(RefSeq, 2002). GSK3B의 이상 조절은 일부 암에서의 세포 성장을 촉진시키고 다른 암에서는 억제시키며, 또한 식도암에서 중요한 역할을 할 수 있다(Gao et al., 2014b). GSK3B는 다형 아교모세포종에서 이상조절된다(Atkins et al., 2013). 이상조절된 GSK3B는 위장관암, 췌장암 및 간암을 촉진시킨다(Miyashita et al., 2009).
HLA-A는 세포질 세망 내강으로부터 유래하는 펩티드의 제시를 통해 면역계에서 중심 역할을 하는 주요 조직적합성 복합체 클래스 1 A를 인코딩한다(RefSeq, 2002). HLA-A 항원의 손실은 인간 종양에서 공통된 특징이다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C-양성 세포의 비율 감소, 특정 항원의 선택적 손실 및 클래스 1 분자 발현의 완전한 소실은 흑색종, 암종, 림프종, 신경아교모세포종 및 급성 백혈병에서 문서화되어 있다(Garrido and Ruiz-Cabello, 1991; Salerno et al., 1990). HLA-A 발현은 위암 및 식도암에서 MAPK 경로에 의해 두드러지게 조절되며, 임상적 종양 샘플에서 p-Erk 발현과 HLA 클래스 1 발현 사이의 강력한 역 상관관계를 갖는 Akt 경로에 의해 부분적으로 영향을 받는다(Mimura et al., 2013).
HNRNPU(SAF-A라고도 함)는 이질 핵 리보단백질(hnRNP)의 RNA 결합 아계열에 속하는 이질 핵 리보핵산단백질 U를 인코딩하며, 이는 pre-mRNA 초리 및 mRNA 대사의 다른 양상 및 핵 내에서의 수송에 관여한다. HNRNPU는 hnRNA의 커다란 리보핵산단백질 복합체로 포장하는데 관여하는 것으로 사료된다(RefSeq, 2002). 폐암 세포의 전이를 억제하는 miR-193a-3p의 상향조절은 HNRNPU의 발현을 하향조절시킨다(Deng et al., 2015b). 긴 비코드 RNA H19는 HNRNPU/PCAF/RNAPol II 단백질 복합체와의 연관을 통해 miR-200 경로를 활성화시킴으로서 간세포 암종에서 중간엽에서 상피로의 세포 이행 및 종양 전이의 억압에 기여한다(Zhang et al., 2013d). HNRNPU는 배아 및 성인 줄기 세포의 줄기세포능을 유지하는 주요 유전자이며 일부 인간 암에서 재활성화되는 것으로 보이는 SOX2와 상호작용한다(Fang et al., 2011).
HSPA2는 정모세포 및 암 세포의 성장에 필수적인 고환 특이적 열충격 단백질 70-2를 인코딩한다. 여러 연구에서 자궁경부암, 신세포 암종 및 방광암의 질병 진행에서 HSPA2의 중요한 역할이 시사되었다. 유전자 내부의 다형성은 위암의 발전과 연관이 있다(Ferrer-Ferrer et al., 2013; Garg et al., 2010a; Garg et al., 2010b; Singh and Suri, 2014).
HSPA8은 식도 편평 세포 암종에서 과발현되는 것으로 나타났다. 식도암 세포에서의 HSPA8의 높은 발현 수준은 이러한 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 산화성 스트레스 유도 세포자멸사에 반대작용을 보였다. 더욱이 HSPA8은 다발골수종 및 대장성 암종에서 과발현되며 HSPA8의 BCR-ABL1-유도 발현은 만성 다발 골수종에서 세포 생존을 촉진한다(Chatterjee et al., 2013; Dadkhah et al., 2013; Jose-Eneriz et al., 2008; Kubota et al., 2010; Wang et al., 2013a).
HSPA8P8은 위유전자이다(RefSeq, 2002).
HSPA9는 열충격 70kDa 단백질 9를 인코딩한다. 이 단백질은 세포 증식, 스트레스 반응 및 미토콘드리아의 보수유지에서 역할을 수행한다(RefSeq, 2002). HSPA9는 바이러스 감염부터 신경 퇴행까지의 세포 과정을 조절하며, 여기에는 암 형성도 포함된다(Flachbartova and Kovacech, 2013). HSPA9는 간세포 암종과 결장직장암에서 상향조절된다(Rozenberg et al., 2013; Chen et al., 2014a; Kuramitsu and Nakamura, 2005). HSPA9는 위암의 발전에서 역할을 한다(Ando et al., 2014). HSPA9는 약물 내성 난소암의 개선된 치료를 위한 가능한 치료 표적이다(Yang et al., 2013).
IGDCC4는 면역글로불린 상계열(superfamily), DCC 아분류(subclass), 구성원 4를 인코딩하며 15q22.31 염색체상에 위치한다(RefSeq, 2002). GDCC4는 간세포 암종에서 발현된다(Joy and Burns, 1988; Marquardt et al., 2011). GDCC4는 급성 림프모구 백혈병에서 발현된다(Taylor et al., 2007).
IGF2BP3은 인슐린 유사 성장 인자 II의 번역을 억제하는 종양 태아 단백질인 인슐린 유사 성장 인자 II mRNA 결합 단백질 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). 여러 연구에 의하면 IGF2BP3은 세포 분극 이동, 형태학, 대사, 증식 및 분화 등 세포 기능의 다양한 주요 양상에서 활동하는 것으로 나타났다. 시험관 내(in vitro) 연구에서는 IGF2BP3이 종양 세포 증식, 유착 및 침입을 촉진하는 것으로 나타났다. 더욱이 IGF2BP3은 공격적이고 진행성인 암과 연관이 있는 것으로 나타났다(Bell et al., 2013; Gong et al., 2014). IGF2BP3 과발현은 다수의 종양 유형, 예를 들어 신경 모세포종, 결장직장 암종, 간내 담관암종, 간세포 암종, 전립선암 및 신세포 암종에서 묘사되고 불량한 예후, 진행 종양 병기 및 전이와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Bell et al., 2013; Findeis-Hosey and Xu, 2012; Hu et al., 2014a; Szarvas et al., 2014; Jeng et al., 2009; Chen et al., 2011c; Chen et al., 2013; Hoffmann et al., 2008; Lin et al., 2013b; Yuan et al., 2009).
IPO5는 임포틴(importin) 베타 계열의 구성원인 임포틴 5를 인코딩한다. 임포틴은 핵공 복합체를 통한 단백질의 전위에 있어서 필수적이다(RefSeq, 2002).
IPO7은 임포틴 7을 인코딩한다. 임포틴 알파/베타 복합체 및 GTPase Ran은 고전적인 핵 국소화 신호로서 단백질의 핵 유입을 매개한다(RefSeq, 2002). IPO7은 암에서 빈번하게 과발현된다(Golomb et al., 2012). IPO7은 아교모세포종, 호지킨 림프종 및 유방암에서 이상조절된다(Jung et al., 2013; Ju et al., 2013; Nagel et al., 2014; Xue et al., 2015). IPO7은 전립선 암종에서 하향조절되는 microRNA 표적이다(Szczyrba et al., 2013). 결장직장 암종에서 IPO7 mRNA의 상승된 수준은 증가된 증식과 연관이 있다(Li et al., 2000).
IQGAP3은 세포 신호전달과 세포골격 사이의 경계면에서 작용하는 IQ-모티프-함유 GAP 계열의 구성원을 인코딩한다. IQGAP3은 Rac1/Cdc42-촉진 신경돌기 증식을 조절하며 칼모둘린(calmodulin)과 미오신(myosin) 경쇄와 직접 상호작용한다(Wang et al., 2007; Atcheson et al., 2011). IQGAP3은 폐암에서 과발현되며 종양 세포 성장, 이동 및 침입과 연관이 있다. 더욱이 이것은 간세포 암종에서 염색체 증폭에 의해 상향조절되고, IQGAP3의 발현은 생존율이 불량한 p53-변이 결장직장암 환자에서 증가한다(Katkoori et al., 2012; Yang et al., 2014b; Skawran et al., 2008). IQGAP3은 EGFR/Ras/ERK 신호전달 연쇄반응을 조정하고 Rac/Cdc42와 상호작용한다(Yang et al., 2014b; Kunimoto et al., 2009).
KDELR1은 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 소포체 단백질 유지 수용체 1을 인코딩한다. KDELR1은 효모 ERD2 유전자 생성물과 구조적으로 및 기능적으로 유사하다(RefSeq, 2002). KDELR1은 종양 형성에서 역할을 한다(Yi et al., 2009). 감소된 KDELR1 수준은 간암 세포에서 발견된다(Hou et al., 2015). KDELR1의 하향조절은 급성 골수성 백혈병에서 나타난다(Caldarelli et al., 2013).
KPNA2는 카리오페린(karyopherin) 알파 2를 인코딩한다. KPNA2는 단백질의 핵 수송에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002). KPNA2 발현은 상피성 난소암에서 이상조절된다(Lin et al., 2015). KPNA2는 작은 종양에 비해 커다란 구강 편평 세포 암종에서 하향조절된다(Diniz et al., 2015). KPNA2는 주요 단백질의 이상 국소화 및 유방암의 불량한 예후에 기여한다(Alshareeda et al., 2015). KPNA2의 발현은 상부 요로 요로상피 암종 및 자궁내막암에서 유의하게 상향조절된다(Ikenberg et al., 2014; Shi et al., 2015). KPNA2는 간세포 암종에서 종양 성장을 촉진시킨다(Hu et al., 2014b).
KRT19는 케라틴 계열의 구성원을 인코딩한다. 케라틴은 상피 세포의 구조적 무결성에 대한 책임이 있는 중간 미세섬유 단백질이며 사이토케라틴 및 털 케라틴으로 더욱 분류된다. KRT19는 구체적으로는 발육 중 표피를 싸는 일과성 표재층인 외표피에서 발현된다(RefSeq, 2002). 종양 세포에서의 KRT19 발현은 유방, 폐, 난소 및 간세포의 암과 같은 여러 종양 객체를 위한 예후 표지자이다(Skondra et al., 2014; Gao et al., 2014b; Liu et al., 2013b; Lee et al., 2013a). KRT19는 췌장 신경 내분비 종양 특히 인슐린 음성 종양에 필요한 독립적 예후 인자로 나타난 바 있다. KRT19 양성 종양은 크기, 유사분열, 림프혈관 침입 및 괴사와 같은 확립된 병리학적 매개변수와 무관하게 불량한 결과와 연관이 있다(Jain et al., 2010).
KRT8(CK8이라고도 함)은 케라틴 18과 이합체화되어 단일층 상피 세포에서 중간 미세섬유를 형성하는 II형 케라틴 계열의 구성원을 인코딩한다. KRT8은 세포 구조의 무결성 유지에서 역할을 수행하며 또한 신호전달 및 세포 분화에서도 기능을 한다(RefSeq, 2002). KRT8은 폐암, 전립선암 및 유방암 등 여러 암 세포에서 상향조절되고 분비된다. KRT8의 높은 수준은 증가된 이동 및 침입과 상관관계가 있다(Gonias et al., 2001; Kuchma et al., 2012; Fukunaga et al., 2002; Takei et al., 1995). MEK/ERK 경로는 Ser431에서의 스핑고실포스포리콜린 유도 KRT8 인산화를 조절한다. 이것은 케라틴 세포골격 재조직화를 초래하고 결과적으로 종양 세포의 이동을 강화시킨다(Busch et al., 2012). 종양 억제인자인 SMAR은 KRT8 발현을 하향조절하며 이것은 세포의 이동 및 침입성을 감소시킨다(Pavithra et al., 2009; Mukhopadhyay and Roth, 1996).
KRT8P44는 케라틴 8 위유전자 44를 인코딩하며 이것은 6q26 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002).
MACC1은 세포 성장, 상피-중간엽 이행, 혈관생성, 세포 이동성, 침입성 및 전이에 관여하는 간세포 성장 인자(HGF) 수용체 경로의 주요 조절 인자이다(RefSeq, 2002). MACC1은 위암, 결장직장암 및 유방암 등 다수의 암 객체에서 과발현되며, 환자의 암 진행, 전이 및 불량한 생존율과 연관이 있다(Huang et al., 2013; Ma et al., 2013; Stein, 2013; Wang et al., 2015a; Wang et al., 2015c; Ilm et al., 2015). MACC1은 베타-카테인의 표적 및 PI3K/AKT 신호전달 경로를 통한 암 형성을 촉진시키며, 이는 c-Met 및 베타-카테인 및 c-Myc, 사이클린 D1, caspase9, BAD 및 MMP9 등 이들의 하류 표적 유전자의 증가를 초래한다(Zhen et al., 2014; Yao et al., 2015).
MAGED2는 X-염색체 연관 정신 지체의 민감점인 Xp11.2에서 새로 정의된 MAGE-D 클러스터의 구성원이며 흑색종 항원 계열 D, 2를 인코딩한다. MAGED2는 도처에서 발현되며 특정 뇌의 영역에서 및 고환의 간질에서 발현 수준이 높다. MAGED2는 야생형 p53 활성도의 잠재적 음성 조절인자이다(Langnaese et al., 2001; Papageorgio et al., 2007). MAGED2 과발현은 흑색종, 유방암 및 결장암과 연관이 있다(Li et al., 2004; Strekalova et al., 2015).
MAN2A1은 만노시다아제 알파 클래스 2A, 구성원 1을 인코딩하며 골지체에 국소화되어 있는데, 아스파라긴 연관 올리고당 성숙화 경로에서 마지막 단계를 촉매한다(RefSeq, 2002). 스와인소닌은 MAN2A1을 억제하여 베타 1,6-분지 N-연결 글리칸의 생성 억제를 초래하는데, 이는 종양 세포의 악성 표현형과 관련이 있다(Yagel et al., 1990; Gerber-Lemaire and Juillerat-Jeanneret, 2010; Santos et al., 2011; Przybylo et al., 2005; Dennis and Laferte, 1987; Baptista et al., 1994; Goss et al., 1994; Fujieda et al., 1994; Korczak and Dennis, 1993; Roberts et al., 1998; Goss et al., 1997; Goss et al., 1995; Seftor et al., 1991). MAN2A1의 SNP는 아동 급성 림프모구 백혈병과 강력히 연관된다(Han et al., 2010).
MAP1A는 미세관 연관 단백질 1A를 인코딩하며, 이는 신경발생의 필수 단계인 미세관 조립에 관여한다(RefSeq, 2002). MAP1A는 레티노산 유도 P19 배아 암종 세포에 축적된다(Vaillant and Brown, 1995). MAP1A는 전립선암의 종양 주위 간질에서 하향조절된다(Zhu et al., 2015b). MAP1A는 세포 증식에서 역할을 할 수 있다(Matsuno et al., 2004). 다누세르팁은 유방암에서 막결합 MAP1A의 발현 수준을 유의하게 증가시킨다(Li et al., 2015c). 바이칼레인은 간세포 암종 세포주 HepG2에서 MAP1A를 상향조절한다(Wang et al., 2015l). MAP1A는 피부 편평 세포 암종에서 p62와 역으로 상관관계가 있다(Yoshihara et al., 2014). 감마-토코트리엔올은 MAP1A를 세포질에서 지질화 아이소형으로의 변환 증가를 유도한다(Tiwari et al., 2014).
MAT2A는 메티오닌 및 ATP로부터 S-아데노실메티오닌의 생성을 촉매하는 메티오닌 아데노실트란스페라제 2A를 인코딩한다(RefSeq, 2002). MAT2A는 타목시펜 내성 MCF-7 유방암 세포에서 상향조절된다(Phuong et al., 2015). 결장암에는 수모화된(sumoylated) 및 총 MAT2A의 더 높은 수준이 있다. Ubc9, Bcl2 및 MAT2A 사이의 상호작용은 암 세포의 성장 및 생존을 강화시킨다(Tomasi et al., 2015). MAT2A 발현은 신세포 암종에서 및 S-아데노실메티오닌으로 치료된 간세포 암종 세포주 WCH17에서 하향조절된다(Kuang et al., 2014; Wang et al., 2014b). MAT1A:MAT2A 스위치는 간세포 암종에서 통괄 DNA 저메틸화, 감소된 DNA 복구, 게놈 불안정성 및 신호전달 탈조절과 연관이 있다(Woodburn et al., 2013; Frau et al., 2013). MAT2A는 간세포 세포 암종, 위암 및 결장암에서 상향조절된다(Frau et al., 2012; Zhang et al., 2013e; Tomasi et al., 2013; Frau et al., 2013; Lo et al., 2013). MAT2A는 위암 환자에서 종양 분류, 림프절 전이 및 불량한 종양 분화와 상관관계가 있다(Liu et al., 2011b; Zhang et al., 2013e). MAT2A는 종양단백질 MafK의 전사 보조억제물질(co-repressor)이다(Katoh et al., 2011). MAT2A는 간암에서 종양의 성장 및 진행과 관련이 있다(Vazquez-Chantada et al., 2010; Liu et al., 2011a; Lu and Mato, 2008).
MBTPS2는 전사의 스테롤 제어에 관여하는 단백질이 신호전달을 활성화시키는 멤브레인 임베디드 아연 금속 단백질 분해효소이며 ER 스트레스 반응에서 역할을 한다(Oeffner et al., 2009).
MCM4는 진핵 게놈 복제의 개시에 필수적인 미니염색체 유지 복합체 구성요소 4를 인코딩한다(RefSeq, 2002). MCM4 발현은 식도암 등 여러 객체에서 감소된 생존 및 암 진행과 상관관계가 있는 막횡단 당단백질인 탄산 무수화효소 IX의 상향조절과 연관이 있다.(Huber et al., 2015). Has-miR-615-3p는 MCM4의 조절에 의해 비인두 암종에 관여될 수 있다(Chen et al., 2015b). MCM4는 방광암의 발생에서 역할을 할 수 있다(Zekri et al., 2015). p53의 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이는 유방암에서 MCM4의 발현을 증가시킨다(Polotskaia et al., 2015). 감소된 DNA 헬리카아제 활성도를 보여주는 인간 피부암에는 MCM4의 돌연변이가 있다(Ishimi and Irie, 2015). 유방암에서 MCM4 과발현만으로는 보다 짧은 생존 기간과 약한 연관이 있다. MCM 복합체의 여섯 부분 모두의 과발현은 보다 긴 생존 기간과 약한 연관이 있다(Kwok et al., 2015). MCM4는 폐 선암종 및 후두 편평 세포 암종에서 차등적으로 발현된다(Lian et al., 2013; Zhang et al., 2014c). MCM4는 자궁경부암에서 유의하게 과발현된다(Das et al., 2013; Das et al., 2015). MCM4는 결장직장암의 바이오마커로 사용될 수 있다(Fijneman et al., 2012).
MIER1(MI-ER1이라고도 함)은 아프리카발톱개구리(Xenopus leavis)에서 처음 확인된 전사 조절인자를 인코딩한다(RefSeq, 2002). MIER1은 만성 골수성 백혈병(CML) 및 유방암에서 상향조절되며, 또한 핵 전사 변이체 알파의 손실은 암의 진행 및 증식과 연관이 있다(McCarthy et al., 2008; Ding et al., 2003; Mascarenhas et al., 2014). 전사 억압인자 MIER1은 HDAC1과의 상호작용으로 인해 기능한다(Ding et al., 2003).
MIR2861은 mRNA의 안정성 및 번역 모두에 영향을 미침으로써 전사후 조절에 관여하는 짧은 비코드 RNA이다(RefSeq, 2002). MIR2861 발현은 림프절 전이가 없는 PTC에 비해 림프절 전이가 있는 유두 갑상선 암종(PTC)에서 상향조절된다(Wang et al., 2013f).
MLEC는 I형 막고정 ER 단백질인 말렉틴(malectin)을 인코딩한다. MLEC는 Glc2Man9GlcNAc2(G2M9) N-글리칸에 대한 친화도가 있으며 ER에서 글리코실화의 조절에 관여한다. MLEC는 리보포린 I과도 상호작용하는 것으로 나타났으며 잘못 접힌 단백질의 퇴행에 대한 지시에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002; Pierce and Taniguchi, 2009). MLEC는 결장직장암에서 탈조절되며 아교모세포종에서는 강화된다(Sethi et al., 2015; Demeure et al., 2016). MLEC는 갑상선 유두상 암종에 대한 바이오마커일 수 있다(Ban et al., 2012).
MVP는 복수의 세포 과정에서 MAPK, JAK/STAT 및 PI3K/Akt 신호전달 경로의 조절에 의해 역할을 할 수 있는 단백질인 볼트 복합체(vault complex)의 주요 구획을 인코딩한다. 또한 다중약물 내성, 선천 면역성, 세포 생존 및 분화에서도 역할을 하며, 이 유전자의 발현은 여러 유형의 암에 대한 예후 표지자일 수 있다(RefSeq, 2002; Tucci et al., 2009; Lara et al., 2011; Scagliotti et al., 1999; van den Heuvel-Eibrink MM et al., 2000; Perez-Tomas, 2006; Scheffer et al., 2000; Ramachandran, 2007; Sekine et al., 2007; Lu and Shervington, 2008). MVP는 여러 중추 신경계 종양에서 고도로 발현된다(Yang et al., 2012a). MVP는 암에서 및 여러 화학요법 내성의 암 세포주에서 고도로 발현된다(Szaflarski et al., 2011; Mossink et al., 2003). MVP 발현 수준은 연령에 따라 증가하고 세포자멸사 내성을 원활하게 한다(Ryu and Park, 2009).
MYBBP1A(p160이라고도 함)는 Myb 원암유전자(proto-oncogene) 단백질에 결합하는 능력에 의해 처음 확인된 핵소체 전자 조절 인자를 인코딩한다. MYBBP1A는 핵소체 스트레스에 대한 반응, 종양 억제, 리보솜 DNA의 합성 등 다수의 세포 과정에서 역할을 할 수 있다(RefSeq, 2002). MYBBP1A는 폐암, 유방암, 두경부암 등 여러 암 객체에서 탈조절된다. 이것은 세포 증식 및 전이와 연관이 있다(Bidkhori et al., 2013; George et al., 2015; Acuna Sanhueza et al., 2012; Akaogi et al., 2013). MYBBP1A는 p53 활성화는 물론 Myb 결합을 통해 전사 활성도를 촉진하며, 염색체 분리의 제어에 영향을 미침으로써 G2/M 정지 또는 이상 유사분열을 유도하도록 세포 주기 및 유사분열을 조절한다(Tavner et al., 1998; Tsuchiya et al., 2011; Mori et al., 2012; Ono et al., 2013).
NCAPD2(CNAP1이라고도 함)는 염색체 응축에 관여하고 알츠하이머병과 연관있는 비-SMC 콘덴신 I 복합체 아단위 D2를 인코딩한다(Ball, Jr. et al., 2002; Zhang et al., 2014b). NCAPD2 과발현은 종양 진행 동안 증폭 및 변이와 함께 난소암 발생에서 발견되었다(Emmanuel et al., 2011).
NCAPG는 유사분열 및 감수분열 동안 염색체의 응축과 안정화에 대해 책임이 있는 비-SMC 응축 I 복합체 아단위 G를 인코딩한다(RefSeq, 2002). NCAPG는 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 및 혈액의 백혈병 세포나 골수종 세포의 환자에서 하향조절된다(Cohen et al., 2014). NCAPG는 결장직장암에서 복수약물 내성 유전자일 수 있다(Li et al., 2012). NCAPG는 인간 세포 암종의 염색소성 아형에서는 고도로 상향조절되지만 일반 인간 신세포 암종에서는 그렇지 않다(Kim et al., 2010a). NCAPG의 상향조절은 흑색종 진행과 연관이 있다(Ryu et al., 2007). NCAPG는 포도막 흑색종과 연관이 있다(Van Ginkel et al., 1998). NCAPG는 여러 종양 세포에서 다양한 발현을 나타낸다(Jager et al., 2000).
NLE1은 여러 신호 경로를 통해 배아 발육에 관여하는 노치레스(notchless) 상동체이고 WD40-repeat 단백질 계열의 구성원이며, 리보솜 성숙화에서 역할을 하는 것으로 보인다(Beck-Cormier et al., 2014; Romes et al., 2016; Lossie et al., 2012).
NOMO1(PM5라고도 함)은 척추동물의 발생 과정 동안 노달(Nodal) 신호전달 경로에 참여하는 단백질 복합체의 일부일 수 있는 단백질인 노달 조정인자 1을 인코딩한다(RefSeq, 2002). NOMO1은 전립선암과 T 세포 림프종 세포에서 탈조절된다(Stubbs et al., 1999; Lange et al., 2009).
NOMO2는 척추동물의 발생 과정 동안 노달 신호전달 경로에 참여하는 단백질 복합체의 일부일 수 있는 단백질인 노달 조정인자 2를 인코딩한다(RefSeq, 2002). NOMO2는 상피 종양 세포의 과밀에 대한 반응일 수 있는 전침습적 게놈 시그내쳐의 일부로서 자궁경부 상피내종양(CIN) 3 및 자궁경부암으로의 전이 동안 상피/간질 세포 경계에서 상향조절된다(Gius et al., 2007).
NOMO3은 척추동물의 발생 과정 동안 노달 신호전달 경로에 참여하는 단백질 복합체의 일부일 수 있는 단백질인 노달 조정인자 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). NOMO3은 배소세포 폐암에서 DNA 메틸화에 의해 탈조절된다(Mullapudi et al., 2015). NOMO3은 난소암 조직에서 글리코실화와 연관있는 보강된 막 단백질이다(Allam et al., 2015).
NONO(p54nrb라고도 알려짐)는 비-POU 도메인 함유, 팔합체 결합을 인코딩한다. NONO는 전사 조절 및 RNA 스플라이싱 등 핵에서 다양한 역할을 하는 RNA 결합 단백질이다. 이 유전자와 전사 인자 E3 사이의 재배열이 유두형 신세포 암종에서 관찰되었다(RefSeq, 2002; Macher-Goeppinger et al., 2012). NONO 발현은 혈관 침습 및 감소된 생존율과 강한 상관관계가 있다(Barboro et al., 2008). 푸로스피노슐린은 저산소증에 적응된 암 세포의 성장을 선택적으로 억제하는데 이는 NONO와의 직접 결합을 통해서일 수 있다(Arai et al., 2016). NONO는 MIA/CD-RAP 작용을 매개하여 악성 흑색종의 연골형성 및 진행을 촉진시킨다(Schmid et al., 2013). NONO 발현은 c-Myc, 시클린 D1 및 CDK4의 발현과 상관관계가 있다(Nelson et al., 2012). YB-1 과발현의 결장직장암에서 NONO의 넉아웃(Knock-out)은 옥살리플라틴에 대해 이 암을 민감하게 할 수 있다(Tsofack et al., 2011). 심바스타틴은 NONO를 강하게 하향조절하며 흑색종 진행을 감소시킨다(Schiffner et al., 2011; Zanfardino et al., 2013). NONO는 유방암과 흑색종에서 과발현된다(Schiffner et al., 2011; Zhu et al., 2015d).
NPC1은 엔도솜 및 리소솜의 경계막에 상주하는 커다란 단백질인 니만-피크병, C1형을 인코딩하며, 이 단백질의 N-말단 도메인에 대한 콜레스테롤 결합을 통해 세포간 콜레스테롤 이동을 매개한다(RefSeq, 2002). 식도암에서 NPC1의 촉진인자는 저메틸화되며 NPC1 발현은 상향조절된다(Singh et al., 2015). NPC1은 동계(isogenic) 전이성 암세포주, 인간 배아 줄기 세포 및 인간 배아 암종 세포에서 차등적으로 발현된다(Lund et al., 2015; Dormeyer et al., 2008). NPC1 탈조절은 Akt에 의해 조절된다. 그리하여 NPC1은 자궁경부암에서 세포 증식과 이동에 관련된다(Du et al., 2015). 실데나필에 의한 치료는 NPC1 발현을 감소시키고 뇌암 줄기 세포를 죽인다(Booth et al., 2015). 콜레스테롤 흡수에 대한 NPC1를 포함하여 콜레스테롤 대사의 억제인자는 암 치료에 유익한 것으로 사료된다(Ali-Rahmani et al., 2014). NPC1은 TNF-알파-내성 MCF-7 유방 선암종 세포에서 상향조절된다(Vincent et al., 2010; Moussay et al., 2011).
NPC2는 후기 엔도솜/리소좀계를 통한 콜레스테롤 수송의 조절에 있어서 기능할 수 있는 지질 인지 도메인이 있는 단백질을 인코딩한다. 이 유전자에서의 돌연변이는 니만-피크병 및 전두엽 위축과 연관이 있다(RefSeq, 2002). NPC2는 유방암, 결장암, 폐암, 신장암, 간암 등 여러 암 객체에서 탈조절된다(McDonald et al., 2004; Garcia-Lorenzo et al., 2012; Liao et al., 2013). NPC 관련 콜레스테롤 교란은 비정상적 신호전달 경로를 유도하여 p38 MAPK 활성화, Mdm2 매개 p53 탈조절, ROCK 활성화 및 증가된 RhoA 합성을 초래한다(Qin et al., 2010).
NUP160은 핵질 수송을 매개하는 핵공 복합체의 일부인 160kDa의 뉴클레오포린(nucleoporin)을 인코딩한다(RefSeq, 2002). NUP160-SLC43A3은 혈관육종에서 재발 융합 종양유전자이며 종양 진행과 연관이 있다(Shimozono et al., 2015).
NUP205는 뉴클레오포린 205kDa를 인코딩한다(RefSeq, 2002). NUP205는 TMEM209에 의해 안정화된다. 이 상호작용은 폐암 증식에 있어서 중대한 구동인자이다(Fujitomo et al., 2012).
NUP98은 핵 유입, 핵 유출, 유사분열 진행, 유전자 발현의 조절 등 다수의 세포 과정에 참여하는 뉴클레오포린 98kDa를 인코딩한다. 이 유전자와 다른 다수의 파트너 유전자 사이의 전위가 여러 백혈병에서 관찰된 바 있다. 재배열은 전형적으로 키메라를 초래하며 이 유전자의 N-말단 GLGF 도메인이 파트너 유전자의 C-말단으로 향한다(RefSeq, 2002). NUP98 재배열은 생쥐의 백혈병을 유도한다. 이것은 원발성 인간 조혈 전구체에서 증식을 강화시키고 분화를 방해한다(Takeda and Yaseen, 2014). 호메오박스(homeobox) 유전자의 이상조절은 NUP98 재배열을 유발하며, 백혈병 전환을 초래한다(Gough et al., 2011; De et al., 2014; Slape and Aplan, 2004; Grier et al., 2005; Abramovich et al., 2005; Nakamura, 2005; Shimada et al., 2000; Argiropoulos and Humphries, 2007). NUP98은 조혈 악성종양에서 여러 파트너와 재배열을 하는데, 급성 골수성 백혈병, 모세포 위기에서 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 급성 림프모구 백혈병, 양표현성 백혈병이 포함된다(Tosic et al., 2009; Haznedaroglu and Beyazit, 2010; Shi et al., 2011; Gough et al., 2011; Panagopoulos et al., 2003; Morerio et al., 2006; Moore et al., 2007; Ahuja et al., 2001; McCormack et al., 2008; Lam and Aplan, 2001). NUP98은 종양 형성과 관련이 있다(Xu and Powers, 2009; Simon and Rout, 2014). NUP98은 게놈 안정성의 조정인자이며 종양 발전의 억제인자이다(Rao et al., 2009).
OXSR1은 산화성 스트레스에 대응하여 하류 키나아제를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제를 인코딩하며, 액틴 세포골격의 조절에서 역할을 할 수 있다(RefSeq, 2002). OXSR1은 인간 유방암 환자의 종양 기질(tumor stroma)에서 상향조절되며 재발과 연관이 있다(Pavlides et al., 2010).
PCSK9는 서브틸리신 유사 전단백질 전환효소 계열의 구성원을 인코딩하며, 분비 경로의 조절 또는 기본구성 가지를 통해 단백질 및 펩티드 전구체 이동을 처리하는 단백분해효소가 포함된다. 이것은 콜레스테롤 및 지방산 대사에서 역할을 한다(RefSeq, 2002). PCSK9는 간암, 폐암, 위암 등 여러 암 객체에서 탈조절된다(Bhat et al., 2015; Marimuthu et al., 2013; Demidyuk et al., 2013). PCSK9 결핍은 콜레스테롤 수준을 낮추는 능력에 의해 및 TNF알파 매개 세포자멸사의 강화에 의해 간 전이를 감소시킨다. 다른 연구에서 대조적으로 암 위험에 대한 콜레스테롤 수준의 영향이 없음을 보여준다(Folsom et al., 2007; Sun et al., 2012).
PDAP1은 섬유모세포의 PDGFA 촉진 성장을 상향조절할 수 있으며 또한 PDGFB의 분열촉진성을 하향조절할 수 있는 인단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002). PDAP1은 위암과 직장암 등 여러 암 유형에서 과발현되며, 따라서 바이오마커 역할을 할 수 있다(Choi et al., 2011; Marimuthu et al., 2013).
PDIA3(ERp57이라고도 알려짐)은 렉틴 섀퍼론, 칼레티큘린 및 칼넥신과 상호작용하여 새로 합성된 당단백질의 접힘을 조정하는 소포체의 단백질이 이황화 이성화효소 계열 A 구성원 3의 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002; Coe and Michalak, 2010). PDIA3은 바이오마커로서 및 종양의 진단에 사용할 수 있다(Shishkin et al., 2013). PDIA3은 신경아교종에서 차등적으로 발현된다(Deighton et al., 2010). PDIA3은 암과 알츠하이머병 등 인간 병리학에 연루된다(Coe and Michalak, 2010). PDIA3은 바이러스 및 자기 펩티드를 MHC 클래스 I에 부하하는 TAP의 보조인자이다(Coe and Michalak, 2010; Abele and Tampe, 2011).
PFDN1은 새로 합성된 폴리펩티드에 결합하여 안정화시킴으로써 올바로 접힐 수 있도록 하는 분자 섀퍼론 복합체이며 프리폴딘의 6개 아단위의 하나인 프리폴딘 아단위 1을 인코딩한다(RefSeq, 2002). PFDN1은 결장직장암의 진행에 관여하며, 종양 크기와 침입과 양의 상관관계가 있다(Wang et al., 2015e). PFDN1은 결장직장암 등 여러 암에서 상향조절된다(Wang et al., 2015e). PFDN1은 비인두 암종에서 기준 유전자로 사용이 가능하다(Guo et al., 2010).
PHB는 인간 세포 노화와 종양 억제에서 역할을 하는 것으로 제안된 프로히비틴(prohibitin)을 인코딩한다(RefSeq, 2002; Mishra et al., 2010; Theiss and Sitaraman, 2011; Zhou and Qin, 2013; Mishra et al., 2005; McClung et al., 1995; Rajalingam and Rudel, 2005). PHB는 세포 성장 및 악성 전환에 관여하는 Raf/MEK/ERK 경로를 활성화시킨다(Rajalingam and Rudel, 2005). PHB는 방사선요법에 대한 치료 반응을 예측하는 비인두 암종에서의 잠재적 바이오마커이다(Chen et al., 2015e). PHB는 약물내성 암 세포, 약물 작용 및 질병 상태 조직의 단백질체 분석에서 확인되었다(Guo et al., 2013). PHB는 다수의 암 객체에서 과발현된다(Zhou and Qin, 2013). C형 간염 바이러스의 핵심 단백질은 간세포 암종의 주요 위험 인자이며, 프로히비틴의 부전에 의해 산화성 스트레스의 과다생성을 유도한다(Theiss and Sitaraman, 2011; Schrier and Falk, 2011; Koike, 2014). PHB는 신경아교종에서 차등적으로 발현된다(Deighton et al., 2010).
PKM2는 피루브산염 키나아제, 근육, 당분해에 관여하는 단백질을 인코딩한다. PKM2는 갑상선 호르몬과 상호작용하여 갑상선 호르몬에 의해 유도되는 세포의 대사 효과를 매개할 수 있다. 이것은 또한 세균의 발병 기전에 관여하는 것으로도 사료된다(RefSeq, 2002; Israelsen and Vander Heiden, 2015). PKM2는 암 세포의 증식과 종양 성장에 중대한 것으로 나타났다(Chen et al., 2014b; Li et al., 2014c; DeLaBarre et al., 2014). N-myc는 수모세포종에서 PKM2의 전사 조절인자로서 작용한다(Tech et al., 2015). PKM2는 간암발생, 상피 중간엽 이행 및 혈관생성에서 역할을 하는 것으로 보인다(Nakao et al., 2014). PKM2는 종양학에서 와버그 효과에 대한 2가지 주요 인자 중 하나이다(Tamada et al., 2012; Warner et al., 2014; Ng et al., 2015). PKM2의 발현은 암 세포에서 상향조절된다(Chaneton and Gottlieb, 2012; Luo and Semenza, 2012; Wu and Le, 2013). 악성종양 세포에서 PKM2는 전사 활성보체로서 및 단백질 키나아제로서 이화작용에서 기능한다. 이것은 후자의 기능에서 핵으로 전위하여 히스톤 3을 인산화시켜, 최종적으로 아교모세포종에서 세포 주기의 진행을 초래한다(Semenza, 2011; Luo and Semenza, 2012; Tamada et al., 2012; Venneti and Thompson, 2013; Yang and Lu, 2013; Gupta et al., 2014; Iqbal et al., 2014; Chen et al., 2014b; Warner et al., 2014). 낮은 활성도의 이합체 PKM2는 활성 사합체 형태 대신 암에서 역할을 할 수 있다(Mazurek, 2011; Wong et al., 2015; Iqbal et al., 2014; Mazurek, 2007).
PKP3은 데스모솜과 핵에 국소화하며 카드헤린을 세포골격의 중간 미세섬유에 대한 연계에 참여하는 아마딜로 반복(arm-repeat) 및 플락토필린 계열의 구성원인 플락토필린(plakophilin), 3을 인코딩한다. PKP3은 세포 데스모솜 의존 유착 및 신호전달 경로에서 작용할 수 있다(RefSeq, 2002). 위장관암 환자의 혈액에서 PKP3 mRNA의 증가는 질병 결과에 대한 바이오마커 및 예측인자로서 사용할 수 있다(Valladares-Ayerbes et al., 2010). PKP3의 과발현은 유방암, 폐암 및 전립선암에서의 불량한 결과와 상관관계가 있었던 반면, 방광암에서의 하향조절은 침습성 거동과 관련이 있다(Furukawa et al., 2005; Breuninger et al., 2010; Demirag et al., 2012; Takahashi et al., 2012). PKP3의 손실은 MMP7 및 PRL3의 증가된 단백질 수준으로 이어지고, 이는 세포 이동 및 종양 형성에 요구된다(Khapare et al., 2012; Basu et al., 2015b).
PLEC에 대한 유전자는 세포골격 및 유착 복합체의 교차결합과 조직에 관여하는 단백질인 플라킨(plakin) 계열 구성원 플렉틴(plectin)을 인코딩한다(Bouameur et al., 2014). PLEC는 결장직장 선암종, 두경부 편평 세포 암종 및 췌장암에서 과발현된다(Lee et al., 2004; Katada et al., 2012; Bausch et al., 2011).
PLXNA2는 세마포린 보조수용체인 플렉신(plexin) A2를 인코딩한다. PLXNA2는 세마포린 3A 및 3C로부터 신호를 변환시키는 것으로 사료된다(RefSeq, 2002). KIAA1199는 PLXNA2에 결합하여 EGFR의 안정화 및 신호전달을 통해 세마포린 3A 매개 세포사의 억제를 초래한다(Shostak et al., 2014). PLXNA2는 TMPRSS2-ERG-양성 전립선암과 전이성 전립선암에서 상향조절되어 세포 이동 및 침입의 강화를 초래한다(Tian et al., 2014). PLXNA2는 공격성이 더 센 유방암에서 더 높은 수준으로 발현되며 종양형성과 연관이 있다(Gabrovska et al., 2011).
POLA2는 촉매 아단위 A 및 프리마아제 복합체를 묶음으로써 DNA 복제에서 중요한 역할을 하는 DNA 폴리머라아제 알파(70/68kDa 또는 B 아단위라고도 함)의 보조 아단위를 인코딩 한다(Collins et al., 1993; Pollok et al., 2003). POLA2는 위장관 기질 종양 및 비소세포 폐암 등 여러 암 유형에서 탈조절된다(Mah et al., 2014; Kang et al., 2015). S기 동안 POLA2는 종말체에 부착된다. 이것은 종말체의 활성도와 연관이 있으며, 메꿔넣기(fill-in) 합성을 통한 적절한 종말체 오버행(overhang) 처리를 위해 중요하다(Diotti et al., 2015).
PPM1G는 단백질 인산분해효소인 Mg2+/Mn2+ 의존, 1G를 인코딩한다. 이 단백질은 전-mRNA 스플라이싱 인자의 탈인산화를 맡는 것으로 나타났으며, 기능적 스플라이스솜의 형성에 중요하다(RefSeq, 2002). PPM1G는 세포 p73 및 DeltaNp73를 차등적으로 분화시키는 E3 리가아제 WWP2를 조절한다(Chaudhary and Maddika, 2014). PPM1G는 다양한 객체에서 고유하게 과발현되는 p53의 세포자멸사 촉진 단백질에 결합할 수 있다(Skene-Arnold et al., 2013). PPM1G는 탈인산화에 의해 USP7S를 하향조절하며 이로써 p53 축적이 초래된다(Khoronenkova et al., 2012).
PPP1R15B는 단백질 인산화효소-1(PP1) 상호작용 단백질을 인코딩한다. PPP1R15B는 PP1 촉매 아단위의 모집을 통해 전사 개시 인자 EIF2-알파의 탈인산화를 촉진시킨다(RefSeq, 2002). PPP1R15B의 하향조절은 세포 주기에서 G1에서 S로의 성공적이지 못한 이행으로 인해 증식의 부전을 초래하며, 이로써 카스파아제 3/7의 활성도 증가에 의한 세포자멸사의 유도와 ER알파 활성도의 조절을 초래한다(Shahmoradgoli et al., 2013).
PPY는 췌장의 랑게르한스 소도에서 95개 아미노산 폴리펩티드 전구체로서 합성되는 단백질을 인코딩한다. 이것은 다음 두 개의 펩티드 생성물로 절단된다; 36개 아미노산의 활성 호르몬 및 기능을 모르는 이코사펩티드. 호르몬은 췌장 및 위장관 기능의 조절인자로서 작용하며 음식물 섭취의 조절에 중요할 수 있다(RefSeq, 2002). 췌장암에 대한 속발성 당뇨병 환자는 2형 당뇨병 환자에 비해 혼합식에 대해 무딘 PPY 반응을 갖는다. 그러나 무딘 PPY 반응은 췌장의 머리 부분에 종양이 위치한 췌장 암종 환자에서만 관찰된다(Hart et al., 2015).
PRKDC는 DNA 의존 단백질 키나아제(DNA-PK)의 촉매 아단위를 인코딩한다(RefSeq, 2002). PRKDC는 자궁내막증 연관 난소암 및 유방암에서 빈번히 변이되는 유전자이다(Er et al., 2016; Wheler et al., 2015). PRKDC는 결장직장 암종에서 정상 조직에 비해 암성 조직에서 상향조절된다. PRKDC 발현이 높은 환자는 전체 생존율이 더 불량하다(Sun et al., 2016b).
PSEN1은 알츠하이머병에 관련된 프레세닐린(presenilin) 1을 인코딩한다. 이것은 노치 활성화에 요구되는 감마-세크레타아제의 일부이다(RefSeq, 2002; Ponnurangam et al., 2015). 작은 방해하는 RNA에 의한 PSEN1의 과발현은 약물유발 세포사에 대해 화학적 내성이 있는 방광암 세포를 감작화시킨다(Deng et al., 2015a). PSEN1은 E-카드헤린의 하향조절에 의한 상피-중간엽 이행 및 화학요법 내성에 중요한 역할을 한다(Sehrawat et al., 2014; Dinicola et al., 2016). TRAF6 매개 PSEN1 활성화는 종양 침입성의 촉진을 초래한다(Gudey et al., 2014; Sundar et al., 2015). 감마-세크레타아제 복합체의 하향조절된 발현은 유방암 특이적 사망율의 위험 요인으로 사료된다(Peltonen et al., 2013). PSEN1은 이상조절된 노치 1에 의해 유발되는 T 세포 급성 림프모구 백혈병에서 차등적으로 발현된다(Paryan et al., 2013). PSEN1은 구강 편평 세포 암종 세포주 및 구강 편평 세포 암종 조직으로부터 분리된 구강 각질형성 세포에서 과발현된다. PSEN1 과발현은 P-카드헤린에 영향을 미침으로써 구강 편평 세포 암종에서의 감소된 세포 유착을 초래한다(Bauer et al., 2013). 엔도카나비노이드 아난드아미드는 담관암종에서 PSEN1의 발현 및 모집을 증가시킨다(Frampton et al., 2010). p53은 PSEN1 발현을 조절할 수 있다(Checler et al., 2010). PSEN1은 종양 복귀에 관여한다(Telerman and Amson, 2009).
PSEN2는 알츠하이머병에 관련된 프레세닐린 2를 인코딩한다. 이것은 노치 활성화에 요구되는 감마-세크레타아제 복합체의 일부이다(RefSeq, 2002). 산화성 스트레스 및 p53 발현 수준은 변이된 PC12 유전자를 보유하는 PSEN2 세포에서 증가된다(Nguyen et al., 2007). PSEN2는 유방암에서 유용한 예후 인자이다. 새로운 PSEN2 대립유전자인 R62H 및 R71W는 PSEN2 기능에 영향을 미치며, 유방암에 대한 감수성의 중간 정도 위험을 부여할 수 있다(To et al., 2006; Xu et al., 2006). PSEN2는 난소 암종에서 무재발 생존 시간과 연관이 있지만 전체 생존 시간과는 연관이 없는 10-유전자 시그내처 조합의 일부이다(Chen and Liu, 2015). PSEN2의 손실은 iPLA2의 상향조절에 의해 폐종양 발생을 초래할 수 있다(Yun et al., 2014). 감마-세크레타아제 복합체의 하향조절된 발현은 유방암 특이적 사망율의 위험 요인으로 사료된다(Peltonen et al., 2013). PSEN2는 거대핵세포 백혈병과 위암에서 차등적으로 발현된다. PSEN2 발현은 종양 유형, UICC 종양 병기, 종양 등급 및 환자 생존율과 상관관계가 있다(Warneke et al., 2013; Hao et al., 2006). PSEN2의 촉진제는 신경아교종에서 탈메틸화되어 PSEN2 과발현을 유발한다(Liu et al., 2012). 2-아라키도닐글리세롤은 담관암종에서 PSEN2의 발현 및 모집을 증가시킨다(Frampton et al., 2010). PSEN2는 쥐의 췌장암에서 EpC를 절단하여 종양 세포 증식을 유발한다(Maetzel et al., 2009; Thuma and Zoller, 2013).
PTGS1(Cox1이라고도 알려짐)은 프로스타글란딘-엔도페록시드 합성효소 1(프로스타글란딘 G/H 합성효소 및 시클로옥시게나제)을 인코딩한다. PTGS1은 구성적으로 발현되어 아라키톤산염에서 프로스타글란딘으로의 전환을 촉매한다. 인코딩된 단백질은 내피 세포에서 혈관생성을 조절하며, 아스피린과 같은 비스테로이드성 소염제에 의해 억제된다. PTGS1은 시클로옥시게나제로서 및 페록시다제로서 기능하는 능력에 근거하여 문라이팅(moonlighting) 단백질로서 확인된 바 있다. 이 단백질은 종양 진행 동안 세균 증식을 촉진시킬 수 있다(RefSeq, 2002; Tietz et al., 2013). PTGS1은 종양형성에 관여할 수 있다(Rouzer and Marnett, 2009). 강화된 종양 성장은 프로스타글란딘과 VEGF 생성에서 역할을 하는 PTGS1의 상향조절에 의해 지원된다(Campione et al., 2015). PTGS1은 재발성 소타액선 암종의 감소된 생존율과 연관이 있다(Haymerle et al., 2015). PTGS1은 유방 암 형성과 연관이 있다(Basu et al., 2015a; Serra et al., 2016). PTGS1은 암의 진행에 있어서 빈번히 탈조절된다(Karnezis et al., 2012). PTGS1의 결손은 기저 세포 암종의 강력한 감소를 초래한다(Arbiser, 2010). 아스피린은 염증 및 결장직장 암종, 두경부암, 위장관암 및 췌장암을 포함하는 암의 발생에 관여하는 것으로 사료되는 PTGS1-유도 혈소판 활성화를 억제시킨다(Pereira et al., 2009; Perrone et al., 2010; Schror, 2011; Garcia Rodriguez et al., 2013; Bruno et al., 2012; Yue et al., 2014; Sostres et al., 2014; Schror and Rauch, 2013; Guillem-Llobat et al., 2014; Patrignani and Patrono, 2015; Patrono, 2015; Dovizio et al., 2015; Jimenez et al., 2007; Klass and Shin, 2007).
PTGS2(COX-2라고도 함)는 디옥시게나제로서 및 페록시나제로서 작용하는 프로스타글란딘 생합성에서의 주요 효소인 프로스타글란딘-엔도페록시다제 합성효소 2(시클로옥시게나제)를 인코딩한다(RefSeq, 2002). PTGS2 및 프로스타글란딘의 발현은 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 결장암, 전립선암 등 다양한 암 유형과 연관이 있다. 그 발현 수준 또한 전이를 포함하여 종양의 공격성에 정비례한다(Shao et al., 2012; Kunzmann et al., 2013; Misra and Sharma, 2014; Aziz and Qiu, 2014; Thill et al., 2014; Knab et al., 2014; Huang and Huang, 2014; Wang et al., 2014c). PTGS2에 대한하는 활성도가 있는 항염증제는 암의 화학예방에 대한 강한 가능성을 갖는다(Harris, 2009; Ghosh et al., 2010).
PTPN14는 포유동물에서 림프 발육을 조절하는 것으로 보이는 티로신 인산분해효소, 비수용체 14형을 인코딩한다. 기능소실 돌연변이는 림프부종 후비공폐쇄증이 있는 친족에서 발견된 바 있다(RefSeq, 2002). PTPN14는 TGF-베타 신호전달을 유도하며, 내피-중간엽 이행 및 기관형성을 조절한다(Wyatt and Khew-Goodall, 2008). PTPN14는 담관암종에서 하향조절되고 임상-병리학적 특징 및 생존과 역 상관관계가 있다(Wang et al., 2015d; Wang et al., 2015c). PTPN14는 가용성 및 막결합 단백질의 교통을 억제함으로써 전이의 예방을 가져온다(Belle et al., 2015). PTPN14는 기관 크기 및 종양형성에 대한 책임이 있는 Hippo 경로에서의 주요 단백질인 종양단백질 Yes-연관 단백질(YAP)을 음성적으로 조절한다(Liu et al., 2013b; Huang et al., 2013a; Lin et al., 2013a). PTPN14에서의 기능소실 돌연변이는 신경모세포종 재발, 유방암 및 결장직장암에 관여한다(Laczmanska and Sasiadek, 2011; Wang et al., 2004; Schramm et al., 2015; Wyatt and Khew-Goodall, 2008).
RABGGTB는 Rab GTPases의 전사후 게라닐게라닐화를 촉매하는 Rab 게라닐게라닐 전이효소의 베타 아단위이다(Pylypenko et al., 2003). RABGGTB는 화학요법-불응성의 미만성 거대 B세포 림프종에서 과발현된다(Linderoth et al., 2008).
RAC1은 작은 GTP-결합 단백질의 RAS 상계열(superfamily)에 속하는 GTPase인 ras 관련 C3 보튤리늄 독소 기질 1(rho 계열, 작은 GTP 결합 단백질 Rac1)을 인코딩한다. 이 상계열의 구성원은 세포 성장, 세포골격의 재조직 및 단백질 키나아제의 활성화 등 방대한 세포 사건을 조절하는 것으로 보인다(RefSeq, 2002). RAC1은 신경관 발육에서 중요하며 흑색종 형성을 방지할 수 있다(Shakhova, 2014). RAC1은 간세포 성장 인자 및 Met 티로신 키나아제 수용체에 의해 활성화될 수 있으며, 그 결과 내피 세포의 증식과 이동이 초래된다(Barrow-McGee and Kermorgant, 2014; Gallo et al., 2015). RAC1은 카포시 육종의 바이러스 종양형성에서 ROS를 유도한다(Mesri et al., 2013). RAC1은 유방암과 두경부암에서 흑색종 개시 및 진행에 관여한다(Alan and Lundquist, 2013; Imianitov, 2013; Meierjohann, 2014). Tiam1은 RAC1를 조절할 수 있으며, 이에 따라 세포골격 활성도, 세포 극성, 세포 내 이입 및 막 교통, 세포 이동, 유착 및 침입, 세포 성장 및 생존, 전이, 혈관형성 및 암 형성에 관여하는 신호전달 경로를 조절한다(Bid et al., 2013; Boissier and Huynh-Do, 2014). RAC1은 종양유전자인 것으로 사료된다(Kunz, 2013; Kunz, 2014). RAC1에서의 돌연변이는 악성 세포 전환을 포함하여 다양한 질병을 초래할 수 있다(Read, 2013; Chi et al., 2013). Rac1의 활성화는 액틴 스트레스 섬유, 막 주름, 라멜리포디아(lamellipodia) 및 필로포디아(filopodia)의 형성을 초래한다(Klopocka et al., 2013; van and van Buul, 2012; Lane et al., 2014). RAC1은 성상세포 종양에서 하향조절되지만 수모세포종 종양에서는 과발현된다(Khalil and El-Sibai, 2012).
RAS3은 작은 GTP-결합 단백질의 RAS 상계열에 속하는 GTPase인 ras 관련 C3 보튤리늄 독소 기질 3(rho 계열, 작은 GTP 결합 단백질 Rac3)을 인코딩한다 이 상계열의 구성원은 세포 성장, 세포골격의 재조직 및 단백질 키나아제의 활성화 등 광범위한 세포 사건을 조절하는 것으로 보인다(RefSeq, 2002). RAC3의 과발현은 자궁내막 암종에서 불량한 예후와 연관이 있다(Balmer et al., 2006). RAC3은 자궁경부암에서 종양 억제인자로 작용하는 ARHGAP6의 표적이다(Li et al., 2015b). RAC3은 세포골격의 조직, 세포 이동 및 침입에 관여한다(Liu et al., 2015c). RAC3은 백혈병과 비소세포 폐암에서 차등적으로 발현되며 종양 성장에 관여한다(Tan and Chen, 2014; Liu et al., 2015c; Koldehoff et al., 2008). RAC3은 식도암에서 E-카드헤린의 TGF-베타-유도 하향조절에 관여한다(Dong et al., 2014; Xu et al., 2007). Rac3은 유방암 세포의 공격성을 유발시키는 Rac3/ERK-2/NF-kappaB 신호전달 경로를 유도한다. 유방암 세포에서의 내인성 Rac 활성도는 높은 전이 가능성과 상관관계가 있다(Gest et al., 2013; Baugher et al., 2005). RAC3은 백혈병, 전립선암 및 유방암 등 여러 암에서 상향조절된다(Fernandez Larrosa et al., 2012; Liu et al., 2015c; Culig and Bartsch, 2006; Calaf and Roy, 2007; Engers et al., 2007; Colo et al., 2007a; Colo et al., 2007b). RAC3은 사이클린 D1 발현을 조절하는 NF-카파B 활성 보체이다(Rubio et al., 2012; Colo et al., 2007b). ERalpha-양성 유방암에서 RAC3의 과발현은 강화된 세포 이동을 초래한다(Walker et al., 2011; Rubio et al., 2006).
RAD54는 DEAD 유사 헬리카아제 상계열에 속하는 단백질을 인코딩한다. 이것은 Saccharomyces cerevisiae RAD54 및 RDH54와 유사성을 공유하며, 이 둘은 DNA의 상동성 재조합 및 복구에 관여한다. 이 단백질은 이중가닥 DNA에 결합하며 DNA의 존재 하에서 ATPase 활성도를 발휘한다. 이 유전자는 고환과 비장에서 고도로 발현되며, 이것은 감수분열 및 유사분열 재조합에서 능동적 역할을 시사한다(RefSeq, 2002). RAD54B의 동종접합 돌연변이는 원발성 림프종과 결장암에서 관찰되었다(Hiramoto et al., 1999). RAD54B는 인간 종양 세포에서 RAD51의 dsDNA에 대한 직접 결합에 따른 게놈-불안정화 영향에 대응한다(Mason et al., 2015).
RAI14(NORPEG라고도 함)는 레티노산 유도 14를 인코딩한다. 이 유전자는 망막 색소 상피 세포에서 검출되는데, 여기서는 인간 조직에서 널릴 발현되는 레티노인산(all-trans-retinoic acid)에 의해 유도가 가능하고, 또한 인간 고환 발육 및 정자형성에서 역할을 할 수 있다(Kutty et al., 2001; Yuan et al., 2005). RAI14는 위암에서 탈조절되고 세포 증식과 연결된다. 이것은 폐암 및 유방암 환자의 무재발 생존 시간에 대한 예후 표지자이다(Zhou et al., 2015a; Hsu et al., 2013).
RBM19는 6개의 RNA-결합 모티프를 포함하는 핵소체 단백질을 인코딩하며 리보솜 생체발생에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002). RBM19는 인간 결장직장암종에서 널리 발현된다(Lorenzen et al., 2005). RBM19의 돌연변이 비활성화는 생쥐에서 p53 활성도의 상승과 세포자멸사의 증가를 초래한다(Zhang et al., 2008; Deisenroth and Zhang, 2010).
RPF1(BXDC5라고도 함)은 시그마(70)-유사 모티프를 함유하는 핵소체 RNA 결합 단백질을 인코딩하며 리보솜 생체발생에 요구된다(Wehner and Baserga, 2002).
RPL13A는 60S 리보솜 아단위의 구성요소인 리보솜 단백질의 L13P 계열의 구성원을 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 또한 번역의 IFN-감마-활성화 억제제(GAIT) 복합체의 구성요소로서 염증성 유전자의 억압에도 역할을 한다(RefSeq, 2002). RPL13A는 전립선암, 간암 및 결장직장암 등 여러 암 유형에서 탈조절된다(Kasai et al., 2003; Ohl et al., 2005; Yoon et al., 2006). RPL13A의 소실은 리보솜 RNA의 메틸화 및 p27, p53 및 SNAT2 mRNA로부터 유래하는 IRES 요소에 의해 매개되는 cap-독립 번역의 유의한 감소를 초래한다(Chaudhuri et al., 2007).
RPL13AP20은 12p13.1 염색체 상에 위치하는 리보솜 L13a 위유전자를 인코딩한다(Balasubramanian et al., 2009).
RPL13AP5는 10q24.1 염색체 상에 위치하는 리보솜 L13a 위유전자를 인코딩한다(Balasubramanian et al., 2009).
RPL34는 60S 아단위의 구성요소인 리보솜 단백질 L34를 인코딩한다. 이 유전자의 과발현은 일부 암 세포에서 관찰된 바 있다(RefSeq, 2002). RPL34의 과발현은 비소세포 폐암에서 악성 증식의 촉진을 초래한다(Yang et al., 2016). RPL34는 인간 악성 위 세포에서 세포 증식, 세포 주기 분포 및 세포자멸사에서 중대한 역할을 수행한다(Liu et al., 2015a).
RPTOR(RAPTOR이라고도 알려짐)은 mTOR, 복합체 1의 조절 연관 단백질을 인코딩한다. 이 단백질은 영양소와 인슐린 수준에 반응하여 세포 성장을 조절하는 신호전달 경로의 구획이다. 이 단백질은 하류 작용인자 리보솜 단백질 S6 키나아제를 양성적으로 조절하고 mTOR 키나아제를 음성적으로 조절한다(RefSeq, 2002). 결절 경화증 복합체 1 또는 2의 부재 시, mTOR-RPTOR 신호전달이 구성적으로 활성화되어 그에 따라 단백질 합성과 세포 성장이 강화되고 탈조절된다(Avruch et al., 2005; Kwiatkowski and Manning, 2005). mTOR은 일차적으로 RPTOR과의 직접적인 상호작용을 통해 세포 성장 및 생존을 양성적으로 조절한다(Sun, 2013). mTOR와의 복합체를 통해, RPTOR은 cap-독립 번역을 제어하며, 이 기능은 PI3K-개시 종양형성에 필수적이다(Vogt et al., 2010). 라팔로그는 mTOR-RPTOR 복합체 1(mTORC1, 라파마이신-민감)을 일차적으로 억제하며 유방암 요법에 사용되는 제제이다(Wysocki, 2009; De et al., 2013; Vinayak and Carlson, 2013; Le et al., 2008).
SEC24D는 SEC24 상동체 D, COPII 외투 복합체 구성요소를 인코딩한다. SEC24D는 COPII의 효모 Sec24p 구성요소와의 유사성을 갖는다. COPII는 ER로부터 뻗어나가는 수포에 대한 책임이 있는 외부 단백질 복합체이다. 이 유전자 생성물은 수포의 형성, 및 적하 선택 및 농축에도 연루된다. 이 유전자에서의 돌연변이는 뼈 형성에 영향을 미침으로써 두개 안면의 기형과 쉽게 부러지는 뼈를 초래하는 콜-카펜터 증후군과 연관이 있었다(RefSeq, 2002). SEC24D의 유도 비율은 인간 전립선 세포주 LNCaP에서 강화된다(DePrimo et al., 2002; Zhao et al., 2004). SEC24D는 Akt에 의해 인산화될 수 있다(Sharpe et al., 2011).
SEPT10은 미세섬유-형성 세포골격 GTPase의 셉틴(septin) 계열 구성원을 인코딩한다. 이것은 세포질 및 핵에 국소화되며 GTP-결합 및 GTPase 활성도를 나타낸다(RefSeq, 2002). SEPT10은 방광암, 유방암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암 및 흑색종과 백혈병 등 여러 암 유형에서 하향조절된다. 이것은 생존에 대한 불량한 예후와 연관이 있다(Kienle et al., 2010; Liu et al., 2010b).
SEPT11은 세포질분열 및 수포 이동 등 다양한 세포 기능에 관여하는 미세섬유-형성 세포골격 GTPase의 보존된 셉틴 계열 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). SEPT11은 뇌암, 자궁경부암, 췌장암, 전립선암, 흑색종, 백혈병 등 여러 암 객체에서 과발현된다(Liu et al., 2010b). SEPT11에서 이형접합성의 손실(LOH)은 간세포 암종의 불량한 예후와 연관이 있다. MLL과의 융합 전사체는 골수 신생종에서 확인된 바 있다(Huang et al., 2010; Cerveira et al., 2011).
SEPT8은 세포골격 조직 및 세포질분열의 조절에 역할을 하며 고도로 보존된 셉틴 계열의 뉴클레오티드 결합 단백질 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). SEPT8은 방광암, 간암, 췌장암, 폐암 및 백혈병 등 여러 암 유형에서 상향조절된다(Liu et al., 2010b).
SERPINB2(PAI2라고도 알려짐)는 세르핀(serpin) 펩티다아제 억제제, 클레이드 B(난알부민), 구성원 2를 인코딩하며 18q21.3 염색체 상에 위치한다. SERPINB2는 비통상적인 세린 단백분해효소 억제제(SERPIN)로서 유전자 발현, 세포 증식 및 분화, 세포자멸사에 영향을 미친다(RefSeq, 2002; Medcalf and Stasinopoulos, 2005). SERPINB2는 세르핀 펩티다아제 억제제, 클레이드 B(난알부민), 구성원 2, 세포외 단백분해효소 유로키나제(urokinase) 플라즈미노겐 활성인자의 억제인자 및 조직 플라즈미노겐 활성인자를 인코딩한다(Schroder et al., 2014). SERPINB2는 다수의 다른 종양에서 발현된다. SERPINB2 발현은 유방암 및 췌장암에서 긍정적인 예후와 연관이 있지만 자궁내막암, 난소암 및 결장직장암에서는 불량한 예후와 연관이 있다(Schroder et al., 2014). SERPINB2는 침습 및 전이 관련 유전자이다(Pucci et al., 2016). SERPINB2는 플라즈미노겐에서 플라스민으로의 전환을 유발시키는 유로키나제 유형의 플라즈미노겐 활성인자(uPA)를 조절한다. 플라스민은 종양 진행의 중요한 과정인 세포외 기질(ECM)을 분해시킬 수 있다(Gershtein and Kushlinskii, 1999; Ulisse et al., 2009; Berger, 2002; Baldini et al., 2012; Mekkawy et al., 2014; Andreasen et al., 2000). ECM의 분해는 종양 진행, 종양 질량 팽창, 종양 성장 인자 방출, 사이토카인 활성화, 종양 세포 증식, 이동 및 침입을 초래한다(Hildenbrand et al., 2010; Magdolen et al., 2003; Halamkova et al., 2012; Duffy, 2004; Mekkawy et al., 2014; Dass et al., 2008). 다수의 종양은 uPA계 구성요소와 종양의 공격성 및 생존율 사이의 상관관계를 보여준다(Mekkawy et al., 2014; Duffy and Duggan, 2004; Han et al., 2005). SERPINB2의 높은 수준은 종양 성장과 전이를 감소시킨다(Croucher et al., 2008).
SH3BP4는 SH3-도메인 결합 단백질 4를 인코딩하며, 이것은 클라트린 매개 세포내이입의 카고 특이적(cargo-specific) 제어, 즉 구체적으로 특이적 단백질 수용체의 내부화 제어에 관여한다(RefSeq, 2002). SH3BP4 발현은 망막모세포종 세포주 Y79에서 7배로 증가한다(Khanobdee et al., 2004). SH3BP4 결핍 세포에서 섬유모세포 성장 인자 10 자극은 유방암 세포에서 세포 이동의 감소 및 생쥐 폐의 체외이식편에서 상피 분지의 억제를 유발한다(Francavilla et al., 2013).
SHCBP1은 인간 센트랄스핀들린(centralspindlin)과 연관 있는 단백질을 인코딩하며 중앙체 조직 및 세포질분열 완료에 관여하는 중대한 인자의 하나이다(Asano et al., 2014). SHCBP1은 인간 간세포 암종에서 상향조절된다. SHCBP1을 표적하면 인간 간세포 암종 세포주에서 세포 증식이 억제된다(Tao et al., 2013). 동시의 게놈 변형이 있는 16개의 유전자 중 SHCBP1은 종양 형성에서 및 침습성 이전(pre-invasive) 유관 상피내암종에서 침습성 유관 암종으로의 침윤 및 진행의 과정에서 관여할 수 있다(Colak et al., 2013).
SIGMAR1(OPRS1 또는 SIG-1R이라고도 함)은 코카인, 암페타민 등 다양한 정신이상 작용제와 상호작용하는 시그마 비아편유사제 세포내 수용체를 인코딩한다. 이 유전자에서의 돌연변이는 유년기 근위축성 측삭 경화증과 연관이 있다(RefSeq, 2002). SIGMAR1은 종양 세포주 및 폐암, 결장암, 피부암, 유방암 등 다양한 암 조직의 종양에서 발현된다. SIGMAR1 과발현은 세포 증식과 연관이 있다(Vilner et al., 1995; Aydar et al., 2004; Aydar et al., 2006; Bem et al., 1991; Skrzycki and Czeczot, 2013). SIGMAR1은 hERG/bet1-인테그린 신호 전달을 촉진시키고, PI3K/Akt 경로의 활성화를 유발하며, 또한 p70S6K, S6 및 4E-BP1과 같은 번역 조절인자 단백질의 인산화를 유도한다. SIGMAR1은 이동성과 VEGF 분비를 증가시키므로, 종양 세포의 공격성을 강화시킨다(Crottes et al., 2016; Kim et al., 2012a).
SLC16A3은 양성자-연계 모노카르복실레이트 수송체인 용질 운반 계열 16 구성원 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). 대부분의 고형 종양은 에너지 생산을 위해 당분해 작용에 의존하는 것으로 알려져 있다. 높은 속도의 당분해 작용은 유산염의 생성 증가를 초래하며, 이것은 불량한 임상적 결과와 종양 성장 및 진행에 대한 직접적 기여와 연관되었다. SLC16A3은 암세포에서 유산염 유출을 원활하게 하는 소수의 모노카르복실레이트 수송체의 하나이다(Dhup et al., 2012; Draoui and Feron, 2011). SLC16A3 발현은 간세포 암 환자에서의 불량한 예후 및 세포주 실험에서 세포 증식, 이동 및 침입의 증가와 연관되었다(Gao et al., 2014a). 종양 생성에서 SLC16A3의 기능적 관여는 췌장암의 아집단에서 보여졌다(Baek et al., 2014).
SLC1A4(ASCT1이라고도 알려짐)는 2p15-p13 염색체 상에 위치한 용질 운반 계열(글루탐산염/중성 아미노산 수송체), 구성원 4를 인코딩한다(RefSeq, 2002). 간세포 암종 세포주 C3A는 시스테인 박탈 후 SLC1A4 발현을 강화시킨다(Lee et al., 2008b). SLC1A4는 식도 선암종에서 아미노산의 모집자로 작용한다(Younes et al., 2000). ASCT2의 넉다운(Knock-down)은 인간 간세포암 세포에서 SLC1A4 mRNA 수준을 강화시킨다(Fuchs et al., 2004). v-myc 골수구종증 바이러스성 종양유전자 상동 유전자의 활성화는 인간 신경아교종 세포주 Hs683에서 SLC1A4의 상향 조절을 이끌어낸다(Jiang et al., 2012). 신경모세포종에서 글루타민 박탈은 SLC1A4의 상향조절을 이어지지 않는다(Wasa et al., 2002).
SLC1A5(ASCT2라고도 알려짐)는 용질 운반 계열(글루탄산염/중성 아미노산 전달체), 구성원 5를 인코딩하는데, 이것은 RD114/type D형 레트로바이러스의 수용체로서 작용가능한 나트륨 의존 형성 아미노산 수송체이다(RefSeq, 2002). c-Myc 활성화는 SLC1A5 발현을 증가시킨다(Perez-Escuredo et al., 2016). SLC1A5의 과발현은 투명세포 신세포 암종에서 불량한 예후와 연관이 있다(Liu et al., 2015d). CD147의 높은 발현은 췌장암 환자에서 SLC1A5와 유의하게 연관이 있다(Kaira et al., 2015). SLC1A5는 비소세포 폐암의 바이오마커일 수 있다(Hassanein et al., 2015; Hassanein et al., 2016). 유비퀴틴 리가아제 RNF5는 유방암에서 SLC1A5를 조절한다(Jeon et al., 2015). SLC1A5는 진행성 후두암, 전립선암 및 선낭암종 등 여러 암 객체에서 과발현된다(Koo and Yoon, 2015; Wang et al., 2015f; Bhutia et al., 2015; Nikkuni et al., 2015; Ganapathy et al., 2009). 유방암에서 SLC1A5의 억제는 글루타민 섭취 및 증식의 감소를 유도한다(Chen et al., 2015d; van et al., 2015). SLC1A5는 mTOR의 조절에 의해 종양 성장을 촉진시킬 수 있다(Nakanishi and Tamai, 2011; Fuchs and Bode, 2005; Corbet et al., 2016; McGivan and Bungard, 2007).
SLC26A6은 음이온 수송 단백질로 구성원 용질 운반 계열 26의 구성원을 인코딩한다. SLC26A6은 염소, 옥살산, 황산 및 중탄산 이온의 수송에 관여한다(RefSeq, 2002). SLC26A6의 돌연변이는 여러 결장직장암 세포주에서 확인되었다(Donnard et al., 2014). SLC26A6 유전자 발현 및 촉진자 활성도는 IFN-감마에 의해 억제된다(Saksena et al., 2010).
SLC52A3(RFT2 또는 C20orf54라고도 함)은 용질 운반 계열 52의 구성원을 인코딩한다. SLC52A3은 리보플라빈 수송체 단백질로서 리보플라빈의 내장 흡수에서 역할을 할 가능성이 있다(RefSeq, 2002). SLC52A3은 위암, 식도 편평 세포 암종, 자궁경부암 등 여러 암 객체에서 탈조절된다. SLC52A3의 단일 뉴클레오티드 다형성은 식도 편평세포 암종 및 위분문부 선암종에서의 암 위험과 상관관계가 있다(Jiang et al., 2014b; Duan et al., 2015; Matnuri et al., 2015; Eli et al., 2012; Aili et al., 2013). SLC52A3의 넉다운(Knock-down)은 p21 및 p27 단백질 수준을 증가시키며 이들의 하류 표적인 사이클린 E1 및 Cdk2를 감소시켜, G1-G1/S의 세포 주기 정지를 초래한다. SLC52A3의 넉다운(Knock-down)은 또한 카스파아제-3 및 세포자멸사의 활성화도 초래한다(Jiang et al., 2014b).
SLC6A15는 중성 아미노산을 수송하는 용질 운반 계열 6의 구성원을 인코딩한다. SLC6A15는 신경세포성 아미노산 수송에서 역할을 할 수도 있으며 주요 우울증과 연관이 있을 수 있다(RefSeq, 2002). SLC6A15는 과메틸화되며 이에 따라 결장직장암에서 하향조절되며 또한 대변 기반 검사의 후보 바이오마커일 수 있다(Kim et al., 2011b; Mitchell et al., 2014).
SMIM10(CXorf69 또는 LOC644538이라고도 함)은 Xq26.3 염색체 상에 위치한 작은 내재성 막 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002).
SNX14는 소팅 넥신(sorting nexin) 계열의 구성원을 인코딩하며 G 단백질 신호전달(RGS) 도메인의 조절인자를 함유한다(RefSeq, 2002). SNX14는 생쥐 배아 섬유모세포의 rasV12/E1A 전환 시 하향조절되며 종양 발전과 연관이 있을 수 있다(Vasseur et al., 2005).
SSH1(SSH1L이라고도 함)은 인산분해효소의 슬링샷 상동체(SSH) 계열의 구성원을 인코딩한다. SSH 계열은 코필린(cofilin) 단백질의 재활성화에 의해 액틴 역학에서 역할을 하는 것으로 보인다(RefSeq, 2002). SSH1은 췌장암에서 과발현되며 종양 세포 이동과 연관이 있다(Wang et al., 2015k). 뉴레굴린에 의한 PKD1의 억제는 SSH1을 F-액틴으로 국소화시키며, 코필린 활성도의 증가 및 액틴 세포 골격 및 세포 이동의 재조직 증가를 유도한다. 코필린의 SSH1 의존 활성화는 PI3K/Akt 신호전달 경로에 의해 유도된다(Wang et al., 2010; Doppler et al., 2013).
STAT2는 IFN에 의해 유도되는 전사 활성화 반응에서 양성 조절인자로서 작동한다(Steen and Gamero, 2012). STAT2는 인터페론에 대한 종양 세포 반응을 조절할 수 있다(Shodeinde et al., 2013). STAT2와 종양형성 사이의 관련이 유전자삽입 생쥐에서 STAT2가 결여된 것으로 관찰되고(Yue et al., 2015) 또는 뇌에서 IFN-알파를 근본적으로 발현하는 것으로 관찰되었다(Wang et al., 2003).
SUPT16H는 염색질로 포장된 DNA의 전사에 필요한 보조 인자인 FACT(염색질 전사의 원활화)의 아단위를 인코딩한다(RefSeq, 2002). SUPT16H는 유년형 비인두 혈관섬유종(JNA)의 내피 및 기질 구성요소에서 탈조절되며 그에 따라 잠재적인 분자 표지자의 역할을 할 수 있다(Silveira et al., 2012). SUPT16H는 염색체의 재형성에 의한 DNA 이중가닥 절단 복구에 관여한다. SUPT16H는 CK2와의 복합체 형성을 통해 p53을 활성화시킨다(Keller et al., 2001; Kari et al., 2011).
SUSD1은 스시(sushi) 도메인 함유 단백질을 인코딩하며 정맥 혈전색전증의 위험 증가와 연관이 있다(Tang et al., 2013). 이종접합의 SUSD1-ROD1/PTBP3 융합 전사체는 인간 유방암 세포주에서 발현된다(Newman et al., 2013).
TAF6L은 TATA-box 결합 단백질 연관 인자 6(TAF6)와 같은 히스톤에 대해 구조적 유사성을 가진 단백질을 인코딩한다. 이것은 PCAF 히스톤 아세틸화효소 복합체의 구성요소로서 근육성 전사 및 분화에 요구된다(RefSeq, 2002). miR-145 및 miR-196a의 발현은 TAF6L의 발현과 음의 상관관계가 있다(Havelange et al., 2011). TAF6L은 융합 전사체 TAF6L-GNG3을 형성함으로써 소세포 폐암 세포주 H187에서 비활성화된다(Fernandez-Cuesta et al., 2015).
TEP1은 끝분절효소의 활성도에 대한 책임이 있는 리보핵산 단백질 복합체의 구성요소인 헬로머라제 연관 단백질 1을 인코딩하며, 이것은 염색체 끝에 말단소립의 추가를 촉매한다(RefSeq, 2002; Szaflarski et al., 2011). TEP1은 주요 볼트 단백질(MVP)이 속하는 볼트의 주요 부분이다(Lara et al., 2011; Mossink et al., 2003). TEP1은 갑상선 암종에서 발현된다(Hoang-Vu et al., 2002).
TFPI는 혈액응고의 조직 인자(TF) 의존 경로를 조절하는 당백분해효소 억제제인 조직 인자 경로 억제제를 인코딩한다(RefSeq, 2002). TFPI는 유방암, 결장직장암 및 췌장암의 세포주에서 발현된다(Kurer, 2007). TFPI는 유방암에서 HIF1알파, c-Myc, c-SRC 및 HDAC2를 유도한다(Davies et al., 2014). TFPI 발현 수준은 비악성종양 병변에 비해 육종에서 감소된다(Savitskaya et al., 2012). TFPI는 전이에 관여하는 TF-VIIa 복합체의 단백 분해효소 활성도를 억제한다(Fischer et al., 1999; Sandset and Abildgaard, 1991; Lindahl et al., 1991).
TFPI2는 인자 VIIa/조직 인자, 인자 Xa, 플라스민, 트립신, 키모트립신 및 혈장 칼리크레인 등 다양한 세린 단백분해효소를 억제시킬 수 있는 조직 인자 경로 억제제 2를 인코딩한다. 이 유전자는 여러 유형의 암에서 종양 억압 유전자로서 확인되었다(RefSeq, 2002; Sierko et al., 2007). TFPI2는 췌장 암종에서 재발 예측의 바이오마커로서 사용될 수 있다(Zhai et al., 2015c). TFPI2의 DNA 메틸화는 분변 잠혈 검사에서 결장직장암의 바이오마커로서 사용이 가능하다(Koga et al., 2015). TFPI2는 세포자멸사를 유도하며, 침윤성, 신생물의 성장, 전이 및 혈관생성을 억제한다(Ghilardi et al., 2015; Amirkhosravi et al., 2007; Sierko et al., 2007). TFPI2는 암에서 과메틸화되고 하향조절되며, 발현은 암의 정도, 조기 종양 재발 및 불량한 예후와 상관관계가 있다(Sun et al., 2016a; Sierko et al., 2007). TFPI2는 췌장암 및 담관암종에서 하향조절된다(Chu et al., 2015; Zhai et al., 2015a; Zhai et al., 2015b). TFPI2는 위암, 개의 미만성 거대 B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 비소세포 폐암, 자궁경부암, 구강 편평세포 암종, 염증-연관 결장암 및 간세포 암종에서 메틸화된다(Qu et al., 2013; Ferraresso et al., 2014; Liu et al., 2014b; Shao et al., 2014; Lai et al., 2014; Hamamoto et al., 2015; Li et al., 2015d; Gerecke et al., 2015; Dong et al., 2015; Sun et al., 2016a). TFPI2는 암에서 잘 검증된 DNA 메틸화 바이오마커이다(Fukushige and Horii, 2013; Huisman et al., 2015).
TGFBI는 I, II 및 IV형 콜라겐에 결합하는 RGD 함유 단백질을 인코딩하며, 세포-콜라겐 상호작용에서 역할을 하는 변환 성장 인자-베타에 의해 유도되고 또한 세포 유착의 억제를 위해 작용한다(RefSeq, 2002). TGFBI 발현은 담관암종, 간 암종, 위 암종, 식도 편평 세포 암종 및 투명 세포 신세포 암종에서 상승된 것으로 나타났다. 더욱이 TGFBI는 결장직장암과 연관이 있는 것으로 나타났다(Lebdai et al., 2015; Ozawa et al., 2014; Zhu et al., 2015; Han et al., 2015).
TGIF2-C20orf24는 TGIF2 및 C20orf24와 서열 정체성을 공유하는 융합 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002).
TMEM154는 2형 당뇨병에 대한 증가된 위험과 연관이 있으며 또한 베타 세포 융합에서 역할을 하는 것으로 보이는 막횡단 단백질을 인코딩한다(Harder et al., 2015).
TRAM2는 전위 연관 막 단백질 2를 인코딩한다. 이것은 소포체(ER) 막에서 신생 분비 및 막 단백질의 번역후 처리를 제어하는 개폐 고분자 채널인 트랜스로콘(translocon)의 구성요소이다(RefSeq, 2002). Runx2는 TRAM2 발현을 조절할 수 있다(Pregizer et al., 2007). TRAM2 내의 SNP는 ER-양성 유방암 환자에서 골절의 위험을 증가시킬 수 있다(Liu et al., 2014a).
TRPV2는 섭씨 52도가 넘는 온도에 의해 활성화되는 이온 채널을 인코딩한다. 이것은 감각 신경절에서 고온 열 반응의 전달에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002). TRPV2는 식도암, 전립선암, 간암, 방광암 및 백혈병 등 여러 유형의 암에서 탈조절된다. TRPV2의 손실이나 변형은 통제가 안 되는 증식 및 세포자멸사 자극에 대한 내성을 초래한다(Liberati et al., 2014a; Zhou et al., 2014; Liberati et al., 2014b; Liu et al., 2010a; Morelli et al., 2013). 신경아교종 세포에서 TRPV2의 침묵은 Fas 및 프로-카스파아제 8의 하향조절은 물론 사이클린 E1, CDK2 E2F1 및 Bcl-2 연관 X 단백질의 상향조절을 초래한다. 방광암 세포에서 TRPV2 과발현은 강화된 세포 이동과 침습으로 이어진다(Nabissi et al., 2010; Liu and Wang, 2013).
TSEN15는 tRNA 스플라이싱 핵속핵산분해효소 아단위 15를 인코딩한다. 이 핵속핵산 분해효소는 tRNA 전구체로부터 인트론의 제거를 촉매한다(RefSeq, 2002; Trotta et al., 2006). TSEN15는 miRNA-449a의 표적이며 신경모세포종에서 종양 억제인자로서 기능한다. TSEN15는 miRNA-449a의 분화 유도 기능의 매개에 있어서 중요한 역할을 한다(Zhao et al., 2015). TSEN15는 인간의 태아 대퇴골 유래 세포에서 세포 분화 잠재성과 연관이 있다(Mirmalek-Sani et al., 2009).
UBE2C(UBCH10이라고도 함)는 E2 유비티퀸-접합 효소 계열의 구성원을 인코딩한다. 이것은 유사분열 사이클린의 파괴 및 세포 주기 진행에 요구된다(RefSeq, 2002). UBE2C는 유방암, 폐암 및 결장직장암 환자에서 관찰되는 것처럼 유전자 증폭에 의해 흔히 상향조절된다. UBE2C 상향 조절은 불량한 예후 및 종양 진행과 상관관계가 있다(Okamoto et al., 2003; Wagner et al., 2004; Fujita et al., 2009; Chen et al., 2010; Hao et al., 2012). UBE2C는 U251 신경아교종 세포에서 및 결장직장 암종(CRC) 환자의 조직에서 상향조절된다. UBE2C 넉다운(Knock-down)은 Bax 및 p53의 유도를 통한 세포자멸사, Bcl-2의 하향조절 및 세포 주기의 G2/M 정지를 유도한다. UBE2C 억제는 CRC에서 사이클린 B 및 ERK1을 탈조절한다(Cacciola et al., 2015; Jiang et al., 2010).
UBIAD1(TERE1이라고도 함)은 콜레스테롤 및 인지질 대사에 관여할 수 있는 UbiA 프레닐트랜스퍼라제를 함유하는 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002). 종양 억제인자 UBIAD1은 방광암, 전립선암 및 신장암 등의 여러 암 객체에서 하향조절되고, 성장 조절과 연관이 있다(McGarvey et al., 2001; Fredericks et al., 2011; McGarvey et al., 2003; Fredericks et al., 2013). UBIAD1은 신장 인자 관련 p42/44 MAP 키나아제의 인산화를 조절한다. UBIAD1의 적합한 골지 국소화는 세포자멸사를 포함하여 그 종양 억제인자 활성도에 영향을 준다(McGarvey et al., 2005; Wang et al., 2013d).
UBR1은 유비퀴틴 단백질 리가아제 E3 구성요소 N-레코그닌(N-recognin) 1을 인코딩한다. 이것은 지질 단백질의 탈안정화 N 말단 잔기에 결합하고, 기질 관련 멀티-유비퀴틴 사슬의 형성에 참여함으로써 유비퀴틴 계통의 단백분해 경로에 대해 단백질을 지시한다(RefSeq, 2002). UBR1 발현의 손실이나 감소는 자연 B세포 림프종 및 T 세포 급성 림프모구 백혈병과 연관이 있다(Chen et al., 2006). UBR1은 세포를 알킬화 제제의 발암성 영향으로부터 보호하는 DNA 복구 효소인 MGMT의 항상성을 조절한다(Leng et al., 2015).
UBR2는 폴리유비퀴틸화 및 프로테오솜 매개 열화를 위한 불안정화 N 말단 잔기를 갖춘 단백질을 표적화하는 N-엔드 룰(N-end rule) 단백질분해 경로의 E3 유비퀴틴 리가아제를 인코딩한다(RefSeq, 2002). 자가면역 췌장염 및 췌장암 환자의 혈청에서는 UBR2에 대한 자가 항체가 검출된다(Frulloni et al., 2009). UBR2는 p38beta/MAPK의 활성화, C/EBPbeta 인산화 및 UBR2 촉진제에 대한 결합을 통한 종양 세포 유도 단백질 자극에 의해 상향조절된다(Zhang et al., 2013b).
URB1은 60S 리보솜 아단위의 조기 성숙화 동안 리보솜 생체발생에 요구된다(Rosado and de la Cruz, 2004).
USP11은 유비퀴틴 특이적 펩티다제 11을 인코딩한다. 단백질 유비퀴틴화는 다수의 세포내 과정을 제어하며, 세포 주기 진행, 전사 활성화 및 신호 전달이 포함된다(RefSeq, 2002). USP11은 p53의 신규 조절인자이며, DNA 손상에 반응하는 p53 활성화에 요구된다(Ke et al., 2014a). USP11은 전골수세포 백혈병 및 췌장암에서 주요 역할을 한다(Burkhart et al., 2013; Wu et al., 2014).
USP22는 유비퀴틴 특이적 펩티다아제 22를 인코딩하며 17p11.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). USP22의 높은 발현은 간세포 암종, 결장 암종, 위 암종, 상피 난소암, 췌장암, 신경아교종, 타액 선양 낭성 암종 및 유두형 갑상선 암종에서 관찰되었다(Wang et al., 2013b; Dai et al., 2014; Liang et al., 2014a; Liang et al., 2014b; Ji et al., 2015; He et al., 2015; Wang et al., 2015n; Tang et al., 2015). USP22는 폐 선암종에서 종양 진행을 촉진시키고 상피 중간엽 이행을 유도한다(Hu et al., 2015a). USP22는 비소세포 폐암에서 시클로옥시게나제 2의 안정성을 조절하여 종양유전자로서 작용한다(Xiao et al., 2015). USP22는 비인두 암종의 병리학적 과정에서 중대한 조절 역할을 하며, 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다(Zhuang et al., 2015). USP22의 과발현은 유방암의 진행에 기여할 수 있다(Zhang et al., 2011).
UTP20은 U3 소형 핵소체 RNA 단백질 복합체의 구성요소이며 18s rRNA 처리에 관여한다(RefSeq, 2002). UTP20 발현은 전이성 인간 유방 종양 세포주에서 감소된다(Schwirzke et al., 1998; Goodison et al., 2003). UTP20은 위암 조직 및 전암성 병변에서 높은 수준으로 발현되어 세포 전환에서 UTP20의 관여를 연루시킨다(Xing et al., 2005).
WLS(EVI 또는 GPR177이라고도 함)는 Wntless Wnt 리간드 분비 매개인자를 인코딩한다. WLS는 자신의 세포의 환경으로의 분비 촉진에 헌신하는 Wnt를 위해 과거 파트너를 나타낸다(Banziger et al., 2006). WLS는 유방암, 위암, 난소암, 결장직장암 및 백혈병 등 여러 암 객체에서 과발현되며 불량한 결과와 연관이 있다(Chiou et al., 2014; Stewart et al., 2015; Lu et al., 2015; Voloshanenko et al., 2013). WLS는 모든 Wnt 단백질의 분비에서 중요하다. 이것은 베타-카테닌 및 사이클린-D1의 발현을 조절함으로써 세포 증식에 영향을 미친다(Yang et al., 2015b; Banziger et al., 2006).
YIF1A는 Yip1 상호작용 인자 상동체 A를 인코딩하여 11q13 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 간세포 암종에서 여러 돌연변이(증폭 및 결손)가 YIF1A 유전자에서 검출되었다(Nalesnik et al., 2012). YIF1A 발현은 정상 및 편평 세포 암종 샘플 사이의 유의한 차이를 보여준다(Sugimoto et al., 2009).
ZRANB3은 아연 핑거, RAN-결합 도메인 함유 3을 인코딩하며 2q21.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). ZRANB3은 구조 특이적 ATP 의존 핵속핵산 분해효소인 아연 핑거 단백질을 인코딩한다. 이 고온 게놈 무결성 유지를 위한 복제 스트레스 반응에 관여한다(Ciccia et al., 2012; Weston et al., 2012). 단일 뉴클레오티드 다형성 rs4954256은 2q21.3 염색체 상의 ZRANB3에 위치하며, 식도암의 치료 시 화학방사선 병행 요법에 대한 병리학적 완전 반응의 3.93배 증가와 연관이 있었다(Chen et al., 2012). ZRANB3은 자궁내막암에서 빈번히 돌연변이를 거친다(Lawrence et al., 2014).
발명의 상세한 설명
면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양 연관 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 및 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. T 세포의 종양 침투 세포 군락 또는 말초 혈액에서의 분리는 이러한 T 세포가 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 시토졸에 자리잡은 단백질 또는 불완전 리보솜 생성물(DRIPS)에서 파생된 보통 8 ~ 10의 아미노산 잔기로 이루어진 주조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 특히, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다.
"T-세포 반응"이란 특이적 증식과 시험관 내 또는 생체 내에서 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 시토카인의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론 감마, TNF 알파, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.
"펩티드"란 용어는 여기서 이웃 아미노산의 알파 아미노와 카보닐 기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 아미노산 8개까지 짧을 수도 있고 아미노산까지 10, 11, 12 또는 13개까지 길 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(본 발명의 펩티드의 연장된 변이) 그 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 알파 아미노 기와 이웃 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 이 염은 예를 들어 염화물 또는 아세트산염(삼분화 아세트산염)과 같은 약학적으로 허용되는 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체 내에서 염이 아니므로 생체 내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 올바른 에피톱이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산 보다 길이가 짧고, 15개 아미노산 보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기 및 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 언급한다.
이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.
클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 혼합물에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 혼합물(MHC 클래스 I 알파 사슬, 베타-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 대개 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 세 개의 유전자 부위가 있다(인간의 MHC 분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*07은 유전자 부위에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
하기 표 5는 HLA-A*02, HLA-A*24 및 가장 빈번한 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도를 나타낸다. 빈도는 Mori 등(Mori et al., 1997)으로부터 조정된 미국 인구 내에서의 일배체형 빈도 Gf로부터 유추되며(Mori et al., 1997), 하디-와인버그 공식 F = 1- (1-Gf)2을 사용한다. A*02 또는 A*24와 일부 HLA-DR 대립형질의 조합은 강화되거나 연관 불평형으로 인해 단일 빈도보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 Chanock 등을 참조한다(Chanock et al., 2004).
[표 5]
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본 발명의 펩티드는 바람직하게는 여기서 설명한 바와 같이 본 발명의 백신에 포함되는 경우 A*02에 결합한다. 백신은 범-결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수도 있다. 그러므로 본 발명의 백신은 A*02 양성인 환자의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 반면, MHC 클래스 II 동종형에 대한 선택은 이 펩티드의 범-결합 성격으로 인해 필요하지 않다.
본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립형질, 예를 들어 A*24와 결합하는 펩티드와 조합되는 경우, 모든 환자 모집단에서 MHC 클래스 I 대립형질 하나만을 취급하는 것에 비해 더 높은 비율의 치료가 가능하다. 대부분의 모집단에서 하나의 대립형질만으로는 환자의 50% 미만을 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02로 구성되는 백신은 일체의 관련있는 모집단에서 적어도 환자의 60% 치료가 가능하다. 구체적으로 환자의 다음 백분율은 다양한 지역에서 적어도 하나의 이러한 대립형질에 대해 양성이 된다: 미국 61%, 서부 유럽 62%, 중국 75%, 한국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net의 자료로부터 계산됨).
한 바람직한 구현에서 용어 "뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드의 이성중합체를 언급한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 절편은 cDNA 조각들과 짧은 올리고뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 조절 요소를 구성하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
여기서 사용되는 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 제조에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.
여기서 사용되는 핵산 서열에 대한 언급에는 한 가닥 및 두 가닥 핵산 모두가 포함된다. 그러므로, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 보완이 있는 이러한 서열의 중복(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 언급한다.
용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 언급한다(즉, 유전자 본래의 발현 생성물에 대한 생체 내 영역 코딩).
코딩 영역은 비변이("정상적")이거나 변이 또는 개조된 유전자에서 찾을 수 있거나, 심지어는 DNA 서열, 또는 DNA 합성 기술을 보유한 제조업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에서 찾을 수 있다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 및 유전적 코딩 퇴화 및 이에 따른 동일 아미노산 코딩으로 인해 초래된 어떤 핵산 서열 코딩 생성물을 의미한다.
코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활 동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 언급한다.
용어 "DNA 분절"은 최소한 한번 이상의 상당히 순수한 형태로 분리된 DNA에서 유도된 단편의 형태, 또는 큰 DNA 구축물의 구성요소로서 DNA 중합체를 언급한다. 여기서 순수한 형태는 내인성 오염 물질이 없고 분절 및 표준 생화학 방법, 예를 들면, 복제 벡터에 따른 그 구성요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도를 언급한다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 코딩 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하며 DNA 폴리머라아제가 디옥시리보 뉴클레오티드 사슬 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 모사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.
용어 "분리"는 그 물질이 원래의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들면, 자연 발생하는 살아 있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 분리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 운송체 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 부분이거나 폴리펩티드는 구성의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 구성이 자연 환경의 일부가 아닐 때 여전히 분리될 수 있다.
본 발명에서 밝혀지는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "순수한" 형태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제조 또는 부분적으로 정제된 제조를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리에서 분리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게 2~3개 순서, 및 더 바람직하게는 4~5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한 바람직하게는 중량으로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%; 및 심지어는 바람직하게 99%보다 큰 순도를 가진 특허청구범위에 기재된 폴리펩티드는 명시적으로 심사숙고된다.
본 발명에서 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 여기에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도(예를 들면)의 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도임을 의미한다. 중량으로 약 0.5%, 1%, 5%, 10%, 및 20% 강화된 제조도 심사 숙고된다. 서열, 구축물, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 격리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 따로 또는 임의적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응(즉, 면역성 활동이 있는)을 생성하고 인간과 같은 받는 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 그렇지 않으면, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.
여기에서 사용되는, "부분", "분절" 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 언급한다. 예를 들면, 만약에 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제 치료를 받는다면, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 언급한다.
본 발명에 따라, 서열을 언급할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 언급한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]
여기서 C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이되,
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열의 각 차이, 및
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산, 차이를 구성하며,
(iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하고;
R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.
만약에 위에서와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 88% 상동성인 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I의 분자에 결합하는 능력 또는 신장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두 개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하여 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는 예를 들면 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 곁사슬이 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 실질적으로 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다(예를 들면 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 곁사슬로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다). 예를 들면, 펩티드 변형에 의해 HLA-A*02 또는 DR와 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지하고 마찬가지로 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지할 수 있다.
이 T 세포는 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의가 된 바 있는 동족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이러한 세포를 죽일 수 있다. 과학 문헌 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 정해진 아미노산 서열을 변형할 수 있고 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 이 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 동족의 펩티드라고 정의된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이 세포를 죽일 수 있다.
여기에서 밝혀진 본래 (변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 아마도 선택적인 다른 부위에서 펩티드 사슬의 부위의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게 이러한 치환은 아미노산 사슬의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들면, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 보수적일 수 있다. 심지어 더 보수적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용인되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"를 정의하는데 기본이 된다.
여기서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1- 작은 지방성, 무극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2- 극성, 음성 하전된 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3- 극성, 양성 하전된 잔기(His, Arg, Lys); 군 4- 큰, 지방성, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 군 5- 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보수적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산을 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되는 L-아미노산으로 교체할 수 있고 여기에서 공개를 통해 계속 포함시킬 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역성과 면역성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 테스트된다. 최대, 펩티드에서 4 곳 이상의 위치에서 동시에 치환될 수 없을 것이다.
본 문서에서 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스-II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환되도록 할 수 있다. 또 다른 구현에서는, 본 문서에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드에 있어서, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스-II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 아미노산이 그에 대한 보존적 교환 파트너(다음을 참조)와 교환될 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는데 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.
[표 6]
서열 식별 번호 7, 32, 46 및 76에 따른 바람직한 펩티드의 변이체 및 모티프
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더 긴(신장된) 펩티드도 적합할 수 있다. 대개 길이가 8-11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성이 있다. 실제 에피톱이 양측에 있는 장기는 처리 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.
본 발명의 펩티드는 아미노산을 최대 4개까지 연장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 일체의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 신장의 조합은 표 7에서 찾을 수 있다:
[표 7]
본 발명의 펩티드들의 신장에 대한 조합
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연장/신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성이나 가용성 강화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특정 에피톱과 동일하거나 또는 실질상 동일한 항원적 활동력을 가지고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함할 수 있다.
대체의 구현에서, 펩티드는 한쪽 또는 양쪽으로 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 총 30개의 아미노산 길이만큼 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 초래할 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하며 여기서 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100 사이이며, 바람직하게는 8 내지 30 사이이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14 사이이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 신장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 특이적 펩티드의 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2개, 보다 바람직하게 3개의 개별 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 따라 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다.
"본질적으로 구성되는"이란 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 따른 서열 또는 변이체 외에도 본 발명에 따른 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에 추가적으로 위치하고 있는 아미노산이 MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로 기능하는 펩티드의 한 부분을 반드시 형성하지 않는 아미노산들을 포함하는 것을 의미해야 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 추가된 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 내로 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서, 펩티드는 예를 들면 NCBI, GenBank Accession-number X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원 결합 불변 사슬(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적화 될 수 있도록 여기서 설명된 상기 항체나 그 기능적 일부 특히 항체의 서열에 대해 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 또는 그 안으로 융합될 수 있다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
반대 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조 문헌으로 포함된 Meziere 등(1997)(Meziere et al., 1997)에 설명되어 있다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 곁사슬의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. Meziere 등 (Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 레트로 역위 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-이다. 미국 특허 번호 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응을 시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 사슬의 비펩티드 결합(-CH2-NH)을 위한 고체상 합성의 방법을 제공한다.
위에서 묘사된 서열로 이루어진 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가 시키기 위해 추가적인 화학 기를 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, 또는 t-부틸옥시카보닐 기 등 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐-기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카르복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 입체적 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 본 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들어, 이 문헌의 참조 문헌에 포함되어 있는 R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004(Lundblad, 2004)에 잘 묘사되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 화합물과 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드에 의한 카르복시메틸레이션 및 시안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카르바밀화를 포함하지만 이에 국한 되지 않은 변형을 언급한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 당업자는 Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan 등(John Wiley & Sons NY 1995-2000)(Coligan et al., 1995)의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 이웃자리 디카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하게 나타난다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어, 디메틸피로카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-히드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표면 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는 예를 들어 이오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-키드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르 캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변환은 히드로겔 준비시 사용되는 단백질을 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합하는 동시 순환 반감기의 증가를 시키는 것과 흔히 관련되어 있다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드 또는 변이체, 여기에서 펩티드는 변환되었거나 또는 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 구현에서 바람직하다. 일반적으로 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 링크를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있으며, 이는 Lukas 등(Lukas et al., 1981) 및 여기에 인용된 참조문헌에 공개되어 있다. 일시적인 N-말단 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호 기의 반복적인 절단은 N, N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘를 이용하여 이루어진다. 곁사슬 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴이 사용되어 곁사슬 아미도 기능을 보호한다. 고체형 보조는 디메틸아크릴아미드(백본-모노머), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능 작용제)의 3개의 모노머로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N, N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-히드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하고 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완료 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 곁사슬 보호 기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저로는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드에 포함되어 있는 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상과 액체상 방법의 결합 또한 가능하다(예를 들면, (Bruckdorfer et al., 2004) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌 참조).
트리플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발된 후 디에틸에테르에 의한 분사슬에 의해 제거되어 조펩티드를 생성한다. 존재하는 일체의 스캐빈저는 수용액 상태에서 냉동건조에 의한 간단한 추출 과정에 의해 제거되어 스캐빈저가 없는 조펩티드를 생성한다. 펩티드 합성의 시약은 일반적으로 예를 들면 칼바이오켐-노바바이오켐(노팅힐)(Calbiochem-Novabiochem(Nottingham)로부터 입수할 수 있다.
정제는 재 결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 (보통) 예를 들면 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등의 단일 방법 또는 이의 결합 방법에 의해 수행할 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 영동법, 특히 모세관 전기 영동법, 고체상 추출법(CSPE), 고성능 역단계 액체 크로마토그래피, 산성 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격(FAB) 질량 분석법 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분석법 등에 의해 이루어질 수 있다.
과다 제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간 샘플 제시는 물론 복제 변이를 보여주는 제시 프로필이 계산된다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 개체 샘플을 정상 조직 샘플의 베이스라인에 병치된다. 그런 다음, 이 프로필 각각에 대해 선형 혼합효과 모형의 p-값을 계산하고(Pinheiro et al., 2015) 오류 발견율(Benjamini and Hochberg, 1995)에 대한 복수의 검사를 조절함으로써 과다 제시 점수에 통합될 수 있다.
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻은 HLA를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 확인했다. 확인된 펩티드는 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 췌장암 샘플(N = 20 A*02-양성 샘플) 로부터 기록된 TUMAP의 분절 패턴을 동일한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 분절 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 이 펩티드는 종양 세포의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 그 결과는 췌장암에 대해 식별된 펩티드의 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
발견 파이프라인 XPRESIDENT v2.1(예를 들어 전체가 여기에 포함되는 US 2013-0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련된 과다 제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 비표지 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과다제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
췌장암 샘플로의 HLA-펩티드 복합체를 정제했으며, HLA-관련 펩티드를 분리하여 LC-MS에 의해 분석했다(실시예 참조). 본 출원에 포함된 모든 TUMAP는 이러한 접근 방식으로써 원발성 췌장암 샘플 상에서 식별하여 췌장암에 대한 제시를 확인했다.
복수의 췌장암 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 비표지 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 과다한 존재와 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을 LS-MS 실험을 중심 경향에 근거하여 정상화하고 샘플 당 평균화하여 제시 프로필이라 부르는 막대 도표에 통합시켰다. 이 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 시간 성격 및 정체 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
본 발명은 암/종양, 바람직하게는 본 발명의 펩티드를 과도하게 또는 배타적으로 제시하는 췌장암의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이 펩티드들은 인간 췌장암 샘플 및/또는 PC 샘플의 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 질량 분석법에 의해 나타났다.
펩티드가 유래하는 소스 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)의 다수는 소스 유전자에 대한 고도의 종양 연관을 표출하는 정상 조직과 비교해서 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다 - 본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 소스 유전자와의 높은 정도의 종양 연관성을 발휘하는 종양-상응 유형의 건강한 췌장 세포 또는 기타 정상 조직 세포를 의미한다(실시예 2 참조). 게다가 펩티드 자체는 종양 조직에서 강력히 과다제시된다 - 본 발명과 관련하여 "종양 조직"은 정상 조직상의 것이 아니라 췌장암 샘플을 의미한다(실시예 1 참조).
HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해서 인식된다. T 세포는 인식된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포, 예를 들어 유도된 펩티드를 제시하는 췌장암의 세포를 파괴할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있고/거나 과다 제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 예를 들어 가용성 TCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3, 실시예 4 참조). 더욱이 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 찾을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들면, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 표적 펩티드가 비교가능한 복사 수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특이적일 수 있다.
본 설명은 또한 알파 사슬 및 베타 사슬("알파/베타 TCR")를 구성하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 또한 MHC 분자에 의해 제시될 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 HAVCR1-001 펩티드가 제공된다. 본 설명은 또 본 설명의 TCR 및 펩티드의 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
"T 세포 수용체"(약자로 TCR)란 용어는 알파 폴리펩티드 사슬(알파 사슬) 및 베타 폴리펩티드 사슬(베타 사슬)로 구성되는 이종이합체 분자를 칭하며 이종이합체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시되는 펩티드 항원에 결합할 수 있다. 이 용어는 또한 소위 감마/델타 TCR도 포함한다.
한 구현에서 이 설명은 여기서 설명한 TCR 생산 방법을 제공하며 이 방법은 TCR의 발현 촉진에 적합한 조건 하에서 TCR을 발현시킬 수 있는 숙주 세포의 배양으로 구성된다.
다른 양상에서 본 발명은 본 설명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 상기 항원이 적절한 항원-제시 세포 또는 인공 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자에 로딩되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체를 사합체화함으로써 상기 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사합체에 로딩된다.
알파/베타 TCR의 알파 및 베타 사슬 및 감마/델타 TCR의 감마 및 베타 사슬은 일반적으로 각각 두 개의 "도메인" 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연속으로 구성된다. 가변 도메인은 선도 구역(L)도 포함할 수 있다. 베타 및 델타 사슬도 다양성 구역(D)을 포함할 수 있다. 알파 및 베타 불변 도메인은 알파 및 베타 사슬을 세포막에 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인도 포함할 수 있다.
감마/델타 TCR에 대하여, 여기서 사용된 "TCR 감마 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L) 없는 TCR 감마 V(TRGV) 구역의 연속을 지칭하며, TCR 감마 불변 도메인이란 용어는 세포의 TRGC 구역이나 C-말단 각추 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로 "TCR 델타 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L)이 없는 TCR 델타 V(TRDV) 영역 및 TCR 델타 D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연속을 지칭하며 "TCR 델타 불변 도메인"이라는 용어는 세포의 TRDC 영역 또는 C-말단 절단 TRDC 서열을 지칭한다.
본 설명의 TCR은 바람직하게는 결합 친화성(KD)이 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 25 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하로서 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체에 결합한다. 더욱 바람직하기로는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하의 결합 친화성을 갖는 고친화성 TCR이다. 본 발명의 TCR에 대한 바람직한 결합 친화성 범위의 비제한적 실례에는 약 1 nM에서 약 10 nM; 약 10 nM에서 약 20 nM; 약 20 nM에서 약 30 nM; 약 30 nM에서 약 40 nM; 약 40 nM에서 약 50 nM; 약 50 nM에서 약 60 nM; 약 60 nM에서 약 70 nM; 약 70 nM에서 약 80 nM; 약 80 nM에서 약 90 nM; 및 약 90 nM에서 약 100 nM이 포함된다.
본 설명의 TCR과 관련하여 여기서 사용되는, "특이적 결합" 및 이의 문법적 변이들은 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체의 결합 친화성(KD)이 100 μM 이하인 TCR을 의미한다.
본 발명의 알파/베타 이종이합체는 그 불변 도메인 사이에 개입된 이황화 결합이 있을 수 있다. 이 유형의 바람직한 TCR에는 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열이 있는 것들을 포함하지만 단 TRAC의 Thr 48을 TRBC1이나 TRBC2의 Ser 57은 시스테인 잔기에 의해 교체되고, 상기 시스테인은 TRAC 불변 도메인 서열과 TCR의 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열 사이에 이황화 결합을 형성한다.
위에서 언급된 도입된 사슬사슬간 결합의 유무와 무관하게, 본 설명의 알파/베타 이종이량체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있으며, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1이나 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 기본 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 설명의 TCR은 방사선핵종, 형광단 및 비오틴 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 본 설명의 TCR은 방사성핵종과 같은 치료적으로 활성인 제제, 화학요법 제제 또는 독소에 결합할 수 있다.
한 구현에서, 알파 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖고/거나 베타 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 발명의 TCR이 돌연변이되지 않은 TCR에 비해 변형된 글리코실화를 갖는다.
한 구현에서, TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 TCR의 HAVCR1-001 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화성 및/또는 결합 반감기가 돌연변이되지 않은 TCR 알파 사슬 및/또는 돌연변이되지 않은 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR의 그것보다 적어도 2배이다. 종양 특이적 TCR의 친화성-강화 및 그 착취는 최적의 TCR 친화성에 대한 창의 존재에 의존한다. 그러한 창의 존재는 HLA-A2-제약된 병원체는, HLA-A2-제약된 종양 관련 자가-항원에 비해 KD 값이 일반적으로 약 10배라는 관찰에 근거한다. 종양 항원이 면역원성의 잠재성을 갖더라도, 종양이 개인 자신의 세포로부터 발생하기 때문에, 돌연변이된 단백질이나 변형된 번역 처리를 갖는 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보여지는 것으로 현재 알려져 있다. 상향조절되거나 과발현된 항원(소위 자가-항원)이 종양에 대해 기능적 면역 반응을 반드시 유도하지는 않을 것이다. 이러한 항원에 대해 반응성이 높은 TCR을 발현하는 T 세포는 자가-항원에 대해 낮은 친화성의 TCR을 가진 T 세포만 남는다는 의미로 알려진 중추 관용의 과정에서 흉선 내에서 부정적으로 선택되었을 것이다. 그러므로 본 발명의 TCR 또는 변이체의 HAVCR1-001에 대한 친화성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 강화시킬 수 있다.
본 설명은 또한 본 발명에 따른 TCR의 식별 및 분리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02-음성의 건강한 공여자로부터 PBMC를 A2/HAVCR1-001 단량체로써 배양, PBMC를 사합체-파이코에리스린(PE)으로써 배양 및 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.
본 설명은 또한 본 설명에 따른 TCR의 식별 및 분리에 관한 것으로, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 수집물을 발현하는 전체 인간 TCR飡 유전자 자리들(1.1 및 0.7 Mb)로써 유전자이전 마우스의 획득, HAVCR1-001 에 의한 마우스의 면역접종, 유전자전이 마우스로부터 얻어진 PBMC의 사합체-홍조(PE)에 의한 배양, 및 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.
한 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, 본 발명의 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 인코딩하는 핵산을 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 이 재조합 바이러스를 생성한 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 검사한다. 다음 최종 생성물의 일정 부분을 사용하여 표적 T 세포 군락(일반적으로 환자 PBMC로부터 정화됨)을 형질도입하며, 이는 확장된 다음 환자에게 주입한다.
다른 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, TCR RNA은 당업계에서 알려진 기법으로 예를 들어 시험관 내 전사 시스템에서 합성한다. 다음, 시험관 내에서 합성된 TCR RNA를 건강한 공여자로부터 얻은 원발성 CD8+ T 세포에 전기천공에 의해 도입함으로써 종양 특이적 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 재발현시킨다.
발현의 증가를 위해, 본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 강력한 촉진자에 작동가능하게 연관시킬 수 있으며, 이는 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포 바이러스(CMV), 마우스 줄기세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세르산 인산화효소(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 및 원숭이 바이러스 40(SV40)/CD43 복합 촉진자, 연장 인자(EF)-1a 및 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 촉진자 등이다. 바람직한 구현에서, 이 촉진자는 발현 중인 핵산에 대해 이종이다.
강력한 촉진자 외에도, 본 설명의 TCR 발현 카세트에는 이식 유전자 발현을 강화시킬 수 있는 추가의 요소들이 포함될 수 있으며, 이는 렌티바이러스성 구축물의 핵 전위를 촉진하는 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT), (Follenzi et al., 2000) 및 RNA 안정성의 증가를 통해 이식 유전자 발현의 수준을 증가시키는 wPRE(우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소) (Zufferey et al., 1999) 등을 포함한다.
본 발명의 TCR의 알파 및 베타 사슬은 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩할 수 있거나 동일한 벡터에 의한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩할 수 있다.
고수준의 TCR 표면 발현의 성취는 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 고수준으로 전사되는 것을 요구한다. 이를 위해서는, 본 설명의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 단일 벡터에서 비시스트로닉 구축물로 클로닝될 수 있으며, 이는 이러한 장애물을 극복할 수 있는 것으로 나타난 바 있다. TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 사이에 있는 바이러스성 내부 리보좀 엔트리 부위(IRES)를 사용하는 경우 두 사슬의 발현 조정을 초래하는데, 이는 번역 동안 2개의 단백질로 분해되는 단일 전사물로부터 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 생성됨으로써 동일한 몰 비율의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 생성되도록 보장하기 때문이다(Schmitt et al. 2009).
본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 코돈의 최적화를 통해 숙주 세포의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전 부호의 중복성으로 인해 일부 아미노산은 하나보다 많은 코돈에 의해 인코딩이 가능하지만, 특정 코돈은 다른 것보다 덜 '최적'인데 이는 tRNA는 물론 다른 인자의 짝짓기에 대한 상대적 가용도 때문이다(Gustafsson et al., 2004). 각 핵산이 포유류 유전자 발현을 위해 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 서열의 변형은 물론 mRNA 불안정성 모티프 또는 잠적 스플라이스 부위의 제거는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 발현을 유의하게 강화시키는 것으로 나타났다(Scholten et al., 2006).
더욱이 도입된 TCR 사슬에 따라 내인성 TCR 사슬 사이의 틀린 짝짓기는 자가 면역에 대해 상당한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합 TCR 이합체의 형성은 제대로 짝짓기된 TCR 복합체의 형성에 가용한 CD3 분자의 수를 감소시킬 수 있으며, 그리하여 도입된 TCR를 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007).
잘못된 짝짓기를 감소시키려면, 본 설명의 도입된 TCR 사슬의 C-말단 도메인을 변형하여 사슬간 친화성을 촉진시킬 수 있는 반면, 내인 TCR과 도입된 사슬의 짝짓기 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 전략에는 인간 TCR-알파 및 TCR-베타 C-말단 도메인의 상응하는 마우스 도메인에 의한 교체(마우스 C-말단 도메인); 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 모두에 제2 시스테인 잔기를 도입하여 C-말단 도메인에서 제2 사슬간 이황 결합의 생성(시스테인 변형); TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 C-말단 도메인에서 상호작용하는 장기들의 교환(놉-인-홀); 및 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬의 가변 도메인을 CD3ζ에 대한 직접 융합(CD3ζ 융합)이 포함될 수 있다(Schmitt et al. 2009).
한 구현에서는, 숙주 세포를 본 설명의 TCR을 발현하도록 공학적으로 조작한다. 바람직한 구현에서는, 이 숙주 세포가 인간 T 세포 또는 T 전구세포이다. 일부 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 암 환자로부터 얻는다. 다른 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 건강한 공여자로부터 얻는다. 본 설명의 숙주 세포는 치료하려는 환자에 대해 동종이거나 자가일 수 있다. 한 구현에서, 이 숙주는 감마/델타 T 세포 변형을 통해 알파/베타 TCR을 발현한다.
"약학적 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에게 투여하는데 적합한 성분이다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 무균이며 GMP 지침에 따라 생산된다.
약학적 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(상기 내용도 참조). 여기서 사용되는 것처럼, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 언급한다. 예를 들면, 산성 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산성 염을 준비할 때 적당한 산은 예를 들면, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산 인산과 같은 같은 무기산뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 잔기의 염기 염의 준비는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 약학적 조성물의 구현은 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로의 펩티드를 가진다.
바람직하게는, 이 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역요법제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 또는 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체 외로 적용될 수도 있거나 또는 나중에 환자에게 다시 투여될 선택된 면역 세포의 부분 집단에 시험관 내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여 되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 시토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있고, 또는 면역 유도 보조제(아래 참조)와 결합되어 있거나 또는 면역-유도 시토카인과 함께 합성체로 사용되거나, 또는 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 키홀 임펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난과 같은 적절한 담체와 접합시킬 수도 있다(WO 95/18145 및 문헌 (Longenecker et al., 1993) 참고). 펩티드는 표지를 붙일 수도 있으며 융합 단백질일 수 있고 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에서 그 서열이 제공된 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대된다. 그러나 CD8 세포의 자극은 CD4 보조 T 세포에 의해 제공되는 도움이 존재할 때 더 효율적이다. 그러므로 CD8 T 세포를 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4-와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 이 백신은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161를 명시하는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩티드 및 적어도 하나의 추가적인 펩티드 바람직하게는 2개 내지 50개이고, 더 바람직하게는 2개 내지 25개이며, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개이고 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들면 폴리뉴클레오티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이의 결합될 수 있으며, 한 가닥 및/또는 이중 사슬로 되어 있을 수 있고, 또는 본래의 형태일 수도 또는 예를 들면 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형으로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기로 이루어진 그리고 자연적으로 일어나는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.
특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 벡터를 예를 들면 보완 응집성 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들면, 보완 동종중합체 트랙트가 DNA 조각에 추가되어 이를 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 벡터와 DNA 조각은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 연결부위는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결부위는 상업적으로 International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명에서 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 다음의 Saiki RK 등에 의하여 공개된 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다(Saiki et al., 1988). 이 방법은 예를 들면 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로 DNA를 도입하는데 사용하거나 또는 당업계에서 알려져 있는 DNA를 다른 유용한 용도를 위해 변형하는데 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로 바이러스 벡터일 경우, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되며 이는 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 공지된 기술과 여기에서의 교시내용을 고려하여 적절히 수정하여 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있고, 이러한 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하도록 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 이러한 기법은 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 번호 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.
본 발명의 화합물을 만드는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적절한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법 및 에피솜 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 조절 제어 뉴클레오티드 서열(그러나, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)에 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택이 가능한 특성(예: 항생제 내성)을 코딩하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택이 가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는데 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 문서에서 기술된 내용을 고려하여 당업자가 이미 알고 있는 적절한 상태에서 충분한 시간 동안 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(E. coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들면 아스퍼길러스 스피시즈(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC Cell Biology Collection에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항성 마커를 포함한다. 하나의 예는, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA 에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3를 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들면 Sigma-Aldrich로부터 입수한) CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 감지, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 감지 시 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 작동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로써 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는 예를 들면 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH poly A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항원, 레진, 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
다른 구현에서는 본 발명의 2개 이상 펩티드나 펩티드 변이체가 인코딩 됨으로써 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양" 구축물과 유사). 그렇게 함으로써 펩티드나 펩티드 변이체는 예를 들어 LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있으며 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구축물은 암 요법에서도 사용할 수 있으며 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구축물에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA에서 구할 수 있는 에스케리치아 콜라이 균주 DH5, 및 American Type Culture Collection(ATCC), Rockville, MD, USA(No ATCC 31343)에서 RR1이 입수가능하다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효소, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501를 포함하며, 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들면 Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1- 58829-262-9 및 당해 분야의 숙련자에게 알려진 다른 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구축물로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들면 Cohen 등(Cohen et al., 1972) 및 (Green and Sambrook, 2012)를 참조한다. 효모 세포의 형질전환은 Sherman 등에 설명되어 있다(Sherman et al., 1986). Beggs의 방법(Beggs, 1978) 또한 유용하다. 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들면 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제는 Stratagene Cloning Systems 또는 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 및/또는 세포를 감염시키는데 유용하며 이는 효소 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환이 된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구축물을 가지고 있는 세포는 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 감지될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 효소 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 그러나, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩이 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 함유하는 재조합 융합 단백질로 로딩된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료에 대해 미국 식품안전청(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인된 바 있다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 이의 변이체를 생산하는 방법, 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 분리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.
다른 구현에서는 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들면, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥 내(i.v.) 투여, 피부 하(s.c.) 투여, 피부 내(i.d.) 투여, 복강 내(i.p.) 투여, 근육 내(i.m.) 투여를 포함한다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m., 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 ㎍ 및 1.5 mg, 바람직하게는 125 ㎍ 내지 500 ㎍의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상실험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).
면역 접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들어 Teufel 등(Teufel et al., 2005)이 제공하고 있다. 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 한 개 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있으며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총(gene-gun)"을 통한 것과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩 된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 언급한다(예: 항원에 대한 CD80-양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서 본 발명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA: 등록상표, 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel(등록상표)벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. Freund's 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇 면역적 보조제(예: MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 묘사된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 시토카인도 사용될 수 있다. 몇몇 시토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동에 영향을 주는 것에 직접적으로 연관된 바 있으며(예: TNF-), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원 제시 세포로의 성장을 가속시키고(예: GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 번호 5,849,589, 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역할을 한다(예: IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파, IFN-베타)(Gabrilovich et al 1996).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 선천(비적응) 면역 반응을 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 촉진시키는 alum 또는 비완성된 프로인트 보조제(Freund's adjuvant(IFA))와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 번호 6,406,705 B1는 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특이 면역 반응을 일으키는 항원의 결합 사용에 대해 묘사한다. CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, Germany)에 의해 만들어진 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpGs(예: CpR, Idera), Poly(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 그 유도체(예: 앰프리젠(AmpliGen, 힐토놀(Hiltonol, poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙(Bevacizumab, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 안티-CTLA4와 같은 면역활성적인 작은 분자 및 항체 및 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예: anti-CD-40, anti-TGFbeta, anti-TNFalpha 수용체) 및 SC58175가 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 숙련된 기술자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 및 PLG 또는 비로솜 미립자 제제이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론 알파와 같은 콜로니 자극 인자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC(Hiltonol: 등록상표) 및 anti-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 담체에 용해 또는 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 시토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수도 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은 예를 들어 다음에서 확인할 수 있다: A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북(Kibbe, 2000). 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 예방, 방지 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는 예를 들어 EP2113253에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 몇몇 표적만을 다루며 종양으로 하여금 공격에 쉽게 적응하도록 유발할 수 있는(종양 탈출) 백신에 비해 이점으로 작용한다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 항원의 패턴을 발현하는 것은 아니다. 그러므로 몇몇 종양 연관 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 한다. 이 조성물은 각 종양이 몇 개의 항원을 발현할 것으로 기대되며 종양 성장 및 유지에 필요한 몇 개의 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 그리하여 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품"으로 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 형결정으로 제약될 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 몇몇 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격되도록 계속 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
여기서 사용된 "골격(scaffold)"이란 용어는 (예: 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 언급한다. 한 구현에서, 골격은 그것이 부착되는 객체(예: (제2) 항원 결합 모이어티)를 표적 부위, 예를 들어 특이한 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 간질(예: 당장의 용도에 따른 펩티드와 MHC의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 구현에서 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중사슬 변수 영역 및 항체 연쇄 변수 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 적어도 하나의 앙키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (가용성) TCR 및 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 검정을 수행할 수 있다.
"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC-복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC-복합체에 더 잘 결합하며, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차-반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 살해의 평가 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 또는 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.
각 골격은 라벨이 제공하는 신호의 존재나 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출 가능하도록 제공하는 라벨링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료나 일체의 다른 해당되는 세포 마커 분자를 사용하여 라벨링이 가능하다. 그러한 마커 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 라벨링은(예를 들어 형광 염료에 의해 제공되는) 형광이나 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.
각 골격은 IL-21, 항CD3, 항CD28와 같은 제2 활성 분자와 접합될 수 있다.
폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는 예를 들어 WO 2014/071978A1의 배경 부분과 거기에 인용된 참조 문헌을 참조한다.
본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머(예를 들어 WO 2014/191359 및 여기에 인용된 문헌을 참조)란 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있으며 특정 표적 구조를 인지할 수 있는 짧은 단일 가닥 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화성 및 특이성으로써 다양한 복합체 표적에 선택적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.
세포 표면에 위치한 분자를 인지하는 압타머가 지난 십 년 동안 동정된 바 있으며 진단 및 치료 접근 방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 소유하지 않는 것으로 나타난 바가 있으므로, 생존의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 정말로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인지하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며 또한 생체 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이 특이적 종양 세포주를 인지하는 압타머가 동정된 바 있다.
DNA 압타머는 다양한 암 세포, 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인지 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성의 그리고 원발성의 건강한 세포는 인지되지 않는다. 동정된 압타머가 특이적 종양 아형을 인지할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
더욱이 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 나노몰 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.
압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 더욱이 일부 압타머는 종양 세포에 의해 섭취되며 그리하여 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적 인도를 위한 분자 부형제로서 기능이 가능함을 보여줄 수 있다.
압타머는 세포와 조직과 같은 복합체 표적, 및 바람직하게는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 사이의 어느 것에 따른 서열로 구성되며 본 발명에 따른 펩티드와 MHC 분자와의 복합체에 대하여, cell-SELEX(지수적 증식에 의한 리간드의 체계적 진화) 기법을 사용하여 선택이 가능하다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 감지하거나 병변 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
그러므로 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 분리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 적어도 하나의 파지의 분리를 포함하며 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
그러한 항체 및 단일 사슬 클래스 I 주조직적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들은 물론 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 출판물(Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003)에 공개되어 있으며, 이들은 본 발명의 목적을 위해 그 전문이 참조문헌에 명백히 포함되어 있다.
바람직하게는 항체는 20 나노몰 미만, 복합체에 대해서 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화력으로써 복합체와 결합하는데, 이는 또한 본 발명의 맥락에서 "특이적"으로 간주된다.
본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드는 기저 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100, 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 8 내지 14인 아미노산이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원 연관 불변 사슬(Ii)에 융합되거나 또는 펩티드는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것으로, 단 펩티드가 완전한 (전부) 인간 단백질은 아니다.
본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 의학에서의 특히 췌장암의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161를 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구를 약제로서 또는 약제의 제조 시사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암세포는 췌장암 세포 또는 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁내막암, 담낭암, 및 담관암과 같은 기타 고형이나 혈액 종양의 세포이다.
본 발명은 또한 췌장암의 진단 및/또는 예후에 사용할 수 있는 여기서 "표적"으로 부르는, 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 여기에서 광범위한 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 무손상 또는 "온전한" 면역글로불린 분자 외에도, "항체"란 용어에는 그러한 면역글로불린 분자들의 단편(예: CDRs, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체 및 면역글로불린 분자의 인간화 버전이 포함되는데, 단 이들은 본 발명에 따른 바람직한 물성들(예: 췌장암 마커 (폴리) 펩티드의 특이적 결합, 암 마커 유전자를 발현하는 췌장암 세포로 증가된 수준의 독소 인도 및/또는 췌장암 마커 폴리펩티드의 활성도 억제)의 어느 것이라도 발현한다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 소스에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 만들어질 수도 있다. 당업자는 췌장암 마커 플리펩티드 또는 이들의 단편이 본 발명의 항체 생성에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 항체를 생성하는데 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정화될 수 있으며, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어질 수도 있다.
예를 들어, 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 cDNA 또는 그 변이체나 단편은 원핵 세포(예, 박테리아) 또는 진핵 세포(예, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 재조합 단백질은 그 후 정화되고 본 발명에 따른 항체 생성에 사용되는 췌장암 마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제조에 사용될 수 있다.
당업자는 두 개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성을 의도하는 사용(예: ELISA, 면역조직화학, 생체 내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득 가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바라는 활성도에 대해 시험된다(예: ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은 다음을 참고한다(예: Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). 예를 들어, 항체는 ELISA 검정, 웨스턴 블롯, 포르말린 고정 암 면역조직화학 염색 또는 동결 조직 절개에서 시험할 수 있다. 치료 또는 생체 내 진단용을 위한 항체는 초기의 시험관 내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
"단클론 항체"라는 용어는 여기서 실질적으로 균등질 항체 개체군으로부터 획득이 된 것을 언급한다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 여기서 특히 중사슬 및/또는 경사슬의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 사슬의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메릭(chimeric)" 항체를 포함한다(미국 특허 번호 4,816,567, 전문이 여기에 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특정적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.
단클론 항체는 미국 특허번호 4,816,567에 설명된 것과 같은 재조합 DNA 방법들에 의해서도 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 격리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예, 마우스 유래 항체의 중사슬 및 경사슬을 인코딩하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
시험관 내 방법 또한 1가의(monovalent) 항체를 준비하는데 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 및 미국 특허 번호 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 소화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편의 동일한 두 개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생산한다.
항체 단편도, 이가 다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 또는 손상이 된지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치의 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생물적 생명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경 우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물작용 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적인 또는 활동적인 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실 험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치-특정 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더욱 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린항체, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 보완 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 바뀐 요구되는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(수납 항체) 이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수납 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 두 개를 포함하며, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역 글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기이라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 변수 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDRs 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이며(US 4,816,567), 온전한 인간 변수 도메인보다 훨씬 적게 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 대체된다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예, 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 배선 돌연변이 생쥐의 항체의 중사슬 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 배선 돌연변이 생쥐로의 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH값은 바람직하게는 약 5 내지 약 8 사이이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5 사이이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로서의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종괴 주위의 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량은 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진 다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg로 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 바람직하게는 췌장암의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 당업자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 치료 항체의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 크기, 수, 및/또는 치료를 받고 있는 대상의 암의 분포 등이 표준 종양 영상 기술을 이용하여 모니터될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어 날 수 있는 종양의 성장을 정지시켜, 종양을 오그라들게 하고, 또는 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 가용성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 가용성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하며, 그 친화력은 상보결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적 상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 목적 상 및 약물로서의 실용적인 용도의 경우, 알파 및 베타 사슬은, 예를 들어 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-사슬 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 및 항-CD3 도메인과 같은 효과기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 병리학자에 의한 생검 샘플에 근거하는 암의 진단을 확인하는데 사용이 가능하다.
항체 또는 TCR은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종으로 라벨이 되고(예, 111 In, 99 Tc, 14 C, 131 I, 3 H, 32 P 또는 35 S) 면역 섬광 조형술을 사용하여 그 종양이 국소화될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 상기 언급된 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 대한 두 개 또는 그 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화성 값(Kd)은 1x10 μM보다 낮다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러 가지의 영상 방법으로 감지될 수 있는 적당한 프로브로 라벨이 될 수 있다. 프로브의 감지 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 두 개의 또는 그 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 여기에 나열된 하나 이상의 방법으로 감지될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 여기에 나열된 프로브로 라벨이 될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 또는 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 라벨된 1차 항체와 2차 항체와 접촉되며 여기서 그 항체는 원위치 단백질 발현의 감지를 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원-제시 세포의 표면에서 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원 특정 방식으로서 활성화시키는데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관 내의 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP이란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA의 카탈로그 번호 CRL 1992에서 구입이 가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863에서 구입이 가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 Ljunggren 등에서 묘사가 된 바 있다(Ljunggren and Karre, 1985).
바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 자극기 세포는 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포를 위한 공동-자극 신호의 제공에 중요한 분자를 발현하는 것 또한 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
만약 항원 제시 세포가 이러한 에피톱을 발현하도록 감염되었다면, 바람직하게는 그 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
T 세포를 시험관 내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 종양-침윤 림프구를 CTL 생성에 사용할 수 있다. Plebanski 등(Plebanski et al., 1995)은 T 세포의 준비에 자기 말초 혈액(PLB) 림프구를 사용했다. 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리 펩티드로 펄스시키거나, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가 조직 T 세포의 생산이 가능하다. 또한, B 세포는 자가 조직 T 세포의 생산에서 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가 조직 T 세포의 준비 시 사용될 수 있다. S. Walter 등(Walter et al., 2003)은 인공 항원 제시 세포(aAPCs)를 사용하는 시험관 내 T 세포의 프라이밍을 묘사하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적절한 방법일 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링을 시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특정 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합력을 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이 이러한 aAPCs-기반 체계는 종종 예를 들면, 인터루킨-12와 같은 시토카인 등 적당한 용해 요소의 첨가를 요구한다.
동종이계 세포는 T 세포의 준비에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 묘사되어 있으며, 여기에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있으며(예를 들면, Porta 등(Porta et al., 1994)), 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 개발에 대해 묘사한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태은 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예, 결합)와 상호작용을 함으로서 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 수가 투여되었을 시 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이는데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 묘사된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 감지될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체 내에서, 본 발명에 따른 CD4-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 또는 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다)(Dengjel et al., 2006)).
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 발명은 본 발명의 아미노산 서 열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 위에 정의된 바처럼 효율적인 T 세포의 수를 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과발현되거나 또는 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것도 의미한다. 발명자는 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는 예를 들면 위에서 묘사된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다: Gattioni 등 및 Morgan 등(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
본 발명의 다른 양태에는 그 핵산이 클로닝되어 숙주 세포 바람직하게는 T 세포로 도입되는 T 세포 수용체를 생성하기 위해 MHC와 복합체가 되는 펩티드의 사용이 포함된다. 이러한 조작된 T 세포는 그리하여 암 치료를 위해 환자로 이전할 수 있다.
본 발명의 모든 분자 즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산은 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 의해 특징지어지는 질병의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는데 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 위에 묘사된 바와 같은 약학적 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;
(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 배합을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및
(c) 임의적으로(i) 용액의 사용 또는(ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 지시.
이 키트는 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 그 용기는 바람직하게 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며; 다용도 용기일 수 있다. 약학적 조성은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침서를 함께 포함한다 적당한 용기는 예를 들면, 병, 바이알(예: 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재질로서 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 표시하는 지시 내용을 그 용기 상에 또는 그와 연관하여 포함한다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 배합을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
배합을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예: 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예: 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞었을 때, 재구성된 배합의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(=75 ㎍)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500 ㎍)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함 하거나(예: 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학적 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 제2 화합물 또는 그들의 약학적 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학적 조성물을 포함한다: 보조제(예: GM-CSF), 화학요법제, 자연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있고 또는 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기 일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 제2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예: 하나 또는 그 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
본 배합은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다. 바람직하게는, 그 투여는 s.c.이며, 가장 바람직하게 i.d. 투여는 주입 펌프에 의할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 췌장암로부터 분리되었으므로, 본 발명의 약제는 바람직하게는 췌장암의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고에서 선택된 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 약학적 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자를 위한 개인화 약학적 조성물의 생산 방법에 관한 것으로, 그 약학적 조성물에 사용되는 상기 적어도 하나의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 구현에서 이 약학적 조성물은 백신이다. 이 방법은 TCR 분리와 같은 하류 용도를 위한 T 세포 클론의 생산 또는 가용성 항체 및 다른 치료 옵션에도 적응할 수 있다.
"개인화 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.
여기에서 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역 원성 및/또는 과다 제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군 또는 조합을 지칭해야 한다. 용어 "창고"는 백신에 포함된 특정 펩티드가 사전 제조되어 물리적 시설에 보관되었음을 함축하는 의도가 아니다(그러나, 그러한 가능성은 고려된다). 생산된 각 개인화된 백신을 위해 펩티드들이 새로 제조될 수 있거나 사전 제조되어 저장될 수 있음이 명백히 고려된다. 창고(예: 데이터베이스의 형태로서)는 다양한 HLA-A HLA-B 및 HLA-C 대립형질을 갖는 췌장암 환자들의 종양 조직에서 고도로 과발현된 종양 연관된 펩티드들로 구성된다. 이는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드 또는 신장된 MHC 클래스 I 펩티드를 포함할 수 있다. 창고는 몇몇 췌장암 조직 샘플들로부터 수집된 종양 연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 마커 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAP에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기에 대한 정량적인 비교를 허용하므로 백신의 항종양 반응을 이끌어내는 용량에 관한 중요한 결론을 도출할 수 있다. 둘째, 어떤 환자에서 "자가" 항원으로 유래한 TUMAP에 대한 인체의 백신-유도 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우, 이것은 "비-자가" 항원으로부터 유래한 중요한 양성 대조 펩티드로서 기능한다. 셋째로, 이것은 환자의 면역능력 상태에 대한 결론의 도출을 가능케 한다.
창고의 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident: 등록상표)이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근 방식은 정상 조직에서 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되는 것이 아닌 고비율의 종양에서 실제로 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택한다는 것을 보증한다. 초기 펩티드 선택을 위해, 환자의 췌장암 샘플 및 건강한 공여자의 샘플들을 단계적 접근 방식으로 분석했다:
1. 악성 물질로부터의 HLA 리간드를 질량 분석법으로 동정했다.
2. 전장 유전체 전령 리보핵산(mRNA)의 발현 분석을 사용하여 다양한 정상 기관 및 조직과 비교하여 악성 조직(췌장암)에서 과발현되는지 평가했다.
3. 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교했다. 2 단계에서 감지된 종양 조직 상에 과다 제시되거나 선택적으로 제시된 바람직하게는 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 인코딩된 펩티드들은 멀티-펩티드 백신의 적절한 TUMAP 후보로서 간주되었다.
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가 증거를 동정하기 위해 문헌 연구를 수행했다.
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 3단계에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 결여(낮은 빈도)에 의해 확인되었다.
6. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 췌장암 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 검사를 수행했다.
한 측면에서는, 펩티드들이 창고에 포함되기 전에 면역원성에 대해 사전선별된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관 내 T 세포 초회감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.
이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로필을 갖는 환자에 대해 선호된다. 현재 개발되고 있는 고정된 성분을 갖는 멀티-펩티드 칵테일과 대비할 때, 창고는 종양에서 항원의 실제 발현과 백신과의 훨씬 더 높은 정합을 허용한다. 선택된 하나의 또는 몇몇 "재고(off-the-shelf)" 펩티드들의 조합을 다중표적 접근 방식으로 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드 선택에 근거한 접근방법은 이미 약 1700만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.
한 양태에서, 이 펩티드는 여기서 또는 다음에 설명된 본 발명에 따른 방법에 근거하여 백신의 포함 여부가 선택된다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 "창고"와 환자 고유의(즉, 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되며, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관 내 면역원성을 나타낸다.
바람직하게는 백신에 포함된 펩티드는, (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)의 동정; (b) (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 적어도 하나의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 동정된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시된 TUMAP는 다음에 의해 동정된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 MHC 리간드의 서열을 동정한다. 바람직하게는 종양 샘플과 정상 조직은 같은 환자로부터 얻는다.
창고(데이터베이스) 모델을 사용하는 펩티드의 선택 외에 또는 그 대안으로서, TUMAP를 신규 환자에서 동정한 다음 백신에 포함시킬 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자의 조직에 상응하는 정상 샘플에 대해 종양 샘플에서 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 동정할 수 있으며, 돌연변이를 특이적으로 표적하는 TUMAP를 동정할 수 있다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체에 대한 염기서열은 전체 유전체의 염기서열결정에 의해 결정할 수 있다. 유전자의 단백질-코딩 영역에서 비동의 돌연변이의 발견을 위해, 유전체 DNA 및 RNA를 종양 조직으로부터 추출하고, 정상의 돌연변이 되지 않은 유전체의 종자계 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 이러한 응용 NGS 접근방법은 단백질 코딩 영역의 염기서열 재결정으로 제약된다(신유전체 염기서열 재결정). 이 목적을 위해, 업체가 공급하는 표적 강화 키트를 사용한 다음 예를 들어 HiSeq2000(Illumina)에 의해 염기서열결정에 의해 인간 샘플의 엑손 DNA를 포착한다. 그 밖에, 유전자 발현의 직접 정량화 및 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA에 대한 염기 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 판독값은 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 그 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양-특이적 체세포 돌연변이는 PBMC-유래 생식세포의 변종과 비교하여 결정한 다음 우선순위화 된다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명한 방법으로 동정한다; (b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 상기 (a)에서 동정된 펩티드와 비교한다; (c) 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 적어도 하나의 펩티드를 창고에서 선택한다; 및 (d) 임의적으로 상기 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드들(TUMAP)을 위에 설명하는 방법으로 동정한다; 및 (b) 상기 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
개인화된 펩티드 기반 백신을 위한 펩티드들이 선택되면, 백신이 생산된다. 백신은 20 ~ 40% DMSO 바람직하게는 약 33% DMSO와 같은 약 30 ~ 35% DMSO에 용해된 개별 펩티드들로 구성된 액체 배합이다.
제품에 포함되는 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 따라 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액들을 동등한 비율로 혼합하여 제품에 포함시킬 모든 펩티드가 포함된 용액을 만드는데 그 농도는 펩티드 당 약 2.5 mg/ml이다. 그런 다음, 주사제용으로 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826 mg/ml의 농도를 얻기 위해 혼합된 용액을 1:3의 비율로 물로 희석한다. 희석시킨 용액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.
최종 벌크 용액을 바이알에 채워 사용시까지 -20 ℃에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578 mg씩 포함하는 700 μL의 용액이 들어 있다. 여기서 500 μL(펩티드 당 약 400 μL)를 피내 주사로 투여하게 된다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단으로도 유용하다. 펩티드가 췌장암 샘플에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 존재하지 않거나 더 낮은 수준으로 존재한다는 것이 결정되었기 때문에, 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
주장되는 펩티드의 혈액 샘플 내 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 다른 알려진 방법의 수단을 통한 특정 펩티드의 검출은 조직 샘플이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 또는 췌장암의 바이오마커로서 사용가능한지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 기의 존재는 병변 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.
병변 조직 샘플의 펩티드의 검출은 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 과정에서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 마커로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들면, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 면역 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료의 접근 방식에서 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다(예를 들면, 이식편대숙주 및 숙주대이식편병의 감지).
이제 본 발명은 그 바람직한 구현을 설명하는 다음의 실시예에서 및 동반되는 도면을 참조하여 묘사될 것이나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조 문헌들은 그 전문이 포함된다.
도 1a 내지 도 1af는 정상 조직(흰색 막대) 및 췌장암(검정색 막대)에서 다양한 펩티드의 과다 제시를 보여준다. 도 1a) 유전자 부호(들): PTGS1, PTGS2, 펩티드: ILIGETIKI (서열 식별 번호: 3) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 지방조직, 3개 부신, 6개 동맥, 5개 골수, 7개 뇌, 3개 유방, 1개 신경, 13개 결장, 1개 난소, 8개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 21개 간, 46개 폐, 3개 림프절, 4개 백혈구 샘플, 3개 난소, 4개 말초 신경, 1개 복막, 3개 뇌하수체, 2개 태반, 3개 흉막, 3개 전립선, 6개 직장, 7개 타액선, 3개 골격근, 5개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 7개 위, 4개 고환, 3개 흉선, 4개 갑상선, 7개 기관, 3개 요관, 6개 방광, 2개 자궁, 2개 정맥, 7개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 91개 중 4개 폐암, 20개 중 1개 난소암, 24개 중 1개 결장직장암, 18개 중 1개 신장암 및 4개 중 1개 방광암에 대해 추가로 검출되었다(도시되어 있지 않음). 도 1b) 유전자 부호(들): COL1A2, 펩티드: FVDTRTLL (서열 식별 번호: 1) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 지방조직, 3개 부신, 6개 동맥, 5개 골수, 7개 뇌, 3개 유방, 1개 신경, 13개 결장, 1개 난소, 8개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 21개 간, 46개 폐, 3개 림프절, 4개 백혈구 샘플, 3개 난소, 4개 말초 신경, 1개 복막, 3개 뇌하수체, 2개 태반, 3개 흉막, 3개 전립선, 6개 직장, 7개 타액선, 3개 골격근, 5개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 7개 위, 4개 고환, 3개 흉선, 4개 갑상선, 7개 기관, 3개 요관, 6개 방광, 2개 자궁, 2개 정맥, 7개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 91개 중 3개 폐암 및 17개 중 1개 식도암에서 추가로 검출되었다. 도 1c) 유전자 부호(들): PTPN14, 서열 식별 번호: AQYKFVYQV (서열 식별 번호: 12) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 지방조직, 3개 부신, 6개 동맥, 5개 골수, 7개 뇌, 3개 유방, 1개 신경, 13개 결장, 1개 난소, 8개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 21개 간, 46개 폐, 3개 림프절, 4개 백혈구 샘플, 3개 난소, 4개 말초 신경, 1개 복막, 3개 뇌하수체, 2개 태반, 3개 흉막, 3개 전립선, 6개 직장, 7개 타액선, 3개 골격근, 5개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 7개 위, 4개 고환, 3개 흉선, 4개 갑상선, 7개 기관, 3개 요관, 6개 방광, 2개 자궁, 2개 정맥, 7개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 20개 중 1개 난소암, 17개 중 2개 식도암, 46개 중 1개 위암, 91개 중 1개 폐암 및 18개 중 1개 신장암에 대해 추가로 검출되었다. 도 1d) 유전자 부호(들): UBR1, 펩티드: SLMDPNKFLLL (서열 식별 번호: 115) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 13개 췌장 세포주, 2개 PBMC 배양액, 1개 전립선 세포 배양, 3개 피부 세포주, 7개 정상 조직(1개 간, 2개 폐, 2개 비장, 1개 위, 1개 기관), 62개 암 조직(8개 뇌암, 2개 유방암, 2개 결장암, 1개 식도암, 1개 담낭암, 5개 신장암, 3개 백혈병, 6개 간암, 19개 폐암, 5개 난소암, 1개 췌장암, 3개 전립선암, 3개 직장암, 1개 피부암, 2개 방광암). 검사한 정상 조직 패널(질병 없음) 및 암 세포주 이종이식 샘플은 도 1a-제C도와 같았으며, 다음으로 구성된다: 1개 지방조직, 3개 부신, 6개 동맥, 5개 골수, 7개 뇌, 3개 유방, 1개 신경, 13개 결장, 1개 난소, 8개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 21개 간, 46개 폐, 3개 림프절, 4개 백혈구 샘플, 3개 난소, 4개 말초 신경, 1개 복막, 3개 뇌하수체, 2개 태반, 3개 흉막, 3개 전립선, 6개 직장, 7개 타액선, 3개 골격근, 5개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 7개 위, 4개 고환, 3개 흉선, 4개 갑상선, 7개 기관, 3개 요관, 6개 방광, 2개 자궁, 2개 정맥, 7개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 6개 중 1개 유방암, 24개 중 5개 결장직장암, 2개 중 1개 담낭암/담관암, 16개 중 6개 간암, 2개 중 1개 흑색종, 20개 중 5개 난소암, 17개 중 1개 식도암, 12개 중 3개 백혈병, 29개 중 7개 뇌암, 91개 중 16개 비소세포 폐암종, 33개 중 3개 전립선암, 18개 중 3개 신장암, 14개 중 3개 소세포 폐암종 및 4개 중 1개 방광암에서 추가로 검출되었다. 도 1d와 표 4와 사이에 종양 유형 목록에 대한 불일치는 표 4에 적용된 보다 엄격한 선택 기준에 기인한 것일 수 있다(자세한 내용은 표 4 참조). 도 1d는 과다 제시 매개변수 및 기술적인 샘플의 품질 시험과 무관하게 펩티드 Y의 검출가능한 제시가 있는 모든 샘플을 보여준다. 도 1e) 유전자 부호(들): NUP205, 펩티드: ALLTGIISKA (서열 식별 번호: 5) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 34개 중 2개 뇌암, 18개 중 1개 유방암, 29개 중 2개 결장암 또는 직장암, 18개 중 1개 식도암, 8개 중 1개 두경부암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 8개 폐암, 20개 중 1개 림프절암, 20개 중 1개 난소암, 18개 중 1개 피부암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1f) 유전자 부호들: NUP160, 펩티드: ALWHDAENQTVV (서열 식별 번호: 19) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 17개 중 2개 담낭암 또는 담관암, 34개 중 2개 뇌암, 18개 중 1개 유방암, 18개 중 1개 식도암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 8개 폐암, 18개 중 2개 피부암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1g) 유전자 부호(들): C11orf80, 펩티드: ILSTEIFGV (서열 식별 번호: 22) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 18개 중 3개 유방암, 17개 중 1개 담낭암, 8개 중 1개 두경부암, 17개 중 5개 백혈구성 백혈병 암, 107개 중 6개 폐암, 20개 중 4개 림프절암, 20개 중 1개 난소암, 19개 중 1개 췌장암, 18개 중 1개 피부암, 21개 중 1개 위암에서 추가로 발견되었다. 도 1h) 유전자 부호(들): FAM83D, 펩티드: FLNPDEVHAI (서열 식별 번호: 37) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 17개 중 2개 담낭암 또는 담관암, 34개 중 2개 뇌암, 18개 중 3개 유방암, 29개 중 6개 결장암 또는 직장암, 18개 중 2개 식도암, 8개 중 2개 두경부암, 23개 중 1개 신장암, 21개 중 5개 간암, 107개 중 25개 폐암, 20개 중 4개 림프절암, 20개 중 7개 난소암, 87개 중 1개 전립선암, 18개 중 2개 피부암, 45개 중 2개 위암, 15개 중 6개 방광암, 16개 중 3개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1i) 유전자 부호(들): DCBLD2, 펩티드: TMVEHNYYV (서열 식별 번호: 46) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 18개 중 1개 식도암 17개 중 1개 담낭암, 8개 중 1개 두경부암, 23개 중 3개 신장암, 107개 중 9개 폐암, 20개 중 7개 난소암, 19개 중 1개 췌장암, 18개 중 1개 피부암, 45개 중 1개 위암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1j) 유전자 부호(들): SHCBP1, 펩티드: RLSELGITQA (서열 식별 번호: 57) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 34개 중 1개 뇌암, 18개 중 1개 유방암, 18개 중 2개 식도암, 8개 중 2개 두경부암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 8개 폐암, 20개 중 4개 림프절암, 18개 중 1개 골수세포암, 20개 중 4개 난소암, 18개 중 4개 피부암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1k) 유전자 부호(들): CTHRC1, 펩티드: VLFSGSLRL (서열 식별 번호: 69) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 18개 중 2개 유방암, 18개 중 1개 식도암, 17개 중 1개 담낭암, 107개 중 9개 폐암, 20개 중 1개 난소암에서 추가로 발견되었다. 도 1l) 유전자 부호(들): CDC27, 펩티드: KISTITPQI (서열 식별 번호: 123) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 34개 중 2개 뇌암, 8개 중 2개 두경부암, 23개 중 1개 신장암, 17개 중 1개 백혈구성 백혈병 암, 21개 중 2개 간암, 107개 중 7개 폐암, 20개 중 2개 림프절암, 18개 중 1개 골수세포암, 18개 중 1개 피부암, 45개 중 1개 위암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 3개 자궁암에서 추가적으로 발견되었다. 도 1m) 유전자 부호(들): UBE2C, 펩티드: ALYDVRTILL (서열 식별 번호: 128) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 18개 중 2개 유방암, 29개 중 3개 결장암 또는 직장암, 17개 중 1개 백혈구성 백혈병 암, 107개 중 8개 폐암, 20개 중 1개 림프절암, 20개 중 1개 난소암, 15개 중 1개 방광암에서 추가로 발견되었다. 제1N도) 유전자 부호(들): MBTPS2, 펩티드: VLISGVVHEI (서열 식별 번호: 146) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 34개 중 7개 뇌암, 18개 중 1개 유방암, 29개 중 2개 결장암 또는 직장암, 18개 중 1개 식도암, 23개 중 1개 신장암, 21개 중 3개 간암, 107개 중 5개 폐암, 20개 중 1개 림프절암, 20개 중 2개 난소암, 87개 중 1개 전립선암, 18개 중 3개 피부암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1o) 유전자 부호(들): PFDN1, 펩티드: KLADIQIEQL (서열 식별 번호: 89) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 29개 중 2개 결장암 또는 직장암, 17개 중 1개 백혈구성 백혈병 암, 107개 중 4개 폐암, 20개 중 4개 난소암, 16개 중 4개 방광암에서 추가로 발견되었다. 도 1p) 유전자 부호(들): PKP3, 펩티드: ALVEENGIFEL (서열 식별 번호: 101) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 17개 중 1개 담관암, 18개 중 2개 유방암, 29개 중 2개 결장암 또는 직장암, 18개 중 2개 식도암, 8개 중 2개 두경부암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 7개 폐암, 20개 중 6개 난소암, 87개 중 3개 전립선암, 15개 중 4개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1q) 유전자 부호(들): GFPT2, 펩티드: LMMSEDRISL (서열 식별 번호: 113) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 17개 중 3개 담낭암 또는 담관암, 34개 중 5개 뇌암, 18개 중 3개 유방암, 29개 중 2개 결장암 또는 직장암, 18개 중 2개 식도암, 8개 중 1개 두경부암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 18개 폐암, 20개 중 3개 림프절암, 19개 중 1개 췌장암, 87개 중 1개 전립선암, 18개 중 2개 피부암, 15개 중 2개 방광암, 16개 중 1개 자궁암에서 추가로 발견되었다. 도 1r) 유전자 부호(들): CCT4, 펩티드: ALSDLALHFL (서열 식별 번호: 127) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 지방 조직, 8개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 9개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 23개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 6개 부갑상선, 1개 복막, 6개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 10개 골격근, 11개 피부, 8개 소장, 12개 비장, 7개 위, 5개 고환, 3개 흉선, 3개 갑상선, 15개 기관, 7개 요도, 8개 방광, 6개 자궁, 10개 췌장, 20개 췌장암 세포주 및 이종이식 샘플. 펩티드는 34개 중 1개 뇌암, 18개 중 2개 유방암, 8개 중 2개 두경부암, 17개 중 3개 백혈구성 백혈병 암, 21개 중 1개 간암, 107개 중 3개 폐암, 20개 중 4개 림프절암, 18개 중 2개 골수세포암, 20개 중 1개 난소암, 18개 중 3개 피부암, 15개 중 4개 방광암에서 추가로 발견되었다. 도 1s) 유전자 부호(들): NUP205, 펩티드: ALLTGIISKA (서열 식별 번호: 5) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 12개 암 세포주, 1개 정상 조직(1개 비장), 22개 암 조직(2개 뇌암, 1개 유방암, 1개 결장암, 1개 식도암, 1개 두경부암, 1개 간암, 8개 폐암, 1개 림프절암, 1개 난소암, 1개 직장암, 1개 피부암, 2개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 제1 E도-제R도에서와 같았다. 도 1t) 유전자 부호(들): NUP160, 펩티드: ALWHDAENQTVV (서열 식별 번호: 19) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 13개 암 세포주, 1개 일차 배양액, 1개 정상 조직(1개 비장), 20개 암 조직(1개 담관암, 2개 뇌암, 1개 유방암, 1개 식도암, 1개 담낭암, 1개 간암, 8개 폐암, 2개 피부암, 2개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1u) 유전자 부호들: C11orf80, 펩티드: ILSTEIFGV (서열 식별 번호: 22) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 암 세포주, 3개 일차 배양액, 1개 정상 조직(1개 림프절), 24개 암 조직(3개 유방암, 1개 담낭암, 1개 두경부암, 5개 백혈구성 백혈병 암, 6개 폐암, 4개 림프절암, 1개 난소암, 1개 췌장암, 1개 피부암, 1개 위암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1v) 유전자 부호(들): FAM83D, 펩티드: FLNPDEVHAI (서열 식별 번호: 37) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 16개 암 세포주, 3개 일차 배양액, 1개 정상 조직(1개 기관), 73개 암 조직(1개 담관암, 2개 뇌암, 3개 유방암, 4개 결장암, 2개 식도암, 1개 담낭암, 2개 두경부암, 1개 신장암, 5개 간암, 25개 폐암, 4개 림프절암, 7개 난소암, 1개 전립선암, 2개 직장암, 2개 피부암, 2개 위암, 6개 방광암, 3개 자궁암). 암검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1w) 유전자 부호(들): DCBLD2, 펩티드: TMVEHNYYV (서열 식별 번호: 46) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 암 세포주, 1개 일차 배양액, 28개 암 조직(1개 식도암, 1개 담낭암, 1개 두경부암, 3개 신장암, 9개 폐암, 7개 난소암, 1개 췌장암, 1개 피부암, 1개 위암, 2개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1x) 유전자 부호(들): SHCBP1, 펩티드: RLSELGITQA (서열 식별 번호: 57) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 20개 암 세포주, 2개 일차 배양액, 2개 정상 조직(1개 골수, 1개 태반), 31개 암 조직(1개 뇌암, 1개 유방암, 2개 식도암, 2개 두경부암, 1개 간암, 8개 폐암, 4개 림프절암, 1개 골수세포암, 4개 난소암, 4개 피부암, 2개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1y) 유전자 부호(들): CTHRC1, 펩티드: VLFSGSLRL (서열 식별 번호: 69) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 5개 암 세포주, 14개 암 조직(2개 유방암, 1개 식도암, 1개 담낭암, 9개 폐암, 1개 난소암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1z) 유전자 부호(들): CDC27, 펩티드: KISTITPQI (서열 식별 번호: 123) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 19개 암 세포주, 2개 일차 배양액, 3개 정상 조직(1개 부신, 1개 간, 1개 태반), 25개 암 조직(2개 뇌암, 2개 두경부암, 1개 신장암, 1개 백혈구성 백혈병 암, 2개 간암, 7개 폐암, 2개 림프절암, 1개 골수세포암, 1개 피부암, 1개 위암, 2개 방광암, 3개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1aa) 유전자 부호(들): UBE2C, 펩티드: ALYDVRTILL (서열 식별 번호: 128) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 10개 암 세포주, 17개 암 조직(2개 유방암, 1개 맹장암, 2개 결장암, 1개 백혈구성 백혈병 암, 8개 폐암, 1개 림프절암, 1개 난소암, 1개 방광암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1ab) 유전자 부호(들): MBTPS2, 펩티드: VLISGVVHEI (서열 식별 번호: 146) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 16개 암 세포주, 2개 일차 배양액, 2개 정상 조직(1개 비장, 1개 자궁), 28개 암 조직(7개 뇌암, 1개 유방암, 2개 결장암, 1개 식도암, 1개 신장암, 3개 간암, 5개 폐암, 1개 림프절암, 2개 난소암, 1개 전립선암, 3개 피부암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1ac) 유전자 부호(들): PFDN1, 펩티드: KLADIQIEQL (서열 식별 번호: 89) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 11개 암 세포주, 2개 정상 조직(2개 부신), 15개 암 조직(2개 결장암, 1개 백혈구성 백혈병 암, 4개 폐암, 4개 난소암, 4개 방광암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1ad) 유전자 부호(들): PKP3, 펩티드: ALVEENGIFEL (서열 식별 번호: 101) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 3개 세포주, 3개 일차 배양액, 2개 정상 조직(2개 결장), 31개 암 조직(1개 담관암, 2개 유방암, 1개 맹장암, 1개 결장암, 2개 식도암, 2개 두경부암, 1개 간암, 7개 폐암, 6개 난소암, 3개 전립선암, 4개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1ae) 유전자 부호(들): GFPT2, 펩티드: LMMSEDRISL (서열 식별 번호: 113) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 8개 암 세포주, 1개 정상 조직(1개 눈), 45개 암 조직(1개 담관암, 5개 뇌암, 3개 유방암, 1개 결장암, 2개 식도암, 2개 담낭암, 1개 두경부암, 1개 간암, 18개 폐암, 3개 림프절암, 1개 췌장암, 1개 전립선암, 1개 직장암, 2개 피부암, 2개 방광암, 1개 자궁암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다. 도 1af) 유전자 부호(들): CCT4, 펩티드: ALSDLALHFL (서열 식별 번호: 127) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 9개 암 세포주, 26개 암 조직(1개 골암, 1개 뇌암, 2개 유방암, 2개 두경부암, 3개 백혈구성 백혈병 암, 1개 간암, 3개 폐암, 4개 림프절암, 1개 골수세포암, 1개 난소암, 3개 피부암, 4개 방광암). 검사한 정상 조직 패널은 도 1e 내지 도 1r에서와 같았다.
도 2a 내지 도 2c는 정상 조직(희색 막대) 및 9개 췌장암 샘플(검정색 막대)의 패널에서 췌장암에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자들의 예시적 발현 프로파일(정상 췌장에 비한 상대적 발현)을 보여준다. 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 부신, 동맥, 골수, 뇌(전체), 유방, 결장, 식도, 심장, 신장(3중), 백혈구, 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 태반, 전립선, 타액선, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 방광, 자궁 경부, 자궁, 정맥, 9개 췌장암 샘플, 도 2a SHCBP1; 도 2b FN1; 도 2c PLEC.
도 3a 내지 도 3d는 예시적 면역원성 데이터(펩티드-특이적 다항체 염색 후 유세포 측정 결과)를 보여준다. 서열 식별 번호 125 펩티드(도 3a, 왼쪽 패널), 서열 식별 번호 148 펩티드(도 3b, 왼쪽 패널), 서열 식별 번호 156 펩티드(도 3c, 왼쪽 패널), 서열 식별 번호 178 펩티드(도 3d, 왼쪽 패널, 위), 및 서열 식별 번호 177 펩티드(도 3d, 왼쪽 패널, 아래) 와의 각 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*24로써 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 세 주기의 자극 후, A*02/서열 식별 번호 125(도 3a), A*02/서열 식별 번호 148(도 3b), 또는 A*02/서열 식별 번호 156(도 3c)로써 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 실행했다. 오른쪽 패널(도 3a, 도 3b, 도 3c, 및 도 3d)은 관련이 없는 A*02/펩티드 복합체로써 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존가능한 단일 유리 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울(Boolean) 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로써 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 중 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시된다.
실시예
실시예 1
세포 표면에 제시한 종양 연관 펩티드의 동정 및 정량화
조직 샘플
환자의 종양 조직 및 세포주는 다음을 통해 제공되었다: University Hospital of Tubingen, Germany, University Hospital of Heidelberg, Germany, NMI Reutlingen, Germany, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA. 정상 조직은 다음을 통해 제공되었다: Asterand, Detroit, USA and Royston, Herts, UK; Bio-Options Inc., CA, USA; BioServe, Beltsville, MD, USA; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, USA; Geneticist Inc., Glendale, CA, USA; Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Scotland, UK; University Hospital of Geneva; University Hospital of Heidelberg; Kyoto Prefectural University of Medicine (KPUM); University Hospital Munich; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, USA; University Hospital of Tubingen, Germany. 모든 공여자의 고지에 의한 동의서가 수술 전 또는 부검 전에 제출되었다. 조직은 절제 직후 충격 동결되었으며 TUMAP의 분리까지 -70 ℃ 이하에서 보관되었다.
조직 샘플에서 HLA 펩티드의 분리
약간 변형된 프로토콜에 따라, 동결된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 면역 침전에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 W6/32, CNBr-활성화 세파로오스, 산성 처리와 한외 여과를 이용해 획득되었다(Falk, et al 1991; Seeger, et al. T 1999).
질량 분광분석법의 분석
얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(nanoAcquity UPLC system, Waters) 용출된 펩티드는 ESI 소스를 갖춘 LTQ- velos 및 융합 하이브리드 질량분광분석기(ThermoElectron)에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 분당 400nL의 유량을 적용하여 1.7 ㎛ C18 역상 물질(Waters)로 충전된 용융-실리카 마이크로모세관 컬럼(75 ㎛ i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 두-단계 180분-10% 내지 33%의 2개 용매 구배를 이용하여 분리되고, 여기서 유량은 분당 300nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 금이 입혀진 유리 모세관(PicoTip, New Objective)이 미세-ESI 소스로의 도입에 사용되었다. LTQ-Orbitrap 분광분석기가 TOP5 전략을 이용한 데이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 사이클은 오비트랩(orbitrap)의 높은 질량 정확도(R = 30000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7500)의 MS/MS 스캔이 이어졌다. 탠덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST와 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 동정된 펩티드 서열은 생성된 자연 펩티드 분절 패턴과 합성을 서열-일치 참고 펩티드와의 비교를 통해 보증되었다.
비표지 상대적 LC-MS 정량화는 이온 계측 즉, LC-MS 특징의 추출 및 분석에 의해 수행했다(Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플 내의 풍부함과 상관관계가 있음을 가정한다. 추출된 특징은 전하 상태 디컨블루션 및 정체 시간 정렬에 의해 더욱 처리되었다(Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). 마지막으로 모든 LC-MS 특징은 서열 확인 결과와 상호 참조하여 다른 샘플과 조직의 정량 데이터를 펩티드 제시 프로필에 합쳤다. 이 정량 데이터를 중심 경향성에 따라 2단 형태로 정상화함으로써 기술적인 생물학적 복제 내에서의 변동을 고려했다. 그리하여 동정된 펩티드는 하나씩 정량 데이터와 연관시키며 샘플과 조직 사이의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 그 밖에 펩티드 후보로부터 얻어진 모든 정량 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보증하고 자동화 분석의 정확성을 확인했다. 펩티드마다 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 보여주는 제시 프로필을 계산했다. 이 프로필은 췌장암 샘플을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다. 예시적인 과다 제시된 펩티드의 제시 프로필이 도 1에 나와 있다. 예시적 펩티드의 제시 점수는 표 8에 나와 있다.
하기 표 8은 제시 점수를 나타낸다. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다제시된(+++), 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다제시된(+) 펩티드를 나열한다.
[표 8]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 2
본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로필
정상 세포와 비교한 종양 세포 상의 펩티드의 과다 제시 또는 특이적 제시는 면역요법에서의 그 유용성에 충분하며 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 그 소스 단백질에도 불구하고 종양-특이적이다. 여전히 mRNA 발현 프로필의 결정은 면역요법을 위한 펩티드 표적의 선택에서 추가적 안정성 수준을 추가한다. 특히 친화성-성숙된 TCR과 같은 안정성 위험이 높은 치료적 옵션의 경우에는, 이상적 표적 펩티드는 종양에 고유하며 정상 조직에서는 없는 단백질로부터 유래될 것이다.
RNA 소스 및 준비
외과적으로 제거된 조직 샘플은 위에서 지적한 바와 같이 각 환자로부터 서면 동의서를 받은 후 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 샘플은 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 총 RNA는 TRIzol(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 샘플로부터 준비되었고 이는 RNeasy(QIAGEN, Hilden, Germany)에 의해 청소되었다; 이 두 개의 모든 방법은 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.
건강한 인간 조직의 총 RNA는 상업적으로 얻어졌다(Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hayward, CA, USA). 여러 개인에서 얻어진 RNA(2에서 123명 의 개인)는 각각의 개인에게 균등 가중치를 두어 섞어졌다.
RNA 샘플의 양과 질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, Germany)에 의해 RNA 6000 Pico LabChip Kit(Agilent)를 사용하여 분석되었다.
마이크로어레이 실험
모든 암과 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 Affymetrix Human Genome(HG) U133A 또는 HG-U133 Plus 2.0 oligonucleotide microarrays(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)에 의해 실행되었다. 모든 단계는 Affymetrix의 사용설명서에 따라 실행되었다. 간단히, 이중가닥 cDNA는 SuperScript RTII(Invitrogen)와 올리고-dT-T7 프라이머(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)를 사용하여 사용설명서에 따라 총 RNA 5 내지 8 ㎍으로부터 합성되었다. 시험관 내 전사는 U133A arrays 를 위한 BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit(ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, USA) 또는 U133 Plus 2.0 arrays를 위한 GeneChip IVT Labelling Kit(Affymetrix)을 사용하여 실행되었다. 이는 cRNA 단편화, 교배 및 스트렙트아비딘-피코에리트리틴 및 비오티닐화된 항-스트렙트아비딘 항체로의 염색으로 이어졌다(Molecular Probes, Leiden, Netherlands). 이미지는 Agilent 2500A GeneArray Scanner(U133A) 또는 Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000(U133 Plus 2.0)를 이용 하여 스캔되었고, 데이터는 기본 세팅을 이용하여 GCOS software(Affymetrix)를 통해 분석되었다. 정상화를 위해, Affymetrix에 의해 제공된 100개의 하우스키핑 유전자(housekeeping)가 사용되었다. 상대적인 발현 값은 시그널 로그 비율을 통해 계산되었고 정상 샘플의 값은 임의로 1.0으로 정해졌다. 본 발명의 췌장암에서 고도로 과발현되는 또는 배타적으로 발현되는 근원 유전자의 예시적 발현 프로필이 도 2에 나와 있다. 추가의 예시적 유전자의 발현 점수는 표 9에 나와 있다.
하기 표 9는 제시 점수를 나타낸다. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다제시된(+++), 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다제시된(+) 펩티드를 나열한다.
[표 9]
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 3
클래스 I 제시 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관 내 초회감작 검사를 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 본 발명자들은 지금까지 22개의 HLA-A*0201제한된 본 발명의 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전구 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다(표 10).
CD8 + T 세포의 시험관 내 초회감작
펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포에 의한 시험관 내 자극을 수행하기 위해, 독일 소재 University clinics Mannheim에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 분리했다. PBMC 및 분리된 CD8+ 림프구는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(PAN-Biotech, Aidenbach, Germany), 100 U/ml 페니실린 / 100 ?g/ml 스트렙토마이신(Cambrex, Cologne, Germany), 1 mM 피루브산 나트륨(CC Pro, Oberdorla, Germany), 20 ㎍/ml 젠타마이신(Cambrex)으로 보충된 RPMI-Glutamax(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)로 구성된 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/ml IL-7(PromoCell, Heidelberg, Germany) 및 10 U/ml IL-2(Novartis Pharma, Nurnberg, Germany) 또한 TCM에 추가했다. pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관 내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 4가지 다른 pMHC 분자 및 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다.
정제된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인체 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-히드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화 했다(Perbio, Bonn, Germany). 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 ㎛의 폴리스티렌 입자였다(Bangs Laboratories, Illinois, USA).
양성 및 음성 대조 자극에 사용된 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 Melan-A/MART-1에서 얻은 펩티드 ELAGIGILTV(서열 식별 번호 179) 및 A*0201/DDX5-001(DDX5에서 얻은 YLLPAIVHI, 서열 식별 번호 180)였다.
800.000 비드/200 μL는 4 x 12.5 ng 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600 ng 비오틴 항CD28를 첨가하여 200 μL의 부피로 만들었다. 1x106 CD8+ T 세포와 2x105의 세척하고 코팅한 비드를 5 ng/ml IL-12 (PromoCell)로 보충한 200 μL TCM에서 그리고 37 ℃에서 3일 동안 배양함으로써 96-웰 플레이트에서의 자극을 개시했다. 배지의 반은 80 U/ml IL-2로 추가된 새로운 TCM에 의해 교환되고 배양은 37 ℃에서 4 일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 세 번 수행되었다.를 조건 당 8가지 다른 pMHC(분자를 사용하는 pMHC 멀티머의 판독을 위해, 이미 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 조합대수적 코팅 접근 방식을 사용했으며, 5가지 다른 형광색소와의 결합을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로 멀티머 분석은 살아있는/죽은 세포를 근적외선(near IR) 염료(Invitrogen, Karlsruhe, Germany), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, Heidelberg, Germany) 및 형광 pMHC 멀티머로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 멀티머 분석의 평가는 FCS Express 소프트웨어(De Novo Software)를 사용하여 수행되었다. 특정 멀티머+ CD8+ 림프구의 시험관 내 프라이밍은 음성 대조군 자극과 비교함으로써 검출했다. 주어진 항원의 면역성은 건강한 기증자의 최소한 하나의 시험관 내 자극된 평가 가능한 웰에 시험관 내 자극 후 CD8+ T 세포주가 포함되는 것으로 확인될 때 나타났다(예를 들면, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 최소한 1%의 특정 테트라머+를 가졌으며 특정 테트라머+ 세포의 백분율은 최소한 음성 대조군 자극의 매체보다 10배여야 한다).
췌장암 펩티드의 시험관 내 면역원성
실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관 내 면역원성은 펩티드 특정 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있었다. 본 발명의 2개의 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 다합체 염색 이후 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조가 도 3에 나와 있다. 본 발명의 4개의 펩티드에 대한 결과는 표 10에 요약되어 있다.
하기 표 10은 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관 내 면역원성을 나타낸다. 본 발명의 출원자가 실행한 HLA-A*02 제한 펩티드에 대한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과시험관 내 면역원성 실험의 결과가 표시된다. 양성 웰 및 공여자의 백분율(평가 가능한 합계)이 다음과 같이 요약된다: 20% 미만= +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 69%= +++; 70% 이상= ++++.
[표 10]
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실시예 4
펩티드의 합성
모든 펩티드는 Fmoc-전략을 사용하여 표준 및 잘 확립된 고체상 펩티드 합성으로써 합성되었다. 각 개별 펩티드의 정체와 순도로 질량 분석법과 분석 RP-HPLC에 의해 결정했다. 펩티드는 백색 내지 황백색 동결건조 배양물(삼불화아세트산 염) 그리고 50% 초과의 순도로서 얻어졌다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 삼불화아세트산 염 또는 아세트산 염으로 투여되지만, 다른 염의 형태 또한 가능하다.
실시예 5
MHC 결합 검정
본 발명에 따른 T 세포 기반 요법의 후보 펩티드를 그 MHC 결합 능력(친화성)에 대해 추가로 시험했다. 개별 펩티드-MHC 복합체는 UV-리간드 교환에 의해 만들었으며, UV에 민감한 펩티드가 UV 조사 후 분할된 다음 분석된 관심 대상의 펩티드로 교환되었다. 펩티드 수용성 MHC 분자를 효과적으로 결합하고 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 막는다. 이 교환작용의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경사슬(β2m) 검출에 근거하여 ELISA를 수행했다. 이 검정은 Rodenko 등에서 일반적으로 설명된 대로 수행했다(Rodenko et al., 2006).
96 웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 PBS에서 실온에서 2 ㎍/ml 스트렙타비딘으로 밤새 코팅하고 4회 세척한 다음 블로킹 완충제를 함유하는 2% BSA에서 37 ℃에서 1시간 동안 블로킹을 진행했다. 되접기된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체가 표준의 역할을 했으며, 그 범위는 15 내지 500 ng/ml였다. UV-교환 반응을 위한 펩티드-MHC 단량체는 블로킹 완충제로 100배 희석되었다. 샘플은 37 ℃에서 1시간 배양 후 4회 세척하고 2 ㎍/ml HRP 접합된 항-β2m으로 37 ℃에서 1시간 배양한 다음 NH2SO4로 정지시킨 TMB 용액으로 검출했다. 흡광은 450 nm에서 측정했다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 초과, 가장 바람직하게는 75% 초과)을 보이는 후보 펩티드가 일반적으로 항체나 그 단편 및/또는 T 세포 수용체나 그 단편의 생성 및 생성을 위해 선호되는데, 이는 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 보이며 MHC 복합체의 해리를 막기 때문이다.
HLA-A*02:01에 대한 HLA-클래스 I 제한된 펩티드의 결합을 펩티드 교환 수율에 의해 범위를 정했다: 10% 이상= +; 20% 이상= ++; 50% 이상 = +++; 75% 이상= ++++.
[표 11]
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참조문헌 목록
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1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Val Leu Phe Asp Val Thr Gly Gln Val 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Val Leu Gly Val Ile Trp Gly Val 1 5 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Val Leu Leu Pro Glu Gly Gly Ile Thr Ala Ile 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Val Met Ala Ser Pro Gly Gly Leu Ser Ala Val 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Val Met Val Asp Gly Lys Pro Val Asn Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Tyr Ile Asp Lys Asp Leu Glu Tyr Val 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu 1 5 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Arg Leu Phe Pro Gly Ser Ser Phe Leu 1 5 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Val Val Tyr Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ala Leu Ile Ala Glu Gly Ile Ala Leu 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ala Leu Ser Lys Glu Ile Tyr Val Ile 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Phe Ile Leu Pro Ile Gly Ala Thr Val 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Phe Leu Ser Asp Gly Thr Ile Ile Ser Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Gly Leu Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val 1 5 10 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Leu Leu Pro Ala Leu Val Ala Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ile Ile Asp Asp Thr Ile Phe Asn Leu 1 5 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Lys Leu Ala Asp Ile Gln Ile Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Lys Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Leu 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Leu Leu Phe Asn Asp Val Gln Thr Leu 1 5 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Tyr Leu Thr Asn Glu Gly Ile Ala His Leu 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ser Ile Asp Ser Glu Pro Ala Leu Val 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Val Met Met Glu Glu Phe Val Gln Leu 1 5 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Ala Leu Ala Asp Asp Asp Phe Leu Thr Val 1 5 10 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Ala Leu Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ala Leu Asp Asp Met Ile Ser Thr Leu 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Ala Leu Asp Gln Lys Val Arg Ser Val 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Ala Leu Glu Ser Phe Leu Lys Gln Val 1 5 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Leu Phe Gly Ala Gly Pro Ala Ser Ile 1 5 10 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ala Leu Val Glu Glu Asn Gly Ile Phe Glu Leu 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ala Leu Tyr Pro Gly Thr Asp Tyr Thr Val 1 5 10 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Ala Val Ala Ala Val Leu Thr Gln Val 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Phe Leu Gln Pro Asp Leu Asp Ser Leu 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Phe Leu Ser Glu Val Phe His Gln Ala 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Phe Val Trp Ser Gly Thr Ala Glu Ala 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Phe Val Tyr Gly Gly Pro Gln Val Gln Leu 1 5 10 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Ile Ala Asp Gly Gly Phe Thr Glu Leu 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Ile Leu Ala Ser Val Ile Leu Asn Val 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ile Leu Leu Thr Gly Thr Pro Ala Leu 1 5 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Leu Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Leu Leu Ser Asp Val Arg Phe Val Leu 1 5 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Leu Met Met Ser Glu Asp Arg Ile Ser Leu 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Ser Leu Phe Pro His Asn Pro Gln Phe Ile 1 5 10 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Ser Leu Met Asp Pro Asn Lys Phe Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Ser Met Met Asp Pro Asn His Phe Leu 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Ser Val Asp Gly Val Ile Lys Glu Val 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu 1 5 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Val Leu Gly Asp Asp Pro Gln Leu Met Lys Val 1 5 10 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Val Leu Val Asn Asp Phe Phe Leu Val 1 5 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Tyr Leu Asp Glu Asp Thr Ile Tyr His Leu 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Met Gln Ala Pro Arg Ala Ala Leu Val Phe Ala 1 5 10 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Lys Ile Ser Thr Ile Thr Pro Gln Ile 1 5 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Ala Leu Phe Glu Glu Ser Gly Leu Ile Arg Ile 1 5 10 <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Ala Leu Leu Gly Lys Leu Asp Ala Ile Asn Val 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Ala Leu Leu Ser Leu Asp Pro Ala Ala Val 1 5 10 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Ala Leu Ser Asp Leu Ala Leu His Phe Leu 1 5 10 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ala Leu Tyr Asp Val Arg Thr Ile Leu Leu 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Ala Leu Tyr Glu Lys Asp Asn Thr Tyr Leu 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Phe Leu Phe Gly Glu Glu Pro Ser Lys Leu 1 5 10 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Phe Leu Ile Glu Glu Gln Lys Ile Val Val 1 5 10 <210> 132 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Phe Leu Trp Ala Gly Gly Arg Ala Ser Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ile Leu Asp Asp Val Ser Leu Thr His Leu 1 5 10 <210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu 1 5 10 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Lys Leu Asp Asp Thr Tyr Ile Lys Ala 1 5 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Lys Leu Phe Pro Gly Phe Glu Ile Glu Thr Val 1 5 10 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Lys Leu Gly Pro Glu Gly Glu Leu Leu 1 5 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Asn Ile Phe Pro Asn Pro Glu Ala Thr Phe Val 1 5 10 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ser Ile Asp Arg Asn Pro Pro Gln Leu 1 5 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ser Leu Leu Asn Pro Pro Glu Thr Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Ser Leu Thr Glu Gln Val His Ser Leu 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Ser Leu Tyr Gly Tyr Leu Arg Gly Ala 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Thr Ala Asp Pro Leu Asp Tyr Arg Leu 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Thr Ala Val Ala Leu Leu Arg Leu Leu 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Thr Thr Phe Pro Arg Pro Val Thr Val 1 5 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Val Leu Ile Ser Gly Val Val His Glu Ile 1 5 10 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Tyr Ala Phe Pro Lys Ala Val Ser Val 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Tyr Leu His Asn Gln Gly Ile Gly Val 1 5 <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Ile Leu Gly Thr Glu Asp Leu Ile Val Glu Val 1 5 10 <210> 150 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Ala Leu Phe Gln Pro His Leu Ile Asn Val 1 5 10 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg Ser Leu 1 5 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Ala Leu Leu Glu Pro Glu Phe Ile Leu Lys Ala 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ala Leu Pro Lys Glu Asp Pro Thr Ala Val 1 5 10 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Lys Val Ala Asp Leu Val Leu Met Leu 1 5 <210> 155 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Leu Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala Val Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Met Leu Leu Glu Ile Pro Tyr Met Ala Ala 1 5 10 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Ser Leu Ile Glu Lys Tyr Phe Ser Val 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Ser Leu Leu Asp Leu His Thr Lys Val 1 5 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Val Leu Leu Pro Asp Glu Arg Thr Ile Ser Leu 1 5 10 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Tyr Leu Pro Asp Ile Ile Lys Asp Gln Lys Ala 1 5 10 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Asn Ala Asp Pro Gln Ala Val Thr Met 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Tyr Leu Gly Arg Leu Ala His Glu Val 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Tyr Leu Leu Ser Tyr Ile Gln Ser Ile 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Ser Leu Phe Pro Gly Gln Val Val Ile 1 5 <210> 167 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Met Leu Phe Gly His Pro Leu Leu Val Ser Val 1 5 10 <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro 1 5 10 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Phe Met Leu Pro Asp Pro Gln Asn Ile 1 5 <210> 170 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Ile Leu Ala Pro Ala Gly Ser Leu Pro Lys Ile 1 5 10 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Thr Met Met Ser Arg Pro Pro Val Leu 1 5 <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Ser Leu Ala Gly Asp Val Ala Leu Gln Gln Leu 1 5 10 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu 1 5 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Ala Leu Leu Glu Ser Ser Leu Arg Gln Ala 1 5 10 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Tyr Leu Met Pro Gly Phe Ile His Leu 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Ser Leu Tyr Lys Gly Leu Leu Ser Val 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val 1 5 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5

Claims (39)

  1. 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별번호 161에 대해 88% 이상 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 변이체는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합하고/거나 상기 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하고, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아닌, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 MHC 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 MHC와 결합시 CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는, 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161의 군에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 ~ 100개의 아미노산, 바람직하게는 8 ~ 30개, 더욱 바람직하게는 8 ~ 16개이고, 가장 바람직하게는 상기 펩티드가 서열 식별 번호 1 ~서열 식별 번호 161의 군에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는, 펩티드 또는 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이고 특히 HLA-DR 항원-연관 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는, 펩티드 또는 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 인코딩하고 임의적으로 이종 촉진자 서열에 연계된 핵산.
  8. 제7항에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포인, 재조합 숙주 세포.
  10. 의학에서의 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 또는 제8항에 따른 발현 벡터 또는 제9항에 따른 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 생산하는 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 제시하거나 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드 또는 이의 변이체를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 활성화 T 림프구를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
    T 세포를 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인공 구축물과 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 항원은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제12항에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화 T 세포, 바람직하게는 활성화 T 림프구.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 표적으로 환자의 몸에서 표적 세포를 괴사시키는 방법으로서,
    제13항에 정의된 효과적인 수의 활성화 T 세포를 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 항체, 특히 가용성 또는 막 결합된 항체로서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합시 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하고, 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유하는, 항체.
  16. 암의 치료 또는 암에 대한 약제의 제조 또는 암 세포의 검출용 진단에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제9항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암이 폐암, 신장암, 뇌암, 위암, 결장 또는 직장암, 간암, 전립선암, 백혈병, 유방암, 메르켈 세포 암종(MCC), 흑색종, 난소암, 식도암, 방광암, 자궁내막암, 담낭암 및 담관암 및 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 중 어느 하나의 펩티드 서열을 포함하는 단백질의 과발현을 보여주는 기타 종양들의 군으로부터 선택되는, 용도.
  18. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제10항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체를 용액이나 동결건조된 형태로 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 용기;
    (b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 배합을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기;
    (c) 임의적으로 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 178로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드; 및
    (d) 임의적으로 (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명
    을 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  21. 개별 환자를 위한 화합물 기반 및/또는 세포 요법으로서의 사용을 위한 개인화 항암 백신의 생산 방법으로서,
    (a) 상기 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드들(TUMAP)을 동정하는 단계;
    (b) 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및/또는 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 (a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계;
    (c) 환자에서 동정된 TUMAP와 일치하는 하나 이상의 펩티드를 창고로부터 선택하는 단계; 및
    (d) (c) 단계에 근거한 개인화 백신 또는 화합물 기반이나 세포 요법을 제조 또는 배합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 TUMAP가
    (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교함; 및
    (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 상기 발현 데이터와 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과의 상관관계를 결정함
    에 의해 동정되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드를 서열결정함에 의해 MHC 리간드의 서열을 동정하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직을 동일한 환자로부터 얻는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드들이 다음 단계들에 근거하여 동정되는 방법:
    (aa) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (ab) 상기 (aa) 단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계, 및
    (ac) 건강한 공여자나 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역 원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계; 또는
    (ba) 질량 분광분석 방법을 사용하여 상기 종양 샘플로부터 HLA 리간드를 동정하는 단계,
    (bb) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (bc) 동정된 HLA 리간드와 상기 유전자 발현 데이터를 비교하는 단계,
    (bd) 상기 (bc) 단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계,
    (be) 종양 조직 상에서 상기 (bd) 단계로부터 선택된 TUMAP 및 건강한 조직 상에서 결여되거나 덜 빈번한 검출을 재검출하고 mRNA 수준에서 과발현의 타당성을 확인하는 단계, 및
    (bf) 건강한 공여자나 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역 원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을, 시험관 내 면역원성 측정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역 모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 검정 및/또는 세포내 시토카인 염색을 포함하는 방법으로 결정하는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 창고가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 178로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 펩티드를 포함하는 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 상응하는 조직에 대해 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 개별 환자로부터 동정하고, 백신에 포함시키거나 세포 요법의 생성을 위해 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 선택함을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 전체 유전체 서열결정에 의해 동정되는 방법.
  30. HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체, 바람직하게는 가용성 또는 막-결합된 T 세포 수용체로서, 상기 리간드가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 동일성을 갖는, T 세포 수용체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161에 대해 88% 이상 동일한, T 세포 수용체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161 중 어느 하나로 구성되는, T 세포 수용체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 수용체가 가용성 분자로 제공되고 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유하는, T 세포 수용체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 인코딩하고 임의적으로 이종 촉진자 서열에 연계된 핵산.
  35. 제34항에 따른 핵산을 발현시키는 발현 벡터.
  36. 제34항에 따른 핵산 또는 제15항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산 또는 제35항에 따른 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포인, 재조합 숙주 세포.
  37. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체의 생산 방법으로서,
    제36항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    상기 숙주 세포 및/또는 그 배양 배지로부터 상기 T 세포 수용체를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  38. 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물:
    (a) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 펩티드;
    (b) 상기 (a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체와 반응성인 T 세포 수용체;
    (c) 상기 (a)에 따른 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변사슬(Ii)의 N-말단 아미노산 1 ~ 80을 포함하는 융합 단백질;
    (d) 상기 (a) ~ (c) 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터;
    (e) 상기 (d)의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포;
    (f) T 세포를 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 상기 (a)에 따른 펩티드와 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하는 방법 및 이러한 활성화 T 세포를 자가 조직 또는 다른 환자에게 이전하는 방법에 의해 얻어지는 활성화 T-림프구;
    (g) 상기 (a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체 및/또는 상기 (a)에 따른 펩티드를 제시하는 세포에 대해 반응성이며 예를 들어 면역-활성화 도메인 또는 독소와의 융합에 의해 잠재적으로 변형되는 항체 또는 가용성 T 세포 수용체;
    (h) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 161로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 및/또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 178로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드와 MHC 분자의 복합체를 인식하는 압타머;
    (i) 상기 (a) ~ (h) 중 어느 하나에 따른 접합된 또는 라벨링된 펩티드 또는 골격 및 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 안정제.
  39. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 압타머.
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