KR20170086059A - 줄기세포 기능 증강용 스타틴 봉입 나노입자 제제, 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 및 그 제조방법 - Google Patents

줄기세포 기능 증강용 스타틴 봉입 나노입자 제제, 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 및 그 제조방법 Download PDF

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KR20170086059A
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마사아키 이이
야스히코 타바타
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마사아키 이이
고에키 자이단 호징 센탄 이료 신코 자이단
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Abstract

본 발명은, 스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 제제이며, 상기 나노입자는 개수 평균 입경이 1000nm 미만이고, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위하여 사용된다. 또한, 본 발명은, 상기 스타틴 봉입 나노입자를 섭취하여 함유하는, 기능이 증강된 줄기세포에 관한 것이다.

Description

줄기세포 기능 증강용 스타틴 봉입 나노입자 제제, 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 및 그 제조방법{STATIN-ENCAPSULATED NANOPARTICLE PREPARATION FOR ENHANCING STEM CELL FUNCTION, STEM CELL WITH ENHANCED FUNCTION CONTAINING STATIN-ENCAPSULATED NANOPARTICLE, AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은 스타틴(statin)을 봉입하는 나노입자에 관한 것으로, 특히 세포의 기능을 증강시키기 위한 스타틴 봉입 나노입자 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포 및 그 제조방법에 관한 것이다.
스타틴은, 간에서의 콜레스테롤 생합성 율속단계의 효소인 HMG-CoA 환원효소를 저해하는 화합물로 알려져 있다. 스타틴에 의하여, 혈중 콜레스테롤 수치를 저하시킬 수 있으므로, 고 콜레스테롤 혈증의 치료약으로 이용되고 있다. 또한 스타틴은 고 콜레스테롤 혈증 이외에도, 그 항염증 작용에 따라, 협심증이나 심근경색과 같은 허혈성 심질환, 및 동맥경화 등의 질환에 효과적인 것이라는 것도 임상시험을 통해 밝혀졌다.
지금까지, 스타틴에 의한 상기 질환의 치료효과의 향상이나, 부작용 저감을 위하여 다양한 연구가 이루어지고 있으며, 예를 들어 특허문헌 1에는, 스타틴을 나노입자에 봉입하고, 이 스타틴 봉입 나노입자를 환자에게 국소 투여함으로써, 종래보다 소량의 스타틴으로 혈관신생을 촉진할 수 있음이 개시되었다.
또 최근에는, 다능성을 가지며, 심근세포로 분화 가능한 줄기세포를 이용하여, 허혈성 심질환을 치료하는 연구도 이루어지고 있다. 비특허문헌 1에는, 지방조직에서 유래하는 줄기세포를 심근경색 모델 마우스의 심근에 직접 투여함으로써, 심장 기능의 개선 및 경색 크기의 감소가 인정된 내용이 개시되었다.
특허문헌 1: 일본 특허공개공보 2012-21002
비특허문헌 1: Masaaki Ii et al., Laboratory Investigation (2011) 91, 539-552
심근경색 등의 허혈성 심질환을 치료하기 위하여, 예를 들어 상기 특허문헌 1에 개시된 바와 같은 스타틴 봉입 나노입자를 투여하는 경우, 전술한 바와 같이 스타틴 봉입 나노입자를 환자에게 국소 투여함으로써 종래보다 소량의 스타틴으로 유효성이 인정되나, 환부에의 국소 투여가 필요하며, 투여가 간편하지 않고, 유효성의 새로운 향상도 요구된다. 또한 국소 투여를 이용하지 않고 정맥 내 투여 등을 이용할 경우는, 더 많은 용량이 필요하게 되어 부작용이 생길 우려도 있다.
한편, 비특허문헌 1에 개시된 바와 같이, 줄기세포를 이용하여 심근경색 등의 허혈성 심질환을 치료하는 경우에도, 줄기세포의 환부에 국소 투여가 필요하며, 예를 들어 마우스의 심근에 투여할 경우, 치료 효과를 얻기 위하여 5×105cells/mouse의 양의 세포를 필요로 한다. 줄기세포로는, 예를 들어 간엽계에 유래하는 체성 줄기세포를 이용할 수 있으며, 이러한 줄기세포는 골수나 지방조직에서 얻을 수 있으나, 한 번에 얻을 수 있는 줄기세포의 양에는 한계가 있기 때문에, 줄기세포를 상기 치료 등에 사용할 경우, 사용할 세포 수는 적은 것이 바람직하다. 이처럼, 보다 적은 수의 줄기세포로 우수한 치료 효과를 얻기 위해서는, 그 줄기세포의 다양한 기능을 향상시킬 필요가 있다.
본 발명은 상기 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 세포 제제로 사용되는 줄기세포의, 질환에 대한 치료 효과를 향상시키고, 부작용을 억제하기 위하여 그 줄기세포의 기능을 향상시킬 수 있도록 하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들이 예의 연구한 결과, 스타틴이 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 함유시킴으로써, 그 줄기세포의 기능이 증강되고, 스타틴을 원하는 환부에 효율적으로 전달할 수 있어, 허혈성 심질환 등 각종 질환의 치료에 높은 효과를 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제는, 스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 제제로서, 상기 나노입자는 개수 평균 입경(number average particle diameter)이 1000nm 이하이며, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위하여 사용되는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제는, 줄기세포에 처리됨으로써, 그 처리된 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있으며, 그 줄기세포를 생체 내에 투여함으로써 다양한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제를 줄기세포에 처리하면, 처리된 줄기세포는 파고사이토시스(phagocytosis)에 의하여 스타틴 봉입 나노입자를 섭취하고, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 줄기세포는, 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능이 증강한다. 때문에, 예를 들어 허혈성 심질환을 앓는 환자의 체내에, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자가 처리된 심혈관 세포로 분화 가능한 줄기세포를 투여함으로써, 줄기세포가 허혈부에 집적되어 증식함과 더불어, 혈관신생인자를 방출함으로써 허혈부의 혈관신생을 촉진한다. 또한, 상기 집적 및 증식된 줄기세포가 심근으로 분화함으로써 심근의 재생을 촉진한다. 또, 본 발명에 관한 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 줄기세포의 투여에 따라, 심근경색부에서 심외막 부근에 존재하는 세포의 분열 증식이 촉진되어 심근 재생이 촉진된다. 그 결과, 우수한 허혈성 심질환의 치료 효과를 나타낸다. 또한, 상기 줄기세포는, 섭취한 스타틴을 서서히 방출(서방: 徐放)할 수 있으며, 이로써, 스타틴 자체의 혈관신생 효과 등 스타틴 특유의 각종 효과도 얻을 수 있으므로, 허혈성 심질환을 비롯하여 다양한 질환의 치료에 유익하다. 또한 환부에 집적된 줄기세포에서 방출된 스타틴에 의하여, 체내의 줄기세포나 골수 유래 혈관내피 전구세포(EPC)의 집적을 항진할 수 있으며, 그 결과, 예를 들어 허혈성 심질환의 경우, 허혈 부분의 심근 재생을 더욱 촉진할 수 있다. 또한 스타틴 등의 화합물을 단순히 정맥 투여한 경우, 혈류를 따라 환부에 운반되나, 심근경색 등의 허혈성 심질환에서는 혈류가 저해를 받고 있어, 정상적으로 환부에 도달하기 어려운데, 본 발명과 같이 유주능이 증강된 줄기세포에 섭취되어 스타틴이 운반되므로, 혈류가 저해받고 있다 하더라도, 환부에 도달할 수 있다. 즉, 양호한 약물 전달 시스템이 될 수 있어, 투여해야 할 세포 수를 감소시킬 수 있다. 이상에서 서술한 작용으로, 심근경색 등의 허혈성 심질환의 치료에 매우 높은 효과를 발휘한다. 여기서, 상기 나노입자의 개수 평균 입경은, 상기 파고사이토시스에 의하여 줄기세포가 효율적으로 스타틴 봉입 나노입자를 섭취할 목적에서 1000nm 미만으로 한다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제에 있어서, 생체 흡수성 폴리머로는, 폴리젖산 중합체(poly lactic acid: PLA) 또는 폴리젖산 글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolicacid): PLGA)를 사용할 수 있다.
PLA 및 PLGA는 체내에서 가수분해됨으로써 봉입된 스타틴을 방출할 수 있으며, PLA는 그 가수분해에 의하여 젖산으로 분해되고, PLGA는 그 가수분해에 의하여 젖산과 글리콜로 분해되고, 각각 최종적으로 물과 탄산가스가 되어 인간 등의 동물에 무해하기 때문에, PLA 또는 PLGA를 나노입자 재료로 사용하는 것은 매우 바람직하다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제는, 상기 줄기세포로서 지방 유래 줄기세포를 증강시키기 위한 것임이 바람직하다.
지방 유래 줄기세포는, 지방조직을 채취하고, 채취한 조직을 콜라게나제(Collagenase) 처리한 후 원심비중법으로 단핵구 세포만을 채취하고, 채취한 단핵구 세포를 배양 접시에서 4일간 정도 배양하여, 접착된 세포를 지방 유래 줄기세포로 선택 및 분리할 수 있다. 또한 셀루션 시스템(Celution System; Cytori사제) 등을 이용하여 지방조직으로부터 용이하면서도 대량으로 추출, 분리 배양할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 간엽계 줄기세포에 속하며 우수한 다능성을 갖고, 또 상기한 바와 같이 간편하게 다량 채취할 수 있기 때문에, 다양한 질병의 치료를 위한 사용에 유리하다.
또한, 본 발명에 관한 기능 증강 줄기세포는, 상기 스타틴이 생체 적합성 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 것이 특징이다.
이러한 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 상기 스타틴 봉입 나노입자를 함유하기 때문에, 상술한 바와 같이, 상기 스타틴 봉입 나노입자에 의하여 세포 기능이 증강되어, 허혈성 심질환을 비롯한 각종 질환의 치료에 우수한 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기 세포는, 스타틴을 서방할 수 있으며, 그 방출된 스타틴에 의한 골수 줄기세포나 골수 유래 혈관내피 전구세포(EPC)의 집적을 항진할 수 있어, 허혈성 심질환의 치료에 유리하다.
본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 상술한 바와 같은 이유에서, 상기 지방 유래 줄기세포인 것이 바람직하며, 심근경색 등의 허혈성 심질환의 치료를 위하여 환자에게 투여되는 것임이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 의약품으로 허용 가능한 용매 및 부형제와 혼합하여 세포 제제로 제제화할 수도 있다. 본 발명에 따른 줄기세포의 생체 내 투여는, 개흉 등의 수술이 불필요한 것임이 바람직하며, 정맥 내 투여용 세포 제제로 제제화되는 것이 바람직하다. 이와 같이 하면, 간편하게 환자에게 본 발명에 따른 줄기세포를 투여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 상술한 바와 같이, 우수한 약물 전달 시스템으로서 기능하여, 원하는 환부에 줄기세포를 집적할 수 있음과 더불어 스타틴을 서방할 수 있기 때문에, 국소 투여를 할 필요가 없으며, 정맥 내 투여를 이용해도 적은 용량으로 높은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포의 제조방법은, 상기 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 처리하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 처리하는 단계에서, 줄기세포를 배양하는 배지 중에 20μg/mL~100μg/mL의 농도가 되도록 스타틴 봉입 나노입자를 첨가하는 것이 바람직하며, 그 처리시간은 30분~2시간인 것이 바람직하다.
이와 같이 하면, 줄기세포가 배양된 배양배지 중에 스타틴 봉입 나노입자를 첨가한다는 간편한 처리단계로써, 상기와 같은 기능 증강 줄기세포를 얻을 수 있다. 또한, 상기 농도 및 시간으로 처리함으로써, 줄기세포 안에서 스타틴 봉입 나노입자가 효율적으로 섭취될 수 있다.
본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포의 제조방법에서는, 상기와 같은 이유에서 줄기세포로 지방 유래 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하고, 또한 허혈성 심질환 치료용 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자, 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 및 그 제조방법에 따르면, 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있으며, 이 줄기세포를 생체 내에 투여함으로써, 허혈성 심질환을 비롯하여 각종 질환의 치료에 효과가 있다.
도 1은, 지방 유래 줄기세포의 배양배지 중에 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를, 그 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL로 되도록 첨가하고, 그 1시간 후 또는 2시간 후에 줄기세포를 공초점 레이저 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는, 지방 유래 줄기세포에 대하여 100μg/mL의 농도로 심바스타틴(simvastatin) 봉입 PLA 나노입자를 1시간 처리시킨 후, 지방 유래 줄기세포에서 배지 중으로 방출된 심바스타틴의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3의 (a)는, PLA 나노입자 또는 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 처리한 지방 유래 줄기세포의 유주성 측정 결과를 나타내는 그래프이며, (b)는 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 처리한 지방 유래 줄기세포의 증식성 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 스타틴 봉입 나노입자를 처리한 지방 유래 줄기세포에서의 혈관신생인자의 mRNA 발현을, 정량 PCR법을 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 혈관신생인자로서 (a)는 VEGF-A, (b)는 VEGF-C, (c)는 FGF-2의 RNA 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는, PBS, 스타틴 봉입 나노입자, 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 초음파 진단을 실시한 결과를 나타내는 그래프이며, (a)는 좌심실 구축율(EF)을 나타내고, (b)는 좌심실 내경 단축율(FS)을 나타내며, (c)는 좌심실 확장 말기직경(LVDd)을 나타내고, (d)는 좌심실 수축 말기직경 (LVDs)을 나타낸다.
도 6은, PBS 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고, 28일 후의 심근경색 모델 마우스의 심장을 나타내는 사진이다.
도 7의 (a)는 PBS, 스타틴 봉입 나노입자, 스타틴 비봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부의 절편을 매슨 트리크롬 염색(Masson trichrome stain) 처리한 결과를 나타내는 사진이고, (b)는 각 절편에서의 섬유화 부분의 길이를 나타내는 그래프이며, (c)는 각 절편에서의 섬유화 부분의 심근벽의 두께를 나타내는 그래프이다.
도 8은, PBS, 스타틴 봉입 나노입자, 스타틴 비봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 매슨 트리크롬 염색한 결과를 나타내며, 섬유화 부분을 확대한 사진이다.
도 9의 (a)는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 60일 후의 심근경색 모델 마우스의 심장을 나타내는 사진이며, (b)~(e)는 (a)에 나타낸 (b)~(e) 각 선에서의 절편을 매슨 트리크롬 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은, PBS, 스타틴 봉입 나노입자, 스타틴 비봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스 심장의 경색부 절편을 이소렉틴 B4(iso-lectin B4) 또는 항SMα-액틴(α-smooth muscle actin) 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은, PBS, 스타틴 봉입 나노입자, 스타틴 비봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 이소렉틴 B4로 염색하고 혈관 밀도를 계측한 결과를 나타내며, (a)는 절편을 염색한 후의 현미경 사진을 나타내고, (b)는 계측된 혈관밀도를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 이소렉틴 B4 또는 항Ki67 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 항SMα-액틴 항체와 항Ki67 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 14는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 14일 후의, 상기 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을, 항Wt1 항체와 상기 항Ki67 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 15는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 항GATA4 항체와 항αMHC 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 16은, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 항Nkx2.5 항체와 항αMHC 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부 절편을 항cTn-1 항체 또는 항SMα 액틴 항체, 및 항-인간 미토콘드리아 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 18은, Tie2/lacZ트랜스제닉 마우스(transgenic mouse)로부터 골수 이식을 받은 심근경색 마우스에, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 후, 그 마우스의 심장 경색부 절편을 항cTn-1 항체, 항SMα액틴 항체 또는 이소렉틴 B4, 및 항β-gal(β-갈락토시다아제)항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 도면에 기초하여 설명한다. 이하의 바람직한 실시형태에 대한 설명은, 본질적으로 예시에 불과하며, 본 발명, 그 적용방법 또는 용도의 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제에 사용되는 스타틴 봉입 나노입자는, 스타틴이 폴리젖산글리콜산 공중합체를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자이며, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위하여 사용된다. 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 제제는, 상기 스타틴 봉입 나노입자 이외에, 안정화제, 보존제, 완충제, pH조정제, 부형제 등, 제제화에 통상적으로 사용되는 첨가제를 포함해도 된다.
본 발명에서 스타틴이란, HMG-CoA(3-하이드록시-3-메틸글루타릴 -코엔자임A) 환원효소 억제제(reductase inhibitor)인 화합물을 모두 포함하는 것이며, 예를 들어, 심바스타틴, 로슈바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴, 및 메바스타틴 등을 들 수 있다. 스타틴은 상술한 바와 같이, 콜레스테롤 저하작용을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이 외에 심혈관 이벤트의 발생과 진행 위험을 저하시키는 것이 대규모 임상시험으로 밝혀졌다. 또한 혈관 내피세포나 골수 유래의 혈관 내피전구세포를 통한 혈관신생촉진 작용에 대해서도 많은 보고가 이루어졌다.
본 발명에서, 나노입자는 스타틴을 봉입할 수 있는 생체 흡수성 폴리머라면 그 재료는 한정되지 않으나, 폴리젖산 중합체(poly lactic acid: PLA) 또는 폴리젖산 글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolicacid): PLGA)를 함유하는 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다. PLA는 체내에서 가수분해되어 젖산으로 분해되고, PLGA는 체내에서 가수분해되어 젖산과 글리콜로 분해되어, 각각 최종적으로 물과 탄산가스가 되므로, 체내에 무해하여 바람직하다.
본 발명에서 스타틴 봉입 나노입자는, 줄기세포의 섭취 효율의 관점에서 광산란법으로 측정했을 때 1000nm 미만, 바람직하게는 약 100nm~400nm, 보다 바람직하게는 200nm~400nm로 가공할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법으로도 제조할 수 있는데, 바람직하게는 구형정석법(spherical crystallization method)을 사용하여 제조한다. 구형정석법은, 화합물 합성의 최종 과정에서 결정의 생성/성장 과정을 제어하는 것으로, 구형의 결정입자를 설계하고, 그 물성을 직접 제어하여 가공할 수 있는 방법으로 잘 알려져 있다. 이 구형정석법의 하나로, 주지의 에멀젼 용매확산법(ESD법: Emulsion Solvent Diffusion method)이 있다.
에멀젼 용매 확산법은, 스타틴을 봉입하기 위한 상기 PLA 또는 PLGA 등의 생체 흡수성 폴리머를 용해할 수 있는 양용매(good solvent)와 폴리머를 용해하지 않는 빈용매(poor solvent)의 2종의 유기용매를 사용하여 이루어진다. 먼저 양용매 중에 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머를 용해시키고, 이 폴리머가 석출되지 않도록 스타틴 용해액을 양용매에 첨가하여 혼합한다. 이 혼합액을 교반 중인 빈용매 중에 적하하면, 급속하게 양용매가 빈용매로, 또한 빈용매는 양용매로 상호 확산되므로, 유기용매상과 수상(水相)과의 계면이 흐트러져, 양용매가 자기유화되고, 서브미크론 크기의 에멀젼 액적이 형성된다. 그 후, 양용매 및 빈용매의 상호 확산이 다시 진행되어, 에멀젼 액적 내의 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머 및 스타틴의 용해도가 저하되고, 그 결과 스타틴을 포함한 구형 결정입자의 폴리머 나노입자가 생성된다.
본 발명에서, 줄기세포는 전능성, 다능성 또는 다분화능을 갖는 세포이며, 예를 들어 배아 줄기세포(ES세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 및 간엽계 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 들 수 있다. 본 발명은 많은 줄기세포를 보다 간편하게 대량으로 얻는다는 관점에서, 골수 조직이나 지방 조직 등에서 얻어지는 간엽계 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 특히 지방 유래 줄기세포를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 지방 유래 줄기세포는, 세포 단독으로 투여하는 것은 이미 임상에서 이루어지고 있는데, 지방을 비롯하여 뼈, 간, 심장 등으로 분화하는 것으로 알려져 있다. 지방 유래 줄기세포는 지방 조직에서 얻을 수 있으며, 해당 지방 조직은 지방 흡인 등의 저침습 기술로 피하 지방 등으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 지방 유래 줄기세포는, 상기와 같이 얻어진 지방 조직에서 셀루션시스템(Cytori사제) 등을 이용하여 추출 및 분리 됨으로써 풍부하게 채취 가능하다. 따라서 본 발명에 관한 줄기세포로 사용하는데 매우 유리하다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자의 줄기세포에의 처리는, 예를 들어 상기 줄기세포가 배양된 배양배지 중에 첨가함으로써 이루어진다. 이와 같이 하면, 파고사이토시스에 의하여 줄기세포가 스타틴 봉입 나노입자를 세포 내로 섭취하므로, 특별한 시약 등을 사용하지 않고 간편하게 줄기세포 내로 스타틴 봉입 나노입자를 함유시킬 수 있다.
본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자에 의하여 처리된 줄기세포는, 특히 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능이 증강되며, 특히 심근경색 등의 허혈성 심질환에 대한 치료 효과가 증강한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자에 의하여 처리된 상기 지방 유래 줄기세포를 허혈성 심질환 환자에게 정맥 내 투여하면, 증강된 유주능 및 증식능에 따라, 지방 유래 줄기세포가 혈류 및 그 유주성에 의하여 심장에 도달하고, 허혈 상해 심근 부분에 집적 및 증식하여, 심혈관계 세포로 분화한다. 또한 집적된 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포는, 혈관신생인자의 생산 및 방출이 촉진되고, 많은 혈관신생인자에 의하여 심근조직의 재생이 촉진된다.
또한, 지방 유래 줄기세포는 전술한 바와 같이, 섭취한 스타틴 봉입 나노입자를 세포 내에서 가수 분해함으로써, 봉입된 스타틴을 서방하므로, 지방 유래 줄기세포는 체내에 투여된 경우, 투여 후에 허혈 상해 심근에서 스타틴을 서방하고, 방출된 스타틴에 의하여 골수 줄기세포나 골수 유래 혈관 내피 전구세포(EPC: endothelial progenitor cell)의 집적을 촉진하고, 골수 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화도 촉진되어, 조직의 재생을 촉진한다. EPC는, 골수 중에 존재하는 혈구계 조혈 줄기세포 중 하나의 세포 분획이며, 또, 소수이기는 하나 말초 순환혈액 중에도 존재하고, 허혈조직에 집적하여 모세혈관을 구성하는 내피세포로 분화하여, 신생혈관의 형성에 도움이 되는 것으로 알려져 있으며, 허혈성 질환에 대한 혈관신생을 위한 세포치료의 소스로 임상시험도 널리 실시되고 있다. 또한 EPC는, 혈관 내피 세포뿐만 아니라 심근세포로도 분화한다는 보고도 있다. 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포는, 이러한 기능을 갖는 EPC를 허혈 상해 심근 부분에 집적시킬 수 있기 때문에, 그 치료에 매우 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 투여에 따라, 심근경색부에서 심외막 부근에 존재하는 세포가 분열 증식하면서 육아 신생시켜 심근의 재생을 촉진한다. 그 결과, 심근경색의 치료에 유리하다. 여기서, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포는, 허혈성 심질환의 치료뿐만 아니라, 줄기세포가 분화할 수 있는 심장 외의 다른 장기 손상에서도 스타틴의 효과나 줄기세포 및 EPC에 의한 재생 기능에 따른 치료 효과를 얻을 수 있다.
실시예
이하, 본 발명에 따른 줄기세포 기능 증강용 스타틴 봉입 나노입자 제제, 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 및 그 제조방법을 상세하게 설명하기 위한 실시예를 나타낸다.
우선 스타틴 봉입 나노입자의 제조방법에 대하여 설명한다. 여기서는, 특히 스타틴으로 심바스타틴을 사용하고, 나노입자로 폴리젖산 중합체(PLA)를 함유하는 나노입자를 사용하였다.
PLA(WAKO Pure Chemical Indastries, PLA0020, 평균중량 분자량 20000) 50mg과 심바스타틴 2.5mg을 아세톤 2mL, 에탄올 0.5mL의 혼합액에 용해시켜 폴리머 용액으로 하였다. 이것을 실온, 500rpm으로 교반한 2wt% PVA용액 10mL 중에 적하시켜, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자 현탁액을 얻었다. 이어서, 실온, 500rpm으로 교반을 계속하면서, 유기용매(아세톤, 에탄올)를 제거하였다. 약 5시간 용매 제거 후, 현탁액을 4℃, 60000g으로 30분간 원심 분리하고, 침전물을 회수하여 증류수에 재현탁시켰다. 이 원심분리와 증류수 재현탁 조작은 총 3회 실시하였다. 그 후, 현탁액을 하룻밤 동결 건조하여, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 얻었다. 심바스타틴은 1mg의 나노입자 중에 24.94μg 봉입되었다. 이하의 시험에서는, 이 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 사용하였다.
다음으로, 줄기세포에 대하여, 상기와 같이 하여 얻어진 스타틴 봉입 나노입자를 처리할 때의 최적 처리농도를 검토하기 위하여 다음과 같은 시험을 실시하였다.
당해 시험을 실시하기 위하여, 먼저 콜라게나제 처리 및 원심비중법을 이용한 주지의 방법을 이용하여, 인간 지방조직에서 인간 지방 유래 줄기세포(Adipose derived Stem Cell: AdSC)를 얻었다. 그 방법에 대하여 상세한 내용을 이하에 설명한다. 먼저, DNase I(0.1mg/mL, Roche, 1284932) 및 3mM CaCl2를 함유하는 콜라게나제 1형(1mg/mL, WAKO 035-17604)/1% BSA HBSS 용액을 콜라게나제 용액으로 제조하였다. 그 후, 인간 지방조직(1g~2g 정도)을 메스로 가늘게 자르고, 그 조직 부피의 3배 정도의 상기 콜라게나제 용액과 함께 15mL 튜브에 넣고, 37℃에서 60분간 진탕 인큐베이션 처리하였다. 그 후, 인큐베이션 처리한 15mL 튜브 내에 실온의 5mM EDTA/PBS(EDTA(0.5M EDTA, pH 8.0, LifeTechnologies, AM9260G), 10X DPBS, Ca(-), Mg(-)(GIBCO, 14200-166)를 희석하여 제작)을 가하여, 15mL 정도의 세포 현탁액으로 한 다음, 300g×5min 원심분리 후, 상청액(지방층을 포함)을 흡인 제거하고, 5mM EDTA/PBS를 추가하여 20mL로 하였다. 얻어진 세포 현탁액을 셀 스트레이너(70μm, BD)를 통과시키면서 새로운 50mL 튜브로 회수하고, 실온의 Histopaque 1077이 4mL 들어간 2개의 15mL 튜브에, 상기 회수된 세포 용액을 10mL씩 조용히, 혼입시키지 않고 중층으로 하였다. 이들을 실온, 800g×20min(브레이크 없음)로 원심 처리하고, 원심처리 후에 단핵구 세포층 만을 18G 바늘 부착 2.5mL 주사기로 회수하여 새로운 15mL 튜브에 옮기고, 냉각된 5mM EDTA/PBS를 추가하여 14mL로 하였다. 그 후, 200g×10min으로 원심(브레이크 있음) 분리하고 상층액을 버렸다. 그 후, 1mL의 냉각 5mM EDTA/PBS로 세포를 현탁하여 14mL까지 메스업 한 후, 200g×10min로 원심 분리하여 상층액을 버렸다. 얻어진 세포 펠릿을 초대 배양(primary culture)용 배지(10% FBS/DMEM F12, Sigma D8042+Antibiotic-Antimycotic, GIBCO 15240-062)에 현탁하고, 3×104/㎠~4×104/㎠ 정도의 세포 밀도로 배양 접시에 파종하였다. 그 후 5% CO2 배양기에서 4~5일간 배양하고, 접착세포(adherent cells)를 인간세포 유래 줄기세포로서 실험에 사용하였다.
이렇게 하여 인간세포 유래 줄기세포를 얻은 후, 상기 에멀젼 용매 확산법을 이용하여 스타틴 대신 로다민 적색 형광색소를 PLA 나노입자에 봉입함으로써 얻어진 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를, 그 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL가 되도록, 상기 지방 유래 줄기세포의 배양배지 중에 첨가하였다. 그 1시간 후(1h) 또는 2시간 후에(2h)에, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자의 섭취에 대하여, 공초점 레이저형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 여기서, 핵 염색은 DAPI를 사용하여 통상적인 방법으로 염색하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자는, 어느 농도에서도 지방 유래 줄기세포에 섭취된 것을 알 수 있다. 단, 처리농도 의존적으로, 지방 유래 줄기세포의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자의 섭취량이 증대한다. 또한, 처리시간이 1시간인 경우보다 2시간인 경우가, 지방 유래 줄기세포에 따른 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자의 섭취량이 많음도 알 수 있다. 특히, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를 100μg/mL의 농도로 지방 유래 줄기세포에 처리한 경우에, 많은 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자가 줄기세포에 섭취되었음이 확인되었다.
다음으로, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포가, 그 후 세포 내에서 어느 정도의 시간을 들여 스타틴을 방출하는지를 검토하기 위하여, 배지 중에 방출된 스타틴의 양을 측정하였다. 여기서는, 상기 시험과 마찬가지로 지방 유래 줄기세포에 대하여 100μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 1시간 동안 처리한 후에 배지를 교환하고, 배지 교환부터 6시간 후, 18시간 후, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간 및 336시간 후, 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 측정하였다. 구체적으로, 이 측정은 HPLC(High-pressure Liquid Chromatography)법을 이용하여 실시하였다. 이 측정결과를 도 2에 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 측정 개시부터 24시간 후에 약 60% 정도의 스타틴이 지방 유래 줄기세포에서 방출되어, 모든 스타틴이 방출되는 데 약 336시간이 걸렸다. 이 결과로부터, 지방 유래 줄기세포에 섭취된 스타틴은, 지방 유래 줄기세포에서 빠르게 방출되는 것이 아니라, 느리게 서방되는 것을 알 수 있다. 따라서, 지방 유래 줄기세포가 허혈 심근에 도달하기 전에 거의 대부분의 스타틴을 방출하는 일 없이, 환부에 도달한 후 장시간에 걸쳐 스타틴을 방출할 수 있기 때문에, 양호한 치료 효과를 기대할 수 있다.
다음으로, 상기 심바스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능 등의 기능 증강에 대하여 검토하기 위하여 다음과 같은 시험을 실시하였다.
먼저, 유주성 시험키트(Transwell(등록 상표))를 이용하여 지방 유래 줄기세포의 유주능에 대하여 검토하였다. 구체적으로, Transwell 플레이트 각 웰의 다공 멤브레인 상에 지방 유래 줄기세포를 5×104cells/well로 파종하고, 스타틴을 봉입하지 않은 PLA 나노입자를 20μg/mL 또는 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 20μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL의 농도가 되도록 배지 중에, 첨가하여, 16~18시간 후에 Transwell의 멤브레인을 통과한 세포 수를 측정하였다. 그 결과를 도 3(a)에 나타낸다.
도 3(a)에 나타낸 바와 같이, 20μg/mL의 스타틴 비봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(PLA20), 및 20μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(PLA-ST20)는, 미처리인 대조군(Control)과 비교하여 지방 유래 줄기세포의 유주성에 변화는 없었으나, 50μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(Statin50)는, 지방 유래 줄기세포의 유주성이 증대하였다. 또한, 100μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(Statin100)는, 지방 유래 줄기세포의 유주성이 저감되는 결과가 되었다. 이 결과로부터, 최적의 처리농도가 있기는 하나, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자에 의하여, 지방 유래 줄기세포의 유주능을 항진할 수 있음이 시사되었다.
다음으로, 심바스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 증식능 향상에 대하여 MTT분석을 이용하여 검토한 결과에 대하여 설명한다.
우선, 지방 유래 줄기세포를 96well 마이크로 플레이트에 5000cells/well의 세포 수로 파종하고, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 20μg/mL, 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 48시간 후에 배지를 교환하고, MTT용액을 각 웰에 첨가하여 2시간 후 분광광도계를 이용하여 450nm의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3(b)에 나타낸다.
도 3(b)에 나타낸 바와 같이, 심바스타틴 봉입 나노입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 농도로 처리한 모든 경우에서, 미처리인 대조군(Control)에 비하여 지방 유래 줄기세포의 증식이 인정되며, 특히 50μg/mL의 농도로 처리한 경우, 대조군에 비해 현저한 증식성의 증가를 보였다. 이 결과로부터, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자에 의하여, 지방 유래 줄기세포의 증식능을 항진할 수 있음이 시사되었다.
다음으로, 심바스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 혈관신생인자 생산능에 대한 효과를 검토하기 위하여, 지방 유래 줄기세포 내에서의 혈관신생인자의 mRNA 발현량에 대하여 정량PCR법을 이용하여 해석하였다. 여기서는, 혈관신생인자로서 VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 세포 내 mRNA 발현량을 측정하였다.
먼저, 지방 유래 줄기세포를 배양하는 배양배지 중에 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 20μg/mL, 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도가 되도록 첨가하여, 24시간 후에 각 농도로 처리된 세포를 회수하고, Nucleo Spin RNA 키트(TAKARA BIO제)를 이용하여 이들의 RNA를 추출하였다. 그 후, VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 DNA서열에 관한 프라이머를 이용하여, 정량PCR법으로 각 세포에서의 VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 mRNA 발현량을 측정하였다. 측정은 ReverTra Ace qPCR RT 키트(TOYOBO)를 이용하여 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하고, SsoFast EvaGreen Mastermix 시약(Bio-Rad)와 프라이머(VEGF-A: F-TTACTCTCACCTGCTTCT R-CTGCTTCTTCCAACAATG, VEGF-C: F -TCAAGGACAGAAGAGACTA R-CCACATCTATACACACCTC, FGF-2: F-TTCTTCCAATGTCTGCTAA R-GACCAATTATCCAAACTGAG)와 함께 써멀 싸이클러(thermal cycler: CFX Connect(등록상표), Bio-Rad)를 사용하여 반응(95℃ 30초를 1주기 반응시킨 후, 95℃ 5초 / 56℃ 5초를 40주기 반응)시켜 갔다.
그 측정 결과를 도 4에 나타낸다. 여기서, 결과는 GAPDH의 mRNA 발현량을 기준으로 한 상기 각 인자의 발현량 비율을 나타낸다.
도 4(a)에 나타낸 바와 같이, VEGF-A의 mRNA 발현량은 심바스타틴 봉입 나노입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 대조군(Control)에 비하여 증대하고, 특히, 심바스타틴 봉입 나노입자를 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 인정되었다.
또한, 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, VEGF-C의 mRNA 발현량은, 심바스타틴 봉입 나노입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 대조군(Control)에 비하여 증대하고, 특히 심바스타틴 봉입 나노입자를 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 인정되었다.
마찬가지로, 도 4(c)에 나타낸 바와 같이, FGF-2의 mRNA 발현량도, 심바스타틴 봉입 나노입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 대조군(Control)에 비하여 증대하고, 특히 심바스타틴 봉입 나노입자를 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 인정되었다. 이들 결과로부터, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자에 의하여, 지방 유래 줄기세포의 혈관신생인자 생산능이 항진됨이 시사되었다.
이상과 같이, 스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능 등 기능 증강에 대하여 검토한 결과, 스타틴 봉입 나노입자에 의하여, 지방 유래 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있다. 이들 기능은, 지방 유래 줄기세포가 생체 내에 투여된 후에, 허혈 심근 부분에 집적하여, 해당 부분의 재생에 유리해지는 기능이며, 이들 기능이 증강됨으로써 지방 유래 줄기세포는 심근경색 등의 허혈성 심질환의 치료에 매우 유리하다.
다음으로, 심근경색 모델 마우스를 이용하여 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 및 이를 함유하는 줄기세포의 심근경색 치료 효과에 대하여 검토하였다.
우선, 12주령의 수컷 BALB/c 누드마우스에 허혈 유발(관동맥전하행지 결찰 모델)을 실시함과 더불어, 심장 초음파 영상진단을 실시하고(0일째), 3일 후(3일째)에 PBS(인산 완충 생리식염수), 상기와 같이 하여 각각 얻어진 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 꼬리정맥에 투여하였다. 여기서, 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포로는, 지방 유래 줄기세포에 대하여 스타틴 봉입 나노입자 100μg/mL의 농도로 1시간 처리한 것을 사용하였다. 지방 유래 줄기세포의 투여량은 1×104cells/mouse로 하고, 스타틴 봉입PLA나노입자의 투여량은 50μg/mouse로 하였다. 또한 이날(3일째)도 심장 초음파 영상진단을 실시하였다. 그 11일 후(14일째)에, 다시 심장 초음파 영상진단을 실시하였다. 그로부터 14일 후(28일째)에, 다시 심장 초음파 영상진단을 실시한 후 해부하여 심장의 조직학적 해석을 실시하였다. 심장 초음파 화상진단에서는, 좌심실 구축율(EF), 좌심실 내경 단축율(FS), 좌심실 이완기말 내경(LVDd) 및 좌심실 수축기 내경(LVDs)을 측정하였다. 조직학적 해석으로는, 모세혈관 밀도, 섬유화 면적율, 지방 유래 줄기세포의 생착률 및 지방 유래 줄기세포의 분화빈도를 분석하였다. 심장 초음파 영상진단의 결과를 도 5에 나타내며, 28일째에 상기 마우스에서 적출된 심장을 도 6에 나타내고, 조직학적 분석결과를 도 7, 8, 10 내지 도 17에 나타낸다. 또한, 상기 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포가 투여된 후 60일째의 마우스에서 적출된 심장 및 그 심장의 다른 부분에서의 절편을 도 9에 나타낸다.
도 5(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 3일째에 EF및 FS가 감소하여 심장 기능이 악화되며, 그 후 14일째 및 28일째에서, 미처리인 대조군(PBS: ●)에서는 개선이 인정되지 않았으나, 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA+AdSC: ▲), 및 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 투여한 군(Statin/PLA: ▼)에서는 약간의 개선이 인정되었다. 또한 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin/PLA+AdSC: ■)에서는 현저한 개선이 인정되었다. 또, 도 5(c) 및 (d)에 나타낸 바와 같이, LVDd 및 LVDs에서도, 미처리인 대조군(PBS: ●)이나, 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA+AdSC: ▲), 및 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 투여한 군(Statin/PLA: ▼)에 비해, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin/PLA+AdSC: ■)에서는, 이들의 크기 증대를 억제할 수 있어, 심장 기능의 개선이 인정되었다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군(왼쪽 사진)에 비하여, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군의 심장(오른쪽 사진)은, 그 확대가 억제되었음이 그 외관으로도 인정된다.
또한 각 군의 적출된 심장의 경색부 절편을 통상적인 방법으로 제작하고 매슨 트리크롬 염색하여, 심근벽 단면적에 대하여 평가한 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7(a)는, 염색한 절편의 사진을 나타내며, 섬유화되어 파랗게 염색된 반흔(cicatrix) 부분을 화살표로 나타낸다. 도 7(b)는 파랗게 물든 섬유화 부분의 길이(도 7(a)의 화살표 방향의 길이)를, 전 둘레 길이를 100%로 했을 경우의 비율로 나타내며, 도 7(c)는 파랗게 물든 섬유화 부분의 심근벽 두께를, 정상 심근벽의 두께를 100%로 했을 경우의 비율로 나타낸다.
도 7(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 섬유화되어 파랗게 물든 반흔 부분의 길이는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(AdSC+Statin/PLA)에서는, 미처리인 대조군(Control), 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA+AdSC), 및 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 투여한 군(Statin/PLA)에 비해 짧아졌다. 또한, 도 7(a) 및 (c)에 나타낸 바와 같이, 심근벽의 두께에 대해서도 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군에서는 다른 군에 비해 두꺼워져, 심근 부분의 재생이 촉진된 것으로 시사된다.
도 8에, 각 군의 절편에서의 섬유화 부분을 확대한 사진을 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)에서는 거의 대부분 파랗게 물든 평평한 외관이며, 또, 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA+AdSC), 및 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 투여한 군(Statin/PLA)은, 약간 붉게 물든 부분이 있기는 하나 대조군과 큰 차이는 인정되지 않았다. 한편, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(AdSC+Statin/PLA)에서는, 섬유화된 심근벽의 외측으로 팽출되며, 붉게 물든 부분이 인정되었다. 이는 다른 군에서는 인정되지 않아, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포에 의하여 새롭게 심근으로 재생되는 과정에 있는 부분인 것으로 추측된다.
또한 도 6 내지 도 8에서는, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 28일 후의 마우스 심장을 나타내는데, 그 이후의 시점에서 새로운 치료 효과가 인정되는 것을 확인하기 위하여, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 60일 후의 마우스 심장의 외관을 관찰하고, 그 심장의 다른 부분의 절편을 상기와 동일하게 염색하여 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 여기서, 도 9(a)는 해당 마우스의 심장을 나타내는 사진이고, 도 9(b) 내지 도 9(e)는 도 9(a)에 나타낸 (b)~(e)의 각 선에서의 절편을 매슨 트리크롬 염색한 결과를 나타내는 사진이다. 또한, 도 9(b)의 곡선 화살표는 상기 염색으로 파랗게 물든 영역을 나타낸다.
도 9(a)에 나타내는 바와 같이, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 60일 후에는, 28일 후에 인정된 경색(섬유화) 부분이 더욱 축소된 경향을 보였다. 또한, 도 9(b)~(e)에 나타내는 바와 같이, 경색부분의 각 절편에 대해서도 심근벽의 두께가 두껍고, 또, 도 9(b)에 나타내는 결찰 부분을 제외한 거의 대부분이 붉게 물들어 있어, 심근 부분의 재생이 촉진된 것으로 생각된다. 이 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하고 60일 후에는, 기능적 심근의 재생 치료효과가 인정된다.
다음으로, 경색부분의 심근조직에서의 혈관신생을 검토하기 위하여, 혈관 내피세포에 발현하는 당단백질 및 혈관 평활근 세포에 발현하는 단백질에 각각 결합하는 항체 등을 이용하여 상기 절편을 면역 염색한 결과를 도 10에 나타낸다. 구체적으로, 상기 항체 등으로서 혈관 내피세포에 발현하는 당단백질에 결합하는 식물 유래 단백질인 FITC(fluorescein isothiocyanate) 표지된 이소렉틴(Isolectine)B4, 및 혈관 평활근 세포에 발현하는 단백질인 SMα액틴에 결합하는 토끼 유래 IgG항체를 이용하고, 토끼 유래 IgG에 대한 이차 항체로는 Alexa488-염소 유래 항토끼IgG 항체를 이용하여 염색하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control(PBS))에서는 FITC-이소렉틴B4(Isolectin B4) 또는 항SMα액틴항체(SMα-actin)의 어느 쪽을 이용한 경우에도 거의 염색이 보이지 않고, 즉 혈관 내피세포 및 혈관 평활근 세포가 거의 검출되지 않아, 혈관이 거의 존재하지 않는 것으로 생각된다. 또한 스타틴 봉입 나노입자를 투여한 군(Statin/PLGA)에서도, 혈관 내피세포 및 혈관 평활근 세포가 거의 검출되지 않고, 스타틴 비봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA-AdSC)에서는, 약간의 혈관 내피세포 및 혈관 평활근 세포가 검출되었다. 이에 반해, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin PLA-AdSC)에서는, 매우 많은 영역에서 염색이 인정되어, 혈관신생이 일어난 것으로 생각된다. 즉, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여함으로써 심근에서의 혈관조직 재생이 촉진된 것으로 생각된다.
다음으로, 허혈 경계영역에서의 혈관 밀도에 대하여 검토하였다. 구체적으로, 각 군의 섬유화 부분에 대하여, 상기 분석과 마찬가지로 FITC-이소렉틴B4를 사용하여 형광염색을 실시하고, 현미경 시야에서 염색영역의 크기를 측정하였다. 또한 그 측정결과를 혈관 밀도로서 그래프화하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control (PBS))과 비교하여, 스타틴 비봉입 PLA 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(PLA+AdSC), 및 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 투여한 군(Statin/PLA)에서는 혈관 밀도가 약간 증가하고, 또 그들에 비해 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin/PLA+AdSC)에서는 더욱 혈관 밀도가 증대되었음을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터도, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여함으로써, 경색 주변부분(허혈 부분)에서 혈관신생이 촉진되어 심근조직 재생에 기여하는 것으로 생각된다.
다음으로, 허혈 심근조직에서의 세포증식 활성에 대해 검토하기 위하여, 세포의 증식기에 발현하는 Ki67 단백질에 결합하는 항체를 이용하여, 상기 절편에 대한 면역염색 결과를 도 12에 나타낸다. 구체적으로, 대조군 및 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군의 섬유화 부분에 대하여, FITC-이소렉틴B4와 토끼 유래 항Ki67 항체 및 2차항체로 Alexa594-염소 유래 항토끼IgG 항체를 이용하여, 혈관 내피세포 및 증식기의 세포를 면역 염색하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 미처리인 대조군(Control)에서는, 어느 항체를 사용하여도 염색은 인정되지 않았으나, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin+AdSC)에서는, 상기 시험과 마찬가지로 FITC-이소렉틴B4로 염색됐을 뿐만 아니라, 항Ki67 항체로도 염색이 인정되었다. 이 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여함으로써, 허혈 심근조직에서의 세포증식 활성을 촉진할 수 있음이 시사되었다. 또한, 이소렉틴B4에 의한 염색 부분과 Ki67에 의한 염색 부분은 서로 달라, 증식된 세포는 모세혈관을 형성하는 혈관 내피세포와는 다른 것(간질 섬유아세포 등)으로 생각된다.
또한, 도 13에, 항SMα-액틴 항체와 항Ki67 항체를 이용하여, 상기와 마찬가지로 절편을 면역 염색한 결과를 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 이 경우도 대조군(Control)에서는 어느 항체를 사용하여도 염색은 거의 인정되지 않았다. 한편, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin+AdSC)에서는, 상기 시험과 마찬가지로 항SMα-액틴 항체에 의한 염색뿐만 아니라, 항Ki67 항체에 의한 염색도 인정되었다. 또한, 항SMα-액틴 항체에 의한 염색 부분과 항Ki67 항체에 의한 염색 부분과는 서로 달라, 증식된 세포는 평활근 세포와는 다른 것(간질 섬유 아세포 등)으로 생각된다.
또한, 도 14에, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포가 투여되고 14일 후의 상기 심근경색 모델 마우스의 심장 경색부를, 심외막 세포가 갖는 Wt1단백질을 염색하는 항Wt1 항체와 상기 항Ki67 항체를 이용하여, 상기와 마찬가지로 절편을 면역 염색한 결과를 나타낸다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 심근경색부에서 항Wt 항체로 염색되는 심외막 세포가 많이 인정되며, 또 그 최외부에 항Wt1 항체와 함께 항Ki67 항체로 염색되는 증식기 세포가 많이 인정되었다(화살표 부분). 이 결과로부터, 경색부에서, 심외막 세포가 바깥쪽을 향해 증식 분열하면서 육아신생 시킴으로써, 심근벽의 두께가 다시 두꺼워지도록 재생된 것으로 시사된다. 따라서, 예를 들어 심근경색 발병 후 1개월 이상 경과하여 경색부의 대부분이 반흔(cicatrix) 상태가 된 경우라도, 본원 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여함으로써, 반흔 부분에 남은 심외막 세포를 증식시키고 심근 재생을 촉진시켜, 심근경색의 치료를 할 수 있음도 추찰된다.
다음으로, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포에 의한 심근 재생에 대하여 검토하기 위하여, 심근세포에서 발현하는 단백질에 결합하는 항체를 이용하여, 면역 염색을 실시한 결과를 도 15에 나타낸다. 여기서는 심근세포에서 발현하는 단백질에 결합하는 항체로서, 유약한 심근세포에서도 발현하는 GATA4에 결합하는 토끼 유래 IgG 항체와, 2차 항체로서 Alexa488 염소 유래 항토끼IgG 항체, 및 유약한 심근세포에서는 발현하지 않고 성숙한 심근세포에만 발현하는 αMHC에 결합하는 마우스 유래 IgG 항체와 2차 항체로 Alexa594 염소 유래 항마우스 IgG 항체를 사용하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 GATA4에 대한 면역 염색 결과, 미처리인 대조군(Control)에서는 거의 염색되지 않았으나, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin+AdSC)에서는 많은 염색 영역이 검출되었다. 한편, 상기 αMHC에 대한 면역 염색 결과, 대조군에서는 거의 염색이 보이지 않고, 또, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군에서는 약간의 염색이 인정되었지만, 항GATA4 항체에 의한 염색 결과와 비교하여 염색된 영역은 현저하게 적었다.
도 16은, GATA4와 마찬가지로 유약한 심근세포에서 발현하는 Nkx2.5 토끼 유래 IgG 항체와 2차 항체로서 Alexa488 염소 유래 항토끼 IgG 항체 및 상기 αMHC 항체를 이용하여, 상기와 마찬가지로 면역 염색한 결과를 나타낸다. 도 16에 나타내는 바와 같이, 도 15의 결과와 마찬가지로, 유약한 심근세포에 발현하는 Nkx2.5로 면역 염색한 결과, 대조군(Control)에서는 거의 염색이 보이지 않았지만, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin+AdSC)에서는 많은 염색 영역이 검출되었다.
도 15 및 도 16에 나타내는 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하면, 허혈성 심근조직에 유약한 심근세포가 출현하는 것이 밝혀졌다. 즉, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포 심근조직의 재생이 촉진됨이 시사된다.
여기까지의 실험에서는, 상기한 바와 같이, 심근경색 모델 마우스에 대하여 1×104cells/mouse의 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 경우의 결과를 나타냈는데, 다음으로, 5×104cells/mouse의 양을 투여한 경우의, 심근조직의 재생에 대하여 검토하였다. 이를 위해, 상기와 마찬가지로 작성한 심근경색 모델 마우스에 허혈 처리 후 3일째에 5×104cells/mouse의 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 꼬리 정맥에 투여하고, 그 25일 후에 상기와 마찬가지로 해부하여, 심근경색 부분의 절편을 작성하였다. 그 절편에, 심근 골격근 세포에 발현하는 cTn-1(심근형 트로포닌)에 결합하는 토끼 유래IgG 항체와, 2차 항체로 Alexa488염소 유래 항토끼IgG 항체 또는 평활근 세포에 발현하는 상기와 동일한 항SMα액틴 항체, 및 인간 미토콘드리아(hMtCd)에 결합하는 토끼 유래 IgG 항체와 2차 항체로 Alexa594 염소 유래 항토끼IgG 항체를 이용하여 면역 염색하였다. 그 결과를 도 17에 나타낸다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 심근경색 모델 마우스에서, 5×104cells/mouse의 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여한 경우, 심근조직의 섬유화 부분에서 항cTn-1 항체에 의한 염색이 인정되어(화살표 부분), 심근세포의 발현이 인정되었다. 또, hMtCd 항체에 의한 염색도 인정되어(화살표 부분), 즉 투여한 인간 지방조직 유래 줄기세포가 심근조직 내에 잔존하고 있는 것으로 나타났다. 또한 이들 영상을 중첩시켜 맞춰 보면, 염색영역이 겹치는 부분(화살표 부분)이 인정되었다. 이로써, 투여한 인간 지방 유래 줄기세포가 심근으로 분화되었음이 시사되었다. 또한, SMα액틴 항체로도 염색이 인정되었지만, 그 염색영역과 hMtCd 항체에서의 염색영역에서는 거의 겹치지 않았다.
이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 5×104cells/mouse 용량으로 투여한 경우, 허혈 심근조직에서, 투여된 세포의 집적과 잔존, 나아가 그 세포의 특히 심근세포로의 분화가 일어났음이 시사된다.
다음으로, 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포가 방출하는 스타틴에 의한 골수 유래 혈관 내피전구세포(EPC)의 경색부분으로의 집적 효과에 대하여 검토하였다. EPC는 상술한 바와 같이, 골수 중에 존재하는 혈구계의 조혈 줄기세포 중 하나의 세포 분획이며, 모세혈관을 구성하는 내피세포나 심근세포로 분화하는 것이 알려져 있다. 또한 EPC는, 혈관 안정화 인자 중의 하나인 안지오포에이틴(Angiopoietin)-1의 수용체이며, 내피계 세포의 마커로 인식되는 Tie2 양성세포에 많이 포함되는 것으로 알려져 있다. 이에, 유전자 재조합에 의하여 Tie2 양성세포를 β-gal(β-갈락토시다아제)의 면역염색으로 동정 가능한 Tie2/lacZ 유전자 형질전환 마우스(transgenic mouse)를 도너(donor)로 하여, 그 골수에서 골수 단핵구 세포를 추출하였다.
Tie2/lacZ 유전자 형질전환 마우스(transgenic mouse)는, 통상 사용되는 방법으로 제작이 가능하며, 구체적으로, 마우스 Tie2 프로모터/인핸서(promoter/enhancer) 내부에 lacZ 유전자를 조합시킨 재조합 유전자 벡터를 제작하고, 이어서 박테리아 내에서 증폭된 상기 재조합 유전자 벡터에서 단리 정제한 마우스 Tie2/lacZ 유전자 발현 벡터를 마우스 수정란에 미세주입(microinjection) 함으로써 제작하였다. 또한 골수 단핵구 세포의 추출은 다음과 같이 하여 실시하였다. 우선 마우스를 희생시킨 후, 대퇴골, 하퇴골, 척추, 장골을 분리하고, 조각내어 막자사발(mortar)에 넣고, 실온의 5mM EDTA/PBS 20mL를 넣어 막자로 골편을 빻아 세포 현탁 용액을 제조하였다. 이 세포현탁액을 셀 스트레이너(40μm, BD)를 통과시키면서 새로운 50mL 튜브로 회수하고, 실온의 Histopaque1083 4mL(Sigma, 10831)가 들어 있는 2개의 15mL 튜브에 세포용액을 10ml씩 서서히 혼입시키지 않고 중층시켰다. 그 후, 이들을 실온 800g×20min(브레이크 없음)에서 원심 처리하고, 그 후에 단핵구 세포층만을 18G 바늘 부착 2.5mL 주사기로 회수하여, 새로운 15mL 튜브로 옮긴 후 냉각 5mM EDTA/PBS를 추가시켜 14mL로 하였다. 그 후, 200g×10min으로 원심(브레이크 있음) 처리하고 상층액을 버렸다. 그리고 1mL의 냉각 5mM EDTA/PBS로 세포를 현탁하고, 14mL까지 메스업(mess up)한 후, 200g×10min로 원심 분리하여 상층액을 버리고 골수 단핵구 세포 펠릿을 제작하여, 이하에 나타내는 골수 이식 실험에 사용하였다.
골수이식으로 먼저, 6~8주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스에 X선을 조사(5Gy로 2회)하여, 골수세포를 모두 파괴시킨 마우스를 레시피언트(recipient) 마우스로 하고, 상기와 같이 하여 얻어진 도너 마우스의 골수 단핵구 세포를 이식하였다. 4주 후에, 상기 레시피언트 마우스에 대하여 전술한 시험과 마찬가지로, 허혈 유발(관상 동맥 전하행지 결찰 모델)을 실시하고, 이 처리 3일 후에 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 꼬리 정맥에 투여하였다. 여기서, 투여한 지방 유래 줄기세포의 수는 1×104cells/mouse로 하였다. 상기 투여 뒤 25일 후에 해부하여, 심장에서의 경색부 절편을 통상적인 방법으로 제작하였다. 그리고, 그 절편에, 상기 항cTn-1항체, 항SMα액틴 항체 또는 FITC-이소렉틴B4, 및 토끼 유래 IgG의 항β-gal 항체와 2차 항체로서 Alexa594 염소 유래 항토끼 IgG 항체로 면역 염색을 실시하였다. 그 결과를 도 18에 나타낸다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 항cTn-1 항체, 항SMα액틴 항체 및 FITC-이소렉틴B4를 이용한 경우, 상기 결과와 마찬가지로 허혈 심근조직에서 심근세포 및 평활근 세포가 염색되었다. 또한 β-gal 항체를 이용한 경우도, 허혈 심근조직에서 염색된 영역이 인정되었다. 즉, 골수로부터의 EPC가 허혈 심근조직에 집적됐음이 인정되었다. 또한, 항cTn-1 항체 또는 FITC-이소렉틴B4로 염색한 영상과, 항β-gal 항체로 염색한 영상을 겹쳐보면, 서로의 염색 부분이 겹쳐진 점에서(화살표 부분), 골수로부터 집적된 EPC가 심근세포로 분화되었음이 시사된다. 한편, SMα 액틴 항체로 염색한 영상과, β-gal 항체로 염색한 영상을 겹쳐보면, 서로의 염색 부분은 거의 겹치지 않았다.
이 결과로부터, 심근경색 마우스에 스타틴 봉입 나노입자를 섭취한 지방 유래 줄기세포를 투여하면, 허혈성 상해 심근 부분에 집적된 지방 유래 줄기세포가 스타틴을 방출함으로써, 해당 허혈성 상해 심근 부분에 EPC가 집적하고, 집적된 EPC가 혈관신생을 촉진함과 더불어, 심근세포로 분화하여 허혈 상해 부분의 치료를 촉진하는 것이 시사된다.
이상과 같이, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는, 줄기세포의 유주성, 증식성 및 혈관신생인자의 생산능 등의 기능을 증강시킬 수 있으며, 이 기능 증강 줄기세포는 경색부에 집적하여 증식함과 더불어, 혈관신생인자를 방출함으로써, 경색부의 혈관신생을 촉진할 수 있다. 또한, 그 집적 및 증식된 줄기세포가 심근으로 분화함으로써, 심근 재생을 촉진하고, 그 결과 우수한 심근경색 등의 허혈성 심질환의 치료 효과를 나타낸다. 또, 당해 줄기세포는, 섭취한 스타틴을 서방할 수 있으며, 이로써 스타틴 자체의 혈관신생 효과 등 스타틴 특유의 다양한 효과도 얻을 수 있으므로, 허혈성 심질환을 비롯한 다양한 질환의 치료에 유익하다. 또한, 환부에 집적한 줄기세포에서 방출된 스타틴에 의하여, 체내의 줄기세포나 골수 유래 혈관 내피 전구세포(EPC)의 집적을 항진시킬 수 있으며, 그 결과, 예를 들어 허혈성 심질환의 경우, 경색부의 심근 재생을 더욱 촉진할 수 있다. 또, 스타틴 등의 화합물을 단순히 정맥 투여한 경우, 혈류를 따라 환부로 운반되는데, 심근경색 등의 허혈성 심질환에서는, 혈류가 저해 받아 정상적으로 환부에 도달하기가 어려우나, 본 발명과 같이 스타틴이, 유주성이 증강된 줄기세포에 섭취되어 운반되므로, 혈류가 저해 받는다 하더라도 환부에 도달할 수 있다. 즉, 양호한 약물 전달 시스템이 될 수 있어, 투여해야 할 세포 수를 저감할 수 있다. 이상에서 설명한 작용에 따라, 본 발명은 심근경색 등의 허혈성 심질환의 치료에 매우 높은 효과를 발휘한다.
SEQUENCE LISTING <110> Masaaki II, FOUNDATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH AND INNOVATION <120> STATIN-ENCAPSULATED NANOPARTICLE PREPARATION FOR ENHANCING STEM CELL FUNCTION, STEM CELL WITH ENHANCED FUNCTION CONTAINING STATIN-ENCAPSULATED NANOPARTICLE, AND METHOD FOR PRODUCING SAME <130> WO2016/076227 <140> PCT/JP2015/081329 <141> 2015-11-06 <150> JP 2014-228409 <151> 2014-11-10 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-A forward primer <400> 1 ttactctcac ctgcttct 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-A reverse primer <400> 2 ctgcttcttc caacaatg 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-C forward primer <400> 3 tcaaggacag aagagacta 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-C reverse primer <400> 4 ccacatctat acacacctc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF-2 forward primer <400> 5 ttcttccaat gtctgctaa 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF-2 reverse primer <400> 6 gaccaattat ccaaactgag 20

Claims (15)

  1. 스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 함유하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 제제이며,
    상기 나노입자는, 개수 평균 입경(number average particle diameter)이 1000nm 미만인, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위한 스타틴 봉입 나노입자 제제.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체 흡수성 폴리머는, 폴리 젖산 중합체(PLA) 또는 폴리 젖산 글리콜산 공중합체(PLGA)인 것을 특징으로 하는 스타틴 봉입 나노입자 제제.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 줄기세포는, 지방 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 스타틴 봉입 나노입자 제제.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 허혈성 심질환의 치료용 줄기세포인 것을 특징으로 하는 스타틴 봉입 나노입자 제제.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증강되는 줄기세포의 기능은, 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스타틴 봉입 나노입자 제제.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는, 기능 증강 줄기세포.
  7. 청구항 6에 있어서,
    지방 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서,
    허혈성 심질환의 치료용인 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포.
  9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포의 증강된 기능은, 유주능, 증식능 및 혈관신생인자의 생산능 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포.
  10. 청구항 6 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 기능 증강 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 정맥 투여용 세포 제제.
  11. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 처리하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포의 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 처리하는 단계에 있어서, 상기 줄기세포를 배양하는 배지 중에 20μg/mL~100μg/mL의 농도가 되도록 상기 스타틴 봉입 나노입자를 첨가하는 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포의 제조방법.
  13. 청구항 11 또는 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 처리하는 단계에 있어서, 상기 스타틴 봉입 나노입자의 처리 시간은 30분 내지 2시간인 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포의 제조방법.
  14. 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포로서 지방 유래 줄기세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포의 제조방법.
  15. 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포는, 허혈성 심질환의 치료용인 것을 특징으로 하는 기능 증강 줄기세포의 제조방법.
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