JP2016195758A - 生体活性を有する流動性でウォッシュアウト耐性の骨グラフト材料およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】欠損部位における体液の存在下等の湿潤環境で物理的一体性を維持して取扱い性を改善した、注入可能で再吸収可能な骨グラフト材料の提供。【解決手段】約１００μｍ〜約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む無機組成物と、生体活性ガラスと、カルボキシメチルセルロースを含む１種または複数の生体適合性ポリマーと、流体とを含む流動性の骨グラフト材料。また、１種または複数の生体適合性ポリマーが、ゼラチンをさらに含む骨グラフト材料。【選択図】なし

Description

骨の修復のために天然および合成の材料を用いることは公知である。殆どの合成材料は、天然材料（たとえば同種移植骨、自家移植骨、および脱塩骨マトリックス（「ＤＢＭ」））に比べて、供給に制限がないこと、疾患の伝播がないこと、再手術の必要がないこと、および種々の形状寸法に成形できること等の多くの利点がある。多くの合成骨グラフトには、リン酸カルシウムを含む組成物等の、哺乳類の骨をそっくり模倣した材料が含まれる。例示的なリン酸カルシウム組成物にはＢ型炭酸ヒドロキシアパタイト［Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ｘ（ＣＯ_３）_ｘ（ＯＨ）］が含まれる。これは哺乳類の体内に見出される主要な無機相である。ヒドロキシアパタイトから形成される体の部分の基本的な組成、結晶寸法、形態、および構造は、タンパク質および有機含量の変化によって決定される。リン酸カルシウムセラミックは、これらに限らないが成形体およびセメントを含む種々の形態に加工され、哺乳類に移植されてきた。ヒドロキシアパタイト（「ＨＡｐ」）、リン酸三カルシウム（「ＴＣＰ」）、リン酸四カルシウム（「ＴＴＣＰ」）、ならびにその他のリン酸カルシウム塩および鉱物等の種々の化学量論的組成物は全て、天然の骨の適応性、生体適合性、構造、および強度と合致するように利用されてきた。血管再生、治癒、および骨のリモデリングの促進における孔径および多孔性の役割は、骨グラフト材料の重要な特性として認識されてきた。骨と極めて類似した例示的な多孔質リン酸カルシウム材料の調製は、たとえば米国特許第６，３８３，５１９号、第６，５２１，２４６号、および第６，９９１，８０３号に開示されており、これらは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

最近、体内全体にわたって骨グラフト材料の用途を拡大する試みとして、柔軟で注入可能な骨グラフト組成物が加工されている。これらの試みのいくつかは、Ｄｕｎｎらの米国特許第５，３２４，５１９号、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，３５２，７１５号、Ｌｅｅらの米国特許第６，２８７，３４１号、Ｌｅｅらの米国特許第６，２１４，３６８号、Ｒｉｃｈｅｌｓｏｐｈらの米国特許第６，６５２，８８７号、およびＳｐｉｒｏらの米国特許第６，２８８，０４３号に開示されている。しかし、これらの試みには多くの欠点がある。いくつかの組成物はリン酸カルシウムとは対照的に熱可塑性ポリマーから作られている。コラーゲンが多いことが必要なセラミック：コラーゲン比を有することを教示する注入可能なインプラント組成物がある。特定のＸＲＤスペクトルおよびＦＴＩＲパターンによって定義される低結晶性アパタイト系リン酸カルシウムから作られ、インプラントとして用いられる組成物もある。その他の試みにおいては硫酸カルシウムから作られた組成物が注目されてきた。

さらに、これらの骨の試みの多くにおいては、最適には再吸収されない材料（たとえば熱可塑性ポリマー、非晶性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水塩）または骨形成を促進するために理想的な多孔性および孔径分布を有しない構造が含まれている。その他の試みにおいては、担体、たとえば、ヒアルロン酸もしくはグリセロール、または組成物を成形しもしくは注入するための高含有率の可塑剤の添加が必要である。いくつかの試みにおいてはまた、注入を容易にするために鉱物成分の粒径が２５０μｍより小さいことが必要である。

さらに、流動性とウォッシュアウト耐性には逆の関係があるため、骨グラフト材料の流動性／注入性を増大させると、そのウォッシュアウト耐性が低下するという問題がある。

米国特許第６，３８３，５１９号 米国特許第６，５２１，２４６号 米国特許第６，９９１，８０３号 米国特許第５，３２４，５１９号 米国特許第５，３５２，７１５号 米国特許第６，２８７，３４１号 米国特許第６，２１４，３６８号 米国特許第６，６５２，８８７号 米国特許第６，２８８，０４３号

したがって、欠損部位における体液の存在下等の湿潤環境で物理的一体性を維持して取扱い性を改善した、注入可能で再吸収可能な骨グラフト材料に対するニーズがある。

骨の欠損を修復するために、理想的な骨伝導性を維持し、種々の用途に応じて都合よく送達することができ、種々の形状の空隙を埋めることができる、再吸収可能で多孔質の注入可能な骨グラフト材料に対するニーズもある。

本明細書は、改良された骨伝導性を有し、また改良されたウォッシュアウト耐性を示し、それにより湿潤環境において物理的一体性を維持することができる流動性の骨グラフト材料を記載するものである。

一実施形態において、この流動性の骨グラフト材料は、約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む無機組成物と、生体活性ガラスと、１種または複数の生体適合性ポリマーと、流体とを含む。

一実施形態において、生体適合性ポリマーはカルボキシメチルセルロースおよびゼラチンであってよい。カルボキシメチルセルロースは約１００，０００Ｍｗから約３００，０００Ｍｗの分子量を有してよい。別の実施形態において、カルボキシメチルセルロースの粘度は約４００ＭＰａ・ｓから約８００ＭＰａ・ｓであってよい。さらに別の実施形態において、カルボキシメチルセルロースの置換度は約０．６〜約０．８、好ましくは約０．７であってよい。好ましい生体適合性ポリマーの例はカルボキシメチルセルロースナトリウムである。

取扱い容易な用量の骨グラフト材料を提供するキットも意図されている。一実施形態において、このキットは、約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムと、生体活性ガラスと、カルボキシメチルセルロースを含む１種または複数の生体適合性ポリマーとを含む乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジを備える。別の実施形態において、このシリンジは追加的な生体適合性ポリマーとしてゼラチンをさらに含む。さらに別の実施形態において、このシリンジは、骨髄吸引液、血液または生理食塩水等の流体が入っていない。

一実施形態において、このキットは、骨髄吸引液、血液または生理食塩水等の流体が充填される加水用シリンジと、乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジを真空引きして空気を排出するための真空シリンジと、乾燥状の骨グラフト材料と流体とが混合された後の骨グラフト材料を注入するためのカニューレとをさらに備える。

骨グラフト材料を製造するための種々の方法も意図されている。一実施形態において、動物において骨を修復する方法は、約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む無機組成物と、生体活性ガラスと、１種または複数の生体適合性ポリマーと、流体とを含む流動性の骨グラフト材料を形成するステップと、復元すべき部位にアクセスするステップと、流動性の骨グラフト材料をこの部位に送達するステップが含まれる。別の実施形態において、骨グラフト材料は追加的な生体適合性ポリマーとしてゼラチンを含む。

シリンジ（製品シリンジ）、加水用シリンジおよび真空シリンジを含む本明細書に記載したキットの実施形態を示す写真である。本発明による乾燥状の骨グラフト材料は、約１００μｍ〜約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む無機組成物、生体活性ガラス、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびゼラチンを含み、流体を含まないシリンジ（製品シリンジ）に収容されている。 乾燥状の骨グラフト材料を含むシリンジ（製品シリンジ）、加水用シリンジ、真空シリンジ、真空ハブアダプターおよびカニューレを含む、本明細書に記載したキットの別の実施形態を示す写真である。 ヒトの膝の中の大腿骨８１の下、脛骨プラトー８２の中の骨の空隙８３の中に注入された骨グラフト材料８０を示す図である。 頭蓋顎顔面７６、頬骨再建７２および下顎インプラント７４として作用させるために注入された本発明のグラフト材料を示す図である。 リン酸カルシウム６２．５重量％、ゼラチン１５重量％、カルボキシメチルセルロースナトリウム１０重量％およびコンベアイト（Ｃｏｍｂｅｉｔｅ）生体活性ガラスセラミック１２．５％を含み、骨グラフト材料が流体を全く含まない、本発明の乾燥状の骨グラフト材料の一実施形態の、それぞれ３０倍、１００倍、２５０倍、および１０００倍の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。 本発明による種々の骨グラフト材料（実施例２〜５）および比較例の透水性試験の結果を示すグラフである。 骨グラフト材料の押出力試験の結果をまとめたグラフである。 流動性の骨グラフト材料の透水性を測定するために用いた試験装置の写真である。 透水性を測定するための試験装置において用いた透過性試験用固定具の部品の写真である。 透過性試験用固定具の試料ホルダーおよびその中の流動性の骨グラフト材料の写真である。

以下に本発明をより詳細に説明する。

特に本発明を特定し、その権利を明確に請求する特許請求の範囲を本明細書の最後に記載しているが、本明細書に記載した本発明は、以下の記載によってより良く理解されると考えられる。特に言及しない限り、全ての温度は摂氏度である。本明細書に記載した発明は本明細書に記載した発明の構成要素、ならびに本明細書に記載したその他の成分または要素を含み（オープンエンド）、または本質的にそれらからなることができる。本明細書において用いる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及した要素、または構造もしくは機能におけるそれらの等価物、および言及していないその他の要素を意味する。「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、文脈によって他が示唆されない限り、オープンエンドとみなされる。本明細書において用いる「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、本発明は特許請求の範囲において言及した成分に加えて他の成分を含んでもよいが、それは追加的な成分が特許を請求する発明の基礎的かつ新規な特徴を実質的に改変しない場合に限ることを意味する。一般に、そのような添加物は全く存在しないか、または微量のみ存在する。しかし、化合物の有用性（有用性の程度とは対照的に）が維持される限り、本発明の基礎的かつ新規な特徴を実質的に改変し得る材料を約１０重量％まで含むことは可能である。本明細書において言及した全ての範囲は端点を含み、２つの値の「間の」範囲を言及する端点を含む。「約」、「一般に」、「実質的に」等の用語は、用語または値を絶対的なものではないように修飾するものと解釈されるべきである。そのような用語は状況によって定義され、それらの用語として修飾する用語は、当業者によって理解される。この中には、少なくともある値を測定するために用いた所与の手法に対して予想される実験誤差、手法誤差および機器誤差の程度が含まれる。

範囲形式の記載は単に便利および簡潔にするためだけであって、本発明の範囲を厳しく限定するものと解釈すべきではないことをさらに理解されたい。したがって、範囲の記載は可能性のある全ての副範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したとみなすべきである。たとえば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの副範囲ならびにその範囲内の個別の数、たとえば１、２、２．３、３、４、５、５．７および６を具体的に開示したとみなすべきである。これは範囲の幅に関わらず適用される。

本明細書において「骨グラフト材料」という用語は、「骨グラフト」および「インプラント」と交換可能に用いられる。

本明細書において用いる「モーセル（morsel）」という用語は、「粒子（particle）」と交換可能に用いられる。

本明細書において「流動性」という用語は、注入可能と読み替えて用いることもできる。本明細書において、本発明に従って用いる「流動性」という用語は、乾燥状の骨グラフト材料を流体と混合すれば、印加した注入力の作用によって、カニューレ、ニードル、カテーテル、シリンジまたは特別に設計された混合デバイスを用いて骨グラフト材料を適用部位に送達できることを意味する。この注入力は、以下の実験例３に説明するように、１８℃〜２２℃の周囲温度で試験され、最終使用者のための注入性を容易にするため、１４０Ｎ、好ましくは１２０Ｎ、より好ましくは１００Ｎを超えない。

骨グラフト材料またはその任意の成分、たとえば生体適合性ポリマーに関連して用いる「生体適合性」という用語は、骨グラフト材料または骨グラフト材料の任意の成分が、意図した用途においてインビボで用いた際に軟組織または硬組織によって拒絶されないことを意図する。

本明細書において用いる「流体」という用語は、乾燥状の骨グラフト材料と混合して流動性の骨グラフト材料を形成させる任意の液体を意味する。そのような流体の例としては、限定するものではないが、骨髄吸引液、血液、生理食塩水、抗生物質および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等のタンパク質等が挙げられる。

多孔質無機組成物および生体活性ガラスを、カルボキシメチルセルロースを含む１種または複数の生体適合性ポリマーと混合することにより、体液の存在下等の湿潤環境において物理的一体性を維持しながら流動性が大きく改善されることが発見された。多孔質無機組成物、生体活性ガラスおよび１種または複数の生体適合性ポリマーを含む乾燥状の骨グラフト材料は、流体と接触した後で柔軟性になり、再吸収、細胞浸潤および吸収のための最適な特徴を維持しながら、種々の直径の、特に小径のシリンジまたは送達チューブを通して注入によって送達することができる。取扱い容易な用量の乾燥状の骨グラフト材料を含むキットは、臨床応用のための現在の骨グラフトシステムに比べて顕著な進歩である。それは、本明細書に記載した骨グラフト材料は流動性であるが、改善されたウォッシュアウト耐性をも有しており、したがって湿潤環境において物理的一体性を維持することができるからである。本明細書に記載した流動性の骨グラフト材料は可撓性または成形可能であり、より好ましくはＭＩＳ処置における使用のために注入可能である。骨グラフト材料の中に含まれる生体適合性ポリマーの性質は、湿潤環境における一体性を維持しながら、グラフト材料の流動性、可撓性、または成形性に影響する。

［多孔質無機組成物］
本明細書に記載した骨グラフト材料中の多孔質無機組成物は、リン酸カルシウムを含む。種々のリン酸カルシウムが意図され、たとえばリン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、およびヒドロキシアパタイト等のアパタイトが挙げられる。しかし簡潔にするため、「リン酸カルシウム」は当業者に公知の任意のカルシウム塩を含む。本発明における使用のための種々の形態のリン酸カルシウムの調製は、本発明の譲受人に譲渡され、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３９，０３９号、第６，３８３，５１９号、第６，５２１，２４６号、および第６，９９１，８０３号に記載されている。リン酸カルシウム製品の例としては、Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．）がある。

本発明によれば、開示したいくつかの骨グラフト材料は、酸化還元反応の結果である材料、即ちモーセルを部分的に含んでよい。これらの材料は、金属カチオンおよび少なくとも１つの酸化剤の水溶液を調製するステップを含む方法によって製造することができる。溶液を前記酸化剤によって酸化され得る少なくとも１つの可溶性前駆体アニオンによって増量すると、沈降性のオキソアニオンが生成する。このように意図された酸化還元反応は、便利には前記反応を起こすのに効果的な温度および圧力の条件下で溶液を加熱することによって開始される。本発明の好ましい実施形態によれば、酸化還元反応によって少なくとも１種の気体生成物が発生し、所望の中間前駆体鉱物が溶液から沈降する。本発明のある好ましい実施形態によれば、本発明による反応性混合物が、これを吸収できる材料に吸収され、多孔質鉱物が生成する。材料は顕著な多孔性を有し、毛管作用によってかなりの量の反応性混合物を吸収することができ、その自己酸化還元反応の前には混合物と実質的に反応しないことが好ましい。

このようにして調製した中間前駆体鉱物は、「そのまま」用いることもでき、種々の方法で処理することもできる。即ち、この前駆体鉱物は１つまたは複数のパラダイムに従って約８００℃超、好ましくは約１１００℃超で熱処理して、予め選択した結晶構造または予め選択した形態学的構造をその中に与えることができる。好ましい実施形態によれば、酸化剤は硝酸イオンであり、気体生成物は一般にＮＯ_ｘ（ｇ）と表わされる酸化窒素である。本方法によって提供される前駆体鉱物は実質的に均一であることが好ましい。本文脈において用いる場合、実質的に均一とは、前駆体鉱物全体にわたる多孔性および孔径分布が全体にわたって同一であることを意味する。

その他の好ましい実施形態によれば、本発明によって提供される中間前駆体鉱物は、任意のカルシウム塩であってよい。引き続く穏やかな熱処理によって、中間材料はたとえば新規な単相リン酸カルシウム鉱物または新規な二相β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）＋Ｂ型炭酸アパタイト（ｃ−ＨＡｐ）［β−Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２＋Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３−ｘ（ＣＯ_３）_ｘ（ＯＨ）］粒子に変換される。より好ましくは、中間材料は熱処理によって主としてβ−ＴＣＰ材料に変換される。

一実施形態において、リン酸カルシウムはβ−ＴＣＰである。好ましい実施形態において、リン酸カルシウムは多孔質である。別の実施形態において、リン酸カルシウムはミクロ、メソおよびマクロ多孔性を含む。さらに別の実施形態において、リン酸カルシウムの細孔は連通している。マクロ多孔性は約１００μｍを超え、いくつかの実施形態においては約１０００μｍ〜２０００μｍまでの孔径によって特徴付けられる。メソ多孔性は約１０μｍ〜１００μｍの孔径によって特徴付けられる一方、ミクロ多孔性は孔径が約１０μｍ未満の場合に生じる。本発明の製品においてマクロ、メソおよびミクロ多孔性は同時に生じ、かつ連通していることが好ましい。それぞれの型の多孔性を厳密に定量する必要はない。むしろ、当業者であれば水銀圧入ポロシメトリー、ヘリウムピクノメトリーまたは走査電子顕微鏡法等の好ましい方法で検討することによって、材料がそれぞれの型の多孔性を有しているかを容易に決定することができる。試料が特定の形態の多孔性を実質的に有しているとみなすために、必須の寸法範囲の中に２個以上または数個の細孔が存在することが必要であることは確かに正しいが、特定の百分率の数値は要求されない。むしろ、マクロ、メソ、およびミクロ細孔性を決定するためには当業者による定性的な評価を用いるべきである。

一実施形態において、リン酸カルシウムは粒子またはモーセルの形態であり、本明細書に記載する多孔構造を含んでよい。

本発明に従って調製された材料のいくつかの実施形態においては、全体の多孔性は高いことが認識されよう。この特徴は、百分率で表わされる細孔容積によって測定される。細孔容積０％は完全に密な材料を意味し、これは必然的に細孔を全く有しない。細孔容積１００％は「全てが細孔」または空気を意味することになり、意味をもって存在することはできない。しかし当業者であれば細孔容積の概念を理解し、容易にそれを計算して適用することができる。たとえば、細孔容積はＫｉｎｇｅｒｙ，Ｗ．Ｄ．、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｒａｍｉｃｓ、Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１版、Ｈｏｌｌｏｗｍａｎ，Ｊ．Ｈ．ら（編）、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９６０、４０９〜４１７頁に従って決定することができる。この文献は多孔性を決定するための公式を提供している。多孔性を百分率として表わすことによって細孔容積が得られる。公式は細孔容積＝（１−ｆ_ｐ）１００％であり、ｆ_Ｐは得られた理論密度の分率である。

多孔性はヘリウムピクノメトリーによって測定することができる。この方法では、較正された体積においてヘリウムの圧力変化を測定することによって試料の密度および真の体積が決定される。既知の質量および大きさを有する試料をピクノメーターに入れ、これにより密度および体積を決定する。試料の質量から、ピクノメーターによって真の密度および体積が決定される。測定した大きさから、見掛けの密度および体積を決定することができる。次いで（見掛けの体積−測定した体積）／見掛けの体積を用いて試料の多孔性を計算する。多孔性および孔径分布は、水銀圧入ポロシメトリーによっても測定することができる。

多孔質無機組成物のいくつかの実施形態に従って、約３０％を超える細孔容積を得ることができるが、５０％または６０％を超える細孔容積を有する材料も日常的に得ることができる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも約７０％の細孔容積が得られる。いくつかの好ましい実施形態は約７５％を超える細孔容積を有し、８０％がさらに好ましい。いくつかの実施形態は約９０％を超え、より好ましくは約９２％を超える細孔容積を有する。いくつかの好ましい事例においては、そのような高い細孔容積が得られる一方、マクロ、メソおよびミクロ多孔性の存在ならびに製造された材料の物理的安定性も得られる。

モーセルの寸法は所望の送達装置を考慮して選択されることが認識されよう。たとえば、標準的なシリンジを用いて流動性組成物を送達するためには、シリンジのオリフィスに適合したモーセルの寸法を選択する必要があろう。本発明のモーセルの好ましい寸法範囲は、約１００μｍ〜約１，０００μｍ、好ましくは約２００μｍ〜９００μｍ、より好ましくは約２１２μｍ〜約８５０μｍである。他に特定しない限り、本明細書において用いるモーセルの寸法はリン酸カルシウムモーセルを分画するために用いる篩の寸法を意味する。

骨グラフト材料は多孔性が高く、孔径分布が広い（１μｍ〜１０００μｍ）ので、インプラントは材料を極めて迅速に含浸／浸漬／吸収できるだけでなく、それらを保持することもできる。本発明においては血液、骨髄吸引液、生理食塩水、抗生物質および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等のタンパク質を含む種々の流体を用いることができる。本発明の材料は細胞（たとえば線維芽細胞、間葉、間質、骨髄および幹細胞）、多血小板血漿、その他の生物学的流体、ならびに上記の任意の組み合わせを吸収することもできる。本発明の骨グラフトは、いったん流体を吸収すれば、実際に流体を保留し、維持し、および／または保持するので、吸収された流体の包含された局所送達が可能になる。この能力は、細胞播種、薬剤送達、および生体分子の送達、ならびに骨組織工学、整形外科、および薬剤の担体における応用に有用性がある。

［生体適合性ポリマー］
本明細書に記載した骨グラフト材料に１種または複数の生体適合性ポリマーを含ませることにより、取扱い性および流動性、ならびに湿潤環境において一体性を維持する能力が改善される。

本発明によれば任意の好適な再吸収性生体適合性ポリマーを用いることができる。好ましい実施形態において、生体適合性ポリマーは低級アルキルセルロースエーテルであってよい。低級アルキルセルロースエーテルの例としては、限定するものではないがメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、低級アルキルセルロースエーテルの分子量は約４９，０００Ｍｗ〜約７２５，０００Ｍｗ、好ましくは約１００，０００Ｍｗ〜約３００，０００Ｍｗ、より好ましくは約２２０，０００Ｍｗ〜約２７０，０００Ｍｗである。低級アルキルセルロースエーテルの量に関しては、これは流動性の骨グラフト材料の全重量に対して約３％ｗ／ｗ〜約２０％ｗ／ｗ、好ましくは約５％ｗ／ｗ〜約１５％ｗ／ｗ、より好ましくは約８％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗの範囲の量で存在する。好ましい実施形態において、低級アルキルセルロースエーテルの粘度は、約１００ＭＰａ・ｓ〜約１０００ＭＰａ・ｓ、好ましくは約３００ＭＰａ・ｓ〜約８００ＭＰａ・ｓ、より好ましくは約４００ＭＰａ・ｓ〜約８００ＭＰａ・ｓであり、低級アルキルセルロースエーテルの置換度は約０．６〜約１．２、より好ましくは約０．６〜０．８、より好ましくは約０．７である。

一実施形態において、低級アルキルセルロースエーテルはカルボキシメチルセルロースナトリウムである。さらに別の実施形態において、カルボキシメチルセルロースナトリウムの分子量は約４９，０００Ｍｗ〜約７２５，０００Ｍｗ、好ましくは約１００，０００Ｍｗ〜約３００，０００Ｍｗ、より好ましくは約２２０，０００Ｍｗ〜約２７０，０００Ｍｗである。カルボキシメチルセルロースナトリウムは分子量が高いので、乾燥状の骨グラフト材料の成分と物理的に混合し、これと絡み合う結合剤として作用すると考えられる。さらに、カルボキシメチルセルロースナトリウムは親水性であるので、水分子を隔離し、それにより水分子と配合物の他の成分との相互作用を最小化することによって乾燥状の骨グラフト材料の崩壊を防止することを助けていると考えられる。カルボキシメチルセルロースナトリウムのアニオン性がβ−リン酸トリカルシウム等のリン酸カルシウムのカルシウム成分との結合力を確立するために寄与しているという考えも説得力がある。

好ましい実施形態において、カルボキシメチルセルロースナトリウムの粘度は、約１００ＭＰａ・ｓ〜約１０００ＭＰａ・ｓ、好ましくは約３００ＭＰａ・ｓ〜約８００ＭＰａ・ｓ、より好ましくは約４００ＭＰａ・ｓ〜約８００ＭＰａ・ｓであり、カルボキシメチルセルロースナトリウムの置換度は約０．６〜約１．２、より好ましくは約０．６〜０．８、より好ましくは約０．７である。

カルボキシメチルセルロースナトリウムの量に関しては、好ましくは流動性の骨グラフト材料の全重量に対して約５％ｗ／ｗ〜約１５％ｗ／ｗ、好ましくは約８％〜約１２％、より好ましくは約９％ｗ／ｗ〜約１０％ｗ／ｗの量で存在する。

他の実施形態において、生体適合性ポリマーは、ゼラチンおよびたとえば本発明の譲受人に譲渡され、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１８９，２６３号、第７，５３４，４５１号、第７，５３１，００４号、および第８，２８７，９１５号に記載された他の好適なポリマーをさらに含んでよい。他の好適なポリマーの例としては、限定するものではないがポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬ−ＬＡ）、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアルケノイクス、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリエステルおよびそれらの混合物が挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態は、１００％までのＩ型コラーゲンを含むコラーゲンをさらに含む。他の実施形態において、用いるコラーゲンは主として、または約９０％までのＩ型コラーゲンであり、約５％までのＩＩＩ型コラーゲンまたは約５％までの他の型のコラーゲンも含む。好適なＩ型コラーゲンとしては、天然の繊維状不溶性ヒト、ウシ、ブタ、もしくは合成のコラーゲン、可溶性コラーゲン、再構成コラーゲン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態はコラーゲンを含まない。

流動性の骨グラフト材料は、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の低級アルキルセルロースエーテルを含む１種または複数の生体適合性ポリマーを含む。別の実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、少なくとも２種の生体適合性ポリマーを含む。好ましい実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、カルボキシメチルセルロースおよびゼラチンを含み、コラーゲンを含まない。より好ましい実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびゼラチンを含み、コラーゲンを含まない。別の好ましい実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、ゼラチンおよび少なくとも１種の低級アルキルセルロースエーテルを含み、コラーゲンを含まない。別の好ましい実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、ゼラチン、コラーゲンおよび少なくとも１種の低級アルキルセルロースエーテルを含む。

［生体活性ガラス／ガラスセラミック］
本明細書において用いる「生体活性ガラス」は、これらに限らないが血液および血清等の生理学的流体と接触して反応し、骨形成を導く、任意のアルカリ含有セラミック、ガラス、ガラスセラミック、または結晶性材料であってよい。好ましい実施形態において、生体活性ガラスは生理学的流体中に入れられると、その表面にアパタイト層を形成する。本発明における使用に好適な好ましい生体活性ガラスの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９１４，３５６号に記載されている。好適な生体活性材料としては４５Ｓ５ガラスおよび４５Ｓ５ガラスセラミック、５８Ｓ５ガラス、Ｓ５３Ｐ４ガラス、アパタイト−ウォラストナイト含有ガラスおよびガラスセラミックも挙げられる。好ましくは、生体活性ガラスは、不規則な形態およびコンベアイト（combeite）結晶の領域を有する不均一粒子を含むガラスセラミック組成物（化学組成Ｎａ_４Ｃａ_３Ｓｉ_６Ｏ_１６（ＯＨ）_２を有する「コンベアイトガラスセラミック」）である。いくつかの実施形態において、生体活性ガラスは約５〜５０体積％のコンベアイト結晶領域を含む。本発明における使用に好適な好ましい生体活性ガラスは、カルシウム−リン−ナトリウム−シリケートおよびカルシウム−リン−シリケートを含む組成物である。そのような生体活性ガラスとしては、ＮｏｖａＢｏｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＬＣ，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬａ．から販売されているＮｏｖａＢｏｎｅおよびＮｏｖａＢｏｎｅ−ＡＲが挙げられる。本発明における使用に好適なさらなる生体活性ガラス組成物は、米国特許第６，７０９，７４４号に記載されている。

理論に縛られることを望むものではないが、アパタイトゲル層の中でシリカが放出されるときに約１５０μｍ以下の生体活性ガラス粒子の再吸収が起こるが、これより大きな粒子は破骨細胞によって最終的には破壊される（Ｇｏａｓｉｎ，Ａ． Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｇｌａｓｓ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ（２００４）１１４巻，２号，５９０−５９３頁）。現在のところ、本発明の骨グラフト材料は生体活性ガラスとは独立に骨の成長のための適切な足場を提供していると考えられる。また理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に記載した骨グラフト材料における生体活性ガラスの役割は、骨芽細胞に対する刺激であると考えられ、したがって骨の成長のための足場をも提供し得る大粒径のガラス（＞１５０μｍ）は必要でなく、したがって溶解によって再吸収される粒子が好ましい。しかし、あらゆる寸法の再吸収可能なガラス粒子が好適と考えられる。

粒径測定は当技術で周知である。他に特定しない限り、本明細書において用いる粒径は、ガラス粒子を分画するために用いた篩の寸法を意味する。本発明に従って用いる生体活性ガラス粒子は、好ましくは約２０μｍ〜約２００μｍである。生体活性ガラス粒子は約１００μｍ以下のオーダー、約１５０μｍ以下のオーダーであってよく、または生体活性ガラス粒子は約３０μｍ〜約２００μｍのオーダーであってよい。生体活性ガラス粒子は事実上、寸法範囲３２μｍ〜９０μｍの区別できる粒子および寸法範囲９０μｍ〜１５０μｍの粒子を含む二峰性であってよい。生体活性ガラス粒子は中実でもよく、多孔質であってさえもよい。好ましい実施形態において、生体活性ガラスは非多孔質である。

生体適合性ポリマーと生体活性ガラスは、混合して実質的に均一な混合物を形成することにより、リン酸カルシウムを含む多孔質無機組成物と組み合わせることができる。本文脈において用いる場合、「実質的に均一」とは、混合物中の成分の比がどこでも等しいことを意味する。リン酸カルシウム、生体適合性ポリマー、および生体活性ガラスを含む多孔質無機組成物はまた、組み合わせて種々の形状および寸法のコンポジットマトリックスを形成することができる。

１つの方法においては、ホモジネートのｐＨを監視しながら３種の成分（多孔質無機組成物、生体適合性ポリマー、および生体活性ガラス）を混合する。生体活性ガラス成分は水系の環境による影響を受けやすいので、ホモジネートのｐＨを監視することによって、骨形成活性を促進するために必要なイオンが早期に溶出して混合物中の生体活性ガラス成分が変化することが防止できる。次いでホモジネートを画定された鋳型の中に分散し、凍結乾燥し、いくつかの実施形態においては架橋する。

ある特定の実施形態において、生体活性ガラスは生体適合性ポリマーストランドの上のコーティングの形態であってよい。他の実施形態において、生体活性ガラスは生体適合性ポリマーとリン酸カルシウムの均一な混合物の上のコーティングの形態であってよい。種々の好ましい加熱、凍結乾燥、および架橋技術を用いる処理により、このような混合物は骨グラフト材料を形成し得る。

［流動性の骨グラフト材料］
１種または複数の生体適合性ポリマーおよび生体活性ガラスと高度多孔質リン酸カルシウムとの混合により、孔径分布が広く、いくつかの形態のリン酸カルシウム単独で得られるよりも優れた取扱い性を有する、高度多孔質のグラフト材料が得られる。

本発明の流動性の骨グラフト材料の１つの独特の特徴は、これが部位からのウォッシュアウトに耐性であるのでＭＩＳ（最小侵襲脊椎手術）に使用できることである。本発明の流動性骨グラフトの別の独特の特徴は、これが多孔質無機組成物、１種または複数の生体適合性ポリマーおよび生体活性ガラスを含む乾燥状の骨グラフト材料からの流体の分離、または乾燥状の骨グラフト材料の相互からの成分の分離がなく、注入性を維持できることである。

さらに、本発明の骨グラフト材料は、従来の骨グラフトに比べて改善された骨伝導特性および骨刺激特性を示す。本発明の実施形態のいくつかにおける再吸収プロファイルは、用いた生体適合性ポリマーの量、性質、および供給源に応じて異なり得る。本発明の優れた再吸収特性を説明し得る１つの理由は、生体適合性ポリマーと生体活性ガラスを混合して反応生成物を形成する際でさえも、高度の多孔性が維持されることである。

本発明の流動性骨グラフトは高度に多孔性である。高度に多孔性とは、約３０％を超え、好ましくは約５０％を超え、かつ約１００％未満の全多孔性を有することと定義される。

本発明の流動性グラフト材料の最終の調製体積は、乾燥状の骨グラフト材料の重量と、流体の再構成／加水（reconstitution/hydration）のための体積に基づく。本発明において用いられる流体は、骨髄吸引液、血液、生理食塩水、抗生物質およびタンパク質、たとえば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等であることができる。たとえば一実施形態においては、乾燥状の骨グラフト材料０．８ｇを生理食塩水１．６ｃｃで再構成／加水し、本発明による流動性の骨グラフト材料を形成する。いくつかの実施形態においては、再構成比／加水比（乾燥状の骨グラフト材料の重量：加水用の体積）は、１：１．２〜１：３、好ましくは１：１．３８〜１：１．２５、より好ましくは１：１．８〜１：１．２５、最も好ましくは１：２である。

この加水比が１：１．２未満であると、カニューレ、ニードル、カテーテル、シリンジまたは特別に設計した混合デバイスを用いて、最終の調製体積の流動性グラフト材料を適用部位に送達するために必要な注入力は１００Ｎを超え、したがって最終使用者にとって容易な注入性を達成することができない。

一方、加水比が１：３を超えると、乾燥状の骨グラフト材料から流体が分離し、最終の流動性の骨グラフト材料のウォッシュアウト耐性が悪化するおそれがある。

骨グラフト材料の成分の１つ、即ちリン酸カルシウムを含む無機組成物は、多孔性が高く、孔径分布が広い（１μｍ〜１０００μｍ）ので、インプラントは材料を極めて迅速に含浸／浸漬／吸収できるだけでなく、それらを保持することもできる。本発明の材料は、細胞（たとえば骨芽細胞および骨細胞等の骨の細胞、線維芽細胞、間葉、間質、骨髄および幹細胞）、多血小板血漿、その他の生物学的流体、ならびに上記の任意の組み合わせを吸収することもできる。

本発明の骨グラフトは、いったん流体を吸収し、または流体と接触すれば、実際に流体を保留し、維持し、および／または保持するので、吸収された流体の包含された局所送達が可能になる。この能力は、細胞播種、薬剤送達、および生体分子の送達、ならびに骨組織工学、整形外科、および薬剤の担体における応用に有用性がある。細胞は埋め込みに先立ってグラフトの上に播種してよい。同様に、埋め込みに先立って分子またはタンパク質をグラフトに浸漬してもよい。所望であれば、本発明は自家グラフトおよび同種グラフトの骨チップ、脱塩骨マトリックス（ＤＢＭ）および合成モーセル等の他の入手可能な骨グラフト材料と混合してもよい。

いくつかの実施形態において、本発明の乾燥状の骨グラフト材料は、乾燥状の骨グラフト材料の全重量に対して、約４０重量％〜約８０重量％、好ましくは約５０重量％〜約７０重量％、より好ましくは５５重量％〜６５重量％のリン酸カルシウムと、約１０重量％〜約５０重量％、好ましくは約１５重量％〜約４０重量％、より好ましくは１５重量％〜約３５重量％の生体適合性ポリマーと、約５重量％〜約２５重量％、好ましくは約１０〜２０重量％、より好ましくは約１０重量％〜約１５重量％の生体活性ガラスとを含む。

ある特定の実施形態において、本発明の乾燥状の骨グラフト材料は、リン酸カルシウム、ポリマーおよび生体活性ガラスを、５０：３０：２０〜７０：２０：５、好ましくは５５：２８：１５〜６５．５：２２：１０、より好ましくは６２．５：２２．５：１５〜６２．５：２５：１２．５の重量比で含む。この質量比は、効果的な流動性骨グラフト（たとえば同時に存在する骨形成、ウォッシュアウト耐性、強度およびグラフトの再吸収）に帰することができる全ての特性（たとえば多孔性、孔径分布）を維持しながら、当技術で容易に入手できる方法により、不合理な試験を行なうことなく変更してもよい。

好ましくは、本発明の乾燥状の骨グラフト材料は約７０重量％までのリン酸カルシウムを含んでよい。ある特定の実施形態においては、本発明の骨グラフト材料は約６５重量％までのリン酸カルシウムを含んでよい。本発明の骨グラフト材料は約６０重量％までのリン酸カルシウムを含んでもよい。

好ましくは、骨グラフト材料は約４０重量％までのポリマーを含んでよい。本発明の他のある変形例において、骨グラフト材料は約３０重量％までのポリマーを含んでよい。その他の変形例において、骨グラフト材料は約２５重量％までのポリマーを含んでよい。本発明のさらに他の実施形態において、骨グラフト材料は上記の割合を含む１種または複数の生体適合性ポリマーを含んでよい。いくつかの実施形態において、１種または複数の生体適合性ポリマーの量は、乾燥状の骨グラフト材料の全重量に対して約１５％〜約４０％、好ましくは約１５％〜約３０％の範囲である。本発明の好ましい実施形態において、骨グラフト材料は、乾燥状の骨グラフト材料の全重量に対して２０重量％までの第１のポリマーと２０重量％までの第２のポリマーとを含む。別の好ましい実施形態において、骨グラフト材料は、乾燥状の骨グラフト材料の全重量に対して１０重量％までの第１のポリマーと１６重量％までの第２のポリマーとを含む。さらに別の好ましい実施形態において、骨グラフト材料は、乾燥状の骨グラフト材料の全重量に対して約５重量％〜２０重量％、好ましくは５重量％〜約１５重量％の第１のポリマーと約５重量％〜約２０重量％、好ましくは１０重量％〜約２０重量％の第２のポリマーとを含む。

本発明の骨グラフト材料は、約２０重量％までの生体活性ガラスを含んでよい。ある特定の実施形態において、本発明の骨グラフト材料は、約１５重量％までの生体活性ガラスを含んでよい。ある特定の他の実施形態において、本発明の骨グラフト材料は、約１０重量％までの生体活性ガラスを含んでよい。他の実施形態において、本発明の骨グラフト材料は、約１２．５重量％までの生体活性ガラスを含んでよい。いくつかの実施形態において、骨グラフト材料は生体活性ガラスを含んだ形態で提供されるが、代替の実施形態において、１用量の生体活性ガラスが、手術部位へ埋め込みされる前またはその間に、骨グラフトの中に組み込まれるように提供される。

好ましい実施形態において、本発明の骨グラフト材料は高度の多孔性を示す。多孔性は、広範囲な有効細孔径（effective pore size）で生じることも好ましい。これに関し、本発明の好ましい実施形態は、マクロ多孔性、メソ多孔性、およびミクロ多孔性を有してよい。マクロ多孔性、メソ多孔性、およびミクロ多孔性の定義ならびに材料の多孔性の測定法については上に記載している。

一実施形態において、本発明の骨グラフト材料は、約３０％を超え、好ましくは約５０％を超え、または約６０％を超え、１００％未満の細孔容積を有する。

好ましい事例においては、そのような高い細孔容積が得られる一方、マクロ、メソおよびミクロ多孔性の存在ならびに製造された材料の物理的安定性も得られる。大きな細孔容積と同時にマクロ、メソおよびミクロ多孔性を有し、ある程度の圧縮抵抗および湿潤時の可撓性、成形性、または流動性をも維持したグラフト材料を調製することには大きな利点があると考えられる。

本発明のある特定の実施形態の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）は、これらのグラフト材料が高い多孔性を有することを示している（たとえば図５Ａ−図５Ｄを参照）。

本発明の流動性の骨グラフト材料はまた、改良されたウォッシュアウト耐性を示し、したがって湿潤環境において物理的一体性を維持することができる。透水性の値は流動性の骨グラフト材料のウォッシュアウト耐性と相関する。透水性はたとえば図８に示す試験装置を用いて測定することができる。試験装置および試験方法の詳細は以下の実験例３で説明する。概して、試験装置には試験すべき流動性試料を固定する透過性試験用固定具、圧力トランスデューサーおよび３０ｃｃのシリンジが含まれている。これら３つの部品は４方向の高流量ストップコックに連結されている。流動性試料を有する透過性試験用固定具に一定の流体流量の生理食塩水を送達するためにシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ １１ Ｅｌｉｔｅ）を用い、圧力トランスデューサーによって試料の抵抗による圧力を記録する。圧力トランスデューサー（Ｏｍｅｇａ ＵＳＢ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ０−１００ ＰＳＩ）は内径１／４インチのタイゴンチューブおよびルアーアダプターによってストップコックに連結されており、チューブはジップタイによって固定されている。

次いでシリンジポンプを始動して、５ｍｌ／分で透過性試験用固定具の中の試料材料への生理食塩水の注入を開始し、圧力トランスデューサーによって試料の抵抗による圧力を１分間記録する。流動性の骨グラフト材料の材料透過性を以下の式：
によって計算する。
ここで、Ｑは体積流量（ｍ^３／ｓ）、
μは水の動粘度（９．４Ｅ−４ Ｐａ・ｓ）、
Ｌは試料の厚み（０．０１０１６ｍ）、
Ｐは試料を横切る圧力低下（Ｐａ）、
Ａは流れに曝される表面積（４．５５ Ｅ−５ ｍ^２）である。

透水性の値は流動性の骨グラフト材料のウォッシュアウト耐性と相関する。より低い透過性値はよりウォッシュアウト耐性である材料と相関する。本発明の流動性の骨グラフト材料は、実験例３に記載した方法に従って試験するとき、約１．０Ｅ−１３ ｍ^２未満、好ましくは約９．０Ｅ−１４ ｍ^２未満の透水性を有することが好ましい。別の実施形態において、流動性の骨グラフト材料の透水性は約１．０Ｅ−１４ ｍ^２〜約１．０Ｅ−１３ ｍ^２、好ましくは約１．０Ｅ−１４ ｍ^２〜約９．０Ｅ−１４ ｍ^２、より好ましくは約２．０Ｅ−１４ ｍ^２〜約６．０Ｅ−１４ ｍ^２、最も好ましくは約３．０Ｅ−１４ ｍ^２〜約４．４Ｅ−１４ ｍ^２である。流動性の骨グラフト材料の透水性は実験例３に記載したように試験される。

本発明の骨グラフト材料は骨伝導特性および骨刺激特性を有する。ある特定の実施形態において、本発明における生体活性ガラスの添加により、骨の成長を促進する製品の能力が増強される。本発明の骨グラフト材料は骨誘導特性をも有し得る。

［キット］
本発明の別の態様によれば、約１００μｍ〜約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムと、生体活性ガラスと、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む１種または複数の生体適合性ポリマーとを含む乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジ（注射器筒）を備えたキットが提供される。好ましい実施形態において、シリンジには、追加的な生体適合性ポリマーとしてゼラチンがさらに含まれる。別の好ましい実施形態において、乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジには、骨髄吸引液、血液または生理食塩水等の流体が入っていない。

好ましい実施形態において、キットは、骨髄吸引液、血液または生理食塩水等の流体が充填される加水用シリンジと、乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジを真空引きして空気を排出するための真空シリンジと、シリンジ中で乾燥状の骨グラフト材料と流体を混合してインサイチュで形成した流動性の骨グラフト材料を注入するためのカニューレとを更に備える。説明のためのキットの部品を図１および図２に示す。

本発明によれば、流体は、乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジ本体に、直接的に吸引または注入されることによって、凝集性で、注入可能な、流動性の骨グラフト材料がシリンジ本体の中に「インサイチュ」で形成される。

別の好ましい実施形態において、キットは、１種または複数の生体適合性ポリマーと無機組成物とを含むが、生体活性ガラスを何ら含まない乾燥状の骨グラフト材料が入った容器またはシリンジを備える。このような実施形態において、生体活性ガラスは、後日使用する前に、異なった別の容器で、または乾燥状の骨グラフト材料と組み合わせるためのシリンジで提供される。生体活性ガラスが入った異なる別の容器は、乾燥状の骨グラフトが入ったシリンジに連結できるように適合されており、それによって、シリンジと容器間で往復させて均一な混合が可能となる。このように、最終的には成分を混合してリン酸カルシウムと、生体適合性ポリマーと、生体活性ガラスとを含む実質的に均一な骨グラフト材料にすることができる複合装置が提供される。

本発明のキットによれば、取扱い容易な用量の流動性の骨グラフト材料が提供される。血液、骨髄吸引液、または生理食塩水等の所望の流体と乾燥状の骨グラフト材料とを混合した後、本発明は１２ゲージまたは１０ゲージのカニューレまたはカテーテル等の細いオリフィスを通して注入により送達することができる。血液、骨髄吸引液、生理食塩水、抗生物質、骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）等のタンパク質、分子、ベクター、治療薬、およびそれらの組み合わせ等の種々の他の流体も、本発明において用いることができる。

［流動性の骨グラフト材料を作成する方法］
本明細書では、本発明に係る流動性の骨グラフト材料を作成する方法も記載する。一実施形態において、この流動性の骨グラフト材料を調製する方法は、水等の溶媒にゼラチンを溶解するステップと、約１００μｍ〜約１，０００μｍ、好ましくは約２１２μｍ〜約８５０μｍの範囲の寸法を有するリン酸カルシウム鉱物粒子を添加するステップと、約２０μｍ〜約２００μｍの範囲の寸法を有する生体活性ガラス粒子、好ましくは３２μｍ〜９０μｍの範囲の寸法を有する第１の粒子の組と約９０μｍ〜約１５０μｍの範囲の寸法を有する第２の粒子の組を有する二峰性粒径分布を有する生体活性ガラス粒子を添加するステップと、低級アルキルセルロースエーテル、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウムを添加するステップと、第３の混合物を凍結乾燥するステップと、凍結乾燥した混合物をモーセル化（morselize）して、好ましくは０．５ｍｍ〜２ｍｍ、より好ましくは０．５ｍｍ〜１ｍｍの範囲の寸法にするステップと、乾燥状の骨グラフト材料をシリンジの中に入れるステップとを含む。

別の実施形態において、流動性の骨グラフト材料を調製する方法は、水等の溶媒にゼラチンを溶解してゼラチン溶液を形成するステップと、約１００μｍ〜約１，０００μｍ、好ましくは約２１２μｍ〜約８５０μｍの範囲の寸法を有するリン酸カルシウム鉱物粒子を所定の量でかつ時間とともに所定した増分でゼラチン溶液に添加して第１の混合物を形成するステップと、約２０μｍ〜約２００μｍの範囲の寸法を有する生体活性ガラス粒子、好ましくは約３２μｍ〜約９０μｍの範囲の寸法を有する第１の粒子の組と約９０μｍ〜約１５０μｍの範囲の寸法を有する第２の粒子の組を有する二峰性粒径分布を有する生体活性ガラス粒子を、所定の量でかつ時間とともに所定の増分で、室温で第１の混合物に添加して第２の混合物を形成するステップと、低級アルキルセルロースエーテル、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウムを所定の量でかつ時間とともに所定の増分で第２の混合物に添加して第３の混合物を形成するステップと、第３の混合物を凍結乾燥するステップと、凍結乾燥した第３の混合物をモーセル化して、好ましくは約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の寸法の乾燥状の骨グラフト材料を製造するステップと、乾燥状の骨グラフト材料をシリンジの中に入れるステップとを含む。

一実施形態において、添加するゼラチンの量は、骨グラフト材料の乾燥成分の全重量に対して約５％〜約２０％、好ましくは約１０％〜約２０％、より好ましくは約１３％〜約１６％である。一実施形態において、添加するリン酸カルシウムの量は、骨グラフト材料の乾燥成分の全重量に対して約５０％〜約７０％、好ましくは約５５％〜約６５％である。別の実施形態において、添加する生体活性ガラスの量は、骨グラフト材料の乾燥成分の全重量に対して約１０％〜約２０％、好ましくは約１０％〜約１５％である。さらに別の実施形態において、添加する低級アルキルセルロースエーテルの量は、骨グラフト材料の乾燥成分の全重量に対して約５％〜２０％、好ましくは約５％〜１５％である。

一実施形態において、ゼラチンは時間とともに１から５の実質的に同じ増分で、好ましくは時間とともに３から５の実質的に同じ増分で溶媒に添加される。別の実施形態において、リン酸カルシウムは時間とともに１から５の実質的に同じ増分で、好ましくは時間とともに３から５の実質的に同じ増分でゼラチン溶液に添加される。別の実施形態において、生体活性ガラスは時間とともに１から４の実質的に同じ増分で、好ましくは時間とともに２から４の実質的に同じ増分で第１の混合物に添加される。さらに別の実施形態において、低級アルキルセルロースエーテルは時間とともに１から５の実質的に同じ増分で、好ましくは時間とともに３から５の実質的に同じ増分で第２の混合物に添加される。

本発明のさらに別の実施形態において、グラフト材料は細切され、または小片に切断され得る。これらの細切された小片は好ましくは０．５ｍｍ〜２ｍｍの寸法範囲、より好ましくは０．５ｍｍ〜１ｍｍの寸法範囲であり、それによりシリンジ本体に入れることができる。細切された小片によって流体との最適な混合のための高い表面積の露出が可能になり、凝集性で注入可能なパテを製造することができる。これには不規則な骨の空隙欠損のためのフィラーとしての特定の用途があり、有益な治癒のための隣接する骨との最大の接触を確実にして注入することができる。

別の好ましい実施形態において、生体適合性ポリマーと無機組成物を上述のように組み合わせ、生体活性ガラスを異なった別の容器として提供し、手術場において使用準備の間に、たとえば外科医により乾燥状の骨グラフト材料に組み込むようにしてもよい。

本発明の代替の実施形態によれば、動物において骨を復元または修復する方法が提供され、この方法は、復元すべき部位にアクセスするステップと、好ましくは約０．５ｍｍ〜２ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の寸法を有する乾燥状の骨グラフト材料を製品シリンジに充填するステップと、製品シリンジに真空シリンジを連結するステップと、真空シリンジを用いて製品シリンジから空気を追い出し、真空引きするステップと、製品シリンジから真空シリンジを取り外すステップと、流体を含む加水用シリンジを製品シリンジに連結するステップと、加水用シリンジを用いて両シリンジ間で合計約５回〜約２０回、好ましくは約１０回〜約１６回、材料を往復移動させることによって、乾燥状の骨グラフトと流体とを混合して流動性の骨グラフト材料をインサイチュで形成するステップであって、このとき生理食塩水を骨グラフト材料に最初に移送することが１回目の移動を構成し、それと逆向きの移送が２回目の移動を構成するステップと、両シリンジを切り離すステップと、製品シリンジと加水用シリンジのいずれであってもよい骨グラフト材料が入ったシリンジにカニューレを取り付けるステップと、復元すべき部位にカニューレを位置決めするステップと、１４０Ｎ未満の力、好ましくは１００Ｎ未満、より好ましくは約５０Ｎ〜約１００Ｎの押出力で流動性の骨グラフトを送達するステップとを含む。

本発明によれば、流体は、乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジ本体に直接吸引または注入され、それにより、用途の必要性に応じて均一で、凝集性で、注入可能な流動性の骨グラフト材料がシリンジ本体中に「インサイチュ」で形成される。

本発明のさらに別の実施形態によれば、動物において骨を復元し、または修復する方法であって、復元すべき部位にアクセスするステップ、好ましくは約０．５ｍｍ〜２ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の寸法を有する乾燥状の骨グラフト材料を製品シリンジに充填するステップ、所望の流体を加水用シリンジに充填するステップ、乾燥状の骨グラフト材料を含む製品シリンジにおいて真空引きして空気を追い出すための真空シリンジを準備するステップ、真空ハブアダプターの３つのルアーにそれぞれ製品シリンジ、加水用シリンジ、および真空シリンジをつなぐステップ、真空シリンジを用いて真空引きして空気を追い出すステップ、ルアーから真空シリンジを取り外すステップ、加水用シリンジを用いて乾燥骨グラフトと流体を混合して製品シリンジの中、インサイチュで流動性の骨グラフト材料を形成させるステップ、真空ハブアダプターから製品シリンジを取り外すステップ、製品シリンジに１０ゲージのカニューレを取り付けるステップ、復元すべき部位にカニューレを位置決めするステップ、復元すべき部位に１４０Ｎ未満の力、好ましくは１００Ｎ未満、より好ましくは約５０Ｎ〜約１００Ｎの押出力で流動性骨グラフトを送達するステップを含む方法が提供される。

［骨修復の方法］
一実施形態において、本発明によれば、流体が骨グラフト材料と混合され、使用者が材料に触れ、または材料を混練する必要なしに部位に注入することができる流動性の均一な塊を得る方法が提供される。一実施形態において、流動性の骨グラフト材料は、ＭＩＳ（最小侵襲脊椎手術）処置に用いられる。

一実施形態において、動物において骨を修復する方法は、約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む無機組成物と、生体活性ガラスと、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む１種または複数の生体適合性ポリマーと、流体とを含む流動性の骨グラフト材料を形成するステップと、復元すべき部位にアクセスするステップと、骨グラフト材料をこの部位に送達するステップを含む。

本明細書に開示する実施形態の多くは、体内の間隙および欠損を充填するためのものである。本発明の実施形態の応用としては、これらに限らないが椎体間固定デバイス／ケージ（リングケージ、円筒状ケージ）の充填、ケージに隣接したプレースメント（即ち、フロントケージ内）、後側方固定術（ＰＬＦ）処置における後側部溝のプレースメント、腸骨稜の埋戻し、寛骨臼の再建ならびに股関節および膝関節の再置換、大きな腫瘍による空隙、脛骨高位骨切り術における使用、穿頭孔の充填、ならびにその他の頭蓋欠損における使用が挙げられることが認識されよう。ストリップ状の骨グラフト材料は、後側方溝のプレースメントによるＰＬＦ、およびオンレイ固定グラフトにおける使用に適している。その他の使用としては、傷害を受けた／空隙のある部位を覆い、または包むことを必要とする頭蓋顔面および外傷の処置が挙げられる。円柱状の骨グラフト材料は、脊椎ケージおよび大きな骨の空隙を充填するため、および脊椎の後側方溝に沿ったプレースメントに適している。

本発明のグラフト材料は、骨の空隙に充填する数多くの用途および椎体間固定デバイスの充填等の幅広い用途において用い得ることを理解されたい。荷重負荷能力を有するグラフト材料を必要とする用途において、本発明のグラフト材料は、メッシュ、プレート、スクリュー、ロッド、縫合糸、ステープル、締結ワイヤ、チタンもしくはステンレススチール等の金属、またはポリエーテルエーテルケトン（「ＰＥＥＫ」）等のポリマーもしくは複合ポリマー、またはニチノール製のインプラントを含む標準的な整形外科用ハードウェアと併用することができる。

本発明は椎体置換デバイスおよび脊椎インプラント等の整形外科用の荷重負荷材料と併用することもでき、それにより本発明の材料はこれらのデバイスの開口部に注入される。荷重負荷フレームはチタン等の金属またはＰＥＥＫもしくはポリ乳酸（「ＰＬＡ」）のある形態のコンポジット等の荷重負荷再吸収性コンポジットから作ることができる。後者の場合には、ＰＬＡ由来の酸が、埋め込まれた骨グラフト材料のリン酸カルシウムと共同作用または相互作用して、優れた再吸収特性を有するインプラントが提供される。

［実施例１］
［乾燥状の骨グラフト材料の製造］
多孔質リン酸カルシウムを調製し、次いで粉砕および篩分けして、寸法範囲が２１２μｍ〜約８５０μｍのモーセルを得た。

ゼラチン（Ｇｅｌｉｔａ ２５０ Ｂｌｏｏｍ ＭｅｄｅｌｌａＰｒｏ Ｔｙｐｅ Ａ ＮＦ ブタ皮膚）を室温で水に溶解した。ゼラチン溶液を２℃〜８℃で一夜冷蔵した。冷蔵したゼラチンを加温チャンバー内で５０℃に加温し、ゼラチンの中心部が約１８℃〜２０℃、容器の周辺部が約２４℃〜２５℃になるようにした。加温したゼラチンを４つのほぼ同じ大きさの小片に切断し、ゼラチンを約１０分間混合した。次に、約２１２μｍ〜約８５０μｍの寸法範囲を有するリン酸カルシウム鉱物粒子を５つのほぼ等量に分割して室温でゼラチンに加えた。次に、非多孔質コンベアイトを４つのほぼ等量に分割して加えた。コンベアイトの粒径は３２μｍ〜９０μｍおよび９０μｍ〜１５０μｍの二峰性粒径分布を有していた。次に、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｓｈｌａｎｄ：Ａｑｕａｌｏｎ ＣＭＣ ７Ｍ８ＳＦ ＰＨ／Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．４１４２６３）を４つのほぼ等量に分割して加えた。加えたゼラチン、リン酸カルシウム粒子、コンベアイト、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムの量を下の表１に示す。実施例１のカルボキシメチルセルロースナトリウム成分の粘度は４００〜８００ＭＰａ・ｓ、置換度は０．７、分子量は２５０，０００であった。

次いで混合物をトレイに載せ、凍結乾燥した。続いて、凍結乾燥した材料を０．５ｍｍ〜２ｍｍの寸法範囲にモーセル化して、得られる乾燥状の骨グラフト材料を製造した。

［実施例２〜５］
［流動性の骨グラフト材料の製造］
実施例１のモーセル化した乾燥状の骨グラフト材料を製品シリンジに入れた。次いで製品シリンジを真空シリンジに連結して製品シリンジから空気を追い出した。製品シリンジから真空シリンジを取り外した後、生理食塩水を含む加水用シリンジを製品シリンジに連結した。加水用シリンジの中の生理食塩水が製品シリンジに流入するにつれて、製品シリンジのプランジャーを押圧した。材料をもう１つのシリンジに逆送することによってこれをさらに混合するまで、５秒の待ち時間があった。材料が適切に混合されるまで、製品シリンジと加水用シリンジの間で材料を往復移送した。加水用シリンジ中の生理食塩水を製品シリンジ中の乾燥状の骨グラフト材料に最初に移送することが、１回目の移動を構成し、逆向きの移送が２回目の移動を構成する、などである。材料を一方のシリンジから他方のシリンジに移送するまでの各移動は、５秒の待ち時間を含んでいた。

例えば、様々な量の生理食塩水を用いて様々な移動回数で、ならびに製品シリンジを真空引きするための真空シリンジを用い、または用いずに、下の表２に示すように種々の配合物を作成した。

［比較例１］
カルボキシメチルセルロースナトリウムを加えなかったこと以外は実施例１と同様にして、乾燥状の骨グラフト材料を調製した。この比較例における成分の量を下の表３に示す。

［比較例２］
市販の製品であるＶＩＴＯＳＳ ＦＯＡＭ ＦＬＯＷ（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｏｒｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を試験した。この製品は生体適合性ポリマーとしてコラーゲンを含み、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはゼラチンを含んでいない。この製品はまた、生体活性ガラスを含んでいない。

［実施例６〜１１］
用いたカルボキシメチルセルロースナトリウムの粘度、置換度および量が下の表４に示すものであったこと以外は実施例２と同様にして、流動性の骨グラフト材料を調製した。

［実験例１］
［走査電子顕微鏡による評価］
実施例１の乾燥状の骨グラフト材料の一実施形態の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を図５Ａ〜図５Ｄに示す。乾燥状の骨グラフト材料は、その全体にわたってリン酸カルシウム、生体適合性ポリマー、および生体活性ガラスの実質的に均一な混合物を有することが確かめられた。

［実験例２］
［混合試験］
種々の配合物の混合特性の評価を下の表５にまとめる。

［実験例３］
［押出力］
２．４ｇの乾燥状の骨グラフト材料を含むシリンジ本体に生理食塩水５ｃｃを直接注入し、１５回移動させて混合して、それにより流動性の骨グラフト材料を「インサイチュ」で形成した。押出力は、それぞれ５ｃｍおよび１０ｃｍの２つの異なった長さを有する１２ゲージのカニューレを用いて、速度０．２５ｃｃ／秒で試験した。実施例１の骨グラフト材料を用いた押出力試験の結果を図７に示す。示したように、１２ゲージを通して流動性の骨グラフト材料を押し出すために必要な押出力は１４０Ｎを超えなかった。

その他の種々の配合物の押出試験の結果を下の表６にまとめる。

［実験例４］
［透水性試験／ウォッシュアウト耐性］
種々の配合物についてウォッシュアウト耐性を決定するために透水性試験を実施した。図８に示すように、試験装置は試験すべき流動性試料を固定した透過性試験用固定具、圧力トランスデューサーおよび３０ｃｃのシリンジを含んでいた。これら３つの部品を４方向の高流量ストップコックに連結した。流動性試料を有する透過性試験用固定具に一定の流体流量の生理食塩水を送達するためにシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ １１ Ｅｌｉｔｅ）を用い、圧力トランスデューサーによって試料の抵抗による圧力を記録した。圧力トランスデューサー（Ｏｍｅｇａ ＵＳＢ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ０−１００ ＰＳＩ）を、内径１／４インチのタイゴンチューブおよびルアーアダプターによってストップコックに連結し、ジップタイを用いてチューブを固定した。

図９の左から右に示す部品を組み立てて、試験装置の部品の１つ、即ち透過性試験用固定具を準備した。部品には固定ベース、外径４分の３インチのステンレススチールフィルター、試料ホルダー、Ｏリングおよび外径２分の１インチのステンレススチールフィルターアセンブリー、Ｏリングインサート、テフロン（登録商標）ワッシャーおよび固定キャップが含まれていた。最初に１個の外径４分の３インチのステンレススチールフィルターを試験用固定ベースに平らに取り付けた。次いで６ｃｃのシリンジに３．００ｃｃの滅菌生理食塩水を満たし、試験用固定ベースのルアーコネクターに連結した。試験用固定ベースにスチールフィルターまで生理食塩水を満たした。次いで図１０に示すように、調製した流動性の骨グラフト材料を、最初に周辺部に材料を満たし、次いで底から充填して試料内部にエアポケットが捕捉されないようにして、試料ホルダーの中に押し出した。引き続いて、第２のＯリングおよび外径２分の１インチのステンレススチールフィルターアセンブリーを試料ホルダーの上部に組み立てた。次いでＯリングインサートをＯリングに押し込み、Ｏリングがベースの周辺部をシールし、試験用固定ベースから突出するようにした。最後に、透過性試験用固定キャップをベースにねじ込んだ。次いで６ｃｃのシリンジを透過性試験用固定ベースから取り外し、ベースを試験装置の４方向ストップコックに連結した。

シリンジポンプを始動して、５ｍｌ／分で透過性試験用固定具の中の試料材料への生理食塩水の注入を開始し、圧力トランスデューサーによって試料の抵抗による圧力を１分間記録した。

乾燥状の骨グラフト材料に対して６２．５重量％のβ−ＴＣＰ、１２．５重量％のＢＡガラス、１５重量％のゼラチンおよび１０重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む実施例２について透水性試験を実施した。ここで実施例２のカルボキシメチルセルロースナトリウム成分の粘度は４００〜８００ＭＰａ・ｓ、置換度は０．７であった。より低い透過性値はよりウォッシュアウト耐性である材料と相関する。実施例２〜５および比較例１〜２の透水性試験の結果を図６に示す。実施例２は最小の透過性値を示し、これは最大のウォッシュアウト耐性と相関する。さらに、実施例２〜５は比較例１〜２と比較して低い透過性値（これは高いウォッシュアウト耐性と相関する）を示した。

［実験例５］
［流体中への注入］
種々の配合物の材料を調製し、４００ｍＬのＰＢＳを入れた６００ｍＬのビーカーに注入した。流体中に注入した際に材料が依然として凝集性であって崩壊しなければ、その配合物は注入試験に合格とした。他の種々の配合物の試験結果を下の表７にまとめる。

本明細書において特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、これらの実施形態は単に本発明の原理および応用を説明するものであることを理解されたい。したがって添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、説明した実施形態に数多くの改変が可能であること、および他の配置も考案できることを理解されたい。

Claims (20)

1. 約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムを含む多孔質無機組成物と、
   生体活性ガラスと、
   カルボキシメチルセルロースを含む１種または複数の生体適合性ポリマーと、
   生理食塩水、骨髄吸引液、血液およびそれらの混合物からなる群から選択される流体と
   を含む流動性の骨グラフト材料。
2. 前記１種または複数の生体適合性ポリマーが、ゼラチンをさらに含むものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
3. 前記カルボキシメチルセルロースが、カルボキシメチルセルロースナトリウムである請求項１に記載の骨グラフト材料。
4. 前記カルボキシメチルセルロースが、約１００，０００ＭＷから約３００，０００ＭＷの分子量を有するものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
5. 前記カルボキシメチルセルロースが、約４００ＭＰａ・ｓから約８００ＭＰａ・ｓの粘度を有するものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
6. 前記カルボキシメチルセルロースが、約０．６〜約０．８の置換度を有するものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
7. 前記カルボキシメチルセルロースが、前記骨グラフト材料の全重量に対して約５％から約１５％の量で存在する請求項１に記載の骨グラフト材料。
8. 前記ゼラチンが、前記流体を除いた前記骨グラフト材料の重量に対して約１０％から約２０％の量で存在する請求項２に記載の骨グラフト材料。
9. 前記１種または複数の生体適合性ポリマーが、前記流体を除いた前記骨グラフト材料の重量に対して約１５％から約４０％の量で存在する請求項１に記載の骨グラフト材料。
10. 前記リン酸カルシウムが、前記流体を除いた前記骨グラフト材料の重量に対して約５０％から約７０％の量で存在する請求項１に記載の骨グラフト材料。
11. 前記生体活性ガラスが、前記流体を除いた前記骨グラフト材料の重量に対して約１０％から約２０％の量で存在する請求項１に記載の骨グラフト材料。
12. 前記無機組成物が、β−リン酸三カルシウムを含むものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
13. 前記生体活性ガラスが、４５Ｓ５ガラスセラミックまたはコンベアイトガラスセラミックである請求項１に記載の骨グラフト材料。
14. 抗生物質、骨形態形成タンパク質、または治療薬をさらに含む請求項１に記載の骨グラフト材料。
15. 前記骨グラフト材料が、１２ゲージのカニューレまたはカテーテルを通して注入によって送達可能なものである請求項１に記載の骨グラフト材料。
16. ５ｃｃの前記生体活性グラフト材料を押し出すために必要な力の量が、長さ７．５ｃｍの１２ゲージのカニューレを通して０．２５ｃｃ／秒の速度で、１００Ｎ未満である請求項１に記載の骨グラフト材料。
17. 約１００μｍから約１，０００μｍの粒径を有するリン酸カルシウムと、生体活性ガラスと、カルボキシメチルセルロースを含む１種または複数の生体適合性ポリマーとを含む乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジを備えたキットであって、前記シリンジは流体が入っていないものであるキット。
18. 前記シリンジがゼラチンをさらに含むものである請求項１７に記載のキット。
19. 流体が充填されている加水用シリンジと、
    前記乾燥状の骨グラフト材料が入ったシリンジを、真空引きして空気を排出するための真空シリンジと、
    前記骨グラフト材料を注入するためのカテーテルまたはカニューレと
    をさらに備えた請求項１８に記載のキット。
20. 前記カテーテルまたはカニューレが、最小侵襲手術に用いるための１２ゲージの装置である請求項１９に記載のキット。