JP2018516552A - メチオニンの生物学的産生のための組成物及び方法 - Google Patents

メチオニンの生物学的産生のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本明細書の開示によって、必要に応じてHの存在下で、CO及び/もしくはCOガスを生物学的に利用するか、またはメチオニンに変換し得る改変された水素資化微生物を使用するための組成物及び方法が提供される。本開示の親または出発の水素資化微生物は、野生型(天然)株、変異(非天然)株(例えば、増殖速度の増大、調節解除または抑制解除された生合成酵素)または組換え株であり得、これらはそれぞれ、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生するようにさらに改変されてもよい。特定の実施形態では、水素資化生物は、メタン生成古細菌であってもよい。
【選択図】なし

Description

(配列表に関する声明)
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、それによって明細書中に参照によって援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、910215_407WO_SEQUENCE_LISTING.txt.である。テキストファイルは、30.5KBであって、2016年5月6日に創出され、EFS−Webを介して電気的に提出されている。
メチオニンは、硫黄含有の必須アミノ酸であって、食品及び医療産業において種々の適用で利用される。例えば、メチオニンは動物のエサ及び食物の添加物として、ならびに多くの医薬における成分として用いられる。従って、メニオニンには産業上の需要が高い。
この高い需要を満たすために、メチオニンは、メチルメルカプタン、プロピレン及びシアン化水素などの取り扱い困難な原料を含む複雑な化学合成を介して合成的に製造された。メチオニンの合成的な産生には苛酷な産生環境を必要とするか、または環境的に有害な副産物を生じる。
高コストの出発材料及び合成産生の環境への影響のせいで、発酵によるメチオニンの製造方法が好ましい。しかし、メチオニン中の硫黄原子の存在により、効率的なメチオニンの発酵による生成は複雑になっている。さらに、現在の発酵方法は、出発炭素源として糖及び炭水化物を利用する。炭水化物の使用は、一貫産生と環境問題のための信頼できる原料を見つけることによって複雑になる。一例として、多くの炭水化物廃棄物源(例えば、残留作物バイオマス)を発酵させることができるが、季節性である。あるいは、いくつかの作物は、産業上の発酵反応のために炭水化物を産生するために栽培してもよい。しかし、これらの方法は、食料産生のために利用可能な耕地を減少させ、かつ費用がかさむ。
メチオニンの需要が高く、発酵性炭水化物が比較的高価でかつ信頼性が低いことを考えれば、メチオニンを生物学的に費用対効果の高い方法で産生するための代替的でかつ改良された方法が必要である。本開示は、このような必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
詳細な説明
本開示は、野生型または親の生物体と比較してより高いレベルのメチオニンを産生するように、水素資化微生物の代謝工学(例えば、遺伝子、遺伝子発現、遺伝子発現調節を変更する)のための組成物及び方法を提供する。
背景として、古細菌及び水素資化微生物に分類される微生物を含む多くの微生物は、アスパラギン酸経路のアミノ酸のような他のアミノ酸の産生に関与するいくつかの酵素を共有する生合成経路を介してメチオニンを産生する。これらのアミノ酸生合成酵素の1つ以上は、フィードバック調節、遺伝子発現の抑制、またはその両方に供される。例えば、工業的に重要なアミノ酸(例えば、メチオニン)の生合成に炭素フラックスを指し向けることに関与する最初の関与する酵素であるアスパルトキナーゼは、Corynebacterium glutamicum中のトレオニン及びリシンによって、リン酸化アスパラギン酸からアロステリックに阻害される(Sano及びShiio,J.Gen.Appl.Microbiol.16:373,1970;Yoshida et al.,J.Mol.Biol.368:521,2007)。別の酵素であるホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼは、メチオニン及びS−アデノシルメチオニンによるフィードバック調節を受ける(Born及びBlanchard、Biochem。38:14416、1999)。ホモセリンデヒドロゲナーゼは、メチオニン/トレオニン生合成経路における最初の関与する酵素であるが、リシン生合成経路であるジヒドロジピコリン酸シンターゼに関与する最初の酵素とアスパルチルセミアルデヒドに関して競合しなければならない。したがって、炭素フラックスがメチオニンまたはリシンに向かうかどうかは、どの酵素が基質を得るかに依存する。
本開示は、本明細書中でMMP1359及びMMP1358と呼ばれる、1つ以上の改変硫黄同化関連オープンリーディングフレーム(ORF)を有する水素資化微生物が、野生型(親)水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)と比較してメチオニンを過剰産生し得るという驚くべき発見に関する。さらなる背景として、Rauchら(Mol.Microbiol.94:1330,2014)は、(それぞれMMP1359及びMMP1358 ORFのホモログである)MA1821及びMA1822 ORFと呼ばれるMethanosarcina acetivorans ORFの二重ノックアウト変異によって、ホモシステイン生合成に関してO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を欠いている遺伝的バックグラウンドにおけるホモシステイン形成に関与していることを見出し;特に、バイオインフォマティクス技術によって特定されたこれらのORFは、嫌気性菌におけるホモシステインへの硫化物の取り込み過程に関与しているようである。Rauchら(2014)は、MA1821及びMA1822のORFが、ゲノム上でメチオニン生合成(ホモシステイン生合成に関与する遺伝子では稀ではない)に共存することを見出し、メチオニン生合成におけるこれらのORFの役割は探究されなかった。理論によって縛られることを望まないが、本開示は、MMP1359及びMMP1358のORFが、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けること、及び本開示の変更されたORFが、メチオニンフィードバック阻害に耐性のポリペプチドをコードすることを実証すると考えられる。したがって、特定の態様において、本開示は、ガス供給原料(例えば、水素及びCO、COなどの酸化炭素を含むガス)の代謝を促進して親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成するために、調節解除されるか、または遺伝子改変されたMMP1359、MMP1358、もしくはその両方を発現する修飾水素資化微生物(例えば、古細菌)を使用するための組成物及び方法を提供する。
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することが本開示の理解に役立ち得る。さらなる定義は、本開示を通して説明される。
本明細書では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値を含み、かつ別段示さない限り、適宜、それらの分数(例えば、10分の1及び100分の1整数)を含むことが理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さのような任意の物理的特徴に関する、本明細書に記載された任意の数の範囲は、別段示さない限り、列挙した範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段示さない限り、示された範囲、値または構造の±20%を意味する。「本質的に〜からなる」という用語は、特許請求の範囲を、請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない特定の材料またはステップ、またはものに限定する。本明細書中で使用される場合、「ある、1つ(「a」及び「an」:不定冠詞)」という用語は、列挙された構成要素の「1つ以上の」を指すことが理解されるべきである。代替(例えば、「または」)の使用は、その代替物の1つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書において用いる場合、「含む、包含する、〜が挙げられる(include)」、「有する、持つ、備える(have)」及び「含む、包含する(comprise)」という用語は同義語として使用され、その用語及び変化型は非限定的であると解釈されるものとする。
本明細書中で使用される場合、「アスパラギン酸経路アミノ酸」または「アミノ酸のアスパラギン酸ファミリー」とは、アスパラギン酸から合成された、リシン、トレオニン及びメチオニンを含む1つ以上のアミノ酸を指す。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸のそれぞれについての生合成経路におけるステップは分岐し、枝分かれするが、それらは全て、アスパラギン酸キナーゼ(アスパルトキナーゼとも称される)によるアスパラギン酸のリン酸化から始まる。特定の実施形態では、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成経路におけるアスパラギン酸キナーゼは、リシン、トレオニン、及びメチオニンのうちの1つ以上によるフィードバック阻害を受ける。
本明細書で使用する場合「メチオニン生合成経路」または「メチオニン経路」とは、メチオニンの生合成に使用されるメチオニン及び前駆体代謝産物(例えば、システイン、ホモセリン)の生合成に直接的または間接的に関与する1つ以上の酵素を指す。メチオニン生合成経路を含み得る例示的な酵素としては、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−トランススクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、MMP1358、MMP1359、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される場合「H/COx基質」または「H/COx供給原料」は、水素(H)と二酸化炭素(CO)または一酸化炭素(CO)またはその両方の混合物を指し、また種々の他の成分、例えば、アンモニア(NH)、炭化水素(例えばメタン(CH))、CO、CO、ホルムアルデヒド(CHO)、硫化水素(HS)、硫化カルボニル(COS)、シアン化水素(HCN)、水蒸気、不活性ガス、または他のガスも含んでもよい。特定の実施形態では、本開示の微生物は、COx基質または供給原料を利用し、これは必要に応じて、Hの存在下であり、また上記したような種々の他の成分も含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「合成ガス」または「合成ガス」とは、例えば、水蒸気改質、乾燥またはCO改質、自己熱改質、天然ガスまたは液化炭化水素の接触部分酸化または部分酸化によって、水素合成において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化よって生成され得る、一酸化炭素と水素との混合物を指す。特定の実施形態では、合成ガスは、水性ガスシフト反応によってさらに調整してもよい。合成ガスはまた、メタン、CO、HS、または他のガスをCO及びHに対して少量含んでもよい。
本明細書中で使用される場合、「宿主」という用語は、変異によって、目的のポリペプチドを産生する外因性核酸分子(例えば、調節解除されたMMP1358、調節解除されたMMP1359)を使用して、ノックアウトまたはそれらの組み合わせにより、遺伝子改変されて、修飾されていない宿主細胞よりもメチオニンの産生を改善し得る細胞または微生物(例えば、古細菌)を指す。特定の実施形態では、宿主細胞は、発現されている変異したかまたは外因性のポリペプチドに関連するかまたは関連しない所望の特性(例えば、調節解除)を付与する他の遺伝子改変を必要に応じて既に有していてもよい。例えば、宿主細胞は、メチオニン経路への付加的もしくは増強された炭素フラックス活性、競合するアミノ酸の産生の減少、高い増殖、汚染物質もしくは特定の培養条件への耐性、追加の炭素基質を代謝する能力、または所望の生成物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子修飾を保有してもよいし、または保有するように変更されてもよい。
本明細書で使用する「水素資化生物、水素栄養生物(hydrogenotroph)」または「水素資化、水素化栄養性、水素栄養性(hydrogenotrophic)」とは、Hを消費するか、Hを酸化するか、またはHを別の化合物にその代謝の一部として変換することができる微生物を指す。特定の実施形態では、水素資化生物は、偏性もしくは通性の水素資化生物、偏性もしくは通性の嫌気性菌、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。例えば、通例の水素資化生物は、エネルギー源として水素の存在下でもまたは非存在下でも成長し得、炭水化物、酢酸塩、ギ酸塩、メタノール、メチルアミンまたは酸化炭素などの1つ以上の種々の炭素源を使用し得る(例えば、酢酸生成菌(Acetogen)、クロストリジウム(Clostridium)はHの非存在下で生育し得、酢酸塩をエネルギー源及び炭素源の両方として使用することができる;Methanosarcina mazeiは、Hの非存在下で、例えばアセテート、メチルアミンまたはメタノールを使用することによって、メタン生成の代替代謝経路を使用して生存し得る)。例示的な水素資化生物としては、メタン生成菌、酢酸生成菌、Knall−gas細菌などが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「メタン生成菌(methanogen)」または「メタン生成古細菌(methanogenic archaea)」という用語は、(a)任意の種々の1つまたは2つの炭素基質(例えば、二酸化炭素、酢酸塩、ギ酸、ホルムアルデヒド、一酸化炭素、メタノール、メチルアミン類(例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど))及び水素ガスを使用すること;(b)酢酸資化経路でアセテートを使用すること、ならびに(c)メチル栄養性メタン生成経路における炭素間の結合を欠く、還元された1つの炭素化合物または多炭素化合物の使用、を含む、任意の1つ以上のメタン生成経路を使用して、無酸素条件下でメタンを生成し得る古細菌の微生物を指す。例えば、Methanosarcina種は、メタン生成について公知の3つ全ての経路を保有し、これは、少なくとも9つのメタン生成基質(例えば、メタノール、メチルアミン類、メチルチオール類、アセテート)を利用することができる古細菌であるが、Methanosarcina acetivoransは、Methanosarcina mazeiとは異なり、機能的なH還元因子を欠くので、H/CO還元では存続できない(Maeder et al、J.Bacteriol.188:7922、2006)。しかし、Methanosarcina acetivoransは、COを酢酸塩及びギ酸塩に代謝することによって、COをCOに酸化することによって、またはメタンを生成する際に電子受容体として酢酸塩を使用することによって、成長し得る。当該技術分野では、細菌は古細菌ではなく、古細菌は細菌ではないことが理解されている。本明細書で使用される場合、メタン生成古細菌は、メタン(例えば、Methanocella conradii)を生成するために水素ガスを必要とする「偏性水素資化生物(obligate hydrogenotrophs)」であってもよい。メタン生成古細菌は、水素ガスの非存在下でメタンを生成することができる「通性の水素資化生物(facultative hydrogenotrophs)」であってもよい(例えば、Methanosarcina mazei)。さらに、メタン生成古細菌は、中温性であっても、好熱性であってもまたは超好熱性であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「バイオマス」とは、生物起源を有する有機物質を指し、これには、全細胞、溶解細胞、細胞外物質、産生産物またはその一部分などを含み得る。例えば、培養された微生物(例えば、細菌または古細菌培養物)から採取された材料は、バイオマスとみなしてもよく、これは、分泌された生成物を含んでもよく、または分泌された生成物であってもよい。
本明細書で使用する「核酸分子」とはまた、ポリヌクレオチドとしても知られ、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットからなる高分子化合物を指す。核酸分子としては、ポリリボ核酸(RNA)、ポリデオキシリボ核酸(DNA)が挙げられ、これらは両方とも一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。DNAとしては、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、半合成DNAなどが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「内因性の」または「天然の」という用語は、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。さらに、親の遺伝子、タンパク質または活性と比較して、変異されるか、過剰発現されるか、シャッフルされるか、複製されるか、または他の形で変更される遺伝子、タンパク質または活性は、依然としてその特定の宿主細胞にとって内因性または天然であると考えられる。例えば、第1の遺伝子由来の内因性制御配列(例えば、プロモーター、翻訳減衰配列)を使用して、第2の天然遺伝子または核酸分子の発現を改変または調節してもよく、ここで、第2の天然遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における正常な発現または調節とは異なる。
本明細書で使用される場合、「異種」または「外因性」の核酸分子、構築物または配列とは、宿主細胞に対して天然ではないが、宿主細胞由来の核酸分子または核酸分子の一部に相同であり得る、核酸分子または核酸分子の一部を指す。異種または外因性の核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種由来のものであってもよい。特定の実施形態では、異種または外因性核酸分子は、例えば、結合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって、宿主細胞または宿主ゲノムに追加され(すなわち、内因性でも天然でもない)、ここでこの追加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれてもよいし、または染色体外遺伝物質として(例えば、プラスミドまたは他の形態の自己複製ベクターとして)存在してもよく、複数のコピーで存在してもよい。さらに、「異種」とは、たとえ宿主細胞が相同なタンパク質または活性をコードしているとしても、宿主細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされる非天然の酵素、タンパク質または他の活性を指す。
「相同な」または「相同体」という用語は、宿主細胞、種または株に見られるかまたはそれに由来する分子または活性に類似する分子または活性を指す。例えば、異種または外因性核酸分子は、天然の宿主細胞遺伝子と相同であり得、必要に応じて、変更された発現レベル、異なる配列、変更された活性、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、参照または親の野生型配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一または100%同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を有し得る。特定の実施形態では、相同ポリペプチドは、参照または親の野生型酵素に対して1つ以上の所定の位置で少なくとも1つのアミノ酸置換(例えば、少なくとも1、2、3、5、6、7、8、9または10以上または20、25または30個までの置換)または特定の数以下のアミノ酸置換(例えば、1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25または30個以下の置換)を、ただし、相同タンパク質またはポリペプチドが、目的の活性(例えば、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、シンターゼ)を保持する条件下で、含む。
本明細書中で使用される場合、「非天然」または「非天然の遺伝子操作型」という用語は、野生型、または親の細胞または分子とは異なる少なくとも1つの遺伝子改変を含むように遺伝子的に操作された生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指す。例えば、非天然のものは、内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現、または遺伝子産物の活性が、野性型または親の微生物と比較して変更される(例えば、増大、減少、調節解除、活性化、抑制解除、抑制)ように遺伝子操作された(例えば、自然発生変異体を含む部位特異的突然変異体またはランダム突然変異体)微生物または細胞を指し得る。このような修飾としては、例えば、遺伝子またはオペロンの発現を変化させる(増大または減少させる)非コード調節領域のものが挙げられる。「非天然」生物、微生物、または細胞としては、組換え生物、微生物または細胞が挙げられ得る。
本明細書中で使用される場合、「組換え」という用語は、外因性核酸分子の導入によって改変された微生物、細胞、核酸分子、もしくはベクターを指すか、または改変された微生物もしくは細胞であって、内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が、そのような改変もしくは改変が遺伝子工学によって導入され得る場合、制御されるか、調節解除されるかもしくは構成的であるような微生物または細胞を指す。遺伝的改変は、例えば、1つ以上のタンパク質または酵素をコードする核酸分子(プロモーターなどの発現制御エレメントを含んでもよい)または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝物質への他の機能的破壊もしくは追加を導入する改変を含んでもよい。例示的な修飾としては、参照または親の微生物由来の異種ポリペプチドまたは同種ポリペプチドのコード領域またはその機能的フラグメントにおける修飾が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の生物、微生物または細胞は、非天然生物、微生物または細胞、ならびに組換え生物体、微生物または細胞である。例えば、調節解除された内因性酵素(例えば、MMP1359、MMP1358、アスパルトキナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ)を発現または過剰発現する非自然の水素資化微生物はまた、発現されるかまたは過剰発現して、メチオニンの生合成に関与する特定の酵素活性(例えば、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリン、Oアセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインSメチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼデヒドロゲナーゼ)を産生する1つ以上の外因性または異種の核酸分子を含んでもよい。
本明細書で使用する場合「形質転換」とは、核酸分子(例えば、外因性または異種の核酸分子)を宿主細胞に導入することを指す。形質転換された宿主細胞は、外因性または異種性の核酸分子を染色体外で担持してもよいし、または染色体に組み込んでもよい。宿主細胞ゲノム及び自己複製ベクターへの組み込みは、一般に、形質転換された核酸分子の遺伝的に安定した遺伝をもたらす。形質転換された核酸を含む宿主細胞は、「組換え」または「遺伝子操作」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞(例えば、古細菌)と呼ばれる。
本明細書中で使用される場合、「調節解除された」という用語は、それぞれ親または野性型の微生物における遺伝子の発現または活性と比較して、遺伝子産物(例えば、タンパク質、酵素)の発現の減少もしくは増大、または遺伝子産物の活性の減少もしくは増大を指す。例えば、微生物は、操作の前よりも、親もしくは野性型微生物のものと比べて、遺伝子産物の発現を増加もしくは減少させるため、または遺伝子産物の活性を増大もしくは低下させるために、遺伝子操作(例えば、変異、遺伝子操作)されてもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子は、発現された遺伝子産物が増大した活性を有するように変異される。例えば、標的遺伝子のコード領域は、発現された遺伝子産物が活性を増大させるように変更されてもよく、標的遺伝子のコピー数が増大されて活性が増大されてもよく、標的遺伝子が過剰発現されて活性が増大されてもよく、またはそれらの任意の組合せであってもよい。他の実施形態では、標的遺伝子は、発現された遺伝子産物が、フィードバック阻害に対して減少した応答、最小の応答、または検出不可能な応答を有するように変異される(例えば、MMP1358もしくはMMP1359のようなアミノ酸生合成酵素、またはその両方が、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの1つ以上のフィードバック阻害剤の存在下で調節解除される)。さらなる実施形態では、標的遺伝子は、ある遺伝子が、発現の抑制に対して減少、最小または検出不能な応答を有するように変異される(例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼなどのアミノ酸生合成酵素が、フィードバックコリプレッサーであるメチオニンの存在下で調節解除される)。あるいは、微生物は、例えば、上記の遺伝子改変の任意の1つ以上(例えば、自発突然変異体)を有する選択圧下で特定することができる。任意の上述の実施形態の調節解除された遺伝子または遺伝子産物は、自発性、誘導性または遺伝子操作された変異体または改変体であってもよい。
本明細書において使用する場合、「過剰発現された」という用語は、同じ条件下で増殖された場合、親または野性型の微生物で見出される遺伝子発現または遺伝子産物のレベルよりも大きい、天然ではないまたは組み換えの微生物中の遺伝子発現または遺伝子生成物のレベルを指す。特定の実施形態において、過剰発現は、改変された調節制御(例えば、強力なプロモーターの使用)もしくはコピー数の増大またはその両方に起因し得る、転写レベル、翻訳レベル、またはその両方で生じ得る。
2つ以上のポリペプチドまたは核酸分子配列の文脈における「同一の」または「同一性パーセント」という用語は、手動アラインメントによって、または目視検査によって、配列比較アルゴリズムなどの当該技術分野で公知の方法を使用して測定した場合、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって、最大一致に関して比較及び整列させた場合、同じであるか、または特定の領域にまたがって同じである特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)2つ以上の配列または部分配列を意味する。例えば、配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403に記載のデフォールト設定で用いられるBLAST2.0アルゴリズムである。
本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体もまた企図される。改変体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの1つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%または99.9%同一である。いくつかの実施形態では、改変体ポリヌクレオチドとは、0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム、約65〜68℃または0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム及び50%ホルムアミドで約42℃というストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で規定の配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1989を参照のこと)。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載の機能性を有する生合成酵素またはそのポリペプチドをコードする能力を保持する。
より厳しい条件(例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤)もまた使用されてもよい;しかし、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。例えば、デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6×SSC、0.05%ピロリン酸ナトリウム、37℃(14塩基のオリゴヌクレオチドについて)、48℃(17塩基のオリゴヌクレオチドについて)、55℃で(20塩基のオリゴヌクレオチドについて)、及び60℃(23塩基のオリゴヌクレオチドについて)での洗浄が挙げられる。
「変異体(mutant)」とは、参照の核酸分子またはアミノ酸配列と比較した、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における変化を指す。変異は、放射線、ウイルス、トランスポゾン、変異原性化学物質、減数分裂またはDNA複製の間に起こるエラー、過剰変異などによって引き起こされ得る。変異は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの任意の組み合わせを含むいくつかの異なるタイプの配列変化をもたらし得る。
「保存的置換」とは、類似の特性を有する別のアミノ酸の1つのアミノ酸の置換として当業界で認識されている。例示的な保存的置換は、当該技術分野で周知である(例えば、WO97/09433号の第10頁;Lehninger,Biochemistry,第2版;Worth Publishers,Inc.NY,NY,pp.71〜77,1975;Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA,p.8,1990を参照のこと)。
「阻害する」または「阻害された」とは本明細書において使用する場合、対照、内因性または参照の分子に対する、標的遺伝子の発現または標的分子(例えば、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ)の活性における直接的または間接的な改変、低減、下方制御または抑止であって、統計的、生物学的、産業的または臨床的に有意な改変、低減、下方制御または抑止を指す。例えば、阻害された、不活性化された、または低下した活性の(例えば、遺伝子改変)生合成酵素は、野生型または親酵素と比較して35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ未満の活性を有してもよい。
(水素資化微生物−宿主細胞)
本開示の親または出発の水素資化微生物は、野生型(天然)株、変異(非天然)株(例えば、増殖速度の増大、調節解除または抑制解除された生合成酵素)または組換え株であり得、これらはそれぞれ、親水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生するようにさらに改変されてもよい。特定の実施形態では、水素資化生物は、メタン生成古細菌であってもよい。
特定の実施形態では、本開示は、メタン生成古細菌である水素資化微生物、例えば、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanocella、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、MethanothermusまたはMethanotorrisを提供する。
さらなる実施形態では、水素資化微生物は、特定のメタン生成古細菌種である。例示的なメタン生成古細菌種としては、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanocaldococcus vilosus、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、Methanocella paludicola、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermococcus okinawensis、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanotorris formicicus、Methanotorris igneus、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii及びMethanocaldococcus vulcaniusが挙げられる。
特定の実施形態では、メタン生成古細菌は、シトクロムを産生するか、またはシトクロムを産生しない。例えば、シトクロムを産生しないメタン生成古細菌としては、Methanococcus maripaludisまたはMethanococcus vannieliiが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Methanosarcina barkeriまたはMethanosarcina mazeiである。
関連の実施形態では、メタン生成古細菌は、中温性であっても、好熱性であっても、または超好熱性であってもよい。例示的な中温性メタン生成菌としては、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanococcus、Methanocorpusculum及びMethanosarcinaといういくつかの種が挙げられる。例示的な好熱性メタン生成菌としては、Methanomicrobium、Methanosaeta、Methanosarcina及びMethanothermococcusといういくつかの種が挙げられる。例示的な超好熱性メタン生成菌としては、Methanocaldococcus、Methanopyrus、Methanothermus、及びMethanotorrisが挙げられる。
メチオニン産生性の水素資化微生物
本開示の水素資化微生物は、目的の硫黄同化ポリペプチドをノックアウト、低減、発現または過剰発現するために遺伝子操作(すなわち、遺伝子的に操作)、組換え修飾、またはそれらの組み合わせをしてもよく、その結果、H/COx基質の種々の成分をメチオニンまたはメチオニン含有フィードに変換(例えば、利用、変換、同化、酸化、還元)するために有用な組み換え微生物が生じる。
非天然の水素資化微生物を生成するための遺伝子の操作または遺伝子操作としては、ランダム(例えば、化学的に誘発される、自発性の)または部位特異的突然変異誘発(例えば、1つ以上の遺伝子標的)、1つ以上の遺伝子標的の発現に関連する調節配列または部位の変更(例えば、強力な、弱い、誘導性の、抑制可能な、もしくは複数のプロモーターを除去することによって、またはこのようなプロモーターを、異なる特性を有するプロモーターと置き換えることによって)、1つ以上の遺伝子標的の染色体位置を変化するステップ、1つ以上の遺伝子標的に隣接する核酸配列(例えば、リボソーム結合部位または転写ターミネーター)を変更するステップ、1つ以上の遺伝子標的のコピー数の減少または増大、1つ以上の遺伝子標的の転写、もしくは1つ以上の遺伝子産物の翻訳に関与する、調節タンパク質、リプレッサー、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなどの改変、または1つ以上の遺伝子標的の発現を調節する任意の他の方法(アンチセンス核酸分子、短い干渉核酸分子、または標的タンパク質の発現をノックアウトまたはブロックするための他の方法の使用を含む)が挙げられる。
特定の実施形態では、遺伝子操作または遺伝子工学は、親の微生物よりも多くのメチオニンを産生する非自然の水素資化微生物を生じる1つ以上の自然突然変異(例えば、化学的、放射線学的または他の変異誘発的処理)を含む。そのような自然発生変異体は、例えば、所望の表現型を有する変異体のみが増殖する特定の選択圧(例えば、増殖培地中に特定のアミノ酸または毒素が存在しないこと、抗生物質が存在すること、特定の代謝産物の非存在など)の下に微生物を置くことによって産生されて、特定され得る。
さらなる実施形態では、野生型から変化したアミノ酸配列を有するなど、メチオニン生合成酵素をコードする内因性または外因性核酸分子を改変してもよい。これらの方法によって生成される各改変体ポリペプチドは、参照または親の野性型ポリペプチド配列に対して、少なくとも50%の活性(好ましくは100%以上の活性)を保持し、かつ少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一、または100%同一であるポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、改変体ポリペプチドは、改変体が目的の活性(例えば、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、シンターゼ)を保持するならば、参照または親の野生型酵素に対して1つ以上の所定の位置で、少なくとも1つのアミノ酸置換(例えば、少なくとも1、2、3、5、6、7、8、9もしくは10以上または20、25または30個までの置換)または1つ以上の特定の数のアミノ酸置換(例えば、1、2、3、5、6、7、8、9、10、15、20、25または30個以下の置換)を、含む。
特定の態様では、本開示は、オープンリーディングフレーム(ORF)MMP1359(GenBank番号NC_005791.1(1337240..1338781、相補体);NCBI Gene ID:2762444、配列番号1)、MMP1358(GenBank番号NC_005791.1(1336828..1337226、相補体)、NCBI遺伝子ID:2762433、配列番号5)、またはその両方によってコードされる硫黄同化酵素が、メチオニン生合成経路に関与し、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けるという予期せぬ結果に関する。いくつかの実施形態において、硫黄同化酵素MMP1359、MMP1358、またはその両方とも、水素栄養性古細菌Methanococcus maripaludis由来である。さらなる実施形態では、本開示は、メチオニンフィードバック阻害に耐性のMMP1359をコードする変異ORF(例えば、配列番号2);メチオニンフィードバック阻害に耐性のMMP1358をコードする変異したORF(例えば、配列番号6)、またはその両方(親、野生型もしくは参照のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して、宿主細胞によって発現される場合、メチオニン産生が増大する)を提供する。集合的に、MMP1359及びMMP1358ポリペプチド、またはその変異体、改変体、ホモログもしくはオーソログは、本明細書では、「硫黄同化ポリペプチド」または「メチオニン経路ポリペプチド」と総称される。
特定の実施形態では、MMP1359、MMP1358、またはその両方のホモログまたはオーソログは、Desulfomonile tiedjei、Syntrophothermus lipocalidus、Acetobacterium woodii、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophomonas wolfei、Thermodesulfobium narugense、Odoribacter splanchnicus、Thermotoga thermarum、Thermosipho melanesiensis、Sphaerochaeta globosa、またはそれらの任意の組合せから得てもよい。
したがって、本開示は、調節解除されるように内因的に修飾される(例えば、もはやメチオニンまたはS−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受けない)、または組み換えにより発現もしくは過剰発現された(野生型または調節解除された)水素資化微生物、メチオニンの生合成に関与するポリペプチド、例えば、本明細書に開示される調節解除された硫黄同化ポリペプチド(例えば、MMP1359、MMP1358)を提供する。さらに、本開示の水素資化微生物は、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼまたはそれらの組み合わせなど(その活性は、内因性、外因性、またはその両方であってもよい)のメチオニン生合成経路のさらなる酵素をさらに発現または過剰発現することができる。特定の実施形態では、調節解除型または過剰発現のMMP1359及び/またはMMP1358及びアスパルトキナーゼを有する水素資化微生物は、必要に応じて、内因性または組換えにより添加されたホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有してもよい。特定の実施形態では、水素資化微生物は、メチオニンフィードバック阻害に耐性である変異されたMMP1359をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号2)、メチオニンフィードバック阻害に耐性である変異されたMMP1358をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号6)、またはその両方を含み、必要に応じてメチオニンシンターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
フィードバック耐性変異体を遺伝子操作及び特定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、リシンアナログS−2−アミノエチル−L−システイン(AEC)またはメチオニンアナログDL−エチオニンなどの毒性アミノ酸アナログの存在下で増殖することができる微生物は、毒性アナログに対応するアミノ酸に対してフィードバック耐性であると考えられている(例えば、Shiio et al.,Agric.Biol.Chem.54:3275、1990;Kumar及びGomes、Biotechnology Advances 23:41〜61,2005を参照のこと)。
本開示のポリヌクレオチドは、他の生物、特に他の古細菌、より詳細には他のメタン生成菌から対応する配列を単離するために使用してもよい。このようにして、PCR、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本明細書に示されるMMP1359またはMMP1358核酸分子配列に対するそれらの配列相同性に基づいて、そのような配列を特定してもよい。本明細書に示されるMMP1359もしくはMMP1358のORF全体、またはその変異体及びフラグメントに対するそれらの配列同一性に基づいて単離された核酸分子は、本発明に包含される。そのような配列は、開示された配列のホモログまたはオーソログである配列を含む。「オーソログ」とは、共通の祖先コード配列に由来し、種分化の結果として異なる種に見出されるコード配列を意味するものとする。それらのヌクレオチド配列またはそれらのコードされたタンパク質配列が、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を共有するとき、種々の種で見出されるコード配列は、オーソログとみなされる。オーソログの機能は、種間で高度に保存されていることが多い。したがって、硫黄同化活性を有するか、またはメチオニン生合成を促進し(及び必要に応じては、調節解除され、例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの1つ以上の化合物によるフィードバック阻害に耐性である)、ストリンジェントな条件下で、MMP1359もしくはMMP1358のORF、またはその改変体もしくはフラグメントにハイブリダイズするポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドは、本開示に包含される。
コドン用法の偏りの変動は、異種宿主での組換えタンパク質発現に影響を及ぼし得る、異なる種の細菌及び古細菌にまたがって観察されている(Sharp et al.,Nucl.Acids Res.33:1141、2005;Emery and Sharp,Biol.Lett.7:131、2011)。特定の実施形態では、核酸分子(例えば、硫黄同化ポリペプチドまたはメチオニン生合成酵素をコードする核酸)は、タンパク質発現を改善または最大化するために、本明細書に記載の宿主細胞に導入する前にコドン最適化されてもよい。コドン最適化とは、コドンによってコードされるアミノ酸を変更することなく、宿主細胞のより一般的なコドン用法を反映するための、核酸分子レベルでの遺伝子またはコード領域におけるコドン配列の改変を指す。異種宿主における遺伝子発現のためのコドン最適化法は、以前に記載されている(例えば、Welch et al.,Methods Enzymol.498 43、2011;Henry and Sharp、Mol.Biol.Evol.24:10,2007;米国特許公開第2011/0111413号を参照のこと)。
PCR法のアプローチでは、目的の任意の微生物(例えば、古細菌)から抽出されたcDNAまたはゲノムDNAから対応するDNA配列を増幅するためのPCR反応における使用のために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよい。PCRプライマー及びPCRクローニングを設計するための方法は、当該技術分野で一般に知られており、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York)で開示される。また、Innis et al.,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applicaions(Academic Press,New York);Innis and Gelfand、eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York);ならびにInnis and Gelfand、eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)も参照のこと。PCRの公知の方法としては、対になったプライマー、入れ子状プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的不一致プライマー等を使用する方法が挙げられる。
ハイブリダイゼーション技術では、選択された生物体由来のクローニングされたゲノムDNAフラグメントまたはcDNAフラグメント(すなわち、ゲノムまたはcDNAライブラリー)の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして、公知のポリヌクレオチドの全てまたは一部が使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNAフラグメント、cDNAフラグメント、RNAフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドに基づくものであってもよく、32Pなどの検出可能な基または任意の他の検出可能なマーカーで標識してもよい。したがって、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書において特定されたMMP1359またはMMP1358ポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。cDNA及びゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションのためのプローブ及び構築のためのプローブの調製方法は、当該技術分野で一般的に公知であり、Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York)に開示される。
例えば、本明細書中に開示されるMMP1359もしくはMMP1358ポリヌクレオチド全体またはその1つ以上の部分は、対応するORF、cDNAまたはmRNAポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、MMP1359またはMMP1358ポリヌクレオチド配列の中で固有であり、かつ必要に応じて長さが少なくとも約10ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも約20ヌクレオチドである。そのようなプローブは、PCRによって選択された微生物由来の対応する硫黄同化ポリヌクレオチドを増幅するために使用され得る。この技術は、水素源化微生物中のコード配列の存在を決定するために、所望の微生物からさらなるコード配列を単離するために使用してもよい。ハイブリダイゼーション技術としては、プレートされたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング(プラークまたはコロニーのいずれか;例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New Yorkを参照)が挙げられる。
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列と、他の配列よりも検出可能な程度に(例えばバックグラウンドに対して少なくとも2倍)ハイブリダイズする条件とする。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーション及び/または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと100%の配列同一性を有する標的配列を特定することができる。あるいは、より低い度合いの類似性(例えば、60%〜99%の配列同一性)を検出できるように、配列におけるある程度のミスマッチを許容するようにストリンジェンシー条件を調整してもよい。
特定の態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物がH/CO基質を代謝して親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し、かつこの非自然の水素資化微生物が調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する、非自然の水素資化微生物を提供する。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号4または8に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号4または8に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号2または6に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号2または6の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除される。
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、遺伝子操作された自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1359またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1358またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、遺伝子操作された自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1359またはそのホモログもしくはオーソログによって;ならびに遺伝子操作された自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1358またはそのホモログもしくはオーソログによってコードされる。
特定の実施形態では、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1359変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。他の実施形態では、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1358変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。さらなる実施形態において、調節解除された内因性または外因性の硫黄同化ポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1359変異体またはそのホモログもしくオーソログ、ならびに1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1358変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。
本開示のMMP1359変異体について言及する場合、Methanococcus maripaludis S2(ATCC番号DSM14266)MMP1359タンパク質(GenBankアクセッション番号NP_988479.1)のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的な変異は、残基D439での変異(例えば、D439N置換)を含む。本開示のMMP1358変異体について言及する場合、Methanococcus maripaludis S2(ATCC番号DSM14266)MMP1358タンパク質(GenBankアクセッション番号NP_988478.1)のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的な変異は、残基G114での変異(例えば、G114E置換)を含む。
本明細書で述べるように、アスパラギン酸経路アミノ酸(例えば、メチオニン)の生合成における最初の関与する酵素は、アスパルトキナーゼであり、これはリシン、トレオニン及びメチオニンのうちの1つ以上によるフィードバック調節を受ける場合がある。例えば、E.coliは、3つのアスパルトキナーゼアイソザイムを有し、2つは、アスパルトキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有して、機能性であり、これらは、アスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼI(AK/HD−I;thrA)及びアスパルトキナーゼII−ホモセリンデヒドロゲナーゼII(AK/HD−II;metL)と呼ばれ、他方は、アスパルトキナーゼ活性のみを有し、アスパルトキナーゼIIIと呼ばれる(AK−III;lysC)。AK/HD−Iは、トレオニンによるフィードバック調節(ならびにトレオニン及びロイシンによる発現抑制)を受けるが、AK/HD−IIはメチオニンのみによるフィードバック調節を受け、AK−IIIは、リシンのみによるフィードバック調節を受ける(Patte et al.,Biochim.Biophys.Acta 136:245,1967;Theze et al.,J.Bacteriol.117:133,1974を参照のこと)。対照的に、Corynebacterium glutamicumのアスパルトキナーゼは、リシン及びトレオニンの両方によってフィードバック阻害される(Sano及びShiio,1970;Yoshida et al.,2007)。アスパラギン酸経路アミノ酸の生合成に関与する他の酵素、例えばホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、及びホモセリンO−トランススクシニルトランスフェラーゼもまた、フィードバック阻害を受ける。
いくつかの実施形態では、本開示は、調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方を発現する非自然の遺伝子操作された水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物はさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性またはメチオニンシンターゼをさらに発現または過剰発現し、ここでこの非自然の水素資化微生物は、必要に応じて、Hの存在下でCO基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態において、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、内因性アスパルトキナーゼ、外因性アスパルトキナーゼ、またはその両方である。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、リシン、トレオニン、及びメチオニンのうちの1つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である。いくつかの実施形態において、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、自発突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体lysC遺伝子によってコードされる。特定の実施形態において、内因性または外因性アスパルトキナーゼは調節解除されず、異種メチオニンシンターゼ(例えば、MetE)が過剰発現される。
さらなる実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンもしくはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおける変異を含む変異体lysC遺伝子によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位に変異を含む変異thrA遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、メチオニン結合部位に変異を含む変異metL遺伝子によってコードされる。
本開示のlysCフィードバック耐性変異体について言及する場合、Corynebacterium glutamicum ATCC13032LysCタンパク質(GenBankアクセッション番号CAF18822.1)のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングが参照される。例示的なトレオニン結合部位変異としては、残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン結合部位変異としては、残基I291、I293、D294、T361、S381、E382、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン及びトレオニン結合部位変異は、残基D294にある。リシン及びトレオニン結合部位以外の部位における例示的な変異には、残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386またはそれらの任意の組合せが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持していれば、上記の変異のいずれか1つ以上を、本開示のアスパルトキナーゼに含めてもよい。
メチオニンの生合成が効率的に起こるためには、一定量の炭素フラックスがメチオニン経路を通って流れなければならない。メチオニンの産生をブーストまたは増強するための1つの方法は、本開示によって提供されるように、メチオニン経路への炭素フラックスを最大にすることである。
特定の態様では、本開示は、調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物を提供し、ここで、この非自然の水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、5−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはその任意の組み合わせを有し、かつここで非自然の水素資化微生物は、H/CO基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する。特定の他の実施形態では、調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方を発現する非天然水素資化微生物は、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−CoAシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはその任意の組み合わせを有する。
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチド(調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方など)を発現する非自然の水素資化微生物はまた、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の減少、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、5−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチルCoAシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する。これらの実施形態のそれぞれにおいて、非自然の水素資化微生物は、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成するために、必要に応じてHの存在下でCO基質を代謝する。
本明細書において注記するとおり、いくつかのメチオニン生合成経路の酵素は、フィードバック調節を受け(例えば、MMP1359、MMP1358、アスパルトキナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ)、これらの酵素をコードする遺伝子のいくつかは、抑制を受ける(例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼ)か、またはその両方である。したがって、本開示によって提供されるように、メチオニンの生成は、調節、抑制、またはその両方を緩和することによって改善され得る。
さらなる態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物が、メチオニンの生合成のための1つ以上の経路由来の1つ以上の調節解除及び/または脱抑制されたポリペプチドを含み、かつここで、この非自然の水素資化微生物が、必要に応じて、Hの存在下で、CO基質を代謝し、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたMMP1359活性、MMP1358活性、またはその両方を発現する非自然の水素資化微生物はまた、アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(例えば、metA)、O−スクシニルホモセリンリアーゼ(例えば、metB)、または脱抑制されているか、調節解除されているか、もしくはその両方であるそれらの任意の組み合わせを有する。
メチオニンの過剰産生に加えて、微生物からの産生されたメチオニンの抽出または単離を避けることが有利であろう。したがって、本開示は、単離または精製方法が単純化されている培養培地中のメチオニン産生の増強方法を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、調節解除されたMMP1359、MMP1358、またはその両方を発現する非自然の水素資化性微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物は、メチオニンのエクスポーターを発現または過剰発現し、かつここでこの非自然の遺伝子操作型または組み換えの水素資化微生物は、必要に応じてHの存在下でCO基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、非自然の水素資化微生物は、強い発現制御配列(例えば、nifまたはtetプロモーター)に作動可能に連結されたCorneybacterium glutamicumのbrnFEまたはmetTなどのメチオニンのエクスポーターを発現または過剰発現する(Trotschel et al.,J.Bacteriol.187:3786〜94、2005を参照のこと)。他の実施形態では、メチオニンの非自然の水素資化微生物のトランスポーター/インポーターがノックアウトまたは阻害される。
メチオニン生合成経路への炭素フラックスを確実にする別の方法は、他の競合するアミノ酸の産生を除去することである。本開示で提供されるように、水素資化性微生物は、1つ以上のアミノ酸の栄養要求株であり得る。
さらに別の態様では、本開示は、非自然の水素資化微生物を提供し、ここでこの非自然の水素資化微生物は1つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求株であり、かつここでこの非自然の水素資化微生物はCO基質を、必要に応じてHの存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態において、非自然の水素資化性微生物は、ホモセリン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、またはその両方である。特定の他の実施形態では、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン要求株、またはその両方である。特定の実施形態では、調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せでもある。
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、1つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の栄養要求株でもある。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、ホモセリン栄養要求株、トレオニン要求、またはそれらの任意の組合せでもある。さらに別の実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせでもある。なおさらなる実施形態では、調節解除された内因性硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、またはその両方でもある。特定の実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せでもある。
時には、メチオニン経路の一部である1つ以上の生合成酵素を単に過剰発現させることは、本開示の水素資化微生物において有用であろう。さらなる態様において、本開示は、メチオニンの生合成のための1つ以上の経路からポリペプチドを過剰発現する非自然の水素資化微生物を提供し、ここで非自然の水素資化微生物はCO基質を、必要に応じてHの存在下で代謝し、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物はまた、メチオニンの生合成のための1つ以上の経路からポリペプチドを過剰発現もする。特定のさらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼもしくはその両方を過剰発現するか;またはホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方を過剰発現するか;またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する。
微生物の生物体における外因性または異種の核酸の発現のための組換え法は、当該技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory、New York(2001);及びAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、Baltimore、MD(1999)の記載に見出され得る。例示的な発現されるべき外因性のタンパク質または酵素としては、メチオニン生合成に関与するもの(例えば、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、シンターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、もしくはそれらの任意の組み合わせ)、またはメチオニン生合成経路への炭素フアックスに影響する酵素(例えば、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸シンターゼ、アセチル−CoAシンターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせ)が挙げられる。酵素またはその機能的フラグメントをコードする核酸分子に対する遺伝的な改変は、天然に存在する状態から改変されている組換え細胞に生化学的または代謝的能力を付与し得る。
本開示の任意の水素資化微生物を、少なくとも1つの外因性核酸を含むように形質転換して、宿主に新たな活性または増強された活性(例えば、酵素活性)を付与してもよいし、または、当該技術分野で公知の任意の種々の方法を使用して、内因性の遺伝子機能を取り除くか、または実質的に低減するように遺伝子的に改変してもよい。水素資化微生物、例えばメタン生成古細菌における異種核酸分子の転移及び発現のための遺伝的ツールは、当該技術分野で公知である(例えば、Rother et al.,Curr.Opin.Microbiol.8:745、2005;Leigh et al.,FEMS Microbiol.Rev.35:577、2011を参照のこと)。例えば、DNA送達のため(Dodsworth et al.,Appl.Environ.Microb.76:5644、2010;Metcalf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2626,1997)、シャトルベクターについて(Gardner及びWhitman、Genetics 152:1439、1999;Metcalf et al.,1997)、異種遺伝子の調節された発現について(Lie及びLeigh、J.Bacteriol.184:5301、2002;Chaban et al.,Mol.Microbiol.66:596,2007;Guss et al.,Archaea 2:193,2008)、及びノックインまたはノックアウト遺伝子交換について(Moore及びLeigh、J.Bacteriol.187:972,2005;Pritchett et al.,Appl.Environ.Microb.70:1425,2004)、ツールが利用可能である。したがって、水素資化微生物において内因性の遺伝子機能を不活性化、ノックアウト、または欠失させるために様々な方法を使用してもよい。
特定の実施形態では、プロモーター、コドン最適化、またはその両方を、宿主の水素資化微生物中のアミノ酸生合成経路酵素をコードする外因性の核酸分子の高い構成的発現のために使用してもよい。宿主の水素資化微生物(例えば、メタン生成古細菌)中の外因性核酸分子の調節された発現もまた利用されてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸生合成酵素をコードする外因性核酸分子の調節された発現が、非自然のまたは組換えの水素資化微生物の増殖速度を最適化するために望ましい場合がある。H/CO基質の存在に対する応答のためのアミノ酸生合成酵素をコードする核酸分子の制御された発現は、利用可能な様々な異なる供給源または比率のH/CO基質に基づいて増殖を改善し得る。
本明細書に記載する場合、2つ以上の異種または外因性の核酸分子を、宿主細胞中に、別々の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして導入してもよい。例えば、本明細書に開示されるとおり、CO基質を、必要に応じてHの存在下で代謝する微生物は、メチオニン生合成経路の所望の酵素(例えば、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ)をコードする2つ以上の異種または外因性の核酸分子を発現するように改変してもよい。2つ以上の外因性核酸分子が、宿主H/CO代謝微生物に導入される場合、2つ以上の外因性核酸分子は、単一の核酸分子として(例えば、単一のベクター上に)、別個のベクター上に、導入され、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込まれてもよい。参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入される別個の核酸分子の数ではなく、核酸分子をコードする数またはタンパク質活性の数を指す。
例えば、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)は、H/CO基質(例えば、HとCO、COまたはその両方)をメチオニンに、親の微生物よりもより高いレベルで利用、転換または代謝することができるポリペプチドを産生するように、組み換え的に形質転換されてもよい。本明細書に記載の任意の実施形態において、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)は、必要に応じてHの存在下で、CO基質を利用、変換または代謝することができるポリペプチドを産生するように組換え的に形質転換されてもよい。
さらなる実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の水素資化微生物は、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子をさらに含み、かつこの非自然の遺伝子操作型水素資化微生物は、本明細書に記載のように、親の水性資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ(例えばmetA)、O−スクシニルホモセリンリアーゼ(例えば、metB)、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第1の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方は必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、またはその両方である。
特定の他の実施形態では、外因性核酸分子は、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、またはその両方が過剰発現される。さらに別の実施形態では、第1の外因性核酸分子は、E.coliのThrA(AK/HD−I)、E.coliのMetL(AK/HD−II)、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはそれらの組み合わせをコードし、ここでこのAK/HD−I、AK/HD−II、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはそれらの組み合わせは、必要に応じて過剰発現されるか、調節解除されるか、または両方が過剰発現される。特定の実施形態では、E.coliのThrA(AK/HD−I)は、調節解除変異体であり、ここでこのAK/HD−Iはアミノ酸位置G330、S345、S352、及びG433のいずれか1つ以上で変異されている。
いくつかの実施形態では、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを発現する非自然の遺伝子操作型水素資化微生物はさらに、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、さらに(a)ノックアウトされているかまたは活性が低下している1つ以上のリシン生合成経路ポリペプチド、(b)ノックアウトされているかまたは活性が低下している1つ以上のトレオニン生合成経路ポリペプチド、(c)ノックアウトされているかまたは活性が低下している1つ以上のグリシン生合成経路ポリペプチド、(d)ノックアウトされているかまたは活性が低下している1つ以上のメチオニン分解経路ポリペプチド(例えば、metK)、または(e)それらの任意の組合せを有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子は、ノックアウトされているか、または低下した活性をコードする。
任意の上記の非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物において、外因性核酸分子はゲノムに組み込まれるか、または外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。さらに、前述の任意の非自然の型水素資化性微生物において、非自然の水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。
特定の態様では、本開示は、組換えの水素資化微生物を提供し、ここでこの組み換え水素資化微生物は、必要に応じてHの存在下でCO基質を代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し、かつここでこの組換えの水素資化微生物は、外因性の硫黄同化ポリペプチドを含むポリペプチドを発現または過剰発現する。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号3、4、7または8のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号3、4、7または8のいずれか1つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号1、2、5または6のいずれか1つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。まださらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、配列番号1、2、5または6のいずれか1つの相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのコードされたポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1359またはそのホモログもしくはオーソログである。いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体MMP1358またはそのホモログまたはオーソログである。特定の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1359変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。特定の実施形態では、硫黄同化ポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されているMMP1358変異体またはそのホモログもしくはオーソログである。
いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物はさらに、調節解除された内因性の硫黄同化ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号4及び8のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号4または8のいずれか1つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。さらなる実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号2または6のいずれか1つに対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。さらに別の実施形態では、内因性の硫黄同化ポリペプチドは、配列番号2及び6のいずれか1つの相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、ここでこのポリペプチドは、1つ以上のフィードバック阻害剤(例えば、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニン)について調節解除されている。
特定の実施形態において、組み換え水素資化微生物はさらに、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、またはその両方を含む。
いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物は、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性を発現または過剰発現し、ここでこの組み換え水素資化微生物はCO基質を必要に応じてHの存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成する。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、リシン、トレオニン、及びメチオニンの1つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含む変異体lysC遺伝子によってコードされる。
さらなる実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおける変異を含む変異体lysC遺伝子によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位に変異を含む変異体thrA遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性は、メチオニン結合部位に変異を含む変異体metL遺伝子によってコードされる。
本開示のlysCフィードバック耐性変異体に言及する場合、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 LysCタンパク質(GenBankアクセッション番号CAF18822.1)のアミノ酸位置に対応する残基ナンバリングを参照のこと。例示的なトレオニン結合部位の変異としては、残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン結合部位の変異としては、残基I291、I293、D294、T361、S381、E382またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例示的なリシン及びトレオニン結合部位の変異は、残基D294である。例示的な、リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の変異としては、残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持している条件であれば、任意の上述の変異の1つ以上が、本開示のアスパルトキナーゼに含まれてもよい。
いくつかの実施形態では、この組み換え水素資化微生物は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第2の外因性核酸分子を含み、ここでこの組み換え水素資化微生物は、CO基質を、必要に応じてHの存在下で同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成し得る。いくつかの実施形態では、第2の外因性核酸分子は、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現するか、またはこの第2の外因性核酸分子は、リシン、トレオニン及びメチオニンのうちの1つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性の内因性アスパルトキナーゼ変異体などの調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性をコードする。いくつかの実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、変異のE.coliのアスパルトキナーゼ遺伝子、例えば変異のアスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼIタンパク質(GenBankアクセッション番号BAB96579.2)、変異したアスパルトキナーゼII−ホモセリンデヒドロゲナーゼIIタンパク質(GenBankアクセッション番号BAE77370.1)または変異したアスパルトキナーゼIIIタンパク質(GenBankアクセッション番号BAE78026.1)によってコードされる。特定の実施形態では、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性は、アミノ酸位置G330、S345、S352及びG433のうちの任意の1つ以上の位置において変異されているE.coliアスパルトキナーゼThrAタンパク質(GenBankアクセッション番号BAB96579.2)によって提供されるか、またはアミノ酸位置T342において変異されている変異体E.coliアスパルトキナーゼlysCタンパク質(GenBankアクセッション番号BAE78026.1)によって提供される。他の実施形態では、調節解除された外因性、内因性またはそれらの両方のアスパルトキナーゼ活性は、自然突然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異またはそれらの任意の組み合わせをそれぞれ含む変異体thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子またはそれらの組み合わせによって、個々にコードされる。
さらなる実施形態では、外因性のアスパルトキナーゼ活性は、トレオニン結合部位、リシン結合部位、リシン及びトレオニン結合部位、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位、またはそれらの任意の組み合わせにおいて変異を含む変異体lysC遺伝子によって個々にコードされる。例示的なトレオニン結合部位の変異体としては、残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。リシン結合部位の例示的な変異体としては、残基I291、I293、D294、T361、S381、E382またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。リシン及びトレオニン結合部位の例示的な変異体は、残基D294である。リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の例示的な変異体としては、残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。アスパルトキナーゼポリペプチドがそのキナーゼ活性を保持することを条件であれば、上記変異のうちのいずれか1つ以上の変異体は、本開示のアスパルトキナーゼに含まれ得る。
他の態様では、本開示は、ピルビン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸分子、または低いホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を必要に応じて有するそれらの任意の組み合わせを含む、組み換え水素資化微生物であって、H/CO基質を同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生することができる組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大またはそれらの両方を有する。特定の他の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−CoAシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大またはそれらの任意の組み合わせを有する。
さらなる態様では、本開示は、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む組み換え水素資化微生物であって、H/CO基質を同化して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生することができる組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、brnFEまたはmetTエクスポーターのような、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性の核酸分子をさらに含む。他の実施形態では、メチオニンの非自然の水素資化微生物トランスポーター/インポーターはノックアウトされるか、または阻害される。
またさらなる態様では、本開示は、1つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸の生合成をノックアウトする遺伝子改変を含む、組み換え水素資化微生物であって、1つ以上のアスパラギン酸経路アミノ酸について栄養要求株であり、かつH/CO基質を同化させて、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを産生し得るこの組み換え水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、ホモセリン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。特定の他の実施形態では、組み換え水素資化微生物は、リシン栄養要求株、イソロイシン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、組み換え水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組合せである。
特定のさらなる態様において、本開示は、メチオニンの生合成のための1つ以上の経路からのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性核酸分子を含む組み換え水素資化微生物であって、この1つ以上のコードされたポリペプチドが過剰発現され、かつCO基質を、必要に応じてHの存在下で同化させて、親の水素資化微生物よりも高いレベルでメチオニンを生成し得る組み換え水素資化微生物を提供する。
特定の実施形態では、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはそれらの任意の組み合わせが過剰発現されるか;またはホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくは両方が過剰発現されるか;またはアスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドが過剰発現される。
さらなる実施形態では、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を有する組み換え水素資化微生物はさらに、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、この組み換え水素資化微生物は、メチオニンを、本明細書に記載のように、親の水素資化微生物よりも高レベルで産生する。さらなる実施形態では、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のコードされたポリペプチドは、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−トランススクシニルトランスフェラーゼ(例えばmetA)、O−スクシニルホモセリンリアーゼ(例えば、metB)、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、第2の外因性核酸分子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードし、ここで、このホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、核酸発現制御配列に作動可能に連結されるか、調節解除されるか、またはそれらの組み合わせである。特定の他の態様において、外因性核酸分子は、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方をコードし、ここでこのホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはその両方は、必要に応じて過剰発現されるか、必要に応じて核酸制御配列に作動可能に連結されるか、調節解除されるか、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を有する組み換え水素資化微生物は、さらに、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、かつさらに(a)ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している1つ以上のリシン生合成経路ポリペプチド(b)ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している1つ以上のトレオニン生合成経路ポリペプチド、(c)ノックアウトされているか、もしくは活性が低下している1つ以上のグリシン生合成経路ポリペプチド、または(d)それらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子は、ノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、ホモセリンキナーゼ変異体、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
任意の上述の組み換え水素資化微生物において、第1の外因性核酸分子はゲノムに組み込まれているか、またはこの第1の外因性核酸分子は自己複製ベクター中にある。さらに、任意の上述の組み換え型水素資化微生物において、組み換えの水素資化微生物は、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである。
特定の実施形態において、本明細書に記載の水素資化微生物を遺伝子操作して、MMP1359活性またはメチオニンフィードバック阻害耐性MMP1359活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の水素資化微生物を、遺伝子操作して、MMP1358活性またはメチオニンフィードバック阻害耐性MMP1358活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の水素資化微生物を、遺伝子操作して、メチオニンフィードバック阻害耐性MMP1359活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチド及びメチオニンフィードバック阻害耐性MMP1358活性を有する変異体硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生してもよい。任意の上述の実施形態において、遺伝子操作された水素資化微生物はさらに、外因性メチオニンシンターゼ活性をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで外因性メチオニンシンターゼを欠く親の細胞と比較して、細胞がメチオニンシンターゼ活性を過剰産生する。
例えば、MMP1359に対応する活性を有する硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生させるために、Methanococcus maripaludis、Methanosarcina acetivorans、Methanocella paludicola、Desulfomonile tiedjei、Syntrophothermus lipocalidus、Acetobacterium woodii、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophomonas wolfei、Thermodesulfobium narugense、Ordoribacter splanchnicus、またはSphaerochaeta globose由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して、発現または過剰発現させてもよく、それによってMMP1359またはその機能的なフラグメントに対して相同であるポリペプチドを生成または過剰産生させ、これは、必要に応じて調節解除される(すなわち、メチオニンフィードバック阻害に耐性)。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のMMP1359ポリペプチドは、Methanococcus maripaludis(NC_05791.1;MMP 1359)Methanosarcina acetivorans(NC_003552.1;ORF 1821)、Methanocella paludicola(NC_013665.1;ORF 0132)、Desulfomonile tiedjei(NC_018025.1;ORF2525)、Syntrophothermus lipocalidus(NC_014220.1;ORF0735)、Acetobacterium woodii(NC_016894.1;ORFc28040)、Tepidanaerobacter acetatoxydans(NC_019954.2;ORF2794)、Syntrophomonas wolfei(NC_008346.1;ORF1441)、Thermodesulfobium narugense(NC_015499.1;ORF 0230)、Ordoribacter splanchnicus(NC_015160.1;ORF 3419)、またはSphaerochaeta globose(NC_ 015152.1;ORF0032)由来である。
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Methanococcus maripaludis S2由来のMMP1359アミノ酸配列に基づき、GenBankアクセッション番号NP_988479.1に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも75%、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたMMP1359は、GenBankアクセッション番号NP_988479.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、または同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、MMP1359アミノ酸配列は、アミノ酸位置D439で変異した(例えば、アスパラギンに対して)M maripaludisタンパク質(GenBankアクセッション番号NP_988479.1)である。
例えば、MMP1358に対応する活性を有する硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生するために、Methanococcus maripaludis、Methanosarcina acetivorans、Methanocella paludicola、Desulfomonile tiedjei、Syntrophothermus lipocalidus、Acetobacterium woodii、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Syntrophomonas wolfei、Thermodesulfobium narugense、Ordoribacter splanchnicus、またはSphaerochaeta globose由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)の中に導入し、発現させるか、または過剰発現させ、それによってMMP1358またはその機能的フラグメントに相同である調節解除されたポリペプチドを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法の硫黄同化ポリペプチドは、Methanococcus maripaludis(NC_05791.1;MMP1358)、Methanosarcina acetivorans(NC_003552.1;ORF1822)、Methanocella paludicola(NC_013665.1;ORF0133)、Desulfomonile tiedjei(NC_01825.1;ORF2526)、Syntrophothermus lipocalidus(NC_014220.1;ORF0736)、Acetobacterium woodii(NC_016894.1;ORFc28030)、Tepidanaerobacter acetatoxydans(NC_019954.2;ORF2795)、Syntrophomonas wolfei(NC_008346.1;ORF1440)、Thermodesulfobium narugense(NC_015499.1;ORF 0231)、Ordoribacter splanchnicus(NC 015160.1;ORF 3418)、またはSphaerochaeta globose(NC_015152.1;ORF0033)由来である。
いくつかの実施形態では、硫黄同化ポリペプチドのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Methanococcus maripaludis S2由来のMMP1358アミノ酸配列に基づき、かつGenBankアクセッション番号NP_988478.1に示される配列またはその機能的なフラグメントに対して、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98同一であるか、少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたMMP1358は、GenBankアクセッション番号NP_988478.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、または同一であるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、MMP1358アミノ酸配列は、アミノ酸位置G14で(例えば、グルタミン酸に対して)変異されたM maripaludisタンパク質(GenBankアクセッション番号NP_988478.1)である。
いくつかの実施形態において、硫黄同化ポリペプチドは、MMP1359及びMMP1358の両方に対応する活性を有するように発現または過剰発現される。例えば、Termotoga thermanrumまたはTermosipho melanesiensis由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入し、発現させるか、または過剰発現させ、それによって、MMP1359及びMMP1358に相同である調節解除ポリペプチド、またはその機能的なフラグメントを産生するか、または過剰産生させてもよい。その特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法の硫黄同化ポリペプチドは、Termotoga thermanrum(NC_015707.1;ORF0529)またはTermosipho melanesiensis(NC_009626.1;ORF0733)由来である。
いくつかの実施形態において、硫黄同化ポリペプチドアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Termotoga thermanrumまたはTermosipho melanesiensis由来のGenBankアクセッション番号NC_015707.1;ORF0529またはNC_009626.1;ORF0733のアミノ酸配列に基づき、かつGenBankアクセッション番号NC_015707.1;ORF0529もしくはNC_009626.1;ORF073に示される配列、またはその機能的フラグメントと少なくとも75%、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%である。他の実施形態では、組み換えによってコードされた硫黄同化ポリペプチドは、GenBankアクセッション番号NC_015707.1;ORF0529またはNC_009626.1;ORF073に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されるか、または同一であるアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の水素資化性微生物は、硫黄同化ポリペプチドを発現または過剰産生するように遺伝子操作してもよく、かつ必要に応じてまたアスパルトキナーゼ(EC2.7.2.4)、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC1.2.1.11)、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ(EC2.3.1.31、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ(例えば、metA;EC2.3.1.46)、O−スクシニルホモセリンリアーゼ(例えば、metB;EC2.5.1.48)、シスタチオニンγ−シンターゼ(EC2.5.1.48)、シスタチオニンβ−リアーゼ(EC4.4.1.8)、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(EC2.5.1.49)、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ(EC2.1.1.10)、またはそれらの任意の組み合わせを発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよい。
例えば、アスパルトキナーゼを発現または過剰産生させるために、E.coli(thrA)、E.coli(metL)、E.coli(lysC)、Corynebacterium glutamicum(lysC)由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性アスパルトキナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのアスパルトキナーゼポリペプチドは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032(Genbankアクセッション番号CAF18822.1)、Methanococcus maripaludis S2(Genbankアクセッション番号CAF30573.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbankアクセッション番号AFD00291.1)、Methanobrevibacter ruminantium M1(Genbankアクセッション番号ADC47522.1)、E.coliK−12亜株W3110 thrA(GenBankアクセッション番号BAB96579.2);E.coli K−12亜株W3110 metL(GenBankアクセッション番号BAE77370.1);E.coli K−12亜株W3110 lysC(GenBankアクセッション番号BAE78026.1)に由来する。
いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、E.coli K−12亜株W3110由来のthrA、metLまたはlysCのアミノ酸配列に基づくものである。W3110は、それぞれGenbankアクセッション番号BAB96579.2、BAE77370.1またはBAE78026.1に示される配列またはその機能的フラグメントと少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、Genbankアクセッション番号BAB96579.2、BAE77370.1もしくはBAE78026.1に示されている配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸位置G330、S345、S352及びG433のうちのいずれか1つ以上の位置において変異されている(例えば、アスパラギン酸、フェニルアラニンまたはアルギニンに)E.coliThrAタンパク質(GenBankアクセッション番号BAB96579.2)であるか、またはアミノ酸位置T342において変異されている(例えば、イソロイシンに)E.coli LysCタンパク質(GenBankアクセッション番号BAE78026.1)である。
特定の実施形態では、アスパルトキナーゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032またはMethanococcus maripaludis S2のアミノ酸配列に基づくものであり、かつそれぞれGenbankアクセッション番号CAF18822.1またはCAF30573.1に示される配列またはその機能的フラグメントと、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるアスパルトキナーゼは、Genbankアクセッション番号CAF18822.1、CAF30573.1、AFD00291.1もしくはADC47522.1に示されている配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルトキナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルトキナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現または過剰産生させるために、Corynebacterium glutamicum(asd)またはEscherichia coli K12(asd)由来の1つ以上の遺伝子を水素資化微生物(例えばメタン生成菌)に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032(Genbankアクセッション番号CAA40504.1)またはE.coli K12(Genbankアクセッション番号CAA23511.1)由来である。
特定の実施形態では、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032またはE.coli K12のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれ、Genbankアクセッション番号CAA40504.1またはCAA23511.1に示される配列、またはその機能的フラグメントに対して、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Genbankアクセッション番号CAA40504.1もしくはCAA23511.1に示される配列に対して宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のアスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、ホモセリンデヒドロゲナーゼを発現または過剰産生させるために、Corynebacterium glutamicum(hom)またはMethanococcus maripaludis(hom)由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性ホモセリンデヒドロゲナーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032(Genbankアクセッション番号BAB98576.1)、Methanococcus maripaludis S2(Genbankアクセッション番号CAF31258.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbankアクセッション番号AFD00624.1)またはMethanobrevibacter ruminantium M1(Genbankアクセッション番号ADC46990.1)に由来する。
特定の実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032またはMethanococcus maripaludis S2のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれGenbankアクセッション番号BAB98576.1またはCAF31258.1に示されている配列またはその機能的フラグメントと、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるホモセリンデヒドロゲナーゼは、Genbankアクセッション番号BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1もしくはADC46990.1に示されている配列に対して宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンデヒドロゲナーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼを発現または過剰産生するために、Corynebacterium glutamicum(metX)またはMethanothermobacter thermautotrophicus(metX)由来の1つ以上の遺伝子を水素資化微生物(例えばメタン生成菌)に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生する。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドは、Corynebacterium glutamicumのATCC13032(Genbankアクセッション番号AAC06035.1)またはMethanothermobacter thermautotrophicus ATCC 29096(Genbankアクセッション番号AAB86286.1)由来である。
特定の実施形態では、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032またはMethanothermobacter thermautotrophicusのアミノ酸配列に基づき、かつ、それぞれGenbankアクセッション番号AAC06035.1またはAAB86286.1に示される配列またはその機能的フラグメントと少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによりコードされるホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼは、Genbankアクセッション番号AAC06035.1もしくはAAB86286.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼを発現または過剰産生させるために、Escherichia coli(metA)またはCampylobacter jejuni(metA)由来の1つ以上の遺伝子を水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼまたはその機能的フラグメントを産生するか、または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼポリペプチドは、Escherichia coli K12株(Genbankアクセッション番号CAA32654.1)またはCampylobacter jejuni株NCTC11168(Genbankアクセッション番号CAL35820.1)由来である。
特定の実施形態では、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032またはMethanococcus maripaludis S2のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれGenbankアクセッション番号BAB98576.1、またはCAF31258.1に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによりコードされるホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼは、Genbankアクセッション番号BAB98576.1、CAF31258.1、AFD00624.1もしくはADC46990.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、O−スクシニルホモセリンリアーゼを発現または過剰産生させるために、Escherichia coli(metB)またはHelicobacter pylori(metB)由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して、発現させるかまたは過剰発現させてもよく、それにより、外因性O−スクシニルホモセリンリアーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用するためのO−スクシニルホモセリンリアーゼポリペプチドは、Escherichia coli K12株(Genbankアクセッション番号AAA24167.1)またはHelicobacter pylori ATCC 700392株(Genbankアクセッション番号AAD07176.1)由来である。
特定の実施形態において、O−スクシニルホモセリンリアーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Escherichia coliまたはHelicobacter pyloriのアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれGenbankアクセッション番号AAA24167.1またはAAD07176.1に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたO−スクシニルホモセリンリアーゼは、Genbankアクセッション番号AAA24167.1もしくはAAD07176.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのO−スクシニルホモセリンリアーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のO−スクシニルホモセリンリアーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
例えば、シスタチオニンβ−リアーゼを発現または過剰産生させるために、Corynebacterium glutamicum(metC)またはEscherichia coli(metC)由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)に導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性シスタチオニンβ−リアーゼまたはその機能的フラグメントを産生するか、または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法における使用のためのシスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドは、Corynebacterium glutamicum(Genbankアクセッション番号AAK69425.1)またはEscherichia coli(Genbankアクセッション番号AAA24158.1)由来である。
特定の実施形態では、シスタチオニンβ−リアーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicumまたはEscherichia coliのアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれGenbankアクセッション番号AAK69425.1またはAAA24158.1に示される配列、またはその機能的なフラグメントと、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるシスタチオニンβ−リアーゼは、Genbankアクセッション番号AAK69425.1もしくはAAA24158.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのシスタチオニンβ−リアーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のシスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
特定の実施形態では、水素資化微生物は、直接、HSなどの硫黄源をメチオニン生合成経路に直接組み込んでもよい。水素資化微生物によって産生されるか、または水素資化微生物による使用のために存在する任意の硫化物は、ホモシステイン生合成経路に入ってもよく、ここでO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼがO−アセチルホモセリンにHSを取り込んでホモシステインを産生し、これはメチオニンシンターゼによってメチオニンにさらに変換されてもよい(コバラミン依存性または非依存性)。
例えば、本明細書中に記載されるような水素資化微生物を遺伝子操作して、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(EC2.5.1.49)を発現または過剰産生してもよく、これは、HSをO−アセチル−ホモセリンに組み込んで、ホモシステインを産生してもよく、必要に応じて遺伝子操作して、コバリン依存性メチオニンシンターゼ(EC2.1.1.13)またはコバリン非依存性メチオニンシンターゼ(ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても知られている)(EC2.1.1.14)を発現または過剰産生して、ホモシステインをメチオニンに変換してもよい。
O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生させるために、本開示の水素資化微生物(例えば、非天然または組み換えのメタン生成物)に、Methanocella conradiiまたはMethanobrevibacter ruminantium由来の遺伝子に基づく1つ以上の遺伝子を導入して、発現させるかまたは過剰発現させ、それによって外因性O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法において使用するためのO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは、Methanocella conradii HZ254(Genbankアクセッション番号AFD00350.1)、Methanobrevibacter ruminantium M1(Genbankアクセッション番号ADC47419.1またはADC46998.1)、Clostridium difficile T19(Genbankアクセッション番号ERM48664.1)、Clostridium botulinum A株、ATCC3502(Genbankアクセッション番号CAL83417.1)、Leptospira meyeri(Genbankアクセッション番号P94890.1)、またはRhodobacter sphaeroides 2.4.1(Genbankアクセッション番号YP_351901.2)由来であり得る。
特定の実施形態において、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Methanocella conradii HZ254またはMethanobrevibacter ruminantium M1のアミノ酸配列に基づき、かつそれぞれGenbankアクセッション番号AFD00350.1またはADC47419.1に示される配列、またはその機能的なフラグメントに対して少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされたO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、Genbankアクセッション番号AFD00350.1、ADC47419.1、ADC46998.1、CCL83415.1、もしくはCAL83417.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
任意の前述のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼにおいて、非自然または組み換えの水素資化微生物は、本明細書に記載のように、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに遺伝子操作される。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の水素資化微生物は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼ(EC2.1.1.13)またはコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(ホモシステインメチルトランスフェラーゼとしても知られる)(EC2.1.1.14)を発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよく、必要に応じてまた、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現または過剰産生するように遺伝子操作されてもよい。
例えば、コバラミン依存性メチオニンシンターゼを発現または過剰産生させるために、Escherichia coli(metH)、Corynebacterium glutamicum(metH)、またはClostridium difficile由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、非自然のメタン資化細菌)に導入して、発現するかまたは過剰発現させ、それによって、外因性コバラミン依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生してもよい。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法での使用のためのコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、Escherichia coli K−12亜株MG1655(Genbankアクセッション番号AAC76832.1)、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032(Genbankアクセッション番号BAB98900.1)、Clostridium difficile F665(Genbankアクセッション番号ERM51559.1)、またはPsuedomonas putida GB−1(Genbankアクセッション番号ABY97885.1)由来である。
特定の実施形態では、コバラミン依存性メチオニンシンターゼアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のアミノ酸配列に基づき、かつGenbankアクセッション番号BAB98900.1に示される配列に対して少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、Genbankアクセッション番号AAC76832.1、BAB98900.1、ERM51559.1もしくはABY97885.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのコバラミン依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のコバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
他の実施形態では、例えば、メチオニンシンターゼを発現または過剰産生するために、Escherichia coli(metEまたはmetB12)、Corynebacterium glutamicum(metE)またはMethanococcus maripaludis(metE)由来の1つ以上の遺伝子を、水素資化微生物(例えば、非自然のまたは組み換えメタン生成菌)に導入して発現または過剰発現させ、それにより、外因性コバラミン非依存性メチオニンシンターゼまたはその機能的フラグメントを産生または過剰産生させてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に使用するためのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドは、Escherichia coli K−12亜株MG1655(Genbankアクセッション番号AAC76832.1)、Corynebacterium glutamicum ATCC13032(Genbankアクセッション番号CAF19845.1)、Methanococcus maripaludis S2(Genbankアクセッション番号NP_987521.1)、Methanocella conradii HZ254(Genbankアクセッション番号AFD00421.1)またはMethanobrevibacter ruminantium M1(Genbankアクセッション番号ADC47470.1)に由来する。
特定の実施形態では、コバラミン非依存性メチオニンシンターゼのアミノ酸配列またはその機能的フラグメントは、Methanococcus maripaludis S2またはMethanobrevibacter ruminantium M1のアミノ酸配列に基づくものであり、かつ、それぞれGenbankアクセッション番号NP_987521.1またはADC47470.1に示されている配列またはその機能的フラグメントと少なくとも75%、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一である。他の実施形態では、組み換えによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼは、Genbankアクセッション番号AAC76832.1、CAF19845.1、NP_987521.1、AFD00421.1もしくはADC47470.1に示される配列に対して、宿主細胞にとってコドン最適化されているか、もしくは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこれらのコバラミン非依存性メチオニンシンターゼのコンセンサス配列を含むか、または複数の公知のコバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドのコンセンサス配列を含む。
上記メチルトランスフェラーゼの実施形態のいずれにおいても、非自然または組み換えの水素資化微生物は、本明細書に記載されるように、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現、過剰発現または過剰産生するようにさらに遺伝子操作される。
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanocella、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、MethanothermusまたはMethanotorrisなどのメタン生成古細菌である水素資化微生物を提供する。
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、特定のメタン生成古細菌種である水素資化微生物を提供する。例示的なメタン生成古細菌種は、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、Methanocella paludicola、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii及びMethanocaldococcus vulcaniusなどである。
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、シトクロムを産生するか、またはシトクロムを産生しないメタン生成古細菌を含む水素資化微生物を提供する。シトクロムを産生しない例示的なメタン生成古細菌としては、Methanococcus maripaludisまたはMethanococcus vannieliiが挙げられる。シトクロムを産生する例示的なメタン生成古細菌は、Methanosarcina barkeriまたはMethanosarcina mazeiである。
/CO基質
水素産生は、一連の改質、コンディショニング及び分離ステップを含み、ここで、これらのステップのいくつか(例えば、水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト、COスクラビング及び圧力スイング吸着)は、それ自体で、または1つ以上の他のガス流と組み合わさって、本開示の水素資化微生物及び方法の原料として有用なH/CO基質を提供し得る、原料を提供し得る。特定の実施形態では、本開示の微生物は、必要に応じてHの存在下でCO基質を利用し得る。
背景として、水素産生は、高温水性ガスシフト(HTS)反応、低温水性ガスシフト(LTS)反応またはそれらの両方と組み合わせて、合成ガスなどのH/CO基質を産生するための単一ステップまたはマルチステップの改質、部分酸化またはガス化を含んでもよい。いくつかの方法では、分子篩と共に圧力スイング吸着(PSA)を使用することによって、酸化炭素を除去し、それによって、様々な量の二酸化炭素(CO)、一酸化炭素(CO)及びメタン(CH)と一緒にいくらかの残留Hガスを含むテールガスから、実質的に純粋な水素(H)ガス流が分離される。特定の実施形態では、ガス(例えば、合成ガス)をPSAに供する前に、二酸化炭素を必要に応じてスクラブしてもよい。使用される合成ガス産生プロセス、及び二酸化炭素がスクラブされる否かに応じて、テールガスは、様々な比のH、CO、CO及びCHを含むであろう。いくつかの実施形態では、本開示の方法に使用するためのH/CO基質は、PSAテールガス及びHガスの混合物を含むガス流混合物である。
例えば、HTSと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、いくらかのCH(約5%)及びごくわずかのCOまたはCOなしの状態で、主にH(約75%)及びCO(約20%)を有するガス流を産生するであろう。別の例では、LTSと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、ある程度のCO(約5%)及びCH(約1%)と共に、主にH(約75%)及びCO(約10%)を有するガス流を産生するであろう。なお別の例では、HTS及びPSAと組み合わせたメタンの水蒸気改質は、かなりの量のCO(約10%)及びCH(約15%)と共に、主にH(約30%)及びCO(約45%)を有するテールガスを産生するであろう。この最後の実施形態では、COスクラビングのステップが含まれる場合、テールガスは、わずかなCO(約1%)と共に、主にH(約50%)、CH(約30%)及びCO(約20%)を含むであろう。特定の実施形態では、PSAテールガスを、PSAから産生されるパイプラインHと混合して、目的のH/CO基質、例えば約5:1、4:1、3:1、2:1または1:1のH:CO比を有するH/CO基質を産生する。
メタンの水蒸気改質は、それぞれ約1:7〜約1:15の範囲のCOとHとの原料比を提供し得、ここで他の成分は、CO、CH及びHOを含んでもよい。あるいは、メタンは、COで改質されてもよく、これは、乾燥改質と称される。メタンの乾燥改質は、それぞれ約1:5〜約1:15の範囲のCOとHとの原料比を提供し得、ここで他の成分は、CO、CH及びHOを含んでもよい。
部分酸化改質(接触または非接触)及び自己熱改質は、水の代わりに天然ガスの共反応物質として酸素を使用する。部分酸化改質及び自己熱改質は、約1:20であるCOとHとの原料比を提供し得、ここで他の成分は、CO、CH及びHOを含んでもよい。
ガス化、すなわち、空気または酸素を有する材料(例えば、天然ガス液、ナフサ、ビチューメン、石炭、バイオマスなど)を含有する炭素の部分酸化は、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのH/CO原料を提供し得る。例えば、石炭のガス化は、それぞれ約1:1.1〜約1:11の範囲のCOとHとの原料比を提供し、ここで他の成分は、CO、CH、N及びHOを含んでもよい。
アンモニア合成は、一連の改質及びコンディショニングステップを含み、これらのステップの4つ(水蒸気改質、自己熱改質、高温シフト、低温シフト)は、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのH/CO原料を提供し得る。これらの異なる各プロセスでは、それぞれ約1:3〜約1:10の範囲のCOとHとの原料比が提供され、ここで他の成分は、CO、CH、N及びHOを含んでもよい。
メタノール合成は、低温改質、水蒸気改質及び自己熱改質というステップを含み、これらはすべてが、本開示の水素資化微生物及び方法と共に使用するためのH/CO原料を提供し得る。これらの3つの各プロセスでは、それぞれ約1:7〜約1:12の範囲のCOとHとの原料比がもたらされ、ここでは、他の成分は、CO、CH及びHOを含んでもよい。
総合製鋼所は、コークス炉(石炭からコークスを作るため)、高炉(銑鉄を作るため)及び酸素炉(鋼を作るため)を含む様々なプロセスを組み合わせる。特定の実施形態では、総合製鋼所における直接還元は、銑鉄を作るための還元剤として(コークスの代わりに)改質天然ガスを使用する。これらの各炉及び直接還元改質(炉頂ガスを産生する)は、それぞれ約8:1(高炉または酸素炉から)〜約1:32(コークス炉から)の範囲のCOとHとの原料比を生じ得、ここで他の成分は、CO、CH、C、C、N及びHOを含んでもよい。
/CO基質の任意の上述の供給源において、このようにして産生されたH/CO原料を、任意の他の産生されたH/CO原料、またはH、CO、COもしくはそれらの任意の組み合わせと混合して、目的のH/CO基質、例えば約4:1または3:1のH:CO比を有する基質を産生してもよい。特定の実施形態では、例えば、メタン生成菌と共に使用するためのH/CO基質は、約5:1、4:1、3:1、2:1または1:1のH:CO比を含み、必要に応じて、COの総量は、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10%、11%、12%、13%、14%、15%または20%以下である。他の実施形態では、例えば、Clostridiumと共に使用するためのH/CO基質は、約5:1、4:1、3:1、2:1または1:1のH:(CO+CO)比を含み、必要に応じてCOの総量は、少なくとも約1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える。任意のこれらの実施形態において、H/CO基質は、PSAテールガスとHガスとの混合物を含んでもよい。
上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、Hと、COまたはCOまたはそれらの両方と、必要に応じて本明細書に記載される様々な他の成分とからなるH/CO基質を利用、代謝、酸化または変換する水素資化微生物を提供する。特定の実施形態では、H/CO基質は、H、CO及びCO(COがCOよりも多い)であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。さらなる実施形態では、H/CO基質は、H、CO及びCO(COがCOよりも多い)であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。なおさらなる実施形態では、H/CO基質は、H、CO及びCO(COがCO及びHの両方よりも多い)であり、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。特定の状況では、H/COを代謝する微生物は、エネルギー源としてH及び炭素源としてCO(xは1または2である)を使用し得、またはエネルギー源としてH及びCOならびに炭素源としてCOを使用し得る。
任意の上述の非自然または組み換えの水素資化微生物の実施形態において、本開示は、H/CO基質を提供し、これは例えば、天然ガスもしくは液体炭化水素(例えば、エタン、プロパン、ナフサ)の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素産生において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生されてもよい。特定の実施形態では、任意の上述の改質方法によって産生されるH/CO基質は、水性ガスシフト反応によってさらにコンディショニングされ得る。加えて、任意の上述の方法によって産生される1つ以上のガス流を、水素、一酸化炭素または二酸化炭素の他の供給源と混合して、H/CO基質を産生または作製してもよく、これにはパイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスを含む。いくつかの実施形態では、COとHの原料比は、それぞれ約1:50〜約10:1の範囲である。さらなる実施形態では、COとHとの原料比は、それぞれ約1:3〜約1:5の範囲である。
培養方法
様々な培養方法が、本明細書に記載される非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、細菌、メタン生成古細菌)のために使用され得る。例えば、バッチ培養または連続培養法によって、水素資化微生物を増殖させてもよい。特定の実施形態では、制御培養ユニット、例えば発酵槽、バイオリアクター、中空繊維膜バイオリアクター、気泡塔バイオリアクター、トリクルベッドバイオリアクターなどで、培養物を増殖させる。
古典的なバッチ培養法は、培地の組成を培養開始時に設定し、培養プロセス中に外部改変を受けない閉鎖系である。したがって、培養プロセス開始時に、所望の水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を培地に接種し、いかなる物質もこの系に追加せずに増殖または代謝の活動を生じさせる。一般に、「バッチ」培養は、炭素源、ガス原料及び培地成分の追加に関してバッチであり、廃ガスが排出可能であり、pHなどの他の因子の制御の試みが多くの場合に行われる。バッチシステムでは、システムの代謝産物及びバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的な遅滞期から高度の対数増殖期へ、そして最終的には増殖速度が低下または停止する静止期へと穏やかになる。未処置の場合、静止期の細胞は、最終的に死滅するであろう。対数成長期の細胞は、多くの場合、いくつかのシステムにおいて最終生成物または中間体の大量産生を担う。他のシステムでは、静止期または対数期後の産生が得られ得る。
流加(Fed−Batch)システムは、標準的なバッチシステムの変形である。流加培養プロセスは、培養が進行するにつれて基質及び潜在的な培地成分が漸増量で追加される改変型のバッチシステムを含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、及び培地中の基質の量を制限することが望ましい場合、流加システムが有用である。ガス基質の発酵では、システムは、(廃ガスを除去し得るので)ガス基質に関して連続的であり、流加は液体(培地)に関して連続的である。バッチ培養法及び流加培養法は一般的であり、当該技術分野で公知である(例えば、Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA;Deshpande,Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,1992を参照のこと)。
連続培養は、所定の培養培地をバイオリアクターに連続的に追加し、かつ同時に、処理のために(バイオマスまたは細胞の保持の有無にかかわらず)同量の馴化培地を除去する「開放」系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、連続培養は、原料及び栄養素を連続的に追加し、かつ有益な生成物、副生成物及び廃棄物を細胞集団から連続的に取り出し得る、バイオマス、細胞保持または細胞固定化を含んでもよい。細胞保持は、様々な方法によって、例えば、ろ過、遠心分離または沈降によって実施してもよい。細胞固定化は、天然材料及び/または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して実施してもよい。
連続培養または半連続培養によって、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす1つの因子または任意の数の因子の調節が能になる。例えば、1つの方法は、限られた栄養素(例えば、炭素源、窒素レベル、水素レベル、リンレベル)を一定の比に維持して、他のすべてのパラメータの調節を可能にし得る。他のシステムでは、成長に影響を及ぼす多くの因子を連続的に改変し得る一方、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持する。特定の実施形態では、水素資化生物のバイオマス成長を制限して、生成物対バイオマスの比を増大させる。連続培養プロセスのための栄養素及び成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化にするための技術は、当該技術分野で周知である(Brock,1989を参照のこと)。
液相バイオリアクター(例えば、撹拌タンク、充填層、一液相、二液相、中空糸膜)は当該技術分野で周知であり、水素資化微生物の成長に使用され得る。
多相バイオリアクターを、本開示の方法に使用してもよい(例えば、気泡塔反応器、トリクルベッド反応器(固定床または充填床)、流動床反応器)。気泡塔は、ガスが泡形態で液体と接触するデバイスである。トリクルベッド反応器は、培養物を成長させるために、並流または向流の気体及び液体を使用する。流動床反応器は、固体を懸濁してそれを液体のように作用させるために十分な高速で、流体(気体または液体)を粒状固体材料に通過させることを含む。多相バイオリアクターの目的の1つは、液相及び気相を混合することであり、ここでは、物質移動及び化学反応の強さに応じて、気体は水素資化微生物によって、より多い程度またはより少ない程度まで消費される。様々な種類の多相バイオリアクターが当該技術分野で周知であり、かつ本開示の方法において水素資化微生物の成長に使用され得る。
本開示に記載される水素資化微生物を、単離された純粋な培養物として、成長を支援し得る異種非水素資化微生物と共に成長させてもよいし、または1つ以上の異なる株もしくは種の水素資化微生物と組み合わせて混合培養物を生成してもよい。
他の態様では、本開示は、メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を産生するための方法であって、1つ以上のメチオニンを産生するために十分な時間にわたって、上述の非自然または組み換えの水素資化微生物のいずれかを培養することを含み、前記非自然または組み換えの水素資化微生物が:(a)親の水素資化微生物と比較して増大した活性を有する1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現し;(b)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現し;または(c)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドの改変された調節を含み、ここでこの非自然の水素資化微生物が、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを産生する方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を作るためのプロセスであって、硫黄同化ポリペプチド由来のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にするために十分な条件下及び時間にわたって、H/CO基質の存在下で、本開示の組み換えのメチオニン排出水素資化微生物を培養するステップを含み、ここでメチオニンが、親の水素資化微生物によって産生されるメチオニンよりも高レベルで培養培地中に産生されて蓄積するプロセスを提供する。
任意の上述の方法において、発酵槽またはバイオリアクター、例えば液相バイオリアクター、気泡塔バイオリアクターまたはトリクルベッドバイオリアクター中で、水素資化微生物を培養してもよい。
非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、ガス原料は、H/CO基質であり、ここでこの原料は、HとCOまたはCOまたはそれらの両方を含み、本明細書に記載される様々な他の成分を必要に応じて含む。特定の実施形態では、H/CO基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは液体炭化水素の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成によって、メタノール合成によって、製鋼によって、または石炭、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生される合成ガスなどの合成ガスである。
非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、ガス基質は、H/CO基質であり、これは、例えば、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素(例えば、エタン、プロパン、ナフサ)の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、水素産生において、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生され得る。特定の実施形態では、H/CO基質は、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上の他の供給源を使用してこのようにして産生された任意のガス流の混合物であり、これには、パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガスまたは塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む。
非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述の方法において、培養される水素資化微生物は、メタン生成古細菌、例えば、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanocella、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、MethanothermusまたはMethanotorrisである。
特定の実施形態では、非自然または組み換えの水素資化微生物は、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、Methanocella paludicola、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii及びMethanocaldococcus vulcaniusであってもよい。
任意の上述の方法では、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を、親の微生物と比較して、増強したレベルでメチオニンを産生するように遺伝子操作してもよい。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作された水素資化微生物は、CO基質の存在下で、必要に応じてHの存在下で、同じ条件(例えば、血清チューブまたはバイオリアクター)下で培養された場合に、親の水素資化微生物によって産生されるレベルより少なくとも約10%高いレベル、または親の水素資化微生物によって産生されるレベルの少なくとも約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約15倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約500倍または約1000倍のレベルでメチオニンを産生する。他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された水素資化微生物は、同じ培養条件下で親の水素資化微生物によって産生されるよりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%少なくとも約85%、少なくとも約90%のレベルで、または少なくとも約95%大きいレベルでメチオニンを産生する。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるような、CO基質を、必要に応じてHの存在下でメチオニンに変換する方法は、培養物1Lあたり約0.001g〜培養物1Lあたり約500gでメチオニンを産生する。いくつかの実施形態において、生成されるメチオニンの量は、培養物1Lあたり約1g〜約100gである。さらなる実施形態において、生成されるメチオニンの量は、約0.001g/L、0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/L、または500g/Lである。
なおさらなる実施形態では、CO基質を、本明細書で提供されるように、必要に応じてHの存在下で、メチオニンに変換するための方法は、1日あたり少なくとも約または最大約1キログラム(kg)、少なくとも約または最大10kg、少なくとも約または最大100kg、少なくとも約または最大1,000kg、少なくとも約または最大10,000kg、少なくとも約または最大50,000kg、少なくとも約または最大100,000kg、少なくとも約または最大250,000kg、少なくとも約または最大500,000kgまたはそれを超えるメチオニンを産生するであろう。特定の実施形態では、メチオニンは、約100,000メートルトン(MT)/年(すなわち、1億kg/年または300,000kg/日)、約75,000MT/年(または225,000kg/日)、約50,000MT/年(または150,000kg/日)、約25,000MT(または75,000kg/日)または約10,000MT/年(または30,000kg/日)で産生される。
メチオニンを作るためのシステム
さらなる態様では、本開示は、メチオニンを産生するためのシステムであって、H/CO基質を含むガスの供給源と;(a)親の水素資化微生物と比較して活性が増大している1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現するか;(b)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現するか;または(c)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドの改変された調節を含む、上述の非自然または組み換えの水素資化微生物のうち任意の1つ以上を含むバイオリアクターと;このバイオリアクターへのガスの流入を可能にするように、このガス供給源とバイオリアクターとの間に配置されたコネクターとを備え、ここで非自然の水素資化微生物が、親の水素資化微生物と比較して、前記H/CO基質を代謝して1つ以上のメチオニン経路のアミノ酸を過剰産生するシステムを提供する。
任意の上述のシステムにおいて、H/CO基質は、生物学的材料、例えば動物飼料または肥料に変換される。特定の実施形態では、H/CO基質は、メチオニンが豊富な生物学的材料に同化される。さらなる実施形態では、得られたメチオニンは精製され、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントとして使用される。また他の実施形態では、メチオニンが豊富なバイオマスは、動物飼料、食品添加物または栄養サプリメントに使用される。
非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述のシステムにおいて、ガス原料は、H/CO基質であり、ここでこの原料は、HとCOもしくはCOまたはそれらの両方とを含み、かつ必要に応じて本明細書に記載される様々な他の成分を含む。特定の実施形態では、H/CO基質は、水性ガスシフト反応によってコンディショニングされた、天然ガスもしくは軽質炭化水素(例えば、エタン、プロパン、ナフサ)の水蒸気改質、乾燥改質、自己熱改質、接触部分酸化もしくは部分酸化によって、アンモニア合成において、メタノール合成において、製鋼によって、または石炭、ナフサ、残油、バイオマスもしくは廃棄物のガス化によって産生される合成ガスなどの合成ガスである。特定の実施形態では、H/CO基質は、パイプライン水素、パイプライン二酸化炭素、二酸化炭素スクラバーオフガス、煙道ガス、エタンクラッカーオフガス、リフォーマーオフガス 塩素合成オフガスまたはそれらの任意の組み合わせを含む、水素、一酸化炭素、二酸化炭素またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上の他の供給源を使用して、このようにして産生された任意のガス流の混合物である。
非自然または組み換えの水素資化微生物(例えば、メタン生成菌)を使用して本明細書に開示されるメチオニンを産生するための任意の上述のシステムにおいて、培養される水素資化微生物は、メタン生成古細菌、例えば、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanocella、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、MethanothermusまたはMethanotorrisである。
特定の実施形態では、非自然または組み換えの水素資化微生物は、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、Methanocella paludicola、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii及びMethanocaldococcus vulcaniusであってもよい。
任意の上述のシステムにおいて、水素資化微生物は、中温菌、好熱菌、超好熱菌またはそれらの組み合わせである。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性嫌気性生物または通性嫌気性生物である。任意の上述の方法において、水素資化微生物は、偏性水素資化生物または通性水素資化生物である。
実施例1
Methanococcus maripaludisのエチオニン耐性変異体の産生
メチオニン産生は、特にフィードバック阻害によって、微生物において高度に調節される。細菌または古細菌をDL−エチオニンのような毒性のあるメチオニンアナログに曝露すると、毒素類似体の存在下で増殖することができる変異体として特定される、メチオニンフィードバック阻害で変異した細胞が得られる(例えば、Kumar et al.,Biotechnology Advances 23:41〜61、2005を参照のこと)。表1は、野生型と比較したその遺伝的背景とともに、作製された生物体のリストを示しており、これには本明細書に記載された実験で使用されたものを含む。
エチオニン耐性M.manpaludis変異体の単離
エチオニン耐性変異体を生成するために、Trel10−333UR−ΔdA(リシンフィードバック耐性lysC及びdapA欠失を含むM.maripaludis S2、表1)を、37℃で、100mg/Lのリシンを補充したカザミノ酸を含まない25mLのMcCas培地中で約0.50のOD600になるまで増殖させ(Sarmiento et al.,Methods Enzymol.494:44、2011、これは培地McCVについて述べており、カザミノ酸または酵母抽出物なしで、本明細書で使用される)、次いで、2つの嫌気的Balchチューブ(各5mLの培養液)に分注して、1本のチューブに0.3mLの変異原メタンスルホン酸エチル(EMS、McCas no Casで1:50希釈)、もう一方のチューブに0.3mLのMcCas no Cas単独を対照として与えた。チューブをH/COの80/20混合物で40PSIGに加圧し、振盪せずに37℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーションの後、圧力を解放して、各チューブから0.5mLの培養物を取り出し、McCas寒天プレート上にプレートして殺傷率を決定した。
培養物の残りを洗浄してEMSを除去し、次いで1000gで15分間遠心分離し、上清を除去し、ペレット化した細胞を1mLのMcCas no Cas中に再懸濁し、最後に再び1000gで15分間遠心分離することによって洗浄した。この洗浄を2回繰り返してEMSを除去した。最終洗浄後、採取した細胞を500μLのMcCas no Casに懸濁して、100μlを、5mLのMcCas no Cas+100mg/Lのリシン(EMS処理したもの)を含む3本のBalchチューブに、または1本のチューブ(対照、未処理)に移して回収した。各チューブに2.5%のNaS×9HOを0.1mL添加し、次いで各チューブを80/20H/COで40PSIGに加圧し、37℃で一晩回復させた。翌朝、各培養物を遠心分離により0.1mLまで濃縮して、100mg/Lのリシン及び3g/Lのエチオニンを含むMcCas no Casプレート上にプレートした。このプレートを37℃で、80/20のH/COガス混合物の10PSIGを含むOxoid嫌気性ジャー中でインキュベートした。エチオニン選択によって、EMSに曝露された培養物からのみ生育したコロニーが生じた。すべての作業は、別段明記しない限り、嫌気性条件下で行った。
個々のプレートからの5つのコロニーを、HPLC分析のために選択してメチオニン産生を測定した。要するに、Methanococcus maripaludis組換え体を、ピューロマイシン(2.5mg/L)を補充したBalchチューブ内の5mlのMcCAS培地で増殖させ、一晩振盪しながら、H:CO(4:1)を使用して37℃で40psiまでガス化した。2日目に100μlの一晩培養物を、種培養物として使用して、Balchチューブまたは100mlの血清培地に5mlの最少培地(MM)を接種し、H:CO(4:1)で、それぞれ40及び20psiの圧量までガス化した。この培養物は、37℃で72時間振盪しながら置いた;H:CO(4:1)ガスを培養開始時に全圧まで再充填した。発酵後、1.8mlの培養物をエッペンドルフチューブに移し、細胞を12,000×gで除去し、得られた上清を0.2μmのフィルターに通した。濾液をHPLCによりアミノ酸含量について分析した。必要に応じて、種子及び発酵培地にピューロマイシン(2.5mg/L)を補充してもよい。
エチオニン選択によって特定された5つのコロニーのうち、3つのコロニーは、HPLCによって分析したとき、メチオニン力価の増大を示した。増大したメチオニン力価を有する3つのコロニーを、エチオニン耐性変異体1.1、3.1、及び3.3(それぞれ、Trel10−333UR−ΔdA−erl.1、Trel10−333UR−ΔdA−er3.1及びTrel10−333UR−ΔdA−er3.3)と命名した。
エチオニン耐性Methanosarcina変異体の単離
エチオニン耐性Methanosarcina変異体を選択するために、変異誘発をTrel42(Methanosarcina acetivorans C2A、DSM 2834)またはTrel 9(Methanosarcina mazei GO1、DSM 3647)に対して行った。要するに、菌株を、25mLのMcCas培地+カザミノを含まない5G/Lのメタノール(培地の処方については、Sarmientoら、Methods Enzymol.494:44、2011;これは、培地McCVを述べており、ここでは、カザミノ酸も酵母抽出物もなしで使用している)、またはカシトン(Casitone)及び酵母なしのDSM120培地+5G/Lのメタノール中で、37℃で約0.50のOD600まで増殖させた。5mLの培養液を2つの嫌気性Balchチューブに分注した。一方のチューブに0.3mLのメタンスルホン酸エチル(EMS、McCas no Cas中の1:50希釈)を添加し、第2のチューブに0.3mLの培地を添加した(対照)。チューブを、37℃で振盪することなく、N2/CO 20 PSIGの80/20混合物と共に37℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーションの後、圧力を解放し、0.5mLの各チューブを取り出して、寒天プレート上にプレートして殺傷率を決定した。
残りの培養物を、1000×gで15分間遠心分離すること、上清を除去すること、及び5mLの培地に再懸濁することにより回収した細胞を洗浄することによって洗浄した。これらの収集及び洗浄のステップをさらに2回繰り返して、EMSのすべての痕跡を取り除いた。最後の洗浄の後、採取した細胞を5mLの培地に懸濁し、1mLを、5mLの培地を含む3つのBalchチューブに移して回収した。各チューブに0.1mLの2.5%NaS×9HOを添加し、次いで各チューブを80:20のN/COを使用して20PSIGまで加圧し、37℃で最低48時間回復させた。翌日、各培養物を遠心分離により1.0mLまで濃縮し、1.25mg/mLのエチオニン及び5g/Lのトリメチルアミンを含有する適切な培地の寒天プレート上にプレートするか、または0.4mg/mL〜1.6mg/mLの範囲のエチオニン濃度の液体培地中で富化させた。プレートする前に富化された培養物については、同じ濃度のエチオニンを含有する寒天プレート上にプレートする前に富化(濃縮)を2回行った。プレートを、37℃で、80:20のN/COガス混合物の10PSIGと共に、Oxoid嫌気性ジャー中でインキュベートした。選択は、EMS処理細胞を接種したプレート上でのみコロニーが生育するような選択であった。すべての作業は別段示さない限り、嫌気性条件下で行った。
変異誘発Methanosarcina acetivorans Trel42の3つのコロニーがエチオニン上で増殖し、これを血清ボトル発酵で試験した(実施例1に記載)。結果を以下の表3にまとめる。
実施例2
Methanococcus maripaludis及びMethanosarcina acetivoransのエチオニン耐性変異体
Methanococcus maripaludis:ゲノムDNAを、メチオニンを過剰産生するM.maripaludis変異体から、同様に、親の株S2(Trel10)から、Qiagen DNAeasy Blood&Tissue Kitを使用して、グラム陰性細菌のプロトコールに従って単離した。MMP1359−MMP1358オペロンの硫黄同化ORFのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅は、以下のプライマーを使用して行った:
1359seqF1(5’−CTATAGAACTAACCCAATG−3’;配列番号9)
1359seqR1(5’−GGTGTTGCAGATACTAT−3’;配列番号10)
1359SeqF3(5’−AGACTTGAACCTTTA−3’;配列番号11)
1359seqR3(5’−CGCCAAAATCTTCCCTGC−3’;配列番号12)。
これらの同じプライマーを、MMP1359−MMP1358オペロンのフォワード配列決定プライマー及びリバース配列決定プライマーとして使用して、これらのORFの完全な重複する配列範囲を得た。
変異体配列と親株及び以前に公表された配列とのBlast比較によって、メチオニンプロデューサーのMMP1359−MMP1358オペロンにおける2つの異なる変異が示された。Trel10−333UR−ΔdA−er1.1及びTrel10−333UR−ΔdA−er3.1は、MMP1358 ORFのヌクレオチド位置341にG−Aトランジションを有し、アミノ酸配列中にGl14E置換変異をもたらした。Trel10−333UR−ΔdA−er3.3は、ORF MMP1359の1315位にG−Aトランジションを有し、アミノ酸配列中にD439N置換変異をもたらした。MMP1359及びMMP1358のORFで特定された変異によって、これらの遺伝子は、メチオニンの生合成と関連し、かつメチオニンまたはS−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害を受ける可能性が高いことが示される。
Methanosarsina acetivorans:ゲノムDNAを、親株C2A(Trel42)を含む、各変異体から、Epicentre Masture Pure DNA精製キットを使用して単離し、ならびに推定のホモシステインシンターゼ遺伝子(ORF1821(配列番号29;配列番号30のアミノ酸配列)、及びTrel42中の1822及びTrel9中の関連のORF)を含有する領域をPCRによって増幅した。Trel42中の領域の増幅及び配列決定に使用したプライマーは以下のとおりであった:
C2A1821F(5’−GTATTGAATTGGCAAACT−3’;配列番号22)
C2A1821R(5’−ACCGGCTCAGACCCGGTG−3’;配列番号23)
C2A1821SEQ1(5’−GGAAAGAACTCGACGTGC−3’;配列番号24)
C2A1821SEQ2(5’−ACTGACATTCTTGATTATG−3’;配列番号25)
C2A1821SEQ3(5’−CTTGCAGCGCGCAGGCT−3’;配列番号26)
G/CからA/Tへのトランジションが、Trel42mut3において、ORF1821のヌクレオチド位置1466で見出された(配列番号31)。この変異は、ORF1821において489位置でのSからNへのアミノ酸変化を生じる(配列番号32)。
実施例3
水素資化微生物のLysC変異体
M maripaludisのフィードバック耐性lysC(アスパルトキナーゼ)変異体の単離については以前に記載されている。要するに、野生型Methanococcus maripaludisのTrel10を、カザミノ酸を含まない25mLのMcCas培地(培地処方については、Sarmiento et al.,Methods Enzymol.494:44、2011を参照のこと;これは、McCV培地を述べており、ここでは、カザミノ酸も酵母抽出物もなしで使用する)中で、37℃でOD600がほぼ0.20まで増殖させた。5mLの培養液を2つの嫌気性Balchチューブに分注した。一方のチューブには0.3mLのメタンスルホン酸エチル(EMS、McCas no Cas中の1:50希釈)を添加し、第2のチューブには0.3mLのMcCas no casを添加した(対照)。チューブをH/COの80/20混合物で40PSIGに加圧し、37℃で1時間振とうせずにインキュベートした。インキュベーションの1時間後、圧力を解放し、各チューブの0.5mLを取り出し、McCas寒天プレート上にプレートして、殺傷率を決定した。
残りの培養液を、5(EMS処理)または2(対照)の1.5滅菌嫌気性微量遠心チューブに分注し、1000gで15分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、1mLのMcCas no Casに再懸濁すること、そして再び1000gで15分間遠心分離することによって洗浄した。この洗浄を2回繰り返して、EMSのすべての痕跡を取り除いた。最後の洗浄の後、採取した細胞を200μLのMcCas no Cas中に懸濁し、回収のために5mLのMcCas no Casに移した。1mLの2.5%NaS×9HOを各チューブに添加し、各チューブを80/20のH/COで40PSIGまで加圧し、37℃で一晩回復させた。翌朝、各培養物を遠心分離により0.1mLまで濃縮し、0.1Mのトレオニン及び0.02MのAECを含むMcCas no Casプレート上にプレートした。プレートを、37℃で80/20のH/COガス混合物の10PSIGを含むOxoid嫌気性ジャー中でインキュベートした。選択は、EMS処理細胞を接種したプレート上でのみコロニーが生育するような選択であった。すべての作業は、別段示さない限り、嫌気性条件下で行った。
G333R変異(Corynebacterium glutamicum ATCC13032のLysCアミノ酸位置G277に対応する)を有する、EMS生成lysC変異体Trel10−Mut333の増殖速度は、リシン及びトレオニンの存在下で増殖させた場合には影響を受けない(OD600は37℃で72時間のインキュベーション時間後に測定した;データは示さず)、換言すれば、Trel10−Mut333の変異したアスパルトキナーゼは、リシン及びトレオニンによるフィードバック阻害を受けない。Trel10−Mut333変異体によって産生されたアスパラギン酸経路のアミノ酸は、HPLCによって特定した(データは示していない)。誘導体化剤オルトフタルアルデヒド(OP A)を、オートサンプラー上の自動誘導体化反応に使用し、プレカラムを行った。反応混合物をpH10.2(ホウ酸塩緩衝液を介して)で緩衝し、酸加水分解タンパク質/ペプチドサンプルの直接誘導体化を可能にした。目的のアミノ酸を、最初に3−メルカプトプロピオン酸(3−MPA)を用いてOPAと反応させた。インドールへの3−MPAの取り込みはそれらの疎水性を低下させ、結果として、OPA誘導体はクロマトグラフィーで溶出された。親の株と比較したTrel10−Mut333変異体の産生プロファイルは、以下のとおりであった(そして、一般には、特定した全ての変異体で同様(データ示さず)):アラニン(5mg/L)、リシン(8mg/L)、トレオニン(21mg/L)、及びグリシン(78mg/L)。
M.maripaludis lysCの変異は、グラム陰性細菌のプロトコールに従って、Qiagen DNAeasy Blood&Tissue Kitを使用してゲノムDNAを抽出することによって確認した。LysC標的を、フォワードプライマー(LysCfor1−5’GGGACGGCGCAACAAATGG3’;配列番号13)及びリバースプライマー(LysCrev1−5’GGAGATAGTGAGACCCCTGGAGT3’;配列番号14)を有するEasy−A高忠実度ポリメラーゼを使用して増幅した。増幅したDNAを、LysCfor1またはLysCrev1のいずれかと混合し、配列決定した(Operon)。1つの自然発生変異体及び8つの化学的に誘導された変異体が特定された。Corynebacterium(この場合、G277R)において以前に特定された位置G277の変異に加えて、S302P及びG359E(Corynebacterium glutamicum ATCC13032のLysCからのアミノ酸位置によるナンバリング)を含む、Corynebacteriumで以前に特定されなかった新しい変異位置が見出された。
実施例4
水素資化微生物におけるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ欠失及びrepA挿入
プラスミド形質転換効率を改善するために、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(upp)遺伝子(Locus MMP0680)を、複製プロテインA(repA、それ自身のプロモーターを有する)をコードする遺伝子で置換することにより、lysC変異体Methanococcus maripaludis Trel10−Mut333をゲノムレベルで改変し、Trel10−333URと呼ぶ。repAは、repAを有する任意のプラスミド、例えば、repA含有pURB500プラスミドに由来するか、またはそれに基づくプラスミド(Tumbula et al.,J。Bacteriol.179:2976,1997を参照のこと)の効率的な形質転換を可能にする。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の喪失によって、修飾されたM.maripaludisに6−アザウラシル耐性表現型が得られる。
要するに、repA遺伝子は、プライマーTKH_038(5’aaattatgaggcgcgcctccctgaagaagaagagag3’;配列番号:27)及びTKH_039(5’tgcttattcggcgcgccagttccattttaccacc3’;配列番号28)を使用して、Methanococcus maripaludis S001(Waltersら、App.Environ.Microbiol.77:2549、2011)のゲノムDNAから(そのプロモーターとともに)増幅した。増幅されたrepAフラグメントを、In−fusion(登録商標)HDクローニングキット(Clontech)を使用して、AscIで直線化したpCR(登録商標)2.1−TOPO(登録商標)TAベクターにクローニングした。最終的なプラスミドを、pKH11と命名した。pKH11由来のXbaI−BamH1断片を、制限酵素NheI及びBglIIで直線化したpMEV1(Gardner WL(2000)Expression vectors for the methane−producing archaeon Methanococcus maripaludis.Dissertation, University of Georgia)中にクローニングした。ピューロマイシン耐性遺伝子を有する得られた自殺ベクターをpKH20と命名した。
プラスミドpKH20を本質的にSarmiento et al(2011)によって記載されたようにTrel10−Mut333中に形質転換し、形質転換体を、ピューロマイシン(2.5mg/L)を含むMcCASプレート上で選択した。ピューロマイシンの存在下で増殖した形質転換コロニーを、6−アザウラシル(0.25mg/ml)を補充したMcCAS液体培地に移し、一晩増殖させた。一晩培養の一部を、0.5mg/mlの6−アザウラシルを補充した新鮮なMcCAS培地に移し、再び一晩増殖させた。培養物を希釈し、0.25mg/mlの6−アザウラシルを含むMcCASプレート上に広げた。5日後、個々のコロニーを、ピューロマイシンの有無の状態のMcCASプレート上に複製してプレートした。ピューロマイシンの存在下で増殖できなかったコロニーを、6−アザウラシル(0.25mg/ml)を補充したMcCAS液体培地に移して耐性を確認した。Trel10−Mut333ゲノム上のrepA遺伝子によるupp遺伝子の置換は、以下のプライマーを使用してPCRによって確認した:uptdelconf1(5’−caattactgaacccaaagaccat−3’;配列番号14)及びuptdelconf2(5’−aatagttaccggcgttacaatca−3’;配列番号15)。repA遺伝子によるupp遺伝子の置換が確認された、6−アザウラシル耐性/ピューロマイシン感受性コロニーを、Trel10−333URと命名した。
実施例5
水素資化微生物におけるDAPA欠失
メチオニン産生を増大するためのTrel10−333UR−ΔdA−dapA欠失の構築は、Sarmiento et al.(2011)に記載されたものと本質的に同じマーカーなしの変異誘発法を使用して生成された。プライマーDapAfor2(5’−tccctgatcgatagaaagtgtagt−3’;配列番号16)及びDapAfor2(5’−ttgccgatgaaattaaagtgaaa−3’;配列番号17)を使用するPCRを介して、上流及び下流領域にそってdapA遺伝子を含むM.maripaludis S2(Trel10)ゲノムからの約2.4kbの断片を合成し、プラスミドpTOPO中にクローニングして、pJB012を作製した。dapA遺伝子のインフレーム欠失のフラグメントを、プライマーDapAdelfor2(5’−gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc−3’;配列番号18)及びDapAdelrev2(5’−gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat−3’;配列番号19)(両方とも5’AscI部位を含む)を使用する外向きPCRを使用することによって、作製した。PCR産物を精製し、AscIで消化し、pTOPOに連結してpJB013を作製した。最後に、upp::neo遺伝子を含む断片を、プライマーuppneoF(5’−attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga−3’;配列番号20)及びuppneoR(5’−gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg−3’;配列番号21)を使用して、pKH14からPCR増幅して、pJB013のKpnI部位にクローニングしてpJB015を作製した。
寒天プレート上でネオマイシン(500mg/ml)耐性コロニーを選択するために、pJB015を、Trel10−333UR(上記のとおり)に形質転換した。染色体dapA遺伝子における単一の交差事象が、PCRによって確認された。単一のクロスオーバを有するコロニーを、非選択培地中で24時間増殖させて二重交差事象を可能にし、次いで100mg/Lのリシン及び0.25ug/mlの6−アザウラシルを含むMcCAS培地上にプレートした。コロニーは、リシンの有無の状態のMcCASプレートにパッチした。増殖のためにリシンを必要とするコロニーで、dapA欠失のPCR確認を行った。このようなコロニーの1つをTrel10−333UR−ΔdAと命名した。
実施例6
メチオニン生合成遺伝子の過剰発現
lysC、調節解除されたlysC、asd、MMP1358 ORF、MMP1359 ORF、調節解除されたMMP1358 ORF、調節解除されたMMP1359 ORFまたはメチオニンシンターゼを含む、Methanococcus maripaludis Trel10メチオニン生合成経路の任意の遺伝子は、天然プロモーターを除去すること、及びそれを強力な構成的プロモーターで置き換えることによって過剰発現され得る。1例では、各々がメチオニンシンターゼ(MetE)の有無の状態で、調節解除されたMMP 1358 ORFまたは調節解除されたMMP1359 ORFを、複製プラスミド上の構成的ヒストン遺伝子hmvプロモーターに作動可能に連結し、M maripaludis Trel10に導入した。別の場合には、調節解除されたORF1358及びOrf1359を、hmvプロモーターに作動可能に連結して、Trel10−Mut333に導入した。血清ボトル(実施例1に記載)及び発酵槽(実施例9に記載)におけるアミノ酸産生を測定して、その結果を表4及び5にまとめる。
調節解除されたMMP1358及びMMP1359 ORF(Trel10−er3.1+er3.3)を構成的に発現するMethanococcus maripaludis Trel10は、有意な量のメチオニン(107mg/L、表4)を産生した。調節解除されたLysC(Trel10−Mut333+er3.1+er3.3)の添加は、メチオニン産生を改善しなかったが、代わりにより多くのグリシン、トレオニン及びリシンが産生された。これらのデータによって、メチオニンの過剰産生がリシン及びトレオニンレベルの低下をもたらし、したがってこれらのアミノ酸がLysCのフィードバック阻害を引き起こすのに十分高い量で存在しないので、野生型Trel10が自然に「調節解除」され得るということが示される。さらに、これらのデータによって、調節解除されたMMP1358及びMMP1359 ORFの過剰発現が、メチオニンの非常に特異的な過剰産生をもたらすことが示される。
実施例7
水素資化微生物からのメチオニンエクスポート
Corynebacterium glutamicum由来の候補brnFEまたはmetTメチオニンエクスポーター遺伝子を単離し、機能性について検査する。機能を高めるためにさらなる変異を必要に応じて導入するか、または強力なプロモーターに作動可能に連結することによってエクスポート遺伝子を過剰発現させるか、または機能的な外因性brnFE遺伝子もしくはmetT遺伝子を、M maripaludisに導入する。過剰産生されたメチオニンは、培養培地から容易に回収及び/または単離し得る。
実施例8
水素資化微生物におけるメチオニン産生への交互性炭素フラックス
水素資化微生物(例えば、M.maripaludis)の主な炭素フラックスは、メチオニン生合成により多くの炭素を供給するために、種々の方法でシフトしてもよい。例えば、ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸(PEP)への炭素の流れを制限することは、PEPシンターゼ遺伝子を、不活性化または下方制御することによって達成される。さらに、イソロイシン経路(存在する場合)を必要に応じてノックアウトして、この経路によって使用されるピルビン酸及びアセチルCoAを保存する。特定の酵素活性の不活性化または減少は、遺伝子的に操作すること(例えば、遺伝子または遺伝子部分の欠失)、または変異による不活性化(例えば、自発的または誘導)を選択することによって導入してもよい。あるいは、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を必要に応じて過剰発現させて、ピルビン酸からオキサロ酢酸(OAA)に多くの炭素を注ぎ込む。さらに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を、必要に応じて過剰発現させ、より多くのOAAをアスパラギン酸(asparate)に変換する。過剰発現は、例えば、遺伝子の複数のコピーを提供することによって、またはプロモーター領域を改変してより強力な発現を得ることによって、達成され得る。
実施例9
バイオリアクター中の非自然及び組み換えの水素資化微生物の培養
M.maripaludisは、培養物が定常状態に達するまで、嫌気性条件下で、気泡塔バイオリアクター内で72時間〜120時間培養され、これは、極めて大容積の高密度培養物に達するように、漸増容積の一連の連続容器で行ってもよい(例えば50mlで開始、この培養物を使用して10Lを播種し、次いでこの培養物を使用して300L以上を播種する)。この時間の間、このシステムは、合成ガスが発酵ブロスに連続的に供給される流加法モードで運転される。ブロス自体は交換されない。一旦、適切なOD600に達すれば(分光光度計で測定して)、連続培養プロセスが開始され、ここでは、培地/ブロスの交換が開始される。交換の割合は、発酵槽内の培養物のOD600を考慮して決定される。例えば、約1.5〜約3.0の全量のブロスが1日に交換される。
培養物は約37℃の温度に維持されるが、約35℃〜約40℃の範囲で変動してもよく、約7.0〜7.2のpHで維持して(必要に応じてHCl及び/またはNaOHを用いpHを調節)、OD600が約1.5〜約2.0に維持されてもよい。合成ガスは、約4:1〜約3:1の範囲の比でH:COからなり、これは、約0%〜約5%の範囲の一酸化炭素(最適は多くとも1%)を含んでもよく、その他の微量の混入物を含んでもよい。合成ガス流速は、そのプロセスで使用される気泡または特定の設計の細流カラムによって決定される。
上述の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせてもよい。本明細書で言及されるか、または出願データシートに列挙されている特許及び非特許刊行物の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、さらなる実施形態を提供するために、必要に応じて様々な特許、出願及び刊行物の概念を使用するように変更してもよい。
上記及び詳細な説明に照らして、この実施形態にこれらの変更及び他の変更を行ってもよい。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を主張する等価物の全範囲とともに、全ての可能性のある実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、この特許請求の範囲は、本開示によって限定されることはない。
2015年5月6日に出願された米国仮特許出願第62/157,797号を含む、本明細書で言及される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物は、本明細書と矛盾しない程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (109)

  1. 非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物であって、ここで前記遺伝子操作型の水素資化微生物は、CO基質を、必要に応じて、Hの存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成し、ここで前記遺伝子操作型の水素資化微生物は、遺伝子的に操作された内因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下:
    (a)配列番号4及び8のうちの少なくとも1つに示されるアミノ酸配列を有する遺伝子的に操作されたポリペプチド;
    (b)配列番号4及び8のうちの少なくとも1つに対して少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を有する遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    (c)配列番号2及び6のうちの少なくとも1つに対して少なくとも70%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされる遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    または
    (d)配列番号2及び6の全長相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる遺伝子的に操作されたポリペプチドであって、ここで前記遺伝子操作型のポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
    、を含む、前記非自然の遺伝子操作型の水素資化微生物。
  2. 前記遺伝子操作型のポリペプチドが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266のMMP1359のホモログまたはオーソログである、請求項1に記載の非自然の水素資化微生物。
  3. 前記ホモログまたはオーソログが、残基D439で変異を含み、ここで前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1359の残基位置に相当する、請求項2に記載の非自然の水素資化微生物。
  4. 前記変異が、D439N置換であり、かつ前記残基ナンバリングがMethanococcus maripaludis S2 DSM1 4266由来のMMP1359の残基位置に相当する、請求項2または3に記載の非自然の水素資化微生物。
  5. 前記遺伝子操作型のポリペプチドが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266のMMP1358のホモログまたはオーソログである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  6. 前記ホモログまたはオーソログが、残基G114で変異を含み、かつ前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1358の残基位置に相当する、請求項5に記載の非自然の水素資化微生物。
  7. 前記変異が、G114E置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1358の残基位置に相当する、請求項5または6に記載の非自然の水素資化微生物。
  8. 前記非自然の水素資化微生物がさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、メチオニンシンターゼ、またはその両方を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  9. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、内因性アスパルトキナーゼ、外因性アスパルトキナーゼ、またはその両方である、請求項8に記載の非自然の水素資化微生物。
  10. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシン、トレオニン、またはメチオニンのうちの1つ以上によるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である、請求項8または9のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  11. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、変異体thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子またはそれらの組み合わせによってコードされ、各々が、自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを含んでいる、請求項8〜10のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  12. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、トレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体lysC遺伝子によってコードされる、請求項8〜11のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  13. 前記トレオニン結合部位の変異が、残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項12に記載の非自然の水素資化微生物。
  14. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシン結合部位で変異を含んでいる変異体lysC遺伝子によってコードされる、請求項8〜13のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  15. 前記リシン結合部位の変異が、残基I291、I293、D294、T361、S381、E382またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項14に記載の非自然の水素資化微生物。
  16. 前記調節解除された内因性のアスパルトキナーゼ活性が、リシン及びトレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体lysC遺伝子によってコードされる、請求項8〜15のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  17. 前記リシン及びトレオニン結合部位の変異が、残基D294であり、ここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項16に記載の非自然の水素資化微生物。
  18. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ活性が、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位で変異を含んでいる変異体lysC遺伝子によってコードされる、請求項8〜17のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  19. 前記リシン及びトレオニン結合部位以外の部位での変異が、残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項18に記載の非自然の水素資化微生物。
  20. 前記非自然の水素資化微生物がさらに、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  21. メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−トランススクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項20に記載の非自然の水素資化微生物。
  22. 前記外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはその両方をコードするか、または外因性核酸分子がホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、もしくはその両方をコードする、請求項20に記載の非自然の水素資化微生物。
  23. 前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が、過剰発現されるか、またはホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、もしくはその両方が過剰発現される、請求項22に記載の非自然の水素資化微生物。
  24. 前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が調節解除されるか、または前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が調節解除される、請求項22または23のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  25. 前記外因性核酸分子がメチオニンシンターゼをコードする、請求項20〜24のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  26. 前記メチオニンシンターゼが、メチオニンシンターゼをコードする外因性核酸分子を欠いている親の水素資化微生物と比較して過剰発現される、請求項25に記載の非自然の水素資化微生物。
  27. リシン生合成経路由来のポリペプチドをコードする1つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項20〜26のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  28. トレオニン生合成経路由来のポリペプチドをコードする1つ以上の核酸分子が、ノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項20〜27のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  29. ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼもしくはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、ホモセリンキナーゼ変異体、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、もしくはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項27または28のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  30. 前記外因性核酸分子が、非自然の水素資化微生物のゲノムに組み込まれる、請求項9〜29のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  31. 前記外因性核酸分子が、非自然の水素資化微生物における自己複製ベクターである、請求項9〜29のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  32. 前記非自然の水素資化微生物が、リシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、グリシン栄養要求株、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1〜31のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  33. 前記非自然の水素資化微生物が、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  34. 前記非自然の水素資化微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、5−メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−CoAシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  35. 前記CO基質が、H、CO、及びCOからなるH/CO基質である、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  36. 前記CO基質が、合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなる、H/CO基質である、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  37. 前記CO対Hの比が、それぞれ、約1:50〜約10:1におよぶ、請求項35または36に記載の非自然の水素資化微生物。
  38. 前記CO対Hの比が、それぞれ、約1:2〜約1:4におよぶ、請求項35または36に記載の非自然の水素資化微生物。
  39. 前記COの総量が、約1%以下である、請求項35〜38のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  40. 前記水素資化微生物がメタン生成古細菌である、請求項1〜39のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  41. 前記メタン生成古細菌が、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanocella、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、Methanothermus、またはMethanotorrisから選択される、請求項40に記載の非自然の水素資化微生物。
  42. 前記メタン生成古細菌が、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanocella arvoryzae、Methanocella conradii、Methanocella paludicola、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii、及びMethanocaldococcus vulcaniusからなる群より選択される、請求項40に記載の非自然の水素資化微生物。
  43. 前記メタン生成古細菌が、シトクロムを生じない、請求項40〜42のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  44. シトクロムを生成しない前記メタン生成古細菌が、Methanococcus maripaludisまたはMethanococcus vannieliiである、請求項43に記載の非自然の水素資化微生物。
  45. 前記メタン生成古細菌がシトクロムを生じる、請求項40〜42のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  46. シトクロムを生成する前記メタン生成古細菌が、Methanosarcina barkeriまたはMethanosarcina mazeiである、請求項45に記載の非自然の水素資化微生物。
  47. 前記非自然の水素資化微生物がメチオニンのエクスポーターを発現するか、または過剰発現する、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  48. 前記非自然の水素資化微生物がさらに、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  49. 前記エクスポーターがbrnFEまたはmetT遺伝子である、請求項47または48に記載の非自然の水素資化微生物。
  50. 前記組み換え水素資化微生物であって、CO基質を、必要に応じて、Hの存在下で代謝して、親の水素資化微生物よりも高レベルのメチオニンを生成し、ここで前記組み換え水素資化微生物が、外因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下:
    (a)配列番号3、4、7及び8のうちの少なくとも1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
    (b)配列番号3、4、7もしくは8のうちの少なくとも1つに対して少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    (c)配列番号1、2、5もしくは6のうちの少なくとも1つに対して少なくとも70%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    または
    (d)配列番号1、2、5もしくは6の全長相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、必要に応じて1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
    、を含む、前記組み換え水素資化微生物。
  51. 前記ポリペプチドが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1359のホモログまたはオーソログである、請求項50に記載の組み換え水素資化微生物。
  52. 前記ホモログまたはオーソログが、残基D439で変異を含み、ここで前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1359の残基位置に相当する、請求項51に記載の組み換え水素資化微生物。
  53. 前記変異が、D439N置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266のMMP1359によってコードされる残基位置に相当する、請求項51または52のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  54. 前記微生物が、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266由来のMMP1358のオーソログである遺伝子中に変異を含む、請求項48〜51のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  55. 前記変異が、残基G114であり、かつ前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266のMMP1358によってコードされる残基位置に相当する、請求項54に記載の組み換え水素資化微生物。
  56. 前記変異が、G114E置換であり、かつ前記残基のナンバリングが、Methanococcus maripaludis S2 DSM14266のMMP1358によってコードされる残基位置に相当する、請求項54または55のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  57. 請求項50〜56のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物であって、ここで前記組み換え水素資化微生物が、遺伝子操作型の調節解除された内因性ポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは以下:
    (a)配列番号4及び8のうちの少なくとも1つに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
    (b)配列番号4及び8のうちの少なくとも1つに対して少なくとも90%の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    (c)配列番号2及び6のうちの少なくとも1つに対して少なくとも70%の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド;
    または
    (d)配列番号2及び6の相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、1つ以上のフィードバック阻害因子について調節解除される、前記ポリペプチド
    、を含む、前記組み換え水素資化微生物。
  58. 前記組み換え水素資化微生物がさらに、調節解除されたアスパルトキナーゼ活性、メチオニンシンターゼ、またはその両方を含む、請求項50〜57のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  59. 前記微生物が、調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性、調節解除された外因性アスパルトキナーゼ活性、またはその両方を発現する、請求項58に記載の組み換え水素資化微生物。
  60. 前記調節解除された内因性アスパルトキナーゼ活性が、1つ以上のリシン、トレオニン、及びメチオニンにより、フィードバック阻害に耐性であるアスパルトキナーゼ変異体である、請求項59に記載の組み換え水素資化微生物。
  61. アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記核酸分子が、調節解除されたアスパルトキナーゼ変異体をコードする、請求項58〜60のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  62. 前記調節解除されたアスパルトキナーゼ変異体が、1つ以上のリシン、トレオニン、及びメチオニンにより、フィードバック阻害に耐性である、請求項61のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  63. 前記核酸分子が、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現する、請求項58〜62のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  64. 前記外因性、内因性もしくはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、個々に変異体lysC遺伝子によってコードされるか、または外因性アスパルトキナーゼ活性が個々に変異体thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子もしくはそれらの組み合わせによってコードされ、各々が自然変異、ランダム突然変異、部位特異的突然変異、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項58〜63のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  65. 前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、個々に、トレオニン結合部位で変異を含んでいる変異体lysC遺伝子によってコードされる、請求項58〜64のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  66. 前記トレオニン結合部位の変異が、残基I272、D274、G277、E278、A279、D294、Q298、N372、N374、I375、またはそれらの任意の組み合わせであり、かつ前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項65に記載の組み換え水素資化微生物。
  67. 前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシン結合部位で変異を含む変異体lysC遺伝子によって個々にコードされる、請求項58〜64のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  68. 前記リシン結合部位の変異が、残基I291、I293、D294、T361、S381、E382、またはそれらの任意の組み合わせであり、ここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項67に記載の組み換え水素資化微生物。
  69. 前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシン及びトレオニン結合部位で変異を含む変異体lysC遺伝子によって個々にコードされる、請求項58〜64のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  70. 前記リシン及びトレオニン結合部位の変異が、残基D294であり、ここで残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項69に記載の組み換え水素資化微生物。
  71. 前記外因性、内因性またはその両方のアスパルトキナーゼ活性が、リシンまたはトレオニン結合部位以外の部位での変異を含む変異体lysC遺伝子によって個々にコードされる、請求項58〜64のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  72. リシン及びトレオニン結合部位以外の部位の前記変異が、残基F283、N299、S301、S302、T308、T311、T336、G359、F364、M365、T380、R384、S386、またはそれらの任意の組み合わせであり、かつここで前記残基のナンバリングが、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のlysCによってコードされる残基位置に相当する、請求項71に記載の組み換え水素資化微生物。
  73. 前記組み換え水素資化微生物がさらに、メチオニン生合成経路由来の1つ以上のポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み、かつ前記組み換え水素資化微生物が、メチオニンを、親の水素資化微生物よりも高レベルで生成する、請求項50〜72のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  74. メチオニン生合成経路由来の前記1つ以上のコードされたポリペプチドが、アスパルトキナーゼ、アスパルチルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンO−トランススクシニルトランスフェラーゼ、O−スクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、ホモシステインS−メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ(コバラミン依存性または非依存性)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項73に記載の組み換え水素資化微生物。
  75. 前記外因性核酸分子が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼもしくはその両方をコードするか、または前記第2の外因性核酸分子が、ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方をコードする、請求項73に記載の組み換え水素資化微生物。
  76. 前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、またはその両方をコードする前記外因性核酸分子が、核酸発現制御配列に対して作動可能に連結されている、請求項75に記載の組み換え水素資化微生物。
  77. 前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が、過剰発現されるか、または前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が過剰発現される、請求項76に記載の組み換え水素資化微生物。
  78. 前記ホモセリンデヒドロゲナーゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、もしくはその両方が調節解除されるか、または前記ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼもしくはその両方が調節解除される、請求項75〜77のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  79. 前記外因性核酸分子が、メチオニンシンターゼをコードする、請求項73〜78のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物。
  80. 前記メチオニンシンターゼが、メチオニンシンターゼをコードする外因性の核酸分子を欠いている親の水素資化微生物と比較して過剰発現される、請求項79に記載の非自然の水素資化微生物。
  81. リシン生合成経路由来のポリペプチドをコードする1つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項50〜80のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  82. トレオニン生合成経路由来のポリペプチドをコードする1つ以上の核酸分子がノックアウトされるか、または活性が低下している、請求項50〜81のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  83. ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、トレオニンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ、トレオニンアルドラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子がノックアウトされるか、または活性の低下したジヒドロジピコリン酸シンターゼ変異体、トレオニンキナーゼ、トレオニンデヒドラターゼ変異体、トレオニンアルドラーゼ変異体、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、またはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項81または82に記載の組み換え水素資化微生物。
  84. 前記外因性核酸分子が、前記組み換え水素資化微生物のゲノムに組み込まれている、請求項50〜83のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  85. 前記外因性核酸分子が、前記組み換え水素資化微生物中の自己複製ベクター中にある、請求項50〜83のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  86. 前記組み換え水素資化微生物がリシン栄養要求株、トレオニン栄養要求株、もしくはその両方である、請求項50〜85のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  87. 前記組み換え水素資化微生物が、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性の低下、ピルビン酸キナーゼ活性の増大、またはその両方を有する、請求項50〜86のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  88. 前記組み換え水素資化微生物が、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増大、ピルビン酸シンターゼの増大、アセチル−CoAシンターゼの増大、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の増大、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項50〜87のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  89. 前記CO基質がH、CO、及びCOからなるH/COx基質である、請求項50〜88のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  90. 前記CO基質が合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなるH/CO基質である、請求項50〜89のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  91. 前記CO対Hの比が、それぞれ、約1:50〜約10:1におよぶ、請求項89または90のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  92. 前記CO対Hの比が、それぞれ、約1:2〜約1:4におよぶ、請求項89または90のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  93. 前記COの総量が、約1%以下である、請求項89〜92のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  94. 前記水素資化微生物がメタン生成古細菌である、請求項50〜93のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  95. 前記メタン生成古細菌が、Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanocalculus、Methanocaldococcus、Methanococcus、Methanococcoides、Methanocorpusculum、Methanoculleus、Methanofollis、Methanogenium、Methanohalobium、Methanohalophilus、Methanolacinia、Methanolobus、Methanomethylovorans、Methanomicrobium、Methanomicrococcus、Methanoplanus、Methanopyrus、Methanoregula、Methanosaeta、Methanosalsum、Methanosarcina、Methanosphaera、Methanospirillium、Methanothermobacter、Methanothermococcus、Methanothermus、またはMethanotorrisから選択される、請求項94に記載の組み換え水素資化微生物。
  96. 前記メタン生成古細菌が、Methanobacterium alcaliphilum、Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium palustre、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium uliginosum、Methanobrevibacter acididurans、Methanobrevibacter arboriphilicus、Methanobrevibacter gottschalkii、Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibacter woesei、Methanobrevibacter wolinii、Methanothermobacter marburgensis、Methanothermobacter thermautotrophicum、Methanothermobacter thermoflexus、Methanothermobacter thermophilus、Methanothermobacter wolfeii、Methanothermus sociabilis、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum parvum、Methanoculleus chikuoensis、Methanoculleus submarinus、Methanogenium frigidum、Methanogenium liminatans、Methanogenium marinum、Methanomicrococcus blatticola、Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius、Methanopyrus kandleri、Methanoregula boonei、Methanosaeta concilii、Methanosaeta harundinacea、Methanosaeta pelagica、Methanosaeta thermophila、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei、Methanosarcina thermophila、Methanomicrobium mobile、Methanococcus aeolicus、Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanothermococcus thermolithotrophicus、Methanopyrus kandleri、Methanothermobacter thermoautotroiphicus、Methanocaldococcus fervens、Methanocaldococcus indicus、Methanocaldococcus infernus、Methanocaldococcus jannaschii、及びMethanocaldococcus vulcaniusからなる群より選択される、請求項95に記載の組み換え水素資化微生物。
  97. 前記メタン生成古細菌が、シトクロムを生じない、請求項94〜96のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  98. 前記シトクロムを生成しないメタン生成古細菌が、Methanococcus maripaludisまたはMethanococcus vannieliiである、請求項97に記載の組み換え水素資化微生物。
  99. 前記メタン生成古細菌がシトクロムを生じる、請求項94〜96のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  100. 前記シトクロムを生成するメタン生成古細菌が、Methanosarcina barkeriまたはMethanosarcina mazeiである、請求項99に記載の組み換え水素資化微生物。
  101. 前記組み換え水素資化微生物が、メチオニンのエクスポーターを発現するか、または過剰発現する、請求項50〜100のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  102. 前記組み換え水素資化微生物がさらに、メチオニンのエクスポーターをコードする外因性核酸分子を含む、請求項52〜101のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物。
  103. 前記エクスポーターがbrnFEまたはmetT遺伝子である、請求項101または102に記載の組み換え水素資化微生物。
  104. メチオニンを生成するための方法であって、メチオニンを生成するために十分な時間、請求項1〜49のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物を培養するステップを包含し、ここで、前記非自然の水素資化微生物が:(a)親の水素資化微生物と比較した場合活性が増大している1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを発現するか;(b)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドを過剰発現するか;または(c)1つ以上の硫黄同化ポリペプチドの調節の変化を含み、ここで前記非自然の水素資化微生物が親の水素資化微生物よりも高レベルでメチオニンを生成する、前記方法。
  105. メチオニンまたはメチオニン含有飼料添加物を作製するためのプロセスであって、請求項50〜103のいずれか1項に記載の組み換え、メチオニン排出性水素資化微生物を、硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下でかつそれに十分な時間、H/CO基質の存在下で培養するステップを包含し、ここでメチオニンが、親の水素資化微生物によって生成される前記メチオニンよりも高レベルで生成されて前記培養培地中で蓄積する、前記プロセス。
  106. メチオニンを生成するためのシステムであって:
    (a)必要に応じてHの存在下において、CO基質を含むガスの供給源と、
    (b)硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項1〜49のいずれか1項に記載の非自然の水素資化微生物を含むバイオリアクターと;
    (c)前記バイオリアクターへのガスの流れを可能にするための、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されるコネクターと;
    を備え、
    ここで、前記非自然の水素資化微生物が、前記H/CO基質を代謝して、親の水素資化微生物と比較した場合メチオニンを過剰発現する、前記システム。
  107. メチオニンを生成するためのシステムであって:
    (a)必要に応じてHの存在下において、CO基質を含むガスの供給源と、
    (b)硫黄同化ポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、請求項50〜103のいずれか1項に記載の組み換え水素資化微生物を含むバイオリアクターと;
    (c)前記バイオリアクターへのガスの流れを可能にするための、前記ガス供給源と前記バイオリアクターとの間に配置されるコネクターと;
    を備え、
    ここで、前記非自然の水素資化微生物が、前記CO基質を、必要に応じてHの存在下で代謝して、親の水素資化微生物と比較した場合メチオニンを過剰発現する、前記システム。
  108. 前記バイオリアクターが、液相、バブルカラム、またはトリクルベッドバイオリアクターである、請求項106または107のいずれか1項に記載のシステム。
  109. 前記CO基質が、合成ガスまたは水性ガスシフトの合成ガスからなるH/CO基質である、請求項106または107のいずれか1項に記載のシステム。
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