KR20170057524A - 백리향의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
백리향의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 백리향(Thymus quinquecostatus Celak)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백리향 유래 추출물은 방사선 조사에 의한 면역기능 저하 모델에서 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시킬 수 있으므로, 면역증강에 도움이 되는 건강기능식품 및 사료의 재료로 이용될 수 있다.
본 발명의 백리향 추출물은 면역증강과 면역회복 능력이 우수하므로, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 건강기능식품과 사료는 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시키는데 효과적이다. 구체적으로, 방사선이 조사된 비장 세포에 백리향 추출물을 농도별로 처리한 경우, 방사선 조사에 의해 감소된 세포의 생존율이 농도 의존적으로 유의성 있게 향상되어, 300 μg/ml의 백리향 추출물을 방사선이 조사된 마우스 비장세포에 처리하여 배양하였을 때 말초 면역세포인 비장 세포가 약 118.6%까지 세포 생존율이 향상되었다.
또한 본 발명의 백리향 추출물은 천연물에서 유래한 물질로서 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명의 백리향 추출물은 면역증강과 면역회복 능력이 우수하므로, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 건강기능식품과 사료는 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시키는데 효과적이다. 구체적으로, 방사선이 조사된 비장 세포에 백리향 추출물을 농도별로 처리한 경우, 방사선 조사에 의해 감소된 세포의 생존율이 농도 의존적으로 유의성 있게 향상되어, 300 μg/ml의 백리향 추출물을 방사선이 조사된 마우스 비장세포에 처리하여 배양하였을 때 말초 면역세포인 비장 세포가 약 118.6%까지 세포 생존율이 향상되었다.
또한 본 발명의 백리향 추출물은 천연물에서 유래한 물질로서 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 백리향(Thymus quinquecostatus Celak)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백리향 유래 추출물은 방사선 조사에 의한 면역기능 저하 모델에서 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시킬 수 있으므로, 면역증강에 도움이 되는 건강기능식품 및 사료의 재료로 이용될 수 있다.
면역은 태어날 때부터 지니고 있는 선천 면역(innate immunity)과 후천적으로 생활하면서 적응되어 얻어지는 획득 면역(acquired immunity)으로 구분될 수 있다. 선천 면역은 일명 '자연 면역'이라고도 하며, 항원에 대해 비특이적으로 반응하고, 특별한 기억작용은 없는 것을 특징으로 한다.
생체내 선천적 방어 면역시스템 중 최근 가장 중요시되는 연구 분야는 인터페론(interferon)에 의해 유도되는 선천성 면역분야이며, 이러한 인터페론 매개 면역의 활성화는 다양한 전염병 병원체에 대한 근본적인 예방 방법이 될 수 있다. 따라서 인터페론 활성화 기전 연구 및 인터페론을 유도시킬 수 있는 면역조절제제의 개발 연구가 활발하다. 또한, 병원체의 감염에 따른 선천 면역의 방어기작의 하나로 면역 인자(염증 사이토카인)가 분비되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어진다. 따라서 적정한 수준의 염증 반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있으며, 이를 유도시킬 수 있는 면역 증강제제의 개발 연구가 필요하다.
천연식품 중 야생 식용작물은 현재 전초와 잎, 줄기, 뿌리, 열매 및 종자 등이 신선한 또는 건조된 상태로 식용되거나 약리학적으로 다양하게 이용되어오고 있 다. 야생식용식물은 식품소재로서의 가치가 클 뿐만 아니라 그 독특한 맛과 향기 때문에 천연 향식료로서의 유용성의 면에서도 그 효과가 지대하다. 현재 국내 고랭지에서 주로 잘 서식하는 식용작물로는 고본, 고추냉이, 메밀, 향유 배초향, 감자꽃, 백리향 등이 있다.
이 중에서 백리향(Thymus quinquecostatus)은 꿀풀과 낙엽 반관목 식물로서 높은 산꼭대기나 바닷가의 바위틈에서 자란다. 높이는 3~15 cm이다. 원줄기는 땅위로 퍼져나가고 어린가지가 긴 타원형이거나 바소꼴이며 길이는 5~12 mm 이다. 양면에 선점(腺點)이 있으며 가장자리는 밋밋하다. 꽃의 길이 약 1 cm인 것을 섬백리향(var. japonica)이라고하는데, 한국 특산종이다. 향기가 있어서 관상용으로 심으며, 포기 전체에 정유(精油)가 있어서 진해, 진경, 구풍에 사용하고 한국, 일본, 중국등지에서 분포한다. 꽃은 6월에 분홍색으로 피고, 줄기가 좀더 들이나 길가에서 자란다. 높이 20-50 cm로 전체에 털에 없고 줄기는 붉은 자주빛의 둥근 통으로 곧게 선다. 가지를 많이 내며 마디에 뿌리를 뻗는다. 잎은 어긋나고 길이 4-8 cm 정도이다.
본 발명자들은 독성 및 부작용이 없으면서 천연인 면역증강 도움물질을 찾기 위해 모색한 결과, 백리향의 추출물에서 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시킬 수 있는 능력을 확인하여, 면역증강에 도움이 되는 건강기능식품 및 사료의 재료로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 상술한 바와 같이 면역증강과 면역회복에 효과가 있는 백리향 추출물과 이를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 면역증강과 면역회복에 효과가 있는 백리향 추출물과 이를 유효성분으로 함유하는 사료조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.
상기 백리향 추출물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 (1) 찬물에서 용해한 후 85 내지 95℃로 가온한 펙틴을 준비하는 단계, (2) 상기 (1)단계에서 준비된 펙틴에 프락토올리고당, 가시오가피농축액, 폴리인산나트륨을 추가하여 혼합하는 단계, (3) 상기 (2)단계에서 혼합한 혼합물에 홍삼농축액, 복합황금추출물, 백리향 추출물을 추가하여 혼합하는 단계 및 (4) 상기 (3)단계에서 혼합한 혼합물에 시클로덱스트린을 추가하여 혼합하는 단계;를 포함하는 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.
또한 본 발명은, 백리향 추출물을 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 방법을 제공한다.
본 발명의 백리향 추출물은 면역증강과 면역회복 능력이 우수하므로, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 건강기능식품과 사료는 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시키는데 효과적이다. 구체적으로, 방사선이 조사된 비장 세포에 백리향 추출물을 농도별로 처리한 경우, 방사선 조사에 의해 감소된 세포의 생존율이 농도 의존적으로 유의성 있게 향상되어, 300 μg/ml의 백리향 추출물을 방사선이 조사된 마우스 비장세포에 처리하여 배양하였을 때 말초 면역세포인 비장 세포가 약 118.6%까지 세포 생존율이 향상되었다.
또한 본 발명의 백리향 추출물은 천연물에서 유래한 물질로서 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
도 1은 백리향 추출물을 처리하여 마우스 비장세포 생존율을 측정한 결과 그래프.
도 2는 방사선을 조사한 마우스 혈액성상 변화에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 3은 방사선을 조사한 마우스 혈액성상 중 백혈구 비중 변화에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 4는 방사선 조사에 의해 마우스 체중의 감소와 체중 대 비장 비율에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 5은 방사선을 조사한 마우스 비장의 조혈 촉진능력에 대한 백리향 추출물의 효과를 보인 사진과 그래프
도 6은 방사선을 조사한 마우스의 골수 및 비장 세포 증식에 대한 백리향 추출물의 효과를 보인 그래프.
도 2는 방사선을 조사한 마우스 혈액성상 변화에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 3은 방사선을 조사한 마우스 혈액성상 중 백혈구 비중 변화에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 4는 방사선 조사에 의해 마우스 체중의 감소와 체중 대 비장 비율에 대한 백리향 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 5은 방사선을 조사한 마우스 비장의 조혈 촉진능력에 대한 백리향 추출물의 효과를 보인 사진과 그래프
도 6은 방사선을 조사한 마우스의 골수 및 비장 세포 증식에 대한 백리향 추출물의 효과를 보인 그래프.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 관점에서 본 발명은 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 백리향은 꿀풀과의 식물로 백리향의 잎과 줄기는 우리나라에서 민간요법으로 발한제(diaphoretic), 항고창제(antiflatulent), 진해제(antitussive), 향료 등의 용도로 사용되고 있다.
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 열수를 첨가하여 추출한다.
또한, 본 발명에서 상기 "추출물"은 추출액, 정제물, 희석액, 농축액 및 건조물을 모두 포함한다.
상기 백리향 추출물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 (1) 찬물에서 용해한 후 85 내지 95℃로 가온한 펙틴을 준비하는 단계, (2) 상기 (1)단계에서 준비된 펙틴에 프락토올리고당, 가시오가피농축액, 폴리인산나트륨을 추가하여 혼합하는 단계, (3) 상기 (2)단계에서 혼합한 혼합물에 홍삼농축액, 복합황금추출물, 백리향 추출물을 추가하여 혼합하는 단계 및 (4) 상기 (3)단계에서 혼합한 혼합물에 시클로덱스트린을 추가하여 혼합하는 단계;를 포함하는 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 관점에서 본 발명은 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 열수를 첨가하여 추출한다.
또 다른 관점에서 본 발명은, 백리향 추출물을 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 그 구성 및 작용을 설명한다. 이 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 백리향 추출물의 제조
자양농장(충주, 한국)에서 구입한 백리향을 건조시켜 마쇄기로 분말화한 후, 그 건조시료에 대해 10배(w/v)의 물을 가하고, 2시간 동안 끓여 여과하고 감압농축한 다음 그 농축액을 동결건조하여 백리향 추출물을 수득하였다.
상기 백리향 추출물을 동결건조 후 파우더 형태로 보관하였다. 추후 추출물을 제조하기 위해서는, 파우더 형태 백리향 시료 일정량에 10배의 물을 가하여 100℃에서 90분 동안 1회 추출한 후 감압여과를 통해 백리향 추출물을 만들었다.
백리향 추출물의 추출 수율을 측정한 결과 아래의 표처럼 18.93%로 나타났다. 또한 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양하고 우수한 생리활성을 가지는 폴리페놀과 플라보노이드의 함량을 각각 측정한 결과 아래의 표처럼 156 mg GAE/g extract의 폴리페놀 함량과 193 mg CE/g extract의 플라보노이드 함량을 나타내었다.
실험예 1. 마우스 비장세포 생존율 측정
본 발명에 따른 백리향 추출물의 면역증강 효과를 확인하기 위하여, 마우스 비장세포의 생존율을 측정하였다.
8-12주령 ICR 마우스 (SLC, Japan)의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었고, 이렇게 얻은 세포는 ACK (ammonium chloride-potassium)용액과 함께 10분간 실온에서 배양하여 적혈구를 lysis시킨 후 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Gibco BRL, UK)로 세척하고, 10% 소태아 혈청 (Gibco BRL)과 1% 항생제 (100U/ml penicillin-streptomycin, Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL)에 부유시켰다.
산화적 스트레스 (oxidative stress)와 면역세포 기능의 억제를 위해 마우스 비장의 단일세포 부유액에 60Co 감마선 (Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교) 7Gy를 1회 조사 하였다.
정상 마우스 비장세포 및 방사선이 조사된 마우스 비장세포의 생존율에 대한 백리향 추출물의 효능을 관찰하기 위하여 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) assay를 수행하였다.
비장에서 얻은 세포를 96 well plate의 각 well에 10% FBS와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 100 μl와 함께 well당 1 X 105개로 분주하고, 각 0, 37.5, 75, 150, 300 μg/ml의 농도로 백리향 추출물를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 조건의 포화습도가 있는 배양기에서 24시간 배양 후, 15 μl의 MTT (5 mg/ml)을 각 well에 첨가하고 4시간 반응시켰다. 이후 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)와 50% dimethylformamide(DMSO)가 함유된 solubilization buffer 100 μl를 첨가하여 570 nm에서 ELISA plate reader로 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다.
비장 세포의 생존율에 대한 백리향 추출물의 효능을 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 세포군에 비해 백리향 추출물를 처리한 경우, 마우스 말초 면역 세포로 알려져 있는 비장 세포의 생존률이 농도 의존적으로 증가하였다는 것을 확인하였다 (도 1 A). 이 결과로부터 백리향 추출물은 세포독성 없이 세포 생존율을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
면역 세포수의 회복은 방사선 조사에 의해 야기되는 손상을 회복시키기 위해 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기에, 방사선이 조사된 마우스 비장 세포의 생존율에 대한 백리향 W의 효능을 검사하였다.
(도 1 B)에서 보는 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해, 방사선이 조사된 비장 세포의 생존율은 약 91.6%로 유의성 있게 감소되었다. 그러나, 방사선이 조사된 비장 세포에 백리향 추출물을 농도별로 처리한 경우, 방사선 조사에 의해 감소된 세포의 생존율이 농도 의존적으로 유의성 있게 향상된 것을 확인하였다. 특히, 300 μg/ml의 백리향 추출물을 세포에 처리하여 배양하였을 때 말초 면역세포인 비장 세포가 약 118.6%까지 세포 생존율이 향상되었다. 이 결과로부터 백리향 추출물이 방사선 조사에 의해 감소된 면역 세포의 생존율을 세포 독성 없이 증가시켰다는 것을 확인하였다.
실험예 2. 마우스 비장세포 내 활성산소 측정
본 발명에 따른 백리향 추출물의 ROS 생성에 대한 저해 효과를 확인하기 위하여, 마우스 비장세포 내 활성산소를 측정하였다.
진동 환경에서 방사선이 조사된 비장세포의 세포내 ROS를 측정하기 위하여 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) assay를 실시하였다. 7 Gy의 방사선이 조사된 마우스 비장세포를 96 well plate의 각 well 당 1 X 105개로 분주하고, 각 0, 37.5, 75, 150, 300 μg/ml의 농도로 백리향 추출물을 처리하였다.
세포 배양기에서 2시간 배양 후, 25 μM의 DCF-DA 용액을 첨가하여 30분 동안 추가 배양하였다. 이후 형광물질의 흡광도를 측정하는 fluorostar (BMG Labtech, USA)를 이용하여 585 nm와 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
일반적으로, 방사선은 생체 내에서 산소나 물의 대사과정을 통해 hydrogen atom(·H), hydrated electron(e-) 그리고 hydroxyl radical (·OH), superoxide radical, hydrogen peroxide, alkoxy radical, peroxy radical과 같은 활성산소 (ROS)를 생성하게 된다. 이러한 활성산소들은 생체 내에서 단백질의 SH기나 DNA와 반응하여 화학결합의 절단이나 가교결합의 형성 등 생체구성 분자의 구조적 변화를 야기하고, 이로 인해 효소 활성의 저하와 DNA, 지질 및 단백질 등을 손상시킬 뿐만 아니라 세포막의 불포화지방산과 일련의 연쇄반응을 통하여 지질과산화를 유발하여 산화적 스트레스를 유도하는 것으로 알려져 있다.
방사선이 조사된 비장 세포 내 ROS 생성에 대한 백리향 추출물의 효과를 확인하기 위해, DCF-DA assay를 수행하였다. (도 1 C)에서 보는 바와 같이, 백리향 추출물을 다양한 농도 (0, 37.5, 75, 150, 300 μg/ml)로 처리함에 따라 방사선 조사에 의해 유도된 마우스 비장 세포 내 ROS 생성량이 유의적으로 감소되었다는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 백리향 추출물이 방사선 조사로 인해 유도된 생체 내 ROS의 생성량을 감소시킴으로써 면역 세포의 생존율을 증가시켰다는 것을 알 수 있다.
실험예 3. 생체 내(In vivo) 방사선 방호 효과 확인
1) 백리향 추출물의 투여 및 실험 수행 계획
본 실험에 이용된 동물은 6~8주령, 24-30g의 C57BL/6 마우스 (Jackon사, USA)를 사용하였다. 사육 조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50% ± 5%를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다.
백리향 추출물은 방사선 조사 12시간 전, 2시간 전 및 방사선 조사 후 5일째에 15 mg/kg(mouse 중량)의 농도로 마우스에 각각 경구 투여하고, 방사선 조사 대조군은 동량의 PBS를 투여하였다. 실험에 공시된 mouse는 perspex box (3 X 3 X 11 cm)에 넣어 60Co 감마선(Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 7 Gy의 양으로 마우스 전신에 조사하였다.
2) 방사선을 조사한 마우스 혈액성상 변화에 대한 백리향 추출물 효과
실험군은 각 군당 3~4마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 백리향 추출물 병행 투여군으로 구분하였고 방사선 조사로 변화된 혈액 성상에 대한 백리향 추출물 의 효능을 알아보기 위해 준치사량인 7 Gy의 방사선을 조사한 후 9일에 각 실험군의 마우스를 희생시켜 혈액을 얻었다.
얻은 혈액을 가지고, 혈액분석기를 이용하여 혈액 성상 변화 (WBC (white blood cells)와 RBC (red blood cells), HGB (hemoglobin), HCT (hematocrit), MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular hemoglobin), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration), CHCM (cellular haemoglobin concentration mean), PLT (platelet), MPV (mean platelet volume))를 확인하였다.
또한, 혈액 내 면역 세포들로 알려진 neutrophils, lymphocytes, monocytes, eosinophils 및 basophils에 대한 백리향 추출물의 효능을 확인하였다.
일반적으로, 방사선을 조사하게 되면, 혈액 세포의 성상이 변하게 되는 것으로 알려져 있다. 방사선 조사가 변화시킨 혈액 세포의 변화에 대한 백리향 추출물의 효능을 확인하였다.
(도 2)에서 제시된 것처럼, 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 방사선을 조사한 후 9일째, 마우스 혈액 내 WBC, RBC, HGB, HCT와 MCV의 수가 유의성 있게 감소하였다는 것을 확인하였으나, 백리향 추출물의 처리는 별다른 영향을 주지 않았다. 또한, 다른 혈액 성상 (MCH, MCHC, CHCM, PLT와 MPV)에 대해서는 방사선 조사와 백리향 추출물의 처리간의 별다른 유의적 차이를 확인할 수 없었다.
또한, 백리향 추출물를 처리한 경우, WBC의 수가 다소 증가하였으나, 유의적인 차이를 보이지 않았고, 다른 혈액성상에도 별다른 영향을 미치지 못했다 (도 2 참조). 흥미롭게도, 방사선이 조사된 마우스 혈액 내 면역 세포의 변화를 확인한 결과, 방사선 조사에 의해 lymphocytes의 %는 감소되었고, basophils의 %는 증가되었다 (도 3 참조). 특히, 방사선 조사에 의해 유도된 lymphocytes %의 감소는 백리향 추출물의 처리에 의해 유의성 있게 회복되었다 (도 3 참조).
일반적으로 방사선 조사에 의해 골수 내 골수모세포가 죽기 때문에 이미 생성된 혈구의 수명이 끝나면 더 이상의 혈구 생산이 되지 않아 말초 혈액 내 적혈구, 백혈구 및 혈소판 수의 감소가 관찰된다. 따라서 방사선 생체 손상의 방호 및 회복을 위해서는 일차적인 조직의 방호뿐만 아니라 이차적인 면역조혈계의 회복촉진이 더욱 중요하다. 이러한 결과로부터, 비록 백리향 추출물의 추출물이 적혈구와 혈소판의 수에는 영향을 주지 못하였다 하더라도, 백혈구 수치를 향상시켜 줌으로써 면역 조혈계의 회복에 기여할 것으로 여겨진다.
(도 4 A)와 (도 4 B)에서 보는 바와 같이, 방사선 조사에 의해 마우스 체중의 감소와 체중 대 비장 비율의 감소가 유도되었고, 백리향 추출물의 처리는 회복에 별다른 영향을 주지 않았다. 또한, 방사선 조사에 의해 마우스 체중 대 간 비율을 확인한 결과에서는 아무것도 처리하지 않은 군과 백리향 추출물 처리군에서 유의적 차이가 보이지 않았다 (도 4 C 참조).
3) 방사선을 조사한 마우스 비장의 조혈 촉진능력에 대한 백리향 추출물의 효과
백리향 추출물을 방사선 조사 12시간 전, 2시간 전 및 방사선 조사 후 5일째에 15 mg/kg(mouse 중량)의 농도로 마우스에 각각 경구 투여하고, 방사선 조사 대조군은 동량의 PBS를 투여하였다. 방사선(7 Gy)을 조사 9일 후, 체중과 비장 및 간의 무게를 각각 측정하였고, 비장을 채취하여 표면에 형성된 조혈 집락을 육안으로 관찰하여 그 수를 count하였다.
방사선이 조사된 생체에서는 감소된 면역세포의 재생성시 골수내의 조혈모세포가 말초 림프기관으로 이동하여 증식한다. 이때 비장 내에서는 조혈모세포의 증식에 의한 집락이 형성되며, 방사선 조사 후 비장에서 형성된 집락이 수는 조혈모세포의 방호 및 재생성 능력의 지표로 사용되어지고 있다.
방사선 조사 후 9일이나 10일까지를 회복기라 부르고 이 시기에는 골수 내의 조혈모세포가 말초 림프기관으로 이동하여 내인성 집락을 형성함으로써 비장 내에서는 조혈모세포의 증식에 의한 집락이 육안으로 확인이 가능해진다.
본 발명에서는 백리향 추출물이 조혈 촉진에 영향을 주는 지를 알아보기 위해 방사선 조사 후 9일 째, 비장의 조혈 기능을 확인하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 이러한 비장 집락을 관찰할 수 없는 반면 방사선 조사 대조군은 2.88 ± 0.67개로 그 수가 증가하였다(도 5 A와 B). 그리고 백리향 추출물 병행 투여군은 4.67 ± 0.22개로 방사선 조사 대조군에 비해 약 1.6배 증가하였다(도 5 A와 B).
4) 방사선을 조사한 마우스 비장에서 감소된 비장 세포 수에 대한 백리향 추출물의 효과
실험군은 각 군당 3~4 마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 백리향 추출물 병행 투여군으로 구분하였고 방사선 조사로 억제된 조혈기능에 대한 백리향 추출물의 효능을 알아보기 위해 준치사량인 7 Gy의 방사선을 조사 후 9일째 각 실험군의 마우스를 희생시켜 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다. 이렇게 얻은 세포는 ACK용액과 함께 10분간 실온에서 배양하여 적혈구를 lysis시킨 후 DPBS로 세척하고, 10% 소태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 RPMI-1640 배지에 부유시켰다.
또한, 방사선이 조사된 마우스의 비장 세포수와 골수 세포수를 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군의 비장 세포 수는 약 3.34 X 107개였으나, 방사선이 조사된 방사선 조사군의 비장 세포 수는 약 1.88 X 106개로 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 5 C 참조). 그러나, 백리향 추출물의 처리는 유의적으로 비장세포의 수를 약 1.15 X 106개로 유의성 있게 증가시켰다(도 5 C 참조).
5) 방사선을 조사한 마우스 골수에서 감소된 골수 세포 수에 대한 백리향 추출물의 효과
실험군은 각 군당 3~4 마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 백리향 추출물 병행 투여군으로 구분하였고 방사선 조사로 억제된 조혈기능에 대한 백리향 추출물의 효능을 알아보기 위해 준치사량인 7 Gy의 방사선을 조사 후 9일째 각 실험군의 마우스를 희생시켜 대퇴골을 얻고 대퇴골의 양 끝단을 자른 후 골수세포를 1% FBS가 들어있는 PBS로 씻어 낸다. 10% FBS가 들어있는 RPMI 배지에 부유시킨 후 trypan Blue 염색을 하여 살아있는 골수세포의 수를 측정하였다.
한편, 골수 세포의 수를 확인한 결과에서는 방사선 조사군 (골수 세포의 수: 약 1.14 X 106개)에서 아무것도 처리하지 정상 대조군 (골수 세포의 수: 약 1.15 X 107개)에 비해 현저하게 감소된 수를 확인할 수 있었고, 백리향 추출물의 처리는 세포수를 약 2.15 X 106개까지 향상시켰으나 유의적 차이는 없었다(도 5 D 참조).
6) 방사선을 조사한 마우스의 골수 및 비장 세포 증식에 대한 백리향 추출물의 효과
실험군은 각 군당 3~4 마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 백리향 추출물 병행 투여군으로 구분하였고 방사선 조사로 억제된 조혈기능에 대한 백리향 추출물의 효능을 알아보기 위해 준치사량인 7 Gy의 방사선을 조사 후 9일째 각 실험군의 마우스를 희생시켜 비장과 대퇴골을 얻고 세포를 각각 분리하였다.
10% FBS가 들어있는 RPMI 배지에 부유시킨 후 96 well plate의 각 well에 10% FBS와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200 μl에 well당 2 X 105의 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2, 포화습도가 있는 incubator에서 48시간 배양 후, 3H-thymidine (42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1 μCi/well를 첨가하여 배양하였다. 18시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조시킨 후 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.
내재성 비장 집락의 형성 결과를 바탕으로 방사선 조사 후 억제된 면역 세포의 증식능에 백리향 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위해 3H-thymidine incorporation 실험을 수행하였다. 방사선 조사 후 9일째 얻은 비장세포에서 백리향 추출물 병행 투여군은 146.4 ± 18.3 cpm으로 방사선 조사 대조군이 105.4 ± 4.5 cpm에 비해 약 1.4배 증가를 나타내었다(도 6 A 참조). 백리향 추출물 투여는 말초 면역 세포로 알려진 비장 세포의 증식을 촉진시키는 것으로 사료된다. 그러나 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군의 골수 세포 증식 (286 ± 61.4 cpm)에 비해 방사선 조사군의 골수 세포 증식 (75.6 ± 7.2 cpm)은 현저한 감소를 보였고, 백리향 추출물 처리군에서는 그룹간 차이가 없었다(도 6 B 참조). 이와 같은 결과로부터 백리향 추출물의 처리는 방사선 조사가 야기한 말초 면역 기관과 조혈 기관으로 알려진 혈액 내 림프구와 비장 및 골수 세포의 수, 증식 능력을 회복시켜줌으로써, 방사선 조사에 대한 방호 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 백리향 추출물 함유 건강기능식품 제조
실시예 1에서 얻은 백리향 추출물을 함유하는 건강기능식품은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
먼저 백리향 추출물에 포함되는 원료인, 펙틴, 프락토올리고당, 가시오가피농축액, 폴리인산나트륨, 홍삼농축액, 복합황금추출물, 시클로덱스트린 및 백리향 추출물을 준비하고 필요한 양만큼을 재어서 준비한다.
다음 단계는, 찬물에서 용해한 후 고온(90 ± 3℃)으로 가온하여 펙틴을 준비한다. 이 때 시간은 20 ± 5분간 가온하며, 50 내지 60 rpm으로 제조기기를 회전시켜 섞는다.
다음 단계로, 준비된 펙틴에 프락토올리고당, 가시오가피농축액, 폴리인산나트륨을 넣어 온도 80 ± 3℃ 조건에서, 시간 20 ± 5분 동안, 50 내지 60 rpm으로 제조기기를 회전시켜 섞는다.
다음 단계로, 앞 단계에서 준비된 펙틴기반 혼합물에 홍삼농축액, 복합황금추출물, 백리향추출물을 넣어 온도 80 ± 3℃ 조건에서, 시간 5분 동안, 50 내지 60 rpm으로 제조기기를 회전시켜 섞는다.
마지막으로, 앞 단계에서 제조된 백리향 추출물 함유 혼합물에 시클로덱스트린을 넣어 온도 80 ± 3℃ 조건에서, 시간 20 ± 5분 동안, 50 내지 60 rpm으로 제조기기를 회전시켜 섞고, 100mesh 체로 걸러서 백리향 추출물을 함유하는 건강기능식품을 제조한다.
상기 방법으로 제조된 백리향 추출물을 함유하는 건강기능식품은, 실험예 1, 실험예 2 및 실험예 3에서 백리향 추출물이 보인 것과 동일한 효과를 보인다.
이상 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품.
- 제 1항에 있어서,
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 면역 증강용 건강기능식품.
- 제 1항에 있어서,
식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 건강기능식품.
- 제 1항에 있어서,
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 건강기능식품.
- (1) 찬물에서 용해한 후 85 내지 95℃로 가온한 펙틴을 준비하는 단계,
(2) 상기 (1)단계에서 준비된 펙틴에 프락토올리고당, 가시오가피농축액, 폴리인산나트륨을 추가하여 혼합하는 단계,
(3) 상기 (2)단계에서 혼합한 혼합물에 홍삼농축액, 복합황금추출물, 백리향추출물을 추가하여 혼합하는 단계 및
(4) 상기 (3)단계에서 혼합한 혼합물에 시클로덱스트린을 추가하여 혼합하는 단계;를 포함하는 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 건강기능식품의 제조 방법.
- 백리향 추출물을 포함하는 면역 증강용 사료 조성물.
- 제 6항에 있어서,
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 면역 증강용 사료 조성물.
- 백리향 추출물을, 인간을 제외한 면역 증강이 필요한 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 면역 증강 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 백리향 추출물은 열수 추출, 알코올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 동물의 면역 증강 방법.
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