KR20170043657A - 국소 지방 및 체중 감소용 조성물 및 그의 제약 및 용도 - Google Patents

Abstract

국소 지방 및 체중 감소용 조성물, 및 그의 제약 및 용도가 본 발명에 개시되어 있다. 조성물은 레스베라트롤 및 커큐민 추출물을 1:30 내지 10:1의 중량비로 함유한다. 본 발명의 조성물 및 그의 제약은 지방세포의 성장을 억제할 수 있고, 지방세포의 계획된 아폽토시스를 유발할 수 있으며, 주위 세포 또는 조직의 염증 또는 괴사 및 주위 조직의 염증 또는 통증 반응을 유발하지 않아, 선행기술에서 사용된 지방 흡입 또는 저침습성 지방-용해 장치에 의해 유발되는 조직 손상 및 염증성 통증의 문제 및 세포 파괴에 의해 촉발되는 주위 조직 염증과 괴사 감염 및 지방-용해 주사 성분인 포스파티딜콜린 또는 소듐 데옥시콜레이트에 의해 유발되는 괴사와 같은 문제를 피하면서, 지방세포 감소 및 국소 지방 침착 감소 및 체중 감소의 효과를 달성할 수 있다.

Description

국소 지방 및 체중 감소용 조성물 및 그의 제약 및 용도 {COMPOSITION FOR REDUCING LOCAL FAT AND BODY WEIGHT, AND PHARMACEUTICALS AND USE THEREOF}

본 발명은 조성물, 또한 보다 특히 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 조성물의 적용, 또한 보다 특히 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 적용에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 조성물을 포함하는 제약 조성물, 또한 보다 특히 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 적용, 또한 보다 특히 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물의 적용에 관한 것이다.

점점 더 많은 사람들이 미에 대한 개념이 달라지고, 그들의 개인 건강, 체형 및 체중에 관한 기준이 높아짐에 따라, 체중 감량 및 신체 윤곽술은 더 이상 비만인들만의 관심사가 아니다. 그에 따라, 체중 감량 및 피트니스 센터와 체중 관리 시장의 붐이 일어나, 예컨대 다이어트 식품, 피트니스 제품, 체중 감량 임상 관리, 의료 기구, 피트니스 기구 등의 상대적인 성장이 추진되었다. 마켓앤드마켓(Marketsand Markets)이 발간한 통계 보고서 "Global Weight Loss and Gain Market 2009-2014"에 따르면, 전세계적으로 체중 관리 시장이 2014년의 5,863억 달러에서 2015년에 6,509억 달러로 성장할 수 있을 것이라 추정되었고; 그 중 최대 시장이 미국이고, 그 시장 규모는 3,100억 달러에 이를 것이라 추정되며, 두번째로 큰 시장인 유럽의 시장 규모는 2,380억 달러로 추정되었다. 그와 동시에, 건강, 특히 비만이 유발하는 만성 질환의 후속 효과에 대한 소비자의 관심이 증가함으로 인해서, 그것이 전세계적으로 점점 더 중요한 현안이 되었고; 그에 따라 비만 인구 이외에도, 건강한 인구를 대상으로 점점 더 많은 사람들이 적극적으로 체중 조절 및 신체 윤곽술을 개발하고 있으며, 이는 체중 조절 및 신체 윤곽술에 대하여 모든 산업의 집중적인 관심을 끌어냈고 산업에서 개발 붐을 일으켰는데, 상기에 언급된 이유가 모두 시장이 꾸준히 성장할 수 있었던 주요 이유이다. 2012년에 발간된 미국성형외과학회 (American Society of Plastic Surgeons; ASPS)의 통계 자료에 따르면, 신체 윤곽술의 수요가 성형 수술 분야에서 줄곧 1위를 차지하였고 이 수요는 2017년까지 약 12.3%의 연간 성장률을 유지할 것이라 추정되었다. 리서치앤드마켓(Research and Markets)에 의해 발표된 "Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecasts"는 신체 윤곽술 기구의 세계 시장이 2010년에 9억 달러에 달하였고 2017년에 20억 달러까지 증가할 것이라 추정하였다. 신체 윤곽술 시장의 수요가 거대하고 매년 계속해서 성장하고 있기 때문에, 다양한 방식의 지방 흡입 및 지방 분해 방법이 시장에 출현하였다. 한편, 위험성이 크거나 또는 안전하지 못한 다수의 의학적 치료법이 또한 연달아 출현하였다.

전통적인 지방 흡입술은 1970년대 초에 개발되었는데; 임의의 수액 없이 음압 하에 건식 지방 흡입에 의해 이루어지는 지방 흡입 방식 때문에, 피하 신경과 혈관이 크게 손상되고; 게다가, 출혈량이 많으며 수술의 위험성이 크다. 튜메슨트(tumescent) 지방 흡입 및 과습식 지방 흡입이 후속 개발되었다. 튜메슨트 지방 흡입은 마취제와 혈관 수축제를 수액에 첨가하는 방식이나, 이 방법에서는 국소 마취가 정맥 마취를 대체하는데, 다량의 수액으로 인해 마취제가 대사되는데 적어도 12시간이 필요하므로, 국소 마취제의 인체에 대한 가능한 위험성이 증가한다. 최근에, 대용량 지방 흡입에 사용하기 위해 의사가 바람직하게 선택하는 방법은 과습식 지방 흡입이며, 그의 특징은 수액의 용량 교환이 추출 지방과 동일해야 하고 과부하 주입의 가능성이 효과적으로 감소될 수 있는 것이다. 그러나, 임상적으로, 투여 부위에 있어서 한계가 있는데, 부위가 주로 지방 축적량이 많은 영역, 예컨대 복부 및 넓적다리 등이고; 한편으로는 지방 흡입의 효과 및 안전성이 전적으로 외과의의 기술과 능력에 따라 좌우된다. 지방 흡입 과정은 많은 신체 손상을 초래하고, 시간이 걸리며, 또한 심한 수술후 멍, 부종, 통증 및 감각 마비, 반흔 조직, 거친 피부 표면과 같은 부작용을 유발할 것이며; 4주에서 6주 정도의 회복 기간이 걸릴 수 있다. 지방 흡입의 너무 긴 수술 시간 때문에, 다량의 출혈이 직접적으로 수술 위험성을 증가시킨다. 그에 따라, 다양한 보조 지방 흡입 장비가 모든 산업에서 고안되고 있어, 초음파 및 레이저와 같은 지방 흡입의 보조 방법이 연달아서 개발되었는데, 핵심 인자는 여전히 집도하는 외과의의 기술이다. 추가적으로, 적절한 보조 지방 흡입 장비를 사용하여도 조직 화상 또는 미비한 효과의 사례가 자주 발생한다. 지방 흡입이 직면한 단점을 고려하여, 모든 산업이 지속적으로 기술과 장비 양측면 모두에서 개선을 이루어 왔고; 미국과 유럽의 미용 의료 산업은 1980년대 이후로 미용 의료 기구의 개발에 초점을 맞추고 있다. 체중 조절 및 신체 윤곽술 분야에서, 제조회사들은 그들의 주요 관심을 전통적인 지방 흡입에서 최소 침습성 및 심지어 비침습성 지방 분해 장비로 진화시켰다. 지방 분해 제품 또는 장비의 목표는 다량의 출혈, 너무 긴 회복 기간, 수술후 반흔의 전통적인 단점을 개선하고, 가능한 한 덜 침습성이도록 하고, 안전성이 높게 하며, 편리하게 하고, 상처를 작게 하고, 또한 짧은 회복 기간을 갖도록 노력함과 동시에; 충분한 장점으로 미용 의료 시장에 진입하도록 하기 위해 우수한 효과 및 경쟁력 있는 가격의 장점을 유지하는 것이다.

메조테라피(mesotherapy)를 사용하는 지방 분해법이 있는데, 이는 지방 분해를 위해 비만인 부위에 활성 성분으로서 포스파티딜콜린 또는 소듐 데옥시콜레이트의 주사를 이용한다. 이러한 종류의 성분의 구조는 세포 막 성분과 유사하고; 따라서 이들은 지방 세포의 세포 막을 파괴할 수 있고 세포 괴사를 촉발할 수 있다. 이러한 종류의 의약을 중배엽에 주사하면 방대한 지방 세포 괴사를 일으켜 후속적으로 지방 배출을 초래할 것이고; 의약이 특이성을 갖지 않기 때문에, 즉 지방세포만을 표적으로 하는 것이 아니기 때문에, 수많은 정상 주위 세포 역시 영향을 받아 괴사를 유발할 것이고, 또한 세포 괴사는 주위 조직이 일련의 염증 반응을 개시하도록 하여, 더 나아가 투여 부위의 염증, 심한 통증, 및 부종을 유발하고, 또한 심지어 국소 조직 괴사 또는 감염의 위험을 초래할 것이다. 거대한 지방 흡입 장비를 사용하는 것과 비교하여, 주사에 의한 지방 분해법은 투여 부위에 있어서의 한계를 극복할 수 있지만, 하나의 지방 분해 주사 치료 과정은 지방 분해 효과의 목표를 달성하기 위해 2주마다 수십 번의 주사와 1 내지 6번의 치료 과정(들)을 필요로 할 수 있다. 마취제가 주사액에 첨가되어도, 마취가 진정된 후에는 주사 부위에서 여전히 심한 염증과 통증을 겪을 수 있고, 또한 치료 및 주사 빈도수가 개선되어야 할 필요가 있다. 심한 수술후 통증, 신경 마비, 국소 조직 괴사 또는 감염의 위험성, 단일 주사에서의 제한된 투여량, 및 얼굴로 제한되는 적용을 고려하여, 대부분의 외과의는 환자의 국소 지방 감소를 위해 상기에 언급된 성분을 더 이상 주사하지 않으며; 미국에서는 소듐 데옥시콜레이트로 제조된 최초 지방 분해 주사 제품이 승인되었지만, 어느 정도의 부작용이 있으며 이중 턱에 대해서만 사용될 수 있어, 그의 사용이 제한된다. 종합하면, 국소 지방을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 보다 감소한 부작용을 가지며, 보다 안전한 제품이 현 시장에 존재하지 않으므로; 외과의와 소비자의 높은 수요에 따라, 보다 안전하고, 감소한 부작용을 가지며, 언급된 단점과 한계를 극복할 수 있는 국소 지방 분해 주사 제제를 개발하는 것이 시장의 추세이다.

본 발명은 1:30 내지 10:1 범위의 중량비로 레스베라트롤(resveratrol) 대 강황 추출물을 포함하는, 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 레스베라트롤 대 강황 추출물의 중량비는 1:19이다.

본 발명의 조성물은 지방세포 성장을 억제하고 계획된 지방세포 아폽토시스를 유도하여 국소 지방 침착을 줄이고 지방세포를 감소시키는 효과를 달성할 수 있고; 또한 체중을 감소시킬 수 있지만, 주위 세포 및 조직의 염증 또는 조직 괴사를 유발하지 않고, 주위 조직에 대하여 염증 또는 심한 통증을 유발하지 않을 것이므로, 상기에 언급된 지방 흡입술 또는 저침습성 지방 분해 장비에 의해 유발되는 조직 손상, 염증 및 통증을 피한다. 게다가, 본 발명의 조성물은 괴사를 유발하지 않을 것이고, 지방 분해 주사 조성물 성분인 포스파티딜콜린 또는 소듐 데옥시콜레이트에 의해 유발되는 괴사로 촉발되는 주위 조직 염증 또는 주위 조직 감염과 같은 문제를 초래하지 않을 것이다. 본 발명은 또한 체중을 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 본원에 사용된 용어 "강황 추출물"은 커큐민(curcumin)을 포함하는 추출물을 말하고, 여기서 강황 추출물은 80% 내지 100%의 커큐민을 포함한다.

본 발명은 또한 레스베라트롤 및 강황 추출물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 레스베라트롤 및 강황 추출물을 포함하는 조성물을, 제약상 허용되는 염 조성물, 제약상 허용되는 안정화제 또는 정균제, 또는 제약상 허용되는 유화제, 부형제, 예컨대 계면활성제, 마취제 중 적어도 1종과 혼합하고; 혼합물을 주사 제제로 제조하는 것을 포함한다.

바람직하게는, 안정화제는 크실리톨, 소르비톨, 폴리덱스트로스, 이소말트 또는 덱스트로스를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, "제약상 허용되는 부형제"는 윤활제, 현탁화제, 가용화제, 활택제, 유화제 또는 계면활성제를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 필요한 부형제의 양은 활성 성분의 양에 따라 달라질 것이고, 1종의 부형제가 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.

바람직하게는, 윤활제는 한천, 칼슘 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레이트, 글리세린, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 산화마그네슘, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 폴록사머, 에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 스테아로일 산, 소르비톨, 스테아르산, 활석, 또는 아연 스테아레이트를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 현탁화제는 만니톨, 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), CMC-Na를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 가용화제는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린, 트윈(tween) 80, 또는 피마자유를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 활택제는 마그네슘 스테아레이트, 이산화규소, 삼규산마그네슘, 분말 셀룰로스, 전분, 활석, 삼염기성 인산칼슘, 규산칼슘, 규산마그네슘, 콜로이드성 이산화규소, 실리콘 히드로겔 등과 같은 물질을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 유화제는 대두 레시틴, 레시틴, 모노글리세리드, 디글리세리드, 소듐 스테아레이트, 지방산의 소르비탄 에스테르, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 천연 인지질일 수 있다.

바람직하게는, 계면활성제는 트윈, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르), 트리톤(Triton)-X, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 또는 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명은 추가로 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물의 제조에 있어서의 조성물의 적용을 제공한다.

본 발명은 추가로 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물을 제공하고; 여기서 제약 조성물은 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 조성물의 유효 투여량 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 액체, 반-고체 및 고체 제약 형태를 비제한적으로 포함하는, 여러 형태로 존재할 수 있다. 그 예로는 액체 용액 (예를 들어, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액, 현탁액, 분말, 동결건조 분말, 또는 리포솜, 또는 경피형 연고 또는 패치가 있다. 바람직한 형태는 예상되는 투여 모드 및 치료 적용에 따라 달라진다. 바람직하게는, 본 발명의 제약 조성물은 주입 용액 형태이고, 바람직한 투여 모드는 비-장형(non-intestinal) 모드, 예컨대 주사 용액이다. 본 발명의 실시양태에서, 제약 조성물은 피하 투여되었을 때 국소 지방을 감소시키는 유효 투여량의 레스베라트롤 및 강황 추출물 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 국소 지방을 감소시키는 유효 투여량의 레스베라트롤 및 강황 추출물 조성물을 포함하는 제약 조성물은 피하 주사에 의해 피하 지방에 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, 연고 제제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 활성 작용제, 왁스, 물, 페트롤라툼, 보존제, 고급 알콜, 다가 알콜, 유화제, 용매, 증점제, 가소제, 방향제, 완충제, 항생제, 안정화제 또는 이들의 혼합물을 비제한적으로 포함한다.

본 발명의 제약 조성물의 투여량은 상이한 파라미터에 따라 조정될 수 있다. 이러한 파라미터에는 대상체의 유형, 대상체의 체중, 및 대상체의 국소 지방 두께 및 면적이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 제약 조성물은 24시간 이내에 1번, 여러 번 또는 지속적으로 투여될 수 있고, 또한 주 단위로 또는 월 단위로 여러 번 또는 지속적으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 주사, 피하 이식, 이식형 주입, 연고, 또는 패치에 의한 것이다. 바람직하게는, 주사 방법은 피하 주사, 피하 이식, 정맥내 점적, 정맥내 주입 펌프 방법, 이식형 주입 펌프 방법을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명은 추가로 레스베라트롤 및 강황 추출물 조성물을 포함하는 제약 조성물의 유효 투여량을 대상체의 국소 부위에 투여하여, 대상체의 국소 부위에서 지방세포 성장을 억제하고, 지방세포 아폽토시스를 촉진하고, 지방 침착을 감소시키고, 체중을 감소시키는 효과를 달성하도록 하는 것을 포함하는, 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물의 적용을 제공한다.

바람직하게는, 대상체는 인간 또는 동물이다.

바람직하게는, 매번 대상체에게 투여되는 제약 조성물의 유효 투여량은 0.4 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 보다 바람직하게는, 매번 대상체에게 투여되는 제약 조성물의 유효 투여량은 1 mg/kg 내지 60 mg/kg이다.

바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "체중 감소"란 대상체의 체중 증가를 5% 내지 30% 감소시키는 것을 말한다.

본 발명에 따르면, 본원에 사용된 용어 "국소 지방 감소"란 본 발명의 레스베라트롤 및 강황 추출물을 포함하는 조성물의 유효 투여량을 투여한 후에, 지방세포 성장이 억제될 수 있고, 지방세포가 절차상의 또는 계획된 아폽토시스를 개시하고, 국소 침착 지방이 감소할 수 있는 것을 말한다. 본 발명의 실시양태에서 알 수 있는 것처럼, 국소 지방 감소량은 레스베라트롤 및 강황 추출물을 포함하는 조성물의 특정 범위의 투여량을 투여하고, 특정 기간에 걸쳐서 래트의 지방세포의 성장 억제율, 세포 아폽토시스 정도, 및 피하 지방 및 내장 지방의 변화를 측정함으로써 검출가능하다. 바람직하게는, 국소 지방은 피하 지방, 내장 지방, 국소 침착 지방, 또는 지방세포를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 국소 지방 부위는 얼굴, 턱, 팔, 허리, 복부 또는 넓적다리를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물 또는 제약 조성물의 효과는 단독으로 투여되는 레스베라트롤 또는 강황 추출물의 효과보다 상당히 우수하다. 뿐만 아니라, 국소 지방을 감소시키기 위해 국소 주사에 의해, 단독으로 또는 함께 투여되는 레스베라트롤 또는 강황 추출물의 선례가 없었다. 추가로, 본 발명은 기본적으로 국소 주사를 통해 의약을 투여함으로써, 주위 세포 또는 조직에 영향을 주지 않으면서, 또한 동물 분석에서 확인되는 유의한 부작용 없이, 지방세포 성장을 억제하고 지방세포 아폽토시스를 촉진하여 국소 지방을 감소시키는 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 제약 조성물은 보다 감소한 부작용으로 더욱 안전하다. 본 발명에서 조성물 또는 제약 조성물의 기술 수준은 기존의 기술 또는 제품과 완전히 상이하다. 따라서, 종래의 지방 흡입술, 지방 분해 장비, 예컨대 고강도 집속 초음파 지방 분해 장비, 또는 지방 분해 주사 성분, 예컨대 포스파티딜콜린 및 소듐 데옥시콜레이트에 의해 유발되는 국소 세포 괴사, 심한 통증, 염증 및 괴사 및/또는 주위 조직의 감염 문제를 피하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 수술후 멍, 부종, 통증 및 감각 마비를 또한 유의하게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 환자의 회복 기간을 단축시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 MTT 분석으로 시험한 각 그룹에서의 지방전구세포의 성장 억제 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 MTT 분석으로 시험한 각 그룹에서의 분화 지방세포의 성장 억제 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 MTT 분석으로 시험한 성숙 지방세포의 성장 억제에 대한 제제 UL003C 및 소듐 데옥시콜레이트의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 아넥신(Annexin) V/PI로 표지한 다음, 유세포 분석기로 검출함으로써 얻어진, 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 제제 UL003A, UL003C 및 UL003R의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 카스파제(caspase) 3 염색을 수행한 다음, 유세포 분석기로 검출함으로써 얻어진, 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 제제 UL003A, UL003C 및 UL003R의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 본 발명에서 카스파제 3 염색을 수행한 다음, 유세포 분석기로 검출함으로써 얻어진, 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 강황 추출물, 레스베라트롤 및 제제 UL003C의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 아넥신 V/PI로 표지한 다음, 유세포 분석기로 검출함으로써 얻어진, 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 제제 UL003C 및 소듐 데옥시콜레이트의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은 국소 지방 증가를 유도하기 위해 래트에게 고지방 사료를 제공한 후에, 본 발명에서 주사를 통해 의약을 국소 투여한 각 그룹에서의 래트의 체중 변화를 나타내는 선 그래프이다.
도 9는 국소 지방 증가를 유도하기 위해 래트에게 고지방 사료를 제공한 후에, 본 발명에서 주사를 통해 의약을 국소 투여한 각 그룹에서의 래트의 피하 지방 감소율을 도시한다.
도 10a는 국소 지방 증가를 유도하기 위해 래트에게 고지방 사료를 제공한 후에, 본 발명에서 주사를 통해 의약을 국소 투여한 각 그룹에서의 래트의 혈청 생화학 지표 (크레아티닌 및 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제 (GOT))를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10b는 국소 지방 증가를 유도하기 위해 래트에게 고지방 사료를 제공한 후에, 본 발명에서 주사를 통해 의약을 국소 투여한 각 그룹에서의 래트의 혈청 생화학 지표 (우레아 및 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제 (GTP))를 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 국소 지방 증가를 유도하기 위해 래트에게 고지방 사료를 제공한 후에, 본 발명에서 주사를 통해 의약을 국소 투여한 각 그룹에서의 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)에 의해 검출된 아폽토시스 관련 단백질, 예컨대 Bax 및 Bcl-2의 발현 및 Bax/Bcl-2의 비율을 나타내는 막대 그래프이다.

의도된 발명의 목적을 달성하기 위해 이용된 기술적 수단이, 본 발명의 도면 및 바람직한 실시양태를 동반하여, 하기에서 자세히 설명될 수 있다.

실시양태 1: 지방전구세포의 성장 억제 분석

본 실시양태에서는, 3T3-L1 지방전구세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁴개의 세포로 인큐베이션하였다. DMSO 용액 대조군 (대조군)을 제외하고는, 50 ppm의 레스베라트롤, 50 ppm의 강황 추출물, 80 ppm의 녹차 추출물, 및 100 ppm의 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 또는 UL003R을 각각 상이한 웰에 첨가하였다. 7개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 48시간의 인큐베이션 후에, 세포의 성장 상태를 기록하기 위해 사진을 촬영하였고, 각 그룹에서의 3T3-L1 지방전구세포의 성장 억제 효과를 MTT 분석에 의해 분석하였다. 조성물 UL003A는 레스베라트롤 대 녹차 추출물의 중량비가 9:1이고; 조성물 UL003C는 레스베라트롤 대 강황 추출물의 중량비가 1:19이며; 조성물 UL003R은 레스베라트롤 대 강황 추출물의 중량비가 9:1이다. 모든 그룹의 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. 문자 a, b, c, d 및 e는 통계 결과를 나타낸다. 상이한 문자는 그룹 간의 통계적 차이를 나타낸다 (p<0.05).

결과가 도 1과 같이 도시되는데, DMSO 용매 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R은 모두 지방전구세포 성장을 효과적으로 억제할 수 있었고 (p<0.05); 단일 식물 추출물 그룹과 비교하여, 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R은 우수한 억제 효과를 가지며 차이가 유의하였다 (p<0.05).

실시양태 2: 분화 지방세포의 성장 억제 분석

본 실시양태에서는, 3T3-L1 지방전구세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁵개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린 분화제, 1 μM의 덱사메타손, 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 배지로 대체하였다. DMSO, 50 ppm의 레스베라트롤, 50 ppm의 강황 추출물, 80 ppm의 녹차 추출물, 및 100 ppm의 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 또는 UL003R을 각각 상이한 웰에 첨가하였고, 여기서 DMSO가 첨가된 그룹은 대조군이었다. 7개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 48시간의 인큐베이션 후에, 세포의 성장 상태를 기록하기 위해 사진을 촬영하였고, 분화 지방세포에 대한 각 실험 물질의 억제 효과를 MTT 분석에 의해 분석하였다. 모든 그룹의 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. 문자 a, b, c, d, e 및 f는 통계 결과를 나타낸다. 상이한 문자는 그룹 간의 통계적 차이를 나타낸다 (p<0.05).

결과가 도 2와 같이 도시되는데, DMSO 용매 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R은 모두 분화 지방세포 성장을 유의하게 억제할 수 있었고 (p<0.05), 여기서 조성물 UL003C가 분화 지방세포 성장에 대하여 최상의 억제 효과를 나타냈다. 다른 단일 식물 추출물 그룹과 비교하여, 조성물 UL003C는 분화 지방세포 성장에 대하여 우수한 억제 효과를 나타냈다 (p<0.05).

실시양태 3: 성숙 지방세포의 성장 억제 분석

본 실시양태에서는, 성숙 국소 지방세포에 대한 본 발명의 조성물의 억제 효과가 종래의 소듐 데옥시콜레이트의 억제 효과와 비교되었다. 본 실시양태에서는, 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 3x10⁴개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린, 1 μM의 덱사메타손, 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 인큐베이션액으로 대체하였다. 추가로 2일간 더 인큐베이션한 후에, 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린을 함유하는 인큐베이션액으로 교체하여 추가로 4일간 더 인큐베이션하였다. 3T3-L1 세포 분화가 완료되었을 때, PBS 용매 대조군 및 DMSO 용매 대조군을 제외하고는, 50 ppm 또는 100 ppm의 조성물 UL003C 또는 소듐 데옥시콜레이트를 각각 상이한 웰에 첨가하였다. 6개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 48시간의 인큐베이션 후에, 세포의 성장 상태를 기록하기 위해 사진을 촬영하였고, 성숙 지방세포에 대한 각 실험 물질의 억제 효과를 MTT 분석에 의해 분석하였다.

결과가 도 3과 같이 도시되는데, 본 발명의 조성물은 성숙 지방세포 성장을 효과적으로 억제할 수 있었고; 2가지의 상이한 투여량 50 ppm 및 100 ppm 모두에서, 성숙 지방세포에 대한 본 발명의 조성물 UL0003C의 억제 효과가 소듐 데옥시콜레이트의 효과보다 유의하게 높았다 (p<0.001).

실시양태 4: 지방세포 아폽토시스 분석 (I)

본 실시양태에서는, 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁵개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린 분화제, 1 μM의 덱사메타손, 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 인큐베이션액으로 대체하였다. 분화제를 함유하는 인큐베이션액에서 4일간 세포를 배양시켜 지방세포 분화가 완료되기까지 대기한 후에, DMSO 용매 대조군을 제외하고는, 50 ppm의 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R을 각각 상이한 웰에 첨가하였다. 4개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 24시간의 인큐베이션 후에, 세포를 수집한 다음 아넥신 V/PI로 염색하고, 세포 아폽토시스를 유세포 분석기로 분석하는데; 여기서 아넥신 V-PI-는 생존한 성숙 지방세포 수를 나타내며, 아넥신 V+PI+는 아폽토시스 성숙 지방세포 수를 나타내고; 이 방법은 각 그룹에서 실험 물질에 의해 유도된 아폽토시스 정도를 구분하고 결정하는데 사용되었다.

결과가 도 4와 같이 도시되는데, 성숙 지방세포를 24시간 동안 상기에 언급된 실험 물질로 처리한 후에, 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R은 모두 DMSO 용매 대조군과 비교하여 성숙 지방세포 아폽토시스를 유의하게 유도할 수 있었고 (p<0.05), 여기서 조성물 UL003C가 성숙 지방세포에 대하여 최상의 아폽토시스 효과를 나타내고, 이는 조성물 UL003A 및 UL003R보다 유의하게 우수하였다 (p<0.05).

실시양태 5: 지방세포 아폽토시스 분석 (II)

본 실시양태에서는, 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁵개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린 분화제, 1 μM의 덱사메타손, 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 인큐베이션액으로 대체하였다. 분화제를 함유하는 인큐베이션액에서 4일간 인큐베이션하여 지방세포가 성숙되기까지 대기한 후에, DMSO 용매 대조군을 제외하고는, 50 ppm 및 100 ppm의 본 발명의 조성물 UL003A, UL003C 및 UL003R을 각각 상이한 웰에 첨가하였다. 7개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 3시간의 인큐베이션 후에, 세포를 수집하여 카스파제 3 염색을 수행하였다. 세포 아폽토시스를 유세포 분석에 의해 분석하는데, 여기서 세포의 카스파제 3이 표지되었다면, 이는 아폽토시스가 개시된 세포를 나타내고; 이 방법은 상이한 투여량 하에 각 그룹에서 실험 물질에 의해 유도된 아폽토시스 정도를 비교하는데 사용되었다.

결과가 도 5와 같이 도시되는데, DMSO 용매 대조군과 비교하여, 성숙 지방세포가 본 발명의 조성물 UL003C 50 ppm으로 처리되었든 또는 100 ppm으로 처리되었든 상관없이, 이들 그룹에서의 카스파제 3-표지 세포는 DMSO 용매 대조군보다 유의하게 많았다 (p<0.001). 이는 조성물 UL003C가 성숙 지방세포 아폽토시스를 유의하게 유도할 수 있었고, 최상의 효과를 나타냄을 시사한다.

실시양태 6: 지방세포 아폽토시스 분석 (III)

본 실시양태에서는, 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁵개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린 분화제, 1 μM의 덱사메타손, 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 인큐베이션액으로 대체하였다. 분화제를 함유하는 인큐베이션액에서 4일간 인큐베이션하여 지방세포가 성숙되기까지 대기한 후에, DMSO 용매 대조군을 제외하고는, 50 ppm의 강황 추출물, 50 ppm의 레스베라트롤, 및 50 ppm 및 100 ppm의 본 발명의 조성물 UL003C를 각 그룹에 각각 첨가하여 실험을 수행하였고; 5개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 이미 공개된 문헌에 따르면, 레스베라트롤로 16시간 동안 처리된 세포는 카스파제 3에 의해 표지될 가능성이 높았고, 나머지 그룹의 세포를 의약으로 처리하여 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 수집하여 카스파제 3 염색을 수행하고, 세포 아폽토시스를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 카스파제 3-표지 세포는 아폽토시스 세포 수를 나타내고; 이 방법은 상이한 투여량 하에 각 그룹에서 실험 물질에 의해 유도된 아폽토시스 정도를 비교하는데 사용되었다.

결과가 도 6과 같이 도시되는데, 지방세포가 50 ppm의 본 발명의 조성물 UL003C로 처리된 후에, 이 그룹에서의 카스파제 3-표지 세포는 DMSO 용매 대조군보다 유의하게 많았고 (p<0.001), 또한 동일한 투여량의 강황 추출물 그룹 (p<0.05) 및 레스베라트롤 그룹 (p<0.001)보다도 유의하게 많았다. 이는 성숙 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 본 발명의 조성물 UL003C의 효과가 조성물 중의 임의의 단일 식물 추출물 성분의 효과보다 유의하게 우수함을 시사한다.

실시양태 7: 지방세포 아폽토시스 분석 (IV)

본 실시양태에서는, 성숙 지방세포 아폽토시스 촉진에 대한 본 발명의 조성물 UL003C의 효과가 널리 공지된 소듐 데옥시콜레이트의 효과와 비교되었다. 본 실시양태에서는, 3T3-L1 세포를 12-웰 플레이트에서 웰 당 1x10⁵개의 세포로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4일째에 배지를 5 ㎍/ml의 인슐린 분화제, 1 μM의 덱사메타손, 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 함유하는 인큐베이션액으로 대체하였다. 분화제를 함유하는 인큐베이션액에서 4일간 인큐베이션하여 지방 세포가 성숙되기까지 대기한 후에, DMSO 용매 대조군을 제외하고는, 100 ppm의 조성물 UL003C 및 소듐 데옥시콜레이트를 각각 상이한 웰에 첨가하였고; 실험에서 3개의 그룹이 존재하고 각 그룹에서 3회 반복을 수행하였다. 투여 과정 및 24시간의 인큐베이션 후에, 세포를 수집하여 아넥신 V/PI 염색을 수행하였다. 세포 아폽토시스를 유세포 분석에 의해 분석하는데, 여기서 아넥신 V-PI- 세포는 생존한 성숙 지방세포 수를 나타내며, 아넥신 V+PI+ 세포는 아폽토시스 성숙 지방세포 수를 나타내고; 이 방법은 2개의 그룹에서 실험 물질에 의해 유도된 아폽토시스 정도를 비교하는데 사용되었다.

결과가 도 7과 같이 도시되는데, DMSO 용매 대조군 및 동일한 농도의 소듐 데옥시콜레이트와 비교하여, 조성물 UL003C는 성숙 지방세포 아폽토시스를 유의하게 유도할 수 있었다 (p<0.001). 한편, DMSO 용매 대조군과 소듐 데옥시콜레이트 그룹 사이에는 유의한 차이가 없었다 (p>0.05). 이는 본 발명의 조성물 UL003C가 성숙 지방세포 아폽토시스를 유의하게 유도할 수 있었고, 공지된 국소 지방 분해 성분인 소듐 데옥시콜레이트는 그렇지 않음을 시사한다.

실시양태 8: 래트를 사용하는 동물 분석 (I)

본 실험에서는 8주령의 수컷 스프래그-돌리 (Sprague-Dawley; SD) 래트를 사용하였다. 각각 대조군, UL003C-20 그룹 (20 mg/kg BW, 저 투여량 그룹이라고도 함), 및 UL003C-40 그룹 (40 mg/kg BW, 고 투여량 그룹이라고도 함)인 3개의 그룹이 존재하였다. 각 그룹에서 7주령의 수컷 래트 4마리를 사용하여 실험을 수행하며, 래트의 초기 체중은 207 g ± 6 g이었다. 모든 그룹의 래트에게 고지방 사료를 2주 동안 연속해서 제공하여 래트의 피하 지방을 두껍게 만들고 래트의 체중이 330 g ± 10 g이 되도록 한 후에 의약을 투여할 수 있었다. 상이한 투여량의 조성물 UL003C를 피하 지방에 피하 주사하는데, 주사 부위는 양측 각각에 2개의 주사 지점을 둔 (5 mg/kg/지점), 양측 서혜부 지방체이며, 각 래트의 총 투여량은 각각 대상체 당 20 mg/kg/1번 및 대상체 당 40 mg/kg/1번이며; 대조군에서는 동일한 용량 4 mL/kg/1번의 주사용수를 래트에게 투여하였다. 격일로 3번 주사하였다. 투여가 개시되는 날을 제1일로 설정하고, 제3일 및 제5일에 상기에 언급된 방법에 따라 의약을 반복 투여하였다. 실험 기간 동안에 매일 체중 변화 및 평균 1일 사료 섭취량을 기록하였다. 제21일 (21^st)에 마지막으로 래트의 체중을 측정한 후에, 래트를 24시간 동안 금식시켰다. 혈액을 채취하여 간 및 신장 기능 지수를 측정하는데; 이러한 지수에는 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제 (GPT), 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제 (GOT), 크레아티닌 및 우레아가 포함되었다. 래트를 희생시킨 후에, 피하 복부 지방, 상부 서혜부 (상부 사타구니)의 지방, 및 하부 서혜부 (하부 사타구니)의 지방을 수득하여 피하 지방의 양을 측정하였다. 모든 그룹의 데이터는 평균 ± SD로 나타내고; 문자는 통계 결과를 나타내는데, 상이한 문자는 그룹 간의 통계적 차이가 있음을 나타내고 (p<0.05), 동일한 문자는 그룹 간의 통계적 차이가 없음을 나타낸다 (p>0.05).

결과가 도 8과 같이 도시되는데, 저 투여량 또는 고 투여량의 본 발명의 조성물 UL003C로 처리된 래트의 총 체중 증가는 대조군 래트의 총 체중 증가보다 낮았고, 여기서 UL003C-40 그룹 래트의 체중 증가량은 대조군 래트의 체중 증가보다 유의하게 낮고 (p<0.05), 체중이 15.8% 감소하였다. 대조군과 비교하여, UL003C-20 그룹 래트의 체중 증가량은 11.1% 감소한 하락 추세이긴 하지만, 유의한 통계적 차이는 이루지 못하였다 (p>0.05). 이는 본 발명의 조성물을 대상체에게 주사함으로써 체중이 또한 감소할 수 있고 그 효과가 투여량과 관련있음을 시사한다.

도 9에 도시된 바와 같이, 희생 후에 각 그룹 래트의 투여 부위에서의 피하 지방 감소 결과가 제시되는데; 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물 UL003C는 주사 부위 주변의 피하 지방을 유의하게 감소시킬 수 있었고 (p<0.05); 여기서 저 투여량 그룹은 주사 부위에서의 피하 지방 감소량이 24.3%를 달성하였고 (p<0.05); 고 투여량 그룹은 주사 부위에서의 피하 지방 감소량이 21.6%를 달성하였다 (p<0.05).

도 10a 및 10b에 도시된 바와 같이, 혈청 생화학 지표, 예컨대 크레아티닌, 우레아, GOT 및 GPT는 통계적 차이를 갖지 않았다 (p>0.05). 이는 저 투여량 또는 고 투여량의 본 발명의 조성물 UL003C를 주사한 사례가 안전성 지수에 영향을 주지 않음을 시사하고; 즉 본 발명의 조성물이 양호한 안전성을 가짐을 시사한다.

실시양태 9: 래트를 사용하는 동물 분석 (II)

Bcl-2 및 Bax는 아폽토시스 경로에서 중요한 2종의 조절인자로서, 이들 2종의 조절인자 사이의 균형이 아폽토시스를 조절하는 중요한 메카니즘이다. 보다 높은 수준의 Bcl-2 발현은 아폽토시스를 억제하는 반면에, 보다 높은 수준의 Bax 발현은 아폽토시스를 촉진한다. 이들 2종의 단백질 사이의 높거나 낮은 비율이 세포가 생존하는 경향이 있을지 또는 아폽토시스 반응을 개시할지를 결정할 수 있다.

본 실험에서는, 각 그룹 래트의 피하 주사 부위의 지방 조직에서의 아폽토시스-억제 단백질 Bcl-2 및 아폽토시스-촉진 단백질 Bax2의 발현이 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 결정되었고, 지방세포 아폽토시스에 대한 본 발명의 조성물 UL003C의 효과를 평가하기 위해 Bax와 Bcl-2의 비율이 사용되었다. 본 실험에서는, 실시예 8에서 희생된 래트의 주사 부위 주변의 하부 서혜부에서의 피하 지방 조직을 사용하여 450 ㎕의 T-PER®을 이용한 단백질 추출을 수행하였고, 각 그룹에서 단백질 30 ㎍을 채취하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행한 다음, 단백질을 PVDF 막으로 전달하였다. 웨스턴 블롯팅에서 사용되는 Bcl-2 항체를 모델 번호 sc-7382로서 산타 크루스(Santa Cruz)로부터 구입하였고, Bax 항체를 모델 번호 sc-526으로서 산타 크루스로부터 구입하였다. 모든 그룹의 데이터는 평균 ± SD로 나타내고; 문자는 통계 결과를 나타내는데, 상이한 문자는 그룹 간의 통계적 차이가 있음을 나타내고 (p<0.05), 동일한 문자는 그룹 간의 통계적 차이가 없음을 나타낸다 (p>0.05).

결과가 도 11과 같이 도시되는데, 대조군과 비교하여, 저 투여량 또는 고 투여량의 본 발명의 조성물 UL003C는 Bcl-2 발현을 유의하게 향상시킬 수 있었고 (p<0.05), Bax 발현을 유의하게 억제할 수 있었으며 (p<0.05), 그의 Bax/Bcl-2 비율은 대조군보다 유의하게 높았다 (p<0.05). 이러한 결과는 본 발명의 조성물 UL003C를 래트에게 주사함으로써 지방 조직에서의 지방세포의 아폽토시스 개시를 효과적으로 유도할 수 있음을 시사한다. 본 발명은 확실히 효과적으로 지방세포의 아폽토시스 개시를 유도할 수 있었고 국소 지방량을 감소시킬 수 있었다. 동물 분석의 결과는 본 발명의 조성물이 지방세포 및 국소 지방을 감소시키는 결과를 달성할 수 있는 메카니즘이 지방세포 아폽토시스를 촉진하는 경로를 통한 것임을 재확인해준다.

상기 상세한 설명은 단지 바람직한 실시양태이며, 어떤 형태로든 본 발명을 제한하지 않고; 본 발명의 바람직한 실시양태가 상기에 개시되어 있지만, 어떤 수단에 의해서도 본 발명을 제한하는데 사용되지 않는다. 본 발명의 기술적 계획 범위를 벗어나지 않으면서 그 범위 내에 포함되는 한, 임의의 기술자라면 상기에 개시된 기술적 정보를 사용하여 약간의 조정 또는 수정으로 등가의 효과를 나타내는 실시양태를 구성할 수 있으나, 상기 실시양태에 대하여 실질적으로 이루어지는 본 발명의 기술로부터의 임의의 단순 수정인, 본 발명의 기술적 계획에서 벗어나지 않는 임의의 정보도 역시 본 발명의 기술적 계획 범위 내에 포함된다.

Claims (12)

1:30 내지 10:1 범위의 중량비로 레스베라트롤 대 강황 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 조성물.

제1항에 있어서, 레스베라트롤 대 강황 추출물의 중량비가 1:19인 것을 특징으로 하는 조성물.

국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물의 제조에서의 제1항 또는 제2항의 조성물의 적용.

유효량의 제1항 또는 제2항의 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 국소 지방 감소 및 체중 감소를 위해 사용되는 제약 조성물.

유효량의 제약 조성물을 대상체의 국소 부위에 투여하여 대상체의 국소 부위에서의 국소 지방 감소 및 체중 감소의 효과를 달성하도록 하는 것을 특징으로 하는, 국소 지방 감소 및 체중 감소용 제약 조성물의 제조에서의 제4항의 제약 조성물의 적용.

제5항에 있어서, 대상체가 동물 또는 인간인 것을 특징으로 하는 적용.

제5항에 있어서, 국소 부위가 얼굴, 턱, 팔, 허리, 복부 또는 넓적다리 등을 포함하는 것을 특징으로 하는 적용.

제5항에 있어서, 투여 방법이 주사, 피하 이식, 이식형 주입, 연고 또는 패치에 의한 것임을 특징으로 하는 적용.

제8항에 있어서, 주사가 피하 주사인 것을 특징으로 하는 적용.

제9항에 있어서, 피하 주사가 피하 지방 층에의 주사인 것을 특징으로 하는 적용.

제8항에 있어서, 매번 대상체에게 투여되는 제약 조성물의 유효량이 0.4 mg/kg 내지 100 mg/kg의 제약 조성물의 투여량인 것을 특징으로 하는 적용.

제11항에 있어서, 매번 대상체에게 투여되는 제약 조성물의 유효량이 1 mg/kg 내지 60 mg/kg의 제약 조성물의 투여량인 것을 특징으로 하는 적용.

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