JP2017529208A - 改善された骨誘導性基材及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
[0001]本願は、Vanderploegらによる2014年8月28日提出の米国仮特許出願第62/043356号及びDeckerらによる2015年5月1日提出の米国仮出願第62/155835号に対し、35U.S.C.§119(e)に基づき優先権の利益を主張するものである。上記出願のそれぞれを、全体として本明細書中で参考として援用する。
[0031]本発明のさまざまな態様に従った埋込物(「構築物」とも称する)は、一般に3つの成分を包含する:カルシウムセラミック又は他の鉱物固体などの骨伝導性材料、骨形成タンパク質などの骨誘導性材料、及び、反応してゲル又は他の塊を形成する流動性生体適合性マトリックス材料。本明細書中で用いる場合、骨伝導性材料は、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨前駆細胞、間葉系幹細胞、並びに、骨格組織を合成及び/又は維持する細胞に分化するか、又はそのような細胞の成長を促進することができる他の細胞を含む、骨芽性細胞の内部成長を促進する任意の材料を表す。本発明の好ましい態様では、骨伝導性材料は、骨伝導性リン酸カルシウムセラミックを含む多孔質顆粒であって、該顆粒上に担持している骨誘導性物質の持続放出がもたらされるように適合されているものである。いくつかの場合には、該顆粒は、骨誘導性物質が吸着又は結合することができる表面を規定するミクロ及びマクロ細孔の両方を包含する。ミクロ細孔及びマクロ細孔はともに、骨誘導性物質が吸着することができる全表面積を増大させるが、細胞による浸潤が可能になるのはマクロ細孔のみである。したがって、ミクロ細孔内の骨誘導性物質は、マクロ細孔に浸潤する細胞によって顆粒が分解されるにつれて、徐々に利用可能になるだけである。
担持手順
[0039]本発明の合成骨移植片材料は、一般に、顆粒、骨誘導性材料、及び生体適合性マトリックス材料を順次組み合わせることにより調製される。図2A〜2Cは、合成骨移植片を調製するための代表的な2段階プロセスを示している。最初に、図2A〜2Bに示すように、BMPのような骨誘導性材料を、例えば、骨誘導性材料が顆粒内のさまざまな表面、例えば内部細孔表面(存在する場合)に付着させるように、該材料を含有する溶液を顆粒上に流すことにより、顆粒に施用する。好ましい態様では、顆粒に施用する溶液の体積は、顆粒を完全に湿潤させるのに十分な体積であり、これにより、確実にすべての表面(内部細孔表面を含む)が骨誘導性材料とインキュベートされる。顆粒のインキュベーションは、さまざまな間隔、温度、圧力(ミクロ細孔の完全な浸潤を促進するのに必要な場合がある)にわたることができ、又は、骨誘導性材料と顆粒の組合せに合うように任意の適した方法で処理することができる。顆粒中への流体の浸潤は、1以上の界面活性剤を包含させることにより促進させてもよい。
[0046]いくつかの場合には、本開示の機器、システム、及び方法を用いて、ヒドロゲル足場内のリン酸カルシウム顆粒上に骨誘導性材料を均一に担持することができる。考えうるヒドロゲル材料の一つは、チラミン置換ヒアルロン酸(HA)である。そのようなヒドロゲルの流れ特性を理解するために、図3に示すように特定濃度(5mg/mL又は10mg/mL)においてさまざまな架橋性活性チラミン塩基置換(1%、3%、及び5%)を有するヒドロゲルのオシレーション及び流れ試験を、AR2000レオメーター(TA Instruments、デラウェア州ニューキャッスル)を用いて分析した。ヒドロゲルの動態は、2°、直径40mmのアルミニウムコーンの下にて、レオメーター表面に900μLのヒドロゲルを施して、流れの手順を用いて試験した。各ヒドロゲルの粘度は、一定温度(25℃)において0〜60Paの施用剪断応力の範囲に及んでいた。各ヒドロゲルの経時変化を分析するために、6つのヒドロゲル組成物のそれぞれでオシレーション試験を実施した。900μLのヒドロゲルを、レオメーターのプラットフォームのアルミニウムコーンの下に加えた。1Hzに保持したオシレーション振動数で1%の一定歪みにて掃引時間20分で実施した。90秒後、化学量論的分量の過酸化水素を、以下の式に従った3つの等量でアルミニウムコーンの縁の周囲に加えた:過酸化水素全量(μL)=(0.496)(X)(Y);式中、X=チラミン塩基置換率(すなわち、1%=1)であり、Y=ヒドロゲル濃度(すなわち、5mg/mL=5)である。
[0048]図3を参照すると、BMP及び流動性マトリックス材料の試験中に直面する課題の1つは、埋込物の形成中にこれらの材料が均一に混合されない点であった。これは、マトリックス中のBMP及び/又は顆粒の濃度が不均一であるため機械的な破損及び/又は矛盾した生物学的活性を生じやすい可能性がある、比較的不均一な埋込物をもたらした。埋込物の均質性を改善するための手段の1つは、有窓ニードル(図3A)の使用であった。有窓ニードルは、その長さに沿って多くの開口部を包含し、この開口部を通って、顆粒を充填したチャンバー(シリンジ筒など)に溶液を流入させることができた。図3に示す実施例では、閉じた遠位端を有する有窓ニードルを、少なくとも部分的に顆粒を詰めたシリンジ筒などの細長いチャンバーのほぼ中心部に挿入している。その後、蛍光標識BMP−2及び過酸化水素(生体適合性マトリックスの架橋に必要とされる試薬)の溶液をニードルに通してチャンバーに流入させた。BMP−2/過酸化水素溶液に続いて、官能基化ヒアルロン酸の溶液をニードルに通して顆粒上に流した。あるいは、溶液は、中心に位置する有窓ニードルなしで、シリンジのルアーチップに通して顆粒に連続的に施用した。どちらの場合も、流体は近位から遠位の方向に流した。有窓ニードルがない場合、チャンバーに流入させた溶液は、近位に位置する顆粒に必然的に接触してから、遠位に位置する顆粒に到達していた。対照的に、有窓ニードルでは、チャンバーの長軸全体にわたり、新鮮な溶液と顆粒がほぼ同時に接触することが可能であった。図3C〜3Nに例示するように、有窓ニードルを使用すると、BMP/過酸化水素及び生体適合性マトリックスの溶液の比較しうるボーラス施用で達成される分布と比較して、得られる埋込物の半径方向(例えば中心から端)及び軸方向(近位から遠位)の両方に沿って、実質的により均一なBMP分布(蛍光信号)がもたらされた。
実施例3:均質な埋込物を形成するための静的ミキサーの使用
[0049]生体適合性マトリックス内にBMP担持顆粒を含む埋込物を作製するために、埋込物の成分を2つのシリンジに入れて、静的ミキサーのコネクターを往復して通過させた。ヒドロゲル材料を一方のシリンジに加え、顆粒、望ましいタンパク質(又は染料)及び0.09%過酸化水素を他方のシリンジで組み合わせた。その後、システムからの成分の漏れ及び/又は成分の時期尚早の混合が起こり得ないように、混合コネクターを、水平に保持されたシリンジにきつく装着した。ヒドロゲルと顆粒成分を混合するために、最初にヒドロゲルシリンジを、顆粒混合物を含有するシリンジにヒドロゲルが移動するように押し込んだ。その後、顆粒混合物シリンジを、すべての成分が静的ミキサーを通って他のシリンジ内に移動するように押し込んだ。この混合は5秒間かけて10回行った。このプロセスの間に、機器を軸に沿って回転させて、顆粒の沈降を抑制した。5秒間の混合時間の後、すべての材料がシリンジの底部に流入し、埋込物が硬化するように、機器を垂直に置いた。シリンジの外形及び材料の使用量(1800μL)により、直径10mmで長さ20mmの円柱状埋込物が形成した。
実施例4:埋込物の機械的分析
[0050]平行板レオメトリーを用いて、静的混合機器を用いて生産した埋込物の機械的特性を評価した。AR2000レオメーターを用いて動的レオロジー試験を実施した。埋込物は、10mg/mL濃度での3%チラミン置換物、トリパンブルー染料、0.09%過酸化物及び顆粒を混合するために単一横棒設計を用いて作製した(表1)。
実施例5:蛍光プレートリーダーの解析
[0052]蛍光標識アルブミンAlexa Fluor−647(AF647)タンパク質(励起波長670nm;発光波長670nm)を用いて埋込物を作製した。単一横棒の原型を用いて、PBS中に1:250で希釈したアルブミンAF647で標識した10mg/mL濃度での3%チラミン置換物、0.09%過酸化物、及び顆粒を混合した(表1)。成形物を5mmの断片に切断し、機械的試験のデータを収集した後、各断片を、100μLのPBSを有する48ウェルプレートの単一ウェルに入れた。プレートをSpectraMaxTM M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,LLC、カリフォルニア州サニーベール)で読んで、5mmの各切片中の蛍光強度を決定した。その後、蛍光強度を、各断片中のアルブミンタンパク質の量で正規化した。アルブミンでの予備試験につづき、BMP緩衝液(50mMグルタミン酸、0.75%グリシン、pH3.75)中に1:120で希釈したAlexa Fluor−488(AF488)標識BMP−2(励起波長488nm;発光波長520nm)を用いて埋込物を作製し、同じアプローチを用いて蛍光性を測定した。
実施例6:ヒドロゲルの硬化及び剛性の測定
[0053]相対的な過酸化物結合の硬化時間及び剛性を、さまざまなヒドロゲル(例えば、1%、3%、及び5%チラミン塩基置換;5mg/mL及び10mg/mL濃度)について特性決定した。各位相差曲線の規則的な減少は、粘性液体から弾性固体への各ヒドロゲルの進行を示している(図6)。硬化時間は、過酸化物を加えたときから、剪断弾性率の剪断貯蔵G’(弾性)成分が剪断損失G”(粘性)成分を超えるまでの期間であった。チラミン塩基置換がより多く、ヒドロゲル濃度がより高いヒドロゲルは、所定のチラミン塩基置換内でより緩慢に硬化した(図7)。もっとも硬化時間が長かったヒドロゲルは、5mg/mLでの1%置換物、10mg/mLでの1%、及び10mg/mLで3%置換物であった(表2)。
[0055]ヒドロゲルの選択に続き、埋込物成分を均一に混合するための機器を開発した。設計プロセスに着手するために、混合機器に関し多数の構想を練った。これらの構想は、決して限定するものではないが、2重筒シリンジ、動翼ミキサー、ローリングチューブ(rolling tube)法及び静的ミキサーを包含していた。ヒドロゲル架橋反応の硬化時間は速いため、撹拌バーでの標準的な混合では、ゲルが混合で剪断される前に顆粒の適切な分布が得られない可能性がある。機能上の設計要件にもっとも合っていたため、静的ミキサーを選んだ。静的ミキサーは操作が単純で、製造費が安く、使い捨て可能であり、廃棄物を最小限に抑えつつ埋込物の成分を均一に混合した。これに加えて、該機器は市販のシリンジと一緒に用いることができるので、新しいシリンジの製造に付随する時間及び費用が削減される。
実施例8:得られた構築物の均一性の評価
[0059]ミキサー設計を最終決定した後、生産した足場の均一性及び再現性を試験した。足場の均一な機械的強度により、回復中の骨の均等成長が確実になる。足場の機械的特性が不均一である場合、成長中の骨の強度及び密度も変動する可能性がある。したがって、形成した埋込物の4つの切片の全体にわたり密度及び弾性率を試験した。結果は、所定の足場内の切片の全体にわたり密度は比較的均一であり、偏差は約4%であったことを示している。これに加えて、所定の顆粒濃度の足場は再現性があり、単一組成物の各試験は比較的同等の密度を示し、分散は約5%であった。したがって、該混合機器は、密度分布に関し均一な足場を繰り返し作製することができ、分散が10%以内という要件を満たしている。ゲルは可撓性であり、断片に切断する間に曲がった可能性があるため、これらの試験中に生じた分散のいくつかは、切片のサイズが不完全であることに起因する可能性がある。
実施例9:埋込物内の機械的特性の評価
[0064]得られた構築物の線状断片に沿った弾性率を計算して、機械的強度の勾配を決定した(図14A)。機械的強度は、構築物の近位(切片A)から遠位(切片D)領域に向かって低下する傾向があったが、試験した顆粒濃度に関し、切片全体の弾性率及び密度の分散は非常に小さかった(図14B)。同じ顆粒濃度の構築物全体の間の偏差を比較して、再現性を決定した。30%顆粒で構成される構築物は、20%及び25%顆粒で作製した構築物と比較して、試験全体で統計的に低い弾性率の偏差をもたらした。20%、25%及び30%の顆粒濃度を含有する得られた足場では、試験全体で密度において約5%の相対的標準誤差が見いだされた(図15)。同じ顆粒濃度の構築物中の切片間の偏差を比較して均一性を決定した。切片全体での弾性率及び密度の偏差に関し、構築物間で顕著な差異は決定されなかった。3つの密度の偏差はすべて、均一性に関し定義した10%の誤差閾値未満であった;しかしながら、弾性率の偏差の閾値未満だったのは30%顆粒濃度だけであった(図16)。
実施例10:埋込物のタンパク質分布の評価
[0065]蛍光発光の広がりは、静的バー混合機器で生産した構築物が、それらの切片間に蛍光発光の統計的有意差を有していないことを示した(図17)。0%顆粒組成物は、他の組成物と比較して統計的に低い蛍光発光強度を有することが示された。30%顆粒を含有する構築物の蛍光の平均差は約90%であったが、20%及び25%の埋込物ではそれぞれ約14%及び16%であった(図18)。20%及び30%顆粒濃度に関するBMP−2の蛍光の読みは1回しか行っていないが、蛍光の測定値は各濃度のアルブミンの値と同様であった(図19)。
実施例11:共焦点顕微鏡法を用いた埋込物のタンパク質含量の評価
[0066]共焦点顕微鏡法を用いて、プレートリーダーの蛍光データの結果を証明した。単一横棒機器の原型を用いて埋込物を作製して、10mg/mLのヒドロゲル濃度での3%チラミン置換物、BMP緩衝液に1:120で希釈したAF488標識BMP−2、0.09体積%の過酸化物及び30体積%の顆粒を混合した。構築物を5mmの断片に切断し、機械的試験を実施した後、各断片を1mmに切断し、上側スライドカバー(elevated slide cover)を用いてスライドガラスに固定し、共焦点顕微鏡下で観測した。各断片の中心及び端からスパン100μの画像10枚のスタックを収集し、ImageJ画像処理ソフトウェアを用いて解析した。各画像の顆粒及びヒドロゲルの区域の折り畳んだスタック(collapsed stack)の平均蛍光強度を収集した。
結び
[0071]本明細書中で用いる場合、「及び/又は」という句は、要素の「いずれか又は両方」がそのように等位接続している、すなわち、要素が、いくつかの場合には接続的に存在し、他の場合には非接続的に存在することを意味すると理解すべきである。そうではないと明記されていない限り、「及び/又は」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別されている要素に関連しているか否かにかかわらず、存在していてもよい。したがって、非限定的例として、「A及び/又はB」への言及は、「含む」などの非限定的用語と併せて用いる場合、例えば、1つの態様では、Bを含まないA(B以外の要素を包含していてもよい)をさし;他の態様では、Aを含まないB(A以外の要素を包含していてもよい)をさし;さらに他の態様では、A及びBの両方(他の要素を包含していてもよい)をさすことができる。
Claims (14)
- 骨誘導性タンパク質;
カルシウムセラミック顆粒及び流動性生体適合性マトリックス材料のうち少なくとも1つ;並びに、
少なくとも1つのチャンバーと、骨誘導性タンパク質、カルシウムセラミック顆粒、及び流動性生体適合性マトリックスのうち1以上をチャンバーに導入するための少なくとも1つの入口とを有する装置;
を含む、複合骨誘導性足場を形成するためのシステム。 - 骨誘導性タンパク質が水溶液の状態にある、請求項1に記載のシステム。
- 装置が、少なくとも1つのチャンバー内に置かれているか又は少なくとも1つのチャンバーに流体接続している1以上の静的混合要素と、少なくとも1つのチャンバーに少なくとも1つの入口を介して挿入可能な有窓ニードルとを包含する、請求項1又は2に記載のシステム。
- システムが、ヒアルロン酸(HA)、修飾HA、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール(PEG)、PEG誘導体、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポロキサマー、及びそれらのコポリマーから成る群より選択される流動性生体適合性マトリックス材料を包含する、請求項1〜3の1項に記載のシステム。
- 流動性生体適合性マトリックス材料が、架橋反応及び重合反応のうち少なくとも一方の架橋剤又は触媒と接触したときにゲルを形成する、請求項4に記載のシステム。
- さらにポロゲンを含む、請求項4に記載のシステム。
- 骨誘導性タンパク質が、骨形成タンパク質2(BMP−2)、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7、BMP−9、デザイナーBMP、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子β(TGF−β)、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項1〜6の1項に記載のシステム。
- システムが顆粒を包含し、該顆粒は多孔質であり、リン酸一カルシウム一水和物、リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム脱水物、リン酸八カルシウム、沈降ヒドロキシアパタイト、沈降非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム、α−リン酸三カルシウム(α−TCP)、β−リン酸三カルシウム(β−TCP)、焼結ヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、及びそれらの組合せを含む群より選択される材料を包含する、請求項1〜7の1項に記載のシステム。
- カルシウムセラミック顆粒を、骨誘導性タンパク質を含む溶液と接触させ、それにより、骨誘導性タンパク質をセラミック顆粒の内側細孔表面と結合させる段階を含む、請求項8に記載のシステムを利用する骨誘導性足場の作製方法。
- カルシウムセラミック顆粒が少なくとも1つのチャンバー内に置かれ、カルシウムセラミック顆粒を骨誘導性タンパク質を含む溶液と接触させる段階が、入口を介して溶液をチャンバーに流し入れ、溶液中で顆粒をインキュベートし、そして入口を介して溶液をチャンバーの外に流出させることを包含する、請求項9に記載の方法。
- 流動性生体適合性マトリックス材料をチャンバーに流し入れ、それにより顆粒をマトリックスと接触させることをさらに含み、マトリックスはチャンバー内でゲルを形成する、請求項10に記載の方法。
- 骨誘導性タンパク質を含む溶液が、ゲル化試薬、ゲル化触媒、及び架橋剤のうち少なくとも1つを包含する、請求項10に記載の方法。
- 生体適合性マトリックス、カルシウムセラミック顆粒の内側表面に結合している骨誘導性タンパク質を含み、カルシウムセラミック顆粒はマトリックスに結合している、請求項10に記載の方法に従って形成される埋込物。
- 骨誘導性タンパク質、並びにカルシウムセラミック顆粒及び生体適合性マトリックス材料のうち1以上の濃度が、埋込物の少なくとも1つの物理的寸法に沿って実質的に一定である、請求項13に記載の埋込物。
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