KR20150104950A - 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스에서 감마선 조사 전 또는 후 헤스페레틴을 투여한 군의 체중, 혈구 수치, 간 조직의 항산화 물질 및 항산화 효소가 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하고, 혈장의 ALT 및 AST, 간 조직의 지질과산화 및 XO가 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소하여 산화적 스트레스가 완화되므로, 상기 헤스페레틴을 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 헤스페레틴(hesperetin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
최근 일본 대지진으로 인한 후쿠시마 원자력발전소 사고로 인해 인체가 방사선 피폭 빈도가 증가하고 있으며, 방사선 치료 및 방사성동위원소의 의학적 이용증가, 우주방사선을 비롯한 자연방사선 피폭으로 인한 인체장애나 인체방어에 관하여 사람들의 관심이 집중되고 있다(Meister 2005). 현재 우리나라 역시 방사선 노출에 대한 불안감이 커진 가운데 '생활주변 방사선 안전관리법'이 시행되어 생활주변에서 발생할 수 있는 방사선에 불필요하게 노출되는 것을 방지하고자 하고 있다. 방사선은 암 세포를 제거하거나 이의 성장을 저해하여 여러 조직의 암 치료와 암환자의 삶을 연장하는 목적 등으로 널리 사용되고 있으나, 장기 암 생존자들의 정상 조직에 손상을 유발하여 2차 암으로 발전될 수 있다(Dormand et al. 2005). 방사선은 직접적인 조직 손상과 생체 물질의 이온화 현상에 의한 간접 손상을 유발하게 되며, 방사선에 의해 생성된 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 간접적으로 DNA, 단백질 및 세포막 등의 세포손상과 세포사멸을 유도한다(Halliwell and Gutterige 1999). 따라서 방사선 피폭시 정상세포를 보호하면서 부작용이 없고 생체손상의 예방 및 세포 보호를 위한 방사선보호제에 대한 연구가 시도되어 왔다(Phillips 1981).
방사선보호제에 대한 연구는 WR-2721(amifostine) 등의 티올(thiol)기를 갖는 합성물질, 사이토카인(cytokines), 면역조절제(immunomodulator) 등에 대해서 연구가 많이 이루어져 있다. 그러나 합성물질은 독성이 강하며, 면역조절제의 경우 부작용이 많고 고가여서 사용에 한계를 나타내고 있어 생체에 안정적이고 값이 싸며 효과적인 방사선보호제의 개발 필요성이 제기되고 있다.
식물의 잎, 꽃, 열매에 풍부하게 존재하는 플라보노이드는 폴리페놀(polyphenol) 화합물로써 치환기의 구조와 위치에 따라 안토시아니딘(anthocyanidin), 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라바노올(flavanolol), 차르콘(chalcone), 카테친(catechin) 그리고 이소플라본(isoflavone)으로 나누어진다(Rauha et al. 2001). 플라보노이드는 항산화작용, 암세포 증식의 억제 효과, 항균성, 항바이러스, 면역자극제 등 다양한 생물학적 효과가 있다고 알려져 있다(Korkina and Afanas'ev 1997).
헤스페리딘(hesperidin)(도 1)은 분자식이 C18H34O15이고 분자량은 610.57이며 이당류(disaccharide) 루티노스(rutinose)와 결합된 플라바논 배당체(glycoside) 형태로 오렌지와 레몬과 같은 감귤류 식물에 존재한다. 헤스페리딘이 체내에서 당 분해 효소에 의해 가수분해되면 아글리콘(aglycone) 형태인 헤스페레틴(hesperetin)(도 1)으로 분해되며, 헤스페레틴의 분자식은 C16H14O6이고 분자량은 302.27이다(Garg et al. 2001). 헤스페레틴은 체내에서 위, 장으로 흡수된 후 생체 내에서 생리활성을 나타내며 혈액 및 간장 등의 조직 내에서 헤스페레틴 형태로 검출되고 있다(Ameer et al. 1996).
이에, 본 발명자들은 독성이 없고 방사선에 의한 생체 손상을 방지하기 위한 천연 소재의 방사선보호제를 찾기 위해 노력한 결과, 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스에서 감마선 조사 전 또는 후 헤스페레틴을 투여한 군의 체중, 혈구 수치, 간 조직의 항산화 물질 및 항산화 효소가 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하고, 혈장의 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase), 간 조직의 지질과산화 및 XO(xanthine oxidase)가 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 헤스페레틴을 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 헤스페레틴(hesperetin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤스페레틴(hesperetin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의하여 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호제를 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의해 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 헤스페레틴(hesperetin)은 감마선 조사로 유도된 손상 마우스에서 방사선에 의한 간 세포 및 조혈 면역계 손상에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타내고, 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 예방 및 회복하는 효과를 나타내므로, 상기 헤스페레틴을 방사선 피폭시 방사선 방호제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 헤스페레틴(hesperetin) 및 헤스페리딘(hesperidin)의 화학적 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다:
*: p<0.05; 및
**: p<0.01.
도 3은 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 ABTS[(2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 FRAP(ferric reducing antioxidant power) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈구 성분 변화를 나타낸 도이다:
정상대조군: 7일 동안 CMC(carboxy methyl cellulose)가 제공된 마우스 군;
6 Gy 조사: 7일 동안 CMC를 제공한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
25 mg/kg HT + 6 Gy 조사: 25 mg/kg 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
50 mg/kg HT + 6 Gy 조사: 50 mg/kg 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
100 mg/kg HD + 6 Gy 조사: 100 mg/kg 헤스페리딘을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
#: p<0.05 및 ##: p<0.01, 정상대조군과 비교; 및
*: p<0.05 및 **: p<0.01, 6 Gy 조사군과 비교.
도 6은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장 중 AST(aspartate aminotransferase)및 ALT(alanine aminotransferase)의 활성도를 나타낸 도이다.
도 7은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 XO 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 GSH(glutathione)변화를 나타낸 도이다.
도 10은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase) 및 GPx(glutathione peroxidase) 변화를 나타낸 도이다.
도 11은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직에서 형태학적 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다:
정상대조군: 7일 동안 CMC가 제공된 마우스군;
50 mg/kg HT: 7일 동안 50 mg/kg 헤스페레틴을 제공한 마우스 군;
6 Gy 조사: 6 Gy 감마선 조사 후 CMC를 제공한 마우스 군;
6 Gy 조사 + 25 mg/kg HT: 6 Gy 감마선 조사 후 7일 동안 25 mg/kg 헤스페레틴을 제공한 마우스 군;
6 Gy 조사 + 50 mg/kg HT: 6 Gy 감마선 조사 후 7일 동안 50 mg/kg 헤스페레틴을 제공한 마우스 군;
6 Gy 조사 + 100 mg/kg HD: 6 Gy 감마선 조사 후 7일 동안 100 mg/kg 헤스페리딘을 제공한 마우스 군;
#: p<0.05 및 ##: p<0.01, 정상대조군과 비교; 및
*: p<0.05 및 **: p<0.01, 6 Gy 조사군과 비교.
도 13은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 비장지수 변화를 나타낸 도이다.
도 14는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장 중 AST 및 ALT의 활성도를 나타낸 도이다.
도 15는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 XO 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 GSH 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 SOD, 카탈라아제 및 GPx 변화를 나타낸 도이다.
도 19는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직에서 형태학적 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다:
*: p<0.05; 및
**: p<0.01.
도 3은 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 ABTS[(2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 FRAP(ferric reducing antioxidant power) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈구 성분 변화를 나타낸 도이다:
정상대조군: 7일 동안 CMC(carboxy methyl cellulose)가 제공된 마우스 군;
6 Gy 조사: 7일 동안 CMC를 제공한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
25 mg/kg HT + 6 Gy 조사: 25 mg/kg 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
50 mg/kg HT + 6 Gy 조사: 50 mg/kg 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
100 mg/kg HD + 6 Gy 조사: 100 mg/kg 헤스페리딘을 7일 동안 경구투여한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 마우스 군;
#: p<0.05 및 ##: p<0.01, 정상대조군과 비교; 및
*: p<0.05 및 **: p<0.01, 6 Gy 조사군과 비교.
도 6은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장 중 AST(aspartate aminotransferase)및 ALT(alanine aminotransferase)의 활성도를 나타낸 도이다.
도 7은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 XO 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 GSH(glutathione)변화를 나타낸 도이다.
도 10은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase) 및 GPx(glutathione peroxidase) 변화를 나타낸 도이다.
도 11은 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직에서 형태학적 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다:
정상대조군: 7일 동안 CMC가 제공된 마우스군;
50 mg/kg HT: 7일 동안 50 mg/kg 헤스페레틴을 제공한 마우스 군;
6 Gy 조사: 6 Gy 감마선 조사 후 CMC를 제공한 마우스 군;
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6 Gy 조사 + 100 mg/kg HD: 6 Gy 감마선 조사 후 7일 동안 100 mg/kg 헤스페리딘을 제공한 마우스 군;
#: p<0.05 및 ##: p<0.01, 정상대조군과 비교; 및
*: p<0.05 및 **: p<0.01, 6 Gy 조사군과 비교.
도 13은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 비장지수 변화를 나타낸 도이다.
도 14는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장 중 AST 및 ALT의 활성도를 나타낸 도이다.
도 15는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 XO 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 GSH 변화를 나타낸 도이다.
도 18은 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 SOD, 카탈라아제 및 GPx 변화를 나타낸 도이다.
도 19는 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직에서 형태학적 변화를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 헤스페레틴(hesperetin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이다:
상기 방사선은 UV, X선, α선, β선, γ선, 전자선 및 중성자선으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포 또는 조직은 조혈계 또는 간의 세포 또는 조직인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 감소되는 체중을 회복시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 증가되는 혈청 표식 효소인 아스파테이트 트랜스아미나제(aspartate aminotransferase, AST) 또는 알라닌 트랜스아미나제(alanine aminotransferase, ALT)의 활성을 감소시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 증가되는 지질과산화 및 XO 활성을 감소시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 효소성 항산화제인 활성산소 제거효소(SOD), 카탈라아제(catalase) 또는 GPx(glutathione peroxidase)의 활성을 회복시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 항산화 물질인 GSH(glutathione)의 활성을 회복시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 혈구의 수를 회복시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 구체적인 실시예에서, 헤스페레틴(hesperetin)과 헤스페리딘(hesperidin)의 항산화 활성을 비교한 결과, 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 DPPH 소거 활성, ABTS 소거 활성, FRAP가 유의적으로 증가하여, 아글리콘 형태의 헤스페레틴이 배당체 형태의 헤스페리딘보다 항산화 능력이 뛰어남을 확인하였다(도 2, 도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 예방 효과를 확인하기 위하여, BALB/c 마우스에 감마선 조사 전 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여하여 감마선 조사로 유도된 손상 동물 모델을 제조하고, 체중, 비장 및 흉선 지수 변화를 확인한 결과, 감마선 조사 1일 후의 체중변화에서 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군은 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가함을 확인하였다. 또한, 헤스페레틴을 투여 한 후 감마선을 조사한 군의 비장 및 흉선 지수는 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 조혈면역계의 손상에 대해 예방 효과가 있음을 확인하였다(표 1 참조). 또한, 상기 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 혈구 성분 분석을 수행한 결과, 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군의 백혈구 수가 증가하는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴이 방사선 조사에 의한 조혈 세포의 방호 및 재생성 촉진에 효과가 있음을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 예방 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 혈액 내 AST 및 ALT 분석을 수행한 결과, 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군의 혈액 내 ALT와 AST가 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소하여 간세포 손상에 대해 예방 효과를 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 및 산화적 스트레스 예방 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 간 조직에서 지질과산화 및 XO를 분석한 결과, 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군의 지질과산화는 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 낮게 나타남을 보여 방사선에 의한 장해를 경감시키고, 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군의 XO는 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소함을 확인함으로써, 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 조직 또는 세포 손상을 예방하고 보호함을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 예방 및 산화적 스트레스 예방 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 간 조직에서 항산화 물질 및 항산화 효소 변화를 분석한 결과, 헤스페레틴을 투여한 후 감마선을 조사한 군의 GSH와 SOD, 카탈라아제 및 GPx 활성은 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 생체 내 항산화 방어 체계를 정상화시킴을 확인하였다(도 9 및 도 10 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 예방 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 흉골 조직의 형태학적 분석을 수행한 결과, 헤스페레틴을 투여한 군의 골수세포 소실이 적게 나타나 손상을 억제시킴으로써, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사에 따른 조직 손상을 예방시킴을 확인하였다 (도 11 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 치료 효과를 확인하기 위하여, BALB/c 마우스에 감마선 조사 후 헤스페레틴을 7일 동안 경구투여하여 감마선 조사로 유도된 손상 동물 모델을 제조하고, 체중 변화 및 비장 지수를 확인한 결과, 감마선 조사 7일 후의 체중변화에서 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군에서 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 회복되고, 비장 지수 또한 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 조혈면역계의 손상에 대해 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 12 및 도 13 참조). 또한, 상기 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 혈구 성분 분석을 수행한 결과, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군의 백혈구, 호중구, 림프구 및 단핵구의 수가 증가하는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴이 방사선 조사에 의한 조혈 세포의 방호 및 재생성 촉진에 효과가 있음을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 치료 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 혈액 내 AST 및 ALT 분석을 수행한 결과, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 50 mg/kg을 투여한 군의 ALT와 AST가 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소하여 간세포 손상을 치료하는 효과를 확인하였다(도 14 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 치료 및 산화적 스트레스 예방 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 간 조직에서 지질과산화 및 XO를 분석한 결과, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군의 지질과산화는 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 낮게 나타나고, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 50 mg/kg을 투여한 군의 XO 또한 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 감소함을 확인함으로써, 헤스페레틴이 방사선에 의한 세포 손상 치료 및 보호 효과가 있음을 확인하였다(도 15 및 도 16 참조).
또한, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 및 산화적 스트레스 치료 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 간 조직에서 항산화 물질 및 항산화 효소 변화를 분석한 결과, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군의 GSH는 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하고, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 25 mg/kg을 투여한 군의 항산화 효소의 활성이 헤스페레틴을 투여하지 않은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 방어체계를 회복함을 확인하였다(도 17 및 도 18 참조).
아울러, 본 발명자들은 헤스페레틴에 의한 방사선 조사로 유도된 손상 치료 효과를 확인하기 위하여, 상기 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 손상 마우스의 흉골 조직의 형태학적 분석을 수행한 결과, 헤스페레틴을 투여한 군의 골수세포 소실이 적게 나타나는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴의 투여가 방사선에 의해 유도된 손상을 회복시킴을 확인하였다(도 19 참조).
따라서, 본 발명의 헤스페레틴은 감마선 조사로 유도된 손상 마우스에서 방사선에 의한 간 세포 및 조혈 면역계 손상에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타내고, 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 예방 및 회복하는 효과를 나타내므로, 방사선 노출에 있어서 방사선 방호제로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 헤스페레틴은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 헤스페레틴을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 헤스페레틴 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 상기 헤스페레틴은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 헤스페레틴을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 헤스페레틴의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의하여 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이다:
[화학식 1]
상기 방사선은 UV, X선, α선, β선, γ선, 전자선 및 중성자선으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 헤스페레틴은 감마선 조사로 유도된 손상 마우스에서 방사선에 의한 간 세포 및 조혈 면역계 손상에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타내고, 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 예방 및 회복하는 효과를 나타내므로, 방사선 피폭시 방사선 방호제로서 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호제를 제공한다.
상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이다:
[화학식 1]
상기 방사선은 UV, X선, α선, β선, γ선, 전자선 및 중성자선으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 헤스페레틴은 감마선 조사로 유도된 손상 마우스에서 방사선에 의한 간 세포 및 조혈 면역계 손상에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타내고, 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 예방 및 회복하는 효과를 나타내므로, 방사선 노출에 있어서 방사선 방호제로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의해 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 건강식품을 제공한다.
상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이다:
[화학식 1]
상기 방사선은 UV, X선, α선, β선, γ선, 전자선 및 중성자선으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 헤스페레틴은 감마선 조사로 유도된 손상 마우스에서 방사선에 의한 간 세포 및 조혈 면역계 손상에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타내고, 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 예방 및 회복하는 효과를 나타내므로, 방사선 노출에 있어서 방사선 방호제로서 유용하게 이용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 제조예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 방사선 조사에 의해 유도된 조직 손상 동물모델의 제조
<1-1>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 동물모델의 제조
감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 예방 효과를 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 동물모델을 제조하였다.
구체적으로, 오리엔트바이오(주)에서 구입한 6주령(19.4±1 g)의 BALB/c 마우스 암컷을 23±2℃ 온도, 55±5% 습도, 명암순환은 12시간 단위로 유지되는 실험동물 사육장에서 1주일간 적응시켰으며, 고형사료와 물은 자유로이 공급하였다. 그 다음, 상기 BALB/c 마우스를 7마리씩 5개 그룹, 즉 7일 동안 CMC(carboxy methyl cellulose)를 제공한 정상대조군, 7일 동안 CMC를 제공한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 감마선 조사군, 헤스페레틴(hesperetin, HT)(Sigma-Aldrich, USA) 25 mg/kg, 50 mg/kg과 헤스페리딘(hesperidin, HD)(Sigma-Aldrich, USA) 100 mg/kg을 7일 동안 경구투여 한 후 6 Gy의 감마선을 조사한 군으로 나누었다. 시료는 1일 1회씩 7일 동안 경구투여하였으며, 마지막 시료 투여 후 감마선을 조사한 후 24시간 뒤에 희생하였다. 감마선 조사는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소 내 Gammacell 40 exactor(MDS Nordion, Canada)를 사용하여 1.1 Gy/분의 선량율이 되게 조사하였다. 정상대조군을 제외한 BALB/c 마우스는 아크릴 상자에 넣고 137Cs-γ선의 흡수선량이 6 Gy 가 되도록 마우스 몸 전체에 조사하였다.
<1-2>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 동물모델의 제조
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 동물모델을 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 같이 적응시킨 BALB/c 마우스를 6마리씩 6개 그룹, 즉 7일 동안 CMC를 제공한 정상대조군, 7일 동안 헤스페레틴(HT)을 50 mg/kg을 제공한 군, 6 Gy의 감마선을 조사한 후 7일 동안 CMC를 제공한 감마선 조사군, 6 Gy의 감마선을 조사한 후 7일 동안 헤스페레틴 25 mg/kg, 50 mg/kg과 헤스페리딘(HD) 100 mg/kg으로 경구투여한 군으로 나누었다. 시료는 감마선 조사 1시간 뒤 투여하여 1일 1회씩 7일 동안 투여하였으며 마지막 시료 투여 후 24시간 뒤에 희생하였다. 상기 실시예 <1-1>과 같이 감마선 조사를 수행하였고, 정상대조군과 7일 동안 헤스페레틴을 투여한 군을 제외한 BALB/c 마우스는 아크릴 상자에 넣고 137Cs-γ선의 흡수선량이 6 Gy 가 되도록 마우스 몸 전체에 조사하였다.
<
비교예
1>
헤스페레틴
및
헤스페리딘의
항산화 활성 비교
<1-1>
헤스페레틴
및
헤스페리딘의
DPPH
라디칼
소거 활성 비교
DPPH 라디칼 소거 활성은 자유라디칼(free radical)을 직접적으로 소거하는 것에 의하여 항산화 활성을 평가하는 방법으로, 반응 중 DPPH의 감소로 자유라디칼의 소거반응이 진행됨을 알 수 있고 지질과산화의 초기반응의 억제정도를 예측할 수 있다(Hatano et al. 1989). 따라서, 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 항산화 활성을 비교하기 위하여, 헤스페레틴 및 헤스페리딘에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다.
구체적으로, DPPH 라디칼 소거 활성은 Dietz et al .(2005)의 방법을 이용하였다. 농도별 헤스페레틴 또는 헤스페리딘 100 ㎕에 80% 메탄올(methanol)로 용해시킨 0.1 mM DPPH용액 900 ㎕를 가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후, Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계(microplate photometer)(Thermo, Filand)를 이용하여 517 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 그 다음, DPPH 라디칼 소거 활성은 하기 [수학식 1]과 같이 계산하였다. 실험 결과 수치는 3회 반복 측정한 평균±표준편차로 나타냈으며, 두 물질간의 차이에 대한 유의성 검증은 독립 t-검정(student's t-test)을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 농도 100 μM부터 농도 의존적으로 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 EDA가 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 DPPH 라디칼 소거 활성이 우수함을 확인하였다(도 2).
<1-2>
헤스페레틴
및
헤스페리딘의
ABTS
라디칼
소거 활성 비교
ABTS 라디칼 소거 활성은 DPPH와 같은 라디칼 소거법에 의한 항산화능 측정법이지만 ABTS와 과황산칼륨(potassium persulfate)을 암소에 방치시켜 화학적 반응을 일으켜 생긴 ABTS+·의 라디칼 용액을 넣어 항산화능을 측정하며, 항산화물질에 의해 ABTS+·이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색된다(Re et al. 1999). 따라서, 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 항산화 활성을 비교하기 위하여, 헤스페레틴 및 헤스페리딘에 대한 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하였다.
구체적으로, ABTS 라디칼 소거 활성은 Re et al .(1999)의 방법을 사용하였다. ABTS 용액은 7.4 mM ABTS[2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)](Sigma-Aldrich, USA)와 2.45 mM 과황산칼륨(Sigma-Aldrich, USA)을 넣고 16시간 동안 냉암소에 보관하여 ABTS+가 형성되게 준비하고, O.D.값이 1.0에 도달하게 인산완충액(pH 7.4)으로 희석하였다. 그 다음, 농도별 헤스페레틴과 헤스페리딘을 100 ㎕에 준비된 ABTS 용액을 900 ㎕씩 첨가하여 6 분 후, Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 734 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 상기 [수학식 1]과 같이 계산하였다. 실험 결과 수치는 3회 반복 측정한 평균±표준편차로 나타냈으며, 두 물질간의 차이에 대한 유의성 검증은 독립 t-검정(student's t-test)을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 EDA가 유의적으로 높게 나타나고, 특히 100 μM부터 헤스페레틴의 EDA가 헤스페리딘의 EDA보다 현저하게 높게 나타나는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 ABTS 라디칼 소거 활성이 우수함을 확인하였다(도 3).
<1-3>
헤스페레틴
및
헤스페리딘의
항산화력
비교
FRAP(ferric reducing antioxidant power) 분석은 시료 내의 총 항산화력을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 3가철이 2가철로 환원시킬 때 2가철이 나타내는 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 평가하는 방법이다(Benzie and Strain 1996). 따라서, 헤스페레틴 및 헤스페리딘의 항산화 활성을 비교하기 위하여, 헤스페레틴 및 헤스페리딘에 대한 FRAP 분석을 수행하였다.
구체적으로, FRAP 분석은 Benzie 과 Strain(1996)의 방법을 사용하였다. FRAP 분석을 위하여, 0.3 M 아세트산나트륨(sodium acetate)(pH 3.6)완충액, 40 mM 염산으로 용해시킨 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-S-triazine) 용액 및 20 mM 염화제2철(ferric chloride) 용액을 제조하였다. 그 다음, 상기 제조된 아세트산나트륨 완충액, TPTZ 용액 및 염화제2철 용액을 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후, 37℃로 유지시켜 FRAP 용액을 준비하였다. 농도별 헤스페레틴과 헤스페리딘 30 ㎕에 FRAP 용액을 100 ㎕에 혼합하여 실온에서 10분간 방치한 후, Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 593 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 실험 결과 수치는 3회 반복 측정한 평균±표준편차로 나타냈으며, 두 물질 간의 차이에 대한 유의성 검증은 독립 t-검정(student's t-test)을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 FRAP가 유의적으로 증가하여 헤스페레틴이 높은 환원력을 나타내는 것을 확인함으로써, 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 항산화력이 우수함을 확인하였다(도 4). 따라서, 상기 <비교예 1>의 결과를 통해 헤스페리딘보다 헤스페레틴의 항산화 활성이 우수함을 확인하였다.
<
실시예
2>
헤스페레틴에
의한 감마선 조사로 유도된 조직 손상 및
산화적
스트레스 예방 효과 확인
<2-1>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 체중, 비장 및 흉선 지수 변화 확인
동물 모델에서 방사선 조사로 인해 체중감소 및 식이 섭취량 감소가 나타남을 볼 수가 있다(Linn et al. 1996; Pradeep et al. 2007). 따라서, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 예방 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스에서 체중, 비장 및 흉선 지수를 측정하였다.
구체적으로, 감마선 조사 후 1일이 지난 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법으로 획득한 5개의 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스를 흡입 마취제로 전신 마취시키고 개복하여 후대정맥에서 혈액을 채취하고, 간, 흉골, 비장, 흉선을 적출하여 냉식염수로 세척한 후 건조시켜 무게를 측정하였다. 비장 및 흉선 지수는 (비장 및 흉선 무게/체중)×100에 의해 계산되었다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 7마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후에 정상대조군의 체중은 19.243±0.353으로 나타났으며, 감마선 조사군의 체중은 18.171±0.289로 정상대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 헤스페레틴 25 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군에서는 19.614±0.295로 감마선 조사군과 비교했을 때 체중이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.
6.5 Gy 이상의 방사선 조사 후 생체 내에서는 방사선에 민감한 조혈 면역계 기관인 비장 및 흉선이 방사선 장해를 받게 되고, 많은 수의 림프구 괴사가 일어나 비장 및 흉선의 부피 및 중량이 감소하는 것으로 알려져 있다(Gough et al. 1977). 실험 결과, 감마선 조사 1일 후에 감마선 조사군의 비장 지수는 0.197±0.004로 정상대조군보다 유의적으로 감소하였으며, 헤스페레틴 25 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군에서는 0.234±0.006으로 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
감마선 조사 1일 후에 감마선 조사군의 흉선 지수는 0.131±0.010로 정상대조군보다 유의적으로 감소하였으며, 헤스페레틴 25 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군에서는 0.200±0.012로 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과를 통해 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 조혈 면역계 기관에 대해 예방 효과가 있음을 확인하였다(표 1).
| 그룹 | 체중(g) | 비장지수 | 흉선지수 |
| 정상대조군 | 19.243±0.353 | 0.425±0.006 | 0.299±0.018 |
| 6 Gy 조사군 | 18.171±0.289# | 0.197±0.004## | 0.131±0.010## |
| 25 mg/kg HT + 6 Gy 조사군 | 19.614±0.295* | 0.234±0.006* | 0.200±0.012* |
| 50 mg/kg HT + 6 Gy 조사군 | 19.214±0.336 | 0.210±0.010 | 0.172±0.013 |
| 100 mg/kg HD + 6 Gy 조사군 | 19.171±0.180 | 0.208±0.003 | 0.157±0.008 |
#p<0.05 및 ##p<0.01은 정상 대조군과 비교하여 중요한 차이를 나타냄.
*p<0.05 및 **p<0.01은 6 Gy 조사군과 비교하여 중요한 차이를 나타냄.
<2-2>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈구 성분 변화 확인
방사선 조사 후에는 말초혈액 내의 면역세포 수가 급격히 감소하며, 회복에 있어서 세포수의 회복이 중요한 요인이 된다는 연구가 보고되어 있다(Patchen et al. 1991). 따라서, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 예방 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액에서의 혈구 성분 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 채취한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액을 혈액응고 방지제인 헤파린(heparin)처리된 튜브에 채취하여 혈액 내 백혈구(white blood cell, WBC) 수를 혈액학적 분석기(HEMAVET HV950, Drew Scientific, Inc., USA)를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 7마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군은 정상대조군에 비해 백혈구(white blood cell, WBC)가 유의적으로 감소하였으며, 헤스페레틴 50 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군은 감마선 조사군과 비교했을 때 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 조혈 세포의 방호와 재생성을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 5).
<2-3>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장의 생화학적 변화 확인
AST와 ALT는 간세포 내에 존재하는 아미노기 전이효소로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 활성이 증가하게 되므로 간독성 검사에 주로 사용된다. AST와 ALP의 경우 간 조직 이외에 신장, 근육, 심장 등에 분포하고 있어 간 손상에 직접적인 원인이 아닐 수 있지만 ALT의 경우는 간 조직에 대부분 분포하고 있기 때문에 ALT 수치가 상승하는 것은 간 손상과 직접적으로 연결되는 것으로 알려져 있다(Recknagel et al. 1989). 또한, 랫트에 감마선을 조사할 경우 혈중 AST와 ALT의 효소 활성이 급격히 증가되는 것으로 알려져 있다(Pradeep et al. 2008). 따라서, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 예방 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액에서의 AST 및 ALT를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 채취한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액이 보관된 채혈 튜브를 3000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고 혈장을 분리하여 4℃에서 저장하였다. 상기 혈장 중 AST와 ALT 측정은 Bergmeye 등(1978)의 방법에 따라 측정하였다. AST와 ALT 기질액 1.0 ㎖를 각각 시험관에 가하여 37℃에서 5분간 방치한 다음 혈장 0.2 ㎖를 넣고 잘 혼합한 후 37℃에서 반응시킨 뒤 DNPH 1 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 20분간 방치하여 반응을 종료시켰다. 마지막으로 0.4 M 수산화나트륨 용액을 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 약 10분간 방치한 후, Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 7마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군의 혈장 중 AST와 ALT는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하여 간독성이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 헤스페레틴과 헤스페리딘을 투여한 후 감마선을 조사한 군에서 감마선 조사군에 비해 ALT와 AST가 유의적으로 감소하였으며, 특히 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 유의적인 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 혈장 내 간손상 지표 효소의 활성 상승을 유의적으로 억제하여 세포 손상을 예방하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 6).
<2-4>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 및
XO
변화 확인
생체막의 주성분인 지질은 X-ray, γ-ray와 같은 이온화 방사선에 의해 산화되어 지질과산화를 나타내는 MDA를 만들어 내며, 이는 산화적 스트레스의 지표가 된다(Emerit et al. 2003). 생체 내에서 XO는 자유라디칼을 생성함으로써 세포에 손상을 주어 지질과산화물을 생성하는 것으로 알려져 있다(Mccord 1985). 따라서, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 예방 효과 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직에서 지질과산화 및 XO(xanthine oxidase)를 측정하였다.
구체적으로, 방사선 조사에 의한 간 조직의 지질과산화 변화를 알아보기 위해 Ohakawa 등(1979)의 방법에 준하여 MDA(malondialdehyde)를 측정하였다. 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 적출한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직은 균질화기기인 Precellys 24-dual(Bertin, France)을 이용하여 인산염 완충액(0.1 M, pH 7.4)을 가하여 10% 균질화 용액으로 만들었으며, 4℃에서 10000×g로 10분 동안 원심분리시켜 상층액을 획득하였다. 상기 상층액 100 ㎕를 취하여 8.1% SDS 용해(lysis) 용액 100 ㎕, 20% TCA 용액 150 ㎕, 0.8% TBA 용액 150 ㎕를 넣고 100℃에서 1시간 동안 반응한 후, 상온에서 식혀 4℃에서 3000×g로 10분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액 300 ㎕와 n-부탄올(n-butanol) 300 ㎕를 섞어 10000×g로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액 200 ㎕를 취하여 Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다(도 7).
또한, 방사선 조사에 의한 간 조직의 XO 변화를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 적출한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직을 측정용 kit 시약(Biovision, USA)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 측정하였다(도 8). 간 조직의 단백질 함량 측정은 Bradford (1976) 방법에 따라 BSA (bovine serum albumin)을 표준품으로 사용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 7마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군의 MDA는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하는 반면, 헤스페레틴과 헤스페리딘을 투여 한 후 감마선을 조사한 군에서는 감마선 조사군에 비해 MDA가 유의적으로 감소하였고, 특히 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 유의적인 감소하는 것을 확인하는 것을 확인하였다(도 7).
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군의 XO는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하는 반면, 헤스페레틴 50 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군은 감마선 조사군에 비해 XO가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 8). 따라서, 상기 결과를 통해 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 따른 간조직 내 지질과산화작용 상승과 XO의 상승도 유의적으로 억제하여 세포 손상을 예방하고 세포를 보호함을 확인하였다.
<2-5>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 항산화 물질 및 항산화 효소 변화 확인
방사선에 의해 생성되는 과도한 자유라디칼은 생체 내의 항산화 물질이나 항산화 효소에 의해 제거되거나 생성이 억제된다. 생체 내에 존재하는 항산화 물질에는 환원형 GSH(glutathione)가 존재하며, 이 물질은 자유라디칼의 소거제 역할과 H2O2 및 지질과산화를 대사시키는 GPx(glutathione peroxidase)의 기질로 작용한다. 생체 내에 존재하는 항산화 효소에는 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), GPx가 존재하며, SOD는 O2 -를 H2O2로 전환시키고, 카탈라아제와 GPx는 이 H2O2를 물로 분해하여 세포내 라디칼을 제거하는 기능을 한다(Fridovich I. 1986). 동물에 감마선을 조사할 경우 항산화 물질인 GSH와 항산화 효소인 SOD, 카탈라아제, GPx가 산화적 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 활성의 감소가 나타나는 것으로 알려져 있다(Pratheeshkumar and Kuttan 2010; Pradeep 2012). 따라서, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 산화적 손상에 대한 예방 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직에서 항산화 물질인 GSH, 및 항산화 효소인 SOD, 카탈라아제 및 GPx를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 적출한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직에서 측정용 키트(kit) 시약(Biovision, USA)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 GSH를 측정하고(도 9), SOD, 카탈라아제 및 GPx를 측정하였다(도 10). 간 조직의 단백질 함량 측정은 Bradford (1976) 방법에 따라 BSA (bovine serum albumin)을 표준품으로 사용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 7마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군의 GSH는 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 반면, 헤스페레틴 50 mg/kg을 투여한 후 감마선을 조사한 군은 감마선 조사군에 비해 GSH가 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 따른 간조직 내 항산화 물질의 감소를 유의적으로 억제시켜 세포 손상을 예방하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 9).
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 1일 후 감마선 조사군의 SOD, 카탈라아제 및 GPx는 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 반면, 헤스페레틴과 헤스페리딘을 투여 한 후 감마선을 조사한 군은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다, 특히, SOD 및 카탈라아제의 경우 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 따른 간조직 내 항산화 효소의 감소를 유의적으로 억제시켜 세포 손상을 예방하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 10).
<2-6>
헤스페레틴
투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 조직학적 형태 확인
감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 세포 손상에 대한 예방 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 적출한 5개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골을 적출하고, 적출된 흉골 조직은 조직병리학적 분석을 위해 10% 포르말린에 고정시켰다. 그 다음, 고정된 흉골 조직을 에탄올(ethanol)과 크실렌(xylene)에 순차적으로 세척하고, 파라핀 왁스에 넣는 과정을 진행한 후, 미세절편기(Leica Microsystems, Germany)을 이용하여 5 ㎛ 두께로 잘랐다. 그 다음, 왁스를 제거시키고 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색시켜 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 정상대조군의 골수세포 충실도는 높았지만, 감마선 조사군의 골수세포는 거의 소실된 상태로 골수세포의 손상을 나타내는 것을 확인하였다. 한편, 감마선 조사 전 헤스페레틴을 투여한 군은 농도의존적으로 감마선 조사군보다 골수세포 소실이 적게 나타나 손상을 억제시킴으로써, 감마선 조사 전 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사에 따른 조직 손상을 예방시킴을 확인하였다(도 11).
<
실시예
3>
헤스페레틴에
의한 감마선 조사로 유도된 조직 손상 및
산화적
스트레스 치료 효과 확인
<3-1>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 체중, 비장 및 흉선 지수 변화 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 치료 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스에서 체중, 비장 및 흉선 지수를 측정하였다.
구체적으로, 감마선 조사 후 7일이 지난 상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법으로 획득한 6개의 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스를 상기 실시예 <2-1>과 같이 혈액을 채취하고, 간, 흉골, 비장을 적출하여 무게를 측정하고(도 12), 비장 지수를 계산하였다(도 13). 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 6마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후에 정상대조군의 체중은 102.24%로 나타났으며, 감마선 조사군의 체중은 89.51%로 정상대조군에 비해 감소하는 반면, 조사한 후 헤스페레틴 25, 50 mg/kg을 투여한 군은 각각 98.95%, 96.84%로 감마선 대조군과 비교했을 때 체중이 회복됨을 확인하였다(도 12).
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후에 감마선 조사군의 비장 지수는 정상대조군보다 유의적으로 감소하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 섭취한 군에서는 농도 의존적으로 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하여 방사선에 의한 비장 손상이 회복됨을 확인하였다. 따라서, 상기 결과를 통해 방사선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 조혈세포의 방호와 재생성을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 13).
<3-2>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈구 성분 변화 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 치료 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액에서의 혈구 성분 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 채취한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액 내 백혈구(WBC), 호중구(neurophil) 및 림프구(lymphocyte) 수를 상기 실시예 <2-2>와 혈액학적 분석기를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 6마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군은 정상대조군에 비해 백혈구, 호중구 및 림프구 수 모두 유의적으로 감소하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페리딘을 투여한 군은 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가를 보이는 것을 확인하였다. 또한, 헤스페레틴 50 mg/kg을 투여한 군은 감마선 조사군과 비교했을 때 유의성은 나타나지 않았지만 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구가 증가하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 조혈 세포의 재생성을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다(표 2).
| 그룹 | WBC(K/㎕) | 호중구(K/㎕) | 림프구(K/㎕) | 단핵구(K/㎕) |
| 정상대조군 | 4.51±0.03 | 1.54±0.99 | 2.64±0.96 | 0.28±0.10 |
| 50 mg/kg HT 군 | 3.46±0.67 | 0.55±0.26 | 2.58±0.5 | 0.26±0.13 |
| 6 Gy 조사군 | 0.33±0.11 | 0.08±0.026 | 0.20±0.70 | 0.04±0.02 |
| 6 Gy 조사 + 25 mg/kg HT 군 | 0.35±0.03 | 0.12±0.03 | 0.17±0.27 | 0.04±0.01 |
| 6 Gy 조사 + 50 mg/kg HT 군 | 0.58±0.44 | 0.14±0.1 | 0.25±0.14 | 0.17±0.28 |
| 6 Gy 조사 + 100 mg/kg HD 군 | 0.86±0.29* | 0.29±0.1* | 0.44±0.16* | 0.06±0.04 |
#p<0.05 및 ##p<0.01은 정상 대조군과 비교하여 중요한 차이를 나타냄.
*p<0.05 및 **p<0.01은 6 Gy 조사군과 비교하여 중요한 차이를 나타냄.
<3-3>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈장의 생화학적 변화 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 치료 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액에서의 AST 및 ALT를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 채취한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 혈액에서 상기 실시예 <2-3>과 같이 혈장을 분리하고, 혈장 중 AST 및 ALT를 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 6마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군의 혈장 중 AST 및 ALT는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하여 간독성이 나타나는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군에서는 감마선 조사군에 비해 ALT 및 AST가 유의적으로 감소하여 간 손상이 적게 나타나고, 특히 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 유의적인 감소를 보임을 확인하였다. 따라서, 상기 결과를 통해 방사선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 의한 혈장 내 간손상 지표 효소의 활성 상승을 유의적으로 억제하여 세포 손상을 치료하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 14).
<3-4>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 지질과산화 및
XO
변화 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 손상에 대한 치료 효과 및 산화적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직에서 지질과산화 및 XO를 측정하였다.
구체적으로, 방사선 조사에 의한 간 조직의 지질과산화 변화를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 적출한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 후 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직을 상기 실시예 <2-4>와 같이 균질화하여 상층액을 획득하고, MDA를 측정하였다(도 15).
또한, 방사선 조사에 의한 간 조직의 XO 변화를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 적출한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직에서 상기 실시예 <2-4>와 같이 XO를 측정하였다(도 16). 간 조직의 단백질 함량 측정은 Bradford (1976) 방법에 따라 BSA (bovine serum albumin)을 표준품으로 사용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 6마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군의 MDA는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴과 헤스페리딘을 투여한 군에서는 감마선 조사군에 비해 MDA가 유의적으로 감소하며, 특히 헤스페레틴이 헤스페리딘보다 유의적인 감소를 보이는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 따른 간 조직 내 지질과산화작용 상승을 억제하여 세포 손상을 치료하고 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다(도 15).
또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군의 XO는 정상대조군과 비교하였을 때 유의적으로 증가하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴 50 mg/kg을 투여한 군에서 감마선 조사군에 비해 XO가 유의적으로 감소하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 후 헤스페레틴 투여가 방사선 조사에 따른 간 조직 내 XO의 상승을 억제하여 세포 손상을 치료하고 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다(도 16).
<3-5>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직의 항산화 물질 및 항산화 효소 변화 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 산화적 손상에 대한 치료 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 간 조직에서 항산화 물질인 GSH, 및 항산화 효소인 SOD, 카탈라아제 및 GPx를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 적출한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스 간 조직을 이용하여 상기 실시예 <2-5>와 같이 GSH를 측정하고(도 17), SOD, 카탈라아제 및 GPx를 측정하였다(도 18). 간 조직의 단백질 함량 측정은 Bradford (1976) 방법에 따라 BSA (bovine serum albumin)을 표준품으로 사용하여 측정하였다. 실험 결과는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 수행되었고, 내부 군 비교는 Tukey 다중비교분석(Tukey's multiple comparision test)를 이용하여 수행되었다. 수치는 각 군의 6마리에 대하여 평균±표준편차로 표현되었다. P 값<0.05인 경우 유의한 것으로 고려되었다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군의 GSH는 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴과 헤스페리딘을 투여한 군에서는 감마선 조사군에 비해 GSH가 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써, 방사선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 방사선 조사에 따른 간조직 내 항산화 물질의 감소를 유의적으로 회복시켜 세포 손상을 치료하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 17).
또한, 도 18에 나타낸 바와 같이, 감마선 조사 7일 후 감마선 조사군의 SOD, 카탈라아제 및 GPx는 정상대조군에 비해 유의적으로 감소하는 반면, 감마선 조사 후 헤스페레틴 25 mg/kg 투여군에서 SOD, 카탈라아제 및 GPx가 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가함하는 것을 확인하였다. 특히, 감마선 조사 후 헤스페레틴 50 mg/kg과 헤스페리딘 100 mg/kg 투여군에서는 GPx만 감마선 조사군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써, 감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사에 따른 간 조직 내 항산화 효소의 감소를 유의적으로 회복시켜 세포 손상을 치료하고 세포를 보호함을 확인하였다(도 18).
<3-6>
헤스페레틴
투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 조직학적 형태 확인
감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사로 유도된 세포 손상에 대한 치료 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골 조직 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 적출한 6개 실험군의 헤스페레틴 투여 전 감마선 조사로 유도된 조직 손상 마우스의 흉골을 적출하고, 적출된 흉골 조직은 조직병리학적 분석을 위해 10% 포르말린에 고정시켰다. 그 다음, 고정된 흉골 조직을 에탄올(ethanol)과 크실렌(xylene)에 순차적으로 세척하고, 파라핀 왁스에 넣는 과정을 진행한 후, 미세절편기(Leica Microsystems, Germany)을 이용하여 5 ㎛ 두께로 잘랐다. 그 다음, 왁스를 제거시키고 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색시켜 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 헤스페레틴을 단독으로 투여한 군의 골수세포 충실도는 높았지만, 감마선 조사군의 골수세포는 거의 소실된 상태로 골수세포의 손상을 나타내는 것을 확인하였다. 한편, 감마선 조사 후 헤스페레틴을 투여한 군은 감마선 조사군보다 골수세포 소실이 적게 나타났으며, 회복되는 경향이 관찰함으로써, 감마선 조사 후 헤스페레틴의 투여가 감마선 조사에 따른 조직 손상을 회복시킴을 확인하였다(도 19).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1>
산제의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2>
정제의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
<1-3>
캡슐제의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 g
옥수수전분 5 g
카르복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 주사제의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<1-5>
액제의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<제조예 2> 건강식품의 제조
<2-1> 밀가루 식품의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이를 혼합한 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<2-2>
스프
및 육즙(
gravies
)의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<2-4> 유제품(dairy products)의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-5>
선식의
제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화한 후 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및, 본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 하기의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<2-6> 건강보조식품의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였으나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제조예 3> 건강 음료의 제조
헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 ㎎
구연산 100 ㎎
올리고당 100 ㎎
매실농축액 2 ㎎
타우린 100 ㎎
정제수를 가하여 전체 500 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였으나, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
Claims (15)
- 헤스페레틴(hesperetin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 헤스페레틴은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
- 제 1항에 있어서, 상기 방사선은 UV, X선, α선, β선, γ선, 전자선 및 중성자선으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 조혈계 또는 간의 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 감소되는 체중을 회복시키는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 증가되는 혈청 표식 효소인 아스파테이트 트랜스아미나제(aspartate aminotransferase, AST) 또는 알라닌 트랜스아미나제(alanine aminotransferase, ALT)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 증가되는 지질과산화 및 XO 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 효소성 항산화제인 활성산소 제거효소(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase) 또는 GPx(glutathione peroxidase)의 활성을 회복시키는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 항산화 물질인 GSH(glutathione)의 활성을 회복시키는 것을 특징으로 하는 헤스페레틴을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 후 감소하는 혈구의 수를 회복시키는 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의하여 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호제.
- 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의한 세포 또는 조직 손상 예방 및 개선용 건강식품.
- 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선에 의해 유발되는 산화적 스트레스 예방 및 개선용 건강식품.
- 헤스페레틴 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 건강식품.
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