KR20170093100A - 개선된 골유도성 기질 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

다공성 세라믹 과립에 골유도성 물질을 부하한 다음, 생체적합성 매트릭스 물질과 접촉시켜 놓는, 골유도성 합성 뼈 이식편을 제조하는 시스템 및 방법이 제공된다.

Description

개선된 골유도성 기질 및 그의 제조 방법{IMPROVED OSTEOINDUCTIVE SUBSTRATES AND METHODS OF MAKING THE SAME}

본 출원은 의료 장치 및 생물학적 요법, 더욱 특별하게는 단백질-부하 매트릭스를 포함하는 뼈 회복을 위한 기질에 관한 것이다.

관련 출원과의 상호-참조

본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에서 반데르플로그 등(Vanderploeg et al.)에 의해 2014년 8월 28일에 출원된 미국 가특허출원 62/043,356 및 덱커 등(Decker et al.)에 의해 2015년 5월 1일에 출원된 미국 가특허출원 62/155,835를 우선권 주장한다. 상기 출원의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

매년 대략 2백만 건의 정형외과적 절차에서 뼈 이식편이 사용되고, 이는 일반적으로 3개 형태 중의 하나를 취한다. 전형적으로 환자의 한 부위로부터 수집된 뼈를 동일 환자의 또 다른 부위로 이식하는 것으로 구성된 자가이식편은, 이러한 물질이 동시에 골전도성 (이것이 새로운 뼈 성장을 위한 스캐폴드(scaffold)로서의 역할을 한다), 골유도성 (골아세포의 발생을 촉진한다), 및 골형성성 (새로운 뼈를 형성하는 골아세포를 함유한다)이므로, 뼈 이식 물질을 위한 기준이다. 그러나, 자가이식편의 공급 제약으로 인해 사체-유래 동종이식편의 사용이 필요하였다. 그러나, 동종이식편은 숙주-이식편 면역 반응을 촉발하거나 감염성 또는 프리온 질환을 전염시킬 수도 있기 때문에 이러한 물질은 자가이식편보다 덜 이상적이고, 종종 멸균하거나 또는 세포를 제거하기 위해 처리하여 그들의 골형성성을 제거한다.

인간-유래 뼈 이식편 물질의 단점은 합성 뼈 이식편 물질에 대한 관심을 점점 증가시키는데 기여하고 있다. 합성 이식편은 전형적으로 페이스트 또는 퍼티의 형태로 전달되는 칼슘 세라믹 및/또는 시멘트를 포함한다. 이러한 물질은 골전도성이지만, 골유도성이거나 골형성성은 아니다. 그의 효능을 개선하기 위하여, 합성 칼슘-함유 물질에 골유도성 물질, 특히 뼈 형태형성 단백질(BMP), 예컨대 BMP-2, BMP-7, 또는 기타 성장 인자, 예컨대 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및/또는 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)를 부하하였다. 그러나, 심각한 기술적인 문제들이, 합성 뼈 이식편 대체물에 골유도성 물질의 효율적인 혼입을 막았으며, 이것은 다시 고-품질 골유도성 합성 뼈 이식편 물질의 개발을 제한하였다.

발명의 요약

본 발명은, 골유도성 물질의 개선된 부하를 갖는 이식편 물질 뿐만 아니라 그의 제조 및 사용 방법을 제공함으로써, 현재-세대의 합성 뼈 이식편의 단점을 해결한다. 한 측면에서, 본 발명은 골유도성 물질 (이 물질은 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 단백질 또는 펩티드이며, 본원에 기재된 일례의 실시양태에서 "골유도성 단백질"로서 상호교환적으로 언급된다), 칼슘 세라믹 과립 및 유동성 생체적합성 매트릭스 물질 중의 적어도 하나, 및 적어도 하나의 챔버 및 단백질, 과립 및/또는 매트릭스 물질을 챔버에 도입하기 위한 적어도 하나의 입구를 한정하는 장치를 포함하는, 복합 골유도성 스캐폴드를 형성하기 위한 시스템에 관한 것이다. 다양한 경우에, 골유도성 물질은 수용액 중에 존재하고, 및/또는 장치는 (예를 들어, 챔버(들) 내에 또는 챔버에 유체 연결된) 정적 혼합 요소를 포함한다. 일부 경우에, 과립, 골유도성 물질 및/또는 유동성 생체적합성 매트릭스 물질 중의 하나 이상이 포로겐과 함께 스캐폴드를 포함하거나 그것에 통합되고, 이 포로겐은 임의로 침출성, 붕괴성, 용해성 또는 달리 분해성인 과립의 평균 크기와 유사한 평균 크기를 갖는 제거가능한 입자이다. 매트릭스는 임의로 히알루론산 (HA), 변형된 HA, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자기-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PEG의 유도체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머, 및 이들의 공중합체 또는 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 과립이 사용된다면, 이것은 일반적으로 다공성이며, 모노칼슘 포스페이트 일수화물, 디칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 탈수화물, 옥토칼슘 포스페이트, 침전된 히드록시아파타이트, 침전된 비정질 칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트 (α-TCP), 베타-트리칼슘 포스페이트 (β-TCP), 소결된 히드록시아파타이트, 옥시아파타이트, 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 물질을 포함할 수도 있다. 골유도성 물질은 임의로 뼈 형태형성 단백질 2 (BMP-2), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, 디자이너 BMP, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한편, 장치는 스캐폴드에 혼입된 요소, 예컨대 챔버 내에 또는 챔버에 연결가능한 정적 혼합 요소, 및/또는 챔버에 삽입가능한 천공 바늘의 혼합을 개선하는 구조물을 임의로 포함한다. 일부 경우에, 이하에서 더욱 상세히 기재된 바와 같은 방법을 수행하고/하거나 의료용 이식물을 형성하기 위해 시스템의 다양한 실시양태가 사용될 수도 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 과립을 골유도성 물질을 포함한 용액과 접촉시킴으로써 칼슘 세라믹 과립에 골유도성 물질을 부하하거나 그와 결합시키는 것을 포함하는, (임의로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 상기 기재된 시스템의 하나를 사용하여) 합성 이식편 물질을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 용액은 과립과 함께 생체적합성 매트릭스의 후속 형성을 촉진하는 시약, 예를 들어 겔화제, 겔화 촉매 및/또는 가교제를 임의로 포함한다. 방법은 또한, 단백질-부하된 과립 위로 유동할 수 있는 (예를 들어, 유동성 매트릭스 물질을 단백질-부하된 과립을 함유한 챔버로 유동시킴으로써) 생체적합성 매트릭스에 단백질-부하된 칼슘 세라믹 과립을 매립하는 것을 포함할 수도 있다. 다양한 실시양태에서, 골유도성 물질은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, 또는 디자이너 BMP이다. 칼슘 세라믹 과립은 다양하게 칼슘 술페이트 및 칼슘 포스페이트, 예컨대 히드록시아파타이트, 트리-칼슘 포스페이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 한편, 생체적합성 매트릭스 물질은 다양한 실시양태에서 히알루론산 (HA) 및 그의 관능화 또는 변형된 형태, 동물이든지 또는 재조합 인간이든지의 콜라겐, 젤라틴 (동물 또는 재조합 인간), 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자기-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 그의 유도체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머 및 관련 기술분야에 공지된 기타 감열성 또는 역-감열성 중합체를 포함하는 관능화 또는 달리 가교가능한 합성 생체적합성 중합체, 및 상기 임의의 하나 이상의 공중합체 또는 혼합물이다. 일부 경우에, 생체적합성 매트릭스 물질은 반응성이며, 겔 또는 기타 중합체 덩어리를 형성하기 위해 하나 이상의 중합 반응 및 가교 반응을 겪도록 촉발될 수 있고; 이러한 경우에, 반응(들)은 임의로 30초 내지 5분이 걸리고, 매트릭스 물질은 임의로 이 간격 동안에 과립 위로 유동하고/하거나 과립과 함께 혼합될 수 있고, 이에 의해 더욱 균일한 이식물의 형성을 촉진한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 시스템 및/또는 방법을 사용하여 형성된 이식물에 관한 것이며, 이 이식물은 생체적합성 매트릭스, 칼슘 세라믹 과립의 내부 표면 (예를 들어, 공극 표면)과 결합된 골유도성 물질을 포함하고, 이 칼슘 세라믹 과립은 다시 매트릭스와 결합된다. 바람직한 경우에, 이식물은 실질적으로 균일하며, 다시 말해서 골유도성 물질 및 칼슘 세라믹 과립 및 생체적합성 매트릭스 물질 중 하나 이상의 농도가 이식물의 적어도 하나의 물리적 차원을 따라 실질적으로 일정하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 과립이 생체적합성 매트릭스에 매립되고, 골유도성 물질로 부하되거나 그와 결합된 칼슘 세라믹 과립을 포함하는 조성물을 전달하는 것을 포함하는, 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 다양한 실시양태에서, 골유도성 물질은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, 또는 디자이너 BMP이다. 칼슘 세라믹 과립은, 다양하게, 칼슘 술페이트 및 칼슘 포스페이트, 예컨대 히드록시아파타이트, 트리-칼슘 포스페이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 한편, 생체적합성 매트릭스는 다양한 실시양태에서 히알루론산 (HA) 및 그의 관능화 또는 변형된 형태, 동물이든지 또는 재조합 인간이든지의 콜라겐, 젤라틴 (동물 또는 재조합 인간), 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자기-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 그의 유도체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머 및 관련 기술분야에 공지된 기타 감열성 또는 역-감열성 중합체를 포함하는 관능화 또는 달리 가교가능한 합성 생체적합성 중합체, 및 상기 임의의 하나 이상의 공중합체 또는 혼합물이다.

또한, 또 다른 측면에서, 본 발명은 골유도성 물질로 환자를 치료하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 일반적으로 칼슘 세라믹 과립, 골유도성 물질, 및 생체적합성 스캐폴드 물질, 뿐만 아니라 이들을 조합하여 골유도성 합성 뼈 이식편을 형성하기 위한 기계적 도구를 포함한다. 일부 경우에, 키트는 과립을 유지하기 위한 챔버 뿐만 아니라 그를 통해 유체가 챔버로 공급되고/되거나 챔버로부터 방출될 수 있는 입구 및 출구를 포함하는 용기를 포함한다. 한 계획에서, 골유도성 물질을 포함한 액체를 상기 입구를 통해 유동시켜 과립을 이것과 접촉시킴으로써 과립에 골유도성 물질을 부하하며; 그 후, 과립을 생체적합성 매트릭스 물질과 혼합하거나 또는 달리 이것과 접촉시켜 놓는다.

본 발명의 특정한 실시양태는 첨부된 도면에 의해 예증된다. 도면은 반드시 일정한 축척이어야 하는 것은 아니며, 본 발명의 이해를 위해 필요하지 않거나 기타 세부사항을 인지하기 어렵게 만드는 세부사항을 생략할 수도 있음을 이해할 것이다. 본 발명이 본원에 예증된 특별한 실시양태로 반드시 제한되는 것이 아님을 이해할 것이다.
도 1A-B는 상이한 거대다공성을 갖는 본 발명의 2개 구조물을 나타낸다.
도 2A-C는 합성 골유도성 뼈 이식편 물질을 제조하는 일례의 방법에서 몇 가지 단계를 나타낸다.
도 3A는 천공 바늘을 포함하는 일례의 혼합 장치를 나타낸다. 도 3B는 일례의 혼합 챔버에서 유체 유동의 방향을 도시한다. 도 3C-N은 다른 것은 유사한 혼합 장치에서 골유도성 인자 (여기서, 시안 중의 BMP2) 및 생체적합성 매트릭스의 용액을 과립에 적용하기 위해 바늘을 사용하지 않고 (C 내지 H) 그리고 중심에 위치한 천공 바늘을 사용하여 (I 내지 N) 만들어진 스캐폴드의 단면도를 나타낸다. 이 도면들은 매립된 천공 바늘을 갖지 않는 장치에 비해 용액을 적용하기 위해 천공 바늘을 사용하여 달성되는 골유도성 물질, 과립 및 매트릭스 물질의 개선된 분포를 도시한다.
도 4A-B는 말단부를 혼합 및 정돈한 후 (2A) 및 혼합 후에 주사기 내에서 형성된 (2B) 원통형 이식물을 나타낸다.
도 5는 압축 시험 전에 레오미터 상의 원통형 이식물의 슬라이스를 나타낸다.
도 6은 다양한 히드로겔 조성물에 대하여 전단 저장 (G') 및 전단 손실 (G") 계수 간의 위상차를 비교한 그래프이다.
도 7은 가교 반응을 완결하기 위해 각각의 히드로겔 조성물에 필요한 시간을 나타내는 그래프이다.
도 8은 각각의 히드로겔 조성물의 최대 강성도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 2개의 혼합 주사기를 부착하기 위한 다양한 커넥터 설계를 나타낸다.
도 10A-D는 혼합 잠재력을 시험하기 위해 사용된 내부 혼합 구조의 변형을 나타낸다. 정적 믹서 설계는 중공 튜브 (10A), 반-구형 (10B), 단일 크로스바 (10C) 및 이중 크로스바 (10D)를 포함한다.
도 11A-B는 혼합 절차 (11B)의 가시화가 가능하도록 투명 플라스틱 (11A)으로 제조된 커넥터의 기계 밀링된 원형을 나타낸다.
도 12는 반-구형 정적 믹서를 포함하는 커넥터 내에 축적된 폐기 물질을 나타낸다.
도 13A-B는 2개의 혼합 주사기 (13B)에 연결된 단일 크로스바 정적 믹서 (13A)를 포함하는 3-D 프린트된 커넥터를 나타낸다.
도 14A-B는 시험된 각각의 히드로겔 조성물에 대해 각각 5 mm 구획의 탄성 계수 (14A) 및 밀도 (14B)의 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 15는 상이한 과립 농도로 구성된 히드로겔 조성물의 기계적 성질의 가변성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 동일한 과립 조성을 갖는 히드로겔 조성물의 슬라이스 간의 기계적 성질의 편차를 나타내는 그래프이다.
도 17은 각각의 히드로겔 조성물의 슬라이스 간의 형광 태그된 알부민의 표준화된 강도 값을 나타내는 그래프이다.
도 18은 각각의 히드로겔 조성물에 대해 형광단 태그된 알부민 형광의 편차를 나타내는 그래프이다.
도 19는 20% 또는 30% 과립을 포함하는 히드로겔 조성물의 4개의 슬라이스 내에서 AF488로 태그된 BMP-2의 표준화된 강도 값을 나타내는 그래프이다.
도 20A-B는 BMP 완충액에 희석된 BMP-2와 함께 30 부피% 과립을 함유하는 히드로겔 조성물의 공촛점 영상이다.
도 21A-B는 AF488 태그된 BMP-2로부터의 형광 방출의 평균 강도를 나타내는 그래프이다.

골유도성 조성물

본 발명의 다양한 실시양태에 따른 이식물 (또한 "구조물"이라고 언급됨)은 일반적으로 3개 성분을 포함한다: 칼슘 세라믹 또는 다른 고체 광물 바디와 같은 골전도성 물질, 뼈 형태형성 단백질과 같은 골유도성 물질, 및 겔 또는 기타 덩어리를 형성하기 위해 반응하는 유동성 생체적합성 매트릭스 물질. 본원에 사용된 바와 같이, 골전도성 물질은 골아세포, 전-골아세포, 골조상 세포, 간엽 줄기 세포, 및 골격 조직을 합성 및/또는 유지하는 세포로 분화하거나 또는 달리 그의 발생을 촉진할 수 있는 다른 세포를 포함하는 조골 세포의 내성장을 촉진시키는 임의의 물질을 가리킨다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 골전도성 물질은 과립 상에 부하되는 골유도성 물질의 지속 방출을 제공하기에 적합한 골전도성 칼슘 포스페이트 세라믹을 포함하는 다공성 과립이다. 일부 경우에, 과립은 골유도성 물질이 부착하거나 달리 결합할 수 있는 표면을 정의하는 미세- 및 거대-공극을 양쪽 모두 포함한다. 미세-공극 및 거대-공극 양쪽 모두 골유도성 물질이 부착할 수 있는 전체 표면적을 증가시키지만, 단지 거대-공극 만이 세포에 의한 침윤을 허용한다. 따라서, 거대-공극을 침윤하는 세포에 의해 과립이 분해되기 때문에, 미세-공극 내의 골유도성 물질이 단지 서서히 이용할 수 있게 된다.

과립은 본 발명의 이식물을 제 자리에 유지할 수 있고 뼈의 형성 및 편성(knitting)에 최적인 시간 간격 (예를 들어, 일, 주 또는 월)에 걸쳐 골유도성 물질을 방출하기에 적합한 조성 및 구조를 갖는 임의의 적절한 골전도성 물질로 제조 될 수 있다. 이러한 특징이 적용 간에 다양할 수도 있지만, 과립은 일반적으로 제한없이 모노칼슘 포스페이트 일수화물, 디칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 탈수화물, 옥토칼슘 포스페이트, 침전된 히드록시아파타이트, 침전된 무정형 칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트 (α-TCP), 베타-트리칼슘 포스페이트 (β-TCP), 소결된 히드록시아파타이트, 옥시아파타이트, 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트 및 이들의 조합을 포함한다.

과립 구조와 관련하여, 바람직한 실시양태에서, 과립은 본 발명의 이식물을 제 자리에 유지할 수 있고 뼈의 형성 및 편성에 최적인 시간 간격 (예를 들어, 일, 주 또는 월)에 걸쳐 골유도성 물질을 방출하도록 선택되는 (a) 표면적 및 (b) 다공성을 특징으로 한다. 다공성은 2개 성분: 미세다공성 및 거대다공성을 가지며, 이것은 원하는 과립 체류 시간 또는 골유도성 물질의 방출 속도를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 미세다공성은 일반적으로, 비교적 좁은 평균 직경을 갖지만 그럼에도 불구하고 미세공극의 표면과 즉시 접촉하지 않으면서 BMP-부하 용액과 같은 유체가 미세공극 내에 침윤할 수 있도록 충분히 큰 (즉, 과다한 표면 장력 없이 유체 접근이 가능하도록 충분히 큰) 공극의 존재를 가리킨다. 과립과 관련하여, 거대다공성은 일반적으로 세포에 의한 침윤을 허용하는 크기를 갖는 공극의 존재를 가리킨다.

골유도성 물질은 일반적으로 골아세포의 생성을 자극하거나 그의 활성을 증가시키고 및/또는 파골세포의 활성 또는 생성을 억제하는 펩티드 및 비-펩티드 성장 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골유도성 물질은 TGF-β와 같은 형질 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 상과의 요소이다. 더욱 바람직하게는, 골유도성 물질은 뼈 형태형성 단백질 (BMP), 예컨대 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, 또는 디자이너 BMP, 예컨대 발명의 명칭이 "디자이너 골형성성 단백질 (Designer Osteogenic Proteins)"인 미국 특허-전 공개번호 US20120046227 A1 (Berasi et al.) (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 BMP-GER 또는 BMP-GER-NR 키메라 BMP이다. 다른 실시양태에서, 골유도성 물질은 섬유아세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 소분자, 뉴클레오티드, 지질, 또는 본원에 기재된 인자들 중의 하나 이상의 조합이다.

본 발명의 다양한 실시양태는 생체적합성 매트릭스를 사용하고, 이것은 바람직하게는 (a) 과립과 함께 사용될 때, 이식 시에 놓이는 하중을 견디기에 충분한 경도 및/또는 컬럼 강도를 나타내고, (b) 과도한 염증 (즉, 새로운 뼈의 형성 또는 부러진 뼈의 편성을 억제하거나 방지하기에 충분한 염증)을 일으키지 않고, 골아세포의 증식을 억제하거나 또는 달리 과립 및/또는 골유도성 물질의 활성을 방해하고, (c) 새로운 뼈의 침착을 허용하기에 적절한 간격 동안 충분한 응집력을 갖는 임의의 적절한 생체적합성 물질일 수 있다. 추가로, 생체적합성 매트릭스는 임의로 분해성 및/또는 골전도성이다. 바람직한 실시양태에서, 생체적합성 매트릭스는, 겔 또는 기타 고체 덩어리를 형성하기 위해 반응하는 유동성 전구체 물질로부터, 예를 들어 과립의 존재하에서 중합 및/또는 가교시킴으로써 제조된다. 다양한 실시양태에서, 매트릭스는 히알루론산 (HA), 및 그의 관능화 또는 변형된 형태, 동물이든지 또는 재조합 인간이든지의 콜라겐, 젤라틴 (동물 또는 재조합 인간), 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자기-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 그의 유도체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머 및 관련 기술분야에 공지된 기타 감열성 또는 역-감열성 중합체를 포함하는 관능화 또는 달리 가교가능한 합성 생체적합성 중합체, 및 상기 임의의 하나 이상의 공중합체 또는 혼합물을 포함한다. 물질이 과립 위로 유동하고/하거나 과립과 혼합될 수 있고 비교적 균일한 혼합물을 형성할 수 있도록, 매트릭스 물질이 겔 또는 기타 덩어리를 형성하는 반응 과정은 바람직하게는 예를 들어 30초, 1분, 5분, 10분 이하가 걸리는 단 시간이지만 순간적인 과정은 아니며, 이는 조성적으로 (따라서 기계적으로) 균일한 이식물을 발생시킬 것이다.

일부 경우에, 매트릭스 물질은 겔 또는 덩어리를 형성하기 위해 반응하기 위하여 하나 이상의 촉매 및 공-반응물을 필요로 한다. 촉매 또는 공-반응물은 매트릭스 물질과 동시에 제공되거나, 또는 일부 경우에 매트릭스 물질의 도입 전에 제공될 수도 있다. 하나의 예에서, 선택된 매트릭스 물질이 효소적-촉매된 가교 반응을 겪기 위해 필요한 시약 (과산화수소)이 과립에 적용된 골유도성 물질 용액에 포함되었다. 따라서, 중합체 용액이 과립과 접촉했을 때 가교가 시작되었다. 과산화수소, 광개시제, 또는 2가 양이온과 같은 다른 가교제 또는 중합제를 매트릭스 물질의 첨가 전에 과립에 또한 첨가할 수도 있다.

상기 기재된 바와 같은 골유도성 물질, 과립 및 생체적합성 매트릭스를 포함하는 본 발명의 이식물 또는 구조물은 또한 뼈 성장 및 편성의 촉진에 적합한 특징을 가지며, 이는 (a) 적용을 위해 적절한 골유도성 물질의 방출 속도, (b) 새로운 뼈 형성을 촉진하지만 방해하지 않기에 적절한 체류 시간, (c) 새로운 뼈의 형성을 수반하는 새로운 혈관 조직을 포함하여 세포 및 조직의 침윤을 허용하는 거대다공성, 및 (d) 이식물에 가해지는 하중에 견디기에 충분한 경도 및/또는 내압축성을 포함한다.

거대다공성에 관해서, 도 1은 비교적 높은 (도 1A) 및 비교적 낮은 (도 1B) 다공성을 갖는 본 발명의 구조물을 나타낸다. 도 1에 단면으로 나타낸 구조물은 서로 조성적으로 유사하지만, 도 1A의 구조물은 포로겐과 같은 크기를 갖는 수크로오스 결정을 포함하는 한편 도 1B의 구조물은 그렇지 않다. 어떠한 이론에 의해 구속되기를 바라지는 않지만, 포로겐의 첨가 없이, 구조물의 다공성은 과립 크기에 따라 변할 것으로 생각되고; 사용된 세라믹 과립의 크기가 클수록, 이들 간의 공간이 더 커진다. 그러나, 본 발명의 특정한 실시양태에서와 같이, 그리고 도 1B에 도시된 바와 같이, 세라믹 과립이 300 내지 500 마이크로미터 범위에 있을 때 과립 간의 공극은 전형적으로 포로겐의 첨가 없이 이상적인 다공성 (또한 300 내지 500 마이크로미터) 미만일 것이다.

부하 절차

본 발명의 합성 뼈 이식편 물질은 일반적으로 과립, 골유도성 물질 및 생체적합성 매트릭스 물질의 순차적 조합에 의해 제조된다. 도 2A-C는 합성 뼈 이식편을 제조하기 위한 일례의 2-단계 공정을 나타낸다. 먼저, 도 2A-B에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 골유도성 물질을 함유하는 용액을 과립 위로 유동시켜 물질이 내부 공극 표면 (존재한다면)을 포함한 과립 내의 다양한 표면에 부착될 수 있도록 함으로써 BMP와 같은 골유도성 물질이 과립에 적용된다. 바람직한 실시양태에서, 과립에 적용되는 용액의 부피는 과립을 완전히 습윤시키기에 충분하고, 이에 의해 모든 표면 (내부 공극 표면 포함)이 골유도성 물질과 함께 인큐베이션되도록 보장한다. 과립의 인큐베이션은 (미세공극의 완전한 침윤을 촉진하기에 필요할 수도 있는) 다양한 간격, 온도, 압력에서 일어날 수도 있거나, 또는 골유도성 물질 및 과립의 조합을 맞추기 위한 임의의 적절한 방식으로 달리 조작될 수도 있다. 과립 내로의 유체의 침윤은 임의로 하나 이상의 계면 활성제를 포함시킴으로써 촉진된다.

부하 단계 후에, 과립이 생체적합성 매트릭스 내에 매립된다. 일부 경우에, 도 2C에 나타낸 바와 같이, 가교가능한 예비중합체와 같은 매트릭스를 생성하는 제제를 과립에 적용하고 이것이 반응하여 매트릭스를 형성한다. 얻어진 구조물이 적절한 거대다공성 (예를 들어, 300 내지 500 마이크로미터 공극)을 갖도록 바람직하게는 포로겐을 제제에 첨가한다. 바람직한 실시양태에서 포로겐이 생체적합성이고, 구조물에서 사용되는 세라믹 과립과 유사한 크기를 갖는 입자로서 제공되며, 매트릭스의 형성 동안에 제거되거나 희석되지 않도록 매트릭스-생성 제제의 밀도보다 크거나 적어도 실질적으로 그보다 작지 않은 밀도를 갖긴 하지만, 어떠한 포로겐이라도 사용될 수 있다. 침출가능한 입자가 사용되는 경우, 이는 바람직하게는 제제에 비교적 불용성이며, 그 결과 생체적합성 매트릭스가 형성되는 동안 고체 상으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 초음파 또는 UV 광과 같은 외부 에너지의 적용에 반응하여 붕괴되거나 용해되도록 배열된 미소구가 사용되는 한편, 다른 실시양태에서 감열성 포로겐 입자, 예컨대 감열성 (또는 역-감열성) 중합체 비드가 포로겐으로서 사용된다.

구조물의 형성 후에, 프로겐이 분해되거나 빠르게 제거될 수도 있거나, 또는 구조물이 환자에게 이식된 후에도 제 자리에 유지될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 포로겐은 수 시간 또는 수 일 동안, 그러나 1주 미만 동안 무손상으로 유지된다.

상기 기재된 중합체 조성물에 추가로, 또는 그를 대신하여, 생체적합성 매트릭스는 아크릴레이트 중합체 물질 (예를 들어 폴리메틸메타크릴레이트), 탈무기질화 뼈, 칼슘 포스페이트 퍼티 등과 같은 뼈의 처리에서 유용한 기타 물질을 포함할 수도 있다.

일부 경우에, 과립의 부하 및/또는 생체적합성 매트릭스에서의 그의 배치는 최종 사용자에 의해 현장에서 수행된다. 이러한 현장에서의 부하는, 일례의 실시양태에서, 과립을 보유하고 골유도성 물질 및/또는 생체적합성 매트릭스를 그 안으로 유동시킬 수 있는 용기를 포함하는 키트에 의해 수월하게 된다. 바람직한 실시양태에서, 용기는 입구, 출구 및 다수의 과립을 보유하는 공간을 포함한다. 하나 이상의 입구 및 출구가 예를 들어 수 또는 암 루어 팁(luer tip)에 의해 유체 공급원에 연결될 수 있다. 키트는 또한 골유도성 물질의 응집체의 혼입을 제한하고/하거나 과립의 누출을 방지하기 위한 하나 이상의 필터 및 이를 통해 유동되는 물질의 혼합을 개선하기 위한 정적 믹서를 임의로 포함한다. 추가로, 골유도성 물질 및 생체적합성 매트릭스 물질의 하나 이상을 예를 들어 예비-부하된 주사기에서 액체 형태로 또는 재구성가능한 형태로 (예를 들어, 바이알에서 재구성을 위한 희석제와 함께 동결건조되거나 또는 동결-건조된 형태로) 제공할 수 있다. 포로겐이 사용되는 경우, 이것을 부하된 과립에 적용하기 직전에 생체적합성 매트릭스와 혼합하기 위해 별도로 공급할 수 있거나, 또는 하나 이상의 과립, 골유도성 물질 (예를 들어 용액과 함께) 및/또는 그 안에서 안정하다면 생체적합성 매트릭스와 함께 혼합할 수 있다. 예를 들어, 침출가능한 포로겐 입자 (예컨대 무기 염 결정)가 사용되는 경우, 이것을 별도로 제공한 다음 과립과 골유도성 물질 및/또는 생체적합성 매트릭스 물질의 인큐베이션에 첨가할 수도 있거나, 또는 예를 들어 매트릭스-물질을 과립에 적용하기 전에 희석제 (예: 물)로 습윤시킨 동결건조된 생체적합성 매트릭스 물질과 함께 제공할 수도 있고; 침출가능한 포로겐은 대략 동일한 크기이고 희석제에 비교적 불용성인 입자 또는 알갱이의 형태로 제공된다.

본 발명의 키트를 사용하기 위해, 사용자는 먼저 과립을 함유하는 용기를 골유도성 물질을 함유하는 첫 번째 용액의 공급원에 연결하고, 첫 번째 용액을 용기 내로 과립 위로 유동시킨다. 그 다음에, 사용자는 첫 번째 용액의 공급원의 연결을 끊고 생체적합성 매트릭스 물질을 함유하는 두 번째 용액의 공급원을 연결한다. 매트릭스의 형성 후에, 이식편을 제거하고, 예를 들어 정돈 및/또는 이식물에 부하함으로써 환자에게 이식하기 위해 임의로 준비한다.

본 발명의 특정한 원리는 하기 비-제한적인 실시예에 의해 예증된다:

실시예 1: 히드로겔 특징의 시험

일부 경우에, 히드로겔 스캐폴드 내의 칼슘 포스페이트 과립 상에 골유도성 물질을 균일하게 부하하기 위해 본 발명의 장치, 시스템 및 방법을 사용할 수도 있다. 하나의 잠재적인 히드로겔 물질은 티라민-치환된 히알루론산 (HA)이다. 이러한 히드로겔의 유동 특징을 이해하기 위하여, AR2000 레오미터 (TA 인스트루먼츠(TA Instruments), 미국 델라웨어주 뉴캐슬)를 사용하여, 도 3에 나타낸 것과 같이 특정 농도 (5 mg/ml 또는 10 mg/ml)에서 가교 활성 티라민 염기의 다양한 치환 (1%, 3% 및 5%)을 갖는 히드로겔에서의 진동 및 유동 시험을 분석하였다. 900 ㎕의 히드로겔이 2°, 40 ㎜ 직경 알루미늄 콘 아래의 레오미터 표면 상에 분배되는 유동 절차를 사용하여 히드로겔 속도를 시험하였다. 각각의 히드로겔의 점도는 일정 온도 (25 ℃)에서 0 내지 60 Pa의 적용된 전단 응력 범위보다 높았다. 시간에 따른 각각의 히드로겔의 변화를 분석하기 위해, 6개 히드로겔 조성물의 각각에서 진동 시험을 수행하였다. 900 ㎕의 히드로겔을 알루미늄 콘 아래의 레오미터의 플랫폼에 첨가하였다. 일정한 1% 변형에서 1Hz로 유지된 진동 주파수로 20 분의 시간 스위프를 수행하였다. 90초 후에, 화학양론적 양의 과산화수소를 알루미늄 콘의 가장자리 둘레에 하기 식에 따라 3개의 동일한 양으로 첨가하였다: 총 과산화수소 양 (㎕) = (0.496)(X)(Y); 여기서, X = 티라민 염기 치환의 백분율 (즉, 1% = 1) 및 Y = 히드로겔의 농도 (즉, 5 mg/ml = 5).

반응이 진행됨에 따라, 전단 계수 G' 및 G" 뿐만 아니라 이들 간의 델타 위상차를 정량화하였다. 대조로서, 히드로겔에 대한 변화가 퍼옥시드 제의 첨가에 기인하였음을 확인하기 위하여 퍼옥시드를 히드로겔에 첨가하지 않는 진동 시험을 수행하였다. 하기 수학식 1에 의한 진동 데이터를 사용하여, 각각의 히드로겔에 대한 복합 전단 계수를 획득하였다:

<수학식 1>

실시예 2: 천공 바늘을 사용한 축방향 균일 이식물의 형성

도 3을 참조하면, BMP 및 유동성 매트릭스 물질의 시험 동안에 겪게 되는 하나의 문제는, 이식물 형성 동안에 이러한 물질들의 불균일 혼합이 발생하고, 그 결과 매트릭스 내에서 BMP 및/또는 과립의 불균일 농도로 인해 기계적 파손 및/또는 일관성없는 생물학적 활성을 더욱 일으킬 수도 있는 비교적 불균일한 이식물이 얻어진다는 것이었다. 이식물의 균일성을 향상시키는 한 가지 수단은, 과립으로 충진된 챔버 (예컨대, 주사기 배럴) 내로 용액이 유동될 수 있는 길이를 따라 다수의 배출구를 포함하는 천공 바늘 (도 3A)을 사용하는 것이었다. 도 3에 나타낸 실시예에서, 폐쇄된 원위 팁을 갖는 천공 바늘을 세장형 챔버, 예컨대 과립으로 적어도 부분적으로 충전된 주사기 배럴의 중심에 다소 삽입한다. 그 후, 형광-태그된 BMP-2 및 과산화수소 (생체적합성 매트릭스를 가교하기 위해 필요한 시약)의 용액을 바늘을 통해 챔버 내로 유동시켰다. BMP-2/과산화수소 용액에 이어서, 관능화 히알루론산 용액을 바늘을 통해 과립 위로 유동시켰다. 대안적으로, 용액을 중심에 위치된 천공 바늘을 갖지 않은 주사기의 루어 팁을 통해 과립에 순차적으로 적용하였다. 양쪽 경우에, 유체가 근위에서-원위로의 방향으로 유동되었다. 천공 바늘의 부재 하에서, 챔버로 유동되는 용액은 원위에 위치한 과립에 도달하기 전에 근위에 위치한 과립과 반드시 접촉하였다. 반대로, 천공 바늘은 챔버의 장축을 통해 새로운 용액을 과립과 거의-동시에 접촉되도록 하였다. 도 3C 내지 3N에 도시된 바와 같이, 천공 바늘을 사용한 결과로, BMP/과산화수소 및 생체적합성 매트릭스 용액의 비교가능한 볼러스 적용으로 달성된 분포와 비교할 때, 얻어지는 이식물의 반경방향 (예를 들어, 중심으로부터 가장자리로) 및 축방향 (근위로부터 원위로) 차원 양쪽 모두를 따라 BMP (형광 신호)의 실질적으로 더욱 균일한 분포가 얻어졌다.

실시예 3: 정적 믹서를 사용한 균일 이식물의 형성

생체적합성 매트릭스 내에 BMP-부하된 과립을 포함하는 이식물을 생성하기 위해, 이식물 성분을 2개의 주사기에 넣고 정적 믹서 커넥터를 통해 앞뒤로 통과시켰다. 히드로겔 물질을 하나의 주사기에 첨가하는 한편, 과립, 목적 단백질 (또는 염료) 및 0.09%의 과산화수소를 다른 주사기에서 조합하였다. 이어서, 혼합 커넥터를 수평으로 유지된 주사기 상에 단단히 나사 결합시켜, 성분의 어느 것도 시스템을 나오고/나오거나 조기에 혼합될 수 없도록 하였다. 히드로겔 및 과립 성분을 혼합하기 위해, 히드로겔 주사기를 먼저 밀어 넣어서 히드로겔이 과립 혼합물을 함유하는 주사기 내로 이동하도록 하였다. 이어서, 과립 혼합물 주사기를 밀어 넣어서 모든 성분이 정적 믹서를 통해 다른 주사기로 이동하도록 하였다. 이러한 혼합을 5초의 기간에 걸쳐 10회 수행하였다. 이 과정 동안에, 과립의 침강을 완화하기 위해 장치를 그의 축을 따라 회전시켰다. 5초의 혼합 시간 후에, 장치를 수직으로 고정하여 모든 물질이 주사기의 하부로 유동되도록 하고 이식물을 설정하였다. 주사기의 형태 및 사용된 물질의 양 (1800 ㎕)은 직경 10 mm를 갖는 20 mm 길이의 원통형 이식물을 형성하였다.

실시예 4: 기계적 이식물 분석

정적 혼합 장치를 사용하여 제조된 이식물의 기계적 성질을 평가하기 위해 평행 플레이트 레오메트리를 사용하였다. 동적 유동학적 시험을 수행하기 위해 AR2000 레오미터를 사용하였다. 10 mg/ml 농도의 3% 티라민 치환, 트리판 블루 (Trypan Blue) 염료, 0.09% 퍼옥시드 및 과립을 혼합하기 위해 단일 크로스바 설계를 사용하여 이식물을 생성하였다 (표 1).

<표 1>

스캐폴드 혼합물 농도

얻어진 이식물 (직경 10mm, 길이 20mm)을 4개의 5 mm 두께 구획으로 절단하였다 (도 4A-B). 이 구획들을 절단 시에 주사기 개구부에 가장 가까운 구획에 해당하는 A로부터 주사기 개구부로부터 가장 먼 구획인 D까지 표식하였다. 건조를 막기 위해 구획을 100 ㎕의 포스페이트 완충 염수 (PBS)에 보관하였다. 각각의 슬라이스의 질량을 측정하였고, 질량을 0.393 ml 부피로 나눔으로써 밀도를 계산하였다. 각각의 이식물 디스크 상에 압축력을 가하기 위해 직경 40mm의 알루미늄 평행 플레이트 배열을 사용하였다 (도 5). 레오미터 플레이트를 샘플의 상단 위로 100 ㎛까지 이동시키고 이것이 샘플을 50% 변형 (2.5 mm)까지 압축할 때 일정한 속도 (10 ㎛/s)로 낮추었다. 압축력을 레오미터 플레이트의 높이의 함수로 기록하였다. 이 값을 기초로 하여, 각각의 샘플에 대한 실제 응력 및 실제 변형 곡선을 계산하였다. 이 그래프의 선형 영역을 기초로 하여 탄성 계수를 계산하고 샘플에 걸쳐 비교하였다. 20 부피%, 25 부피% 및 30 부피%의 과립 농도로 시험을 완결하였다. 대조 시험은 과립을 갖지 않는 히드로겔 및 혼합 기하구조를 갖지 않은 중공 튜브 커넥터를 사용하여 혼합된 30% 과립 농도를 시험하는 것을 포함하였다.

실시예 5: 형광 플레이트 판독기 분석

형광 태그된 알부민 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-647 (AF647) 단백질 (647 nm 여기; 670 nm 방출 파장)을 사용하여 이식물을 생성하였다. 10 mg/ml 농도의 3% 티라민 치환, PBS 중에 1:250 희석된 태그된 알부민 AF647, 0.09% 퍼옥시드 및 과립을 혼합하기 위해 단일 크로스바 원형을 사용하였다 (표 1). 금형을 5 mm 구획으로 절단하고 기계적 시험 데이터를 수집한 후에, 각각의 구획을 100 ㎕ PBS로 48 웰 플레이트의 단일 웰에 넣었다. 플레이트를 스펙트라맥스(SpectraMax) ™ M5 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘러 디바이스(Molecular Devices), LLC, 미국 캘리포니아주 서니베일)로 판독하여 각각의 5mm 슬라이스 내에서의 형광 강도를 결정하였다. 각각의 구획 내의 알부민 단백질의 양으로 형광 강도를 표준화하였다. 알부민으로의 예비 시험 후에, BMP 완충액 (50 mM 글루탐산, 0.75% 글리신, pH 3.75) 중에 1:120 희석된 알렉사 플루오르-488 (AF488) 태그된 BMP-2 (488 nm 여기 파장; 520 nm 발광 파장)을 사용하여 이식물을 생성하고, 동일한 접근법을 사용하여 형광을 측정하였다.

실시예 6: 히드로겔 설정 및 강성도 측정

다양한 히드로겔 (예를 들어, 1%, 3% 및 5% 티라민 염기 치환; 5 mg/ml 및 10 mg/ml 농도) 중에서 상대적 퍼옥시드-연결 설정 시간 및 강성도를 특징화하였다. 각각의 위상차 곡선의 정상 감소 (steady decrease)는 각각의 히드로겔의 점성 액체로부터 탄성 고체로의 진행을 나타낸다 (도 6). 설정 시간은 퍼옥시드가 첨가될 때부터 전단 계수의 전단 저장 G' (탄성) 성분이 전단 손실 G" (점성) 성분을 초과할 때까지 걸리는 시간이었다. 더 높은 티라민 염기 치환 및 더 높은 농도의 히드로겔을 갖는 히드로겔이 주어진 티라민 염기 치환에서 더욱 느리게 설정되었다. (도 7). 가장 긴 설정 시간을 갖는 히드로겔은 5 mg/ml에서 1% 치환, 10 mg/ml에서 1% 및 10 mg/ml에서 3% 치환이었다 (표 2).

<표 2>

가교 반응의 완결을 위한 시간

복합 전단 계수 G^*는 시험된 히드로겔 간의 상대적 강성도를 결정하였다. 더 높은 농도의 히드로겔은 주어진 티라민 염기 치환 내에서 더 큰 복합 계수를 가졌다 (도 8). 최대 강성도 최종 설정을 갖는 히드로겔은 10 mg/ml에서 3% 치환 및 10 mg/ml에서 5% 치환이었다 (도 8; 표 3). 10 mg/ml에서 3% 치환을 갖는 히드로겔을 선택하였다.

<표 3>

20-분 가교 반응 동안에 측정된 최대 강성도 값

실시예 7: 장치 원형화

히드로겔 선택 후에, 이식물 성분을 균일하게 혼합하기 위해 장치를 개발하였다. 설계 과정을 시작하기 위해 혼합 장치에 대한 여러 개념을 형성하였다. 이러한 개념은 이중 배럴 주사기, 회전 블레이드 믹서, 롤링 튜브 방법 및 정적 믹서를 포함하지만 어떠한 방식으로도 이에 한정되지 않는다. 히드로겔 가교 반응의 빠른 설정 시간으로 인해, 교반 막대로의 일반적 혼합은 겔이 혼합으로부터 전단되기 전에 과립의 적절한 분포를 제공하지 않을 것이다. 기능적 설계 요건을 가장 잘 충족하기 때문에 정적 믹서를 선택하였다. 정적 믹서는 조작이 간단하고, 제조 비용이 저렴하며, 폐기할 수 있고, 폐기물을 최소화하면서 이식물의 성분을 균일하게 혼합하였다. 추가로, 장치는 상업용 주사기와 함께 사용될 수 있고, 새로운 주사기의 제조와 관련된 시간 및 비용을 없앨 수 있다.

주사기 간의 최단 거리뿐만 아니라 밀폐 끼워맞춤을 제공하는 커넥터를 생성하기 위해 정적 믹서 설계를 여러 번 반복하였다. 믹서의 이전 형태는 너무 길어서 물질이 커넥터 내부에 걸리지 않고, 밀폐되지 않아서, 물질이 장치 밖으로 스며 나올 수 있었다. 장치의 기계가공 및 3D 프린트된 형태 양쪽 모두가 짧고 밀폐되었지만, 기계가공된 형태가 재현하기에 더욱 어렵고 시간이 걸렸다. 3D 프린트된 믹서는 믹서를 통한 물질의 유동을 방해하여 과립이 히드로겔 전체에 고르게 분산되도록 배열된 다양한 내부 기하구조를 포함하도록 재설계되었다. 이중 크로스바 및 반-구형 설계와 같은 일부 믹서는 물질의 전부가 유동할 수 없도록 하여, 폐기되는 물질을 커넥터에 남겨 두었다. 단일 크로스바 설계가, 부분적으로, 물질의 대부분이 유동하도록 하면서 고른 혼합을 제공하기 때문에 선택되었다.

4개의 초기 개념들로부터 정적 믹서 설계를 선택하였다. 기존 주사기의 나사산이 밀폐되도록 이들을 맞추기 위해 3D-프린트된 원형을 설계하였다. 초기에, 믹서 내부에 고무 O-링을 추가하여 밀폐된 밀봉부를 만들었다. 추가의 설계 변경은 나사산을 더욱 잘 맞게 하고, O-링의 필요성을 없앤다. 폐기물을 최소화하기 위해 믹서에 연결될 때 주사기의 말단 간의 거리를 감소시켰다. 믹서 형태의 진행을 도 9에 나타낸다. 도 10A-D에 나타낸 바와 같이, 설계의 형태 및 나사산이 일단 완성되면, 혼합 능력을 시험하기 위해 중공 튜브 (10A), 반-구형 (10B), 단일 크로스바 (10C) 및 더블 크로스바 (10D)와 같은 내부 혼합 구조의 변형을 만들었다.

3D-프린터의 온도 제약으로 인해, 혼합 장치 내의 혼합을 관찰하기 위한 투명 플라스틱을 사용할 수 없었다. 따라서, 나사산이 없는 통상적인 주사기로 압력 끼워맞춤 밀봉부를 갖도록 투명한 플라스틱 튜브를 밀링함으로써 추가의 정적 믹서의 원형을 만들었다 (도 11A-B). 이러한 부품은 장치를 통해 혼합 절차를 볼 수 있도록 하지만, 기계가공 제약으로 내부 기하구조의 가변성을 제한하였다. 3D-프린트된 원형은 훨씬 더 재현가능하고 생성 및 변형하는데 시간 효율적임을 입증하였다. 초기에 이들이 생성한 이식물과 폐기물을 시각적으로 비교함으로써 상이한 혼합 기하구조를 평가하였다. 비교적 다량의 폐기 물질이 더블 크로스바 및 반-구형 원형의 정적 믹서 성분에 남아있다 (도 12). 따라서 단일 크로스바 3D-프린트된 설계를 최종 장치 설계로서 선택하였다 (도 13).

실시예 8: 생성된 구조물의 균일성 평가

믹서 설계가 완성된 후, 제조된 스캐폴드를 균일성 및 재현성에 대해 시험하였다. 스캐폴드의 균일한 기계적 강도는 심지어 회복 중에도 뼈 성장을 보장한다. 스캐폴드의 기계적 성질이 불균일하다면, 발달하는 뼈는 강도 및 밀도 면에서 다양할 수 있다. 따라서, 형성된 이식물을 4개 슬라이스에 걸쳐 밀도 및 탄성 계수에 대해 시험하였다. 결과는, 주어진 스캐폴드 내에서 슬라이스 간의 밀도가 약 4%의 편차로 비교적 균일함을 증명한다. 추가로, 단일 조성물의 각각의 시험이 약 5%의 변동으로 비교적 동일한 밀도를 나타내기 때문에, 주어진 과립 농도에 대한 스캐폴드는 재현가능했다. 따라서, 혼합 장치는 그들의 밀도 분포와 관련하여 균일한 스캐폴드를 반복적으로 생성할 수 있고, 10% 변동 이내가 되는 요건을 충족한다. 겔이 유연하고 구획으로 절단되는 동안 뒤틀릴 수 있기 때문에, 이 시험 동안에 발생하는 일부 변동은 불완전한 크기의 슬라이스에 기인한 것일 수도 있다.

스캐폴드의 탄성 계수를 분석할 때 이러한 일관성이 나타나지 않았다. 30% 과립 구조물은, 다른 과립 농도에서 보이는 약 11% 편차와 비교하여, 슬라이스에 걸쳐 단지 약 9% 만큼의 편차의 더욱 균일한 분포를 나타냈다. 다양한 스캐폴드에 대해 슬라이스 간의 이러한 차이가 단지 약 2%이긴 하지만, 단지 하나 만이 슬라이스 간의 균일성을 위한 10% 변동 요건을 충족하기 때문에 30% 농도를 구별하는 것으로 충분하였다.

30% 과립 이식물은 이식물 간에 약 8%의 편차를 갖고, 재현성을 위한 10% 변동 요건을 충족하는 한편, 20% 및 25% 과립 이식물은 그렇지 않았다. 스캐폴드는 원위 말단부 (D)에서보다 근위 슬라이스 (A)에서 비교적 낮은 탄성 계수를 갖는 경향이 있다. 이것은, 스캐폴드가 그의 가교를 완료하는 동안, 혼합의 종료 시에 히드로겔에 더 무거운 과립이 떨어지는 것에 기인할 수 있다. 이러한 요인에도 불구하고, 30% 과립 이식물은 균일성 및 재현성 양쪽 모두에 대해 10% 변동 요건을 충족한다.

균일성의 또 다른 척도는 이식물의 길이에 걸친 과립 및 단백질의 분산이다. 이식물의 일부로부터의 형광 강도는 존재하는 단백질의 양을 나타낸다. 형광 단백질이 그 주위에 국한되기 때문에, 이것은 또한 간접적으로 과립의 존재를 나타낸다. 30% 과립 농도가 형광 강도의 균일성에서 10% 미만의 편차를 갖는 유일한 조성물임이 입증되었고, 30 부피% 과립이 바람직한 농도임을 추가로 확인하였다. 선택된 내부 기하구조로 인한 혼합을 확인하기 위해, 30% 과립을 사용하여 혼합 장치로서 중공 튜브를 사용하는 대조 시험을 완결하였다. 2개의 대조 시험의 결과로 구조물 전체에 걸쳐 형광 강도의 약 12% 편차가 얻어졌다. 이것은 10% 오류 역치를 충족하지 못하고 최적의 설계로서 단일 크로스바 원형의 유효성을 뒷받침한다. 0% 과립 대조 구조물 농도는 다른 조성물로부터의 균등한 슬라이스와 비교할 때 형광 방출 강도에서 현저한 차이를 나타내었다. 이것은 과립이 알부민 단백질 국소화에 중요한 역할을 하며 단백질을 더 작은 영역으로 통합시킴을 의미한다. 제한된 물질 및 시간으로 인해 이 결과를 BMP-2로 재-시험하지 않지만, 알부민은 저 비용, 생체적합성 및 유사한 칼슘 포스페이트 결합 특성으로 인해 만족스런 대체물로 작용한다. 알부민은 단지 2회 시험되었지만, BMP-2로의 플레이트 판독기 시험의 예비 결과는 20% 및 30% 과립 농도가 알부민 결과와 일치함을 나타내었다.

혼합 장치 및 그의 사용 방법의 개발은 최적의 스캐폴드 조성을 결정하는 것을 요구하였다. 혼합 장치가 요구하는 기능적 규정은, 균일한 기계적 성질, 히드로겔 전체에 걸친 과립의 분산, 및 과립 중에 단백질의 분포를 갖는 이식물을 제조하는 것이었다. 균일성은 이식물 간의 10% 미만의 변동으로서 정의된다. 초기 원형이 개발된 후, 다양한 과립 농도를 시험하여 바람직한 범위를 20-30 부피% 과립으로서 결정하였다. 낮은 과립 농도는 BMP 결합 및 구조적 지지체를 위해 너무 적은 과립을 제공하였다. 30%를 초과하는 농도는, 비효율적인 히드로겔이 과립을 결합시키는데 이용될 수 있는 결과를 가져왔다. 추가로, 과립 간의 히드로겔 부피는 골형성성 세포 및 혈관이 더욱 쉽게 이식물에 침윤될 수 있도록 한다. 이식물이 주사기 내에서 형성되었을 때, 상부는 기형을 띄는 경향이 있다. 이식물이 원하는 형태 및 길이를 갖도록 이 층을 정돈하였다. 작업실에서, 이식 부위에 꼭 맞도록 이식물을 성형할 때 이러한 불완전한 형태의 말단을 잘라낼 것이다. 이러한 성질은 레오미터 압축 분석, 플레이트 판독기 형광 시험 및 공촛점 현미경 영상화를 통해 시험되었다.

실시예 9: 내부- 이식물 기계적 성질의 평가

기계적 강도의 구배를 결정하기 위해 제조된 구조물의 선형 구획을 따른 탄성 계수를 계산하였다 (도 14A). 기계적 강도는 구조물의 근위 (슬라이스 A)로부터 원위 (슬라이스 D) 영역으로 감소하는 경향이 있지만, 시험된 과립 농도에 대해 슬라이스 전체에 걸쳐 탄성 계수 및 밀도의 변동이 최소였다 (도 14B). 재현성을 결정하기 위해 동일한 과립 농도의 전체 구조물 간의 편차를 비교하였다. 30% 과립으로 구성된 구조물은 20% 및 25% 과립으로 생성된 구조물에 비하여 시험에 걸쳐 통계적으로 더 낮은 탄성 계수 편차를 나타내었다. 20%, 25% 및 30% 과립 농도를 함유하는 생성된 스캐폴드에서 시험에 걸쳐 밀도에서 약 5%의 상대 표준 오차가 관찰되었다 (도 15). 동일한 과립 농도의 구조물 내에서 슬라이스 간의 편차를 비교하여 균일성을 결정하였다. 탄성 계수 및 슬라이스 간의 밀도 편차에 대하여 구조물 간에 유의한 차이가 결정되지 않았다. 모든 3개 밀도 편차는 균일성을 위해 정의된 10% 오류 역치의 미만이었다; 그러나, 30% 과립 농도 만이 탄성 계수 편차에 대한 역치 미만이었다 (도 16).

실시예 10: 이식물 단백질 분포의 평가

형광 방출의 전개는, 정적 막대 혼합 장치로 제조된 구조물이 그들의 슬라이스 간에 형광 방출의 통계적으로 유의한 차이를 갖지 않음을 나타내었다 (도 17). 0% 과립 조성물은 다른 조성물과 비하여 통계적으로 낮은 형광 방출 강도를 갖는 것으로 나타났다. 30% 과립을 함유한 구조물에 대한 형광의 평균 차이는 약 90%인 한편, 20% 및 25% 이식물은 각각 약 14% 및 16%였다 (도 18). BMP-2 형광 판독을 20% 및 30% 과립 농도에 대해 단지 한 번 완료하였지만, 형광 측정값은 그들의 각각의 농도의 알부민 값과 유사하였다 (도 19).

실시예 11: 공촛점 현미경검사를 이용한 이식물 단백질 함량의 평가

플레이트 판독기 형광 데이터의 결과를 입증하기 위해 공촛점 현미경검사를 사용하였다. 단일 크로스바 장치 원형을 사용하여, 10 mg/ml 히드로겔 농도의 3% 티라민 치환, BMP 완충액 중에 1:120 희석된 AF488 태그된 BMP-2, 0.09% 퍼옥시드 및 30 부피% 과립을 혼합하여 이식물을 생성하였다. 구조물을 5mm 구획으로 절단하고 기계적 시험을 수행한 후에, 각각의 구획을 1mm로 절단하고 올린 슬라이드 커버와 함께 유리 슬라이드에 고정시키고 공촛점 현미경으로 관찰하였다. 100 마이크로미터에 걸쳐있는 10개 영상의 스택을 각각의 구획의 중심과 가장자리로부터 수집하고 이미지J (ImageJ) 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 영상에서 과립 및 히드로겔 부위에 대해 붕괴된 스택의 평균 형광 강도를 수집 하였다.

BMP-2의 공촛점 현미경검사를 위한 최대 강도 붕괴 스택 영상을 도 20A-B에 나타낸다. 단백질은 과립 주위에 집중되는 것으로 나타난다 (화살표 참조). 덜 집중된 형광을 갖는 부위가 히드로겔의 영역이다. 이것은 각각의 슬라이스의 중간 및 가장자리에서 히드로겔 및 과립 영역을 비교하는 평균 형광 강도 값에 의해 확인되었다 (도 21A-B).

예상된 바와 같이, 영상은 각각의 슬라이스에서의 단백질이 각각의 과립 주위에 특이적으로 국소화되어 존재함을 나타내었다. 형광 강도는 각각의 영상에서 과립 영역과 히드로겔 영역 내의 평균 강도를 계산함으로써 수득되었다. 이 절차는 단지 단일 이식물에 대해서만 수행되었지만, 단백질 강도는 히드로겔보다 과립에서 훨씬 높았다. 그러나, 중간에 더 근접한 측정에 비해 슬라이스의 가장자리에서 형광 강도 측정의 가변성이 더욱 높았다.

공촛점 영상에서 보이는 예상하지 못한 부작용은 각각의 과립을 둘러싸고 있는 칼슘 포스페이트 가루의 연무였다. 단백질과 결합된 과립 파편의 작은 조각을 함유하는 각각의 영상의 명확한 부분이 존재한다. 이 효과는 혼합 과정 동안에 과립이 파괴된 결과이거나 장기간 보관의 부작용일 수 있다. 이 파편이 존재하는 이유 및 이것이 존재한다면 생체 내에서 이식물의 성능에 어떤 효과를 미치는지를 결정하기 위해 추가의 연구가 요구된다.

본원에 개시된 바와 같이, 사용된 히드로겔의 성질은 합성 뼈 이식편 물질의 기능적 요건을 충족시키는 혼합 장치의 능력에 크게 영향을 미쳤다. 퍼옥시드 가교 반응이 일단 완료되면, 전단의 위험으로 인해 이식물의 성분들이 더 이상 혼합 될 수 없다. 혼합 시간이 길어짐에 따라 혼합 잠재력이 증가하므로, 더욱 긴 설정 시간은 생성된 이식물과의 더욱 균일한 분포와 서로 관련된다. 히드로겔 특징화 실험을 통해 확인된 설정 시간은 시험된 히드로겔 중에서 상대적 겔화 속도를 제공하였다. 높은 티라민 염기 치환을 갖는 히드로겔은 더욱 빠른 설정 시간을 갖는 경향이 있고, 높은 농도의 히드로겔은 치환 백분율 내에서 다른 것에 비해 더 느리게 설정된다. 구조물 성분을 혼합할 때의 설정 시간이 장치 혼합 조건 하에서 현저히 빠르긴 하지만, 특징화 절차에 의해 시험된 히드로겔 중에서 상대적 반응 시간을 결정하였다. 따라서, 가장 긴 상대적 설정 시간을 갖는 히드로겔 (5 mg/ml에서 1% 치환, 10 mg/ml에서 1% 치환 및 10 mg/ml에서 3% 치환)이 더욱 빠르게 설정되는 히드로겔 (5 mg/ml에서 5% 치환 및 10 mg/ml에서 5% 치환)보다 혼합 장치와 함께 더욱 쉽게 사용될 수 있었다. 추가로, 각각의 히드로겔의 전단 계수를 기계적 안정성의 지표로서 결정하였다. 임상 환경으로 전환하기 위해서는, 혼합 장치에 의해 제조된 이식물이 신체에서의 힘을 견뎌야 한다. 따라서, 상당히 큰 강성도를 갖는 히드로겔 (10 mg/ml에서 3% 치환 및 10 mg/ml에서 5% 치환)이 혼합 장치와 함께 사용하기에 더욱 적합하다. 10 mg/ml의 농도에서 3% 티라민 염기 치환을 갖는 히드로겔은, 임상 사용을 위해 필요한 비교적 긴 혼합 시간 및 더 높은 강성도로 인해 합성 뼈 이식편 물질로서 가장 적합했다.

결론

본원에서 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소, 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 양쪽 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 명확히 반대로 표시되지 않는 한, 구체적으로 표시된 요소와 관련되든지 관련이 없든지 간에 "및/또는" 구절에 의해 구체적으로 표시되는 요소 이외에 다른 요소가 임의로 존재할 수도 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, 하나의 실시양태에서 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 B가 없는 A (임의로, B 이외의 다른 요소 포함)를 가리키고; 다른 실시양태에서 A가 없는 B (임의로, A 이외의 다른 요소 포함)를 가리키며; 또 다른 실시양태에서, A 및 B 양쪽 모두 (임의로, 다른 원소를 포함함)를 가리킨다.

용어 "필수적으로 구성된다"는, 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 기능에 기여하는 다른 물질을 배제하는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 다른 물질은 총체적으로 또는 개별적으로 미량으로 존재할 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로" 또는 "대략적으로"는 플러스 또는 마이너스 10% (예를 들어, 중량 또는 부피 기준)를 의미하고, 일부 실시양태에서 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시예", "실시예" 또는 "실시양태"는, 이 실시예와 관련하여 기재된 특별한 특성, 구조 또는 특징이 현재 기술의 적어도 하나의 실시예에 포함됨을 의미한다. 본 명세서 전체의 다양한 곳에서 구절 "하나의 실시예에서", "실시예에서", "하나의 실시양태" 또는 "실시양태"의 출현이 반드시 동일한 실시예를 언급하는 것은 아니다. 또한, 특별한 특성, 구조, 정해진 순서, 단계 또는 특징은 기술의 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 본원에 제공된 제목은 단지 편의를 위한 것이며 청구된 기술의 범위 또는 의미를 제한하거나 해석할 의도는 아니다.

본 발명의 특정한 실시양태가 상기 기재되었다. 그러나, 본 발명은 이들 실시양태에 한정되는 것이 아니며 오히려 본원에 명확히 기재된 것에 대한 추가 및 수정이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석된다. 또한, 비록 이러한 조합 또는 변경이 본원에 표현되지 않았더라도, 본 발명의 의도 및 범위를 벗어나지 않으면서, 본원에 기재된 다양한 실시양태의 특징이 상호 배타적인 것이 아니며 다양한 조합 및 변경으로 존재할 수 있음을 이해해야 한다. 사실상, 본원에 기재된 내용의 변형, 수정 및 다른 실행은 본 발명의 의도 및 범위를 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 이와 같이, 본 발명은 상기예증을 위한 설명에 의해서만 한정되는 것은 아니다.

Claims (14)

1. 골유도성 단백질;
   칼슘 세라믹 과립 및 유동성 생체적합성 매트릭스 물질 중의 적어도 하나; 및
   적어도 하나의 챔버, 및 골유도성 단백질, 칼슘 세라믹 과립 및 유동성 생체적합성 매트릭스 중의 하나 이상을 챔버에 도입하기 위한 적어도 하나의 입구를 갖는 장치
   를 포함하는, 복합 골유도성 스캐폴드를 형성하기 위한 시스템.
2. 제1항에 있어서, 골유도성 단백질이 수용액 중에 존재하는 것인 시스템.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장치가, 적어도 하나의 챔버 내에 배치되거나 그에 유체 연결된 하나 이상의 정적 혼합 요소 및 적어도 하나의 입구를 통해 적어도 하나의 챔버에 삽입가능한 천공 바늘을 포함하는 것인 시스템.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론산 (HA), 변형된 HA, 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 키토산, 알기네이트, 아가로스, 자기-조립 펩티드, 전혈, 혈소판-풍부 혈장, 골수 흡인물, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PEG의 유도체, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴록사머, 및 이들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 유동성 생체적합성 매트릭스 물질을 포함하는 시스템.
5. 제4항에 있어서, 가교 반응 및 중합 반응 중 적어도 하나의 가교제 또는 촉매와 접촉할 때 유동성 생체적합성 매트릭스 물질이 겔을 형성하는 것인 시스템.
6. 제4항에 있어서, 포로겐을 추가로 포함하는 시스템.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 골유도성 단백질이 뼈 형태형성 단백질 2 (BMP-2), BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, 디자이너 BMP, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템이 과립을 포함하고, 과립은 다공성이며 모노칼슘 포스페이트 일수화물, 디칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 탈수화물, 옥토칼슘 포스페이트, 침전된 히드록시아파타이트, 침전된 비정질 칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 알파-트리칼슘 포스페이트 (α-TCP), 베타-트리칼슘 포스페이트 (β-TCP), 소결된 히드록시아파타이트, 옥시아파타이트, 테트라칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 물질을 포함하는 것인 시스템.
9. 칼슘 세라믹 과립을 골유도성 단백질을 포함한 용액과 접촉시키고, 이에 의해 골유도성 단백질을 세라믹 과립의 내부 공극 표면과 결합시키는 단계를 포함하는, 제8항에 따른 시스템을 이용한 골유도성 스캐폴드의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서, 칼슘 세라믹 과립을 적어도 하나의 챔버 내에 배치하고, 칼슘 세라믹 과립을 골유도성 단백질을 포함한 용액과 접촉시키는 단계가, 입구를 통해 용액을 챔버 내로 유동시키고, 과립을 용액 중에서 인큐베이션하고, 입구를 통해 챔버 밖으로 용액을 유동시키는 것을 포함하는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 유동성 생체적합성 매트릭스 물질을 챔버 내로 유동시키고, 이에 의해 과립을 매트릭스와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 매트릭스가 챔버 내에서 겔을 형성하는 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 골유도성 단백질을 포함하는 용액이 겔화제, 겔화 촉매 및 가교제 중의 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
13. 생체적합성 매트릭스, 칼슘 세라믹 과립의 내부 표면과 결합된 골유도성 단백질을 포함하고, 칼슘 세라믹 과립이 매트릭스와 결합되는, 제10항의 방법에 따라 형성된 이식물.
14. 제13항에 있어서, 골유도성 단백질 및 칼슘 세라믹 과립 및 생체적합성 매트릭스 물질 중 하나 이상의 농도가 이식물의 적어도 하나의 물리적 차원을 따라 실질적으로 일정한 것인 이식물.
    
    

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