KR20170040804A - 암 진단 및 치료법 - Google Patents

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폴 프랑크 데이비스
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Abstract

본 발명은 비제한적으로, 레닌 수용체, 안지오텐신 II 수용체 (2) 및 레닌 수용체의 분비된 형태를 포함하는 레닌-안지오텐신 시스템의 조절에 의해, 종양 전이에 대한 가능성을 포함하는 종양 (5) 성장 및 확산을 근절 또는 감속 또는 예방하도록, 종양에 존재하는 암 줄기 세포 군집의 동정 및 특이적 표적화를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 암 진단 및 치료에 대한 신규한 접근법을 제공한다.

Description

암 진단 및 치료법 {CANCER DIAGNOSIS AND THERAPY}
본 발명은 암 진단 및 암 치료에 대한 신규한 접근법을 제공한다. 특히, 종양 전이에 대한 가능성을 포함하여 종양 성장 및 확산을 근절시키거나 저하시키거나 예방하기 위해 종양에 존재하는 암 줄기 세포 군집의 동정 및 특이적 표적화가 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 본 발명은 종양의 동정 및 치료에 특히 유용하다.
심혈관 질환에 이어, 암은 4명 중 대략 1명의 사망에 대한 원인이 되는 세계적으로 가장 현저한 건강 장애 중 하나이다. 미국에서만, 건강 비용은 년간 수천억 달러로 달러로 추정되며, 현재 직접적인 지출액은 약 1천억 달러이다. 이러한 지출은 2020년까지 최대 US$2070억으로 추정된다. 암의 발병률은 전 세계적으로 인구가 노화함에 따라 증가할 것으로 크게 예상되며, 이러한 범위의 질환의 영향을 추가로 확대시킬 것이다. 1970년대 및 1980년대에 확립된 현재의 암 치료 요법은 크게 변화되지 않았다. 수술, 방사선요법 및 화학요법을 포함하는 이들 치료법 및 더욱 새로운 표적화된 요법을 포함하는 기타 양식은 더욱 진행된 단계의 암에 사용될 때 제한된 전반적인 생존 이점을 나타내는데, 특히 이들 요법은 종양발생을 추진하는 것으로 여겨지는 암 줄기 세포보다는 종양 벌크를 우선적으로 표적으로 하기 때문이다.
현재까지의 통상적인 암 진단 및 치료법은 크게 급성장하는 신생물 세포 (즉, 종양 벌크를 형성하는 세포)를 선택적으로 검출하고 근절시키기 위해 시도되었다. 표준 암 치료 요법은 종종 과도한 독성 없이 가장 높은 용량의 방사선을 전달하고/거나 화학요법제를 투여하도록 크게 설계되었으며, 즉 종종 "최대 내성 용량" (MTD) 또는 "부작용 미관찰 수준" (NOAEL)으로서 종종 불린다. 화학요법은 증가된 독성을 희생시키면서 암 제어를 개선하기 위해 방사선 요법에 종종 부가된다. 많은 통상적인 암 화학요법 (예를 들어, 알킬화제 예컨대, 사이클로포스파미드; 항대사산물 예컨대, 5-플루오로우라실; 식물 알칼로이드 예컨대, 빈크리스틴) 및 통상적인 방사선 요법은 세포 성장 및 DNA 복제에 관련된 세포 기전을 방해함으로써 암 세포에 대한 이들의 독성 효과를 크게 발휘한다. 화학요법 프로토콜은 또한 치료 효능을 증가시키고자 화학요법제의 조합물의 투여를 종종 포함한다. 많은 종류의 화학요법제의 이용가능성에도 불구하고, 이들 요법은 많은 제약을 갖는다. 예를 들어, 화학요법제는 정상 세포든지 악성 세포든지 빠르게 성장하는 세포에 대한 비특이적인 효과로 인해 독성에 대한 악명이 높다. 예를 들어, 화학요법제는 골수 억제, 면역억제, 위장 장애 등을 포함하는 유의하고 종종 심각한 독성을 초래한다.
기타 유형의 전통적인 암 치료법은 환자에서 신생 세포를 근절시키기 위한 수술, 호르몬 요법, 면역요법, 후생유전적 요법, 항-혈관신생 요법, 표적 요법 (예를 들어, 제제 예컨대, Gleevec® 및 기타 티로신 키나제 억제제, Velcade®, Sutent® 등을 암 표적으로 유도하는 요법), 및 방사선 요법을 포함한다. 이들 접근법 모두는 종종 조합되어 효능 결여, 독성 및 ??의 질 저하를 포함하는 환자에 대한 심각한 단점을 일으킬 수 있다. 따라서, 암 환자 치료의 생존 및 부작용 감소를 포함하여 장기 전망을 개선하기 위한 신규하고 더욱 효과적인 치료법 및/또는 요법이 필요하다.
암 줄기 세포는 종양의 고유한 아집단 (전형적으로 ~0.1-10%)을 포함하며, 이는 종양 (즉, 종양 벌크)의 나머지 90% 가량과 비교하여, 더욱 종양형성을 띠며, 비교적 더욱 느리게 성장하거나 휴지 상태이며, 종종 종양 세포보다 더욱 화학요법 및/또는 방사선요법 내성을 띤다. 대부분 통상적인 치료법 및 요법이 신속하게 증식하는 세포 (즉, 종양 벌크를 포함하는 그러한 암 세포)를 공격하도록 설계된 것을 감안할 때, 종종 느리게-성장하는 암 줄기 세포는 더욱 빠르게 성장하는 종양 세포보다 통상적인 치료법 및 요법에 대해 비교적 더욱 내성이다. 또한, 암 줄기 세포는 다약물 내성과 같은 화학내성을 부여하고/거나 항-아폽토시스 경로를 발전시키고/거나 강화시키는 기타 특징을 지닐 수 있다. 이들 특징은 대부분의 환자 특히, 더욱 진행된 단계의 암을 갖는 환자에서 장기적인 이점을 보장하는 표준 암 치료법의 실패(즉, 암 줄기 세포를 적절하게 표적화시키고 근절시키는데 실패)에 대한 주요 원인을 구성할 것이다. 일부 경우에, 암 줄기 세포(들)는 종양의 주조 세포(founding cell)이다 (즉, 이는 종양 벌크를 포함하는 암 세포를 발생시키는 기원(progenitor)이다).
암 줄기 세포 증식의 두 모델이 제안되었다. 확률론적 모델은, 발암 돌연변이가 정상 세포에서 무작위로 발생하며, 종양 내의 모든 세포는 종양을 재개시할 가능성이 낮지만 동일한 것으로 가정된다. 그에 반해, 종양 줄기 세포 모델은, 종양에서 관찰되는 이종 세포 계통을 야기하는 작은 표현형적으로 구별되는 암 세포의 서브세트로부터 종양이 발생하는 것으로 단정된다.
암 줄기 세포는 암 세포 군집의 나머지 부분과 구별되는 몇 가지 특성을 지닌다. 가장 중요하게는, 이들은 비대칭적 세포 분열로서, 하나의 자손 세포는 모 세포와 동일하게 유지되는 반면, 다른 하나는 상이한 독특한 유형의 세포 분열을 겪는다. 정상 성인 조직에서, 자가-재생은 성인 줄기 세포에 의해서만 독점적으로 나타난다. 배아 줄기 세포와 마찬가지로, 암 줄기 세포는 종양 세포 계층 구조의 상단에 놓이며, 비록 비정상적인 방식이지만 분화 스펙트럼을 따라 추가로 세포를 생성시키기 위해 자극에 반응할 수 있다. 암 줄기 세포는 또한, 화학요법 및 방사선 요법에 내성이며, 이는 통상적인 치료법이 암 치료에 효과적이지 않으며 재발이 일반적으로 더욱 공격적인 형태로 발생하는 이유를 설명할 수 있다. 게다가, 일부 암 줄기 세포는 비교적 휴지상태이기 때문에, 고도로 증식하는 세포를 표적으로 하는 약물로부터 이들 자신을 차단한다. 마지막으로, 암 줄기 세포는 암에서 전이를 발생시킬 수 있다.
암 줄기 세포는 매우 다양한 암 유형에서 확인되었다. 예를 들어, 백혈병 벌크의 나머지 99+%와 달리, 특정 표현형 CD34+CD38- (주어진 백혈병의 <1% 포함)을 갖는 백혈병 세포는 면역결핍 마우스로 전이될 경우 이로부터 파생된 백혈병을 재발견할 수 있었다(Bonnet et al. (1997) Nat Med 3:730-737). 즉, 이들 암 줄기 세포는 10,000개 백혈병 세포에서 <1로 발견되지만, 이러한 낮은 빈도 군집은 원래의 종양과 동일한 조직학적 표현형을 지닌 인간 백혈병을 개시하여 심한 복합 면역부전/비-비만 당뇨병 (NOD/SCID) 마우스로 연속으로 전이시킬 수 있다.
예를 들어, 인간 유방암 (CD44+CD24low lin; Al-Hajj et al. (2003) Proc Nat. Acad. Sci USA 100:3983-3988), 인간 급성 림프구성 백혈병 (CD34+CD10-, CC34+CD19-; Cox et al. (2004) Blood 104(19):2919-2925), 및 다발성 골수종 (CD138-; Matsui et al. (2004) Blood 103(6):2332)으로부터 분리된 암 줄기 세포와 관련된 유사한 연구 모두는 마우스의 재현 연구에서 증가된 종양형성 가능성을 증가시키는 것으로 나타났다.
통상적인 암 요법은 빠르게 증식하는 세포 (즉, 종양 벌크를 형성하는 세포)를 표적으로 하기 때문에, 이들 치료는 암 줄기 세포를 표적으로 하고 이를 손상시키는데 있어서 상대적으로 비효과적인 것으로 여겨진다. 사실, 백혈병 줄기 세포를 포함하는 암 줄기 세포는 통상적인 화학요법제 (예를 들어, Ara-C, 다우노루비신(Daunorubicin)) 뿐만 아니라 더욱 새로운 표적화된 요법 (예를 들어, Gleevec®, Velcade®)에 대해 비교적 내성인 것으로 나타났다. 예를 들어, 백혈병 줄기 세포는 비교적 느리게 성장하거나 휴지 상태이며, 다약 내성 유전자를 발현하며, 기타 항-아폽토시스 메카니즘, 이들의 화학내성에 기여하는 특징을 사용한다. 또한, 이들의 화학-내성에 의해, 암 줄기 세포는 치료 실패의 원인이 될 수 있으며, 또한 치료 후 지속될 수 있거나 명백한 초기 임상 증상 후 나중에 재발할 수 있다.
암 줄기 세포 표적화는 암 환자의 개선된 장기적 결과를 제공할 것으로 기대된다. 따라서, 더욱 성공적인 치료 결과를 달성하기 위해 암 줄기 세포를 표적화하도록 고안된 새로운 치료학적 제제 및/또는 치료를 제공할 필요가 존재한다. 본 발명은 이러한 문제를 해결하고자 한다.
본원에 기술되고 청구된 본 발명은 비제한적으로, 발명의 개요에 제시되거나 기술되거나 언급된 것들을 포함하는 많은 속성 및 구체예를 갖는다. 모두를 포함하는 것으로 의도되지는 않으며, 본원에 기술되고 청구된 본 발명은 본 발명의 개요에서 확인된 특징 또는 구체예로 제한되지 않거나 이에 의해 제한되지 않으며, 이는 단지 비제한적인 예시의 목적으로서 포함된다.
출원인은 조사된 주요 장기 시스템에 영향을 미치는 광범위한 범위의 다양한 종양 유형과 관련되는 것으로 입증된 암 줄기 세포의 개별 군집을 확인하였다. 따라서, 이들 암 줄기 세포 및 암 줄기 세포 군집의 동정은 암 관리에 대한 새로운 접근법 뿐만 아니라, 예후, 진단 및 추적 적용을 제공한다. 또한, 출원인은 놀랍게도, 이들 암 줄기 세포가 예를 들어, 프로/레닌 수용체 시스템 (PRRS)을 포함하는 레닌-안지오텐신 시스템 (RAS) 및 관련 우회 경로를 포함하는 주요 조절 시스템과 관련된 마커를 발현함을 입증하였다. 이러한 새로운 이해는, 암 줄기 세포 군집의 성장, 증식 및/또는 분화를 근절시키거나 저지하고자 하는 시도에서 이들 조절 경로를 특정하게 표적으로 하는 확립되고/거나 신규한 약물을 사용함으로써 암 관리에서의 새로운 목표와 고유의 치료 기회를 제공한다. 이는 초기 및 확립된 종양의 종양형성 및 전이 가능성 둘 모두를 감소시킬 잠재력을 갖는다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 종양의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 암은 고형암 또는 혈액암인 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 종양은 구강의 편평 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 뇌암, 장암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법이 제공된다.
본 발명의 더욱 추가의 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 종양은 편평 세포 암종인 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 환자에서 암을 예방하거나 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하는데 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 크립토(Cripto), ABCG2, 알칼리 포스파타제/ALPL, CD9, FGF-4, GDF-3, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 베타 1/CD29, NANOG, OCT-3/4, 포도칼릭신, SOX2, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, SSEA-1, FoxD3, DPPA5/ESG1, Rex-1/ZFP42, DPPA4, LIN-28A, UTF1, 레프티-A(Lefty-A), 레프티-1, TBX3, ESGP, TRA-1-60(R), TRA-1-81, 5T4, TBX2, ZIC3, CD30/TNFRSF8, KLF5, c-Myc, GCNF/NR6A1, SUZ12, Smad2, CDX2, TROP-2, CD117/c-키트, LIN-41, 인테그린 알파 6 베타 4, THAP11, Smad2/3, TBX5, TEX19, Oct-4A, TEX19.1, DPPA2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, FGF-5, GBX2, 스텔라(Stella)/Dppa3, DNMT3B, F-박스 단백질 15/FBXO15, LIN-28B, 인테그린 알파 6 베타 1, KLF4, ERR 베타/NR3B2, EpCAM/TROP1, TERT, CHD1, Cbx2, c-Maf, L1TD1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌 수용체(RR), 안지오텐신 II 수용체 2 및 레닌 수용체의 분비된 형태(screted form of the Renin Receptor)(sRR)로 구성된 군으로부터 선택된 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료제(들)를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) Oct-4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌 수용체, 안지오텐신 II 수용체 2 및 레닌 수용체의 분비된 형태 (sRR)로 구성된 군으로부터 선택된 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 치료학적 제제는 직접 레닌 억제제(DRI), 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 추가의 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 암 줄기 세포의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 생물학적 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 수준을 대조군 군집으로부터 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서;
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 증가된 암 줄기 세포 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 암 줄기 세포의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 생물학적 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 수준을 대조군 군집으로부터의 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 증가된 암 줄기 세포 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계, 및
(iii) 암을 가지고 있거나 암이 발병되기 쉬운 대상체에 예방학적 또는 치료학적 요법제(들)를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 치료 방법에 사용하기 위한 약제 조성물이 제공되며, 상기 약제 조성물은 암 내부의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 치료학적 제제를 포함하며, 상기 방법은 암 환자에게 치료학적 제제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 치료에 사용하기 위한 제조 키트 또는 물품이 제공되며, 키트는 대상체에 치료학적 용량을 투여하는 방법에 대한 설명서와 함께 암 내부의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 치료학적 제제를 포함한다.
도 1은 RAS와 관련된 주요 경로를 보여준다. ACE: 안지오텐신 전환 효소; ACEI: 안지오텐신 전환 효소 억제제; Cox2i: Cox2 억제제; β-차단체: 베타-차단제; ATIIR2: 안지오텐신 II 수용체 2; ATIIR1: 안지오텐신 II 수용체 1; (프로)-PR: 프로(레닌) 수용체 [레닌 수용체 (RR)라고도 불림]; Vit D: 비타민 D; XX: 주요 차단; ++: 주요 증진 단계.
도 2는 RAS와 관련된 조합된 경로를 보여준다. ACE: 안지오텐신 전환 효소; ACEI: 안지오텐신 전환 효소 억제제; Cox2i: Cox2 억제제; β-차단체: 베타-차단제; ATIIR2: 안지오텐신 II 수용체 2; ATIIR1: 안지오텐신 II 수용체 1; (프로)-PR: 프로(레닌) 수용체 [레닌 수용체 (RR)라고도 불림]; Vit D: 비타민 D; XX: 주요 차단; x: 마이너 차단; ++: 주요 증진 단계; +: 마이너 차단 단계.
도 3은 개별 면역조직화학 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 구강 혀 편평 세포 암종 (OTSCC)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 4는 RR에 특이적인 항체, 즉 항-ATP6IP2 일차 항체 (ab40790) 및 염소 항-토끼 HRP 이차 항체 (A16110)를 사용한 OTSCC 암 줄기 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 예측된 39 kDa 레닌 수용체 단백질 밴드는 분석된 두 OTSCC 샘플 모두에 존재하였다. 인간 간 조직 또는 이차 항체 단독 (음성 대조군)과 관련된 세포에 대한 염색은 관찰되지 않았다.
도 5a 및 5b는 OTSCC와 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 5a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 공동-염색을 나타낸다. 도 5b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 6은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 흑색종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 흑색종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 7a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 7b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 8은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 육종(평활근육종)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 육종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 9a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 9b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 10은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 장암과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 11a 및 11b는 장암과 관련된 암 줄기 세포 군집에서 OCT4의 공동-위치화를 나타낸다. 도 11a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 11b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 12는 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 뇌암(다형성 아교모세포종)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 뇌암(다형성 아교모세포종)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 13a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 13b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 14는 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 유방암과 관련된 암 줄기 세포 군집에서 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 유방암과 관련된 암 줄기 세포 군집에서 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 15a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 15b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 16는 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 폐암(폐 전이 암종)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 17a 및 17b는 폐암(폐 전이 암종)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 17a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 17b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 18은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 B 세포 림프종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 19a 및 19b는 B 세포 림프종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 19a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 19b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 20은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 신장암(콩팥 세포 전이 암)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 21a 및 21b는 신장 암 (콩팥 세포 전이 암)과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 21a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 21b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 22는 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 갑상선암과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 23a 및 23b는 갑상선암과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 23a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 23b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 24는 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 만성 림프구 백혈병과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 25a 및 25b는 만성 림프구 백혈병과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 25a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 25b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 26은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 피부 편평 세포 암종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 27a 및 27b는 피부 편평 세포 암종과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 27a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 27b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 28은 면역조직화학적 염색 프로파일에 의해 입증된 바와 같은 전립선암과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 나타낸다.
도 29a 및 29b는 전립선암과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 OCT4 및 RR의 공동-위치화를 나타낸다. 도 29a는 OCT4 및 RR에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 도 29b는 OCT4 (점선) 및 RR (긴 파선)에 대한 상대적 형광 신호의 정량화를 나타낸다.
도 30은 각 양성 대조군으로서 인간 정상피종 조직 샘플에서의 OCT4 및 SOX2, 인간 신장에서의 ATIIR2 및 인간 태반 조직에서의 RR의 발현을 나타낸다. 음성 대조군은 뇌암 (다형성 아교모세포종) 조직 절편에서 일차 항체가 없는 염색의 부재를 보여준다.
선택적 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 임의의 검정, 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실시 또는 평가에 사용될 수 있지만, 다양한 검정, 방법, 장치 및 재료가 이제 기술될 것이다.
본원에 개시된 숫자 범위 (예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은 또한 그 범위 내의 모든 관련 수 (예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한, 그 범위 내의 유리수의 임의의 범위 (예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5, 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급을 포함하며, 따라서, 모든 범위의 모든 하위 범위는 명시적으로 기재될 것이다. 이들은 단지 구체적으로 의도된 것의 예일 뿐이며, 열거된 가장 낮은 값과 가장 높은 값 사이의 모든 가능한 숫자 값의 조합이 본 출원에서 유사한 방식으로 명시적으로 언급된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하다", "포함하는" 및 유사어는 배타적이거나 총 망라하는 의미로 해석되어서는 안된다. 즉, 이들은 "비제한적으로 포함하는"을 의미하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원 결합 부위 예를 들어, 면역글로불린을 함유하는 분자를 지칭한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 항체는 비제한적으로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 낙타화 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 Fvs (scFv), 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-결합된 Fvs (sdFv), 및 항-아이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 세포의 비정상적인 제어되지 않은 성장으로 인한 신생물 또는 종양을 지칭한다. 용어 "암"은 전암 세포 및 악성 암 세포 둘 모두를 포함하는 질환을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 대상체의 다른 부분으로 퍼지지 않는 세포의 국소적인 과증식 즉, 양성 종양을 지칭한다. 기타 예에서, 암은 악성 종양으로서, 인접한 몸체 구조를 침범하여 파괴하고/거나 멀리 떨어진 부위로 퍼진 종양을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "암 세포"는 이들의 발생 동안 아폽토시스를 회피하는 능력을 포함하는 작용 능력의 특징 세트를 획득하고, 성장 신호에서 자급 자족하며, 항-성장 신호에 민감하지 않은 세포, 조직 침윤/전이, 현저한 성장 가능성, 및/또는 지속적인 혈관신생을 나타내는 세포를 지칭한다. 용어 "암 세포"는 전암성 및 악성 암 세포 둘 모두를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암 줄기 세포(들)"는 고도로 증식성인 암 세포의 기원일 수 있는 세포를 지칭한다. 암 줄기 세포는 면역저하된 마우스에서 종양을 형성하는 이의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 비대칭 분열 능력 및 종양 재성장 능력, 및 전형적으로 면역저하된 마우스에서 차후의 일련의 이식시 종양을 형성하는 능력을 갖는다. 또한, 암 줄기 세포는 전형적으로, 종양 벌크에 비해 서서히 성장하며; 즉, 암 줄기 세포는 일반적으로 휴지 상태이다. 전부가 아닌 특정 예에서, 암 줄기 세포는 종양의 대략 0.1 내지 10%를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암 줄기 세포 군집"은 하나 이상의 암 줄기 세포 즉, 단일 암 줄기 세포 또는 다중 암 줄기 세포를 의미하고자 하며, 단일 암 줄기 세포 또는 다중 암 줄기 세포는 해당 암의 종양형성을 추진할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "편평 세포 암종"은 피부, 상부 호흡소화관(구강 포함) 및 부비동 (paranasal sinuses), 식도, 폐 및 자궁 경부를 포함하는 많은 다른 기관, 및 편평 세포 분화를 보여주는 기타 기관에서 발견되는 상피 종양을 지칭한다. 머리 및 목 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 피부 편평 세포 암종, 귀 편평 세포 암종, 외음부 편평 세포 암종, 자궁경부 편평 세포 암종, 식도 편평 세포 암종, 상부 호흡소화관 및 부비동 편평 세포 암종 및 기타 등등이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "레닌-안지오텐신 시스템(RAS)" 또는 "레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)"은 혈압 및 체액 균형을 조절하는 호르몬 시스템이다. RAS와 관련된 더 넓은 경로는 또한, 프로/레닌 수용체 시스템(PRRS) 및 관련 우회 경로를 포함한다. 예로서, 도 1 및 2 참조. 아래에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, PRRS를 포함하는 RAS를 표적으로 하는 많은 공지된 약물이 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 또 다른 요법의 치료학적 효과(들)를 향상 또는 개선시키고/거나, 중증도, 암의 기간을 감소시키고/거나, 암의 하나 이상의 증상을 완화시키고/거나, 암의 진행을 예방하고/거나, 암의 퇴행을 초래하고/거나 또 다른 요법의 치료학적 효과를 향상 또는 개선시키기 위해, 암 및 이의 하나 이상의 증상의 전개, 재발 또는 발병을 예방하기에 충분한 요법제의 양을 지칭한다. 본 발명의 예에서, 요법제의 양은 1, 2, 3 또는 그 초과의 요법제의 투여 후 1, 2 또는 3개 또는 그 초과의 결과를 달성하는데 효과적이다: (1) 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절; (2) 암 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절; (3) 종양 또는 신생물 성장의 안정화 또는 감소; (4) 종양 형성 장애; (5) 원발, 지역적 및/또는 전이 암의 근절, 제거 또는 제어; (6) 사망률의 감소; (7) 무병 상태, 무재발 상태, 무진행 상태 및/또는 전체 생존, 기간, 또는 비율의 증가; (8) 반응 속도, 반응 지속성, 또는 반응하거나 완화되는 환자 수의 증가; (9) 입원율의 감소, (10) 입원 기간의 감소, (11) 종양의 크기가 유지되거나 증가하지 않거나 10% 미만, 바람직하게는, 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 바람직하게는 2% 미만 증가됨, (12) 차도를 보이는 환자 수 증가, (13) 완화 길이 또는 기간 증가, (14) 암 재발률 감소, (15) 암 재발까지의 시간 증가, 및 (16) 암-관련 증상 및/또는 삶의 질 개선.
대상체로의 요법제의 투여와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 대상체가 요법제 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제) 또는 요법제의 조합물로부터 유도된 유익한 효과를 지칭하나, 암의 치료를 발생시키지 않는다. 특정 구체예에서, 대상체에 하나 이상의 요법제 (예를 들어, 하나 이상의 예방학적 또는 치료학적 제제)가 투여되어 병태의 진행 또는 악화를 방지하도록 암이 "관리"된다.
대상체로의 요법제의 투여와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 요법제 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제) 또는 요법제의 조합물 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제의 조합물)의 투여로부터 발생하는, 대상체에서 암의 재발, 발병 및/또는 전개를 예방 또는 억제를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 하나 이상의 요법제의 투여 후 1, 2, 3 또는 그 초과의 결과를 지칭한다: (1) 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절, (2) 암 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절 (3) 반응 속도의 증가, (4) 완화 기간의 증가, (5) 암의 재발율의 감소, (6) 암 재발까지의 시간의 증가, (7) 환자의 무질환, 무재발, 무진행 및/또는 전체 생존의 증가, 및 (8) 암 관련 증상 및/또는 삶의 질의 개선. 특정 예에서, 이러한 용어는 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절을 지칭한다.
조직 (예를 들어, 정상 세포 또는 종양 세포)과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 질환 또는 장애 예를 들어, 암에 의해 영향을 받은 특정 조직 내 또는 조직 상에서 확인되거나 확인되는 것이 바람직한 조직 내 또는 조직 상에서 특이적으로 발견된 임의의 항원, 분자 또는 기타 화학적 또는 생물학적 실체를 의미한다. 용어 "종양발생 바이오마커"는 또한 암과 관련하여 이의 정의와 관련이 있다. 특정 예에서, 마커는 특이적 세포 유형에 의해 차별적으로 또는 우선적으로 발현되는 세포 표면 항원이다. 특정 예에서, 마커는 특이적 세포 유형에 의해 차별적으로 또는 우선적으로 발현되는 핵 항원이다. 특정 예에서, 마커는 특이적 세포 유형에 의해 차별적으로 또는 우선적으로 발현되는 세포내 항원이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방학적 제제"는 암 예방 목적으로 사용되는 임의의 분자, 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 예방학적 제제의 예는 비제한적으로, 단백질, 면역글로불린 (예를 들어, 다중-특이적 Ig, 단일쇄 Ig, Ig 단편, 폴리클로날 항체 및 이의 단편, 모노클로날 항체 및 이의 단편), 항체 컨쥬게이트 또는 항체 단편 컨쥬게이트, 펩티드 (예를 들어, 펩티드 수용체, 셀렉틴), 결합 단백질, 화학특이적 제제, 화학독성제 (예를 들어, 항암제), 증식 기반 요법, 및 소분자 약물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 제제"는 질환 또는 장애의 치료 및/또는 관리 목적에 사용되는 임의의 분자, 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 치료학적 제제의 예는 비제한적으로, 단백질, 면역글로불린 (예를 들어, 다중-특이적 Ig, 단일쇄 Ig, Ig 단편, 폴리클로날 항체 및 이의 단편, 모노클로날 항체 및 이의 단편), 펩티드 (예를 들어, 펩티드 수용체, 셀렉틴), 결합 단백질, 생물학제(biology), 화학특이적 제제, 화학독성제 (예를 들어, 항암제), 증식 기반 요법제, 호르몬 제제, 방사선면역요법제, 표적 제제, 후성적 요법제, 분화 요법제, 생물학적 제제, 방사선 제제, 화학요법제, 항-혈관형성제, 및 소분자 약물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "요법제" 및 "요법"은 암 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료 및/또는 관리에 사용될 수 있는 임의의 방법(들), 조성물(들) 및/또는 제제(들)를 지칭할 수 있다. 특정 예에서, 용어 "요법" 및 "요법제"는 화학요법, 방사선요법, 수술, 호르몬 요법, 항-혈관형성 요법, 생물학적 요법, 증식 기반 요법, 프로드러그-활성화 효소 요법, 소분자 요법, 독소 요법, 항체 요법, 면역요법, 방사선면역요법, 표적 요법, 후성적 요법, 탈메틸화 요법, 히스톤 데악틸라제 억제제 요법, 분화 요법 및/또는 암 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 관리 및/또는 치료에 유용한 기타 요법을 지칭한다.
대상체로의 요법제의 투여와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법제의 투여로부터 발생하는, 암의 진행 및/또는 기간의 감소 또는 억제, 암의 중증도의 감소 또는 완화, 및/또는 이의 하나 이상의 증상의 완화를 지칭한다. 특정 예에서, 이러한 용어는 1, 2, 3 또는 그 초과의 요법제 투여 후 1, 2 또는 3개 또는 그 초과의 결과를 지칭한다: (1) 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 근절; (2) 암 세포 군집의 안정화, 감소 또는 제거; (3) 종양 또는 신생물의 성장에서 안정화 또는 감소; (4) 종양 형성 손상; (5) 원발, 지역적 및/또는 전이 암의 근절, 제거 또는 제어; (6) 사망률의 감소; (7) 무병 상태, 무재발 상태, 무진행 상태 및/또는 전체 생존, 기간, 또는 비율의 증가; (8) 반응 속도, 반응 지속성, 또는 반응하거나 완화되는 환자 수의 증가; (9) 입원율의 감소, (10) 입원 기간의 감소, (11) 종양의 크기가 유지되거나 증가하지 않거나 10% 미만, 바람직하게는, 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 바람직하게는 2% 미만 증가됨, 및 (12) 차도를 보이는 환자 수 증가. 특정 예에서, 이러한 용어는 암 줄기 세포 군집의 안정화 또는 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 암 세포 성장의 안정화 또는 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 암 줄기 세포 군집의 안정화 또는 감소 및 암 세포 군집의 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 종양의 성장 및/또는 형성의 안정화 또는 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 상기 용어는 원발, 지역적 또는 전이 암의 근절, 제거 또는 제어 (예를 들어, 암 확산의 최소화 또는 지연)을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 환자 군집의 사망률의 감소 및/또는 생존율의 증가를 지칭한다. 추가의 예에서, 이러한 용어는 반응 속도의 증가, 반응의 지속성, 또는 반응하거나 완화되는 환자 수의 증가를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 환자 군집의 입원율의 감소 및/또는 환자 군집의 입원 기간 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 취해지거나 유도된 임의의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 대상체로부터 수득될 수 있거나, 대상체에 제공하고자 하는 생물학적 물질로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 예를 들어, 대상체의 암 상태를 조사하기 위해 평가될 혈액으로부터 수득될 수 있다. 임의의 대상체 예컨대, 정상적인 건강한 대상체 및/또는 암 상태를 이해하는데 유용한 건강한 대상체로부터 취해지거나 유도된 샘플이 포함된다. 바람직한 샘플은 생물학적 유체 샘플이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 유체 샘플"은 관심 대상체 예컨대, 환자의 예를 들어, 진단, 예후, 분류 또는 평가의 목적으로 수득된 체액의 샘플을 지칭한다. 특정 구체예에서, 이러한 샘플은 환자의 암 상태를 측정하는 목적으로 수득될 수 있다. 샘플은 암 줄기 세포가 검출될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 샘플일 수 있다. 임의의 체액 예컨대, 전혈 샘플, 혈장, 혈청, 난소 난포액 샘플, 정액 샘플, 뇌척수액, 타액, 객담, 소변, 흉수, 간질액, 윤활액, 림프, 눈물이 예를 들어, 포함되나, 전혈 샘플, 혈장 및 혈청이 본 발명에 사용하기에 특히 적합하다. 또한, 당업자는 특정 체액 샘플이 분별 또는 정제 절차 예를 들어, 전혈의 혈청 또는 혈장 성분으로의 분리 후 더욱 용이하게 분석될 것임을 인지할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않는다. 한 구체예에서, 정제된은 예를 제공하기 위해, 샘플 중의 폴리펩티드 또는 항체의 적어도 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99% 균질성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 바람직하게는, 포유동물이며, 인간 및 인간외 포유동물 예컨대, 고양이, 개, 말, 소, 양, 사슴, 마우스, 래트, 영장류 (고릴라, 붉은털 원숭이 및 침팬지 포함), 주머니쥐 및 기타 가축 또는 동물원 동물을 포함한다. 이와 같이, 본원에 기술된 검정, 방법 및 키트는 인간 및 인간외 동물 둘 모두, 특히 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 양, 염소, 돼지, 사슴, 알파카, 라마, 버팔로를 포함하는 농장 동물, 고양이, 개 및 말을 포함하는 반려동물 및/또는 순수종 동물에 적용된다. 바람직한 대상체는 인간이며, 가장 바람직하게는, 본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 질환 또는 병태에 대한 의학적 관리 또는 평가를 받을 수 있거나 받고 있는 살아있는 인간을 지칭한다. 또한, 대상체는 바람직하게는, 살아있는 유기체이지만, 본원에 기술된 발명은 또한 사후 분석에도 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "ELISA"는 효소 결합된 면역흡착 검정법으로서, 샘플 중의 분석물의 양을 정량하는데 사용된 검출가능한 라벨 및 항체를 포함하는 경쟁 결합 검정의 한 유형을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포획 항체"는 전형적으로 고형 지지체 예컨대, 플레이트, 비드 또는 튜브에 고정화되는 항체로서, 관심 분석물(들) 예를 들어, 암 줄기 세포 군집과 관련된 막 결합된 마커에 결합하여 포획하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출 항체"는 관심 분석물(들)에 결합하는 검출가능한 라벨을 포함하는 항체를 의미한다. 라벨은 관심 분석물(들) 예를 들어, 암 줄기 세포 군집과 관련된 막 결합 마커의 정량적, 반-정량적 또는 정성적 측정을 위한 관례적 검출 수단을 사용하여 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 분석물의 "존재 또는 양에 관련"이라는 용어는, 검정 신호가 전형적으로 관심 분석물의 알려진 농도를 사용하여 계산된 표준 곡선을 통해 분석물의 존재 또는 양과 관련된다는 것을 반영한다. 본원에서 용어가 사용되는 바와 같이, 검정이 분석물의 존재 또는 생리적으로 관련된 농도의 양을 나타내는 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 경우 검정법은 분석물을 "검출하도록 구성된다". 일반적으로, 분석물은 샘플에서 측정된다.
한 구체예에서, 대조군보다 "높은" 또는 "낮은" 수준, 또는 대조군 (수준)으로부터의 "변화" 또는 "편차"는 통계적으로 유의하다. 수준이 대조군 수준과 비교하여 약 5% 또는 그 초과, 약 10% 또는 그 초과, 약 20% 또는 그 초과, 또는 약 50% 또는 그 초과 만큼 대조군 수준과 차이가 나는 경우, 대조군 수준 또는 평균 또는 과거 대조군 수준보다 높은 수준, 낮은 수준, 이로부터의 편차 또는 변화가 존재하는 것으로 간주될 수 있다. 통계학적으로 유의한 것은 P≤0.05로 대안적으로 계산될 수 있다. 더 높은 수준, 낮은 수준, 편차 및 변화는 또한 검정 기준 한계 또는 기준 간격에 의해 결정될 수 있다. 직관적인 평가 또는 비-매개변수 방법으로 계산될 수 있다. 전반적으로, 이러한 방법은 0.025* (n+1) 및 0.975 (n+1)로서 0.025 및 0.975 분위수를 계산할 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술에 잘 공지되어 있다. 대조군에 부재하는 마커의 존재는 더 높은 수준, 편차 또는 변화로 볼 수 있다. 대조군에 존재하는 마커의 부재는 더 낮은 수준, 편차 또는 변화로 볼 수 있다.
상세한 설명
암 줄기 세포가 종양의 지속 또는 재발을 유도한다는 새로운 개념이 있다. 통상적인 암 요법은 벌크 종양을 근절하는데 성공적이지만 서서히 퍼지는 암 줄기 세포에 대해서는 전형적으로 덜 효과적이다. 또한, 이들 세포에 의해 나타나는 선택적 약물 내성은 암 환자의 심각한 이환 및 사망에 기여한다. 따라서, 암 줄기 세포를 특이적으로 그리고, 선택적으로 표적으로 하는 치료 요법이 필요하다.
본 발명은, 별개의 암 줄기 세포 군집이 예를 들어, 구강의 편평 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 뇌암, 장암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병 및 육종을 포함하는 특정 종양과 관련된다는 놀랍고도 예측하지 못한 발견을 전제로 한다. 이들 종양과 관련된 암 줄기 세포 군집은 특정 암의 특이적 동정 및 진단을 허용하는 고유한 바이오마커 발현 프로파일을 특징으로 한다.
중요하게도, 이들 암 줄기 세포 군집이 레닌 수용체 (RR) 안지오텐신 II 수용체 2 (ATIIR2)는 물론 레닌 수용체의 분비된 형태 (sRR)을 포함하는 레닌-안지오텐신 시스템(RAS)의 주요 구성요소를 발현한다는 것이 본 출원인에 의해 또한 밝혀졌다. 도 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 및 28을 참조하여, 본 출원인은 다양한 종양과 관련된 암 줄기 세포 군집에 의한 RR 및 ATIIR2의 공동-발현을 입증한다. 이들 암 줄기 세포 군집은 예를 들어, OCT4, SOX2, PSTAT3 및 NANOG의 발현을 특징으로 한다. 따라서, 이러한 암 줄기 세포 군집에 의한 RAS의 구성요소의 발현은, RAS를 표적으로 하는 약물 예컨대, 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACEi), 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB), 직접 레닌 억제제 (DRI), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘 보충제, 비타민 D 및 칼슘 채널 차단제의 광범위한 약물 집단으로부터 다양한 종양과 관련된 암 줄기 세포를 표적화함으로써 신규하고 독특한 치료 접근법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 또한 RAS의 간접적인 억제제 (예를 들어, 칼슘 채널 차단제)를 고려한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 제거하거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 암은 고형 종양 또는 혈액암인 방법이 제공된다.
한 예에서, 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 크립토, ABCG2, 알칼리성 포스파타제/ALPL, CD9, FGF-4, GDF-3, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 베타 1/CD29, Nanog, Oct-3/4, 포도칼릭신, SOX2, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, SSEA-1, FoxD3, DPPA5/ESG1, Rex-1/ZFP42, DPPA4, LIN-28A, UTF1, 레프티-A, 레프티-1, TBX3, ESGP, TRA-1-60(R), TRA-1-81, 5T4, TBX2, ZIC3, CD30/TNFRSF8, KLF5, c-Myc, GCNF/NR6A1, SUZ12, Smad2, CDX2, TROP-2, CD117/c-키트, LIN-41, 인테그린 알파 6 베타 4, THAP11, Smad2/3, TBX5, TEX19, Oct-4A, TEX19.1, DPPA2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, FGF-5, GBX2, 스텔라/Dppa3, DNMT3B, F-박스 단백질 15/FBXO15, LIN-28B, 인테그린 알파 6 베타 1, KLF4, ERR 베타/NR3B2, EpCAM/TROP1, TERT, CHD1, Cbx2, c-Maf 및 L1TD1으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커는 OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3으로 구성된다. 추가의 또 다른 예에서, RAS와 관련된 하나 이상의 바이오마커는 RR, ATIIR2 및 sRR로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 종양은 구강의 편평 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 뇌암, 장암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법이 제공된다.
본 발명의 더욱 추가의 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하며, 종양은 편평 세포 암종인 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리가 필요한 환자에서 암을 예방하거나 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하는데 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 크립토, ABCG2, 알칼리 포스파타제/ALPL, CD9, FGF-4, GDF-3, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 베타 1/CD29, NANOG, OCT3/4, 포도칼릭신, SOX2, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, SSEA-1, FoxD3, DPPA5/ESG1, Rex-1/ZFP42, DPPA4, LIN-28A, UTF1, 레프티-A, 레프티-1, TBX3, ESGP, TRA-1-60(R), TRA-1-81, 5T4, TBX2, ZIC3, CD30/TNFRSF8, KLF5, c-Myc, GCNF/NR6A1, SUZ12, Smad2, CDX2, TROP-2, CD117/c-키트, LIN-41, 인테그린 알파 6 베타 4, THAP11, Smad2/3, TBX5, TEX19, Oct-4A, TEX19.1, DPPA2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, FGF-5, GBX2, 스텔라/Dppa3, DNMT3B, F-박스 단백질 15/FBXO15, LIN-28B, 인테그린 알파 6 베타 1, KLF4, ERR 베타/NR3B2, EpCAM/TROP1, TERT, CHD1, Cbx2, c-Maf 및 L1TD1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 또 다른 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 제거하거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현 및 (ii) 레닌 수용체, 안지오텐신 II 수용체 2 및 레닌 수용체의 분비된 형태로 구성된 군으로부터 선택된 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제(들)를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌 수용체, 안지오텐신 II 수용체 2 및/또는 레닌 수용체의 분비된 형태의 발현을 특징으로 하며, 치료학적 제제는 직접 레닌 억제제(DRI), ACEi, ARB, 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법이 제공된다.
한 예에서, 암 줄기 세포는 SOX2, OCT4, PSTAT3 및 NANOG의 발현을 특징으로 한다. 이들 세포는 마커 발현 프로파일 SOX2+Oct-4+PSTAT3+NANOG+를 가지고 있다고 한다.
관련 예에서, 암 줄기 세포는 구강 혀의 편평 세포 암종의 암 줄기 세포이며, 마커 발현 프로파일 CD44+SOX2+OCT4+NANOG+를 특징으로 한다. 추가 예에서, 구강 혀의 편평 세포 암종의 암 줄기 세포는 마커 발현 프로파일 CD44+SOX2+OCT4+NANOG+CD34-를 특징으로 한다. 여전히 추가의 예에서, 암 줄기 세포는 구강 혀의 편평 세포 암종의 암 줄기 세포이며, 마커 발현 프로파일 CD44+SOX2+OCT4+NANOG+CD34-p63-EMA-를 특징으로 한다.
암 줄기 세포는 배아 줄기 세포 마커, 림프 세포 마커, 상피 암 세포 마커 또는 이들의 임의의 조합과 공동-발현될 수 있다. 따라서, 한 예에서, 암 줄기 세포는 배아 줄기 세포 마커 및 상피 암 세포 마커와 공동-발현된다. 또 다른 예에서, 암 줄기 세포는 림프 세포 마커 및 상피 암 세포 마커와 공동-발현된다. 추가의 예에서, 암 줄기 세포는 배아 줄기 세포 마커, 림프 세포 마커, 및 상피 암 세포 마커와 공동-발현된다.
본 발명은 특히 고형 종양과 관련이 있지만, 또한 혈액 암까지 확대된다. 예를 들어, 본 출원인은 만성 림프성 백혈병이 OCT4, SOX2, ATIIR2 및 RR의 발현을 특징으로 하는 암 줄기 세포를 포함하며 (도 24), 암 줄기 세포는 또한, RR 및 ATIIR2를 공동-발현함을 (도 25a 및 25b) 입증한다. 따라서, 본 발명에 따른 치료 방법 및 조성물은 혈액 암까지도 확대된다.
따라서, 본 발명은 종양 성장, 확산 및 전이의 원인으로서 암 줄기 세포의 성장 및 증식을 확인하고 표적으로 하는 것과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 상기 조성물 및 방법은 고유의 종양형성 바이오마커 발현 프로파일을 나타내는 암 줄기 세포에 관한 것이다. 암 줄기 세포를 특정하게 표적으로 함으로써, (초기 또는 확립된) 종양의 종양형성 및 전이 잠재력이 현저하게 약화되며, 이에 의해 향상된 치료 결과로 이어짐이 추정된다.
암 줄기 세포는 비제한적으로, 상부 호흡소화관 (구강 포함)의 편평 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 뇌암, 장암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병 및 육종을 포함하는 다양한 암과 관련될 수 있다.
편평 세포 암종은 머리 및 목 편평 세포 암종 (상부 소화호흡관 [구강 포함] 및 부비동 및 기타 부위의 편평 세포 암종 포함), 식도 편평 세포 암종, 피부 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 외음부 편평 세포 암종 및 자궁경부 편평 세포 암종을 포함한다. 한 예에서, 상부 호흡소화관 편평 세포 암종은 구강 혀의 편평 세포 암종이다.
본 발명은 암을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 암 줄기 세포 군집을 안정화시키거나 감소시키거나 근절시키는 치료 과정을 수행하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 예에서, 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 제거는 암 줄기 세포의 성장 및 증식을 표적으로 하는 요법제를 투여함으로써 달성된다.
놀랍게도, 본 출원인은 본 발명에 따른 방법에서 동정된 암 줄기 세포 군집이 RAS의 구성요소를 공동-발현하며, 암 줄기 세포 군집이 다수의 상이한 종양 유형과 관련됨을 입증한다. 단지 예시로서, 본 출원인은 OTSCC (도 4a, 4b), 흑색종 (도 7a, 7b), 육종 (도 9a, 9b), 장암 (도 11a, 11b), 뇌암 (도 13a, 13b), 유방암 (도 15a, 15b), 폐암 (도 17a, 17b), B 세포 림프종 (도 19a, 19b) 및 신장 (도 21a, 21b), 갑상선암 (도 23a, 23b), 만성 림프구성 암 (25a, 25b), 피부 편평 세포 암종 (27a, 27b), 전립선암 (29a, 29b)에서 RR 및 ATIIR2의 공동-발현을 입증한다.
따라서, 암 줄기 세포 군집의 성장 및 증식을 표적으로하는 요법은 암 줄기 세포에 의해 발현된 RAS 및/또는 프로/레닌 수용체 시스템 (PRRS)의 구성요소를 선택적으로 표적으로 하는 치료학적 제제를 투여하는 것을 포함한다. 도 1 및 2는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 따라 유용한, 이러한 시스템을 표적으로 하는 억제제/약물의 유형을 나타낸다.
레닌-안지오텐신 시스템을 표적으로 하는 공지된 치료제의 예는 비제한적으로, ACEI, ARB, DRI, 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘 채널 차단제, 칼슘 보충제 및 비타민 D를 포함한다.
ACEI의 예는 비제한적으로, 베나제프릴(Benazepril) (로테신(Lotesin)), 캅토프릴(Captopril) (카포텐(Capoten)), 실라지프릴(Cilazipril), 에날라프릴(Enalapril) (바소테크(Vasotec), 레니테크(Renitec)), 포시노프릴(Fosinopril) (모노프릴(Monopril)), 리시노프릴(Lisinopril) (리소두르(Lisodur), 로프릴(Lopril), 노바테크(Novatec), 프리니빌(Prinivil), 제스트릴(Zestril)), 모엑시프릴(Moexipril), 페린도프릴(Perindopril) (코베르세이(Coversay), 에이세온(Aceon)), 퀴나프릴(Quinapril) (악쿠프릴(Accupril)), 라미프릴(Ramipril) (알타세(Altace), 트리타세(Tritace), 라마세(Ramace), 라미윈(Ramiwin)), 트랜도라프릴(Trandolapril), 델라프릴(Delapril), 조페노프릴(Zofenopril) 및 이미다프릴(Imidapril)을 포함한다.
ARB의 예는 비제한적으로, 로사르탄(Losartan), 아이르베사르탄(Irbesartan), 칸데사르탄(Candesartan), 에프로사르탄(Eprosartan), 올메사르탄(Olmesartan), 텔미사르탄(Telmisartan), PD123319 및 발사르탄(Valsartan)을 포함한다.
베타-차단제의 예로는 비제한적으로, 아세부톨롤(Acebutolol) (섹트랄(Sectral)), 아테놀롤(Atenolol)(테노르민(Tenormin)), 베탁솔롤(Betaxolol) (베톱틱(Betoptic)), 비소프롤롤(Bisoprolol) (카르디코르(Cardicor), 엠코르(Emcor), 제베타(Zebeta)), 카르테올롤(Carteolol) (테옵틱(Teoptic)), 카르베딜롤(Carvedilol) (코레그(Coreg), 유카르딕(Eucardic)), 셀리프롤로(Celiprolol) (셀렉톨(Celectol)), 라베탈롤(Labetalol) (트란데이트(Trandate)), 레보부놀롤(Levobunolol) (베타간(Betagan)), 메티프라놀롤(Metipranolol) (메티프라놀롤 미님스(Metipranolol Minims)), 메토프롤롤(Metoprolol) (베탈록(Betaloc), 로프레소르(Lopresor), 로프레스소르(Lopressor), 토프롤 XL(Toprol XL)), 나돌롤(Nadolol) (코르가드(Corgard)), 네비볼롤(Nebivolol) (바이스톨릭(Bystolic), 네빌렛(Nebilet)), 옥스프레놀롤(Oxprenolol) (트라시코르(Trasicor), 핀돌롤(Pindolol) (비스켄(Visken)), 프로프라놀롤(Propranolol) (인데랄 LA(Inderal LA)), 소탈롤(Sotalol) (베타-카르돈(Beta-Cardone), 소타코르(Sotacor)), 및 티몰롤(Timolol) (베팀(Betim), 니오겔(Nyogel), 티몹톨(Timoptol))을 포함한다.
사이클로-옥시게나제 2 억제제의 예는 비제한적으로, 셀레콕시브(Celecoxib), 네파레낙(Nepafenac), 이부프로펜(Ibuprofen) (돌게식(Dolgesic)), 인도메타신, 설린닥(Sulindac), 잔토휴몰(Xanthohumol), 메클로페나메이트 소듐 (Meclofenamate Sodium), 멜록시캄(Meloxicam), 로페콕시브(Rofecoxib), 브롬페낙 소듐(Bromfenac Sodium), 이부프로펜 리신(Ibuprofen Lysine), 케토롤락(Ketorolac) (케토롤락 트로메타민), 디클로페낙 소듐(Diclofenac Sodium), 에토돌락(Etodolac), 케토프로펜, 나프록센 소듐(Naproxen Sodium), 피록시캄(Piroxicam), 아세메타신(Acemetacin), 페나세틴, 톨페나믹산, 니메설라이드(Nimesulide), 플루닉신 메글루민(Flunixin Meglumin), 아스피린, 부펙사막(Bufexamac), 니플루믹산(Niflumic acid), 리코펠론(Licofelone), 옥사프로진(Oxaprozin), 로르녹시캄(Lornoxicam), 루미라콕시브(Lumiracoxib), 잘토프로펜(Zaltoprofen), 암피록시캄(Ampiroxicam), 발데콕시브(Valdecoxib), 나부메톤(Nabumetone), 메페나믹산(Mefenamic Acid), 카프로펜(Carprofen), 안페낙 소듐 모노하이드레이트, 아사르알데하이드(Asaraldehyde) 및 수프로펜(Suprofen)을 포함한다.
키마제 억제제의 예는 비제한적으로, TY-51469 (2-[4-(5-플루오로-3-메틸벤조[b]티오펜-2-일)설폰아미도-3-메탄설포닐-페닐]티아졸-4-카복실산), 에글린 C(Eglin C), CI, SUN13834, 키모스타틴(Chymostatin), TJK002 벤즈이미다졸 억제제, ONO-WH-236, 암블리옴마 아메리카늄 진드기(Amblyomma americanum tick) 세린 프로테아제 억제제 6(AamS6), N-토실-L-페닐알라닐 클로로메틸 케톤(TPCK), 알파-아미노알킬포스포네이트 디아릴 에스테르, 세린 프로테아제 억제제 A3(세르핀A3), 편평 세포 암종 항원(SCCA-2), 보르테조밉(Bortezomib)(벨케이드(Velcade)), RO5066852 및 17베타-에스트라디올을 포함한다.
카텝신 B 억제제의 예는 비제한적으로, 시스타틴 B, 시스타틴 C, 시스테인 펩티다제 억제제 E64, [Pt(dmba)(aza-N1)(dmso)] 복합물 1 (수개의 종양 세포주에서 시스플라틴보다 더 낮은 IC50을 갖는 잠재적인 항-종양 약물), 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-디옥신 (TCDD), CA-074Me, 리포좀 나노담체의 엔벨로프 내로 혼입된 리피드화된 CtsB 억제제 (LNC-NS-629), 프로안토시아니딘 (PA) 및 아파티닌 Ac (ahpatinin Ac) (1) 및 아파티닌 Pr (2)를 포함한다.
카텝신 D 억제제의 예는 비제한적으로, 카텝신 D의 비-펩티드 아실구아니딘 억제제, 펩스타틴 A, Bm-아스핀(Aspin), SIPI, Via, RNAi-Rab27A 및 솔라늄 라이코페르시쿰 아스파르틱 프로테아제 억제제 (Solanum lycopersicum aspartic protease inhibitor) (SLAPI)를 포함한다.
카텝신 G 억제제의 예는 비제한적으로, WFDC12, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), 에코틴, 세르핀B1, 세르핀A3, CeEI, 또는 캐살피니아 에치나타(Caesalpinia echinata) 엘라스타제 억제제, SLPI (분비성 류코사이트 프로테아제 억제제), 알파1-안티트립신 (AAT), 바우히니아 바우히노이데스 크루지파인 억제제 (Bauhinia bauhinoides cruzipain inhibitor), 알파-아미노알킬포스포네이트 디아릴 에스테르, 그레글린(Greglin), [2-[3-[[(1-벤조일-4-피페리디닐)메틸아미노]카르보닐]-2-나프탈레닐]-1-(1-나프탈레닐)-2-옥소에틸]-포스포닉산 (KPA), 림포-에피텔리알 카잘-타입-관련 억제제 (Lympho-Epithelial Kazal-Type-related Inhibitor) (LEKTI), 트랍핀(Trappin)-2 A62L, SV-66, SCGI, 보르테조밉(Bortezomib), 인간 모노사이트/호중구 엘라스타제 억제제 (MNEI), 42-kDa 세르핀 단백질 및 항-류코프로테이나제 (ALP)를 포함한다.
칼슘 채널 차단제의 예는 비제한적으로, 디하이드로피리딘 칼슘 채널 차단제, 페닐알킬아민 칼슘 채널 차단제, 벤조티아제핀 칼슘 채널 차단제, 비선택적 칼슘 채널 차단제는 물론 "기타" 칼슘 채널 차단제를 포함한다.
디하이드로피리딘 칼슘 채널 차단제의 예는 비제한적으로, 암로디핀 (Amlodipine) (노르바스크(Norvasc)), 아라니디핀(Aranidipine) (사프레스타(Sapresta)), 아젤니디핀(Azelnidipine) (칼블록(Calblock)), 바르니디핀(Barnidipine) (하이포Ca(HypoCa)), 베니디핀(Benidipine) (코니엘(Coniel)), 실니디핀(Cilnidipine) (아텔렉(Atelec), 시날롱(Cinalong), 시스카드(Siscard)) (미국에서 입수불가능함), 클레비디핀(Clevidipine) (클레비프렉스(Cleviprex)), 이스라디핀(Isradipine) (디나서크(DynaCirc), 프레스칼(Prescal)), 에포니디핀(Efonidipine) (란델(Landel)), 펠로디핀(Felodipine) (플렌딜(Plendil)), 라시디핀(Lacidipine) (모텐스(Motens), 라시필(Lacipil)), 레르카니디핀(Lercanidipine) (자니딥(Zanidip)), 마니디핀(Manidipine) (칼스롯(Calslot), 마디핀(Madipine)), 니카르디핀(Nicardipine) (카르덴(Cardene), 카르덴 SR(Carden SR)), 니페디핀(Nifedipine) (프로카르디아(Procardia), 아달라트(Adalat)), 닐바디핀(Nilvadipine) (니바딜(Nivadil)), 니모디핀(Nimodipine) (니모탑(Nimotop)), 니솔디핀(Nisoldipine) (베이마이카드(Baymycard), 술라르(Sular), 시스코르(Syscor)), 니트렌디핀(Nitrendipine) (카르디프(Cardif), 니트레핀(Nitrepin), 베이로텐신(Baylotensin)), 프라니디핀(Pranidipine) (아칼라스(Acalas))을 포함한다.
페닐알킬아민 칼슘 채널 차단제의 예로는 비제한적으로, 베라파닐(Verapamil) (칼란(Calan), 이솝틴(Isoptin)), 갈로파밀(Gallopamil) 및 펜딜린(Fendiline)을 포함한다.
벤조티아제핀 칼슘 채널 차단제의 예로는 비제한적으로, 딜티아젬(Diltiazem) (카르디젬(Cardizem)) 및 펜딜린(Fendiline)을 포함한다.
비선택적 칼슘 채널 차단제의 예는 비제한적으로, 미베프라딜(Mibefradil), 베프리딜(Bepridil), 플루나리진(Flunarizine), 플루스피릴렌(Fluspirilene) 및 펜딜린을 포함한다.
기타 칼슘 채널 차단제의 예로는 비제한적으로, 가바펜틴(Gabapentin), 프레가발린(Pregabalin) 및 지코노티드(Ziconotide)를 포함한다.
DRI의 예는 비제한적으로, 알리스키렌을 포함한다.
특정 예에서, 암 줄기 세포는 특정 종양과 관련된 특이적 세포 계통을 향해 부분적으로 분화되고 인도될 수 있다.
한 예에서, 부분적으로 분화된 암 줄기 세포는 하나 이상의 종양형성 바이오마커의 발현을 특징으로 하거나, 상피 암 세포 마커, 림프 세포 마커, 혈관 마커, 골수 세포 마커는 물론 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양형성 바이오마커와 공동-발현된다.
상피 암 세포 마커의 예는 비제한적으로, p63, 상피 막 항원(EMA), 및 CYK 5, CYK6, CYK8 및 CYK18을 포함하는 사이토케라틴을 포함한다.
암 줄기 세포 마커의 예는 비제한적으로, CD44, CD133, CD24, 및 ALDH1을 포함한다.
림프 세포 마커의 예는 비제한적으로, LYVE-1 및 VEGFR-3을 포함한다.
혈관 마커의 예는 비제한적으로, CD34 및 ACE를 포함한다.
헤모제닉 내피 마커의 예는 비제한적으로, TAL-1을 포함한다.
골수 마커의 예는 비제한적으로, 트립타제 및 CD163을 포함한다.
상피간엽이행 (EMT) 마커의 예는 비제한적으로, Twist, Slug, SNAIL, Bmi1 및 MMP-9를 포함한다.
증식 마커의 예는 비제한적으로, Ki67을 포함한다.
예를 들어, 임의의 주어진 종양은 암 줄기 세포, 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 및 성숙한 종양 세포 등을 포함하는 세포의 다양한 군집을 가질 수 있다.
단지 예시적으로, 편평 세포 암종과 관련된 부분적으로 분화된 줄기 세포는 특정 마커 예컨대, EMA 및 p63을 발현할 수 있다. 유사하게는, 백혈병과 관련된 부분적으로 분화된 암 줄기 세포는 마커 예컨대, TAL-1 및 GATA-2를 발현할 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 또한 암 줄기 세포 (예를 들어, 배아 줄기 세포 마커를 발현)의 동정뿐만 아니라 특정 종양/암 또는 성숙 종양 세포와 관련된 특정 세포 계통에 기여하는 부분적으로 분화된 암 줄기 세포의 동정을 고려한다. 따라서, 본 발명은 기원 암 줄기 세포의 존재에 관한 초기 예후 또는 진단 (따라서 암을 갖거나 암이 발병되기 쉬운 가능성)을 제공하는데 사용될 수 있으며, 후속 질문을 통해 추적되어 예를 들어, 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 또는 성숙한 종양 세포의 프로파일을 조사함으로써 암 유형을 측정할 수 있다. 후자의 연구는 종양으로부터 수득된 또는 종양관 관련된 것으로 공지된 생물학적 샘플 예를 들어, 조직 생검 또는 종양 쉐딩 (tumor shedding)을 통한 혈액/혈청 샘플로부터 수득되는 세포에 대한 바이오마커 발현 프로파일을 사용하여 수행될 수 있다. 임의의 주어진 종양 유형에 있어서 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 및/또는 성숙한 종양 세포와 관련된 특이적 세포 마커 시그니처는 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.
암 줄기 세포 예를 들어, 고형 종양 줄기 세포는 물론 신규한 줄기 세포 암 마커와 관련된 시그니처 및 주어진 발현 프로파일은 암 줄기 세포를 갖는 종양의 진단, 특징화, 예후 및 치료에 유용하다. 바이오마커 발현 분석은 종양형성을 담당하는 암 줄기 세포의 군집 (또는 하위-군집)을 측정하는데 사용될 수 있다. 그 후, 암 줄기 세포의 이러한 하위/군집은 종양의 성장 및 확산은 물론 이의 가능한 전이를 예방하기 위해 효과적인 치료 요법을 사용하여 표적화될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 또한, 특히, 암 줄기 세포 또는 암 줄기 세포 군집의 존재에 대해 생물학적 유체 샘플을 프로파일링함으로써 암의 진단 및 예상에 유용하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 암 줄기 세포 군집의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 군집의 수준을 대조군 군집으로부터 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 증가된 암 줄기 세포 군집의 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 암 줄기 세포 군집의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 군집의 수준을 대조군 군집으로부터 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 군집의 증가된 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계, 및
(iii) 암을 가지고 있거나 암이 발병되기 쉬운 대상체에 예방학적 또는 치료학적 요법제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 예후 및 진단 방법에 따른 특정 예에서, 암 줄기 세포는 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오 마커의 발현뿐만 아니라 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 한다. 한 예에서, 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커는 OCT4, SOX2, NANOG, CD44, SAL-4, SSEA4, PSTAT3 및 H1F1로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커는 OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3으로 구성된다. 추가의 또 다른 예에서, 레닌-안지오텐신 시스템과 관련된 하나 이상의 바이오마커는 RR, ATIIR2 및 sRR로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 예후 및 진단 방법에 따른 다른 예에서, 치료학적 제제는 ACEI, ARB, 직접 DRI, 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘 채널 차단제, 칼슘 보충제 및 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 샘플로부터 수득된 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 수준을 대조군 군집으로부터의 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득되는 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 증가된 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
(i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
(ii) 샘플로부터 수득된 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 수준을 대조군 군집으로부터의 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득되는 부분적으로 분화된 암 줄기 세포 군집의 증가된 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계, 및
(iii) 암을 가지고 있거나 암이 발병되기 쉬운 대상체에 예방학적 또는 치료학적 요법제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 예후 및 진단 방법에 따른 예에서, 바이오마커 분석은 유전자 발현 및/또는 단백질 분석 기술을 이용하여 수행된다.
치료학적 제제(들)는 암 줄기 세포 군집을 선택적으로 표적으로 하는 임의의 공지된 또는 아직 확인되지 않은 치료제를 포함한다. 공지된 치료제의 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 한 예에서, 치료학적 제제는 암 세포의 대략 25% 감소, 대략 40% 감소, 대략 50% 감소 또는 대략 75% 감소를 유도한다. 이는 암 줄기 세포 및 성숙/벌크 종양 세포 둘 모두를 포함한다.
관련된 예에서, 암 세포의 감소는 인간 대상체로부터의 조직 샘플에 존재하는 암 세포 마커 표현형을 갖는 세포의 양을, 더 이른 시점에서 동일한 인간 대상체로부터의 조직 샘플에 존재하는 동일한 암 세포 마커 표현형을 갖는 세포의 양과 비교함으로써 측정된다.
암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화는 치료학적 제제를 사용하여 선택적으로 근절되거나 억제될 수 있다. 따라서, 한 예시에서, 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화는 세포 표면 항원에 결합하고 암 줄기 세포의 성장 및 증식을 저지하는 치료학적 제제를 사용하여 선택적으로 억제된다.
또 다른 예에서, 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화는 암 줄기 세포를 비-악성 세포 계통으로 분화하거나 악성 세포 계통 가능성으로부터 벌리 분화시킬 수 있는 분화 인자를 포함하는 치료학적 제제를 사용하여 선택적으로 억제된다. 분화된 세포는 더 이상 종양형성 능력을 보유하지 않는다.
암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 효과적으로 저지함으로써, 종양/벌크 세포로 분화하는 이들의 능력도 또한 억제되어 종양의 확산 및 성장을 감소시킨다.
본 출원의 발명자들은 또한, 놀랍게도 암 줄기 세포가 림프 세포 계통 (예를 들어, LYVE-1 및/또는 VEGFR-3을 발현하는 림프 세포)과 공동-발현한다는 것을 확인하였다. 따라서, 이는 암의 확산과 전이가 더욱 수용되는 혈관계 (즉, 혈관발생)보다는 림프계를 통해 이루어질 수 있으며 암의 이차 부위로의 확산 (즉, 전이)을 방지하는 수단으로서의 대안적인 표적을 제공함을 시사한다.
특정 예에서, 치료학적 제제는 일정 기간 후 (예를 들어, 치료 2, 5, 10, 20, 30회 또는 그 초과의 투여 후, 또는 2주, 1개월, 2개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 그 초과 후) 암 줄기 세포 군집의 안정화를 초래한다. 다른 예에서, 치료학적 제제는 암 줄기 세포 군집에서 5%-40%, 10%-60%, 20% 내지 99% 또는 그 초과의 감소를 달성한다. 다른 예에서는, 하나 이상의 요법제의 투여 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년 또는 4년 후에 암 줄기 세포 군집의 감소가 달성된다. 추가의 예에서, 요법에 따라, 암 줄기 세포 군집의 감소가 주기적으로 (예를 들어, 하나 이상의 요법제의 2, 5, 10, 20, 30회 또는 그 초과 투여 후 또는 하나 또는 그 초과의 요법제 제공 후 2주, 1개월, 2개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 그 초과) 관찰된다. 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 제거는 암 줄기 세포 군집에 의해 생성된 암 세포 군집을 안정화시키거나 감소시키거나 제거하며, 따라서, 종양의 성장, 종양의 벌크 크기, 종양의 형성 및/또는 전이의 형성을 안정화시키거나 감소시키거나 제거한다. 즉, 암 줄기 세포 군집의 안정화, 감소 또는 제거는 암 세포에 의한 종양 및/또는 전이의 형성, 재형성 또는 성장을 예방한다.
본 발명에 따른 치료학적 제제 또는 제제들은 시험관내 및 생체내에서 암 줄기 세포 성장을 억제할 수 있다. 다양한 치료학적 제제의 예가 하기에 더 상세하게 열거된다.
화학요법을 포함하는 통상적인 암 치료법은 암을 제어하거나 치료하기 위해 성숙한 종양 세포를 표적으로 한다. 예를 들어, 통상적인 화학요법 제제는 정상적인 세포-주기를 방해하고자 하는 것이다. 결과적으로, 표준 화학요법은 급속-순환하는 그러한 세포만을 효과적으로 표적으로 한다. 성숙한 종양 세포는 급속-순환하는 반면, 암 줄기 세포는 느리게 순환한다. 이와 같이, 통상적인 화학요법은 성숙한 종양 세포뿐만 아니라 존재하는 다른 비-종양 급속 사이클링 세포를 표적화시키고 사멸시키는 것을 포함하지만, 암 줄기 세포는 표적화되지 않고 계속 증식하기 때문에 암 줄기 세포에 대한 풍부화 효과를 갖는다.
그러면 이는 종양 벌크 세포를 재증식시켜 종양 재발을 초래하거나 전이를 초래하고 신체의 다른 곳에서 이차 종양을 형성할 기회를 암 줄기 세포에 제공한다.
암 줄기 세포 생물학은 여전히 잘 이해되고 있지 않으며, 많은 연구가 이들 세포의 독립적인 예후 지표 및 식별자로서 사용될 수 있는 단일 마커를 규명하는데 초점을 두고 있다.
본 발명자들은 암 줄기 세포의 전반적인 단백질 발현 프로파일 및 궁극적으로 종양형성을 제어하는 분자 시스템을 조사하였다. 예를 들어, 다른 중요한 분자 유발 인자 및 신호 전달 경로가 또한 관여하는 것으로 보이지만, RAS가 여기에서 역할을 수행하는 것으로 보인다 (이들 세포에 의한 ACE의 발현에 의해 지지됨; 실시예 2/표 5 참조).
발명자는 암 줄기 세포 군집의 역할에 중점을 두고 종양형성에 관여하는 분자 촉발 인자 및 신호 전달 경로를 이해함으로써, 암 줄기 세포의 선택적 표적화를 허용함으로써 암 배후의 원동력을 제거할 새로운 치료 표적을 확인하였다. 또한, 지방 조직과 같은 성숙한 세포 유형으로의 이들 세포의 분화를 유도함으로써, 이는 이들 세포의 악성 잠재력을 근절시킬 것이다.
본원에 기술된 방법 이외에, 본 발명은 또한 암의 치료 또는 예방에 유용한 약제 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제 조성물은 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절 또는 억제하기에 충분한 치료학적 제제를 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 암 치료 방법에 사용하기 위한 약제 조성물이 제공되며, 상기 약제 조성물은 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 억제하거나 근절시키기에 충분한 치료학적 제제(들)를 포함하며, 상기 방법은 암 환자에게 치료학적 제제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암 치료 방법에 사용하기 위한 제조 키트 또는 물품이 제공되며, 키트는 대상체에 치료학적 용량을 투여하는 방법에 대한 설명서와 함께 암과 관련된 종양에서 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 치료학적 제제(들)를 포함한다.
본 발명에 따른 암 줄기 세포는 (예를 들어) 레닌-안지오텐신 시스템 및/또는 프로/레닌 시스템의 주요 조절 요소를 발현하는 것으로 나타났기 때문에, 특정 종양과 관련된 암 줄기 세포 군집은 이들 시스템을 또한 표적으로 하는 것으로 알려진 약물을 치료학적 용량으로 투여함으로써 효과적으로 표적화될 수 있다. 예로는 비제한적으로, 상기 기술된 바와 같은 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB), 직접 레닌 억제제 (DRI), 베타 차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B 억제제, 카텝신 D 억제제 및 카텝신 G 억제제를 포함한 카텝신 억제제, 칼슘 채널 차단제, 칼슘 보충제 및 비타민 D를 포함한다.
특정 예에서, 암 치료 방법은 치료학적 제제의 투여 전에 치료학적 제제가 암 줄기 세포를 포함하는 샘플에서 암 줄기 세포의 양을 감소시킬 수 있음을 시험관내에서 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에 관한 보다 상세한 설명은 이하의 하위제목하에 제시된다.
레닌- 안지오텐신 시스템
레닌-안지오텐신 시스템(RAS)은 전통적으로 제한된 식이염 기간 동안 액량을 보존하는 것으로 알려져 있으며 또한 급성 액량 감소 동안 허혈을 예방한다. RAS의 주요 이펙터 펩티드는 안지오텐신 II (ATII)이다. 이는 혈관수축 및 교감신경 활성화를 유도하고, 알도스테론 수준을 높이고, 안지오텐신 II 수용체 1(ATIIR1)을 통한 신장 염 및 수분 유지를 촉진한다. 지난 수십년 동안 RAS는 심혈관 질환 (CVD)과 신장혈관 질환에 관여하기 때문에 특히 관심이 가는 약물 표적이 되었다. CVD 및 신장혈관 질환은 위험 인자, 표적 기관 손상, 사건 및 사망의 연속체로서 이해될 수 있다. 위험 인자 (예컨대, 고혈압, 이상지질혈증, 당뇨병 및 흡연)는 죽상경화증, 좌심실 비대증 (LVH) 및 신장 손상을 포함하는 표적 장기 손상의 발생으로 이어졌다. 표적 기관 손상은 점차적으로 악화되어, 결국에는 심근경색(MI), 심부전(HF), 말기 신장 질환(ESRD), 뇌졸증 또는 사망으로 이어진다.
RAS의 주요 이팩터 펩티드인 ATII는 이러한 연속체의 모든 단계 동안 적극적인 역할을 담당한다. RAS 캐스케이드의 제 1 단계는 레닌 작용하에 전구체 안지오텐시노겐으로부터의 안지오텐신 I (ATI)의 형성이며; CVD에서 RAS의 중요성에 대한 초기 증거는 레닌 활성이 심혈관 (CV) 사건의 위험을 예측한다는 일관된 발견으로부터 비롯된다. 이어서, ATI는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)에 의해 RAS의 주요 이펙터 펩티드인 ATII로 전환된다. 또한, ATII는 키마제와 같은 효소에 의해 조직에서 생성될 수 있다. 이러한 국소적으로 생성된 ATII는 파라크린 및 오토크린 기능을 매개하는 것으로 여겨진다. ATII는 ATIIR1 및 ATIIR2를 통해 작용한다. ATIIR1의 활성화는 혈관수축, 알도스테론 및 바소프레신 분비, 나트륨 보유 및 신장 관류 감소를 초래한다. 따라서, 이들 수용체는 증가된 혈압(BP) 및 심장 및 혈관 재형성을 포함하는 ATII의 해로운 효과를 매개한다. ATII 수용체의 효과는 성인에서 이들 수용체의 제한된 발현으로 인해, 이들의 비전형적인 신호전달 경로로 인해 그리고, 많은 ATII-매개된 작용이 반대되는 ATI-매개된 효과에 의해 차폐되기 때문에 덜 명확하게 규정되었다. 그러나, ATIIR2가 일반적으로 ATIIR1의 작용에 반대되며, 이는 다양한 항증식성 및 항-염증 효과를 매개하고 조직 분화 및 재생 및 아폽토시스를 촉진함이 현재 인식된다.
생활성 안지오텐신 펩티드 예컨대, 안지오텐신 III, 안지오텐신 IV, 및 안지오텐신-(1-7)을 포함하는 RAS의 추가적인 요소가 지난 십년 동안 확인되었으나, CV 및 신장 시스템에 대한 이의 효과는 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
레닌 수용체의 발견은 RAS의 생물학에 대해 추가로 설명해준다. 최근까지도 단순하게 RAS 활성화의 속도-제한 효소로서 간주된 레닌은 또한, 이들의 생물학적 활성과 무관하게, 레닌 및 프로레닌과 거의 동일하게 결합하는 레닌/프로레닌 수용체로서 공지된 단백질에 대한 리간드인 것으로 또한 밝혀졌다. 총 순환하는 레닌의 70% 내지 90%를 나타내는 프로레닌은 수용체에 결합할 때 ATI로의 안지오텐시노겐 전환의 촉매 효율 증가를 유도하며, 이는 ATII의 국소적 생성 및 이의 전신 수준에 기여할 뿐만 아니라, 레닌/프로레닌이 레닌/프로레닌 수용체에 결합하며, 세포내 신호전달 경로의 활성화, DNA의 향상된 합성, 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1, 콜라겐 1, 피브로넥틴 및 형질전환 성장 인자 β-1.6의 방출 자극을 포함하는 ATII에 독립적인 생리학적 효과를 발휘하는 것에 기여한다.
RAS를 표적으로 하는 많은 공지된 약물이 존재한다. RAS를 표적으로 하는 2가지 주요 약물 부류는 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 및 선택적인 ATI 수용체 차단제 (ARB)이다. 이들 약물 분류물 둘 모두가 ATII를 표적으로 하지만, 이들의 작용 메카니즘에서의 차이는 치료학적 결과를 가질 수 있는 다른 경로 및 수용체에 대한 이들의 효과에 영향을 끼친다. ACEI 및 ARB 둘 모두는 심혈관 및 신장 현상의 위험을 감소시키는 것으로 입증된 효과적인 항고혈압제이다.
RAS의 가장 근접한 측면인 레닌의 직접 억제는 알리스키렌(Aliskiren)의 도입으로 2007년부터 임상적으로 실현가능하게 되었다. 이러한 후자 약물은 고혈압 관리에 효과가 있는 것으로 나타났다. ACEI 또는 ARB와 직접 레닌-억제제의 조합된 요법dl 울혈성 HF 및 단백뇨와 같은 일부 임상 상황에서 평가되었으며 다양한 결과를 갖는다.
RAS 약물은 비제한적으로, 상기 기술된 바와 같은 안지오텐신-전환 효소 억제제 (ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB), 직접 레닌 억제제 (DRI), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B 억제제, 카텝신 D 억제제 및 카텝신 G 억제제를 포함한 카텝신 억제제, 칼슘 채널 차단제, 칼슘 보충제 및 비타민 D를 포함한다.
편평 세포 암종
편평 세포는 상피의 표면층을 형성하는 평평한 세포이다. 이들은 현미경으로 평평하고 얇게 보인다는 점에 의해 조직학적으로 확인될 수 있다. 편평 세포에 의해 라이닝된 상피세포는 단층 편평 상피세포 또는 중층 편평 상피세포로서 분류될 수 있다.
편평 세포 암종은 편평 세포 분화를 나타내는, 피부, 구강을 포함하는 상부 호흡소화관, 비강, 식도, 폐, 자궁경부 및 위장관을 포함하는 많은 다양한 기관에서 발견된 상피 종양을 지칭한다. 머리 및 목 편평 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 피부 편평 세포 암종, 귀 편평 세포 암종, 외음부 편평 세포 암종, 자궁경부 편평 세포 암종, 식도 편평 세포 암종, 및 기타 등등이 포함된다. 이는 편평 세포 분화를 나타내는 상피의 악성 종양이다. 편평 세포 암종은 일반적으로, 피부의 상피 층 및 때때로 신체의 다양한 점막에서 발생한다. 이러한 유형의 암은 피부, 입술, 입 내부, 후두 또는 식도에서 볼 수 있다.
머리 및 목의 가장 흔한 비-피부 종양은 상부 호흡소화관 (후두, 구인두, 구강 [구강 혀 및 입 바닥 포함] 포함)의 편평 세포 암종이다. 다소 덜 일반적인 것은 타액선, 턱, 코 및 부비동, 및 귀의 종양이다.
대부분의 머리 및 목 암은 무증상 덩어리, 궤양, 또는 가시적 점막 병변 (예를 들어, 백반, 홍색반)으로서 먼저 나타난다. 후속 증상은 종양의 위치 및 범위에 의존적이며, 통증, 감각이상, 신경 마비, 입벌림장애 및 입냄새를 포함한다. 머리 및 목 암은 수개월에서 수년 동안 국소화된 채로 유지될 수 있다. 국소 조직 침범은 결국 지역적 림프절로 전이된다. 먼 림프 전이는 후에 발생하는 경향이 있다. 혈행성(Haematogenous) 전이는 일반적으로 크거나 지속적인 종양과 관련되며, 면역결핍 환자에서 더욱 일반적으로 발생한다. 먼 전이의 일반적 부위는 폐, 간, 뼈 및 뇌이다.
구강 및 구강인두 편평 세포 암종은 매년 약 30,000명의 미국인에 영향을 준다. 구강 편평 세포 암종은 가장 일반적인 구강 및 구강인두 암이다. 구강 편평 세포 암종에 대한 주요 위험 인자는 흡연 및/또는 음주이다. 구강 혀의 편평 세포 암종은 또한 플러머-빈슨 증후군, 매독 또는 만성 트라우마로부터 발생할 수 있다. 구강 편평 세포 암종의 약 40%는 구강 혀에 영향을 끼치고 20%는 입 바닥에 영향을 끼치며, 나머지는 입술 볼점막, 구치후삼각, 폐포 및 경구개에 영향을 끼친다. 구강인두 편평 세포 암종은 혀와 연구개의 아래 및 편도 영역에 영향을 끼치며, 인간 파필로마 바이러스 감염과 관련되며, 음주와 흡연은 더 적은 역할을 담당한다.
구강 병변은 처음에는 무증상이다. 이들은 홍색판 또는 백판증 영역으로 나타날 수 있으며 외성장성이거나 궤양일 수 있다. 두 변종 모두는 경화되고 단단하며 말려들어간 경계를 갖는다. 구강인두암은 일반적으로 비대칭 팽창과 인후통으로 나타난다; 통증은 종종 동측 귀로 발산된다. 목의 전이성 종괴가 첫 증상일 수 있다.
혀의 편평 세포 암종이 국소화되는 경우 (림프절 병발이 없는 경우), 5년 생존율은 약 50%이다. 입 바닥의 국소화된 편평 세포 암종에 있어서, 5년 생존율은 65%이나, 림프절 전이된 경우, 5년 생존율은 20%이다. 하순 병변에 있어서, 5년 생존율은 90%이며, 전이는 드물다. 하순의 편평 세포 암종은 더욱 공격적이고 전이성을 띠는 경향이 있다. 구강인두 편평 세포 암종에 있어서, 환자가 림프절 병발 전 치료되는 경우 5년 생존율은 68%이며, 병발 후에는 단지 17%이다. 전이는 먼저 지역적 림프절에 도달하고 후에 폐에 도달한다. 구강 암에 대해 선택된 치료법으로는 수술 및 방사선 요법이 있다. 구강인두 암에 대해 선택된 치료법으로는 방사선요법 및 종종 화학요법이 있다.
편평 암종 줄기 세포의 특징 규명
편평 세포 암종에서, 암 줄기 세포의 특징 규명은 이러한 중요한 세포 군집에 대해 특히, 이들의 자가 재생 능력을 특정하게 표적으로 하는 새로운 치료법의 개발을 허용하여 더욱 효과적인 요법을 개발한다.
인간 편평 세포 암종에서, 자가-재생 및 분화 능력 둘 모두를 갖는 종양형성 암 세포의 하위군집이 존재함이 본원에서 입증되었다. 이들 종양형성 세포는 종양 유지를 담당하며, 또한 종양형성이 아닌 많은 비정상적으로 분화하는 자손을 발생시켜 암 줄기 세포의 기준을 충족시킨다.
편평 암종의 암 줄기 세포는 특정 마커와 관련하여 이들의 표현형 및/또는 이들의 기능적 표현형에 의해 확인된다. 일부 예에서, 이들 암 줄기 세포는 관심 마커에 대해 특이적인 시약으로 세포에 결합시킴으로써 확인 및/또는 단리된다. 분석될 세포는 생존가능한 세포일 수 있거나 고정되거나 내재된 세포일 수 있다.
일부 예에서, 관심 마커에 특이적인 시약은 항체이며, 이는 직접적으로 또는 간접적으로 라벨링될 수 있다. 이러한 항체는 일반적으로 계통 패널에 대해 특이적인 항체 및 CD44에 특이적인 항체를 포함할 것이다. 계통 패널은 일반적으로 정상적인 백혈구, 섬유아세포, 내피세포, 중피세포 등의 마커에 특이적인 시약을 포함한다. 이러한 마커는 하기 마커중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상에 대해 특이적인 시약을 포함할 수 있다: CD44, SOX2, OCT4, NANOG, 및 p63, CD34 및 EMA의 발현 결핍.
암 요법 - 일반
암의 예방, 치료 및/또는 관리에 유용하거나, 사용되었거나 현재 사용되는 임의의 요법 (예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 제제)이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 요법제 (예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 제제)은 비제한적으로, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 컨쥬게이트, 핵산 분자, 소분자, 모방 제제, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자를 포함한다. 암 요법의 비제한적 예는 화학요법, 방사선 요법, 방사선면역요법, 호르몬 요법, 표적 요법, 후성적 요법, 분화 요법, 항-혈관형성 요법, 소분자 요법, 후성적 요법, 독소 요법, 분화요법, 프로드러그 활성화 효소 요법, 항체 요법, 단백질 요법, 및/또는 면역요법을 포함하는 생물학적 요법, 및 수술을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명의 예방적 및/또는 치료적 유효 요법은 요법의 조합의 수행을 포함한다.
암 요법제의 예는 비제한적으로, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라사이클린; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘 (비다자(Vidaza)); 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 바이칼루타미드; 바이산트렌 하이드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비스포스포네이트 (예를 들어, 파미드로네이트 (아레드리아(Aredria)), 소듐 클론드로네이트 (보네포스(Bonefos)), 졸레드로닉산 (조메타(Zometa)), 알렌드로네이트 (포사막스(Fosamax)), 에티드로네이트, 아이반도르네이트, 시마드로네이트, 리세드로메이트, 및 틸루드로메이트); 비젤레신; 블레마이신 설페이트; 브레퀴나르 소듐; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세마이드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르누스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈 (Ara-C); 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈 (다코겐(Dacogen)); 탈메틸화제; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 하이드로클로라이드; EphA2 억제제; 엘사미트루신; 에놀플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDAC-I); 하이드록시우레아; 아이다루비신 하이드로클로라이드; 아이포스파미드; 일모포신; 이마티닙 메실레이트 (글레벡(Gleevec), 글리벡(Glivec)); 인터류킨 II (재조합 인터류킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-nl; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 아이프로플라틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오타이드 아세테이트; 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)); 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 항-CD2 항체 (예를 들어, 시플리주맙 (Medlmmune Inc.; 그 전체에서 본원에 참조로 통합된 국제 공개 번호 WO 02/098370)); 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 하이드로클로라이드; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥살리플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가스; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 페르포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피록산트론 하이드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보피린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔록사트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스톨락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 하이드로클로라이드; 우라실 무스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드를 포함한다.
암 요법제의 기타 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 20-에피-1,25 디하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 안타고니스트; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불리닉산; 암루비신; 암사크린; 아나글레라이드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 억제제; /-/; 안타고니스트 D; 안타고니스트 G; 안타렐릭스; 항-등쪽화결정 형태형성 단백질-1; 안티안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절인자; 아폽토시스 조절제; 아푸리닉산; 아라-CDP-D L-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 박카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 안타고니스트; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴리닉산; bFGF 억제제; 바이칼루타미드; 비산트렌; 비사지리디닐스페리민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복사미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래된 억제제; 카르젤레신; 카세인 키나제 억제제 (ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로른스; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로플라탐; 사이페마이신; 사이타라빈 옥포스페이트; 사이톨릭틱 인자; 사이토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데하이드로디뎀닌 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지퀴온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스페르민; 디하이드로-5-아자시티딘; 디하이드로탁솔, 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 아고니스트; 에스트로겐 안타고니스트; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈리움 니트레이트; 갈록시타빈; 가니렐릭스; 겔라티나제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; HMG CoA 환원효소 억제제 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴; 플루바스타틴, 레스콜, 루피토르, 로바스타틴, 로수바스타틴 및 심바스타틴); 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 하이페리신; 아이반드로닉산; 아이다루비신; 아이독시펜; 아이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극제 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 아고니스트; 인터페론; 인터류킨; 아이오벤구안; 아이도독소루비신; 아이포메아놀, 4-아이로플락트; 아이르소글라딘; 아이소벤가졸; 아이소호모할리콘드린 B; 아이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; LFA-3TIP (Biogen, Cambridge, MA; 국제 공개 번호 WO 93/0686 및 미국 특허 번호 6,162,432); 리아로졸; 선형 폴리아미드 유사체; 친지성 디사카라이드 펩티드; 친지성 플라티늄 화합물; 리스소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 리틱 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈 로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매칭된 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미톨락톨; 미토마이신 유사체; 미톤아피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 코리오닉 고나도트로핀; 모노포스포릴 리피드 A+마이오박테리움 세포 벽 sk; 모피다몰; 다약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기반 요법; 머스타드 항암제; 마이카퍼옥사이드 B; 마이코박테리아 세포 벽 추출물; 마이리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드로닉산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 니트릭 옥사이드 조절제; 니트록사이드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 오라신; 경구 사이토킨 유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드로닉산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리서페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스프아미드; 페릴릴 알코올; 펜아지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카인 하이드로클로라이드 (pilocaφine hydrochloride); 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성인자 억제제; 플라티늄 착물; 플라티늄 화합물; 플라티늄-트리아민 착물; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기반 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트; raf 안타고니스트; 랄티트렉스드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 BI; 루복실; 사핀골; 세인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 센스센스 (senescence) 유래된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 형질도입 억제제; 신호 형질도입 조절제; 감마 세크레타제 억제제, 단일쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 소파르포식산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 억제제; 줄기-세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술피노신; 과다활성 혈관작용 장 펩티드 안타고니스트; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 5-플루오로우라실; 류코보린; 타목시펜 메트아이오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 아고니스트; 티모트리난; 티로이드 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 바이클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포텐트 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 유베니멕스; 비뇨생식굴-유래된 성장 억제 인자; 유로키나제 수용체 안타고니스트; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 탈리도미드; 벨라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 항-인테그린 항체 (예를 들어, 항-인테그린 αvp3 항체); 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코브; 및 지노스타틴 스티말라머. 암 줄기 세포를 표적으로 하는데 사용될 수 있는 화합물의 비제한적 목록은 하기를 포함한다: 인터류킨-3 수용체 (IL-3R) 및 CD123의 억제제 (펩티드, 펩티드-컨쥬게이트, 항체, 항체-컨쥬게이트, 항체 단편, 및 IL-3R 또는 CDI 23을 표적으로 하는 항체 단편-컨쥬게이트 포함); 칸타리딘; 노르칸타리딘 및 이의 유사체 및 유도체;감마 세크레타제 억제제를 포함하는 노치 경로 억제제; 사이클로파민 및 이의 유사체를 포함하는 소닉 헤지호그/평활화 경로; CD96에 대한 항체; 파르테놀리드 및 이의 유사체를 포함하는 특정 NF-kB/프로테아좀 억제제; 셀라스트롤을 포함하는 특정 트리테르펜; 특정 mTOR 억제제; 유로키나제 수용체를 표적으로 하는 화합물 및 항체; 시네푼진; 특정 이노신 모노포스페이트 데하이드로게나제 (IMPDH) 억제제; PPAR-알파 및 PPAR-감마 아고니스트 및 안타고니스트 (피오글리타존, 테사슬리타자르, 무라글리타자르, 펠리글리타자르, 로베글리타존, 발라글리타존, 라그글리타자르, 로시글리타존, 파르글리타자르, 소델글리타자르, 레글리타자르, 나베글리타자르, 옥세글리타자르, 메타글리다센, 네토글리타존, 다르글리타존, 엔글리타존, 티아졸리디네디온, 알레글리타자르, 에다글리타존, 리보글리타존, 트로글리타존, 이미글리타자르, 및 스포글리타자르 포함); 텔로머라제 억제제; EpCAM (ESA)에 대한 항체; GSK-3 베타 아고니스트 및 안타고니스트 (리튬, 6-브로모이니루빈-3'-옥심 (BIO), TDZD8 포함); 디쉘브드/프리즐드(disheveled/frizzled) 또는 베타 카테닌을 억제하는 프리즐드 분자 또는 소분자에 대한 항체를 포함하는 Wnt 경로 억제제; 다중 골수종 또는 흑색종에 신규하게 사용하기 위한 항-CD20 항체 및 컨쥬게이트 (예를 들어, 리툭산(Rituxan), 벡사르(Bexxar), 제발린(Zevalin)); 항-CD133 항체; 항-CD44 항체; IL-4에 대한 항체; 특정 분화제 예컨대, 베르스나리논; 항체 또는 베툴리닉산과 같은 CD33을 표적으로 하는 화합물; 항체와 같은 락타드헤린을 표적으로 하는 화합물; CXCR4 또는 SDF-I를 표적으로 하는 소분자 또는 항체; 다약물 내성 펌프를 표적으로 하는 소분자 또는 항체; 수르비빈의 억제제; XIAP의 억제제; BcI-2를 표적으로 하는 소분자; CLL-I에 대한 항체; 및 푸린 억제제 (예컨대, 쿠쿠르비타신). 암 줄기 세포를 표적으로 하는데 또한 사용될 수 있는 화합물의 추가적인 비제한적 목록은 i) 항체, 항체 단편, 및 암 줄기 세포 상의 특정 세포 표면을 표적으로 하는 치료학적 모이어티에 컨쥬게이팅된 또는 네이키드 단백질, 또는 ii) 암 줄기 세포-기반 스크린(예를 들어, 예컨대, 화합물이 표준 방법을 통해 암 줄기 세포의 증식성 또는 생존력을 손상시키는지의 여부를 측정하는 스크린)을 통해 추가로 확인되거나 최적화될 수 있는 (예를 들어, 화학반응을 통해) 것을 포함하는 당업계에 공지된 소분자를 포함하며, 세포 표면 및 세포내 표적은 Rexl (Zfp42), CTGF, 액티빈 A, Wnt, FGF-2, HIF-I, AP- 2감마, Bmi-1, 뉴클레오스테민, 히위(hiwi), Moz-TIF2, Nanog, 베타-아레스틴-2, OCT4, SOX2, 스텔라, GDF3, RUNX3, EBAF, TDGF-I, 노달, ZFPY, PTNE, EvM5 Pax3, McI-I, c-키트, Lex-1, Zfx, 락타드헤린, 알데하이드 데하이드로게나제, BCRP, 텔로머라제, CD133, Bcl-2, CD26, 그렘린(Gremlin), 및 FoxC2을 포함한다 (총 망라하는 것은 아님).
일부 예에서, 사용된 요법제(들)는 면역조절제이다. 면역조절제의 비제한적인 예로는 단백질성 제제 예컨대, 사이토킨, 펩티드 모방체, 및 항체 (예를 들어, 인간, 인간화된, 키메라, 모노클로날, 폴리클로날, Fvs, ScFvs, Fab 또는 F(ab)2 단편 또는 에피토프 결합 단편), 핵산 분자 (예를 들어, 안티센스 핵산 분자 및 트리플 헬릭스), 소분자, 유기 화합물, 및 무기 화합물을 포함한다. 특히, 면역조절제는 비제한적으로, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 사이클로포스파미드, 시톡산(Cytoxan), 이뮤란(Immuran), 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제 (예를 들어, FK506 (타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론 (MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신 (시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아미드 (예를 들어, 레피우나미드), T 세포 수용체 조절제, 사이토카인 수용체 조절제, 및 비만 세포 조절제를 포함한다. 면역조절제의 다른 예는 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 인용된 미국 공개 번호 2005/0002934 Al의 단락 259-275에서 찾을 수 있다. 한 예에서, 면역조절제는 화학요법제이다. 대안적 예에서, 면역조절제는 화학요법제 이외의 면역조절제이다. 일부 예에서, 본 발명에 따라 사용된 요법제(들)는 면역조절제가 아니다.
일부 예에서, 사용된 요법제(들)는 항-혈관형성제이다. 항-혈관형성제의 비제한적 예는 혈관형성을 감소시키거나 억제하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체 (예를 들어, 인간, 인간화된, 키메라, 모노클로날, 폴리클로날, Fvs, ScFvs, Fab 단편, F(ab)2 단편, 및 이의 항원-결합 단편) 예컨대, TNF-α에 특이적으로 결합하는 항체, 핵산 분자 (예를 들어, 안티센스 분자 또는 트리플 헬릭스), 유기 분자, 무기 분자, 및 소분자를 포함한다. 항-혈관형성제의 다른 예는 예를 들어, 그 전체가 참조로 인용된 미국 공개 번호 2005/0002934 Al의 단락 277-282에서 찾아볼 수 있다. 기타 예에서, 본 발명에 따라 사용된 요법제(들)는 항-혈관형성제가 아니다.
특정 예에서, 사용된 요법제는 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사산물, 및 안트라사이클린, 토포아이소머라제 II 억제제, 또는 유사분열 억제제이다. 알킬화제는 비제한적으로, 부술판, 시스플라틴, 카르보플라틴, 콜로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 데카르바진, 메클로르에탄아민, 메팔렌, 및 테모졸로미드를 포함한다. 니트로소우레아는 비제한적으로, 카르무스틴(BCNU) 및 로무스틴 (CCNU)를 포함한다. 항대사산물은 비제한적으로, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 젬시타빈, 시타라빈, 및 플루다라빈을 포함한다. 안트라사이클린은 비제한적으로, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 및 미톡산트론을 포함한다. 토포아이소머라제 II 억제제는 비제한적으로, 토포테칸, 이리노테칸, 에토피시드 (VP-16), 및 테니포시드를 포함한다. 유사분열 억제제는 비제한적으로, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 및 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈)을 포함한다.
본 발명은 암 줄기 세포를 표적으로 하는 제제의 사용을 포함한다. 특정 예에서, 제제는 화학 또는 재조합 기법을 통해 치료학적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되거나 네이키드인 펩티드 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 제제, 소분자, 또는 생물제제이다. 치료학적 모이어티의 비제한적 예는 비제한적으로, 치료학적 효소, 화학요법제, 사이토킨, 박테리아 독소, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신, 라디오뉴클리드, RN아제, 및 항대사산물을 포함한다. 일부 예에서, 사용된 제제는 마커 예를 들어, 암 줄기 세포 상의 항원에 결합하는 제제이다. 특정 예에서, 제제는 정상 줄기 세포보다 암 줄기 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원에 결합한다. 또 다른 특정 예에서, 제제는 정상 줄기 세포와 동일한 수준으로 암 줄기 세포 상에서 발현되는 항원에 결합한다.
특정 예에서, 제제는 정상 줄기 세포이거나 아닌 암 줄기 세포 항원에 특이적으로 결합한다. 기타 예에서, 본 발명에 따라 사용된 요법제(들)는 암 줄기 세포 상의 마커에 결합되는 제제이다. 한 예에서, 암 줄기 세포 상의 마커에 결합하는 제제는 항체 또는 항체 단편이다 - 이들 중 하나는 네이키드이거나 치료학적 모이어티 예컨대, 치료학적 효소, 화학요법제, 사이토킨, 박테리아 독소, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신, 라디오뉴클리드, RN아제, 및 항대사산물에 컨쥬게이팅될 수 있다.
예를 들어, 특정 예에서, 제제는 IL-3 수용체 (IL-3R) 또는 이의 α-서브유닛 (즉, CD123 항원)에 특이적으로 결합한다. 일부 예에서, IL-3R에 결합하는 제제는 IL-3R 또는 이의 α-서브유닛에 대해 특이적인 항체이다. 항체는 연결제를 사용하여 화학적으로 또는 재조합적으로 치료학적 모이어티 (예를 들어, 화학요법제, 식물-, 진균류- 또는 박테리아-유래된 독소, 또는 라디오뉴클리드, RNA아제)에 컨쥬게이팅되어 세포 치사 반응을 수행할 수 있다. 특정 예에서, 항체 또는 항체-컨쥬게이트는 IL-3R의 α-서브유닛 (즉, CDI 23 항원)에 결합한다. 즉, 항체 또는 항체-컨쥬게이트는 IL-3R α-서브유닛에 결합하나, IL-3R β-서브유닛에는 결합하지 않는다. 다른 예에서, 항체 또는 항체-컨쥬게이트는 α 및 β 서브유닛 둘 모두를 함유하는 IL-3R에 면역특이적으로 결합한다. IL-3R에 대한 항체 및 IL-3R에 대한 항체의 모방체를 제조하는 방법은 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 통합된 미국 특허 번호 6,733,743 B2에 기술되어 있다.
다른 예에서, 암 줄기 세포 상의 마커에 결합하는 제체는 리간드이다. 일부 예에서, 리간드는 암 줄기 세포 상의 사이토킨 수용체에 결합하는 사이토킨이다. 특정 예에서, 리간드는 독소를 포함하는 치료학적 모이어티에 컨쥬게이팅될 수 있는 인터류킨-3(IL-3)이다. IL-3-독소 컨쥬게이트는 독소가 단백질 예컨대, 디프테리아 독소인 예에서 융합 단백질 형태로 존재할 수 있다. IL-3-디프테리아 독소 융합 단백질 ("IL3DT")을 제조하고 단리하는 방법은 그 기재내용 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Frankel et al., "Diphtheria toxin fused to human interleukin-3 is toxic to blasts from patients with myeloid leukemias,"], [Leukemia 14:576 (2000) and Urieto et al., "Expression and purification of the recombinant diphtheria fusion toxin DT388IL3 for phase I clinical trials,"], 및 [Protein Expression and Purification 33: 123-133 (2004)]에 기재되어 있다. 다른 예에서, 요법제는 IL3DT가 아니다.
특정 예에서, 암 줄기 세포 상의 마커에 결합하는 항체는 치료된 대상체에서 실질적으로 비-면역 원성이다. 비-면역원성 항체를 수득하는 방법은 비제한적으로, 항체를 키메라시키고, 항체를 인간화시키고, 항체 단편을 생성시키고, 치료법 처리되는 대상체와 동일한 종으로부터 항체를 생성시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 참조로 통합된 미국 공개 번호 2005/0002934 Al의 단락 539-573 참조. 암 줄기 세포에서 마커에 결합하는 항체는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 예에서, 사용된 요법은 암 줄기 세포 및/또는 암 세포를 파괴하는 x-선, 감마 선 및 방사선의 기타 공급원의 사용을 포함한다. 특정 예에서, 방사선 요법은 외부 빔 방사선 또는 원격요법으로서 수행되며, 방사선은 원격 공급원로부터 유도된다. 다른 예에서, 방사선 요법은 방사선 활성 공급원이 암 줄기 세포, 암세포 및/또는 종양 덩어리에 가까운 신체 내부에 배치되는 내부 요법 또는 근접치료법으로서 수행된다.
일부 예에서, 사용된 요법은 증식 기반 요법이다. 이러한 요법의 비제한적 예는 상기한 바와 같은 화학요법 및 방사선 요법을 포함한다.
현재 이용가능한 요법제 및 이의 투여량, 투여 경로 및 권장 사용은 당업계에 공지되어 있으며, [Physician's Desk Reference (60th ed., 2006)]와 같은 그러한 문헌에 기재되어 있다. 당업계에 공지된 투여 경로는 비제한적으로, 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 피내, 종양내, 뇌내, 척추강내 및 비내를 포함한다. 일부 예에서, 요법제는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의 일부로서 투여된다.
시험관내 검정
본원에 기술된 요법은 암 세포의 양 및/또는 암 세포를 감소시키거나 이들의 증식을 억제하는 이들의 능력에 있어서 시험관내 및/또는 생체내에서 평가될 수 있다. 암 줄기 세포, 암 세포 및/또는 면역 세포 (예를 들어, 림프구)의 양을 안정화시키거나 감소시키거나 이들의 증식을 억제하는 요법의 능력은 암 줄기 세포, 암 세포, 및 면역 세포 상의 항원 발현을 검출하고; 암 줄기 세포, 암 세포 및 면역 세포 증식을 검출하고; 기능성 검정법을 이용하여 암 줄기 세포 및 암 세포를 검출함으로써 평가될 수 있다. 당업자에게 공지된 기법은 이들 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식은 3H-티미딘 혼입 검정 및 트립판 블루 세포 계수에 의해 검정될 수 있다. 항원 발현은 예를 들어, 기술 예컨대, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 방사성면역 검정법, ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정법), "샌드위치" 면역검정법, 면역침전 검정법, 침강 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-결합 검정, 면역방사측정 검정, 형광 면역 검정, 단백질 A 면역검정, 면역형광법, 유동 세포 계측법 및 FACS 분석을 이용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 비제한적으로 포함하는 면역검정에 의해 검정될 수 있다.
본 발명의 화합물, 약제 조성물, 치료학적 또는 예방학적 제제는 인간에 사용하기 전에 요망되는 치료학적 또는 예방학적 활성에 대해 시험관내 및 이어서 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 특정 화합물의 투여가 효과적인지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있는 검정은 세포 및 조직 배양 검정을 포함하며, 여기에서 환자 조직 샘플 (예를 들어, 암 세포 또는 암 줄기 세포)는 배양물에서 성장되며, 화합물에 노출되거나 다르게는 이와 접촉되며, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과가 관찰된다. 조직 샘플은 환자의 생검으로 얻을 수 있다. 이러한 평가는 각 개별 환자에 대해 치료학적으로 가장 효과적인 요법제 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 확인을 허용한다.
요법제는 바람직하게는, 인간에 사용하기 전에 요망되는 치료학적 또는 예방학적 활성에 대해 시험관내 및 이어서 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 특정 화합물의 투여가 효과적인지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있는 검정은 세포 및 조직 배양 검정을 포함하며, 여기에서 환자 조직 샘플 (예를 들어, 암 세포 또는 암 세포)는 배양물에서 성장되며, 예방학적 또는 치료학적 화합물에 노출되거나 다르게는 이와 접촉되며, 조직 샘플에 대한 이러한 화합물의 효과가 관찰된다. 조직 샘플은 환자로부터 생검에 의해 얻을 수 있다. 이러한 평가는 각 개별 환자에 대해 치료학적으로 가장 효과적인 요법제 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 확인을 허용한다. 특정 예에서, 요법제의 효과는 예를 들어, XTT 검정과 같은 당업계에 공지된 표준 검정법을 사용하여 세포 생존능 분석에서 평가된다.
독성 검정
본원에 기술된 요법제의 독성 및/또는 효능은 예를 들어, LD50 (군집의 50% 까지 치사되는 투여 량) 및 ED50 (군집의 50%에서 치료학적 효과가 있는 투여량)을 측정하기 위한 세포 또는 조직 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로서 표현될 수 있다 - 높은 치료 지수를 나타내는 방식이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 방식이 사용될 수 있지만, 비감염된 세포로의 잠재적 손상을 최소화하고 이에 의해 부작용을 감소시키기 위해 감염된 조직의 부위로 이러한 제제를 표적화시키는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에 사용하기 위한 요법제의 투여량 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 이러한 제제의 투여량은 바람직하게는, 정상 조직에 거의 또는 전혀 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 있다. 투여량은 사용된 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위내에서 변화될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 요법에 있어서, 예방학적 및/또는 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양에서 측정되는 IC50 (즉, 증상의 최대-절반 억제를 달성하는 평가 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 투여량이 동물 모델에서 정해질 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 측정하는데 사용될 수 있다. 혈장 중 화합물 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
제조 물품
본 발명은 또한, 마무리되어 포장되고 라벨링된 약학 제품(들)을 포함한다. 이러한 제조 물품은 적절한 용기 또는 컨테이너 예컨대, 유리병 또는 기타 밀폐 밀봉된 컨테이너의 적절한 단위 투여량 형태를 포함한다. 약학 제품은 예를 들어, 제 1 컨테이너에서 단위 투여량 형태의 예방학적 또는 치료학적 제제, 및 제 2 컨테이너에서 주입용 멸균수를 함유할 수 있다. 대안적으로, 단위 투여량 형태는 경구, 경피, 비강내 또는 국소 전달에 적합한 고체일 수 있다.
특정 예에서, 단위 투여량 형태는 정맥내, 근육내, 비내, 경구, 국소 또는 피하 전달에 적합하다. 따라서, 본 발명은 각각의 전달 경로에 적합한 용액 바람직하게는, 무균 용액을 포함한다.
일부 예에서, 약학 제품은 본원에 기재된 예방학적 및/또는 치료학적 제제이다. 일부 예에서, 약학 제품은 예방학적 및/또는 치료학적 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물이다. 특정 예에서, 약제 조성물은 적절한 투여 경로를 위한 형태로 존재한다. 이러한 경로는 비제한적으로, 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 피부내, 종양내, 뇌내, 척추강내 및 비내 경로를 포함한다.
임의의 약학 제품과 함께, 포장재 및 컨테이너는 저장 및 운반 동안 제품의 안정성을 보호하도록 설계된다. 또한, 본 발명의 제품은 해당 질환 또는 장애를 적절하게 예방 또는 치료하는 방법에 대해 의사, 기술자 또는 환자에게 조언하는 사용 설명서 또는 기타 정보 자료를 포함한다. 즉, 제조 물품은 비제한적으로, 실제 용량, 투여 빈도, 투여 기간, 암 세포 계수, 암 줄기 세포 계수, 림프구 계수, 친핵구 계수에 대한 투여 모니터링 절차 기간, 및 기타 모니터링 정보를 포함하나 이에 제한되지 않는 투약 방식을 나타내거나 시사하는 지시 수단을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 포장재 예컨대, 박스, 병, 튜브, 바이알, 컨테이너, 스프레이어, 취분기, 정맥내 (i.v.) 백, 엔벨로프 및 기타 등등; 및 상기 포장재 내부에 함유된 약제의 적어도 하나의 단위 투여량 형태를 포함하는 제조 물품을 제공하며, 상기 약제는 예방학적 또는 치료학적 제제를 포함하며, 상기 포장재는, 상기 제제가 본원에 기술된 바와 같은 특정 투약 요법을 이용하여 특정 투여량을 투여함으로써 암과 관련된 하나 이상의 증상, 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 및/또는 완화시키는데 사용될 수 있는지를 나타내는 설명 수단을 포함한다.
특정 예에서, 제조 물품은 암 줄기 세포에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하고, 암 세포에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 라벨링된 항체를 포함한다. 이와 같이, 제품은 치료 방식에 이용되는 투여량을 조절하고, 방식의 효율을 모니터링하는 방법을 함유한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 감소되거나 회피될 수 있는 부작용이 암의 예방, 치료 및/또는 관리에 사용하기 위한 제조 물품에 들어있는 정보 재료에 표시되어 있음을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 감소되거나 회피될 수 있는 부작용은 비제한적으로, 생체 신호 이상 (발열, 심박급속증, 고혈압, 저혈압), 혈액학적 사건 (빈혈, 림프구 감소증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증), 두통, 오한, 어지럼, 구역, 무력증, 등 통증, 가슴 통증 (가슴 압박), 당뇨병, 근육통, 통증, 가려움증, 건선, 비염, 발한, 주사 부위 반응 및 혈관 확장을 포함한다.
또한, 암 예방, 치료 및/또는 관리에 사용하기 위한 제조 물품에 밀봉된 정보 자료는 외래 단백질이 또한 아나필락시스 또는 시토신 방출 증후군을 포함하는 알레르기 반응을 일으킬 수 있음을 나타낼 수 있다. 정보 자료는 알레르기 반응이 단지 약한 소양성 발진으로서 나타날 수 있거나 홍색피부증, 스티븐-존슨 증후군, 혈관염 또는 아나필락시스와 같이 심각할 수 있음을 나타내야 한다. 정보 자료는 또한, 아나필락시 반응 (아나필락시스)이 심각하고 때로는 치명적인 과민 반응임을 나타내야 한다. 아나필락시스를 포함하는 알레르기 반응은 임의의 외래 단백질이 체내에 주입될 때 발생할 수 있다. 이들은 두드러기나 발진과 같은 가벼운 증상에서 치명적인 전신 반응에 이르기까지 다양할 수 있다. 아나필락시 반응은 일반적으로, 노출 후 10분 이내에 바로 발생한다. 환자는 감각 이상, 저혈압, 후두 부종, 정신 상태 변화, 안면 또는 인두 혈관 부종, 기도 폐쇄, 기관지경련, 두드러기 및 가려움증, 혈청병, 관절염, 알레르기성 신염, 사구체신염, 일시적 관절염, 또는 호산구 증가증을 겪을 수 있다.
키트
본 발명은 또한, 암 줄기 세포를 검출하고/거나 모니터링하고/거나 측정하기 위한 시약으로 채워진 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 한 예에서, 약제 팩 또는 키트는 선택적으로, 암 줄기 세포를 검출하고/거나 측정하기 위해 제공된 시약의 사용 설명서를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제 팩 또는 키는 선택적으로, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지를 포함하며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 사용 또는 판매에 대한 제조 기관에 의한 승인을 반영한다.
한 예에서, 약제 팩 또는 키트는 하나 이상의 컨테이너에 암 줄기 세포 표면 마커-결합제를 포함한다. 특정 예에서, 제제는 암 줄기 세포 표면 마커에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 제제는 임의의 암 줄기 세포 표면 마커와 교차-반응하는 항체 (예를 들어, 인간, 인간화, 키메라, 모노클로날, 폴리클로날, Fvs, ScFvs, Fab 또는 F(ab)2 단편 또는 에피토프 결합 단편 포함)일 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 미국 특허 번호 6,004,528의 표 1 또는 미국 특허 출원 번호 09/468,286의 표 1, 2 또는 3, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0083682, 2007/0036800, 2007/0036801, 2007/0036802, 2007/0041984, 2007/0036803, 및 2007/0036804에 기록된 암 줄기 세포 표면 마커 중 어느 하나와 반응하며, 상기 특허 문헌 각각은 본원에 참조로 통합된다. 이러한 예에 따르면, 약제 팩 또는 키트는 암 줄기 세포 표면 마커에 결합하는 하나 이상의 항체를 포함하며, 여기에서 각 항체는 암 줄기 세포 표면 마커의 다양한 에피토프에 결합하고/거나 다양한 친화도의 암 줄기 세포 표면 마커에 결합한다.
항체 기반 키트의 경우, 키트는 예를 들어: (1) 암 줄기 세포 표면 마커 단백질에 결합하는 제 1 항체 (고형 지지체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있음); 및 선택적으로, (2) 제 1 항체에 의해 결합된 암 줄기 세포 표면 마커 단백질 또는 제 1 항체에 결합하며 검출 가능한 라벨 (예를 들어, 형광 라벨, 방사성 동위 원소 또는 효소)에 컨쥬게이팅된 제 2의 상이한 항체를 포함할 수 있다. 항체-기반 키트는 또한 면역침전을 수행하기 위한 비드를 포함할 수 있다. 항체-기반 키트의 각 구성요소는 일반적으로 자체의 적합한 컨테이너에 존재한다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각 항체에 적합한 별개의 컨테이너를 포함한다. 또한, 항체-기반 키트는 검정을 수행하기 위한 설명서 및 검정 수행으로부터 발생한 데이터를 해석하고 분석하는 방법을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 백혈병 암 줄기 세포 (CD34+/CD38-/CD123+임)를 단리시키고/거나 정량화하고/거나 이의 양 측정을 보조하기 위한 양성 선택용 항-CD34 항체, 음성 선택용 항-CD38 항체, 및 양성 선택용 항-CD123 항체를 포함할 수 있다.
핵산 마이크로어레이 키트에 있어서, 키트는 일반적으로 고형 지지체 표면 상에 부착된 특정 유전자에 특이적인 프로브를 포함한다 (그러나, 이에 제한되지 않음). 다른 예에서, 프로브는 가용성이다. 그러한 한 예에서, 프로브는 150개 뉴클레오티드 길이 내지 800개 뉴클레오티드 길이 범위의 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 더 긴 길이의 프로브일 수 있다. 프로브는 검출 가능한 라벨로 라벨링될 수 있다. 마이크로어레이 키트는 검정을 수행하기 위한 설명서 및 검정 수행으로부터 발생한 데이터를 해석하고 분석하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 키트는 또한, 프로브가 암 줄기 세포 표면 마커 핵산 서열에 하이브리드화될 때 생성되는 신호를 검출하는데 필요한 시약 및/또는 하이브리드화 시약을 포함할 수 있다. 일반적으로, 마이크로어레이 키트의 재료 및 시약은 하나 이상의 컨테이너에 존재한다. 키트의 각 구성요소는 일반적으로 자체의 적합한 컨테이너에 존재한다.
정량적 PCR의 경우, 키트는 일반적으로 특정 암 줄기 세포 표면 마커 핵산 서열에 특이적인 사전 선택된 프라이머를 포함한다. 정량적 PCR 키트는 또한, 핵산 증폭에 적합한 효소 (예를 들어, 폴리머라제 예컨대, Taq), 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 증폭을 위한 반응 혼합물에 필요한 완충액을 포함할 수 있다. 정량적 PCR 키트는 또한 병태와 관련되거나 병태를 나타내는 핵산 서열에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다. 프로브는 플루오로포어로 라벨링될 수 있거나 없다. 프로브는 켄처 분자로 라벨링될 수 있거나 없다. 일부 예에서, 정량적 PCR 키트는 또한, 역전사 반응에 필요한 완충액 및 데옥시뉴클레오티드와 함께 역전사용 프라이머 및 효소 (예를 들어, AMV, MMLV 및 기타 등등과 같은 역전사효소)를 포함하는, RNA 역전사에 적합한 구성요소를 포함한다. 정량적 PCR 키트의 각 구성요소는 일반적으로 자체의 적합한 컨테이너에 존재한다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각 개별 시약, 효소, 프라이머 및 프로브에 적합한 별개의 컨테이너를 포함한다. 또한, 정량적 PCR 키트는 검정을 수행하기 위한 설명서 및 검정 수행으로부터 발생한 데이터를 해석하고 분석하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로, 예를 들어, 표준 또는 대조군으로서 사용하기 위해 소정량의 분리된 암 줄기 세포 표면 마커 폴리 펩타이드 또는 암 줄기 세포 표면 마커를 엔코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 진단 방법은 임상 연구의 수행 또는 모니터링을 보조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 대상체로부터 수득한 예를 들어, 혈청 또는 조직의 적합한 시험 샘플이 진단에 사용될 수 있다.
약제 팩 또는 키트의 사용에 의해 얻어진 결과 (즉, 암 줄기 세포의 양이 안정화되거나 감소되었는지 여부)에 기초하여, 암 요법 또는 처방을 수행하는 의료 종사자는 치료 또는 처방을 계속 선택할 수 있다. 대안적으로, 암 줄기 세포의 양이 증가한 결과를 토대로 의료 종사자는 치료법 또는 요법을 계속하거나, 변경하거나 중단하도록 선택할 수 있다.
본 명세서에서 선행 기술 문헌에 대한 어떠한 언급도 그러한 선행 기술이 널리 알려져 있거나 해당 분야의 일반적인 지식의 일부를 구성함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하다", "포함하는" 및 유사어는 배타적이거나 총 망라한 의미로 해석되어서는 안된다. 즉, 이들은 "비제한적으로 포함하는"을 의미하고자 한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술된다. 청구된 본 발명은 이들 실시 예에 의해 어떠한 방식으로도 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
재료
항체
면역조직 화학에 사용된 항체, 이들의 최적화된 희석액 및 공급처는 표 1에 알파벳 순으로 나열되어 있다.
표 1. 항체, 희석액 및 공급처
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
화학 물질 및 시약
본 연구에 사용된 화학 물질과 시약 및 이들의 공급처는 표 2에 기록되어 있다.
표 2. 화학 물질 및 시약
Figure pct00004
완충제 , 용액 및 착색제
본 연구에서 사용된 완충제, 용액 및 착색제는 표 3에 기록되어 있다.
표 3. 완충제 , 용액 및 착색제
Figure pct00005
Figure pct00006
오토스테이너 면역조직화학에 사용된 키트 및 이들의 공급처는 표 4에 기록되어 있다.
표 4. 면역조직화학 오토스테이너 키트
Figure pct00007
방법
포르말린-고정되고 파라핀-매립된 절편 준비
포르말린 고정되고 파라핀-매립된 SCCOT 절편의 4um 절편을 마이크로톰을 사용하여 절단하고, 40℃의 수조에서 스트레칭시키고, 유리 슬라이드에 옮기고 밤새 실온에서 건조시켰다.
H&E 염색
H&E 염색은 환자 당 한 개의 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 슬라이드에서 수행하였다.
H&E 염색 분석
컨설턴트 병리학자는 H&E 염색된 슬라이드를 사용하여 잘 분화된 군, 중간으로 분화된 군 및 불량하게 분화된 군으로 병변을 초기 등급화시켰다. 이들은 차후 표본 내의 IHC 염색 패턴의 방향 및 조직 형태에 대한 기준으로서 사용되었다.
자동화된 형광 면역조직화학 절차
이중 염색, 삼중 염색 또는 사중 염색으로 자동화된 형광 면역염색은 Leica Bond RX Immunohistochemistry Autostainer(Nussloch, Germany)를 사용하여 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다.
자동화된 DAB 면역조직화학 염색 절차
단일 염색의 자동화된 DAB 면역염색은 Leica Bond RX Immunohistochemistry Autostainer(Nussloch, Germany)를 사용하여 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다.
가시화, 사진 및 이미지 분석
DAB로 염색된 슬라이드를 Olympus BX53 현미경과 Olympus SC100 현미경 카메라로 보았다.
DAB 면역염색된 슬라이드를 Olympus BX53 현미경과 Olympus SC100 현미경 카메라를 사용하여 관찰하고 캡처링하였다. 이미지의 정성 분석은 비-염색, 약한-양성 염색, 강한 양성 염색으로서 기술하였다. 조직 내 양성 염색의 위치, 양성 세포의 형태 및 양성 염색 세포 내 염색의 정확한 위치에 대한 관찰을 또한 기록하였다.
형광 면역염색된 슬라이드는 Olympus FV1200 생물학적 공촛점 레이저-스캐닝 현미경(Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하고 캡처링하였다.
이미지의 정성 분석은 비-염색, 염색 또는 공동-염색으로서 기술하였다.
세포 내 마커 발현의 위치화는 FV-10 소프트웨어를 사용하여 분석하여, 단일 세포의 직경에 걸쳐 다중 마커 발현의 상대적 강도를 생성하였다. 발현은 핵, 세포질 및 막 영역으로 분리되었다. 이들 각 부분의 평균 염색 강도는 환자 당 9 개의 개별 세포로 계산되었다. 이는 환자의 세포 내에서의 염색의 정확한 위치에 관한 일반화를 가능하게 하였다. 예를 들어, 핵 70%, 세포질 30%, 막 0%.
웨스턴 블롯팅
샘플 취급 및 준비
수술용 견본을 수술실에서 GMRI 연구소로 직접 옮기고, 여기에서 이것들을 Cryovials에 넣고 액체 질소로 급속 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다.
스냅-냉동된 조직을 냉동고에서 꺼내어 적절한 크기 (40-80mg)로 나누었다. 사용될 샘플의 질량을 기록하고, 임의의 나머지 조직은 즉시 원래의 Cryovial에 넣고 향후 연구를 위해 -80℃에서 보관하였다. 샘플은 되도록 얼음에 보관하였다.
샘플을 RIPA 완충제와 프로테아제 억제제를 함유하는 개별 에펜도르프 튜브에 첨가하고 (10mg/500uL/5uL), 이어서 유리 유발에 옮기고 얼음 상에서 유봉으로 균질화될 때까지 분쇄하였다. 이어서 조직 현탁액을 에펜도르프 튜브로 다시 옮기고, 5분 동안 얼음상에서 인큐베이션시킨 후, 20분 동안 4℃에서 13300rpm으로 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음에 보관하였다. 펠렛을 버렸다.
단백질 검정
QubitTM 작업 용액은 QubitTM 시약 1ul을 199ul QubitTM 완충제로 희석하여 표준 물질과 샘플을 각각 200uL로 만들어 준비하였다. 190-199ul Qubit™ 작업 용액에 10ul (단백질 표준)을 첨가하여 3가지 단백질 표준을 준비하였다. 이어서, 표준 물질을 2-3초 동안 볼텍싱하고 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 각 표준 물질을 QubitTM 2.0 형광측정기에 순차적으로 넣어 표준 곡선을 도출하였다.
실험 단백질 샘플은 190uL의 Qubit™ 작업 용액에 10uL의 용해물을 첨가하여 200ul로 만들어 준비하였다. 그런 다음 QubitTM 2.0 형광측정기를 사용하여 샘플을 판독하고, 희석 계산기 기능을 사용하여 원래 원액 샘플 중의 단백질 농도를 계산하였다.
샘플에 과량의 단백질이 존재하기 때문에 샘플 단백질 농도가 판독될 수 없다면, 용해액을 희석하고 만족스러운 판독 값이 얻어질 때까지 공정을 반복하였다.
이어서, 조직 용해물 샘플을 에펜도르프 튜브 내로 분취하여 반복되는 동결/해동 사이클에 의해 초래되는 오염 위험과 손상을 줄였으며, 이어서 후속 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다.
용해물 샘플을 냉동고에서 꺼내고 얼음상 유지시켰다. 각 샘플의 부피는 단백질 농도 (겔 상의 웰 당 동일량의 단백질의 로딩을 허용함)를 토대로 계산한 다음, 여기에 추출 버퍼를 각 샘플이 동일 부피 (10uL)가 되도록 첨가하였다.
작업 용액 (Laemmli 완충액 9.5uL 및 β-메르캅토에탄올 0.5uL)을 샘플 당 10uL가 되도록 제조하였다. 이어서, 10uL 샘플 및 10uL 작업 용액을 10분 동안 가열 블록상에서 비등시켰다.
겔 전기영동
Laemmli SDS-PAGE 런닝 완충액은 100mL 10x 원액을 900mL ddH20에 첨가하여 제조하였다.
콤(comb) 및 테이프를 미니-SDS PAGE 겔에서 제거하고 Mini-Protean 테트라 셀을 조립하고 내부 및 외부 챔버를 1x 런닝 완충액으로 채웠다.
2.5uL의 단백질 표준 물질 (분자량 마커)을 겔 웰 1에 로딩하고, 20uL의 단백질 샘플을 나머지 웰에 로딩하였다.
이어서, 샘플이 겔에 유입될 때까지 110V에서 5분간 겔을 런닝시킨 후 전압을 30분 동안 200V로 증가시켰다. 이어서 겔을 제거하고, 겔 (로딩 염료 함유)의 웰 및 바닥을 메스로 절단하였다.
막으로의 겔의 반-건식 이동
전달 샌드위치는 Bio-Rad Trans-Blot TurboTM 전달 시스템에서 하기 정확한 순서로 조립하였다: 여과지, PVDF 막, 겔, 여과지. 소량의 1 x 런닝 완충액을 막을 적시는데 사용하고 롤러를 사용하여 임의의 갇힌 기포를 제거하였다. 그런 다음 챔버를 닫고 정확한 설정값 (TURBO, 1 MINI GEL (1,3A, 25V, 7 분) A: 런)으로 전달을 시작하고 7분 동안 런닝시켰다. 이어서 블롯을 샌드위치로부터 제거하고 작업 용액에 잠깐 위치시켰다.
면역검출
1x iBindTM 용액을 23.7mL ddH20, 및 300uL 첨가제 및 6mL iBindTM 완충액과 준비하였다. 블롯팅된 막은 록킹 플랫폼(rocking platform) 상의 10mL iBindTM 용액에서 10분 동안 담갔다. IBindTM 카드를 iBindTM 웨스턴 장치의 스테이지에 놓고, 1x iBindTM 용액 5mL를 플로우 영역에 걸쳐 균일하게 분주하고, 카드 중앙에 추가 1mL의 iBindTM 용액을 풀링시켰다. 이어서, 블롯팅된 막을 단백질 면이 아래로 오고 저분자량 영역에 스택에 가장 가깝게 되도록 iBindTM 카드 위에 놓았다. 이어서, 블롯팅 롤러를 사용하여 임의의 기포를 제거하고, 뚜껑을 닫았다. 이어서, 항체 및 1x iBindTM 용액을 하기 순서로 웰에 첨가하였다. 1: 작업 용액 2mL 중 1차 항원 (5x 농도), 2: 2mL iBindTM 용액, 3: 2mL 작업 용액 중 HRP 2차 항체 (5x 농도), 4: 6mL iBindTM 용액, 2.5시간 또는 실온에서 밤새 인큐베이션시킴.
이미징 및 데이터 분석
블롯팅된 막을 로킹 플랫폼 상에서 5분 동안 수돗물로 헹구었다. 화학발광 기질 키트 (ClarityTM Western ECL Substrate Kit)는 1:1 비율: 7 mL 루미놀 인핸서 용액 및 7mL 퍼옥사이드 용액 중에 준비하고, 록킹 플랫폼에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 화학발광 신호는 Bio-Rad ChemiDoc™ MP 이미징 시스템 및 Bio-Rad Image LabTM 소프트웨어 버전 5.0을 사용하여 캡처링하였다.
재- 프로빙
블로팅된 막을 4℃에서 TBST에 보관하였다. 필요한 경우, 블로팅된 막을 추가적인 마커에 대해 재-프로빙하였다. 블롯팅된 막을 록킹 플랫폼 상에서 10분 동안 수돗물로 세척하고, 이어서 록킹 플랫폼 상에서 10분 동안 10mL iBindTM 용액 중에서 인큐베이션하였다. IBindTM 카드, iBindTM 작업 용액 및 항체는, HRP 2차 항체보다는 형광 2차 항체를 사용하는 것을 제외하고는 앞에서 기술된 바와 같이 준비하였다. 그 후, 막을 3.5시간 동안 인큐베이션하였다.
단백질 정량화
불량하게 분화된 혀 SCC 샘플의 초기 샘플에서 추출한 단백질. 단백질 정량화는 2-D Quant 키트를 사용하여 수행하였다. 단백질 표준은 에펜도르프 튜브에 0uL, 10uL, 20uL, 30uL, 40uL, 50uL의 BSA 용액을 넣어서 준비하였다. 에펜도르프 튜브에 단백질 용해물 (2uL, 5uL, 15uL, 30uL) 범위에 걸친 OTSCC 및 대조군 조직 (태반) 샘플을 준비하였다. 이어서, 500uL의 침전제 용액을 각각에 첨가하고, 각 튜브를 5초 동안 볼텍싱하였다. 500uL의 공동-침전제를 각 튜브에 첨가하고, 다시 5초 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 모든 단백질 표준물질 및 용액을 13,300rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 쏟아 버리고, 튜브를 다시 간단히 원심분리하여 튜브 바닥으로부터 남아있는 모든 나머지 용액을 제거하였다. 이어서, 이러한 용액을 펠렛이 파괴되지 않도록 주의하면서 피펫 제거하였다.
각 단백질 표준물질 및 샘플에 대한 500uL 구리 용액을 준비하였다(1:5 구리 용액:ddH2O). 이어서, 500uL 구리 용액을 각 튜브에 넣고 5초 동안 볼텍싱하여 침전된 단백질을 재용해시켰다.
각 단백질 표준물질 및 샘플에 대한 1000uL의 컬러 시약 용액을 준비하였다(1:200 컬러 시약 A:컬러 시약 B). 1000uL의 컬러 시약 용액을 각 튜브에 첨가하고 5분 동안 발색되도록 방치하였다.
각각 200uL의 ddH20, 표준 용액 및 샘플을 웰 플레이트에 순차적으로 로딩하였다.
웰 플레이트를 플레이트-판독기에 넣었다. 표준 용액으로부터 표준 곡선을 생성시키고, 480nm에서 샘플의 흡광도를 판독하였다.
그런 다음 표준 곡선을 생성시키고 샘플을 이와 비교해 판독하여, 원액 샘플 단백질 용해물중 총 단백질 농도 (mg/mL)를 획득하였다.
실시예 2: 구강 편평 세포 암종에서 발현 분석
하기 마커를 구강 혀의 편평 세포 암종 (SCCOT)을 갖는 환자로부터 얻은 조직 샘플에서 분석하였다.
1. 배아 줄기 세포 마커
OCT4: 정상 성인 조직에서 발현되지 않는 다능성 및 자가 재생성의 유지와 관련된 배아 줄기 세포 마커. 암 세포에서 일부 세포질 발현을 가지나, 정상적으로 핵에 한정된 발현을 갖는 전사 인자가 문헌에 기록되어 있다 (또한, 본 발명자들의 결과에서 언급됨).
NANOG: 다능성 및 자가 재생성의 유지와 관련된 배아 줄기 세포 마커로서, SOX2 및 OCT4에 의해 발현 제어됨. 또한, 암 세포에서 일부 세포질 발현을 가지나, 정상적으로는 핵에 한정된 발현을 갖는 전사 인자가 문헌에 기록되어 있다 (또한, 본 발명자들의 결과에서 언급됨).
SOX2: 다능성 및 자가 재생성의 유지와 관련된 배아 줄기 세포 마커. 또한, 암 세포에서 일부 세포질 발현을 가지나, 주로 핵에 한정된 발현을 갖는 전사 인자가 문헌에 기록되었다 (또한, 본 발명자들의 결과에서 언급됨).
pSTAT3: 활성화된 신호 변환기 및 전사 활성인자. 다능성, 자가-재생성의 유지와 관련된 공지의 줄기 세포 마커. pSTAT3의 항시적 활성화는 암에서 세포-주기의 진행 및 항-아폽토시스 및 혈관형성의 제어에 중요한 역할을 하는 것으로 인지되었다.
구강 혀의 편평 세포 암종 (SCCOT) 샘플에서 수행된 마커 발현 및 마커 공동-위치화 분석 결과는 하기 표 5에 요약되어 있다.
표 5. 구강 혀의 SCC의 중간 분화된 절편 내의 마커 발현 개요 (현재까지). 공동-위치화 조사
Figure pct00008
(Rb) 토끼에서 발생한 1차 항체
(Ms) 마우스에서 발생한 1차 항체
8. 양성 대조군
양성 대조군 조직 (표적 단백질 특이적)을 확인하고, 평가하고, 이어서 오토스테이너 상의 실험 조직과 동시에 염색하였다.
9. 결과
이들 데이터의 결과는 다음과 같다:
1. 혀 암 내의 암 줄기 세포 마커의 확실한 공동-위치화. 지금까지 이러한 암 줄기 세포 군집 내에 공동-위치화된 단백질은 다음과 같다: NANOG, OCT4, SOX2, CD44, LYVE-1, VEGFR-3 및 ACE.
2. 암 줄기 세포는 상피암 마커 EMA, p63 또는 사이토케라틴 5,6,8,18을 공동 발현하지 않는다. 이는 이들 세포가 이들 마커를 발현하지 않는 벌크 암 세포보다 더욱 원시적 (업스트림)임을 시사한다.
3. 처음으로 림프계 마커 (LYVE-1 및 VEGFR-3) 및 암 줄기 세포 마커 (CD44) 및 배아 줄기 세포 마커 (NANOG, OCT4, SOX2)가 공동-발현되는 것으로 입증되었다. 이는 이러한 세포 군집의 생물학을 이해하는데 흥미로운 함의를 지니며, 이들 세포가 혈관과는 별개로서 림프관 채널을 통해 전이를 유도하는데 적극적으로 관여할 수 있음을 시사하며, 또한, 이들 암 줄기 세포가 실제로 다능성이며 새로 림프관형성 (자가-재생 이외에, 벌크 종양 세포의 형성)을 할 수 있다는 본 발명자들의 가설을 뒷받침한다.
4. 암 줄기 세포 군집에 의한 ACE의 발현 또한 새로운 것이며, 레닌-안지오텐신 시스템(RAS)이 어느 정도의 능력으로 암 줄기 세포 조절에 관여한다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 3: 기타 암 발현 분석
배아 줄기 세포 마커, OCT4 및 레닌 수용체의 발현에 대한 공동-발현 연구를 수행하기 위해, 파라핀 절편을 두 단백질의 존재에 대해 순차적으로 염색하였다. 이미지는 Olympus FV-1200 공촛점 현미경을 사용하여 캡처링하고 Olympus Fluoview FV1000 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 시험한 각 암 시스템으로부터 대표적인 암 줄기 세포를 선택하고, 그 중간을 통과하는 단면 선을 그리고, 세포 핵과 비교하여 OCT4, 레닌 수용체의 상대적인 발현 수준을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)의 표현으로 나타냈다. 이는 암 유형 즉, 하기의 암 유형에 의해 첨부된 도면에서의 데이터로부터 분명해진다: OTSCC (도 4a, 4b), 흑색종 (도 7a, 7b), 육종 (도 9a, 9b), 장암 (도 11a, 11b), 뇌암 (도 13a, 13b), 유방암 (도 15a, 15b), 폐암 (도 17a, 17b), B 세포 림프종 (도 19a, 19b) 및 신장 (도 21a, 21b), 갑상선암 (도 23a, 23b), 만성 림프구성 암 (25a, 25b), 피부 편평 세포 암종 (27a, 27b), 전립선암 (29a, 29b).
프로/레닌 수용체는 약 39 KDa에서 검출되는 세포 표면 및 세포질 세포 단백질이며, 이 단백질은 다수의 단백질 예컨대, 비제한적으로 퓨린 및 카텝신 B에 의해 세포내에서 절단될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wang et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (19): 12633-12638] 참조). 절단된 생성물은 원래 단백질의 절두된 형태이며, 크기는 약 25 KDa이다. 전체 길이 및 절단된 프로/레닌 형태 모두는 도 5에 도시되어 있다. 후자의 절단된 형태는 세포외 유체로 활동적으로 분비되고, 실질적으로 혈액, 림프와 같은 체액으로 그 경로가 만들어진다. 따라서, 이러한 마커는 암 및 특히, 암 줄기 세포 군집(들)과 관련된 암의 바이오마커로 사용될 수 있다.
본 발명이 예시적으로 기술되었지만, 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 특정 특징에 대한 공지된 등가물이 존재하는 경우, 이러한 등가물은 본 명세서에서 구체적으로 언급된 것처럼 통합된다.

Claims (15)

  1. 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암 내부에서 종양의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제(들)를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템(Renin-Angiotensin System)과 관련된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 암 줄기 세포가 크립토(Cripto), ABCG2, 알칼리 포스파타제/ALPL, CD9, FGF-4, GDF-3, 인테그린 알파 6/CD49f, 인테그린 베타 1/CD29, NANOG, OCT-3/4, 포도칼릭신(Podocalyxin), SOX2, SSEA-3, SSEA-4, STAT3, SSEA-1, FoxD3, DPPA5/ESG1, Rex-1/ZFP42, DPPA4, LIN-28A, UTF1, 레프티-A(Lefty-A), 레프티-1, TBX3, ESGP, TRA-1-60(R), TRA-1-81, 5T4, TBX2, ZIC3, CD30/TNFRSF8, KLF5, c-Myc, GCNF/NR6A1, SUZ12, Smad2, CDX2, TROP-2, CD117/c-키트, LIN-41, 인테그린 알파 6 베타 4, THAP11, Smad2/3, TBX5, TEX19, OCT4A, TEX19.1, DPPA2, 액티빈 RIB/ALK-4, 액티빈 RIIB, FGF-5, GBX2, 스텔라(Stella)/Dppa3, DNMT3B, F-박스 단백질 15/FBXO15, LIN-28B, 인테그린 알파 6 베타 1, KLF4, ERR 베타/NR3B2, EpCAM/TROP1, TERT, CHD1, Cbx2, c-Maf 및 L1TD1으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 암 줄기 세포가 OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 암 줄기 세포가 OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3으로 구성된 배아 줄기 세포 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 암 줄기 세포가 레닌 수용체, 안지오텐신 II 수용체 2 및 레닌 수용체의 분비된 형태로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 레닌-안지오텐신 시스템 바이오마커의 발현을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 암이 두경부의 편평 세포 암종(상부 호흡소화관 포함), 피부의 편평 세포 암종, 흑색종, 폐암, 유방암, 신장암, 뇌암, 장암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 암이 두경부의 편평 세포 암종임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료학적 제제가 직접 레닌 억제제(DRI), 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D, 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  9. 암의 예방, 치료 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 암을 예방하거나, 치료하거나 관리하는 방법으로서, 암과 관련된 종양의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 양의 치료학적 제제를 환자에 투여하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포는 (i) 배아 줄기 세포 바이오마커 OCT4, SOX2, NANOG 및 PSTAT3의 발현 및 (ii) 레닌-안지오텐신 시스템 바이오마커 레닌 수용체 및 안지오텐신 II 수용체 2의 발현을 특징으로 하며, 치료학적 제제는 직접 레닌 억제제(DRI), 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  10. 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
    (i) 바이오마커 발현 분석을 사용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에 존재하는 암 줄기 세포의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
    (ii) 생물학적 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 수준을 대조군 군집으로부터의 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
    대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 증가된 암 줄기 세포 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계를 포함하는 방법.
  11. 대상체에서 암의 존재 또는 부재를 측정하는 방법으로서,
    (i) 바이오마커 발현 분석을 이용하여 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 암 줄기 세포의 수준을 검출하고/거나 측정하는 단계;
    (ii) 생물학적 샘플로부터 수득된 암 줄기 세포 수준을 대조군 군집으로부터 암 줄기 세포 수준과 비교하는 단계로서,
    대조군 군집과 비교하여 생물학적 샘플로부터 수득된 증가된 암 줄기 세포 수준은 대상체가 암을 갖고 있거나 암이 발병되기 쉬운 것으로 진단되는 단계, 및
    (iii) 암을 가지고 있거나 암이 발병되기 쉬운 대상체에 예방학적 또는 치료학적 요법제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 암 치료 방법에 사용하기 위한 약제 조성물로서, 상기 약제 조성물은 암 내의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 치료학적 제제(들)를 포함하며, 상기 방법은 암 환자에게 치료학적 제제를 투여하는 것을 포함하는 약제 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 치료학적 제제는 직접 레닌 억제제(DRI), 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D, 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택된 약제 조성물.
  14. 암 치료에 사용하기 위한 키트로서, 대상체에 치료학적 용량을 투여하는 방법에 대한 설명서와 함께 암 내의 암 줄기 세포의 성장, 증식 및/또는 분화를 선택적으로 근절시키거나 억제하기에 충분한 치료학적 제제를 포함하는 키트.
  15. 제 14항에 있어서, 치료학적 제제는 직접 레닌 억제제(DRI), 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACEI), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 베타-차단제, 사이클로-옥시게나제 2 억제제, 키마제 억제제, 카텝신 B, 카텝신 D 및 카텝신 G의 억제제, 칼슘, 비타민 D, 및 칼슘 채널 차단제로 구성된 군으로부터 선택된 키트.
KR1020177006765A 2014-08-12 2015-08-12 암 진단 및 치료법 KR20170040804A (ko)

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