KR20170134468A - 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법 - Google Patents

Abstract

(과제) 측정에 필요한 시료액을 극소량으로 할 수 있고, 신속하게 측정 결과를 얻는 것이 가능한 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법을 제공한다.
(해결 수단) 천면 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 수용되는 흡수 부재와, 상기 흡수 부재의 상기 상부 덮개 부재측 단면에 형성된 필터 부재를 구비하고, 상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면을 고상 반응의 반응장으로 하는 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법.

Description

고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법{SOLID-PHASE REACTION VESSEL AND MEASUREMENT METHOD USING SAME}

본 발명은 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법에 관한 것이다.

종래부터, 항원-항체 반응, 당 (사슬)-렉틴 반응, 비오틴-아비딘 반응과 같은 특이적 결합 반응을 이용하여, 시료 중에 포함되는 측정 대상물을 포착하는 수법이 알려져 있으며, 그 중에서도 측정의 간편함 등의 관점에서 고상 담체 상에서 상기 반응을 완결시키는 방법이 선호되어 이용되고 있다.

예를 들어, 특허문헌 1 에는, 다공질 매트릭스를 고상으로 하는 분석법에 있어서, 특정 범위의 섬유경을 갖는 유리 섬유로 구성된 필터에 피측정 물질과 특이적으로 반응하는 제 1 물질을 결합한 다공질 매트릭스를 고상으로 한 고상 생물학적 특이 반응 측정 방법에 대해 기재가 되어 있다.

또, 예를 들어, 특허문헌 2 에는, 섬유질 다공성 필터를 고상 담체로 하고, 종래의 면역학적 측정법에 필요로 하는 시간보다 매우 짧은 시간으로, 1 ㎖ 당 나노 그램량의 레벨에서의 측정 감도를 얻을 수 있는 면역학적 측정법에 기초하는 생리 활성을 갖는 시료 물질의 측정 방법에 대해 기재가 되어 있다.

상기 선행 기술 문헌으로서 예시한 종래 기술에 있어서는, 다공질 매트릭스 (필터) 를 직경 약 5 ㎜ 의 원 형상으로 잘라내고, 개구부를 갖는 용기의 개구부측에 세트하고, 또한, 올레핀계의 부직포, 셀룰로오스 등으로 이루어지는 흡수층을 순차 적층하고, 필요에 따라 저판을 형성한 반응 용기가 사용되고 있다.

개구부를 통한 다공질 매트릭스 상에는, 측정 대상물과 특이적으로 결합하는 제 1 물질이 고정되고, 당해 다공질 매트릭스 상부로부터, 측정 대상물을 포함하는 시료, 검출 가능한 시그널 발생 물질을 결합한, 측정 대상물 또는 그 제 1 물질과 특이적으로 반응하는 제 2 물질, 및 세정액을 순차 공급하고, 시그널 발생 물질로부터 발해지는 시그널을 측정함으로써, 다공질 매트릭스 상에 남은 측정 대상물의 양을 구하는 것이다.

일본 공개특허공보 평4-318462호 일본 공개특허공보 2010-44083호

그러나, 종래의 반응 용기에서는 개구부의 직경이 약 5 ㎜ 로 비교적 크고, 당해 개구부를 통해서 공급하는 시료액, 세정액의 양은 적어도 20 ㎕ ∼ 100 ㎕ 는 필요하였다. 이와 같이, 개구부를 통해서 공급되는 액의 양이 많으면, 공급액이 흡수층에 완전히 흡수될 때까지 다음 조작으로 진행될 수 없기 때문에, 다공질 매트릭스 상에 남은 측정 대상물의 양을 구하기까지 시간을 필요로 하게 된다. 또, 측정 대상물을 포함하는 시료액의 액량이 많으면, 이것을 제공하는 피험자의 육체적 부담도 큰 것이 된다.

게다가, 예를 들어, 알레르기 질환의 원인 물질인 알레르겐을 특정하는 경우, 필연적으로 측정 대상수 (검체수) 는 많아진다. 실제로, 알레르기 질환이 의심되는 피험자가 진단을 받는 의료 기관에서는, 피험자의 육체적 부담, 시간적 부담 등을 고려하여, 극소량의 시료액을 사용한 신속한 진단 재료의 제공이 요구되는 가운데, 종래 기술은 만족스러운 것은 아니었다.

본 발명은 이와 같은 실상을 감안하여 이루어진 것이며, 본 발명의 과제는, 측정에 필요한 시료액을 극소량으로 할 수 있고, 신속하게 측정 결과를 얻는 것이 가능한 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 관련된 고상 반응 용기는, 천면 (天面) 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 압궤한 상태로 수용되는 흡수 부재와, 상기 흡수 부재의 상기 상부 덮개 부재측 단면 (端面) 에 형성된 필터 부재를 구비하고, 상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면을 고상 반응의 반응장으로 하는 것을 특징으로 하고 있다.

또, 본 발명에 관련된 고상 반응 용기를 사용한 측정 방법은, 천면 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와, 상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 압궤한 상태로 수용되는 흡수 부재와, 상기 흡수 부재의 상기 상부 덮개 부재측 단면에 형성된 필터 부재를 구비한 고상 반응 용기를 사용하고, 상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면 상에 측정 대상 물질을 결합시키는 제 1 결합 스텝과, 상기 측정 대상 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 시그널 생성 물질에 의해 표식된 표식화 물질을 상기 측정 대상 물질에 결합시키는 제 2 결합 스텝과, 상기 시그널 생성 물질에 의해 발생한 시그널을 측정하는 측정 스텝을 구비하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명에 의하면, 측정에 필요한 시료액을 극소량으로 할 수 있고, 신속하게 측정 결과를 얻는 것이 가능한 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은, 본 실시형태에 관련된 고상 반응 용기의 외관을 설명하는 사시도이다.
도 2 는, 고상 반응 용기의 상면도 (a) 및 하면도 (b) 이다.
도 3 은, 고상 반응 용기를 구성하는 각 부재를 설명하기 위한 단면도이다.
도 4 는, 고상 반응 용기의 내부 구성을 설명하기 위한 단면도이다.
도 5 는, 고상 반송 용기를 세로 방향으로 적층한 상태를 설명하는 단면도이다.
도 6 은, 고상 반응 용기에 리간드 포착 물질을 고정화시키는 공정을 설명하는 플로우 차트이다.
도 7 은, 리간드 포착 물질을 고정화시킨 고상 반응 용기 (100) 를 사용한 구체적인 측정법을 설명하는 플로우 차트이다.
도 8 은, 표준액 (a) 및 알레르겐으로서 삼나무 (b) 를 선택한 경우의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9 는, 고상 반응 용기의 다른 형태를 설명하는 도면이다.
도 10 은, 고상 반응 용기의 다른 형태를 설명하는 도면이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 도면을 참조하여 설명한다. 또한, 본 발명은, 이하의 기술에만 한정되는 것이 아니라, 본 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위에 있어서 적절히 변경 가능하다. 또, 도면은 모식적인 것이며, 각 치수의 비율 등은 현실의 것과는 상이한 경우가 있다. 구체적인 치수 등은 이하의 설명을 참작하여 판단해야 할 것이다. 또, 도면 상호간에 있어서도 서로의 치수의 관계나 비율이 상이한 부분이 포함되어 있는 것은 물론이다.

본 발명에 관련된 고상 반응 용기는, 천면 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와, 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와, 상부 덮개 부재와 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 수용되는 흡수 부재와, 흡수 부재의 상부 덮개 부재측 단면에 형성된 필터 부재를 구비하고, 개구부를 통한 필터 부재의 노출면을 고상 반응의 반응장으로 하는 것이다. 이하 상세하게 설명한다.

도 1 은, 본 실시형태에 관련된 고상 반응 용기 (100) 의 외관을 설명하는 사시도이다. 도 2 는, 고상 반응 용기 (100) 의 상면도 (a) 및 하면도 (b) 이다. 고상 반응 용기 (100) 는, 포개지도록, 바닥이 깊지 않은 대략 원통 형상으로 형성된 상부 덮개 부재로서의 상부 덮개 (10) 와, 상부 덮개 (10) 의 구경보다 약간 구경이 작아지도록 형성된 하부 덮개 부재로서의 하부 덮개 (20) 가 끼워 맞춰짐으로써 구성되어 있다. 그리고, 도 2(a) 에 나타내는 바와 같이, 상부 덮개 (10) 의 대략 중앙부에 형성된 원환부 (圓環部) (12) 내에는 테이퍼 형상의 개구부 (13) 가 형성되어 있고, 당해 개구부 (13) 를 통해서 측정 대상물을 포함하는 시료액이나 세정액 등의 액체를 용기 내부에 도입할 수 있다. 또, 도 2(b) 에 나타내는 바와 같이, 하부 덮개 (20) 의 저부 (21) 에는 통기부 (22) 가 형성되어 있고, 개구부 (13) 를 통해서 도입된 액체의 흡수 부재로의 통액을 용이하게 한다.

도 3 은, 고상 반응 용기 (100) 를 구성하는 각 부재를 설명하기 위한 단면도이고, 도 4 는, 고상 반응 용기 (100) 의 내부 구성을 설명하기 위한 단면도이다. 전술한 바와 같이, 상부 덮개 (10) 와 하부 덮개 (20) 가 끼워 맞춰짐으로써 고상 반응 용기 외형이 형성된다. 상부 덮개 (10) 의 내주 벽면 (15) 측에는, 하부 덮개 (20) 의 외주 벽면 (23) 측에 형성된 피걸어맞춤부 (24) 와 걸어맞춤 가능한 걸어맞춤부 (16) 가 형성되고, 당해 걸어맞춤부 (16) 와 피걸어맞춤부 (24) 가 걸어맞춰짐으로써, 상부 덮개 (10) 와 하부 덮개 (20) 는 끼워 맞춰진다. 하부 덮개 (20) 의 외주 벽면 (23) 은, 저부 (21) 를 형성하는 대좌부 (25) 로부터 상부 덮개 (10) 로의 끼워 맞춤 방향으로 연장되어 형성되어 있고, 당해 외주 벽면 (23) 은, 상부 덮개 (10) 와의 끼워 맞춤시에 상부 덮개 (10) 의 내주 벽면 (15) 과 맞닿는다. 또한, 상부 덮개 (10) 의 외주 벽면 (14) 과 하부 덮개 (20) 의 대좌부 (25) 의 외주 벽면 (26) 은 끼워 맞춤시에 동일 벽면이 되도록 배치되고, 끼워 맞춤 후의 고상 반응 용기 (100) 의 형상은, 도 4 에 나타내는 바와 같은 바닥이 깊지 않은 원통 형상이 된다.

여기서, 도 3 및 도 4 에 나타내는 고상 반응 용기 (100) 의 치수는, 직경이 15 ㎜ 정도, 높이가 5 ㎜ 정도, 개구부 (13) 의 구경 (13a) 은 1.5 ㎜ 이하가 적합한 것으로 알려져 있다. 또한, 고상 반응 용기 (100) 의 실치수는 이것에 한정되지 않고, 용도에 따라 적절히 변경 가능하다.

그런데, 상부 덮개 (10) 및 하부 덮개 (20) 의 제조에 사용하는 재료로는, 액체를 투과시키지 않고, 단백질 등에 대하여 비흡착성을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 염화비닐, 폴리스티렌, ABS 수지, 폴리아미드, 4불화에틸렌, 폴리프로필렌, 불포화 폴리에스테르, 에폭시 등의 플라스틱류를 사용할 수 있다.

그리고, 상부 덮개 (10) 와 하부 덮개 (20) 가 끼워맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간 (30) 에는, 흡수 부재 (40) 가 압궤한 상태로 수용된다. 또, 흡수 부재 (40) 의 상부 덮개 (10) 측단면에는 개구부 (13) 를 통해서 일부분이 노출면 (50a) 으로서 노출되도록 필터 부재 (50) 가 수용되어 있고, 당해 노출면 (50a) 은 고상 반응의 반응장으로서 사용된다.

흡수 부재 (40) 의 재료로는, 예를 들어, 폴리에틸렌테레프탈레이트나 폴리에틸렌테레부티레이트 등의 폴리에스테르계 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 폴리올레핀계 섬유, 혹은 이들을 복합한 복합 섬유나, 펄프 섬유, 무명 섬유, 마 섬유 등의 식물 섬유, 견 섬유, 레이온 섬유 등의 재생 섬유와 같은 섬유, 직포, 부직포, 종이 등을 사용할 수 있다. 특히, 펄프 섬유나 레이온 섬유와 같은 셀룰로오스를 주성분으로 하는 것, 목재 펄프에 아세트산을 작용시켜 제조한 아세테이트 (아세틸셀룰로오스) 와 같은 다당류로 이루어지는 다공질 매트릭스인 것이 바람직하다.

흡수 부재 (40) 의 치수로는, 상부 덮개 (10) 및 하부 덮개 (20) 로 형성되는 내부 공간 (30) 의 체적보다 약간 큰 체적을 갖는 것이면 특별히 제한은 없고, 그 형상도 당해 내부 공간 (30) 에 수용될 때에 압궤한 상태 (상부 덮개 (10) 및 하부 덮개 (20) 의 내주 벽면에 맞닿은 상태) 를 유지할 수 있으면, 원통 형상이 아니어도 직방체 형상이어도 상관없다.

필터 부재 (50) 의 재료로는, 액체의 통액이 가능하고, 고상 반응에 있어서 리간드 포착 물질을 고정화시키고, 후에 이어지는 측정 스텝까지를 동일 고상 상에서 실시할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 저밀도 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리4불화에틸렌 등의 균일한 플라스틱 분말을 소결 성형한 다공질 유기 필터나, 스테인리스강, 니켈, 알루미늄 등의 금속을 성형한 다공질 금속 필터나, 알루미나, 지르코니아, 탄화규소 등을 성형한 다공질 무기 필터나, 니트로셀룰로오스, PVDF, 아세트산셀룰로오스류, 나일론류 등의 멤브레인 필터나, 셀룰로오스 섬유, 유리 섬유 등으로 이루어지는 여과지류 등을 사용할 수 있다. 이들 재료 중에서도 유리 섬유 필터를 사용하는 것이 바람직하다.

필터 부재 (50) 의 치수로는, 개구부 (13) 를 통해서 노출면 (50a) 이 노출될 수 있는 치수이면 특별히 한정되지는 않지만, 압궤한 상태의 흡수 부재 (40) 로부터 받는 압접력을 균등하게 하기 위해서, 하부 덮개 (20) 의 저부 (21) 면적과 대략 동일 면적을 갖는 원 형상으로 하는 것이 바람직하다.

상기 구성을 구비한 고상 반응 용기 (100) 는, 직경이 15 ㎜ 정도, 높이가 5 ㎜ 정도인 바닥이 깊지 않은 원통 형상을 이루고, 그 개구부 (13) 의 구경 (13a) 은 1.5 ㎜ 이하이다. 그리고, 내부 공간 (30) 에는, 흡수 부재 (40) 가 압궤한 상태로 수용되고, 당해 흡수 부재 (40) 의 상부 덮개 (10) 측단면에는 개구부 (13) 를 통해서 일부분이 노출면 (50a) 으로서 노출되도록 필터 부재 (50) 가 수용되어 있다. 개구부 (13) 를 통해서 고상 반응 용기 (100) 에 제공되는 시료액, 세정액 등의 액량은 최대라도 10 ㎕ 정도이면 되고, 제공한 액체는 필터 부재 (50) 를 통과 후, 흡수 부재 (40) 로 신속하게 흡수되기 때문에, 고상 반응의 각 스텝에 관련된 처리를 신속하게 실시할 수 있다.

또한, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 하부 덮개 (20) 의 대좌부 (25) 에는, 다른 고상 반응 용기 (100) 의 개구부 (13) (원환부 (12)) 를 수용 가능한 홈부 (27) 가 형성되어 있다. 이에 따라, 도 5 에 나타내는 바와 같이, 복수의 고상 반응 용기 (100) 를 세로로 적층한 상태에서, 자동 분주기 (分注器) 나 발광량 측정기 등의 챔버 내에 세트할 수 있기 때문에, 다검체 처리의 고속화를 도모하는 것이 가능하다. 또, 고상 반응 용기 (100) 자체의 치수가 직경 15 ㎜ 정도로 매우 작기 때문에, 자동 분주기나 발광량 측정기 등의 장치 치수도 소형화할 수 있어, 의료 현장 등의 비좁은 스페이스에 있어서도 이들 장치 설치가 가능해진다.

다음으로, 본 실시형태에 관련된 고상 반응 용기 (100) 를 사용한 측정 방법에 대해 설명한다. 본 측정법에서는, 고상 반응 용기 (100) 를 사용하고, 개구부를 통한 필터 부재의 노출면 상에 측정 대상 물질을 결합시키는 제 1 결합 스텝과, 측정 대상 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 시그널 생성 물질에 의해 표식된 표식화 물질을 측정 대상 물질에 결합시키는 제 2 결합 스텝과, 시그널 생성 물질에 의해 발생한 시그널을 측정하는 측정 스텝을 구비하는 것이다.

그리고, 제 1 결합 스텝은, 개구부를 통한 필터 부재의 노출면에 대하여, 리간드를 포착하는 리간드 포착 물질을 고정화시키는 고정화 스텝과, 측정 대상 물질과, 당해 측정 대상 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 리간드가 도입된 제 1 물질을 혼합함으로써 복합체를 형성하는 혼합 스텝과, 리간드 포착 물질을 통한 리간드의 포착에 의해 복합체를 결합시키는 스텝을 포함하고, 제 2 결합 스텝은 측정 대상 물질 또는 제 1 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 시그널 생성 물질에 의해 표식된 표식화 물질을 결합시키는 스텝을 포함하는 것이 바람직하다.

여기서, 리간드로는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 펩티드류, 폴리펩티드류, 단백질류 (효소류, 항체류, 항원성 단백질류, 당단백질류, 리포단백질류, 아비딘 등), 호르몬류, 면역계 모듈레이터, 비타민류, 스테로이드류, 탄수화물류 (예를 들어, 당류), 당지질류, 핵산류 (1 본쇄 및 2 본차 올리고뉴클레오티드를 포함한다), 합텐류, 렉틴류, 비오틴 등을 들 수 있다. 이 중에서도 비오틴을 사용하는 것이 바람직하다.

리간드 포착 물질로는, 제 1 물질에 도입되는 리간드를 포착할 수 있으면, 어떤 물질이어도 되고, 리간드에 따라 적절히 선택 가능하다. 리간드-리간드 포착 물질과의 조합으로는, 항원-항체, 합텐-항체, 당-렉틴, 항체-프로테인 A/G, 비오틴-항비오틴 항체 등을 들 수 있다. 그리고, 리간드로서 비오틴을 사용하는 경우, 리간드 포착 물질로서 항비오틴 항체나 아비딘, 스트렙토 아비딘 등을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 리간드 포착 물질을 고상 반응 용기 (100) 의 노출면 (50a) 에 고정화시키려면, 일반적으로 사용되는 물리적 흡착 또는 화학적 결합에 의해 실시할 수 있다. 이 경우, 리간드 포착 물질을 직접 노출면 (50a) 에 고정시켜도 되고, 리간드 포착 물질에 특이적으로 결합하는 항체 등을 스페이서 물질로서 노출면 (50a) 에 고정화시킨 후, 당해 스페이서 물질을 통해서 리간드 포착 물질을 고정화시키는 형태로 해도 된다.

시그널 생성 물질로는, 예를 들어, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코오스옥시다아제, 우레아제, 크레아틴키나아제, 우리카아제, 글루코오스-6-포스페이트데하이드로게나아제, 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 서양 와사비 퍼옥시다아제를 사용하는 것이 바람직하다. 그리고, 시그널 생성 물질이 서양 와사비 퍼옥시다아제 등의 퍼옥시다아제인 경우, 생성되는 시그널은 기질에 의존하여 비색 시그널, 화학 루미네선스 시그널로서 얻을 수 있다. 비색 시그널의 생성에 사용되는 기질로는, 예를 들어, 테트라메틸벤지딘 및 그 유도체, o-페닐렌디아민, 트리아릴메탄류, 이미다졸 류코 색소류 등을 사용할 수 있다. 또, 화학 루미네선스 시그널의 생성에는, 예를 들어, 아크리디늄염류, 디옥세탄류, 루시페린, 루시게닌, 염화옥살릴 등을 들 수 있다. 또한, 시그널 생성 물질로는, 상기한, 소위, 효소 항체법에 사용되는 물질에 한정되는 것이 아니라, 예를 들어, 오토라디오그래피에 사용되는 방사성 동위 원소, 금 콜로이드법에 사용되는 금 콜로이드, 형광 항체법에 사용되는 FITC, RITC, CY, Alexe 계의 형광 색소를 시그널 생성 물질로서 사용해도 상관없다.

다음으로, 본 실시형태에 관련된 측정법에 대해, 측정 대상 물질을 알레르겐 특이적 IgE 로 한 예에 대해 구체적으로 설명한다. 알레르겐으로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 하우스 더스트 1 (2), 집먼지 진드기, 삼나무, 노송나무, 오리나무 (속), 자작나무 (속), 오리새, 돼지풀, 쑥, 알터나리아, 아스페르길루스, 말라쎄지아 (속), 고양이 (비듬), 개 (비듬), 바퀴벌레, 나방, 라텍스 등의 흡입계·그 밖의 알레르겐, 우유, 난백 (卵白), 오포뮤코이드, 쌀, 밀 (열매), 메밀, 대두, 피넛, 사과, 키위, 참깨, 쇠고기, 닭고기, 새우, 게, 고등어, 연어, 다랑어 등의 음식물계 알레르겐과 같은, 의료 기관 등에서 알레르겐 검사 항목으로서 진찰 가능한 것이면 어떤 알레르겐도 선택 가능하다.

도 6 은, 고상 반응 용기 (100) (노출면 (50a)) 에 리간드 포착 물질로서의 항비오틴 항체 (염소) 를 고정화시키는 공정을 설명하는 플로우 차트이다. 먼저, 스텝 S200 에 있어서, 미감작 (未減作) 의 고상 반응 용기 (100) 의 개구부 (13) 를 통해서, 예를 들어, 시트르산 완충액 등의 습윤액 10 ㎕ 를 공급한다.

습윤액 10 ㎕ 가 흡수 부재 (40) 에 흡수된 후, 스페이서 물질로서 항염소 IgG 항체 (당나귀) 용액 5 ㎕ 를 공급하고, 당해 항염소 IgG 항체를 필터 부재 (50) 의 노출면 (50a) 에 고정화시킨다 (스텝 S201).

다음으로, 리간드 포착 물질로서의 항비오틴 항체 (염소) 용액 5 ㎕ 를 공급하고, 항염소 IgG 항체를 통해서 항비오틴 항체를 고정화시킨다 (스텝 S202).

그리고, 예를 들어, 소혈청 알부민 등을 포함하는 인산 완충액 등의 보호액 10 ㎕ 를 통액 후 (스텝 S203), 1 시간 정도, 풍건 등에 의해 건조시킴으로써, 리간드 포착 물질의 고정화는 완료한다.

도 6 에서 설명한 리간드 포착 물질의 고정화는, 측정 대상물의 측정 직전에 실시해도 되고, 미리 리간드 포착 물질을 고정화시킨 필터 부재 (50) 를 잘라내어, 고상 반응 장치 (100) 에 세트하는 형태로 해도 된다.

도 7 은, 리간드 포착 물질로서 항비오틴 항체를 고정화시킨 고상 반응 용기 (100) 를 사용한 구체적인 측정법을 설명하는 플로우 차트이다. 먼저, 피험자로부터 채취한 샘플 (검체) 5 ㎕ 와 제 1 물질로서의 비오틴화 항사람 IgE 항체 또는 비오틴화 알레르겐 용액 5 ㎕ 를 3 분간, 액상 반응시키고 복합체를 형성시킨다 (스텝 S300).

다음으로, 스텝 S300 에서 조정한 혼합 용액으로부터 5 ㎕ 분주하고, 고상 반응 용기 (100) 의 개구부 (13) 를 통해서 공급함으로써 1 분간 고상 반응을 실시한다 (스텝 S301).

스텝 S302 에 있어서, 서양 와사비 퍼옥시다아제 (HRP) 로 표식화한 표식화 물질로서의 항사람 IgE 항체 (마우스) 용액 5 ㎕ 를 고상 반응 용기 (100) 의 개구부 (13) 를 통해서 공급함으로써 1 분간 고상 반응을 실시한다.

그리고, 예를 들어, tween20 등의 계면 활성제를 포함하는 세정액 5 ㎕ 로 3 회 세정 후 (스텝 S303), 테트라메틸벤지딘 (TMB) 등의 기질을 첨가하고, 600 ∼ 660 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써, 검체 중에 포함되는 알레르겐 특이적 IgE 의 양을 측정한다 (스텝 S304).

이와 같이, 흡광도의 측정에 필요로 하는 시간을 예를 들어 1 분간으로 하면, 본 실시형태에 의하면, 모든 측정 동작이 6 분간 정도에서 종료하기 때문에, 신속하게 측정 결과를 얻을 수 있다.

도 8 은, 본 실시형태에 관련된 측정 방법에 있어서 표준액 및 알레르겐으로서 삼나무를 선택한 경우의 측정 결과를 나타낸 도면이다. 도 8(a) 에 나타내는 바와 같이, 표준액의 농도 변화 (0 IU/㎖ ∼ 100 IU/㎖) 에 수반하여, TMB 의 발색에 차이가 보이고, 본 측정법이 유효한 측정계인 것이 확인되었다. 또, 도 8(b) 의 알레르겐으로서 삼나무를 선택한 경우의 측정 결과에도 나타내는 바와 같이, 검체에 포함되는 알레르겐 (삼나무) 특이적 IgE 의 양에 따라 TMB 의 발색에 차이가 보이고, 본 측정법이 유효한 측정계인 것이 확인되었다.

또한, 피험자로부터 채취한 샘플 (검체) 과 제 1 물질을 액상 반응시켜 복합체를 형성시키는 혼합 용기로는, 예를 들어, 도 9 에 나타내는 바와 같이, 고상 반응 용기 (100) 에 혼합 전용의 혼합 용기 (101) 를 병설 (倂設) 한 것을 사용하는 것도 가능하다.

또, 도 10 에 나타내는 바와 같이, 다검체의 연속 처리를 실현하기 위해서, 본 실시형태에 관련된 고상 반응 용기 (100') 를 복수 연속해서 플레이트 (102) 상에 형성하고, 마이크로타이터 플레이트 형상과 같이 구성하는 것도 가능하다. 이 경우, 세정액을 수용하는 세정액 웰 (103), 보호액을 수용하는 보호액 웰 (104) 등을 플레이트 상에 형성하는 것도 가능하다.

이상과 같이, 본 실시형태에 의하면, 측정에 필요한 시료액을 극소량으로 할 수 있고, 신속하게 측정 결과를 얻는 것이 가능한 고상 반응 용기 및 이것을 사용한 측정 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 실시형태의 설명에 있어서는, 측정 대상물로서 알레르겐 특이적 IgE 의 예에 대해 설명했지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 측정 대상물로서, 펩티드류, 폴리펩티드류, 단백질류 (효소류, IgE 이외의 항체류, 항원성 단백질류, 당단백질류, 리포단백질류, 아비딘 등), 호르몬류, 면역계 모듈레이터, 비타민류, 스테로이드류, 탄수화물류 (예를 들어, 당류), 당지질류, 핵산류 (1 본쇄 및 2 본차 올리고뉴클레오티드를 포함한다) 로 하는 것도 가능하다.

상기 측정 대상물을 타겟으로 함으로써, 예를 들어, 식도암, 폐암, 편평미 상피암, 소세포암, 간세포암, 담도암, 전립선암, 신경아세포종, 갑상선 골수형암, 유방암, 위암, 췌암, 대장암, 자궁경부암, 자궁체부암, 난소암과 같은 종양 마커, 아메바 이질, E 형 간염, 인플루엔자, 웨스트나일열, HIV 감염증·AIDS, A 형 간염, 에키노코쿠스증, 에볼라 출혈열, 예르시니아 감염증, 황열, 온코세르카증, 회귀열, 개선 (疥癬), 캄필로박터 감염증, Q 열, 광견병, 우해면상뇌증, 요충증, 크립토스포리듐증, 크림·콩고 출혈열, 결핵, 콕시디오이데스증, 콜레라, 세균성 이질, 사이클로스포라증, 살모넬라균 감염증, SARS, 지아디아증, C 형 간염, 디프테리아, 주혈흡충증, 주혈선충증, 조충증, 신증후성 출혈열, 수두, 수막염균성 수막염, 성행위 감염증, 연중증, 진드기 매개성 뇌염, 탄저, 치쿤구니야열, 장염 비비리오, 장관 출혈성 대장균 감염증, 장티푸스, 수족구병, 뎅기열, 두창, 톡소플라스마증, 조류 인플루엔자, 트리파노소마증, 남미 출혈열, 일본 뇌염, 낭충증, 노로바이러스 감염증, 폐렴 구균 감염증, 파상풍, 바르토넬라균 관련 질환, 한타바이러스 폐증후군, B 형 간염, 히스토플라스마증, 인간 파필로마바이러스 감염증, 피부 유충 이행증, 필라리아증, 풍진, 브루셀라증, 분선충증, 페스트, 폴리오, 마르부르크병, 홍역, 말라리아, 라임병, 라사열, 리슈마니아증, 리케차 감염증, 리프트밸리열, 유비저 (類鼻疽), 레지오넬라증, 렙토스피라증, 로타바이러스 감염증과 같은 감염증, 심근 괴사·장애 마커, 심근 스트레스 마커, 플라크 불안정화 마커, 염증 마커와 같은 심근 마커, 또는 자기 면역성 용혈성 빈혈, 수포성류 천포창, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증근무력증, 천포창, 악성 빈혈, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 1 형 당뇨병, 혈관염과 같은 자기 면역 질환 등의 간이 진단 툴로서의 사용도 가능하다.

또, 본 발명에 관련된 고상 반응 용기는 측정의 간편함에 더하여, 휴대성도 우수하다는 점에서, 상기한 사람의 질병에 대한 진단 툴로서의 뿐만 아니라, 양, 돼지, 염소, 소, 닭, 집오리, 칠면조, 거위, 잡종 오리, 꿩, 메추라기 등의 식용 가축, 개, 고양이, 햄스터, 모르모트, 잉꼬, 앵무새, 열대어 등의 애완용 가축, 말, 낙타, 물소, 노새, 당나귀, 야크, 포니 등의 노동용 가축, 또는 그 외 야생 동물이 보유하는 각종 병원체 등의 옥외에서의 간이 검사에도 적용 가능하다.

또한, 본 실시형태의 설명에 있어서는, 소위 샌드위치법에 대해 설명했지만, 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 예를 들어, 항사람 IgE 항체나 알레르겐을 직접 필터 부재에 고정화시키는 직접 흡착법에 대해서도 적용 가능한 것은 말할 필요도 없다.

10 : 상부 덮개
11 : 천면부
12 : 원환부
13 : 개구부
13a : 구경
14 : 외주 벽면
15 : 내주 벽면
16 : 걸어맞춤부
20 : 하부 덮개
21 : 저부
22 : 통기구
23 : 외주 벽면
24 : 피걸어맞춤부
25 : 대좌부
26 : 외주 벽면
27 : 홈부
30 : 내부 공간
40 : 흡수 부재
50 : 필터 부재
50a : 노출면
100, 100' : 고상 반응 용기
101 : 혼합 용기
102 : 플레이트
103 : 세정액 웰
104 : 보호액 웰

Claims (17)

1. 천면 (天面) 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와,
   상기 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와,
   상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 수용되는 흡수 부재와,
   상기 흡수 부재의 상기 상부 덮개 부재측 단면 (端面) 에 형성된 필터 부재를 구비하고,
   상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면을 고상 반응의 반응장으로 하는 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 흡수 부재는 압궤한 상태로 상기 내부 공간에 수용되는 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 개구부의 직경은 1.5 ㎜ 이하인 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 필터 부재는 유리 섬유인 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 하부 덮개 부재의 외주벽에는 상기 상부 덮개 부재의 내주벽에 형성된 걸어맞춤부와 걸어맞춤 가능한 피걸어맞춤부가 형성되고, 당해 걸어맞춤부와 당해 피걸어맞춤부가 걸어맞춰짐으로써 상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재는 끼워 맞춰지는 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 하부 덮개 부재의 외주벽은 상기 저부를 형성하는 대좌부로부터 연장되어 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 대좌부는 상기 상부 덮개 부재의 상기 개구부를 수용 가능한 홈부를 구비하는 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
   상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰졌을 때에 상기 상부 덮개 부재의 외주 벽면과 상기 대좌부의 외주 벽면은 동일 벽면 상에 배치되고, 끼워 맞춤 후의 형상은 원통 형상인 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 흡수 부재는 다당류로 이루어지는 다공질 매트릭스인 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 다당류는 아세테이트인 것을 특징으로 하는 고상 반응 용기.
11. 천면 부분의 대략 중앙부에 테이퍼 형상의 개구부를 갖는 상부 덮개 부재와,
    상기 상부 덮개 부재와 끼워 맞춤 가능하도록 형성되고, 저부에 통기부를 갖는 하부 덮개 부재와,
    상기 상부 덮개 부재와 상기 하부 덮개 부재가 끼워 맞춰짐으로써 형성되는 내부 공간에 수용되는 흡수 부재와,
    상기 흡수 부재의 상기 상부 덮개 부재측 단면에 형성된 필터 부재를 구비한 고상 반응 용기를 사용하고,
    상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면 상에 측정 대상 물질을 결합시키는 제 1 결합 스텝과,
    상기 측정 대상 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 시그널 생성 물질에 의해 표식된 표식화 물질을 상기 측정 대상 물질에 결합시키는 제 2 결합 스텝과,
    상기 시그널 생성 물질에 의해 발생한 시그널을 측정하는 측정 스텝을 구비하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 제 1 결합 스텝은 상기 개구부를 통한 상기 필터 부재의 노출면에 대하여, 리간드를 포착하는 리간드 포착 물질을 고정화시키는 고정화 스텝과,
    상기 측정 대상 물질과, 당해 측정 대상 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 상기 리간드가 도입된 제 1 물질을 혼합함으로써 복합체를 형성하는 혼합 스텝과,
    상기 리간드 포착 물질을 통한 상기 리간드의 포착에 의해 상기 복합체를 결합시키는 스텝을 포함하고,
    상기 제 2 결합 스텝은 상기 측정 대상 물질 또는 상기 제 1 물질에 대하여 특이적 결합능을 갖고 시그널 생성 물질에 의해 표식된 표식화 물질을 결합시키는 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 리간드-리간드 포착 물질과의 조합은, 항원-항체, 합텐 항체, 당-렉틴, 항체-프로테인 A/G, 또는 비오틴-항비오틴 항체 중 어느 것인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 제 1 물질은 상기 리간드로서 비오틴이 도입된 알레르겐인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
15. 제 13 항에 있어서,
    상기 제 1 물질은 상기 리간드로서 비오틴이 도입된 항 IgE 항체인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표식화 물질은 상기 측정 대상 물질 또는 상기 제 1 물질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시그널 생성 물질은 퍼옥시다아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 측정 방법.

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