KR20180002700A - 메티오닌의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

메티오닌의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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트렐 와이에스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 CO 및/또는 CO2 기체를, 임의로 H2의 존재에서, 메티오닌으로 생물학적으로 이용하거나 전환할 수 있는 변형된 수소영양 미생물을 이용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

메티오닌의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법
서열 목록에 관한 선언
본 명세서와 관련된 서열 목록은 실제 문서가 아닌 텍스트 포맷으로 제공되며, 이 선언에 의해 본 명세서에 참고로서 포함된다. 본 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 910215_407WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 30.5 KB이며, 2016년 5월 6일에 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자 제출되었다.
발명의 배경
메티오닌은 황을-함유하는, 필수 아미노산으로, 식품 및 의약 산업에서 다양한 용도로 이용된다. 예를 들면, 메티오닌은 동물 사료 및 식품에서 첨가제로 그리고 많은 의약에서 성분으로 사용된다. 따라서, 메티오닌에 대한 높은 산업적 수요가 존재한다.
높은 수요를 충족하기 위해, 메티오닌은 가공이 쉽지 않은 원재료 가령 메틸 메르캅탄, 프로필렌 및 시안화수소를 포함하는 복잡한 화학적 합성을 통해 합성적으로 제조되어 왔다. 메티오닌의 합성적 생산은 까다로운 생산 환경을 요하거나 환경에 유해한 부산물을 배출한다.
출발 물질의 높은 비용과 합성 생산의 환경적 영향으로 인해, 발효에 의해 메티오닌을 생산하는 방법이 바람직할 수 있다. 그러나, 메티오닌의 효율적인 발효적 생산은 메티오닌 내 황 원자의 존재로 인해 복잡해졌다. 또한, 기존 발효 방법은 출발하는 탄소 공급원으로 당과 탄수화물을 사용한다. 탄수화물의 사용은 연중 계속되는 생산 및 환경적 우려에 있어서 믿을만한 원료 물질을 찾는 것 때문에 어렵다. 일례로, 많은 탄수화물 폐기 원료(예컨대, 잔여 작물 바이오매스)는 발효가 가능하지만, 계절의 영향을 받는다. 대안적으로, 일부 작물은 산업적 발효 반응을 위한 탄수화물 생산을 위해 재배될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 식재료 생산을 위해 이용가능한 경작지를 감소시키며 많은 비용이 든다.
메티오닌에 대한 높은 수요 및 비교적 높은 비용 및 발효가능한 탄수화물의 불안정성을 감안할 때, 당해 분야에서는 비용-효과적인 방식으로 메티오닌을 생물학적으로 생산하기 위한 대안적이고 개선된 방법을 필요로 한다. 본 개시는 그러한 필요를 충족하고, 또한 다른 연관된 장점도 제공한다.
상세한 설명
본 개시는 야생형 또는 모 유기체에 비해 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하는 수소영양 미생물의 대사 공학(예컨대, 유전자 변형, 유전자 발현, 유전자 발현 조절)을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
배경 설명을 위해, 고세균 및 수소영양 미생물로 분류되는 종류를 비롯한 많은 미생물은 다른 아미노산, 가령 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산에 관여하는 몇몇 효소를 공유하는 생합성 경로를 통해 메티오닌을 생산한다. 하나 이상의 이들 아미노산 생합성 효소는 유전자 발현의 피드백 조절과 억제, 또는 두 가지 과정을 모두 받는다. 예를 들면, 산업적으로 중요한 아미노산(예컨대, 메티오닌)의 생합성에 탄소 유동을 지시하는데 관여하는 제1의 주된 효소인 아스파르토키나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 아스파르테이트의 인산화를 트레오닌 및 라이신에 의해 알로스테릭 위치에서 저해받는다(Sano 및 Shiio, J. Gen. Appl. Microbiol. 16:373, 1970; Yoshida 등, J. Mol. Biol. 368:521, 2007). 또다른 효소인, 호모세린 O-석시닐전이효소는 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌에 의한 피드백 조절을 받는다(Born 및 Blanchard, Biochem. 38:14416, 1999). 호모세린 탈수소화효소는 메티오닌/트레오닌 생합성 경로의 제1의 주된 효소이지만, 아스파르틸 세미알데히드를 두고 라이신 생합성 경로에 투입되는 제1의 효소인, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소와 경쟁해야 한다. 따라서, 탄소 유동이 메티오닌 또는 라이신 중 어느 쪽으로 가느냐는 어떤 효소가 기질을 획득했느냐에 의존할 것이다.
본 개시는 본 명세서에서 MMP1359 및 MMP1358로 지칭되는, 하나 이상의 변형된 황 동화-연관 개방 판독 프레임(ORF)을 가지는 수소영양 미생물이 야생형(모) 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 비해 메티오닌을 초과생산할 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 추가적인 배경 설명을 위해, Rauch 등(Mol. Microbiol. 94:1330, 2014)은 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans)의 이중 녹아웃 돌연변이에 의해 MA1821 및 MA1822 ORF(이는 각각 MMP1359 및 MMP1358 ORF의 상동체다)로 불리는 ORF가 호모시스테인 형성을 위한 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 활성이 결여된 유전적 배경에서 호모시스테인 생합성에 관여하며; 특히 생물정보학 기술로 확인된 이들 ORF가 혐기성 균에서 설파이드를 호모시스테인으로 결합시키는 과정에 관여하는 것으로 보임을 밝혔다. 비록 Rauch 등(2014)이 MA1821 및 MA1822 ORF가 유전체 상에서 메티오닌 생합성과 공존함을 밝혔으나(이는 호모시스테인 생합성에 관여하는 유전자에게는 일반적이지 않다), 메티오닌 생합성에서 이들 ORF의 역할은 밝혀지지 않았다. 이론에 얽매이는 것을 원치 않으나, 본 개시는 MMP1359 및 MMP1358 ORF가 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌에 의한 피드백 저해를 받으며 본 개시의 변형된 ORF가 메티오닌 피드백 저해에 저항성인 폴리펩티드를 인코딩함을 보여주는 것으로 여겨진다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시는 기체 공급원료(예컨대, 수소 및 탄소산화물, 가령 CO, CO2을 포함하는 기체)의 대사를 촉진하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하게 하는 탈조절된 또는 유전적으로 변형된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 변형된 수소영양 미생물(예컨대, 고세균)을 이용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 개시에 관해 더욱 자세히 살펴보기 전에, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하면 이해하는데 도움이 될 것이다. 추가적인 정의는 본 개시 전체에 걸쳐 제시된다.
본 명세서에서, 어떤 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지정되지 않은 한 나열된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에, 이의 분수(가령 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 어떤 물리적 특징, 가령 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 나열된 임의의 수치 범위는 달리 나타나지 않은 한 나열된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 달리 지정되지 않는 한 언급된 범위, 수치, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 용어 "본질적으로 구성되는"은 청구항의 범위를 명시된 재료 또는 단계에, 또는 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들에 제한한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "한(a)" 및 "하나(an)"가 "하나 이상의" 열거된 구성요소를 가리킴이 이해되어야 한다. 대안적인 표현의 사용(예컨대, "또는")은 대안의 하나, 둘다, 혹은 이들의 임의의 조합을 의미함이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함한다(include)", "가지다(have)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용되며, 이들 용어와 변형태는 비-제한적인 의미로 이해하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 "아스파르테이트 경로 아미노산" 또는 "아미노산의 아스파르테이트 패밀리"는 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌을 비롯한 아스파르테이트로부터 합성된 하나 이상의 아미노산을 가리킨다. 각각의 아미노산의 아스파르테이트 패밀리에 있어서 생합성 경로의 단계들이 나뉘고 분기하지만, 이들 경로는 모두 아스파르테이트 키나아제(또한 아스파르토키나아제로도 지칭됨)에 의한 아스파르테이트의 인산화로 시작된다. 특정 구체예에서, 아미노산의 아스파르테이트 패밀리의 생합성 경로에서 아스파르테이트 키나아제는 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해를 받는다.
본 명세서에서 사용된 "메티오닌 생합성 경로" 또는 "메티오닌 경로"는 메티오닌 및 메티오닌의 생합성에 사용되는 전구체 대사산물(예컨대, 시스테인, 호모세린)의 생합성에 직접 또는 간접적으로 관여하는 하나 이상의 효소들을 가리킨다. 메티오닌 생합성 경로에 포함될 수 있는 예시적인 효소는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-트랜스석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), MMP1358, MMP1359, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "H2/COX 기질" 또는 "H2/COX 공급원료"는 수소(H2)의 이산화탄소(CO2) 또는 일산화탄소(CO) 또는 둘다와의 혼합물을 가리키며, 이는 또한 다양한 다른 성분, 가령 암모니아(NH3), 탄화수소(예컨대, 메탄(CH4)), CO2, CO, 포름알데히드(CH2O), 황화수소(H2S), 황화카르보닐, (COS), 시안화수소(HCN), 수증기, 불활성 기체, 또는 다른 기체를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 미생물은 COX 기질 또는 공급원료를 이용하며, 이는 임의로 H2의 존재 하에 있으며 또한 위에서 언급한 바와 같은 다양한 다른 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "합성 기체" 또는 "합성가스"는 예를 들면, 수증기 개질, 건조 또는 CO2 개질, 자기열 개질, 촉매적 부분 산화 또는 자연 기체 또는 액체 탄화수소의 부분 산화에 의해, 수소 합성 도중, 암모니아 합성 도중, 메탄올 합성 도중, 제강에 의해, 또는 석탄, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생성될 수 있는 일산화탄소 및 수소의 혼합물을 가리킨다. 특정 구체예에서, 합성가스는 수분-기체 이동 반응에 의해 더욱 컨디셔닝될 수 있다. 합성가스는 또한 메탄, CO2, H2S, 또는 다른 기체를 CO 및 H2 보다 더 적은 양으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "숙주"는 관심의 폴리펩티드(예컨대, 탈조절된 MMP1358, 탈조절된 MMP1359)를 생산하는 외인성 핵산 분자를 가지며, 변형되지 않은 숙주 세포보다 메티오닌 생산이 향상된, 녹아웃 또는 이들의 조합에 의한 돌연변이에 의해 유전적으로 변형될 수 있는 세포 또는 미생물(예컨대, 고세균)을 가리킨다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 변이된 또는 외인성 폴리펩티드(예컨대, 탈조절)가 발현되는 것과 관계있거나 관계없이 요망되는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형을 임의로 이미 보유할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 메티오닌 경로로의 추가적인 또는 증진된 탄소 유동 활성, 경쟁 아미노산의 감소된 생산, 빠른 성장, 오염물질 또는 특정 배양 조건에 대한 저항성, 추가적인 탄소 기질을 대사하는 능력, 또는 요망되는 산물 또는 중간체를 합성하는 능력을 부여하는 유전자 변형을 보유하거나 보유하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "수소영양생물" 또는 "수소영양"은 H2를 소비하거나, H2를 산화하거나, 또는 이의 대사 과정 일부로서 H2를 또다른 화합물로 전환할 수 있는 미생물을 가리킨다. 특정 구체예에서, 수소영양생물은 편성(obligate) 혹은 통성(facultative) 수소영양생물, 편성 혹은 통성 혐기성생물, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들면, 통성 수소영양생물은 에너지 공급원으로서 수소의 존재 또는 부재에서 성장할 수 있고, 하나 이상의 다양한 탄소 공급원, 가령 탄수화물, 아세테이트, 포르메이트, 메탄올, 메틸아민, 또는 탄소 산화물을 사용할 수 있다(예컨대, 아세트산 생성 세균인 클로스트리듐(Clostridium)은 H2의 부재에서 성장할 수 있고 에너지 및 탄소 공급원 모두로서 아세테이트를 사용하며; 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei)는 H2의 부재에서 메탄 생성을 위한 대안적인 대사 경로를 이용함으로써 예를 들면, 아세테이트, 메틸아민, 또는 메탄올을 사용하여 생존할 수 있다). 예시적인 수소영양생물은 메탄 생성 세균, 아세트산 생성 세균, Knall-기체 박테리아, 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "메탄 생성 세균" 또는 "메탄 생성 고세균"은 무산소 조건 하에서 (a) 임의의 하나 또는 두 개의 다양한 탄소 기질(예컨대, 이산화탄소, 아세테이트, 포름산, 포름알데히드, 일산화탄소, 메탄올, 메틸 아민(예컨대, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 등)) 및 수소 기체를 이용하는 경로; (b) 아세트산 분해전환 경로에서 아세테이트를 이용하는 경로, 및 (c) 메탄영양생물의 메탄생성 경로에서 탄소-탄소 결합이 결여된 환원된 단일 탄소 화합물 또는 다중-탄소 화합물을 이용하는 경로를 비롯한 임의의 하나 이상의 메탄 생성 세균 경로를 이용하여 메탄을 생성할 수 있는 고세균 미생물을 가리킨다. 예를 들면, 메타노사르시나 종은 적어도 아홉 가지의 메탄 생성 기질(예컨대, 메탄올, 메틸아민, 메틸티올, 아세테이트)을 이용할 수 있는 고세균으로, 메탄 생성을 위한 세 가지 경로를 모두 보유하지만, 메타노사르시나 마제이와 달리 기능적인 H2 환원제가 결핍된 메타노사르시나 아세티보란스만은 H2/CO2 환원으로 생존하지 못한다(Maeder 등, J. Bacteriol. 188:7922, 2006). 그러나, 메타노사르시나 아세티보란스는 CO를 CO2로 산화시킴으로써, 또는 메탄을 생산할 때 전자 수용체로 아세테이트를 이용함으로써 CO를 아세테이트 및 포르메이트로 대사하여 성장할 수 있다. 박테리아는 고세균이 아니며 고세균은 박테리아가 아님이 당해 분야에서 이해된다. 본 명세서에서 사용된 메탄 생성 고세균은 메탄을 생산하기 위해 수소 기체를 필요로 하는 "편성 수소영양생물"(예컨대, 메타노셀라 콘라디이(Methanocella conradii))일 수 있다. 메탄 생성 고세균은 수소 기체의 부재에서 메탄을 생산할 수 있는 "통성 수소영양균"(예컨대, 메타노사르시나 마제이)일 수 있다. 게다가, 메탄 생성 고세균은 중온성, 호열성 또는 고호열성일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "바이오매스"는 생물학적 기원을 가지는 유기물질을 가리키며, 전세포, 용해된 세포, 세포외 물질, 산물 또는 이들의 일부, 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 배양된 미생물(예컨대, 박테리아 또는 고세균 배양물)로부터 수확된 물질은 바이오매스로 고려될 수 있고, 이는 분비된 산물을 포함할 수 있거나 분비된 산물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 또한 폴리뉴클레오티드로도 공지된 "핵산 분자"는 뉴클레오티드로 불리는 공유 결합된 서브유닛을 포함하는 중합체 화합물을 가리킨다. 핵산 분자는 폴리리보핵산(RNA), 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 둘다 단일 또는 이중 가닥으로 되어있을 수 있다. DNA는 cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA, 반-합성 DNA, 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "내인성" 또는 "자연적인"은 숙주 세포에 일반적으로 존재하는 유전자, 단백질, 화합물 또는 활성을 가리킨다. 게다가, 모 유전자, 단백질 또는 활성에 비해 변이, 과발현, 뒤섞임, 이중복제 또는 달리 변형된 유전자, 단백질 또는 활성은 여전히 특정 숙주 세포에 대하여 내인성 또는 자연적인 것으로 여겨진다. 예를 들면, 첫 번째 유전자로부터의 내인성 제어 서열(예컨대, 프로모터, 번역 감쇠 서열)은 두 번째의 자연적인 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 변형 또는 조절하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 두 번째의 자연적인 유전자 또는 핵산 분자의 발현 또는 조절은 모 세포에서의 정상적인 발현 또는 조절과 다르다.
본 명세서에서 사용된 "이종" 또는 "외인성" 핵산 분자, 구조체 또는 서열은 숙주 세포에 자연적이지는 않지만, 숙주 세포로부터의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부와 상동일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부를 가리킨다. 이종 또는 외인성 핵산 분자, 구조체 또는 서열의 원천은 상이한 속(genus) 또는 종일 수 있다. 특정 구체예에서, 이종 또는 외인성 핵산 분자는 숙주 세포 또는 숙주 유전체에, 예를 들면, 접합, 형질전환, 형질주입, 전기천공, 등에 의해 부가되며(즉, 내인성 또는 자연적인 것이 아님), 여기서 부가된 분자는 숙주 유전체에 통합되거나 염색체-외 유전 물질로서(예컨대, 플라스미드 또는 다른 형태의 자가-복제 벡터로서) 존재할 수 있고, 복수의 복제본으로 존재할 수 있다. 또한, "이종"은 숙주 세포가 상동성 단백질 또는 활성을 인코딩하더라도 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산 분자에 의해 인코딩되는 비-자연적인 효소, 단백질 또는 다른 활성을 가리킨다.
용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 이로부터 유래한 것과 유사한 분자 또는 활성을 가리킨다. 예를 들면, 이종 또는 외인성 핵산 분자는 자연적인 숙주 세포 유전자에 상동일 수 있고, 임의로 변형된 발현 수준, 상이한 서열, 변형된 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 상동성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 기준 또는 모 야생형 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 상동성 폴리펩티드는 기준 또는 모 야생형 효소와 비교할 때 하나 이상의 소정의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환(예컨대, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상 또는 최대 20, 25, 또는 30 치환) 또는 특정 수 이하의 아미노산 치환(예컨대, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30 이하의 치환)를 가질 것이며, 단 이때 상동성 단백질 또는 폴리펩티드는 관심의 활성(예컨대, 카르복실화효소, 탈카복실화효소, 탈수소화효소, 에피머라아제, 키나아제, 리아제, 환원효소, 합성효소)을 보유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "비-자연적인" 또는 "비-자연적으로 조작된"은 야생형 또는 모 세포 또는 분자와 상이한 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하도록 유전적으로 조작된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 가리킨다. 예를 들면, 비-자연적인은 야생형 또는 모 미생물과 비교할 때 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현, 또는 유전자 산물의 활성이, 변형(예컨대, 증가된, 감소된, 탈조절된, 활성화된, 탈억제된, 억제된)되도록 조작된(예컨대, 부위-특이적 또는 무작위 돌연변이, 가령 자발적인 돌연변이) 미생물 또는 세포를 가리킬 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들면, 유전자 또는 오페론의 발현을 변형(증가 또는 감소)시키는 비-암호화 조절 부위 내의 것들을 포함한다. "비-자연적인" 유기체, 미생물, 또는 세포는 재조합 유기체, 미생물, 또는 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합"은 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 가리키거나, 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어, 탈조절 또는 구성적이 되도록 변형된 미생물 또는 세포를 가리키며, 여기서 그러한 변형 또는 수정은 유전공학에 의해 도입될 수 있다. 유전자 변형은, 예를 들면, 세포의 유전 물질의 혹은 이에 더하여 하나 이상의 단백질 또는 효소를 인코딩하는 핵산 분자(이는 발현 제어 요소, 가령 프로모터를 포함할 수 있다), 또는 다른 핵산 분자의 삽입, 결실, 치환, 또는 다른 기능적 파괴를 도입하는 수정을 포함할 수 있다. 예시적인 수정은 기준 또는 모 미생물로부터의 이종 또는 상동성 폴리펩티드의 암호화 부위 또는 이의 기능적 단편 내의 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 유기체, 미생물, 또는 세포는 비-자연적인 유기체, 미생물, 또는 세포 및 재조합 유기체, 미생물, 또는 세포이다. 예를 들면, 탈조절된 내인성 효소(예컨대, MMP1359, MMP1358, 아스파르토키나아제, 호모세린 O-아세틸전이효소)를 발현하거나 과발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 메티오닌의 생합성에 관여하는 특정 효소 활성(예컨대, 아스파레이트 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린, O 아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S 메틸전이효소, 메티오닌 합성효소 탈수소화효소)을 생산하도록 발현되거나 과발현된 하나 이상의 외인성 또는 이종 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "형질전환"은 숙주 세포로의 핵산 분자(예컨대, 외인성 또는 이종 핵산 분자)의 도입을 가리킨다. 형질전환된 숙주 세포는 외인성 또는 이종 핵산 분자를 염색체-외에 또는 염색체 내에 통합된 상태로 수반할 수 있다. 숙주 세포 유전체 및 자가-복제 벡터로의 통합은 일반적으로 형질전환된 핵산 분자의 유전적으로 안정한 유전성(inheritance)을 야기한다. 형질전환된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합" 또는 "유전적으로 조작된" 또는 "형질전환된" 또는 "유전자 이식" 세포(예컨대, 고세균)라고 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "탈조절된"은 모 또는 야생형 미생물에서의 유전자 발현 또는 활성에 비해 개별적인 유전자 산물의 감소되거나 증가된 발현, 또는 유전자 산물(예컨대, 단백질, 효소)의 감소되거나 증가된 활성을 가리킨다. 예를 들면, 미생물은 조작 전의 모 또는 야생형 미생물보다 유전자 산물의 발현이 증가 또는 감소되도록 또는 유전자 산물의 활성이 증가 또는 감소되도록 하기 위해 유전적으로 개조(예컨대, 변이된, 유전적으로 조작)될 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 유전자는 발현된 유전자 산물이 증가된 활성을 갖도록 변이된다. 예를 들면, 표적 유전자의 암호화 부위는 발현된 유전자 산물이 증가된 활성을 가지도록, 표적 유전자의 복제 수가 증가되어 활성이 증가될 수 있도록, 표적 유전자가 과발현되어 활성이 증가될 수 있도록, 또는 이들 결과가 임의로 조합되도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 유전자는 발현된 유전자 산물이 피드백 저해에 대해 감소되거나, 최소의 또는 비-검출가능한 반응을 가지도록 변이된다(예컨대, 아미노산 생합성 효소, 가령 MMP1358 또는 MMP1359 또는 둘다는 하나 이상의 피드백 저해인자, 가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌의 존재에서 탈조절된다). 추가의 구체예에서, 표적 유전자는 유전자가 발현의 억제에 대해 감소되거나, 최소의 또는 비-검출가능한 반응을 가지도록 변이된다(예컨대, 아미노산 생합성 효소, 가령 호모세린 탈수소화효소는 피드백 보조-억제인자 메티오닌의 존재에서 탈조절된다). 대안적으로, 미생물은, 예를 들면, 선택적 압력 하에서 상기-언급된 유전자 변형(예컨대, 자발적인 돌연변이) 중 어느 하나 이상을 가지는 것으로 식별될 수 있다. 전술된 구체예 중 어느 하나의 탈조절된 유전자 또는 유전자 산물은 자발적인, 유도된 또는 조작된 돌연변이 또는 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "과발현된"은 동일한 조건에서 성장했을 때 모 또는 야생형 미생물에서 발견되는 유전자 발현 또는 유전자 산물의 수준을 초월하는 비-자연적인 또는 재조합 미생물에서의 유전자 발현 또는 유전자 산물의 수준을 가리킨다. 특정 구체예에서, 과발현은 전사 수준, 번역 수준, 또는 둘다에서 발생할 수 있고, 이는 변형된 조절 제어(예컨대, 강한 프로모터의 사용) 또는 복제 수의 증가 또는 두 가지 모두 때문일 수 있다.
둘 이상의 폴리펩티드 또는 핵산 분자 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 "백분율 동일성"은 당해 분야에 공지된 방법, 가령 서열 비교 알고리즘, 수동 정렬, 또는 육안 검사를 사용하여 측정하여, 비교 창 또는 지정된 부위에 대해 비교하고 최대 대응으로 정렬했을 때, 특정된 부위에 대해 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일하거나 특정된 백분율(예컨대, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)을 가지는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 예를 들면, 백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적절한 알고리즘은 디폴트 설정으로 사용되는 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이 내용은 Altschul 등(1990) J. Mol. Biol. 215:403에 서술되어 있다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 변이체가 또한 고려된다. 변이 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 99.9% 동일하다. 일부 구체예에서, 변이 폴리뉴클레오티드는 약 65-68℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 구연산나트륨 또는 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 구연산나트륨, 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건 하에서 정해진 서열의 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 것들이다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989를 참조하라). 폴리뉴클레오티드 변이체는 본 명세서에 기술된 기능성을 가지는 생합성 효소 또는 이의 폴리펩티드를 인코딩하는 능력을 보유한다.
더욱 엄격한 조건(가령 더 높은 온도, 더 낮은 이온 강도, 더 높은 포름아미드, 또는 다른 변성제)이 또한 사용될 수 있지만; 그러나, 혼성화 속도가 영향을 받을 것이다. 데옥시올리고뉴클레오티드의 혼성화가 관련된 경우에, 추가적인 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 6x SSC로의 세척, 37℃에서(14-염기 올리고뉴클레오티드를 위해), 48℃에서(17-염기 올리고뉴클레오티드를 위해), 55℃에서(20-염기 올리고뉴클레오티드를 위해), 및 60℃에서(23-염기 올리고뉴클레오티드를 위해) 0.05% 피로인산나트륨을 포함한다.
"돌연변이"는 기준 핵산 분자 또는 아미노산 서열과 비교할 때 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 변화를 가리킨다. 돌연변이는 방사선, 바이러스, 전이인자, 변이원성 화학물질, 감수분열이나 DNA 복제 도중 발생하는 오류, 과돌연변이, 등에 의해 야기될 수 있다. 돌연변이는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이들 중 임의의 조합을 비롯한 몇 가지 상이한 유형의 서열 변화를 유발할 수 있다.
"보존적 치환"은 당해 분야에서 한 아미노산이 유사한 특성을 지닌 또다른 아미노산으로 치환되는 것으로 인식된다. 예시적인 보존적 치환이 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예컨대, WO 97/09433의 10쪽; Lehninger, Biochemistry, 2판; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990을 참조하라).
본 명세서에서 사용된 "저해" 또는 "저해된"은 대조군, 내인성 또는 기준 분자에 비해 표적 유전자의 발현 또는 표적 분자(예컨대, 포스포에놀피루베이트 합성효소)의 활성에서의 직접 또는 간접적인 변질, 감소, 하향 조절 또는 저지를 가리키며, 여기서 변질, 감소, 하향 조절 또는 저지는 통계학적, 생물학적, 산업적, 또는 임상적으로 유의미하다. 예를 들면, 저해된, 비활성화된 또는 감소된 활성의 생합성 효소(예컨대, 유전적으로 변형된)는 야생형 또는 모 효소와 비교할 때 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만의 활성을 보유할 수 있다.
수소영양 미생물 - 숙주 세포
본 개시의 모 또는 출발 수소영양 미생물은 야생형(자연적인) 균주, 변이된(비-자연적인) 균주(예컨대, 증가된 성장 속도, 탈조절된 또는 탈억제된 생합성 효소), 또는 재조합 균주일 수 있고, 이들은 각각 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하도록 추가로 수정될 수 있다. 특정 구체예에서, 수소영양생물은 메탄 생성 고세균일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 개시는 메탄 생성 고세균인 수소영양 미생물, 가령 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 메타노칼큘루스(Methanocalculus), 메타노칼도코쿠스(Methanocaldococcus), 메타노셀라(Methanocella), 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노코코이데스(Methanococcoides), 메타노코르푸스쿨룸(Methanocorpusculum), 메타노쿨레우스(Methanoculleus), 메타노폴리스(Methanofollis), 메타노제니움(Methanogenium), 메타노할로븀(Methanohalobium), 메타노할로필루스(Methanohalophilus), 메타노라시니아(Methanolacinia), 메타놀로부스(Methanolobus), 메타노메틸로보란스(Methanomethylovorans), 메타노마이크로븀(Methanomicrobium), 메타노마이크로코쿠스(Methanomicrococcus), 메타노플라누스(Methanoplanus), 메타노피루스(Methanopyrus), 메타노레귤라(Methanoregula), 메타노사에타(Methanosaeta), 메타노살숨(Methanosalsum), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노스파에라(Methanosphaera), 메타노스피릴륨(Methanospirillium), 메타노써모박터(Methanothermobacter), 메타노써모코쿠스(Methanothermococcus), 메타노테르무스(Methanothermus), 또는 메타노토리스(Methanotorris) 등을 제공한다.
추가의 구체예에서, 수소영양 미생물은 특정한 메탄 생성 고세균 종이다. 예시적인 메탄 생성 고세균 종은 메타노박테리움 알칼리필룸(Methanobacterium alcaliphilum), 메타노박테리움 브리얀티(Methanobacterium bryantii), 메타노박테리움 콘골렌세(Methanobacterium congolense), 메타노박테리움 데플루비(Methanobacterium defluvii), 메타노박테리움 에스파놀래(Methanobacterium espanolae), 메타노박테리움 포르미시쿰(Methanobacterium formicicum), 메타노박테리움 이바노비(Methanobacterium ivanovii), 메타노박테리움 팔루스트레(Methanobacterium palustre), 메타노박테리움 써마그레간스(Methanobacterium thermaggregans), 메타노박테리움 울리기노숨(Methanobacterium uliginosum), 메타노브레비박터 아시디두란스(Methanobrevibacter acididurans), 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스(Methanobrevibacter arboriphilicus), 메타노브레비박터 고트샬키(Methanobrevibacter gottschalkii), 메타노브레비박터 올레야에(Methanobrevibacter olleyae), 메타노브레비박터 루미난튬(Methanobrevibacter ruminantium), 메타노브레비박터 스미티(Methanobrevibacter smithii), 메타노브레비박터 워에세이(Methanobrevibacter woesei), 메타노브레비박터 월리니(Methanobrevibacter wolinii), 메타노칼도코쿠스 빌로수스(Methanocaldococcus vilosus), 메타노셀라 아르보리재(Methanocella arvoryzae), 메타노셀라 콘라디이, 메타노셀라 팔루디콜라(Methanocella paludicola), 메타노써모박터 마르부르겐시스(Methanothermobacter marburgensis), 메타노써모박터 써마우토트로피쿰(Methanothermobacter thermautotrophicum), 메타노써모박터 써모플렉수스(Methanothermobacter thermoflexus), 메타노써모박터 써모필루스(Methanothermobacter thermophilus), 메타노써모박터 월페이(Methanothermobacter wolfeii), 메타노써모코쿠스 오키나웬시스(Methanothermococcus okinawensis), 메타노테르무스 소시아빌리스(Methanothermus sociabilis), 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰(Methanocorpusculum bavaricum), 메타노코르푸스쿨룸 파르붐(Methanocorpusculum parvum), 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스(Methanoculleus chikuoensis), 메타노쿨레우스 서브마리누스(Methanoculleus submarinus), 메타노제니움 프리기둠(Methanogenium frigidum), 메타노제니움 리미나탄스(Methanogenium liminatans), 메타노제니움 마리눔(Methanogenium marinum), 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라(Methanomicrococcus blatticola), 메타노플라누스 엔도심바이오수스(Methanoplanus endosymbiosus), 메타노플라누스 리미콜라(Methanoplanus limicola), 메타노플라누스 페트롤레아리우스(Methanoplanus petrolearius), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노레귤라 부네이(Methanoregula boonei), 메타노토리스 포르미시쿠스(Methanotorris formicicus), 메타노토리스 이그네우스(Methanotorris igneus), 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii), 메타노사에타 하룬디나세아(Methanosaeta harundinacea), 메타노사에타 펠라지카(Methanosaeta pelagica), 메타노사에타 써모필라(Methanosaeta thermophila), 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이, 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila), 메타노마이크로븀 모빌레(Methanomicrobium mobile), 메타노코쿠스 아에올리쿠스(Methanococcus aeolicus), 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노코쿠스 반니엘리(Methanococcus vannielii), 메타노코쿠스 볼테(Methanococcus voltae), 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스(Methanothermococcus thermolithotrophicus), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스(Methanothermobacter thermoautotroiphicus), 메타노칼도코쿠스 페르벤스(Methanocaldococcus fervens), 메타노칼도코쿠스 인디쿠스(Methanocaldococcus indicus), 메타노칼도코쿠스 인페르누스(Methanocaldococcus infernus), 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이(Methanocaldococcus jannaschii), 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스(Methanocaldococcus vulcanius)를 포함한다.
특정 구체예에서, 메탄 생성 고세균은 시토크롬을 생산하거나 시토크롬을 생산하지 않는다. 예를 들면, 시토크롬을 생산하지 않는 메탄 생성 고세균은 메타노코쿠스 마리팔루디스 또는 메타노코쿠스 반니엘리를 포함한다. 시토크롬을 생산하는 예시적인 메탄 생성 고세균은 메타노사르시나 바르케리 또는 메타노사르시나 마제이다.
연관된 구체예에서, 메탄 생성 고세균은 중온성, 호열성 또는 고호열성일 수 있다. 예시적인 중온성 메탄 생성 세균은 메타노박테리움, 메타노브레비박터, 메타노칼큘루스, 메타노칼도코쿠스, 메타노코쿠스, 메타노코르푸스쿨룸, 및 메타노사르시나의 일부 종을 포함한다. 예시적인 호열성 메탄 생성 세균은 메타노마이크로븀, 메타노사에타, 메타노사르시나, 및 메타노써모코쿠스의 일부 종을 포함한다. 예시적인 고호열성 메탄 생성 세균은 메타노칼도코쿠스, 메타노피루스, 메타노테르무스, 및 메타노토리스의 일부 종을 포함한다.
메티오닌 생성 수소영양 미생물
본 개시의 수소영양 미생물은 유전적으로 개조(즉, 유전적으로 조작)되거나, 재조합적으로 수정되거나 또는 이들의 조합으로 관심의 황 동화 폴리펩티드를 녹-아웃, 감소, 발현 또는 과-발현시킬 수 있고, 이는 H2/COX 기질의 다양한 성분을 메티오닌 또는 메티오닌 함유 공급물로 전환(예컨대, 이용, 전환, 동화, 산화, 환원)하기 위해 유용한 재조합 미생물을 야기한다.
비-자연적인 수소영양 미생물을 생성하기 위한 유전자 개조 또는 조작은 무작위(예컨대, 화학적으로-유도된, 자발적인) 또는 부위-지정 돌연변이유발(예컨대, 하나 이상의 유전자 표적을 지정), 하나 이상의 유전자 표적의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변형(예컨대, 강한, 약한, 유도성, 억제성, 또는 복수의 프로모터를 제거함으로써, 또는 그러한 프로모터을 상이한 특성을 가진 프로모터로 치환함으로써), 하나 이상의 유전자 표적(가령 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자)의 염색체 위치 변경, 하나 이상의 유전자 표적에 인접한 핵산 서열 변형, 하나 이상의 유전자 표적의 복제수 감소 또는 증가, 하나 이상의 유전자 표적의 전사 또는 하나 이상의 유전자 산물의 번역에 관여하는 조절 단백질, 억제인자, 억압인자, 인핸서, 전사 활성화제 등의 수정, 또는 하나 이상의 유전자 표적의 발현을 탈조절하는 임의의 다른 방법(가령 안티센스 핵산 분자, 소형 간섭 핵산 분자의 사용, 또는 표적 단백질을 녹-아웃 또는 발현을 차단하기 위한 다른 방법)을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 유전자 개조 또는 조작은 모 미생물보다 더 많은 메티오닌을 생산하는 비-자연적인 수소영양 미생물을 야기하는 하나 이상의 자발적인 돌연변이(예컨대, 화학적, 방사선, 또는 다른 변이원성 처리)를 포함한다. 그러한 자발적인 돌연변이는, 예를 들면, 요망되는 표현형을 가진 돌연변이만 성장할 수 있는 특정한 선택적 압력(예컨대, 성장 배지 내 특정 아미노산 또는 독소의 부재, 항생제의 존재, 특정 대사산물의 부재, 등) 하에 미생물을 배치함으로써 생산하고 확인할 수 있다.
추가의 구체예에서, 메티오닌 생합성 효소를 인코딩하는 내인성 또는 외인성 핵산 분자는, 가령 야생형에서 변화된 아미노산 서열을 가지도록 변형될 수 있다. 이들 방법에 의해 생성된 각각의 변이 폴리펩티드는 적어도 50% 활성(바람직하게는 100% 또는 그 이상의 활성)을 보유할 것이며 기준 또는 모 야생형 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다. 특정 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 기준 또는 모 야생형 효소와 비교할 때 하나 이상의 소정의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환(예컨대, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상 또는 최대 20, 25, 또는 30 치환) 또는 특정 수 이하의 아미노산 치환(예컨대, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30 이하의 치환)를 가질 것이며, 단 이때 변이체는 관심의 활성(예컨대, 카르복실화효소, 탈카복실화효소, 탈수소화효소, 에피머라아제, 키나아제, 리아제, 환원효소, 합성효소)을 보유한다.
특정 양태에서, 본 개시는 개방 판독 프레임(ORF) MMP1359 (GenBank No. NC_005791.1 (1337240..1338781, 보체); NCBI Gene ID:2762444, 서열 번호:1), MMP1358 (GenBank No. NC_005791.1 (1336828..1337226, 보체), NCBI Gene ID:2762433; 서열 번호:5), 또는 둘다에 의해 인코딩되는 황 동화 효소가 메티오닌 생합성 경로에 관여하며 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌에 의한 피드백 저해를 받는다는 예상치 못한 결과에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 황 동화 효소 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다는 수소영양 고세균 메타노코쿠스 마리팔루디스로부터 유래한다. 추가의 구체예에서, 본 개시는 숙주 세포에 의해 발현되었을 때 모, 야생형 또는 기준 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포보다 증가된 메티오닌 생산을 야기하는 메티오닌 피드백 저해에 저항성인 MMP1359를 인코딩하는 변이된 ORF(예컨대, 서열 번호:2), 메티오닌 피드백 저해에 저항성인 MMP1358을 인코딩하는 변이된 ORF(예컨대, 서열 번호:6), 또는 둘다를 제공한다. 통합적으로, MMP1359 및 MMP1358 폴리펩티드, 또는 이들의 돌연변이, 변이체, 상동체, 또는 이종상동체는 본 명세서에서 통합적으로 "황 동화 폴리펩티드" 또는 "메티오닌 경로 폴리펩티드"로 지칭된다.
특정 구체예에서, MMP1359, MMP1358, 또는 둘다의 상동체 또는 이종상동체는 데설포모닐레 티에드제이(Desulfomonile tiedjei), 신트로포테르무스 리포칼리두스(Syntrophothermus lipocalidus), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 테피다나에어로박터 아세테이트옥시단스(Tepidanaerobacter acetatoxydans), 신트로포모나스 월페이(Syntrophomonas wolfei), 써모데설포븀 나루겐세(Thermodesulfobium narugense), 오도리박터 스플란츠니쿠스(Odoribacter splanchnicus), 써모토가 테르마룸(Thermotoga thermarum), 써모시포 멜라네시엔시스(Thermosipho melanesiensis), 스파에로차에타 글로보사(Sphaerochaeta globosa), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 얻을 수 있다.
따라서, 본 개시는 탈조절되도록(예컨대, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌에 의한 피드백 저해를 더 이상 받지 않도록) 내인성으로-수정된, 또는 재조합적으로 발현되거나 과발현된(야생형 또는 탈조절된), 메티오닌의 생합성에 관여하는 폴리펩티드, 가령 본 명세서에 개시된 탈조절된 황 동화 폴리펩티드(예컨대, MMP1359, MMP1358)를 가지는 수소영양 미생물을 제공한다. 또한, 본 개시의 수소영양 미생물은 메티오닌 생합성 경로의 추가적인 효소, 가령 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소 또는 이들의 조합을 더욱 발현 또는 과발현할 수 있고, 이들 활성은 내인성, 외인성, 또는 둘다일 수 있다. 특정 구체예에서, 탈조절되거나 과발현된 MMP1359 및/또는 MMP1358, 및 아스파르토키나아제를 가지는 수소영양 미생물은 임의로 내인성 또는 재조합적으로 부가된 호모세린 탈수소화효소 활성을 가질 수 있다. 특정한 구체예에서, 수소영양 미생물은 메티오닌 피드백 저해에 저항성인 변이된 MMP1359를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열 번호:2), 메티오닌 피드백 저해에 저항성인 변이된 MMP1358을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열 번호:6), 또는 둘다를 포함하며, 및 임의로 메티오닌 합성효소를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
피드백 저항성 돌연변이를 조작하고 식별하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 - 예를 들어, 독성 아미노산 유사체, 가령 라이신 유사체 S-2-아미노에틸-L-시스테인(AEC) 또는 메티오닌 유사체 DL-에티오닌의 존재에서 자랄 수 있는 미생물은 독성 유사체에 해당하는 아미노산에 피드백 저항성인 것으로 간주된다(예컨대, Shiio 등, Agric. Biol. Chem. 54:3275, 1990; Kumar 및 Gomes, Biotechnology Advances 23:41-61, 2005을 참조하라).
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 다른 유기체, 특히 다른 고세균, 더 상세하게는 다른 메탄 생성 세균으로부터 상응하는 서열을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, PCR, 혼성화, 등과 같은 방법이 본 명세서에 제시된 MMP1359 또는 MMP1358 핵산 분자 서열에 상동성인 이들의 서열을 기초로 하여 그러한 서열을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 제시된 전체 MMP1359 또는 MMP1358 ORF에 대한 이들의 서열 동일성을 기초로 하여 단리된 핵산 분자, 또는 이의 변이체 및 단편은 본 발명에 포함된다. 그러한 서열은 개시된 서열의 상동체 또는 이종상동체인 서열을 포함한다. "이종상동체"는 공통적인 조상의 암호화 서열로부터 유래하고 종분화의 결과 상이한 종에서 발견되는 암호화 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 상이한 종에서 발견되는 암호화 서열은 이들의 뉴클레오티드 서열 또는 이들이 인코딩하는 단백질 서열이 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유하는 경우 이종상동체로 여겨진다. 이종상동체의 기능은 흔히 종 사이에서 고도로 보존되어 있다. 따라서, 황 동화 활성을 가지거나 메티오닌 생합성을 촉진하는 (및 가령 하나 이상의 화합물, 가령 메티오닌 또는 S-아데노실 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성을 가지도록 임의로 탈조절된), 및 엄격한 조건 하에 MMP1359 또는 MMP1358 ORF, 또는 이의 변이체 또는 단편에 혼성화하는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 개시에 포함된다.
코돈 사용 바이어스의 차이가 상이한 종의 박테리아 및 고세균에 걸쳐 관찰되어 왔으며, 이는 이종 숙주의 재조합 단백질 발현에 영향을 줄 수 있다(Sharp 등, Nucl. Acids Res. 33:1141, 2005; Emery 및 Sharp, Biol. Lett. 7:131, 2011). 특정 구체예에서, 핵산 분자(예컨대, 황 동화 폴리펩티드 또는 메티오닌 생합성 효소를 인코딩하는 핵산)는 단백질 발현을 향상 또는 극대화하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같은 숙주 세포에 도입되기 전에 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 코돈에 의해 인코딩되는 아미노산을 변형하지 않고도 숙주 세포의 더 빈번한 코돈 사용을 반영하도록 핵산 분자 수준으로 유전자 또는 암호화 부위 내 코돈 서열을 변형하는 것을 가리킨다. 이종 숙주에서 유전자 발현을 위한 코돈 최적화 방법은 기존에 기술된 바 있다(예컨대, Welch 등, Methods Enzymol. 498:43, 2011; Henry 및 Sharp, Mol. Biol. Evol. 24:10, 2007; 미국 특허 공보 제2011/0111413호를 참조하라).
PCR 접근법에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 관심의 미생물(예컨대, 고세균) 중 어느 하나로부터 추출된 cDNA 또는 유전체 DNA로부터 해당하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 PCR 반응에서 사용하도록 설계될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 설계하는 방법은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있고 Sambrook 등(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)에 기술되어 있다. 또한 Innis 등, 편저 (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis 및 Gelfand, 편저 (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); 및 Innis 및 Gelfand, 편저 (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)을 참조하라. 공지된 PCR 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 이중(nested) 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 역추적(degenerate) 프라이머, 유전자-특이적 프라이머, 벡터-특이적 프라이머, 부분적-미스매치 프라이머, 등을 이용하는 방법을 포함한다.
혼성화 기술에서, 공지의 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부는 선택된 유기체로부터의 클로닝된 유전체 DNA 단편 또는 cDNA 단편의 집단(즉, 유전체 또는 cDNA 라이브러리)에 존재하는 다른 상응하는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 탐침으로서 사용된다. 혼성화 탐침은 유전체 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 다른 올리고뉴클레오티드를 기초로 할 수 있고, 검출가능한 기, 가령 32P, 또는 임의의 다른 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 혼성화를 위한 탐침은 본 명세서에서 규명된 MMP1359 또는 MMP1358 폴리뉴클레오티드를 기초로 한 합성 올리고뉴클레오티드를 표지시킴으로써 만들어질 수 있다. 혼성화를 위한 탐침의 제조 및 cDNA 및 유전체 라이브러리의 구성 방법은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있고 Sambrook 등(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)에 기술되어 있다.
예를 들면, 본 명세서에 개시된 전체 MMP1359 또는 MMP1358 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 하나 이상의 부분은 해당하는 ORF, cDNA 또는 mRNA 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화할 수 있는 탐침으로서 사용될 수 있다. 다양한 조건 하에서 특이적 혼성화를 달성하기 위해, 그러한 탐침은 MMP1359 또는 MMP1358 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 고유하며 바람직하게는 적어도 약 10 뉴클레오티드 길이, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 20 뉴클레오티드 길이를 가지는 서열을 포함한다. 그러한 탐침은 PCR에 의해 선택된 미생물로부터의 해당하는 황 동화 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 수소영양 미생물 내 암호화 서열의 존재를 확인하기 위해 요망되는 미생물로부터 추가적인 암호화 서열을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 플레이트 상의 DNA 라이브러리의 혼성화 선별을 포함한다(용균반 혹은 콜로니; 예를 들면, Sambrook 등(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York를 참조하라).
그러한 서열의 혼성화는 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 탐침이 다른 서열보다 이의 표적 서열에 검출가능할 만큼 높은 수준으로(예컨대, 바탕에 비해 적어도 2-배) 혼성화하도록 의도된 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 상이한 환경에 따라 달라질 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격한 정도를 제어함으로써, 탐침에 대해 100% 동일성을 가지는 표적 서열이 규명될 수 있다. 대안적으로, 엄격한 조건은 서열 내 일부 미스매치를 허용하도록 조정되어 더 낮은 수준의 유사성(예컨대, 60% 내지 99% 서열 동일성)이 검출될 수 있도록 할 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하고 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:4 또는 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:4 또는 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:2 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 더욱 추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에서 서열 번호:2 또는 6의 보체에 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 조작된 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1359 또는 이의 상동체 또는 이종상동체에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1358 또는 이의 상동체 또는 이종상동체에 의해 인코딩된다. 추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 조작된 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1359 또는 이의 상동체 또는 이종상동체에 의해; 및 조작된 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1358 또는 이의 상동체 또는 이종상동체에 의해 인코딩된다.
특정 구체예에서, 탈조절된 내인성 또는 이종 황 동화 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1359 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다. 다른 구체예에서, 탈조절된 내인성 또는 이종 황 동화 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1358 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다. 추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 또는 이종 황 동화 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1359 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체, 및 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1358 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다.
본 개시의 MMP1359 돌연변이가 언급되는 경우에, 그 언급은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 (ATCC No. DSM14266) MMP1359 단백질 (GenBank Accession No. NP 988479.1)의 아미노산 위치에 해당하는 잔기 넘버링에 대한 것이다. 예시적인 돌연변이는 잔기 D439에서의 돌연변이(예컨대, D439N 치환)을 포함한다. 본 개시의 MMP1358 돌연변이가 언급되는 경우에, 그 언급은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 (ATCC No. DSM14266) MMP1358 단백질 (GenBank Accession No. NP 988478.1)의 아미노산 위치에 해당하는 잔기 넘버링에 대한 것이다. 예시적인 돌연변이는 잔기 G114에서의 돌연변이(예컨대, G114E 치환)을 포함한다.
본 명세서에서 강조된 바와 같이, 아스파르테이트 경로 아미노산(예컨대, 메티오닌)의 생합성에서 제1의 주된 효소는 아스파르토키나아제이며, 이는 하나 이상의 라이신, 트레오닌 및 메티오닌에 의한 피드백 조절을 받을 수 있다. 예를 들면, E. coli는 세 가지 아스파르토키나아제 동질효소를 가지며 - 두 가지는 아스파르토키나아제 및 호모세린 탈수소화효소 활성을 갖는 이관능성이며, 아스파르토키나아제 I-호모세린 탈수소화효소 I(AK/HD-I; thrA) 및 아스파르토키나아제 II-호모세린 탈수소화효소 II (AK/HD-II; metL)로 지칭되고, 다른 한 가지는 아스파르토키나아제 활성만 단독으로 가지며, 아스파르토키나아제 III (AK-III; lysC)로 지칭된다. AK/HD-I는 트레오닌에 의한 피드백 조절(뿐만 아니라 트레오닌 및 류신에 의한 발현 억제)을 받는 반면, AK/HD-II는 메티오닌에 의한 피드백 조절만 받으며 AK-III는 라이신에 의한 피드백 조절만 받는다(Patte 등, Biochim. Biophys. Acta 136:245, 1967; Theze 등, J. Bacteriol. 117:133, 1974를 참조하라). 대조적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 아스파르토키나아제는 라이신 및 트레오닌 둘다에 의한 피드백 저해를 받는다(Sano 및 Shiio, 1970; Yoshida 등, 2007). 아스파르테이트 경로 아미노산의 생합성에 관여하는 다른 효소, 가령 호모세린 O-아세틸전이효소 및 호모세린 O-트랜스석시닐전이효소 또한 피드백 저해를 받는다.
일부 구체예에서, 본 개시는 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 유전적으로 조작된 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 추가로 탈조절된 아스파르토키나아제 활성 또는 메티오닌 합성효소를 발현하거나 과발현하고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 내인성 아스파르토키나아제, 외인성 아스파르토키나아제, 또는 둘다이다. 특정 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성인 아스파르토키나아제 돌연변이이다. 일부 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩된다. 특정 구체예에서, 내인성 또는 외인성 아스파르토키나아제는 탈조절되지 않으며 이종 메티오닌 합성효소(예컨대, MetE)는 과발현된다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위, 라이신 결합 부위, 라이신 및 트레오닌 결합 부위, 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위, 또는 이들의 임의의 조합에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩된다. 특정 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 thrA 유전자에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 메티오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 metL 유전자에 의해 인코딩된다.
본 개시의 lysC 피드백 저항성 돌연변이가 언급되는 경우에, 그 언급은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 LysC 단백질 (GenBank Accession No. CAF 18822.1)의 아미노산 위치에 해당하는 잔기 넘버링에 대한 것이다. 예시적인 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, I375, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있다. 라이신 및 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위의 예시적인 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 전술된 돌연변이 중 임의의 하나 이상이 본 개시의 아스파르토키나아제에 포함될 수 있고, 단 이때 아스파르토키나아제 폴리펩티드는 이의 키나아제 활성을 보유해야 한다.
메티오닌의 생합성이 효율적으로 일어나게 하기 위해, 일정한 양의 탄소 유동을 메티오닌 경로를 통해 유입해야 한다. 메티오닌의 생산을 신장하거나 향상하기 위한 한 방법은 본 개시에 제공된 바와 같은 메티오닌 경로로의 탄소 유동을 최대화하는 것이다.
특정 양태에서, 본 개시는 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 증가된 5-메틸테트라하이드로폴레이트 코리노이드/철 황 단백질 메틸전이효소 활성, 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가지고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘다를 가진다. 특정한 다른 구체예에서, 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 피루베이트 합성효소, 증가된 아세틸-CoA 합성효소, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드(가령 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다)를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 탈조절된 아스파르토키나아제 활성, 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다. 더욱 추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 탈조절된 아스파르토키나아제 활성, 증가된 5-메틸테트라하이드로폴레이트 코리노이드/철 황 단백질 메틸전이효소 활성, 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 피루베이트 합성효소, 증가된 아세틸-CoA 합성효소, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다. 각각의 이들 구체예에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다.
본 명세서에 강조된 바와 같이, 몇 가지 생합성 메티오닌 경로 효소는 피드백 조절을 받고(예컨대, MMP1359, MMP1358, 아스파르토키나아제, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-석시닐전이효소), 이들 효소를 인코딩하는 유전자 중 일부는 억제를 받고(예컨대, 호모세린 탈수소화효소), 또는 두 가지 모두가 해당한다. 따라서, 메티오닌의 생산은 본 개시에 제공된 바와 같이 조절, 억제 또는 둘다를 완화시킴으로써 향상될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 개시는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 메티오닌의 생합성을 위한 하나 이상의 경로로부터의 하나 이상의 탈조절된 및/또는 탈억제된 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 탈조절된 MMP1359 활성, MMP1358 활성, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 탈억제된, 탈조절된, 또는 둘다인 아스파르토키나아제, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소(예컨대, metA), O-석시닐호모세린 리아제(예컨대, metB), 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
메티오닌을 초과생산하는 것 외에도, 미생물로부터 생산된 메티오닌의 유출 또는 분리를 방지하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 본 개시는 단리 또는 정제 방법이 단순한 배양 배지에서 메티오닌의 생산을 향상하기 위한 방법을 제공한다.
더욱 추가의 양태에서, 본 개시는 탈조절된 MMP1359, MMP1358, 또는 둘다를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 메티오닌의 배출인자(exporter)를 발현하거나 과발현하고, 여기서 비-자연적인 조작된 또는 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 강한 발현 제어 서열(예컨대, nif 또는 tet 프로모터)에 작동가능하게 연결된 메티오닌의 배출인자, 가령 코리네박테리움 글루타미쿰의 brnFE 또는 metT를 발현하거나 과발현한다(Trotschel 등, J. Bacteriol. 187:3786-94, 2005을 참조하라). 다른 구체예에서, 메티오닌의 비-자연적인 수소영양 미생물 수송인자/유입인자(importer)는 녹-아웃되거나 저해된다.
메티오닌 생합성 경로로의 탄소 유동을 보장하는 또다른 방법은 다른 경쟁적 아미노산의 생산을 제거하는 것이다. 본 개시에 제공된 수소영양 미생물은 하나 이상의 아미노산을 필요로 하는 영양요구체일 수 있다.
더욱 추가의 양태에서, 본 개시는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 하나 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산에 대한 영양요구체이고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 호모세린 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 또는 둘다이다. 특정한 다른 구체예에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 이소류신 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 또는 둘다이다. 특정 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 하나 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산에 대한 영양요구체이다. 더욱 추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 호모세린 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 더욱 추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양요구체, 이소류신 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 더욱 추가적인 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 또는 둘다이다. 특정 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
때때로, 메티오닌 경로의 일부인 하나 이상의 생합성 효소를 단순 과발현하는 것이 본 개시의 수소영양 미생물에서 유용할 것이다. 추가의 양태에서, 본 개시는 메티오닌의 생합성을 위한 하나 이상의 경로로부터의 폴리펩티드를 과발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물을 제공하고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 메티오닌의 생합성을 위한 하나 이상의 경로로부터의 폴리펩티드를 과발현한다. 특정한 추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은 또한 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소 또는 둘다를 과발현하고; 또는 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 또는 둘다를 과발현하고; 또는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 과발현한다.
미세 유기체에서 외인성 또는 이종 핵산을 발현하기 위한 재조합 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 그러한 방법은 예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)의 설명에서 발견할 수 있다. 발현되어야 할 예시적인 외인성 단백질 또는 효소는 메티오닌 생합성에 관여하는 것들(예컨대, 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합) 또는 메티오닌 생합성 경로로의 탄소 유동에 영향을 주는 효소(예컨대, 피루베이트 키나아제, 피루베이트 카르복실화효소, 피루베이트 합성효소, 아세틸-CoA 합성효소, 아스파르테이트 아미노전이효소, 또는 이들의 임의의 조합)을 포함한다. 효소를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 이의 기능적 단편에 대한 유전자 수정은 이의 자연발생적 상태에서 변형된 생화학적 또는 대사적 능력을 재조합 세포에 부여할 수 있다.
본 개시의 어느 한 수소영양 미생물은 다양한 당해 분야에 공지된 방법 중 어느 하나를 이용하여 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하여 숙주에게 신규하거나 향상된 활성(예컨대, 효소 활성)을 제공하도록 형질전환될 수 있거나 내인성 유전자 기능을 제거하거나 실질적으로 감소하도록 유전적으로 개질될 수 있다. 수소영양 미생물, 가령 메탄 생성 고세균에서 이종 핵산 분자를 전이 및 발현시키기 위한 유전적 도구는 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, Rother 등, Curr. Opin. Microbiol. 8:745, 2005; Leigh 등, FEMS Microbiol. Rev. 35:577, 2011을 참조하라). 예를 들면, DNA 송달(Dodsworth 등, Appl. Environ. Microb. 76:5644, 2010; Metcalf 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:2626, 1997), 뒤섞음 벡터(Gardner 및 Whitman, Genetics 152:1439, 1999; Metcalf 등, 1997), 이종 유전자의 조절 발현(Lie 및 Leigh, J. Bacteriol. 184:5301, 2002; Chaban 등., Mol. Microbiol. 66:596, 2007; Guss 등, Archaea 2:193, 2008), 및 녹-인 또는 녹-아웃 유전자 교환(Moore 및 Leigh, J. Bacteriol. 187:912, 2005; Pritchett 등, Appl. Environ. Microb. 70:1425, 2004)를 위한 도구들이 사용가능하다. 그러므로, 수소영양 미생물에서 내인성 유전자 기능을 비활성화, 녹-아웃, 또는 삭제하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 프로모터, 코돈 최적화, 또는 둘다가 숙주 수소영양 미생물에서 아미노산 생합성 경로 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 분자의 높은, 구성적 발현을 위해 사용될 수 있다. 숙주 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 고세균)에서 외인성 핵산 분자의 조절 발현이 또한 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 생합성 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 분자의 조절 발현은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물의 성장 속도를 최적화하기 위해 바람직할 수 있다. H2/COX 기질의 존재에 반응하기 위한 아미노산 생합성 효소를 인코딩하는 핵산 분자의 제어 발현은 상이한 공급원의 다양성 또는 가용 H2/COX 기질의 비율을 기초로 하는 성장을 증진할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 하나 초과의 이종 또는 외인성 핵산 분자는 숙주 세포에 별도의 핵산 분자로서, 다수의 개별적으로 제어되는 유전자로서, 폴리시스트론 핵산 분자로서, 융합 단백질을 인코딩하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이들의 임의의 조합으로서 도입될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 바와 같이, COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하는 미생물은 메티오닌 생합성 경로의 요망되는 효소(예컨대, 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소)를 인코딩하는 둘 이상의 이종 또는 외인성 핵산 분자를 발현하도록 수정될 수 있다. 둘 이상의 외인성 핵산 분자가 숙주 H2/COX 대사 미생물에 도입되는 경우, 둘 이상의 외인성 핵산 분자가 단일 핵산 분자로서(예컨대, 단일 벡터 상의), 숙주 염색체의 단일 부위 또는 다중 부위에 통합된 별도의 벡터 상에 도입될 수 있음이 이해된다. 언급된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 인코딩하는 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성의 수를 가리키며, 숙주 세포에 도입되는 별도의 핵산 분자의 수를 가리키지 않는다.
예를 들면, 수소영양 미생물(가령 메탄 생성 세균)은 H2/COX 기질(예컨대, H2를 CO2, CO, 또는 둘다와 함께)을 모 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌으로 이용, 전환 또는 대사할 수 있는 폴리펩티드를 생산하도록 재조합적으로 형질전환될 수 있다. 본 명세서에 기술된 어느 한 구체예에서, 수소영양 미생물(가령 메탄 생성 세균)은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서 이용, 전환 또는 대사할 수 있는 폴리펩티드를 생산하도록 재조합적으로 형질전환될 수 있다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물은, 추가로 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하고, 비-자연적인 조작된 수소영양 미생물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 추가의 구체예에서, 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-석시닐전이효소(예컨대, metA), O-석시닐호모세린 리아제(예컨대, metB), 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다를 인코딩하고, 여기서 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다는 임의로 과발현되거나 탈조절되거나, 또는 둘다이다.
특정한 다른 구체예에서, 외인성 핵산 분자는 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다를 인코딩하고, 여기서 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다는 임의로 과발현되거나 탈조절되고, 또는 둘다 과발현된다. 또다른 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 E. coli ThrA (AK/HD-I), E. coli MetL (AK/HD-II), 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 이들의 조합을 인코딩하며, 여기서 AK/HD-I, AK/HD-II, 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 이들의 조합은 임의로 과발현되거나 탈조절되고, 또는 둘다 과발현된다. 특정한 구체예에서, E. coli ThrA (AK/HD-I)는 탈조절된 돌연변이이고, 여기서 AK/HD-I는 임의의 하나 이상의 아미노산 위치 G330, S345, S352, 및 G433에서 변이된다.
일부 구체예에서, 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 조작된 수소영양 미생물은, 추가로 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하고, 추가로 (a) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 라이신 생합성 경로 폴리펩티드, (b) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩티드, (c) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 글리신 생합성 경로 폴리펩티드, (d) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 메티오닌 분해 경로 폴리펩티드(예컨대, metK), 또는 (e) 이들의 임의의 조합을 가진다. 특정 구체예에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, 호모세린 키나아제, 트레오닌 탈수효소, 세린 하이드록시메틸 전이효소, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 분자는 녹아웃되거나 감소된 활성을 인코딩한다.
전술된 비-자연적인 조작된 수소영양 미생물 중 어느 하나에서, 외인성 핵산 분자는 유전체에 통합되거나 외인성 핵산 분자는 자가-복제 벡터 내에 있다. 추가적으로, 전술된 비-자연적인 수소영양 미생물 중 어느 하나에서, 비-자연적인 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 양태에서, 본 개시는 재조합 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하고 여기서 재조합 수소영양 미생물은 외인성 황 동화 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 발현하거나 과발현한다. 일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:3, 4, 7, 또는 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:3, 4, 7, 또는 8 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:1, 2, 5, 또는 6 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 더욱 추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에서 서열 번호:1, 2, 5, 또는 6 중 어느 하나의 보체에 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 인코딩된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1359 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다. 일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 MMP1358 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다. 특정 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1359 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다. 특정 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된 MMP1358 돌연변이 또는 이의 상동체 또는 이종상동체이다.
일부 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 추가로 탈조절된 내인성 황 동화 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 내인성 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:4 및 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 내인성 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:4 또는 8 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 추가의 구체예에서, 내인성 황 동화 폴리펩티드는 서열 번호:2 또는 6 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다. 더욱 추가의 구체예에서, 내인성 황 동화 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에서 서열 번호:2 및 6 중 어느 하나의 보체에 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자(가령 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌)에 대해 탈조절된다.
특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 추가로 탈조절된 내인성 아스파르토키나아제 활성, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 또는 둘다를 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 탈조절된 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하거나 과발현하고, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성인 아스파르토키나아제 돌연변이이다. 다른 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩된다.
추가의 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위, 라이신 결합 부위, 라이신 및 트레오닌 결합 부위, 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위, 또는 이들의 임의의 조합에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩된다. 특정 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 thrA 유전자에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성은 메티오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 metL 유전자에 의해 인코딩된다.
본 개시의 lysC 피드백 저항성 돌연변이가 언급되는 경우에, 그 언급은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 LysC 단백질 (GenBank Accession No. CAF18822.1)의 아미노산 위치에 해당하는 잔기 넘버링에 대한 것이다. 예시적인 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, I375, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있다. 라이신 및 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위의 예시적인 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 전술된 돌연변이 중 임의의 하나 이상이 본 개시의 아스파르토키나아제에 포함될 수 있고, 단 이때 아스파르토키나아제 폴리펩티드는 이의 키나아제 활성을 보유해야 한다.
일부 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 포함하고, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 동화할 수 있어서 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 일부 구체예에서, 두 번째 외인성 핵산 분자는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 과발현하고, 또는 두 번째 외인성 핵산 분자는 탈조절된 외인성 아스파르토키나아제 활성, 가령 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성을 가진 외인성 아스파르토키나아제 돌연변이를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 탈조절된 외인성 아스파르토키나아제 활성은 변이된 E. coli 아스파르토키나아제 유전자, 가령 변이된 아스파르토키나아제 I-호모세린 탈수소화효소 I 단백질(GenBank Accession No. BAB96579.2), 변이된 아스파르토키나아제 II-호모세린 탈수소화효소 II 단백질(GenBank Accession No. BAE77370.1) 또는 변이된 아스파르토키나아제 III 단백질(GenBank Accession No. BAE78026.1)에 의해 인코딩된다. 특정한 구체예에서, 탈조절된 외인성 아스파르토키나아제 활성은 하나 이상의 아미노산 위치 G330, S345, S352 및 G433 중 어느 하나에서 변이된 E. coli 아스파르토키나아제 ThrA 단백질(GenBank Accession No. BAB96579.2)에 의해 제공되거나, 아미노산 위치 T342에서 변이된 돌연변이 E. coli 아스파르토키나아제 lysC 단백질(GenBank Accession No. BAE78026.1)에 의해 제공된다. 다른 구체예에서, 탈조절된 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성은 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 각각 포함하는 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이들의 조합에 의해 개별적으로 인코딩된다.
추가의 구체예에서, 외인성 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위, 라이신 결합 부위, 라이신 및 트레오닌 결합 부위, 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위, 또는 이들의 임의의 조합에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩된다. 예시적인 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, I375, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있다. 라이신 및 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위의 예시적인 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 전술된 돌연변이 중 임의의 하나 이상이 본 개시의 아스파르토키나아제에 포함될 수 있고, 단 이때 아스파르토키나아제 폴리펩티드는 이의 키나아제 활성을 보유해야 한다.
다른 양태에서, 본 개시는 피루베이트 키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 피루베이트 카르복실화효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 아스파르테이트 아미노전이효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 임의로 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성을 가지는 재조합 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 동화할 수 있어서 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘다를 가진다. 특정한 다른 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 피루베이트 합성효소, 증가된 아세틸-CoA 합성효소, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
추가의 양태에서, 본 개시는 메티오닌의 배출인자를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 동화할 수 있어서 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 추가로 메티오닌의 배출인자, 가령 brnFE 또는 metT 배출인자를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 메티오닌의 비-자연적인 수소영양 미생물 수송인자/유입인자(importer)는 녹-아웃되거나 저해된다.
더욱 추가의 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 생합성을 녹아웃시키는 유전자 수정을 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 하나 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산에 대한 영양요구체이고 H2/COX 기질을 동화할 수 있어서 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 호모세린 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정한 다른 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 이소류신 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정한 추가의 양태에서, 본 개시는 메티오닌의 생합성을 위한 하나 이상의 경로로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 인코딩된 폴리펩티드는 과발현되고, 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 동화할 수 있어서 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다.
특정 구체예에서, 별도의 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 이들의 임의의 조합은 과발현되고; 또는 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 또는 둘다는 과발현되고; 또는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드는 과발현된다.
추가의 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 추가로 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하고, 재조합 수소영양 미생물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다. 추가의 구체예에서, 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 인코딩된 폴리펩티드는 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-트랜스석시닐전이효소(예컨대, metA), O-석시닐호모세린 리아제(예컨대, metB), 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 두 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다를 인코딩하며, 여기서 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다는 임의로 과발현되거나, 핵산 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나, 탈조절되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정한 다른 구체예에서, 외인성 핵산 분자는 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다를 인코딩하며, 여기서 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다는 임의로 과발현되거나, 핵산 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나, 탈조절되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 추가로 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하고, 추가로 (a) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 라이신 생합성 경로 폴리펩티드, (b) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩티드, (c) 녹아웃된 또는 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 글리신 생합성 경로 폴리펩티드, 또는 (d) 이들의 임의의 조합을 가진다. 특정 구체예에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, 호모세린 키나아제, 트레오닌 탈수효소, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 전이효소, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 분자는 녹아웃되거나 감소된 활성의 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 돌연변이, 호모세린 키나아제 돌연변이, 트레오닌 탈수효소 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 전이효소 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.
전술된 재조합 수소영양 미생물 중 어느 하나에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 유전체에 통합되거나 첫 번째 외인성 핵산 분자는 자가-복제 벡터 내에 있다. 추가적으로, 전술된 재조합 수소영양 미생물 중 어느 하나에서, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 MMP1359 활성 또는 메티오닌 피드백 저해 저항성 MMP1359 활성을 가지는 돌연변이 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 MMP1358 활성 또는 메티오닌 피드백 저해 저항성 MMP1358 활성을 가지는 돌연변이 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 메티오닌 피드백 저해 저항성 MMP1359 활성을 가지는 돌연변이 황 동화 폴리펩티드 및 메티오닌 피드백 저해 저항성 MMP1358 활성을 가지는 돌연변이 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다. 전술된 구체예 중 어느 하나에서, 조작된 수소영양 미생물은 추가로 외인성 메티오닌 합성효소 활성을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 세포는 외인성 메티오닌 합성효소이 결여된 모 세포에 비해 메티오닌 합성효소 활성을 초과생산한다.
예를 들면, MMP1359에 해당하는 활성을 가지는 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하기 위해, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노셀라 팔루디콜라, 데설포모닐레 티에드제이, 신트로포테르무스 리포칼리두스, 아세토박테리움 우디이, 테피다나에어로박터 아세테이트옥시단스, 신트로포모나스 월페이, 써모데설포븀 나루겐세, 오도리박터 스플란츠니쿠스, 또는 스파에로차에타 글로보세로부터의 하나 이상의 유전자가 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 MMP1359 또는 이의 기능적 단편에 상동적인 폴리펩티드를 생산하거나 초과생산하며, 이는 임의로 탈조절된다(즉, 메티오닌 피드백 저해에 저항성임). 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 MMP1359 폴리펩티드는 메타노코쿠스 마리팔루디스(NC_05791.1; MMP1359), 메타노사르시나 아세티보란스(NC_003552.1; ORF1821), 메타노셀라 팔루디콜라(NC_013665.1; ORF 0132), 데설포모닐레 티에드제이(NC_018025.1; ORF 2525), 신트로포테르무스 리포칼리두스(NC_014220.1; ORF0735), 아세토박테리움 우디이(NC_016894.1; ORFc28040), 테피다나에어로박터 아세테이트옥시단스(NC_019954.2; ORF2794), 신트로포모나스 월페이(NC_008346.1; ORF1441), 써모데설포븀 나루겐세(NC_015499.1; ORF 0230), 오도리박터 스플란츠니쿠스(NC_015160.1; ORF 3419), 또는 스파에로차에타 글로보세(NC_015152.1; ORF0032)로부터 유래한다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2로부터의 MMP 1359 아미노산 서열을 기초로 하며 GenBank Accession No. NP_988479.1에 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 적어도 75%, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 MMP 1359는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈인 아미노산 서열을 가지거나, GenBank Accession No. NP_988479.1에 제시된 서열과 동일하다. 특정한 구체예에서, MMP1359 아미노산 서열은 아미노산 위치 D439에서 (예를 들면, 아스파라긴으로) 변이된 M. 마리팔루디스 단백질(GenBank Accession No. NP_988479.1)이다.
예를 들면, MMP1358에 해당하는 활성을 가지는 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하기 위해, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노셀라 팔루디콜라, 데설포모닐레 티에드제이, 신트로포테르무스 리포칼리두스, 아세토박테리움 우디이, 테피다나에어로박터 아세테이트옥시단스, 신트로포모나스 월페이, 써모데설포븀 나루겐세, 오도리박터 스플란츠니쿠스, 또는 스파에로차에타 글로보세로부터의 하나 이상의 유전자가 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 MMP1358 또는 이의 기능적 단편에 상동적인 탈조절된 폴리펩티드를 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 황 동화 폴리펩티드는 메타노코쿠스 마리팔루디스(NC_05791.1; MMP1358), 메타노사르시나 아세티보란스(NC_003552.1; ORF1822), 메타노셀라 팔루디콜라(NC_013665.1; ORF 0133), 데설포모닐레 티에드제이(NC_018025.1; ORF 2526), 신트로포테르무스 리포칼리두스(NC_014220.1; ORF0736), 아세토박테리움 우디이(NC_016894.1; ORFc28030), 테피다나에어로박터 아세테이트옥시단스(NC_019954.2; ORF2795), 신트로포모나스 월페이(NC_008346.1; ORF1440), 써모데설포븀 나루겐세(NC_015499.1; ORF 0231), 오도리박터 스플란츠니쿠스(NC_015160.1; ORF 3418), 또는 스파에로차에타 글로보세(NC_015152.1; ORF0033)로부터 유래한다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2로부터의 MMP 1358 아미노산 서열을 기초로 하며 GenBank Accession No. NP_988478.1에 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 MMP 1358은 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈인 아미노산 서열을 가지거나, GenBank Accession No. NP_988478.1에 제시된 서열과 동일하다. 특정한 구체예에서, MMP1358 아미노산 서열은 아미노산 위치 G114에서 (예를 들면, 글루탐산으로) 변이된 M. 마리팔루디스 단백질(GenBank Accession No. NP_988478.1)이다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드는 MMP1359 및 MMP1358 둘다에 상응하는 활성을 가지도록 발현되거나 과발현된다. 예를 들면, 써모토가 테르만룸 또는 써모시포 멜라네시엔시스로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 MMP1359 및 MMP1358, 또는 이들의 기능적 단편에 상동적인 탈조절된 폴리펩티드를 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 황 동화 폴리펩티드는 써모토가 테르만룸(NC_015707.1; ORF0529) 또는 써모시포 멜라네시엔시스(NC_009626.1; ORF0733)로부터 유래한다.
일부 구체예에서, 황 동화 폴리펩티드 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 써모토가 테르만룸 또는 써모시포 멜라네시엔시스로부터의 GenBank Accession Nos. NC_015707.1; ORF0529 또는 NC_009626.1; ORF0733 아미노산 서열을 기초로 하며 GenBank Accession Nos. NC_015707.1; ORF0529 또는 NC_009626.1; ORF073에 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75%, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 황 동화 폴리펩티드는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈인 아미노산 서열을 가지거나, GenBank Accession Nos. NC_015707.1; ORF0529 또는 NC_009626.1; ORF073에 제시된 서열과 동일하다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 황 동화 폴리펩티드를 발현하거나 초과생산하도록 조작될 수 있고, 임의로 또한 아스파르토키나아제(EC 2.7.2.4), 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소(EC 1.2.1.11), 호모세린 O-아세틸전이효소(EC 2.3.1.31, 호모세린 O-석시닐전이효소(예컨대, metA; EC 2.3.1.46), O-석시닐호모세린 리아제(예컨대, metB; EC 2.5.1.48), 시스타티오닌 γ-합성효소(EC 2.5.1.48), 시스타티오닌 β-리아제(EC 4.4.1.8), O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제(EC 2.5.1.49), 호모시스테인 S-메틸전이효소(EC 2.1.1.10), 또는 이들의 임의의 조합을 발현하거나 초과생산하도록 조작된다.
예를 들면, 아스파르토키나아제를 발현하거나 초과생산하기 위해, E. coli (thrA), E. coli (metL), E. coli (lysC), 코리네박테리움 글루타미쿰(lysC), 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스(lysC)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 아스파르토키나아제 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 아스파르토키나아제 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF18822.1), 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 (Genbank Accession No. CAF30573.1), 메타노셀라다 콘라디이 HZ254 (Genbank Accession No. AFD00291.1), 메타노브레비박터 루미난튬 M1 (Genbank Accession No. ADC47522.1), E. coli K-12 아주 W3110 thrA (GenBank Accession No. BAB96579.2); E. coli K-12 아주 W3110 metL (GenBank Accession No. BAE77370.1); E. coli K-12 아주 W3110 lysC (GenBank Accession No. BAE78026.1)로부터 유래한다.
일부 구체예에서, 아스파르토키나아제 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 E. coli K-12 아주 W3110로부터의 thrA, metL, 또는 lysC 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. BAB96579.2, BAE77370.1 또는 BAE78026.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 아스파르토키나아제는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. BAB96579.2, BAE77370.1 또는 BAE78026.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 아스파르토키나아제의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 아스파르토키나아제 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 아스파르토키나아제 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 위치 G330, S345, S352 및 G433 중 어느 하나에서 (예를 들면, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 또는 아르기닌으로) 변이된 E. coli ThrA 단백질(GenBank Accession No. BAB96579.2)이거나, 아미노산 위치 T342에서 (예를 들면, 이소류신으로) 변이된 E. coli LysC 단백질(GenBank Accession No. BAE78026.1)이다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. CAF18822.1 또는 CAF30573.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 아스파르토키나아제는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. CAF18822.1, CAF30573.1, AFD00291.1 또는 ADC47522.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 아스파르토키나아제의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 아스파르토키나아제 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰(asd), 또는 에셰리키아 콜라이 K12(asd)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAA40504.1) 또는 E. coli K12 (Genbank Accession No. CAA23511.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 E. coli K12의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No CAA40504.1 또는 CAA23511.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나 Genbank Accession Nos. CAA40504.1 또는 CAA23511.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, 호모세린 탈수소화효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰(hom), 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스(hom)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고), 이를 통해 외인성 호모세린 탈수소화효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 호모세린 탈수소화효소 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB98576.1), 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 (Genbank Accession No. CAF31258.1), 메타노셀라 콘라디이 HZ254 (Genbank Accession No. AFD00624.1), 또는 메타노브레비박터 루미난튬 M1 (Genbank Accession No. ADC46990.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 호모세린 탈수소화효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No BAB98576.1 또는 CAF31258.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 호모세린 탈수소화효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나 Genbank Accession Nos. BAB98576.1, CAF31258.1, AFD00624.1 또는 ADC46990.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 호모세린 탈수소화효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 호모세린 탈수소화효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, 호모세린 O-아세틸전이효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰(metX), 또는 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스(metX)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고), 이를 통해 외인성 호모세린 O-아세틸전이효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 호모세린 O-아세틸전이효소 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. AAC06035.1) 또는 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스 ATCC 29096 (Genbank Accession No. AAB86286.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 호모세린 O-아세틸전이효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. AAC06035.1 또는 AAB86286.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 호모세린 O-아세틸전이효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나 Genbank Accession Nos. AAC06035.1 또는 AAB86286.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 호모세린 O-아세틸전이효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 호모세린 O-아세틸전이효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, 호모세린 O-석시닐전이효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) (metA), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) (metA)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 호모세린 O-석시닐전이효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 호모세린 O-석시닐전이효소 폴리펩티드는 에셔리키아 콜라이 균주 K12 (Genbank Accession No. CAA32654.1) 또는 캄필로박터 제주니 균주 NCTC 11168 (Genbank Accession NO.CAL35820.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 호모세린 O-석시닐전이효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No BAB98576.1 또는 CAF31258.1에 각각 제시된 서열, 또는 이들의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 호모세린 O-석시닐전이효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나 Genbank Accession Nos. BAB98576.1, CAF31258.1, AFD00624.1 또는 ADC46990.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 호모세린 O-석시닐전이효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 호모세린 O-석시닐전이효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, O-석시닐호모세린 리아제를 발현하거나 초과생산하기 위해, 에셔리키아 콜라이(metB), 또는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)(metB)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 O-석시닐호모세린 리아제 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 O-석시닐호모세린 리아제 폴리펩티드는 에셔리키아 콜라이 균주 K12 (Genbank Accession No. AAA24167.1) 또는 헬리코박터 필로리 균주 ATCC 700392 (Genbank Accession No. AAD07176.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, O-석시닐호모세린 리아제 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 에셔리키아 콜라이 또는 헬리코박터 필로리의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. AAA24167.1 또는 AAD07176.1에 각각 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 O-석시닐호모세린 리아제는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. AAA24167.1 또는 AAD07176.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 O-석시닐호모세린 리아제의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 O-석시닐호모세린 리아제 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
예를 들면, 시스타티오닌 β-리아제를 발현하거나 초과생산하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰(metC), 또는 에셔리키아 콜라이(metC)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 시스타티오닌 β-리아제 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 시스타티오닌 β-리아제 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰(Genbank Accession No. AAK69425.1) 또는 에셔리키아 콜라이(Genbank Accession No. AAA24158.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 시스타티오닌 β-리아제 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에셔리키아 콜라이의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. AAK69425.1 또는 AAA24158.1에 각각 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 시스타티오닌 β-리아제는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. AAK69425.1 또는 AAA24158.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 시스타티오닌 β-리아제의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 시스타티오닌 β-리아제 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 수소영양 미생물은 황 공급원을 직접, 가령 H2S를 직접 메티오닌 생합성 경로로 편입시킬 수 있다. 수소영양 미생물에 의해 사용되기 위해 생산되거나 존재하는 임의의 황화물은 호모시스테인 생합성 경로로 들어갈 수 있고 여기서 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제는 H2S를 O-아세틸호모세린 내로 편입시켜 호모시스테인을 생성하고, 이는 추후에 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성)에 의해 메티오닌으로 전환될 수 있다.
예를 들면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 H2S를 O-아세틸-호모세린 내로 편입시켜 호모시스테인을 생성할 수 있는 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제(EC 2.5.1.49)를 발현하거나 초과생산하도록 조작될 수 있고, 임의로 호모시스테인을 메티오닌으로 전환하는 코발리민-의존성 메티오닌 합성효소(EC 2.1.1.13) 또는 코발리민-비의존성 메티오닌 합성효소(또한 호모시스테인 메틸전이효소로도 공지됨)(EC 2.1.1.14)를 발현하거나 초과생산하도록 조작될 수 있다.
O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제를 발현하거나 초과생산하기 위해, 메타노셀라 콘라디이 또는 메타노브레비박터 루미난튬으로부터의 것들을 기초로 하는 하나 이상의 유전자는 본 개시의 수소영양 미생물(예컨대, 비-자연적인 또는 재조합 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 폴리펩티드는 메타노셀라 콘라디이 HZ254 (Genbank Accession No. AFD00350.1), 메타노브레비박터 루미난튬 M1 (Genbank Accession No. ADC47419.1 또는 ADC46998.1), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) T19 (Genbank Accession No. ERM48664.1), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) A 균주 ATCC 3502 (Genbank Accession No. CAL83417.1), 렙토스피라 메예리(Leptospira meyeri) (Genbank Accession No. P94890.1), 또는 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1 (Genbank Accession No. YP_351901.2)로부터 유래할 수 있다.
특정 구체예에서, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 메타노셀라 콘라디이 HZ254 또는 메타노브레비박터 루미난튬 M1의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. AFD00350.1 또는 ADC47419.1에 각각 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. AFD00350.1, ADC47419.1, ADC46998.1, CCL83415.1 또는 CAL83417.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
전술된 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제 중 어느 하나에서, 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물은 추가로 조작되어 본 명세서에 기술된 바와 같이 호모세린 O-아세틸전이효소를 발현, 과발현, 또는 초과생산한다.
추가의 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 수소영양 미생물은 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소 (EC 2.1.1.13) 또는 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소(또한 호모시스테인 메틸전이효소로도 공지됨)(EC 2.1.1.14)을 발현 또는 초과생산하도록 조작될 수 있고, 임의로 또한 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제를 발현하거나 초과생산하도록 조작될 수 있다.
예를 들면, 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 에셔리키아 콜라이(metH), 코리네박테리움 글루타미쿰(metH), 또는 클로스트리듐 디피실로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 비-자연적인 메탄 영양 박테리아)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소 폴리펩티드는 에셔리키아 콜라이 K-12 아주 MG1655 (Genbank Accession No. AAC76832.1), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB98900.1), 클로스트리듐 디피실 F665 (Genbank Accession No. ERM51559.1), 또는 슈도모나스 퓨티다(Psuedomonas putida) GB-1 (Genbank Accession No. ABY97885.1)로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. BAB98900.1에 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. AAC76832.1, BAB98900.1, ERM51559.1 또는 ABY97885.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 코발라민-의존성 메티오닌 합성효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 예를 들면, 메티오닌 합성효소를 발현하거나 초과생산하기 위해, 에셔리키아 콜라이(metE 또는 metB12), 코리네박테리움 글루타미쿰(metE), 또는 메타노코쿠스 마리팔루디스(metE)로부터의 하나 이상의 유전자는 수소영양 미생물(예컨대, 비-자연적인 또는 재조합 메탄 생성 세균)에 도입되고 발현되거나 과발현될 수 있고, 이를 통해 외인성 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소 또는 이의 기능적 단편을 생산하거나 초과생산한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소 폴리펩티드는 에셔리키아 콜라이 K-12 아주 MG1655 (Genbank Accession No. AAC76832.1), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF19845.1), 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 (Genbank Accession No. NP_987521.1), 메타노셀라 콘라디이 HZ254 (Genbank Accession No. AFD00421.1), 또는 메타노브레비박터 루미난튬 M1 (Genbank Accession No. ADC47470.1)으로부터 유래한다.
특정 구체예에서, 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 또는 메타노브레비박터 루미난튬 M1의 아미노산 서열을 기초로 하고 Genbank Accession No. NP_987521.1 또는 ADC47470.1에 각각 제시된 서열, 또는 이의 기능적 단편에 대해 적어도 75% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합적으로 인코딩된 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈이거나, Genbank Accession Nos. AAC76832.1, CAF19845.1, NP_987521.1, AFD00421.1 또는 ADC47470.1에 제시된 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이들 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소의 공통 서열을 포함하거나 복수의 공지된 코발라민-비의존성 메티오닌 합성효소 폴리펩티드의 공통 서열을 포함한다.
전술된 메틸 전이효소 구체예 중 어느 하나에서, 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물은 추가로 조작되어 본 명세서에 기술된 바와 같이 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제를 발현, 과발현, 또는 초과생산한다.
전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어느 하나에서, 본 개시는 메탄 생성 고세균인 수소영양 미생물, 가령 메타노박테리움, 메타노브레비박터, 메타노칼큘루스, 메타노칼도코쿠스, 메타노셀라, 메타노코쿠스, 메타노코코이데스, 메타노코르푸스쿨룸, 메타노쿨레우스, 메타노폴리스, 메타노제니움, 메타노할로븀, 메타노할로필루스, 메타노라시니아, 메타놀로부스, 메타노메틸로보란스, 메타노마이크로븀, 메타노마이크로코쿠스, 메타노플라누스, 메타노피루스, 메타노레귤라, 메타노사에타, 메타노살숨, 메타노사르시나, 메타노스파에라, 메타노스피릴륨, 메타노써모박터, 메타노써모코쿠스, 메타노테르무스, 또는 메타노토리스를 제공한다.
전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어느 하나에서, 본 개시는 특정한 메탄 생성 고세균 종인 수소영양 미생물을 제공한다. 예시적인 메탄 생성 고세균 종은 가령 메타노박테리움 알칼리필룸, 메타노박테리움 브리얀티, 메타노박테리움 콘골렌세, 메타노박테리움 데플루비, 메타노박테리움 에스파놀래, 메타노박테리움 포르미시쿰, 메타노박테리움 이바노비, 메타노박테리움 팔루스트레, 메타노박테리움 써마그레간스, 메타노박테리움 울리기노숨, 메타노브레비박터 아시디두란스, 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스, 메타노브레비박터 고트샬키, 메타노브레비박터 올레야에, 메타노브레비박터 루미난튬, 메타노브레비박터 스미티, 메타노브레비박터 워에세이, 메타노브레비박터 월리니, 메타노셀라 아르보리재, 메타노셀라 콘라디이, 메타노셀라 팔루디콜라, 메타노써모박터 마르부르겐시스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿰, 메타노써모박터 써모플렉수스, 메타노써모박터 써모필루스, 메타노써모박터 월페이, 메타노테르무스 소시아빌리스, 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰, 메타노코르푸스쿨룸 파르붐, 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스, 메타노쿨레우스 서브마리누스, 메타노제니움 프리기둠, 메타노제니움 리미나탄스, 메타노제니움 마리눔, 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라, 메타노플라누스 엔도심바이오수스, 메타노플라누스 리미콜라, 메타노플라누스 페트롤레아리우스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노레귤라 부네이, 메타노사에타 콘실리, 메타노사에타 하룬디나세아, 메타노사에타 펠라지카, 메타노사에타 써모필라, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노사르시나 바르케리, 메타노사르시나 마제이, 메타노사르시나 써모필라, 메타노마이크로븀 모빌레, 메타노코쿠스 아에올리쿠스, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노코쿠스 반니엘리, 메타노코쿠스 볼테, 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스, 메타노칼도코쿠스 페르벤스, 메타노칼도코쿠스 인디쿠스, 메타노칼도코쿠스 인페르누스, 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이, 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스이다.
전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어느 하나에서, 본 개시는 시토크롬을 생산하거나 시토크롬을 생산하지 않는 메탄 생성 고세균을 포함하는 수소영양 미생물을 제공한다. 시토크롬을 생산하지 않는 예시적인 메탄 생성 고세균은 메타노코쿠스 마리팔루디스 또는 메타노코쿠스 반니엘리를 포함한다. 시토크롬을 생산하는 예시적인 메탄 생성 고세균은 메타노사르시나 바르케리 또는 메타노사르시나 마제이다.
H 2 /CO X 기질
수소 생산은 일련의 개질, 컨디셔닝 및 분리 단계를 수반하며 여기서 이들 단계 중 몇 가지(예컨대, 수증기 개질, 자기열 개질, 고온 전환, 저온 전환, CO2 스크러빙 및 압력 변동 흡착)는 그 자체로 또는 하나 이상의 다른 기체 스트림과 조합으로 본 개시의 수소영양 미생물 및 방법을 위한 공급원료로서 유용한 H2/COX 기질을 제공할 수 있는 공급원료를 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서 이용할 수 있다.
배경 설명을 위해, 수소 생산은 단일 단계 또는 다중단계 개질, 부분 산화 또는 가스화를 수반하며, 고온 수성가스 전환(HTS) 반응, 저온 수성가스 전환(LTS) 반응, 또는 둘다와 조합되어 합성가스와 같은 H2/COX 기질을 생산할 수 있다. 일부 방법에서, 탄소 산화물은 분자체를 이용한 압력 변동 흡착(PSA)에 의해 제거되며, 이는 일부 잔여 H2 기체와 함께 다양한 양의 이산화탄소(CO2), 일산화탄소(CO), 및 메탄(CH4)를 포함하는 테일가스(tail gas)로부터 실질적으로 순수한 수소(H2) 기체 스트림을 분리한다. 특정 구체예에서, 이산화탄소는 기체(예컨대, 합성가스)를 PSA 처리하기 전에 임의로 스크러빙될 수 있다. 사용되는 합성가스 제조 공정 및 이산화탄소의 스크러빙 여부에 따라, 테일가스는 상이한 비율의 H2, CO2, CO, 및 CH4를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 본 개시의 방법에서 사용하기 위한 H2/COX 기질은 PSA 테일가스 및 H2 기체의 혼합물을 포함하는 기체 스트림 배합물이다.
예를 들면, HTS와 조합된 메탄 수증기 개질은 대부분의 H2(약 75%) 및 CO2(약 20%), 그리고 일부의 CH4(약 5%)를 가지고 CO가 매우 적거나 아예 없는 기체 스트림을 생성할 것이다. 또다른 예에서, LTS와 조합된 메탄 수증기 개질은 대부분의 H2(약 75%) 및 CO(약 10%), 그리고 일부의 CO2(약 5%) 및 CH4(약 1%)를 가지는 기체 스트림을 생성할 것이다. 또다른 예에서, HTS 및 PSA와 조합된 메탄 수증기 개질은 대부분의 H2(약 30%) 및 CO2(약 45%), 그리고 적은 양의 CO(약 10%) 및 CH4(약 15%)를 가지는 테일가스를 생성할 것이다. 마지막 구체예에서, CO2 스크러빙 단계가 포함되는 경우라면, 테일가스는 대부분의 H2(약 50%), CH4(약 30%) 및 CO(약 20%), 그리고 적은 CO2(약 1%)를 포함할 것이다. 특정 구체예에서, PSA 테일가스는 PSA로부터 생성된 파이프라인 H2와 혼합되어 관심의 H2/COX 기질, 가령 약 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1의 H2:CO2 비율을 가지는 H2/COX 기질을 생성한다.
메탄의 수증기 개질은 각각 약 1:7 내지 약 1:15 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율을 제공할 수 있고, 여기서 다른 성분은 CO, CH4 및 H2O을 포함할 수 있다. 대안적으로, 메탄은 CO2로 개질될 수 있고, 이를 건식 개질이라 부른다. 메탄의 건식 개질은 각각 약 1:5 내지 약 1:15 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율을 제공할 수 있고, 여기서 다른 성분은 CO, CH4 및 H2O을 포함할 수 있다.
부분 산화(촉매적 또는 비-촉매적) 및 자기열 개질은 천연가스의 보조-반응물질로서 물 대신 산소를 사용한다. 부분 산화 및 자기열 개질은 약 1:20인 CO2 대 H2의 공급원료 비율을 제공할 수 있고, 여기서 다른 성분은 CO, CH4 및 H2O을 포함할 수 있다.
가스화, 즉 탄소 함유 재료(예컨대, 액화 천연가스, 나프타, 역청, 석탄, 바이오매스, 등)를 공기 또는 산소와 함께 부분 산화하는 과정은 본 개시의 수소영양 미생물 및 방법과 함께 사용하기 위한 H2/COX 공급원료를 제공할 수 있다. 예를 들면, 석탄의 가스화는 각각 약 1:1.1 내지 약 1:11 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율을 제공하고, 여기서 다른 성분은 CO, CH4, N2, 및 H2O를 포함할 수 있다.
암모니아 합성은 일련의 개질 및 컨디셔닝 단계를 수반하며, 여기서 이들 단계 중 네 가지(수증기 개질, 자기열 개질, 고온 전환, 저온 전환)은 본 개시의 수소영양 미생물 및 방법과 함께 사용하기 위한 H2/COX 공급원료를 제공할 수 있다. 이들 상이한 과정 각각을 위해, 각각 약 1:3 내지 약 1:10 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율이 제공되며, 여기서 다른 성분은 CO, CH4, N2 및 H2O을 포함할 수 있다.
메탄올 합성은 저온 개질, 수증기 개질, 및 자기열 개질의 단계를 수반하며, 이들은 모두 본 개시의 수소영양 미생물 및 방법과 함께 사용하기 위한 H2/COX 공급원료를 제공할 수 있다. 이들 상이한 세 과정 각각을 위해, 각각 약 1:7 내지 약 1:12 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율이 생성되며, 여기서 다른 성분은 CO, CH4, 및 H2O을 포함할 수 있다.
통합된 제강 공장은 코크스 오븐(석탄으로부터 코크스를 제조), 용광로(선철을 제조) 및 산소 용광로(강철을 제조)를 포함하는 다양한 공정을 조합한다. 특정 구체예에서, 통합 제강 공장 내 직접 환원은 (코크스 대신에) 천연가스를 환원제로 사용하여 선철을 제조한다. 이들 오븐뿐 아니라 직접 환원 개질(이는 탑가스를 생성함)은 각각 약 8:1(용광로 또는 산소 용광로로부터) 내지 약 1:32(코크스 오븐으로부터) 범위인 CO2 대 H2의 공급원료 비율을 생성할 수 있고, 여기서 다른 성분은 CO, CH4, C2H6, C3H8, N2, 및 H2O을 포함할 수 있다.
전술된 H2/COX 기질의 공급원 중 어느 하나에서, 그렇게 생성된 H2/COX 공급원료는 임의의 다른 생성된 H2/COX 공급원료 또는 H2, CO2, CO 또는 이들의 임의의 조합과 혼합되어 관심의 H2/COX 기질, 가령 약 4:1 또는 3:1의 H2:CO2 비율을 가지는 기질을 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들면, 메탄 생성 세균과 사용하기 위한 H2/COX 기질은 약 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1의 H2:CO2 비율을 포함하고, 임의로 CO의 총량은 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.9%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 20%을 넘지 않는다. 다른 구체예에서, 예를 들면, 클로스트리듐과 사용하기 위한 H2/COX 기질은 약 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1의 H2:(CO2 + CO) 비율을 포함하고, 임의로 CO의 총량은 적어도 약 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상이다. 이들 구체예 중 어느 하나에서, H2/COX 기질은 PSA 테일가스와 H2 기체의 배합물을 포함할 수 있다.
전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어느 하나에서, 본 개시는 H2와 CO2 또는 CO 또는 둘다, 및 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분을 포함하는 H2/COX 기질을 이용, 대사, 산화, 또는 전환하는 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 H2, CO2 및 CO, 여기서 CO가 CO2보다 많고, 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분이다. 추가의 구체예에서, H2/COX 기질은 H2, CO2 및 CO, 여기서 CO2가 CO보다 많고, 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분이다. 더욱 추가의 구체예에서, H2/COX 기질은 H2, CO2 및 CO, 여기서 CO가 CO2 및 H2 둘다보다 많고, 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분이다. 특정한 경우에, H2/COX를 대사하는 미생물은 에너지 공급원으로서 H2를 및 탄소 공급원으로서 COX를 사용하고, 여기서 x는 1 또는 2임, 또는 에너지 공급원으로서 H2 및 COX를, 및 탄소 공급원으로서 COX를 사용할 수 있다.
전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어느 하나에서, 본 개시는 예를 들면, 천연가스 또는 액체 탄화수소(예컨대, 에탄, 프로판, 나프타)의 수증기 개질, 건식 개질, 자기열 개질, 촉매적 부분 산화 또는 부분 산화에 의해, 수소 생산 도중, 암모니아 합성 도중, 메탄올 합성 도중, 제강에 의해, 또는 석탄, 나프타, 잔사유, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생산될 수 있는 H2/COX 기질을 제공한다. 특정 구체예에서, 전술된 개질 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 H2/COX 기질은 수성-가스 전환 반응에 의해 추가로 컨디셔닝될 수 있다. 또한, 전술된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 하나 이상의 기체 스트림은 수소, 일산화탄소 또는 이산화탄소의 다른 공급원과 배합되어 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소 스크러버 폐-가스, 연도 가스, 에탄 크래커 폐-가스, 개질기 폐-가스 또는 염소 합성 폐-가스를 비롯한 H2/COX 기질을 생산하거나 만들 수 있다. 일부 구체예에서, CO2 대 H2의 공급원료 비율은 각각 약 1:50 내지 약 10:1 범위이다. 추가의 구체예에서, CO2 대 H2의 공급원료 비율은 각각 약 1:3 내지 약 1:5 범위이다.
배양 방법
다양한 배양 방법론이 본 명세서에 기술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 박테리아, 메탄 생성 고세균)을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 수소영양 미생물은 회분 배양 또는 연속 배양 방법에 의해 성장될 수 있다. 특정 구체예에서, 배양물은 제어된 배양 유닛, 가령 발효조, 생물반응기, 중공섬유막 생물반응기, 기포탑 생물반응기, 삼상층(trickle bed) 생물반응기, 등에서 성장한다.
전통적인 회분 배양 방법은 배지의 조성이 배양 시작시에 설정되며 배양 과정 도중에는 외부적인 변화를 겪지 않는 폐쇄된 시스템이다. 따라서, 배양 과정의 시작시에, 배지는 요망되는 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)으로 접종되고 시스템에 아무 것도 추가하지 않아도 성장 또는 대사 활성이 일어나도록 허용된다. 일반적으로, "회분" 배양은 탄소 공급원, 기체 공급원료 및 배지 성분의 부가와 관련된 회분이고, 여기서 폐기 가스는 배출되도록 허용되며, 시도는 대개 pH와 같은 다른 요인을 조절하는 시점에 이루어진다. 회분 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 바이오매스 조성은 배양이 종결되는 시간까지 끊임없이 변화한다. 회분 배양 도중에,세포는 안정한 유도기를 거쳐 높은 성장의 로그기로 및 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 멈추는 정체기로 간다. 처리해주지 않으면 정체기의 세포는 결국 죽을 것이다. 로그 성장기의 세포는 흔히 일부 시스템에서 최종 산물 또는 중간산물의 대량 생산을 담당한다. 정체기 또는 로그-이후기 생산은 다른 시스템에서 수득될 수 있다.
공급-회분 시스템은 표준 회분 시스템을 변화시킨 것이다. 공급-회분 배양 과정은 배양이 진행되면서 기질 및 잠재적으로는 배지 성분이 늘어나도록 부가되는 수정이 있는 회분 시스템을 포함한다. 공급-회분 시스템은 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해하는 경향이 있는 경우 및 배지 내에 제한된 양의 기질이 요망되는 경우에 유용하다. 기체 기질 발효에서, 시스템은 기체 기질에 대하여는 연속적(폐기가스가 제거될 수 있기 때문임)이고 액체(배지)에 대하여는 공급-회분 방식이다. 회분 및 공급-회분 배양 방법은 일반적이며 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2판 (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227, 1992를 참조하라).
연속 배양은 진행을 위해 일정한 배양 배지가 연속적으로 생물반응기에 부가되고 동시에 동일한 양의 조건화 배지가 제거되는 (바이오매스 또는 세포 보전과 함께 또는 없이) "개방된" 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로 세포를 일정한 높은 액체상 밀도로 유지하며 여기서 세포는 주로 로그기 성장 중에 있다. 대안적으로, 연속 배양은 공급원료 및 양분이 연속적으로 부가되고 세포 무리로부터 중요한 산물, 부산물, 및 폐 산물이 연속적으로 제거될 수 있는 바이오매스, 세포 보전 또는 세포 부동화를 수반할 수 있다. 세포 보전은 다양한 방법, 가령 여과, 원심분리 또는 침전에 의해 수행될 수 있다. 세포 부동화는 천연 및/또는 합성 재료로 이루어진 다양한 고체 지지체를 이용하여 수행될 수 있다.
연속 또는 반-연속 배양은 세포 성장 또는 최종 산물 농도에 영향을 주는 하나의 요인 또는 복수 개의 요인의 조절을 허용한다. 예를 들면, 한 방법은 제한된 양분(예컨대, 탄소 공급원, 질소 수준, 수소 수준, 아인산 수준)을 고정된 비율로 유지할 수 있고 모든 다른 척도의 조절을 허용한다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 수많은 요인이 연속적으로 변형될 수 있는 반면 배지 탁도로 측정되는 세포 농도는 불변하게 유지된다. 특정 구체예에서, 수소영양 바이오매스 성장은 산물 대 바이오매스 비율이 증가하도록 제한된다. 연속 배양 과정을 위해 양분 및 성장 요인을 조절하는 방법, 뿐만 아니라 산물 형성 속도를 최대화하기 위한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Brock, 1989을 참조하라).
액체상 생물반응기(예컨대, 교반 탱크, 충전층, 단일 액체상, 이중 액체상, 중공섬유막)는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 수소영양 미생물의 성장을 위해 사용될 수 있다.
다중상 생물반응기가 본 개시의 방법에서 사용될 수 있다(예컨대, 기포탑 반응기, 삼상층 반응기(고정 또는 충전층), 유동층 반응기). 기포탑은 기체가 기포의 형태로 액체와 접촉되는 장치다. 삼상층 반응기는 배양물을 성장시키기 위해 기체와 액체의 동방향 또는 역방향 흐름을 이용한다. 유동층 반응기는 유체(기체 또는 액체)를 과립형 고체 물질을 통해 고속으로 통과하게 하여 고체를 부유시켜 고체로 하여금 유체처럼 행동하게 만드는 것을 포함한다. 다중상 생물반응기의 한 가지 목적은 액체 및 기체상을 혼합하는 것이고, 여기서 기체는 수소영양 미생물에 의해 물질 이동 및 화학 반응의 강도에 따라 더 높거나 더 낮은 정도로 소비된다. 다양한 유형의 다중상 생물반응기는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 본 개시의 수소영양 미생물의 성장을 위해 사용될 수 있다.
본 개시에 기술된 수소영양 미생물은 분리된 순수한 배양물로서, 성장에 도움을 줄 수 있는 이종의 비-수소영양 미생물(들)과 함께, 또는 혼합된 배양물을 생성하기 위해 하나 이상의 상이한 균주 또는 종의 수소영양 미생물과 조합되어 성장할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시는 전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 중 어느 하나를 메티오닌을 생산하기에 충분한 시간 동안 배양하는 것을 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌-함유 공급물 첨가제를 생산하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물은: (a) 모 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 발현하고; (b) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 과발현하고; 또는 (c) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드의 변형된 조절을 포함하고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산한다.
특정 구체예에서, 본 개시는 본 개시의 재조합, 메티오닌-분비 수소영양 미생물을 H2/COX기질의 존재에서 황 동화 폴리펩티드로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조건 하에 및 충분한 시간 동안 배양하는 것을 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌-함유 공급물 첨가제를 제조하기 위한 공정을 제공하며, 여기서 모 수소영양 미생물에 의해 생산된 메티오닌보다 더 높은 수준으로 메티오닌이 생산되고 배양 배지 내에 축적된다.
전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 발효조 또는 생물반응기, 가령 액체상, 기포탑, 또는 삼상층 생물반응기에서 배양될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)을 이용하여 메티오닌을 생산하기 위한 전술된 방법 중 어느 하나에서, 기체 공급원료는 H2/COX 기질이고, 여기서 공급원료는 H2와 CO2 또는 CO 또는 둘다, 및 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분을 포함한다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 합성가스, 가령 천연가스 또는 액체 탄화수소의 수증기 개질, 건식 개질, 자기열 개질, 촉매적 부분 산화 또는 부분 산화에 의해 생산되고, 수성-기체 전환 반응에 의해 컨디셔닝된, 암모니아 합성에 의해, 메탄올 합성에 의해, 제강에 의해, 또는 석탄, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생산된 합성가스이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)을 이용하여 메티오닌을 생산하기 위한 전술된 방법 중 어느 하나에서, 기체 기질은 H2/COX 기질이며, 이는 예를 들면, 천연가스 또는 경질 탄화수소(예컨대, 에탄, 프로판, 나프타)의 수증기 개질, 건식 개질, 자기열 개질, 촉매적 부분 산화 또는 부분 산화에 의해 생산되고, 수성-가스 전환 반응에 의한 컨디셔닝되고, 수소 생산 도중, 암모니아 합성 도중, 메탄올 합성 도중, 제강에 의해, 또는 석탄, 나프타, 잔사유, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 그렇게 생산된 임의의 기체 스트림과 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소 스크러버 폐-가스, 연도 가스, 에탄 크래커 폐-가스, 개질기 폐-가스 염소 합성 폐-가스, 또는 이들의 임의의 조합을 비롯한 수소, 일산화탄소, 이산화탄소 또는 이들의 임의의 조합의 하나 이상의 다른 공급원의 배합물이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)을 이용하여 메티오닌을 생산하기 위한 전술된 방법 중 어느 하나에서, 배양되는 수소영양 미생물은 메탄 생성 고세균, 가령 메타노박테리움, 메타노브레비박터, 메타노칼큘루스, 메타노칼도코쿠스, 메타노셀라, 메타노코쿠스, 메타노코코이데스, 메타노코르푸스쿨룸, 메타노쿨레우스, 메타노폴리스, 메타노제니움, 메타노할로븀, 메타노할로필루스, 메타노라시니아, 메타놀로부스, 메타노메틸로보란스, 메타노마이크로븀, 메타노마이크로코쿠스, 메타노플라누스, 메타노피루스, 메타노레귤라, 메타노사에타, 메타노살숨, 메타노사르시나, 메타노스파에라, 메타노스피릴륨, 메타노써모박터, 메타노써모코쿠스, 메타노테르무스, 또는 메타노토리스이다.
특정 구체예에서, 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물은 메타노박테리움 알칼리필룸, 메타노박테리움 브리얀티, 메타노박테리움 콘골렌세, 메타노박테리움 데플루비, 메타노박테리움 에스파놀래, 메타노박테리움 포르미시쿰, 메타노박테리움 이바노비, 메타노박테리움 팔루스트레, 메타노박테리움 써마그레간스, 메타노박테리움 울리기노숨, 메타노브레비박터 아시디두란스, 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스, 메타노브레비박터 고트샬키, 메타노브레비박터 올레야에, 메타노브레비박터 루미난튬, 메타노브레비박터 스미티, 메타노브레비박터 워에세이, 메타노브레비박터 월리니, 메타노셀라 아르보리재, 메타노셀라 콘라디이, 메타노셀라 팔루디콜라, 메타노써모박터 마르부르겐시스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿰, 메타노써모박터 써모플렉수스, 메타노써모박터 써모필루스, 메타노써모박터 월페이, 메타노테르무스 소시아빌리스, 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰, 메타노코르푸스쿨룸 파르붐, 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스, 메타노쿨레우스 서브마리누스, 메타노제니움 프리기둠, 메타노제니움 리미나탄스, 메타노제니움 마리눔, 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라, 메타노플라누스 엔도심바이오수스, 메타노플라누스 리미콜라, 메타노플라누스 페트롤레아리우스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노레귤라 부네이, 메타노사에타 콘실리, 메타노사에타 하룬디나세아, 메타노사에타 펠라지카, 메타노사에타 써모필라, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노사르시나 바르케리, 메타노사르시나 마제이, 메타노사르시나 써모필라, 메타노마이크로븀 모빌레, 메타노코쿠스 아에올리쿠스, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노코쿠스 반니엘리, 메타노코쿠스 볼테, 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스, 메타노칼도코쿠스 페르벤스, 메타노칼도코쿠스 인디쿠스, 메타노칼도코쿠스 인페르누스, 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이, 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스일 수 있다.
전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 중온성, 호열성, 고호열성, 또는 이들의 조합이다. 전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 편성 혐기성생물 또는 통성 혐기성생물이다. 전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 편성 수소영양생물 또는 통성 수소영양생물이다.
수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)은 모 미생물과 비교할 때 향상된 수준의 메티오닌을 생산하도록 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 조작된 수소영양 미생물은 COX 기질의 존재에서, 임의로 H2의 존재에서, 동일한 배양 조건(예컨대, 혈청 튜브 또는 생물반응기)에서 배양될 경우 모 수소영양 미생물에 의해 생산된 것보다 적어도 약 10% 을 초과하는 수준으로, 또는 모 수소영양 미생물에 의해 생산된 것보다 적어도 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배, 약 15-배, 약 20-배, 약 30-배, 약 40-배, 약 50-배, 약 60-배, 약 70-배, 약 80-배, 약 90-배, 약 100-배, 약 500-배, 또는 약 1000-배 수준으로 메티오닌을 생산한다. 다른 구체예에서, 본 개시의 조작된 수소영양 미생물은 동일한 배양 조건 하에서 모 수소영양 미생물에 의해 생산된 것보다 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%을 초과하는 수준으로 메티오닌을 생산한다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 메티오닌으로 전환하기 위한 방법은 약 0.001g/배양물의 L 내지 약 500g/배양물의 L의 메티오닌을 생산할 것이다. 일부 구체예에서, 생산되는 메티오닌의 양은 약 1g/배양물의 L 내지 약 100g/배양물의 L이다. 추가의 구체예에서, 생산되는 메티오닌의 양은 약 0.001g/L, 0.01g/L, 0.025g/L, 0.05g/L, 0.1g/L, 0.15g/L, 0.2g/L, 0.25g/L, 0.3g/L, 0.4g/L, 0.5g/L, 0.6g/L, 0.7g/L, 0.8g/L, 0.9g/L, lg/L, 2.5g/L, 5g/L, 7.5g/L, 10g/L, 12.5g/L, 15g/L, 20g/L, 25g/L, 30g/L, 35g/L, 40g/L, 45g/L, 50g/L, 60g/L, 70g/L, 80g/L, 90g/L, 100g/L, 125g/L, 150g/L, 175g/L, 200g/L, 225g/L, 250g/L, 275g/L, 300g/L, 325g/L, 350g/L, 375g/L, 400g/L, 425g/L, 450g/L, 475g/L, 또는 500g/L이다.
더욱 추가의 구체예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 메티오닌으로 전환하기 위한 방법은 적어도 약 또는 최대 약 1 킬로그램(kg), 적어도 약 또는 최대 10 kg, 적어도 약 또는 최대 100 kg, 적어도 약 또는 최대 1,000 kg, 적어도 약 또는 최대 10,000 kg, 적어도 약 또는 최대 50,000 kg, 적어도 약 또는 최대 100,000 kg, 적어도 약 또는 최대 250,000 kg, 적어도 약 또는 최대 500,000 kg, 또는 그 이상의 메티오닌/일을 생산할 것이다. 특정 구체예에서, 메티오닌은 연간 약 100,000 메트릭톤(MT)(즉, 연간 1억 kg 또는 300,000 kg/일), 연간 약 75,000 MT(또는 225,000 kg/일), 연간 약 50,000 MT(또는 150,000 kg/일), 약 25,000 MT(또는 75,000 kg/일), 또는 연간 약 10,000 MT(또는 30,000 kg/일)로 생산된다.
메티오닌을 생산하기 위한 시스템
추가적인 양태에서, 본 개시는 메티오닌을 생산하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 H2/COX 기질을 포함하는 기체의 공급원; (a) 모 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 발현하고; (b) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 과발현하고; 또는 (c) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드의 변형된 조절을 포함하는 전술된 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물 중 어느 하나 이상을 포함하는 생물반응기; 및 기체가 생물반응기로 유동할 수 있게 하는 기체 공급원 및 생물반응기 사이에 배치된 이음장치(connector)를 포함하고; 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 대사하여 모 수소영양 미생물과 비교할 때 하나 이상의 메티오닌 경로 아미노산을 초과생산한다.
전술된 시스템 중 어느 하나에서, H2/COX 기질은 동물 사료 또는 비료와 같은 생물학적 재료로 전환된다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 메티오닌이 농축된 생물학적 재료로 동화된다. 추가의 구체예에서, 생성된 메티오닌은 정제되고 동물 사료, 식품 첨가제 또는 영양 보충제로 사용된다. 또 다른 구체예에서, 메티오닌이 농축된 바이오매스는 동물 사료, 식품 첨가제 또는 영양 보충제로 사용된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)을 이용하여 메티오닌을 생산하기 위한 전술된 시스템 중 어느 하나에서, 기체 공급원료는 H2/COX 기질이고, 여기서 공급원료는 H2와 CO2 또는 CO 또는 둘다, 및 임의로 본 명세서에 기술된 바와 같은 다양한 다른 성분을 포함한다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 합성가스, 가령 천연가스 또는 경질 탄화수소(예컨대, 에탄, 프로판, 나프타)의 수증기 개질, 건식 개질, 자기열 개질, 촉매적 부분 산화 또는 부분 산화에 의해 생산되고, 수성-기체 전환 반응에 의해 컨디셔닝된, 암모니아 합성 도중, 메탄올 합성 도중, 제강에 의해, 또는 석탄, 나프타, 잔사유, 바이오매스 또는 폐기물의 가스화에 의해 생산된 합성가스이다. 특정 구체예에서, H2/COX 기질은 그렇게 생산된 임의의 기체 스트림과 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소 스크러버 폐-가스, 연도 가스, 에탄 크래커 폐-가스, 개질기 폐-가스 염소 합성 폐-가스, 또는 이들의 임의의 조합을 비롯한 수소, 일산화탄소, 이산화탄소 또는 이들의 임의의 조합의 하나 이상의 다른 공급원의 배합물이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물(예컨대, 메탄 생성 세균)을 이용하여 메티오닌을 생산하기 위한 전술된 시스템 중 어느 하나에서, 배양되는 수소영양 미생물은 메탄 생성 고세균, 가령 메타노박테리움, 메타노브레비박터, 메타노칼큘루스, 메타노칼도코쿠스, 메타노셀라, 메타노코쿠스, 메타노코코이데스, 메타노코르푸스쿨룸, 메타노쿨레우스, 메타노폴리스, 메타노제니움, 메타노할로븀, 메타노할로필루스, 메타노라시니아, 메타놀로부스, 메타노메틸로보란스, 메타노마이크로븀, 메타노마이크로코쿠스, 메타노플라누스, 메타노피루스, 메타노레귤라, 메타노사에타, 메타노살숨, 메타노사르시나, 메타노스파에라, 메타노스피릴륨, 메타노써모박터, 메타노써모코쿠스, 메타노테르무스, 또는 메타노토리스이다.
특정 구체예에서, 비-자연적인 또는 재조합 수소영양 미생물은 메타노박테리움 알칼리필룸, 메타노박테리움 브리얀티, 메타노박테리움 콘골렌세, 메타노박테리움 데플루비, 메타노박테리움 에스파놀래, 메타노박테리움 포르미시쿰, 메타노박테리움 이바노비, 메타노박테리움 팔루스트레, 메타노박테리움 써마그레간스, 메타노박테리움 울리기노숨, 메타노브레비박터 아시디두란스, 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스, 메타노브레비박터 고트샬키, 메타노브레비박터 올레야에, 메타노브레비박터 루미난튬, 메타노브레비박터 스미티, 메타노브레비박터 워에세이, 메타노브레비박터 월리니, 메타노셀라 아르보리재, 메타노셀라 콘라디이, 메타노셀라 팔루디콜라, 메타노써모박터 마르부르겐시스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿰, 메타노써모박터 써모플렉수스, 메타노써모박터 써모필루스, 메타노써모박터 월페이, 메타노테르무스 소시아빌리스, 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰, 메타노코르푸스쿨룸 파르붐, 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스, 메타노쿨레우스 서브마리누스, 메타노제니움 프리기둠, 메타노제니움 리미나탄스, 메타노제니움 마리눔, 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라, 메타노플라누스 엔도심바이오수스, 메타노플라누스 리미콜라, 메타노플라누스 페트롤레아리우스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노레귤라 부네이, 메타노사에타 콘실리, 메타노사에타 하룬디나세아, 메타노사에타 펠라지카, 메타노사에타 써모필라, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노사르시나 바르케리, 메타노사르시나 마제이, 메타노사르시나 써모필라, 메타노마이크로븀 모빌레, 메타노코쿠스 아에올리쿠스, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노코쿠스 반니엘리, 메타노코쿠스 볼테, 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스, 메타노칼도코쿠스 페르벤스, 메타노칼도코쿠스 인디쿠스, 메타노칼도코쿠스 인페르누스, 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이, 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스일 수 있다.
전술된 시스템 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 중온성, 호열성, 고호열성, 또는 이들의 조합이다. 전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 편성 혐기성생물 또는 통성 혐기성생물이다. 전술된 방법 중 어느 하나에서, 수소영양 미생물은 편성 수소영양생물 또는 통성 수소영양생물이다.
실시예
실시예 1
메타노코쿠스 마리팔루디스 의 에티오닌-저항성 돌연변이의 생산
메티오닌 생산은 미생물에서, 특히 피드백 저해에 의해 고도로 조절된다. 박테리아 또는 고세균을 독성 메티오닌 유사체, 가령 DL-에티오닌에 노출시키면, 메티오닌 피드백 저해에서 변이된 세포가 생성될 것이고, 이는 독성 유사체의 존재에서 성장할 수 있는 돌연변이로 규명된다(예컨대, Kumar 등, Biotechnology Advances 23:41-61, 2005를 참조하라). 표 1은 본 명세서에 기술된 실험에서 사용된 일부를 포함하여, 야생형에 비교한 이들의 유전적 바탕과 함께 제작한 유기체의 목록을 제공한다.
표 1. 수정된 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2
균주 비교의 표현형 또는 유전형
Trel 10 야생형 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2
Trel10-Mut333 피드백 저항성 아스파르토키나아제(LysC)를 갖는 Trel 10
Trel10-333UR Upp:rep를 갖는 Trel10-Mut333. Trel10-Mut333과 거의 동일한 아미노산 생산을 가짐.
Trel10-333UR-ΔdA dapA결실을 갖는 Trel10-333UR. 성장을 위해 라이신을 필요로 함
Trel10-333UR-ΔdA-er1.1 Trel10-333UR-ΔdA 에티오닌 저항성 돌연변이 1.1
Trel10-333UR-ΔdA-er3.1 Trel10-333UR-ΔdA 에티오닌 저항성 돌연변이 3.1
Trel10-333UR-ΔdA-er3.3 Trel10-333UR-ΔdA 에티오닌 저항성 돌연변이 3.3
Trel 9 야생형 메타노사르시나 마제이 C2A
Trel 42 야생형 메타노사르시나 아세티보란스 C2A
Trel42-er1.1 Trel142에티오닌 저항성 돌연변이 1.1
Trel42-er1.2 Trel142에티오닌 저항성 돌연변이 1.2
Trel42 -er1.3 Trel142에티오닌 저항성 돌연변이 1.3
에티오닌 저항성 M. 마리팔루디스 돌연변이의 단리
에티오닌 저항성 돌연변이를 생성하기 위해, Trel10-333UR-ΔdA(라이신 피드백 저항성 lysC 및 dapA 결실을 내포하는 M. 마리팔루디스 S2, 표 1)를 100 mg/L의 라이신으로 보충된 카사미노산이 없는 25 mL McCas 배지에서 37 ℃에서 대략 0.50의 OD600까지 성장시키고(Sarmiento 등, Methods Enzymol. 494:44, 2011를 참조하라, 이는 배지 McCV를 언급하며, 본 실시예에서는 카사미노산 또는 효모 추출물 없이 사용되었다), 이후 두 개의 무산소 Balch 튜브에 분배하고(각각 5 mL의 배양물), 한 튜브는 0.3 mL 변이원성 에틸 메탄설포네이트(EMS, McCas no Cas 내 1:50 희석)를 및 다른 튜브는 대조군으로서 0.3mL McCas no Cas만 담았다. 튜브에 H2/CO2의 80/20 혼합물을 40 PSIG의 압력으로 가압하고 교반 없이 37℃에서 한 시간 동안 배양했다. 배양 한 시간 후에, 압력을 방출하고 각 튜브로부터 0.5mL의 배양물을 꺼내고 McCas 아가 플레이트에 분주하여 사멸 속도를 확인했다.
나머지 배양물을 세척하여 EMS를 제거하고, 이후 15분간 1000g로 원심분리하여 침전시키고 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1mL McCas no Cas에 재현탁하여 세척하고, 마지막으로 1000g로 15분간 다시 원심분리했다. 이러한 세척을 2번 반복하여 EMS를 제거했다. 마지막 세척 후에, 수확한 세포를 500 μL McCas no Cas에 현탁시키고 회복을 위해 100 μl를 5 mL의 McCas no Cas + 100mg/L 라이신을 함유하는 세 개의 Balch 튜브(EMS 처리군) 또는 하나의 튜브(대조군, 미처리)에 옮겼다. 각각의 튜브에 0.1mL 2.5% Na2S x 9H20를 부가하고 이후 각각의 튜브에 80/20 H2/CO2을 40 PSIG로 가압하고 밤새 37℃에서 회복하도록 두었다. 다음날 아침, 각각의 배양물을 원심분리하여 0.1mL까지 농축하고 100 mg/L 라이신 및 3 g/L 에티오닌을 함유하는 McCas no Cas 플레이트에 분주했다. 플레이트를 37℃에서 10 PSIG의 80/20 H2/CO2 기체 혼합물과 함께 Oxoid 무산소 자(jar)에서 배양했다. 에티오닌 선별은 EMS에 노출되었던 배양물에서만 성장하는 콜로니를 생성했다. 모든 작업은 달리 언급되지 않은 한 무산소 조건 하에서 수행했다.
각각의 플레이트로부터 다섯 개의 콜로니를 선택하고 HPLC 분석하여 메티오닌 생산을 측정했다. 요약하면, 메타노코쿠스 마리팔루디스 재조합체가 퓨로마이신(2.5 mg/L)으로 보충하고, 37 ℃에서 밤새 교반하며 H2:CO2 (4:1)를 40 psi로 통기시킨 Balch 튜브 내 5 mL의 McCAS 배지에서 성장했다. 두 번째 날에, 밤새 배양시킨 100 μl를 시드 배양물로 사용하여 H2:CO2 (4:1)를 각각 40 및 20 psi의 압력으로 통기시킨 Balch 튜브 내 5 ml 최소 배지(MM) 또는 100 ml 혈청 배지에 접종하였다. 배양물을 72 시간 동안 교반하며 37℃에 배치하고; 배양 시작시 H2:CO2 (4:1) 기체를 온전한 압력까지 다시 채웠다. 발효 후에, 1.8 ml의 배양액을 Eppendorf 튜브에 옮기고, 세포를 12,000xg로 제거하고 생성된 상청액을 0.2 μm 필터를 통해 통과시켰다. 여과액의 아미노산 함량을 HPLC로 분석했다. 필요한 경우, 시드 및 발효 배지에 퓨로마이신(2.5 mg/L)을 보충할 수 있다.
표 2. 혈청 튜브에서 돌연변이 M. 마리팔루디스 에 의한 아미노산 생산
균주 아미노산(mg/L)
글리신 트레오닌 라이신 메티오닌
Trel10 7 31 ND ND
Trel10-Mut333 208 24 22 ND
Trel10-333UR 149 10 12 ND
Trel10-333UR-ΔdA 166 17 NA 3
Trel10-333UR-ΔdA-er1.1 219 32 NA 22
Trel10-333UR-ΔdA-er3.1 175 22 NA 15
Trel10-333UR-ΔdA-er3.3 165 19 NA 6
에티오닌 선별에 의해 확인한 다섯 개 콜로니 중에서, 세 개의 콜로니가 HPLC로 분석했을 때 메티오닌 역가 증가를 보였다. 증가된 메티오닌 역가를 갖는 세 개의 콜로니를 에티오닌 저항성 돌연변이 1.1, 3.1, 및 3.3로 지정했다(각각 Trel10-333UR-ΔdA-er1.1, Trel10-333UR-ΔdA-er3.1, 및 Trel10-333UR-ΔdA-er3.3).
에티오닌 저항성 메타노사르시나 돌연변이의 단리
에티오닌 저항성 메타노사르시나 돌연변이를 선별하기 위해, Trel 42 (메타노사르시나 아세티보란스 C2A, DSM 2834) 또는 Trel 9 (메타노사르시나 마제이 GO1, DSM 3647)에 대해 돌연변이유발을 수행했다. 요약하면, 균주를 카사미노산이 없는 25 mL McCas 배지 더하기 5G/L 의 메탄올(배지 레시피에 관해서는, Sarmiento 등, Methods Enzymol. 494:44, 2011을 참조하라; 이는 배지 McCV를 언급하며, 본 실시예에서는 카사미노산 또는 효모 추출물 없이 사용되었다) 또는 카지톤(Casitone)과 효모가 없는 DSM 120 배지 플러스 5 G/L 메탄올에서 37℃에서 대략 0.50의 OD600까지 성장시켰다. 5 mL의 배양물을 두 개의 무산소 Balch 튜브에 분배했다. 한 튜브에, 0.3 mL 에틸 메탄설포네이트(EMS, McCas no Cas 내 1:50 희석)를 부가하고 다른 튜브에는, 0.3mL의 배지(대조군)를 부가했다. 튜브에 N2/CO2의 80/20 혼합물을 20 PSIG의 압력으로 가압하고 교반 없이 37℃에서 한 시간 동안 배양했다. 배양 한 시간 후에, 압력을 방출하고 각 튜브의 0.5mL를 꺼내고 아가 플레이트에 분주하여 사멸 속도를 확인했다.
나머지 배양물을 15분간 1000g로 원심분리하여 세척하고, 상청액을 제거하고 수확한 세포를 5mL 배지에 재현탁하여 세척했다. 이들 수확 및 세척 단계를 두 차례 이상 반복하여 EMS의 모든 잔여물을 제거했다. 마지막 세척 후에, 수확한 세포를 5mL 배지에 현탁시키고 회복을 위해 1mL를 5 mL의 배지를 담은 세 개의 Balch 튜브에 옮겼다. 각각의 튜브에 0.1mL 2.5% Na2S x 9H20를 부가하고 이후 각각의 튜브에 80:20 N2/CO2을 20 PSIG로 가압하고 37℃에서 최소한 48시간 동안 회복하도록 두었다. 다음 날, 각각의 배양액을 원심분리하여 1.0 mL까지 농축하고 1.25 mg/mL의 에티오닌 및 5g/L의 트리메틸아민을 함유한 적절한 배지의 아가 플레이트에 분주하거나 0.4 mg/mL 내지 1.6 mg/mL 범위의 에티오닌 농도로 액체 배지에 농축했다. 분주하기 전에 농축시킨 배양물에 있어서, 농축은 동일 농도의 에티오닌을 함유하는 아가 플레이트에 분주하기 전에 두 차례 수행했다. 플레이트를 37℃에서 10 PSIG의 80:20 N2/CO2 기체 혼합물과 함께 Oxoid 무산소 자에서 배양했다. 선별은 EMS 처리된 세포로 접종된 플레이트에서만 콜로니가 자라도록 이루어졌다. 모든 작업은 달리 지시되지 않은 한 무산소 조건 하에서 수행했다.
돌연변이유발된 메타노사르시나 아세티보란스 Trel42의 콜로니 세 개는 에티오닌에서 성장했고, 이들을 혈청 병(bottle) 발효에서 시험했다(실시예 1에 기술된 바와 같음). 결과는 하기 표 3에 요약되어 있다.
표 3. 혈청 튜브 내 돌연변이 메타노사르시나에 의한 아미노산 생산
균주 아미노산(mg/L)
글리신 트레오닌 라이신 메티오닌
Trel42 9 4 0 3
Trel42-er1.1 9 3 0 13
Trel42-er1.2 8 2 0 14
Trel42-er1.3 8 3 0 16
실시예 2
메타노코쿠스 마리팔루디스 및 메타노사르시나 아세티보란스 의 에티오닌-저항성 돌연변이
메타노코쿠스 마리팔루디스: Qiagen DNAeasy 혈액 & 조직 키트를 이용하고 그램 음성 박테리아에 대한 프로토콜에 따라, 메티오닌을 초과생산하는 M. 마리팔루디스 돌연변이, 뿐만 아니라 모 균주 S2(Trel10)로부터 유전체 DNA를 단리했다. MMP1359-MMP1358 오페론의 황 동화 ORF의 중합효소 사슬 반응(PCR) 증폭을 다음의 프라이머를 사용하여 수행했다:
1359seqF1 (5'-CTATAGAACTAACCCAATG-3'; 서열 번호:9)
1359seqR1 (5'-GGTGTTGCAGATACTAT-3'; 서열 번호:10)
1359SeqF3 (5'-AGACTTGAACCTTTA-3'; 서열 번호:11)
1359seqR3 (5'-CGCCAAAATCTTCCCTGC-3'; 서열 번호:12).
동일한 프라이머를 MMP1359-MMP1358 오페론의 순방향 및 역방향 서열분석 프라이머로서 사용하여 이들 ORF의 온전하고, 중첩되는 서열 범위를 얻었다.
돌연변이 서열과 모 균주 및 기존 공개된 서열의 Blast 비교는 메티오닌 생산체에서 MMP1359-MMP1358 오페론 내 두 개의 분명한 돌연변이를 나타냈다. Trel10-333UR-ΔdA-er1.1 및 Trel10-333UR-ΔdA-er3.1은 MMP1358 ORF의 뉴클레오티드 위치 341에서 G-A 전이를 가지며, 아미노산 서열 내에 G114E 치환 돌연변이를 야기했다. Trel10-333UR-ΔdA-er3.3은 ORF MMP1359의 위치 1315에서 G-A 전이를 가지며, 아미노산 서열 내에 D439N 치환 돌연변이를 야기했다. MMP1359 및 MMP1358 ORF에서 확인된 돌연변이는 이들 유전자가 메티오닌의 생합성과 연관되며 가능하게는 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌에 의한 피드백 저해를 받음을 시사한다.
메타노사르시나 아세티보란스: 모 균주 C2A(Trel42)를 비롯한 각각의 돌연변이로부터 유전체 DNA를 Epicentre Masture Pure DNA 정제 키트를 이용하여 단리하고 추정상의 호모시스테인 합성효소 유전자(Trel 42 내 ORF1821 (서열 번호:29; 서열 번호:30의 아미노산 서열) 및 1822 및 Trel 9 내 연관된 ORF)를 내포하는 부위를 PCR로 증폭했다. Trel 42 내 부위의 증폭 및 서열분석을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다:
C2A1821F (5'-GTATTGAATTGGCAAACT-3'; 서열 번호:22)
C2A1821R (5'-ACCGGCTCAGACCCGGTG-3'; 서열 번호:23)
C2A1821 SEQ1 (5'-GGAAAGAACTCGACGTGC-3'; 서열 번호:24)
C2A1821 SEQ2 (5'-ACTGACATTCTTGATTATG-3'; 서열 번호:25)
C2A1821 SEQ3 (5'-CTTGCAGCGCGCAGGCT-3'; 서열 번호:26)
G/C의 A/T로의 전이가 ORF 1821 (서열 번호31) 내의 뉴클레오티드 위치 1466의 Trel42mut3에서 발견되었다. 이러한 돌연변이는 ORF 1821 (서열 번호:32) 내의 위치 489에서 S의 N으로의 아미노산 변화를 야기한다.
실시예 3
수소영양 미생물의 LYSC 돌연변이
M. 마리팔루디스의 피드백 저항성 lysC(아스파르토키나아제) 돌연변이의 단리는 앞서 기술했다. 요약하면, 야생형 메타노코쿠스 마리팔루디스 Trel10를 카사미노산이 없는 25 mL McCas 배지(배지 레시피에 관해서는, Sarmiento 등, Methods Enzymol. 494:44, 2011을 참조하라; 이는 배지 McCV를 언급하며, 본 실시예에서는 카사미노산 또는 효모 추출물 없이 사용되었다)에서 37℃에서 대략 0.20의 OD600까지 성장시켰다. 5 mL의 배양물을 두 개의 무산소 Balch 튜브에 분배했다. 한 튜브에, 0.3 mL 에틸 메탄설포네이트(EMS, McCas no Cas 내 1:50 희석)를 부가하고 다른 튜브에는, 0.3mL의 McCas no cas를 부가했다(대조군). 튜브에 H2/CO2의 80/20 혼합물을 40 PSIG의 압력으로 가압하고 교반 없이 37℃에서 한 시간 동안 배양했다. 배양 한 시간 후에, 압력을 방출하고 각 튜브의 0.5mL를 꺼내고 McCas 아가 플레이트에 분주하여 사멸 속도를 확인했다.
나머지 배양물을 5(EMS 처리군) 또는 2(대조군), 1.5 무균 무산소 원심분리 튜브로 분배하고 15분간 1000g로 원심분리했다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1mL McCas no Cas에 재현탁하여 세척하고, 다시 15분간 1000g로 원심분리했다. 이러한 세척 단계를 2번 반복하여 EMS의 모든 잔여물을 제거했다. 마지막 세척 후에, 수확한 세포를 200 μL McCas no Cas에 현탁시키고 회복을 위해 5 mL의 McCas no Cas에 옮겼다. 1 mL 2.5% Na2S x 9H20를 각각의 튜브에 부가하고 각각의 튜브에 80/20 H2/CO2을 40 PSIG로 가압하고 밤새 37℃에서 회복하도록 두었다. 다음날 아침, 각각의 배양물을 원심분리하여 0.1 mL까지 농축하고 0.1M 트레오닌 및 0.02M AEC을 함유하는 McCas no Cas 플레이트에 분주했다. 플레이트를 37℃에서 10PSIG의 80/20 H2/CO2 기체 혼합물과 함께 Oxoid 무산소 자에서 배양했다. 선별은 EMS 처리된 세포로 접종된 플레이트에서만 콜로니가 자라도록 이루어졌다. 모든 작업은 달리 언급되지 않은 한 무산소 조건 하에서 수행했다.
G333R 돌연변이(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 LysC 아미노산 위치 G277에 해당)를 가지는 EMS 생성된 lysC 돌연변이 Trel10-Mut333의 성장 속도는 라이신 및 트레오닌의 존재에서 성장시켰을 때 영향받지 않았고(OD600는 37℃에서 72시간 동안 배양한 후에 측정했다; 데이터 나타내지 않음) - 달리 말하면, Trel10-Mut333의 변이된 아스파르토키나아제는 라이신 및 트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않는다. Trel10-Mut333 돌연변이에 의해 생산된 아스파르테이트 경로 아미노산을 HPLC로 확인했다(데이터 나타내지 않음). 유도체화제인 오르소-프탈알데히드(OPA)를 자동샘플러 상의 자동 유도체화 반응에서 사용했고 전치-컬럼을 수행했다. 반응 혼합물을 pH 10.2으로 완충하고(보레이트 완충액 이용), 이는 산 가수분해 단백질/펩티드 샘플의 직접 유도체화를 가능하게 했다. 관심의 아미노산을 먼저 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)을 이용하여 OPA와 함께 반응시켰다. 인돌 내로의 3-MPA의 통합은 이의 소수성을 감소시키고, 그 결과, OPA-유도체는 크로마토그래피로 용출된다. 모 균주와 비교할 때 Trel10-Mut333 돌연변이의 생산 프로파일은 다음과 같았다(및 확인된 모든 돌연변이에서 전반적으로 유사했다, 데이터 나타내지 않음): 알라닌(5 mg/L), 라이신(8 mg/L), 트레오닌(21 mg/L), 및 글리신(78 mg/L).
M. 마리팔루디스 lysC 내의 돌연변이를 Qiagen DNAeasy 혈액 & 조직 키트를 이용하고 그램 음성 박테리아에 대한 프로토콜에 따라 유전체 DNA를 추출하여 확인했다. LysC 표적을 Easy-A 고정확성 중합효소를 이용하여 순방향 프라이머(LysCfor1 - 5'GGGACGGCGCAACAAATGG3'; 서열 번호:13) 및 역방향 프라이머(LysCrev1 - 5'GGAGATAGTGAGACCCCTGGAGT3'; 서열 번호:14)로 증폭했다. 증폭된 DNA를 LysCfor1 또는 LysCrev1 중 어느 하나와 혼합하고 서열분석했다(Operon). 하나의 자발적인 돌연변이 및 8개의 화학적으로 유도된 돌연변이가 확인되었다. 코리네박테리움(이 경우에는, G277R)에서 이미 확인된 위치 G277의 돌연변이 외에도, 코리네박테리움에서 아직 확인되지 않은 신규한 돌연변이 위치를, S302P 및 G359E를 비롯하여 발견하였다(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 LysC로부터의 아미노산 위치에 따른 넘버링).
실시예 4
수소영양 미생물에서 우라실 포스포리보실전이효소 결실 및 REPA 삽입
플라스미드 형질전환 효율을 개선하기 위해, lysC 돌연변이 메타노코쿠스 마리팔루디스 Trel10-Mut333을 우라실 포스포리보실전이효소(upp) 유전자(위치 MMP0680)를 Trel10-333UR로 지칭되는 복제 단백질 A를 인코딩하는 유전자(repA, 그 자체의 프로모터와 함께)로 교체하여 유전체 수준으로 수정했다. repA는 repA를 가지는 임의의 플라스미드, 가령 repA-내포 pURB500 플라스미드로부터 유래되거나 이를 기초로 하는 플라스미드의 효율적인 형질전환을 가능하게 한다(Tumbula 등, J. Bacteriol. 179:2976, 1997을 참조하라). 우라실 포스포리복실전이효소 활성의 상실은 수정된 M. 마리팔루디스에게 6-아자우라실 저항성 표현형을 부여한다.
요약하면, repA 유전자를(이의 프로모터와 함께) 메타노코쿠스 마리팔루디스 S001 (Walters 등, App. Environ. Microbiol. 77:2549, 2011)의 유전체 DNA로부터 프라이머 TKH_038 (5'aaattatgaggcgcgcctccctgaagaagaagagag3'; 서열 번호:27) 및 TKH_039 (5'tgcttattcggcgcgccagttccattttaccacc3'; 서열 번호:28)를 이용하여 증폭했다. 증폭된 repA 단편을 In-fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 이용하여 AscI로 선형화시킨 pCR® 2.1-TOPO® TA 벡터 내로 클로닝했다. 최종 플라스미드는 pKH11라고 명명했다. pKH11로부터 XbaI-BamHI 단편을 제한효소 NheI 및 BglII로 선형화시킨 pMEV1 (Gardner WL (2000) Expression vectors for the methane-producing archaeon Methanococcus maripaludis. 논문, University of Georgia) 내로 클로닝했다. 퓨로마이신 저항성 유전자를 동반하고 생성된 자살 벡터는 pKH20라고 명명했다.
플라스미드 pKH20를 Sarmiento 등 (2011)에 의해 기술된 바와 같이 본질적으로 Trel10-Mut333로 형질전환시켰고, 형질전환체를 퓨로마이신(2.5 mg/L)을 함유하는 McCAS 플레이트상에서 선별했다. 퓨로마이신의 존재에서 성장한 형질전환 콜로니를 6-아자우라실(0.25 mg/ml)로 보충된 McCAS 액체 배지에 옮기고 밤새 성장시켰다. 밤새 배양한 배양물 일부를 0.5 mg/ml 6-아자우라실로 보충된 신선한 McCAS 배지에 옮기고 다시 밤새 성장시켰다. 배양물을 희석하고 이후 0.25 mg/ml 6-아자우라실을 함유하는 McCAS 플레이트 위에 펼쳤다. 5 일 후에, 개별적인 콜로니를 퓨로마이신이 있거나 없는 McCAS 플레이트 상에 이중복으로 분주했다. 퓨로마이신의 존재에서 성장에 실패한 콜로니를 저항성을 확인하기 위해 6-아자우라실(0.25 mg/ml)로 보충된 McCAS 액체 배지에 옮겼다. Trel10-Mut333 유전체 상의 upp 유전자가 repA 유전자로 교체된 것은 다음의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하였다: uptdelconfl (5'-caattactgaacccaaagaccat-3'; 서열 번호:14) 및 uptdelconf2 (5'-aatagttaccggcgttacaatca-3'; 서열 번호:15). upp 유전자가 repA 유전자로 교체된 것이 확인된 6-아자우라실 저항성/퓨로마이신 민감성 콜로니는 Trel10-333UR라고 명명했다.
실시예 5
수소영양 미생물에서 DAPA 결실
Trel10-333UR-ΔdA의 제작 - 증가된 메티오닌 생산을 위한 dapA 결실을 Sarmiento 등(2011)에 기술된 본질적으로 동일한 무표지 돌연변이유발 방법을 이용하여 생성했다. dapA 유전자를 내포하는 M. 마리팔루디스 S2 (Trel10) 유전체로부터 대략 2.4 kb 단편을 상류 및 하류 부위와 함께, 프라이머 DapAfor2 (5'-tccctgatcgatagaaagtgtagt-3'; 서열 번호:16) 및 DapArev2 (5'-ttgccgatgaaattaaagtgaaa-3'; 서열 번호:17)를 이용하여 PCR을 통해 합성하고 플라스미드 pTOPO 내로 클로닝하여 pJB012를 생성했다. dapA 유전자의 프레임-내 결실 단편을 둘다 5' AscI 부위를 내포하는 프라이머 DapAdelfor2 (5'-gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc-3'; 서열 번호:18) 및 DapAdelrev2 (5'-gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat-3'; 서열 번호:19)을 이용하는 외향 PCR을 이용하여 생성했다. PCR 산물을 정제하고, AscI로 절단하고 pTOPO 내로 결찰하여 pJB013를 생성했다. 마지막으로, upp::neo 유전자를 내포하는 단편을 pKH14로부터의 프라이머 uppneoF (5'-attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga-3'; 서열 번호:20) 및 uppneoR (5'-gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg-3'; 서열 번호:21)을 이용하여 PCR 증폭하고 pJB013의 KpnI 부위 내로 클로닝하여 pJB015를 생성했다.
pJB015를 Trel10-333UR로(앞서 기술한 바와 같이) 형질전환하고 아가 플레이트 상의 네오마이신 (500 ug mg/ml) 저항성 콜로니에 대해 선별했다. 염색체 dapA 유전자에서의 단일 교차 현상을 PCR로 확인했다. 단일 교차가 일어난 콜로니를 비-선별 배지에서 24시간동안 성장시켜 이중 교차가 일어나게 하고, 이후 100 mg/L 라이신 및 0.25ug/ml 6-아자우라실을 함유하는 McCAS 배지 위에 분주했다. 콜로니를 라이신이 있거나 없는 McCAS 플레이트에 붙였다. 성장을 위해 라이신을 필요로 하는 콜로니에 대해 dapA 결실의 PCR 확인을 수행했다. 그러한 콜로니 하나를 Trel10-333UR-ΔdA라고 지정했다.
실시예 6
메티오닌 생합성 유전자의 과발현
lysC, 탈조절된 lysC, asd, MMP1358 ORF, MMP1359 ORF, 탈조절된 MMP1358 ORF, 탈조절된 MMP1359 ORF 또는 메티오닌 합성효소를 비롯한메타노코쿠스 마리팔루디스 Trel10 메티오닌 생합성 경로의 어느 한 유전자는 자연적인 프로모터를 제거하고 이를 강한 구성적 프로모터로 대체함으로써 과발현될 수 있다. 한 경우에, 각각 메티오닌 합성효소(MetE)가 있고 없는 탈조절된 MMP1358 ORF 또는 탈조절된 MMP1359 ORF는 복제형 플라스미드 상에서 구성적 히스톤 유전자 hmv 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며 M. 마리팔루디스 Trel10에 도입되었다. 또다른 경우에 탈조절된 ORF1358 및 Orf 1359는 hmv 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며 Trel10-Mut333에 도입되었다. 혈청 병(실시예 1에 기술된 바와 같음) 및 발효조(실시예 9에 기술된 바와 같음)에서의 아미노산 생산을 측정했고 결과는 표 4 및 5에 요약된다.
표 4. 혈청 튜브에서 조작된 M. 마리팔루디스 에 의한 아미노산 생산
균주 아미노산(mg/L)
글리신 트레오닌 라이신 메티오닌
Trel10-er3.1+er3.3 6.6 20.7 0 107
Trel10-er3.1+er3.3+E 0 21 0 97
Trel10-Mut333+er3.1+er3.3 154 44 10 66
표 5. 발효조에서 조작된 M. 마리팔루디스 에 의한 아미노산 생산
균주 아미노산(mg/L)
글리신 트레오닌 라이신 메티오닌
Trel10-er3.1 +er3.3 +E 62 97 5 312
탈조절된 MMP1358 및 MMP1359 ORF를 구성적으로 발현하는 메타노코쿠스 마리팔루디스 Trel10(Trel10-er3.1+er3.3)은 상당한 양의 메티오닌을 생산했다(107 mg/L, 표 4). 탈조절된 LysC의 부가 (Trel10-Mut333+er3.1+er3.3)는 메티오닌 생산을 개선하지 않았지만, 대신 더 많은 글리신, 트레오닌 및 라이신을 생산했다. 이들 데이터는 메티오닌의 초과생산이 라이신 및 트레오닌 수준의 하강을 야기하므로 야생형 Trel10이 자연적으로 '탈조절'될 수 있음 및, 그러므로, 이들 아미노산이 LysC의 피드백 저해를 촉발할 정도로 높은 충분한 양으로 존재하지 않음을 시사한다. 게다가, 이들 데이터는 탈조절된 MMP1358 및 MMP1359 ORF의 과발현이 메티오닌의 매우 특이적인 초과생산을 야기함을 시사한다.
실시예 7
수소영양 미생물로부터의 메티오닌 배출
코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 후보 brnFE 또는 metT 메티오닌 배출인자 유전자를 단리하고 기능성을 검사했다. 추가의 돌연변이가 임의로 도입되어 기능을 증가시키거나, 배출 유전자가 더 강한 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 과발현되거나, 또는 기능적 외인성 brnFE 또는 metT 유전자가 M. 마리팔루디스 내로 도입된다. 초과생산된 메티오닌은 배양 배지로부터 쉽게 회수 및/또는 단리될 수 있다.
실시예 8
수소영양 미생물에서 메티오닌 생산으로의 탄소 유동 변형
수소영양 미생물(예컨대, M. 마리팔루디스)의 주요 탄소 유동은 메티오닌 생합성으로 더 많은 탄소를 제공하기 위해 다양한 방식으로 전환될 수 있다. 예를 들면, 피루베이트로부터 포스포에놀피루베이트(PEP)로의 탄소 유동 제한은 PEP 합성효소 유전자를 비활성화 또는 하향조절하여 달성된다. 또한, 이소류신 경로(존재하는 경우)는 임의로 녹아웃되며, 이는 이러한 경로에 의해 사용되는 피루베이트 및 아세틸 CoA를 보존한다. 특정 효소 활성의 비활성화 또는 감소는 유전자 조작(예컨대, 유전자 또는 유전자 부분 결실)에 의해 또는 돌연변이에 의한 비활성화에 대한 선별(예컨대, 자발적인 또는 유도된)에 의해 도입될 수 있다. 대안적으로, 피루베이트 카르복실화효소 유전자는 임의로 과발현되어 더 많은 탄소를 피루베이트로부터 옥살로아세테이트(OAA)에 보낸다. 또한, 아스파르테이트 아미노전이효소 유전자는 임의로 과발현되어 더 많은 OAA를 아스파르테이트로 전환한다. 과발현은 예를 들면, 유전자의 다중 복제를 제공함으로써 또는 더 강한 발현을 제공하도록 프로모터 부위를 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
실시예 9
생물반응기에서 비-자연적인 및 재조합 수소영양 미생물의 배양
M. 마리팔루디스는 기포탑 생물반응기에서 무산소 조건 하에 약 72시간 내지 120 시간 동안 배양물이 정체기 조건에 도달할 때까지 배양되며, 이는 일련의 증가하는 부피의 연속 용기에서 이루어질 수 있고(예컨대, 50ml으로 출발하고, 이 배양물을 10L에 접종하기 위해 사용하고, 이후 이 배양물을 300L 또는 그 이상에 접종하기 위해 사용함) 따라서 매우 큰 부피의 밀집된 배양물에 도달한다. 이러한 시간 동안, 시스템은 공급 회분 방식으로 가동될 것이며, 여기서 합성가스는 발효 브로스에 연속적으로 공급된다. 브로스 자체는 교환되지 않을 것이다. 일단 적절한 OD600에 도달하면(분광광도계로 측정시), 이후 연속 배양 과정이 개시될 것이며, 여기서 배지/브로스의 교환이 시작된다. 교환 속도는 발효조 내 배양물의 OD600를 고려하여 결정될 것이다. 예를 들면, 하루에 전체 부피의 약 1.5 내지 약 3.0의 브로스가 교환된다.
배양물은 약 37℃의 온도로 유지되지만, 약 35℃ 내지 약 40℃ 사이에서 요동할 수 있고, 약 7.0-7.2의 pH로 유지되고(pH는 필요시 HCl 및/또는 NaOH로 조정됨), 약 1.5 내지 약 2.0의 OD600로 유지된다. 합성가스는 약 4:1 내지 약 3:1 범위의 비율의 H2:CO2로 이루어지고, 이는 약 0% 내지 약 5% 범위(가장 좋게는 최대 1%)의 일산화탄소를 포함할 수 있고, 다른 미미한 오염물질을 포함할 수 있다. 합성가스 유속은 공정에 사용된 기포 또는 삼상층 컬럼의 구체적인 설계에 의해 좌우된다.
상기 기술된 다양한 구체예는 조합되어 추가적인 구체예를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되거나 출원 데이터 시트에 나열된 모든 특허 및 비-특허 간행물은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다. 구체예의 양태들은, 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하기 위해 수정되어 추가적인 구체예를 제공할 수 있다.
구체예에 대한 이들 및 다른 변화가 상기 상세한 설명에 비추어 만들어질 수 있다. 일반적으로, 이하의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정한 구체예에 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 대신 이러한 청구범위가 권리를 주장하는 전 범위의 등가물과 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 청구 범위는 본 개시에 의해 제한되지 않는다.
2015년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 특허 일련 번호 제62/157,797호를 비롯한 본 명세서에서 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허 공보, 미국 출원, 해외 특허, 해외 출원 및 비-특허 간행물은 본 명세서와 모순되지 않는 한 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Trelys, Inc. Bradshaw, Jill <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF METHIONINE <130> 910215.407WO <140> PCT <141> 2016-05-06 <150> US 62/157,797 <151> 2015-05-06 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1542 <212> DNA <213> Archaea sp. <400> 1 ttgaaaaccg ttcacgaaat taacgagaag atacgaaatg gcgatgcagt tgtagtcact 60 gcagaagaga tgatcgatat agtcgacgaa ctgggtgcag aaaaagcggc agttgaaata 120 gatgtagtta cgacaggtac atttggagca atgtgttcaa gcggagcatt tttaaatttt 180 ggacactctg atccgccaat aaaaatgtgt aaaacatatt tgaatggtgt ggaagcatat 240 tcaggaattg cagcagttga tgcttattta ggggctactc aaacgaatag tgatgatgat 300 attgatatat catatggggg ttcccacgtt cttgaagatc ttgtagctgg aaaagaaatt 360 gaacttgtag cggaaggata cactactgac tgctacccta gaaaaaaagt agaaacaacg 420 ataacaattg atgatttaaa tcaagcaatc ttagtaaatc caagaaactg ctaccaatct 480 tacaatggtg ctacgaacag tactgaagaa aaaatataca cttacatggg tgcacttctc 540 ccagaatttg gaaatttaaa ttattccggt gcaggtcaat taaatccact gcaaaacgat 600 ttcaataaag aaacaaaaac 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aaggttcttg gggtggtttc agctgaagat 1500 atctcaaaac ttatcgggag aaatggactt cataaaattt aa 1542 <210> 2 <211> 1542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaea mutant sequence <400> 2 ttgaaaaccg ttcacgaaat taacgagaag atacgaaatg gcgatgcagt tgtagtcact 60 gcagaagaga tgatcgatat agtcgacgaa ctgggtgcag aaaaagcggc agttgaaata 120 gatgtagtta cgacaggtac atttggagca atgtgttcaa gcggagcatt tttaaatttt 180 ggacactctg atccgccaat aaaaatgtgt aaaacatatt tgaatggtgt ggaagcatat 240 tcaggaattg cagcagttga tgcttattta ggggctactc aaacgaatag tgatgatgat 300 attgatatat catatggggg ttcccacgtt cttgaagatc ttgtagctgg aaaagaaatt 360 gaacttgtag cggaaggata cactactgac tgctacccta gaaaaaaagt agaaacaacg 420 ataacaattg atgatttaaa tcaagcaatc ttagtaaatc caagaaactg ctaccaatct 480 tacaatggtg ctacgaacag tactgaagaa aaaatataca cttacatggg tgcacttctc 540 ccagaatttg gaaatttaaa ttattccggt gcaggtcaat taaatccact gcaaaacgat 600 ttcaataaag aaacaaaaac ttataacacc ttaggaatgg gtacaagaat cttcttaggc 660 ggtgcacaag gttatattgc aggttcagga 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Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer sequence <400> 13 gggacggcgc aacaaatgg 19 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer sequence <400> 14 ggagatagtg agacccctgg agt 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 aatagttacc ggcgttacaa tca 23 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 tccctgatcg atagaaagtg tagt 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 ttgccgatga aattaaagtg aaa 23 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 gcgggcgcgc cgcataatta caccttatgc gttc 34 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 gcgggcgcgc ctaatcacgg ttcgtgatac tat 33 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 attacgccaa gcttggtacc actctcttct tcttcaggga 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 gtggatccga gctcggtacc tgagatcccc gcgctggagg 40 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 gtattgaatt ggcaaact 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 accggctcag acccggtg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 ggaaagaact cgacgtgc 18 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 actgacattc ttgattatg 19 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 cttgcagcgc gcaggct 17 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 aaattatgag gcgcgcctcc ctgaagaaga agagag 36 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 tgcttattcg gcgcgccagt tccattttac cacc 34 <210> 29 <211> 1503 <212> DNA <213> Archaea sp. <400> 29 atggttgaaa aatcggttca tgagatcaat aaaaaaattg aagatggaag cgtcaatgta 60 gtcacagccg aggaaatggt cggaattgtt gaaaaccttg gcgtggaagg tgctgcaaga 120 gaagttgatg tggtcactac aggcacgttc ggagccatgt gctcttcagg tttgatgctt 180 aatctcggac attccgaacc cccgatcaag atccagaaac tctggtttaa caacgtggag 240 gcatacagcg ggcttgctgc tgtggatgct tatctggggg ctgcccagat atcggataca 300 agaggaatac agtatggtgg agcgcacgtt attgaagacc tgctgagagg gaaagaactc 360 gacgtgcatg caacttccta tgggacagac tgctatccca ggaaagtgct tgatacgaga 420 attaccctcg atgacttaaa cgaggcagtc cttctcaacc ccagaaacgc ttaccagaaa 480 tatgccgctg caacaaacag ttcaaaaagg attctgaaca cctatatggg agagcttcta 540 cccaatttcg gaaacgtaac ttattccggg gcaggagtgc tttctcccct ttcaaatgat 600 cctgactacg aaactatcgg gatgggcaca aggattttca tgggaggagc ccagggctat 660 attataggca atgggaccca gcattctccc tcaagcagtt ttgggaccct tatgcttaaa 720 ggaaacctga aagaaatgag ctccgattat ttaagggctg cttcttttgc aggctacgga 780 acaactcttt acatgggaat cggaatcccc atacccattc tgaatgaaaa aatcgcagcc 840 tcaactgcgg tgcgtgatga agacattttt actgacattc ttgattatgc cgtgggcagc 900 agggataagc ctgtgataaa gcaggtaaac tatgccgagc tcaggtcagg ctcgatagag 960 cttgaaggga agaacacacc gacctcatcc ctctcaagtt tcaagaacgc cagaaagatt 1020 gcaaatgagc taaaggaatg ggttaagcac ggaaaattct ttgtcagcat gcccgtagaa 1080 aagctttccc gcgagggctc ggcaaagtcc atgaaacaga ctcaggcagt cccactcgta 1140 aaagacgtca tggcagactt tattgttacg atcaaaaaga accagacggt tcaggacgct 1200 gcaaagaaga tctgggaaaa ctcttttaac caccttgctg tggtttcgga tacaggggaa 1260 ctggtaggaa tcctgacggc ctgggatatc tcaaaagccg ttgccgaaaa tatatttgat 1320 tccgtagaaa gtgtcatgac gaaaaaagtc cttacctgcg ccccgaacga acccgtggac 1380 cttgcagcgc gcaggcttga ccgctatggc gtttcggcaa tgcctgtaat cgatacacag 1440 agaaaagtac tcggaataat tacgagcgac aatataagca agcttctcgc aaggaggtac 1500 tga 1503 <210> 30 <211> 500 <212> PRT <213> Archaea sp. <400> 30 Met Val Glu Lys Ser Val His Glu Ile Asn Lys Lys Ile Glu Asp Gly 1 5 10 15 Ser Val Asn Val Val Thr Ala Glu Glu Met Val Gly Ile Val Glu Asn 20 25 30 Leu Gly Val Glu Gly Ala Ala Arg Glu Val Asp Val Val Thr Thr Gly 35 40 45 Thr Phe Gly Ala Met Cys Ser Ser Gly Leu Met Leu Asn Leu Gly His 50 55 60 Ser Glu Pro Pro Ile Lys Ile Gln Lys Leu Trp Phe Asn Asn Val Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Ser Gly Leu Ala Ala Val Asp Ala Tyr Leu Gly Ala Ala Gln 85 90 95 Ile Ser Asp Thr Arg Gly Ile Gln Tyr Gly Gly Ala His Val Ile Glu 100 105 110 Asp Leu Leu Arg Gly Lys Glu Leu Asp Val His Ala Thr Ser Tyr Gly 115 120 125 Thr Asp Cys Tyr Pro Arg Lys Val Leu Asp Thr Arg Ile Thr Leu Asp 130 135 140 Asp Leu Asn Glu Ala Val Leu Leu Asn Pro Arg Asn Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Tyr Ala Ala Ala Thr Asn Ser Ser Lys Arg Ile Leu Asn Thr Tyr Met 165 170 175 Gly Glu Leu Leu Pro Asn Phe Gly Asn Val Thr Tyr Ser Gly Ala Gly 180 185 190 Val Leu Ser Pro Leu Ser Asn Asp Pro Asp Tyr Glu Thr Ile Gly Met 195 200 205 Gly Thr Arg Ile Phe Met Gly Gly Ala Gln Gly Tyr Ile Ile Gly Asn 210 215 220 Gly Thr Gln His Ser Pro Ser Ser Ser Phe Gly Thr Leu Met Leu Lys 225 230 235 240 Gly Asn Leu Lys Glu Met Ser Ser Asp Tyr Leu Arg Ala Ala Ser Phe 245 250 255 Ala Gly Tyr Gly Thr Thr Leu Tyr Met Gly Ile Gly Ile Pro Ile Pro 260 265 270 Ile Leu Asn Glu Lys Ile Ala Ala Ser Thr Ala Val Arg Asp Glu Asp 275 280 285 Ile Phe Thr Asp Ile Leu Asp Tyr Ala Val Gly Ser Arg Asp Lys Pro 290 295 300 Val Ile Lys Gln Val Asn Tyr Ala Glu Leu Arg Ser Gly Ser Ile Glu 305 310 315 320 Leu Glu Gly Lys Asn Thr Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Phe Lys Asn 325 330 335 Ala Arg Lys Ile Ala Asn Glu Leu Lys Glu Trp Val Lys His Gly Lys 340 345 350 Phe Phe Val Ser Met Pro Val Glu Lys Leu Ser Arg Glu Gly Ser Ala 355 360 365 Lys Ser Met Lys Gln Thr Gln Ala Val Pro Leu Val Lys Asp Val Met 370 375 380 Ala Asp Phe Ile Val Thr Ile Lys Lys Asn Gln Thr Val Gln Asp Ala 385 390 395 400 Ala Lys Lys Ile Trp Glu Asn Ser Phe Asn His Leu Ala Val Val Ser 405 410 415 Asp Thr Gly Glu Leu Val Gly Ile Leu Thr Ala Trp Asp Ile Ser Lys 420 425 430 Ala Val Ala Glu Asn Ile Phe Asp Ser Val Glu Ser Val Met Thr Lys 435 440 445 Lys Val Leu Thr Cys Ala Pro Asn Glu Pro Val Asp Leu Ala Ala Arg 450 455 460 Arg Leu Asp Arg Tyr Gly Val Ser Ala Met Pro Val Ile Asp Thr Gln 465 470 475 480 Arg Lys Val Leu Gly Ile Ile Thr Ser Asp Asn Ile Ser Lys Leu Leu 485 490 495 Ala Arg Arg Tyr 500 <210> 31 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaea mutant sequence <400> 31 atggttgaaa aatcggttca tgagatcaat aaaaaaattg aagatggaag cgtcaatgta 60 gtcacagccg aggaaatggt cggaattgtt gaaaaccttg gcgtggaagg tgctgcaaga 120 gaagttgatg tggtcactac aggcacgttc ggagccatgt gctcttcagg tttgatgctt 180 aatctcggac attccgaacc cccgatcaag atccagaaac tctggtttaa caacgtggag 240 gcatacagcg ggcttgctgc tgtggatgct tatctggggg ctgcccagat atcggataca 300 agaggaatac agtatggtgg agcgcacgtt attgaagacc tgctgagagg gaaagaactc 360 gacgtgcatg caacttccta tgggacagac tgctatccca ggaaagtgct tgatacgaga 420 attaccctcg atgacttaaa cgaggcagtc cttctcaacc ccagaaacgc ttaccagaaa 480 tatgccgctg caacaaacag ttcaaaaagg attctgaaca cctatatggg agagcttcta 540 cccaatttcg gaaacgtaac ttattccggg gcaggagtgc tttctcccct ttcaaatgat 600 cctgactacg aaactatcgg gatgggcaca aggattttca tgggaggagc ccagggctat 660 attataggca atgggaccca gcattctccc tcaagcagtt ttgggaccct tatgcttaaa 720 ggaaacctga aagaaatgag ctccgattat ttaagggctg cttcttttgc aggctacgga 780 acaactcttt acatgggaat cggaatcccc atacccattc tgaatgaaaa aatcgcagcc 840 tcaactgcgg tgcgtgatga agacattttt actgacattc ttgattatgc cgtgggcagc 900 agggataagc ctgtgataaa gcaggtaaac tatgccgagc tcaggtcagg ctcgatagag 960 cttgaaggga agaacacacc gacctcatcc ctctcaagtt tcaagaacgc cagaaagatt 1020 gcaaatgagc taaaggaatg ggttaagcac ggaaaattct ttgtcagcat gcccgtagaa 1080 aagctttccc gcgagggctc ggcaaagtcc atgaaacaga ctcaggcagt cccactcgta 1140 aaagacgtca tggcagactt tattgttacg atcaaaaaga accagacggt tcaggacgct 1200 gcaaagaaga tctgggaaaa ctcttttaac caccttgctg tggtttcgga tacaggggaa 1260 ctggtaggaa tcctgacggc ctgggatatc tcaaaagccg ttgccgaaaa tatatttgat 1320 tccgtagaaa gtgtcatgac gaaaaaagtc cttacctgcg ccccgaacga acccgtggac 1380 cttgcagcgc gcaggcttga ccgctatggc gtttcggcaa tgcctgtaat cgatacacag 1440 agaaaagtac tcggaataat tacgaacgac aatataagca agcttctcgc aaggaggtac 1500 tga 1503 <210> 32 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaea mutant sequence <400> 32 Met Val Glu Lys Ser Val His Glu Ile Asn Lys Lys Ile Glu Asp Gly 1 5 10 15 Ser Val Asn Val Val Thr Ala Glu Glu Met Val Gly Ile Val Glu Asn 20 25 30 Leu Gly Val Glu Gly Ala Ala Arg Glu Val Asp Val Val Thr Thr Gly 35 40 45 Thr Phe Gly Ala Met Cys Ser Ser Gly Leu Met Leu Asn Leu Gly His 50 55 60 Ser Glu Pro Pro Ile Lys Ile Gln Lys Leu Trp Phe Asn Asn Val Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Ser Gly Leu Ala Ala Val Asp Ala Tyr Leu Gly Ala Ala Gln 85 90 95 Ile Ser Asp Thr Arg Gly Ile Gln Tyr Gly Gly Ala His Val Ile Glu 100 105 110 Asp Leu Leu Arg Gly Lys Glu Leu Asp Val His Ala Thr Ser Tyr Gly 115 120 125 Thr Asp Cys Tyr Pro Arg Lys Val Leu Asp Thr Arg Ile Thr Leu Asp 130 135 140 Asp Leu Asn Glu Ala Val Leu Leu Asn Pro Arg Asn Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Tyr Ala Ala Ala Thr Asn Ser Ser Lys Arg Ile Leu Asn Thr Tyr Met 165 170 175 Gly Glu Leu Leu Pro Asn Phe Gly Asn Val Thr Tyr Ser Gly Ala Gly 180 185 190 Val Leu Ser Pro Leu Ser Asn Asp Pro Asp Tyr Glu Thr Ile Gly Met 195 200 205 Gly Thr Arg Ile Phe Met Gly Gly Ala Gln Gly Tyr Ile Ile Gly Asn 210 215 220 Gly Thr Gln His Ser Pro Ser Ser Ser Phe Gly Thr Leu Met Leu Lys 225 230 235 240 Gly Asn Leu Lys Glu Met Ser Ser Asp Tyr Leu Arg Ala Ala Ser Phe 245 250 255 Ala Gly Tyr Gly Thr Thr Leu Tyr Met Gly Ile Gly Ile Pro Ile Pro 260 265 270 Ile Leu Asn Glu Lys Ile Ala Ala Ser Thr Ala Val Arg Asp Glu Asp 275 280 285 Ile Phe Thr Asp Ile Leu Asp Tyr Ala Val Gly Ser Arg Asp Lys Pro 290 295 300 Val Ile Lys Gln Val Asn Tyr Ala Glu Leu Arg Ser Gly Ser Ile Glu 305 310 315 320 Leu Glu Gly Lys Asn Thr Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Phe Lys Asn 325 330 335 Ala Arg Lys Ile Ala Asn Glu Leu Lys Glu Trp Val Lys His Gly Lys 340 345 350 Phe Phe Val Ser Met Pro Val Glu Lys Leu Ser Arg Glu Gly Ser Ala 355 360 365 Lys Ser Met Lys Gln Thr Gln Ala Val Pro Leu Val Lys Asp Val Met 370 375 380 Ala Asp Phe Ile Val Thr Ile Lys Lys Asn Gln Thr Val Gln Asp Ala 385 390 395 400 Ala Lys Lys Ile Trp Glu Asn Ser Phe Asn His Leu Ala Val Val Ser 405 410 415 Asp Thr Gly Glu Leu Val Gly Ile Leu Thr Ala Trp Asp Ile Ser Lys 420 425 430 Ala Val Ala Glu Asn Ile Phe Asp Ser Val Glu Ser Val Met Thr Lys 435 440 445 Lys Val Leu Thr Cys Ala Pro Asn Glu Pro Val Asp Leu Ala Ala Arg 450 455 460 Arg Leu Asp Arg Tyr Gly Val Ser Ala Met Pro Val Ile Asp Thr Gln 465 470 475 480 Arg Lys Val Leu Gly Ile Ile Thr Asn Asp Asn Ile Ser Lys Leu Leu 485 490 495 Ala Arg Arg Tyr 500

Claims (109)

  1. 비-자연적인 조작된 수소영양 미생물, 여기서 조작된 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하고 여기서 조작된 수소영양 미생물은 다음을 포함하는 유전적으로 조작된 내인성 폴리펩티드를 발현하는 비-자연적인 수소영양 미생물:
    (a) 서열 번호:4 및 8 중 적어도 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 유전적으로 조작된 폴리펩티드;
    (b) 서열 번호:4 및 8 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 유전적으로 조작된 폴리펩티드, 여기서 조작된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨;
    (c) 서열 번호:2 및 6 중 적어도 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 유전적으로 조작된 폴리펩티드, 여기서 조작된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨; 또는
    (d) 서열 번호:2 및 6의 전장 보체에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 유전적으로 조작된 폴리펩티드, 여기서 조작된 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨.
  2. 제1항에 있어서, 조작된 폴리펩티드가 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis) S2 DSM14266의 MMP1359의 상동체 또는 이종상동체인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상동체 또는 이종상동체는 잔기 D439에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1359의 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 돌연변이는 D439N 치환이고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1359의 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 폴리펩티드가 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266의 MMP1358의 상동체 또는 이종상동체인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상동체 또는 이종상동체는 잔기 G114에서의 돌연변이를 포함하고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1358의 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 돌연변이는 G114E 치환이고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1358의 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 탈조절된 아스파르토키나아제 활성, 메티오닌 합성효소, 또는 둘다를 더욱 포함하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 내인성 아스파르토키나아제, 외인성 아스파르토키나아제, 또는 둘다인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 또는 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성인 아스파르토키나아제 돌연변이인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  11. 제8항 내지 제10항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 각각 포함하는 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이들의 조합에 의해 인코딩되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, I375, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 라이신 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 내인성 아스파르토키나아제 활성이 라이신 및 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 인코딩되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  19. 제18항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위의 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 더욱 포함하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  21. 제20항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-트랜스석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  22. 제20항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다를 인코딩하거나, 외인성 핵산 분자가 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다를 인코딩하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  23. 제22항에 있어서, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다가 과발현되거나, 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다가 과발현되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다가 탈조절되거나, 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다가 탈조절되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 메티오닌 합성효소를 인코딩하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  26. 제25항에 있어서, 메티오닌 합성효소가 메티오닌 합성효소를 인코딩하는 외인성 핵산 분자가 결여된 모 수소영양 미생물에 비해 과발현되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성을 가지는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성을 가지는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, 호모세린 키나아제, 트레오닌 탈수효소, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 전이효소, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성의 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 돌연변이, 호모세린 키나아제 돌연변이, 트레오닌 탈수효소 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 전이효소 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  30. 제9항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비-자연적인 수소영양 미생물의 유전체에 통합된, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  31. 제9항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비-자연적인 수소영양 미생물 내의 자가-복제 벡터 내에 있는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 글리신 영양요구체, 또는 이들의 임의의 조합인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  33. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘다를 가지는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  34. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 5-메틸테트라하이드로폴레이트 코리노이드/철 황 단백질 메틸전이효소 활성, 증가된 피루베이트 합성효소, 증가된 아세틸-CoA 합성효소, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가지는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  35. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, COX 기질이 H2, CO, 및 CO2로 이루어진 H2/COX기질인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  36. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, COX 기질이 합성가스 또는 수성-가스 전환된 합성가스로 이루어진 H2/COX기질인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, CO2 대 H2의 비율이 각각 약 1:50 내지 약 10:1 범위인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, CO2 대 H2의 비율이 각각 약 1:2 내지 약 1:4 범위인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, CO의 총량이 약 1%를 넘지 않는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 수소영양 미생물이 메탄 생성 고세균인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  41. 제40항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 메타노칼큘루스(Methanocalculus), 메타노칼도코쿠스(Methanocaldococcus), 메타노셀라(Methanocella), 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노코코이데스(Methanococcoides), 메타노코르푸스쿨룸(Methanocorpusculum), 메타노쿨레우스(Methanoculleus), 메타노폴리스(Methanofollis), 메타노제니움(Methanogenium), 메타노할로븀(Methanohalobium), 메타노할로필루스(Methanohalophilus), 메타노라시니아(Methanolacinia), 메타놀로부스(Methanolobus), 메타노메틸로보란스(Methanomethylovorans), 메타노마이크로븀(Methanomicrobium), 메타노마이크로코쿠스(Methanomicrococcus), 메타노플라누스(Methanoplanus), 메타노피루스(Methanopyrus), 메타노레귤라(Methanoregula), 메타노사에타(Methanosaeta), 메타노살숨(Methanosalsum), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노스파에라(Methanosphaera), 메타노스피릴륨(Methanospirillium), 메타노써모박터(Methanothermobacter), 메타노써모코쿠스(Methanothermococcus), 메타노테르무스(Methanothermus), 또는 메타노토리스(Methanotorris)로부터 선택되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  42. 제40항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 메타노박테리움 알칼리필룸(Methanobacterium alcaliphilum), 메타노박테리움 브리얀티(Methanobacterium bryantii), 메타노박테리움 콘골렌세(Methanobacterium congolense), 메타노박테리움 데플루비(Methanobacterium defluvii), 메타노박테리움 에스파놀래(Methanobacterium espanolae), 메타노박테리움 포르미시쿰(Methanobacterium formicicum), 메타노박테리움 이바노비(Methanobacterium ivanovii), 메타노박테리움 팔루스트레(Methanobacterium palustre), 메타노박테리움 써마그레간스(Methanobacterium thermaggregans), 메타노박테리움 울리기노숨(Methanobacterium uliginosum), 메타노브레비박터 아시디두란스(Methanobrevibacter acididurans), 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스(Methanobrevibacter arboriphilicus), 메타노브레비박터 고트샬키(Methanobrevibacter gottschalkii), 메타노브레비박터 올레야에(Methanobrevibacter olleyae), 메타노브레비박터 루미난튬(Methanobrevibacter ruminantium), 메타노브레비박터 스미티(Methanobrevibacter smithii), 메타노브레비박터 워에세이(Methanobrevibacter woesei), 메타노브레비박터 월리니(Methanobrevibacter wolinii), 메타노셀라 아르보리재(Methanocella arvoryzae), 메타노셀라 콘라디이, 메타노셀라 팔루디콜라(Methanocella paludicola), 메타노써모박터 마르부르겐시스(Methanothermobacter marburgensis), 메타노써모박터 써마우토트로피쿰(Methanothermobacter thermautotrophicum), 메타노써모박터 써모플렉수스(Methanothermobacter thermoflexus), 메타노써모박터 써모필루스(Methanothermobacter thermophilus), 메타노써모박터 월페이(Methanothermobacter wolfeii), 메타노테르무스 소시아빌리스(Methanothermus sociabilis), 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰(Methanocorpusculum bavaricum), 메타노코르푸스쿨룸 파르붐(Methanocorpusculum parvum), 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스(Methanoculleus chikuoensis), 메타노쿨레우스 서브마리누스(Methanoculleus submarinus), 메타노제니움 프리기둠(Methanogenium frigidum), 메타노제니움 리미나탄스(Methanogenium liminatans), 메타노제니움 마리눔(Methanogenium marinum), 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라(Methanomicrococcus blatticola), 메타노플라누스 엔도심바이오수스(Methanoplanus endosymbiosus), 메타노플라누스 리미콜라(Methanoplanus limicola), 메타노플라누스 페트롤레아리우스(Methanoplanus petrolearius), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노레귤라 부네이(Methanoregula boonei), 메타노사에타 콘실리(Methanosaeta concilii), 메타노사에타 하룬디나세아(Methanosaeta harundinacea), 메타노사에타 펠라지카(Methanosaeta pelagica), 메타노사에타 써모필라(Methanosaeta thermophila), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila), 메타노마이크로븀 모빌레(Methanomicrobium mobile), 메타노코쿠스 아에올리쿠스(Methanococcus aeolicus), 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노코쿠스 반니엘리(Methanococcus vannielii), 메타노코쿠스 볼테(Methanococcus voltae), 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스(Methanothermococcus thermolithotrophicus), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스(Methanothermobacter thermoautotroiphicus), 메타노칼도코쿠스 페르벤스(Methanocaldococcus fervens), 메타노칼도코쿠스 인디쿠스(Methanocaldococcus indicus), 메타노칼도코쿠스 인페르누스(Methanocaldococcus infernus), 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이(Methanocaldococcus jannaschii), 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스(Methanocaldococcus vulcanius)로 이루어진 군에서 선택되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 시토크롬을 생산하지 않는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  44. 제43항에 있어서, 시토크롬을 생산하지 않는 메탄 생성 고세균이 메타노코쿠스 마리팔루디스 또는 메타노코쿠스 반니엘리인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  45. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 시토크롬을 생산하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  46. 제45항에 있어서, 시토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균은 메타노사르시나 바르케리 또는 메타노사르시나 마제이인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  47. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 메티오닌의 배출인자(exporter)를 발현하거나 과발현하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  48. 전술된 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연적인 수소영양 미생물이 메티오닌의 배출인자를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 더욱 포함하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 배출인자가 brnFE 또는 metT 유전자인, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  50. 재조합 수소영양 미생물, 여기서 재조합 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서 대사하여 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하고 여기서 재조합 수소영양 미생물은 다음을 포함하는 외인성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 수소영양 미생물:
    (a) 서열 번호:3, 4, 7, 또는 8 중 적어도 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;
    (b) 서열 번호:3, 4, 7, 또는 8 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 임의로 탈조절됨;
    (c) 서열 번호:1, 2, 5, 또는 6 중 적어도 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 임의로 탈조절됨; 또는
    (d) 서열 번호:1, 2, 5, 또는 6의 전장 보체에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 임의로 탈조절됨.
  51. 제50항에 있어서, 폴리펩티드가 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1359의 상동체 또는 이종상동체인, 재조합 수소영양 미생물.
  52. 제51항에 있어서, 상동체 또는 이종상동체는 잔기 D439에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1359의 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 돌연변이는 D439N 치환이고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266의 MMP1359에 의해 인코딩된 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  54. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266로부터의 MMP1358의 이종상동체인 유전자에 돌연변이를 포함하는, 재조합 수소영양 미생물.
  55. 제54항에 있어서, 돌연변이는 잔기 G114에 있고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266의 MMP1358에 의해 인코딩된 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 돌연변이는 G114E 치환이고 잔기 넘버링은 메타노코쿠스 마리팔루디스 S2 DSM14266의 MMP1358에 의해 인코딩된 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 다음을 포함하는 조작된 탈조절된 내인성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 수소영양 미생물:
    (a) 서열 번호:4 및 8 중 적어도 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;
    (b) 서열 번호:4 및 8 중 적어도 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨;
    (c) 서열 번호:2 및 6 중 적어도 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨; 또는
    (d) 서열 번호:2 및 6의 보체에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 피드백 저해인자에 대해 탈조절됨.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 탈조절된 아스파르토키나아제 활성, 메티오닌 합성효소, 또는 둘다를 더욱 포함하는, 재조합 수소영양 미생물.
  59. 제58항에 있어서, 미생물이 탈조절된 내인성 아스파르토키나아제 활성, 탈조절된 외인성 아스파르토키나아제 활성, 또는 둘다를 발현하는, 재조합 수소영양 미생물.
  60. 제59항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 활성이 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성인 아스파르토키나아제 돌연변이인, 재조합 수소영양 미생물.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 탈조절된 아스파르토키나아제 돌연변이를 인코딩하는, 재조합 수소영양 미생물.
  62. 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 아스파르토키나아제 돌연변이가 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 저해에 저항성인 재조합 수소영양 미생물.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 과발현하는, 재조합 수소영양 미생물.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성은 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩되거나, 외인성 아스파르토키나아제 활성은 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 각각 포함하는 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이들의 조합에 의해 개별적으로 인코딩되는, 재조합 수소영양 미생물.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성이 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩되는, 재조합 수소영양 미생물.
  66. 제65항에 있어서, 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, I375, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  67. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성이 라이신 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩되는, 재조합 수소영양 미생물.
  68. 제67항에 있어서, 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  69. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성이 라이신 및 트레오닌 결합 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩되는, 재조합 수소영양 미생물.
  70. 제69항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  71. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘다인 아스파르토키나아제 활성이 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 인코딩되는, 재조합 수소영양 미생물.
  72. 제71항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 부위의 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기서 잔기 넘버링은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 lysC에 의해 인코딩되는 잔기 위치에 해당하는, 재조합 수소영양 미생물.
  73. 제50항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물은 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 더욱 포함하고, 재조합 수소영양 미생물은 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산하는, 재조합 수소영양 미생물.
  74. 제73항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로로부터의 하나 이상의 인코딩된 폴리펩티드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 탈수소화효소, 호모세린 탈수소화효소, 호모세린 O-아세틸전이효소, 호모세린 O-트랜스석시닐전이효소, O-석시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-합성효소, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸전이효소, 메티오닌 합성효소(코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 재조합 수소영양 미생물.
  75. 제73항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다를 인코딩하거나, 두 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다를 인코딩하는, 재조합 수소영양 미생물.
  76. 제75항에 있어서, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다를 인코딩하는 외인성 핵산 분자가 핵산 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 재조합 수소영양 미생물.
  77. 제76항에 있어서, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다가 과발현되거나, 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다가 과발현되는, 재조합 수소영양 미생물.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 탈수소화효소, 세린 아세틸전이효소, 또는 둘다가 탈조절되거나, 호모세린 O-아세틸전이효소, O-아세틸호모세린 설프하이드릴라아제, 또는 둘다가 탈조절되는, 재조합 수소영양 미생물.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 메티오닌 합성효소를 인코딩하는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  80. 제79항에 있어서, 메티오닌 합성효소가 메티오닌 합성효소를 인코딩하는 외인성 핵산 분자가 결여된 모 수소영양 미생물에 비해 과발현되는, 비-자연적인 수소영양 미생물.
  81. 제50항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성을 가지는, 재조합 수소영양 미생물.
  82. 제50항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로로부터의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성을 가지는, 재조합 수소영양 미생물.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, 트레오닌 키나아제, 트레오닌 탈수효소, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 전이효소, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 분자가 녹아웃되거나 감소된 활성의 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 돌연변이, 트레오닌 키나아제, 트레오닌 탈수효소 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 전이효소 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는, 재조합 수소영양 미생물.
  84. 제50항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 유전체에 통합된, 재조합 수소영양 미생물.
  85. 제50항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물 내의 자가-복제 벡터 내에 있는, 재조합 수소영양 미생물.
  86. 제50항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 라이신 영양요구체, 트레오닌 영양요구체, 또는 둘다인, 재조합 수소영양 미생물.
  87. 제50항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 감소된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘다를 가지는, 재조합 수소영양 미생물.
  88. 제50항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 증가된 피루베이트 카르복실화효소 활성, 증가된 피루베이트 합성효소, 증가된 아세틸-CoA 합성효소, 증가된 아스파르테이트 아미노전이효소 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가지는, 재조합 수소영양 미생물.
  89. 제50항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, COX 기질이 H2, CO, 및 CO2로 이루어진 H2/COX기질인, 재조합 수소영양 미생물.
  90. 제50항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, COX 기질이 합성가스 또는 수성-가스 전환된 합성가스로 이루어진 H2/COX기질인, 재조합 수소영양 미생물.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, CO2 대 H2의 비율이 각각 약 1:50 내지 약 10:1 범위인, 재조합 수소영양 미생물.
  92. 제89항 또는 제90항에 있어서, CO2 대 H2의 비율이 각각 약 1:2 내지 약 1:4 범위인, 재조합 수소영양 미생물.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, CO의 총량이 약 1%를 넘지 않는, 재조합 수소영양 미생물.
  94. 제50항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 수소영양 미생물이 메탄 생성 고세균인, 재조합 수소영양 미생물.
  95. 제94항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 메타노박테리움, 메타노브레비박터, 메타노칼큘루스, 메타노칼도코쿠스, 메타노코쿠스, 메타노코코이데스, 메타노코르푸스쿨룸, 메타노쿨레우스, 메타노폴리스, 메타노제니움, 메타노할로븀, 메타노할로필루스, 메타노라시니아, 메타놀로부스, 메타노메틸로보란스, 메타노마이크로븀, 메타노마이크로코쿠스, 메타노플라누스, 메타노피루스, 메타노레귤라, 메타노사에타, 메타노살숨, 메타노사르시나, 메타노스파에라, 메타노스피릴륨, 메타노써모박터, 메타노써모코쿠스, 메타노테르무스, 또는 메타노토리스로부터 선택되는, 재조합 수소영양 미생물.
  96. 제95항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 메타노박테리움 알칼리필룸, 메타노박테리움 브리얀티, 메타노박테리움 콘골렌세, 메타노박테리움 데플루비, 메타노박테리움 에스파놀래, 메타노박테리움 포르미시쿰, 메타노박테리움 이바노비, 메타노박테리움 팔루스트레, 메타노박테리움 써마그레간스, 메타노박테리움 울리기노숨, 메타노브레비박터 아시디두란스, 메타노브레비박터 아르보리필리쿠스, 메타노브레비박터 고트샬키, 메타노브레비박터 올레야에, 메타노브레비박터 루미난튬, 메타노브레비박터 스미티, 메타노브레비박터 워에세이, 메타노브레비박터 월리니, 메타노써모박터 마르부르겐시스, 메타노써모박터 써마우토트로피쿰, 메타노써모박터 써모플렉수스, 메타노써모박터 써모필루스, 메타노써모박터 월페이, 메타노테르무스 소시아빌리스, 메타노코르푸스쿨룸 바바리쿰, 메타노코르푸스쿨룸 파르붐, 메타노쿨레우스 치쿠오엔시스, 메타노쿨레우스 서브마리누스, 메타노제니움 프리기둠, 메타노제니움 리미나탄스, 메타노제니움 마리눔, 메타노마이크로코쿠스 블라티콜라, 메타노플라누스 엔도심바이오수스, 메타노플라누스 리미콜라, 메타노플라누스 페트롤레아리우스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노레귤라 부네이, 메타노사에타 콘실리, 메타노사에타 하룬디나세아, 메타노사에타 펠라지카, 메타노사에타 써모필라, 메타노사르시나 아세티보란스, 메타노사르시나 바르케리, 메타노사르시나 마제이, 메타노사르시나 써모필라, 메타노마이크로븀 모빌레, 메타노코쿠스 아에올리쿠스, 메타노코쿠스 마리팔루디스, 메타노코쿠스 반니엘리, 메타노코쿠스 볼테, 메타노써모코쿠스 써모리토트로피쿠스, 메타노피루스 칸들레리, 메타노써모박터 써모오토트로이피쿠스, 메타노칼도코쿠스 페르벤스, 메타노칼도코쿠스 인디쿠스, 메타노칼도코쿠스 인페르누스, 메타노칼도코쿠스 잔나쉬이, 및 메타노칼도코쿠스 불카니우스로 이루어진 군에서 선택되는, 재조합 수소영양 미생물.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 시토크롬을 생산하지 않는, 재조합 수소영양 미생물.
  98. 제97항에 있어서, 시토크롬을 생산하지 않는 메탄 생성 고세균이 메타노코쿠스 마리팔루디스 또는 메타노코쿠스 반니엘리인, 재조합 수소영양 미생물.
  99. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 시토크롬을 생산하는, 재조합 수소영양 미생물.
  100. 제99항에 있어서, 시토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균은 메타노사르시나 바르케리 또는 메타노사르시나 마제이인, 재조합 수소영양 미생물.
  101. 제50항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 메티오닌의 배출인자를 발현하거나 과발현하는, 재조합 수소영양 미생물.
  102. 제52항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수소영양 미생물이 메티오닌의 배출인자를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 더욱 포함하는, 재조합 수소영양 미생물.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 배출인자가 brnFE 또는 metT 유전자인, 재조합 수소영양 미생물.
  104. 메티오닌을 생산하기 위한 방법으로, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 비-자연적인 수소영양 미생물을 메티오닌을 생산하기에 충분한 시간 동안 배양하는 것을 포함하는 방법, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은: (a) 모 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 발현하고; (b) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드를 과발현하고; 또는 (c) 하나 이상의 황 동화 폴리펩티드의 변형된 조절을 포함하고, 여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 모 수소영양 미생물보다 더 높은 수준의 메티오닌을 생산함.
  105. 메티오닌 또는 메티오닌-함유 공급물 첨가제를 제조하기 위한 공정으로, 제50항 내지 제103항 중 어느 한 항에 따른 재조합, 메티오닌-분비 수소영양 미생물을 H2/COX기질의 존재에서 황 동화 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조건 하에 및 충분한 시간 동안 배양하는 것을 포함하는 공정, 여기서 모 수소영양 미생물에 의해 생산된 메티오닌보다 더 높은 수준으로 메티오닌이 생산되고 배양 배지 내에 축적됨.
  106. 메티오닌을 생산하기 위한 방법으로, 다음을 포함하는 방법:
    (a) COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 포함하는 기체의 공급원;
    (b) 황 동화 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 비-자연적인 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응기; 및
    (c) 기체가 생물반응기로 유동할 수 있게 하는 기체 공급원 및 생물반응기 사이에 배치된 이음장치(connector);
    여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 H2/COX 기질을 대사하여 모 수소영양 미생물과 비교할 때 하나 이상의 메티오닌 경로 아미노산을 초과생산함.
  107. 메티오닌을 생산하기 위한 시스템으로, 다음을 포함하는 시스템:
    (a) COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 포함하는 기체의 공급원;
    (b) 황 동화 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 제50항 내지 제103항 중 어느 한 항에 따른 재조합 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응기; 및
    (c) 기체가 생물반응기로 유동할 수 있게 하는 기체 공급원 및 생물반응기 사이에 배치된 이음장치(connector);
    여기서 비-자연적인 수소영양 미생물은 COX 기질을, 임의로 H2의 존재에서, 대사하여 모 수소영양 미생물과 비교할 때 하나 이상의 메티오닌 경로 아미노산을 초과생산함.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 생물반응기가 액체상, 기포탑, 또는 삼상층 생물반응기인 시스템.
  109. 제106항 또는 제107항에 있어서, COX 기질이 합성가스 또는 수성-가스 전환된 합성가스로 이루어진 H2/COX기질인, 시스템.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6980819B2 (ja) * 2017-06-30 2021-12-15 シージェイ チェイルジェダング コーポレイション 新規なｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異体及びこれを用いたｏ−スクシニルホモセリンの製造方法
US10982245B2 (en) 2017-06-30 2021-04-20 Cj Cheiljedang Corporation O-succinyl homoserine transferase mutant and method for producing O-succinyl homoserine using same
KR102079741B1 (ko) * 2018-10-02 2020-02-20 이화여자대학교 산학협력단 메타노박테리움 콩고렌스를 유효성분으로 포함하는 포름산 제거용 조성물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
CN110172432A (zh) * 2019-04-16 2019-08-27 深圳市奥极因科技有限公司 一种不依赖vb12的聚球藻pcc 7002工程菌及其构建方法和应用
WO2020252335A1 (en) * 2019-06-14 2020-12-17 Trelys, Inc. Processes and systems for producing products by fermentation
JP2022538784A (ja) * 2019-06-14 2022-09-06 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法
CN111139230B (zh) * 2020-01-17 2021-05-14 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法
CN116622596A (zh) * 2022-02-10 2023-08-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用
EP4296367A1 (en) 2022-06-24 2023-12-27 Arkeon GmbH Method for fermentatively producing norvaline
EP4296369A1 (en) 2022-06-24 2023-12-27 Arkeon GmbH Method for producing amino acids in a bioreactor
EP4296354A1 (en) 2022-06-24 2023-12-27 Arkeon GmbH Method for producing amino acids in a bioreactor with methanogenic microorganisms
EP4296368A1 (en) 2022-06-24 2023-12-27 Arkeon GmbH Method for producing amino acids with methanogenic microorganisms in a bioreactor

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06277081A (ja) 1992-11-19 1994-10-04 Shimizu Corp メタン生成細菌による５−アミノレブリン酸の生産方法
EP0834559B1 (en) * 1995-06-13 2003-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine by fermentation
GB9518220D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Checkpoint gene
JP4110641B2 (ja) * 1998-11-17 2008-07-02 味の素株式会社 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法
US6299774B1 (en) 2000-06-26 2001-10-09 Jack L. Ainsworth Anaerobic digester system
US20110111413A1 (en) 2001-02-02 2011-05-12 Padgett Hal S Method of optimizing codon usage through dna shuffling
WO2005111202A1 (en) * 2004-05-12 2005-11-24 Metabolic Explorer Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity
JP2007068437A (ja) 2005-09-05 2007-03-22 Chisso Corp 変異型アスパルトキナーゼとその利用方法
KR100905381B1 (ko) 2006-07-28 2009-06-30 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
EP2808382B1 (en) * 2007-04-11 2016-03-16 CJ CheilJedang Corporation Compositions and methods of producing methionine
US9005952B2 (en) * 2008-04-04 2015-04-14 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism
CN101580813A (zh) * 2008-05-12 2009-11-18 长春大成实业集团有限公司 应用发酵生产l-苏氨酸的方法
WO2011139804A2 (en) 2010-04-27 2011-11-10 Sequesco Use of oxyhydrogen microorganisms for non-photosynthetic carbon capture and conversion of inorganic and/or c1 carbon sources into useful organic compounds
WO2013148348A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Kiverdi, Inc. Engineered co2-fixing chemotrophic microorganisms producing carbon-based products and methods of using the same
US20100120104A1 (en) 2008-11-06 2010-05-13 John Stuart Reed Biological and chemical process utilizing chemoautotrophic microorganisms for the chemosythetic fixation of carbon dioxide and/or other inorganic carbon sources into organic compounds, and the generation of additional useful products
US9657317B2 (en) 2011-10-19 2017-05-23 Calysta, Inc. Host cells and method for making acrylate and precursors thereof using an odd-numbered alkane feedstock
WO2013090769A2 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Kiverdi, Inc. Method and apparatus for growing microbial cultures that require gaseous electron donors, electron acceptors, carbon sources, or other nutrients
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
KR20150036502A (ko) 2012-07-13 2015-04-07 칼리스타, 인코포레이티드 바이오리파이너리 시스템, 이의 방법 및 조성물
WO2014047209A1 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Calysta Energy, Inc. Propylene synthesis using engineered enzymes
WO2014058761A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Calysta Energy, Llc Gas-fed fermentation systems
US10480016B2 (en) 2012-10-15 2019-11-19 Calysta, Inc. Genetically engineered microorganisms for biological oxidation of hydrocarbons
US9845474B2 (en) 2012-10-24 2017-12-19 Calysta, Inc. Engineering of multi-carbon substrate utilization pathways in methanotrophic bacteria
BR112015021003A2 (pt) 2013-03-07 2017-07-18 Calysta Inc composições e métodos para a produção biológica de isopreno.
WO2014145194A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Kiverdi, Inc. Methods of using natural and engineered organisms to produce small molecules for industrial application
CN105378077A (zh) 2013-06-18 2016-03-02 凯利斯塔公司 用于使用乳酸脱氢酶转化体从c1化合物以生物方式产生乳酸的组合物和方法
CN106062176A (zh) 2014-01-02 2016-10-26 特雷里斯公司 用于在氢营养微生物中生物制备氨基酸的组合物和方法
RU2016133400A (ru) 2014-01-16 2018-02-19 Калиста, Инк. Композиции и способы для добычи трудноизвлекаемых газа и нефти
EP3094718A4 (en) 2014-01-16 2017-06-07 Calysta, Inc. Microorganisms for the enhanced production of amino acids and related methods
EP3097185A4 (en) 2014-01-16 2017-08-09 Calysta, Inc. Carbohydrate-enriched recombinant microorganisms

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