KR20170038829A - 함수 유동상 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 리소자임 가공품 및/또는 그 염 그리고 그 제조 방법 - Google Patents

함수 유동상 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 리소자임 가공품 및/또는 그 염 그리고 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는 함수 유동상 조성물로서, 상기 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 형광 강도가 5,000 이상이고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서의 상기 극성 유기 용제의 함유량이, 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하이다. 형광 강도 : 상기 함수 유동상 조성물을 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도

Description

함수 유동상 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 리소자임 가공품 및/또는 그 염 그리고 그 제조 방법{WATER-CONTAINING FLUID COMPOSITION, METHOD FOR PRODUCING SAME, PROCESSED LYSOZYME AND/OR SALT THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은, 함수 유동상 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 리소자임 가공품 및/또는 그 염 그리고 그 제조 방법에 관한 것이다.
리소자임은, 알, 동물의 조직, 체액, 식물 등 생물계에 널리 존재하는 효소이다. 공업적으로는, 난백으로부터 단리되는 리소자임이 식품 및 의약품에 응용되고 있다 (특허문헌 1). 예를 들어, 리소자임은 항균 작용을 가지므로, 소독제의 성분으로서 널리 사용되고 있다.
일본 공개특허공보 평5-221875호
본 발명자들은, 리소자임을 특정 조건에서 변성시켜 얻어지는 리소자임 가공품이 노로바이러스 불활화 작용을 갖는 것, 그리고 그 리소자임 가공품을 극성 유기 용제의 존재하에서 보존하면, 노로바이러스 불활화 작용의 저하를 억제할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 상도하였다.
본 발명은, 노로바이러스 불활화 작용의 저하를 억제할 수 있는 함수 유동상 조성물 및 그 제조 방법, 그리고 리소자임 가공품 및/또는 그 염, 그리고 그 제조 방법을 제공한다.
1. 본 발명의 일 양태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는 함수 유동상 조성물로서, 상기 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 형광 강도가 5,000 이상이고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서의 상기 극성 유기 용제의 함유량이, 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하이다.
형광 강도 : 상기 함수 유동상 조성물을 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
2. 상기 1 에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 하기에 규정된 항 (抗) 노로바이러스 활성이 3.0 이상일 수 있다. 항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액 0.1 질량부에 대해 상기 함수 유동상 조성물 1 질량부를 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값.
3. 상기 1 또는 2 에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 형광 강도가 6,000 이상일 수 있다.
4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 극성 유기 용제는 에탄올을 포함하고, 상기 에탄올의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하일 수 있다.
5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하일 수 있다.
6. 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 에탄올 이외의 수용성 알코올을 추가로 함유할 수 있다.
7. 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 난백 리소자임에서 유래할 수 있다.
8. 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물은, 스프레이식 용기에 충전되어 있을 수 있다.
9. 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물은, 펌프식 용기에 충전되어 있을 수 있다.
10. 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물은, 부직포에 함침되어 있을 수 있다.
11. 본 발명의 일 양태에 관련된 균 및/또는 바이러스의 불활화 방법은, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물을 대상물에 접촉시키는 공정을 포함한다.
12. 본 발명의 일 양태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 하기 정의에 의해 규정되는 형광 강도가 4,000 이상이다 :
형광 강도 : 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
13. 상기 12 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 2.0 이상인, 리소자임 가공품 및/또는 그 염일 수 있다.
항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액과 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값.
14. 본 발명의 일 양태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법은, 상기 12 또는 13 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 제조하는 방법으로서, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한 리소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정과, 상기 제 1 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만의 극소값이 될 때까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정과, 상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정을 포함한다.
15. 상기 14 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 상기 제 3 가열 공정의 가열 조건이, 그 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 조건일 수 있다.
16. 상기 14 또는 15 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 얻는 공정을 추가로 포함한다.
17. 본 발명의 일 양태에 관련된 함수 유동상 조성물의 제조 방법은, 상기 14 내지 16 중 어느 하나에 기재된 제조 방법으로 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함한다.
18. 본 발명의 일 양태에 관련된 함수 유동상 조성물의 제조 방법은, 상기 12 또는 13 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함한다.
19. 상기 17 또는 18 에 기재된 함수 유동상 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 함수 유동상 조성물을 얻는 공정에 있어서, 그 함수 유동상 조성물에 있어서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하가 되도록, 상기 극성 유기 용제와 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 혼합할 수 있다.
상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물에 의하면, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하고, 상기 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 형광 강도가 5,000 이상이며, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서의 상기 극성 유기 용제의 함유량이, 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하임으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖는 것에 추가로, 노로바이러스의 불활화 작용을 장기간 (예를 들어 40 ℃ 에서 2 주간 이상, 통상 24 주간 이하) 에 걸쳐서 유지할 수 있다.
상기 함수 유동상 조성물은 예를 들어, 의약품, 의약 부외품, 화장품, 식품의 세정 용도, 혹은 위생 용도로서의 사용이 가능하다. 이 경우, 노로바이러스의 제거 용도로서 상기 함수 유동상 조성물을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 함수 유동상 조성물은 예를 들어, 용기 (예를 들어, 노즐 또는 스프레이 등이 부속되어 있는 용기, 혹은 이들이 부속되어 있지 않은 용기) 에 수용한 형태로, 혹은 부직포에 함침시킨 형태로 사용할 수 있다.
또, 상기 12 또는 13 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 상기 정의에서 규정된 형광 강도가 4,000 이상임으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖는 것에 추가로, 그 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제와 접촉시킴으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 장기간에 걸쳐서 유지할 수 있다.
또, 상기 14 내지 16 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 의하면, 상기 제 1 가열 공정, 상기 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해 노로바이러스의 불활화 작용을 갖고, 또한 극성 유기 용제와 접촉시킴으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 장기간에 걸쳐서 유지할 수 있는 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 얻을 수 있다.
또, 상기 17 및 19 에 기재된 함수 유동상 조성물의 제조 방법에 의하면, 상기 14 내지 16 중 어느 하나에 기재된 제조 방법으로 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함함으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖고, 또한 노로바이러스의 불활화 작용을 장기간에 걸쳐서 유지할 수 있는 함수 유동상 조성물을 얻을 수 있다.
또, 상기 18 및 19 중 어느 하나에 기재된 함수 유동상 조성물의 제조 방법에 의하면, 상기 12 또는 13 에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함함으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖고, 또한 노로바이러스의 불활화 작용을 장기간에 걸쳐서 유지할 수 있는 함수 유동상 조성물을 얻을 수 있다.
도 1 은 본 발명의 일 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서의 가열 시간과 투과율의 관계를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 2 는 본 발명의 일 실시예에서 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 전기 영동 (SDS-PAGE) 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명에 있어서 특별히 기재하지 않는 한 「부」는 「질량부」를 의미하고, 「％」는 「질량％」를 의미한다.
＜함수 유동상 조성물＞
본 발명의 일 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는 함수 유동상 조성물로서, 상기 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 형광 강도가 5,000 이상이고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서의 상기 극성 유기 용제의 함유량이, 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하이다.
형광 강도 : 상기 함수 유동상 조성물을 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
본 발명에 있어서, 「함수 유동상 조성물」이란, 물을 함유하고, 변형 가능한 정도의 점도 (예를 들어 1 ∼ 100,000 mPa·s) 를 갖는 조성물이며, 분무 가능한 정도로 점도가 낮은 액상 조성물, 및 젤상의 조성물을 포함하는 개념이다. 용매는 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 균일하게 용해, 또는 분산되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 물이나 알코올을 사용할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서 「실온」이란, 20 ℃ 이상 25 ℃ 이하를 말한다.
[형광 강도 및 노로바이러스의 불활화 작용]
표면 소수성이 보다 높은 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 형광 강도는, 상기 정의에 의해 규정되는 6,000 이상인 것이 바람직하고, 6500 이상인 것이 바람직하며, 7,000 이상인 것이 더 바람직하고, 통상 10,000 이하이다. 본 발명에서 규정되는 함수 유동상 조성물의 형광 강도는, 함수 유동상 조성물에 포함되는 단백질의 표면 소수성의 지표이다. 즉, 본 발명에서 규정되는 함수 유동상 조성물의 형광 강도가 높을수록 함수 유동상 조성물에 포함되는 단백질의 표면 소수성이 높고, 그 함수 유동상 조성물의 표면 소수성이 높을수록 노로바이러스의 불활화 작용이 높다고 할 수 있다.
그 때문에, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 형광 강도는 주로, 그 함수 유동상 조성물에 포함되는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성에서 기인하고 있다. 통상, 단백질의 표면 소수성을 높이면, 단백질의 소수성 부분끼리가 서로 끌어당기고, 응집한다. 본 발명자들은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성이 높을수록, 노로바이러스의 불활화 작용이 높은 경향이 있는 것을 알아냈다. 즉, 본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 노로바이러스의 불활화 작용이 우수하다는 특징을 갖는다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 포함되는 리소자임 가공품 및/또는 그 염이, 우수한 노로바이러스의 불활화 작용을 갖는 원인은 분명하지 않지만, 제 1 로, 표면 소수성을 갖는 리소자임 가공품 및/또는 그 염이, 노로바이러스의 소수성 부위에 결합하기 쉬운 것, 제 2 로, 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 리소자임의 변성물이고, 변성에 의해 리소자임이 갖는 S-S 결합의 적어도 일부가 개열하여 얻어지는 티올기 (-SH) 를 리소자임 가공품이 함유하고 있고, 이 티올기가 노로바이러스의 표면에 존재하는 S-S 결합과 결합하고 있는 것, 제 3 으로, 리소자임 가공품 및/또는 그 염이, 노로바이러스에 결합하기 쉬운 입체 구조를 갖는 것이 추측된다.
또, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하를 억제할 수 있는 원인은 분명하지는 않지만, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 용해되어 있는 것에 의해, 그 함수 유동상 조성물에 포함되는 극성 유기 용제와 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 접촉한 상태를 취하기 때문에, 리소자임 가공품 및/또는 그 염이, 노로바이러스의 불활화 작용을 발현할 수 있는 입체 구조를 유지할 수 있기 때문이라고 추측된다.
즉, 리소자임 가공품 및/또는 그 염은 표면 소수성이 높은 것에 의해, 극성 유기 용제 (특히 에탄올) 와의 친화성이 높기 때문에, 그 함수 유동상 조성물 중에서 리소자임 가공품이 극성 유기 용제에 접촉한 상태에 있어서, 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 노로바이러스의 불활화 작용을 발현할 수 있는 입체 구조를 유지할 수 있고, 그 결과 노로바이러스의 불활화 작용을 유지할 수 있다고 추측된다.
본 발명에 있어서, 함수 유동상 조성물 및 후술하는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도는, Canadian Institute of Food Scienceand Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295 에 기재된 방법으로 측정된 값이다. 또한, 본 발명에 있어서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도의 측정에 사용하는 인산 완충액은, 인산 2 수소나트륨 및 인산수소 2 나트륨으로 조제된 것이다. 또, 본 발명에 있어서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도는, 0.2 M 인산 완충액 (pH7.0, 인산염으로서 인산 2 수소나트륨 및 인산수소 2 나트륨을 함유한다) 의 형광 강도를 블랭크값으로 하여 별도 측정하고, 그 블랭크값을 뺀 값이다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물 및 후술하는 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도는, 닛폰 분광 주식회사 제조, 형명 FP-8500 형광 분광 광도계를 사용하여, 여기 파장 390 ㎚, 여기 밴드폭 10 ㎚, 형광 파장 470 ㎚, 형광 밴드폭 10 ㎚, 리스폰스 0.5 sec, 감도 Low (약 270±10 V)(전원 주파수 (50/60 ㎐)), 페리스타십퍼 SHP-820 형 사용의 조건으로 측정했을 때의 값이다. 또한, 다른 형광 분광 광도계를 사용하여 측정할 수도 있지만, 그 때는 감도 등의 측정 조건을 본원에서 규정하는 조건에 맞출 필요가 있다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 상기 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물 중에 보존되어 있다. 즉, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 상기 함수 유동상 조성물에 용해되어 있으므로 상기 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물 중에 존재하고 있을 수 있다.
본 발명자들은, 특정 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 노로바이러스의 불활화 작용을 갖는 것, 그리고 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 상기 극성 유기 용제 (특히, 에탄올 등의 수용성 알코올) 에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물 중에 용해되어 있음으로써, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하를 억제할 수 있다는 놀랄 만한 지견을 알아내어, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 창출하였다.
[리소자임 가공품 및/또는 그 염]
본 발명에 있어서, 「리소자임」이란, N-아세틸글루코사민과 N-아세틸뮤람산의 β-1,4 결합을 가수분해하는 성질을 갖는 단백질을 말한다. 또, 본 발명에 있어서 「리소자임 가공품」이란, 리소자임의 변성물이고, 리소자임 및/또는 그 염과는 상이한 입체 구조를 갖는 것을 말한다.
리소자임은, 알, 동물의 조직, 체액, 식물 등 생물계에 널리 존재하고, 기질 특이성과 구조로부터 크게 이하의 5 종의 패밀리로 분류된다.
1. 리소자임 (세균형)
2. 리소자임 (닭형)
3. 리소자임 (거위형)
4. 리소자임 (파지형 ; V 타입)
5. 리소자임 (CH 형)
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에서는, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 원료로서 상기 5 종의 패밀리의 어느 것이나 사용할 수 있다. 이들 리소자임 중에서도, 원료인 리소자임으로서 난백 리소자임, 인간 리소자임 등의 리소자임 (닭형) 이 바람직하다. 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에서는, 노로바이러스의 불활화 작용이 보다 우수하고, 저비용이고 또한 입수 용이한 점에서, 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 원료인 리소자임으로서 난백 리소자임에서 유래하는 것이 보다 바람직하다.
또, 리소자임 가공품의 염으로는, 식품 첨가물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 들 수 있고, 염산, 탄산, 인산, 붕산, 헥사메타인산, 질산, 황산 등의 무기산의 염, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 아세트산, 글루탐산, 글리세로인산, 글루콘산 등의 유기산의 염을 들 수 있다. 리소자임의 염 중에서도, 무기산의 염이 바람직하고, 소염제로서 널리 사용되고, 안전성이 확립되어 있는 점에서, 염산염이 보다 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염으로부터 선택되는 적어도 1 종을 함유할 수 있다. 또, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 복수 종류 함유하는 경우, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도 (고형분 환산) 는, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 합계량의 농도 (고형분 환산) 를 의미한다.
(형광 강도)
본 발명에서 규정되는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도는, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성의 지표이다. 즉, 본 발명에서 규정되는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도가 높을수록, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성이 높고, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성이 높다고 할 수 있다.
표면 소수성이 보다 높고, 노로바이러스의 불활화 작용이 보다 우수하다는 점에서, 하기 정의에 의해 규정되는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 형광 강도는 4,000 이상인 것이 바람직하고, 5,000 이상인 것이 보다 바람직하며, 통상 10,000 이하이다.
상기 형광 강도는, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도의 값이다. 또한, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 이고, 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액으로 희석한다는 것은, 구체적으로는 예를 들어 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 고형분 환산으로 1 질량％ 함유하는 수용액의 형광 강도를 측정하는 경우, 상기 수용액 5 g 과 0.25 M 의 인산 완충액 80 ㎖ 를 100 ㎖ 의 메스 플라스크에 넣은 후, 정제수로 100 ㎖ 로 메스업함으로써 조정되는 것을 말한다.
(농도)
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하를 보다 확실하게 억제할 수 있는 점에서, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 0.2 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.5 질량％ 초과, 예를 들어 0.6 질량％ 이상인 것이 더 바람직하며, 0.7 질량％ 이상인 것이 가장 바람직하고, 한편 5 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 4 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하며, 2 질량％ 이하인 것이 더 바람직하다.
(리소자임 가공품 및/또는 그 염의 항 노로바이러스 활성)
본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖는다. 보다 구체적으로는, 본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 2.0 이상이 되는 것이 바람직하다.
리소자임 가공품 및/또는 그 염의 항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액과 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값
(이량체 및 삼량체)
상기 리소자임 가공품 또는 그 염은, 약 29 KDa (KDa = 103 Da) 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 포함할 수 있다. 즉, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 포함할 수 있다. 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물 그리고 상기 리소자임 가공품 또는 그 염 중에 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질이 포함되어 있는 것은, 후술하는 실시예에 나타내는 전기 영동에 의해 확인할 수 있다. 또한, 전기 영동은, 시판되는 전기 영동 키트를 사용하여 실시할 수 있다.
약 29 KDa 의 단백질은, 리소자임 가공품의 이량체라고 추측되고, 약 36.5 KDa 의 단백질은, 리소자임 가공품의 삼량체라고 추측된다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물 중에 있어서, 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질이 포함되어 있음으로써, 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 표면 소수성이 높은 상태에서 그 함수 유동상 조성물 중에 존재하고 있다고 추측된다.
(제조 방법)
리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 후술하는 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법의 난에 기재된 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해 제조할 수 있다.
[극성 유기 용제]
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 극성 유기 용매를 함유하는 것이다. 본 발명에 있어서 「극성 유기 용제」란, 물에 대한 친화성을 갖는 유기 용제이고, 보다 구체적으로는 물과 혼화하는 유기 용제를 말한다. 극성 유기 용제로는, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, n-부탄올 등의 탄소 원자수 1 이상 4 이하 (바람직하게는 3 이하) 의 1 가 알코올, 글리세린, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등의 다가 알코올 등의 다가 알코올을 포함하는 수용성 알코올 (알코올계 용제), 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용제, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, N-메틸피롤리돈을 들 수 있고, 이들 중 1 종을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이 중, 생체에 대한 부담이 적은 점에서, 극성 유기 용제는 알코올계 용제를 함유하는 것이 바람직하고, 에탄올을 함유하는 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 용해성이 우수하고, 또한 노로바이러스 불활화 작용의 저하를 보다 확실하게 억제할 수 있는 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서의 극성 유기 용제의 농도는 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하이고, 60 질량％ 이상인 것이 바람직하며, 65 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하다. 한편, 85 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 80 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 극성 유기 용제로서 에탄올을 함유하는 경우, 노로바이러스 불활화 작용의 저하를 보다 확실하게 억제할 수 있는 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서의 에탄올의 농도는 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하일 수 있고, 60 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 65 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하며, 한편 85 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 80 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다.
[노로바이러스 불활화 작용]
본 발명에 있어서, 노로바이러스 불활화 작용은, 후술하는 실시예에 기재된 방법 (즉, 노로바이러스를 감염시킨 마우스 세포) 을 사용한 계에 의해 평가할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 노로바이러스 불활화 작용을 갖는다. 보다 구체적으로는, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 3.0 이상이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 함수 유동상 조성물의 항 노로바이러스 활성은 각각, 리소자임 가공품의 농도 (고형분 환산) 가 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물에 대해 측정된 값인 것이 바람직하다. 이 경우, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 약 29 KDa 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 포함하는 리소자임 가공품 또는 그 염을 포함할 수 있다.
함수 유동상 조성물의 항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액 0.1 질량부에 대해 상기 함수 유동상 조성물 1 질량부를 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값
[노로바이러스 불활화 작용의 유지]
또, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 장기간 보존 후에도 노로바이러스 불활화 작용을 유지할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 4 주간 보존 후의 항 노로바이러스 활성이 보존 전의 항 노로바이러스 활성에 대해 50 ％ 이상 (바람직하게는 70 ％ 이상, 통상 100 ％ 이하) 일 수 있다.
[에탄올 이외의 수용성 알코올]
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 에탄올 이외의 수용성 알코올을 추가로 함유할 수 있다. 에탄올 이외의 수용성 알코올로는 상기 서술한 것을 들 수 있다. 에탄올 이외의 수용성 알코올은, 극성 유기 용제로서 기능할 수 있다. 에탄올 이외의 수용성 알코올을 사용하는 경우에는, 에탄올 이외의 수용성 알코올을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 수용성 및 극성 유기 용제 (특히 에탄올) 에 대한 용해성이 우수하기 때문에, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 에탄올 이외의 수용성 알코올로부터 선택되는 적어도 1 종을 추가로 함유함으로써, 그 극성 유기 용제 (특히 에탄올) 에 대한 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 용해성을 보다 높일 수 있고, 그 결과 그 함수 유동상 조성물에 있어서 극성 유기 용제와 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 접촉을 담보할 수 있다.
그 중에서도, 생체에 대한 부담이 적은 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은 에탄올에 추가로, 물 및 에탄올 이외의 수용성 알코올 혹은 어느 일방을 포함하는 것이 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 에탄올 이외의 수용성 알코올을 포함하는 경우, 그 함유량은 통상 0.1 질량％ 이상 20 질량％ 이하이고, 0.5 질량％ 이상인 것이 바람직하며, 한편 10 질량％ 이하인 것이 바람직하다. 이 경우, 그 함수 유동상 조성물 중에서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 용해성을 보다 높일 수 있는 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 에탄올 및 에탄올 이외의 수용성 알코올을 포함하는 경우, 에탄올의 함유량에 대한 수용성 알코올의 함유량은 1/700 이상 1/5 이하인 것이 바람직하다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 물을 포함하는 경우, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에 있어서의 물의 함유량은 통상 10 질량％ 이상 50 질량％ 이하이고, 15 질량％ 이상인 것이 바람직하며, 20 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편 40 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 30 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다. 이 경우, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 용해성을 보다 높일 수 있는 점에서, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 에탄올을 포함하는 경우, 에탄올의 함유량에 대한 물의 함유량은 1/3 이상 1/1 이하인 것이 바람직하다.
[기타 소재]
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품, 극성 유기 용제 및 물 이외에 기타 배합 소재를 함유할 수 있다.
기타 소재로는, 예를 들어 글리신, 유기산, 벤조산나트륨, 소르브산나트륨, 프로피온산나트륨, 데하이드로산나트륨, 파라옥시벤조산에스테르, 아황산나트륨, EDTA, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 글루콘산클로르헥시딘, 염화알킬디아미노에틸글리신, 요오드팅크, 포피돈요오드, 세틸산화벤잘코늄, 트리클로산, 클로르자일레놀, 이소프로필메틸페놀, ε-폴리리신, 락토페린, 나이신, 박테리오신, 땅두릅 추출물, 때죽나무 추출물, 사철쑥 추출물, 효소 분해 율무 추출물, 이리 단백 추출물, 투야플리신, 펙틴 분해물 등의 정균제를 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은 추가로 시트르산, 시트르산나트륨, 수산화나트륨, 트리에탄올아민 등의 pH 조정제, 토코페롤아세트산에스테르 등의 산화 방지제, 카르복시비닐 폴리머, 하이드록시에틸셀룰로오스 등의 증점제 등의 첨가제, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르 등의 계면활성제를 필요에 따라 함유하고 있어도 된다.
＜제형＞
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 점도는 사용 방법에 따라 적절히 정할 수 있다. 예를 들어, 분무 가능한 점도의 액제로 하고, 트리거 스프레이어, 펌프 용기, 스퀴즈 용기, 에어졸 용기 등의 용기에 충전함으로써, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 포함하는 액적을, 손가락, 식품, 조리 기구, 주거 환경, 구토물, 배설물 등에 분무함으로써, 바이러스의 불활화를 간편하게 실시할 수 있다. 즉, 상기 용기는, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 포함한다.
또, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물에, 불활화의 대상물 (예를 들어, 손가락, 식품, 의료 기기, 의료 기구, 조리 기구, 주거 환경) 을 담금으로써, 바이러스의 불활화를 간편하게 실시할 수 있다.
또, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 부직포에 함침시킨 시트의 형태로 사용할 수 있다. 즉, 상기 부직포는, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물이 함침되어 있다. 이 경우, 부직포의 재질로는, 예를 들어 종이, 섬유를 들 수 있다. 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 부직포에 함침시킨 시트를 대상물의 표면에 접촉시킴으로써, 바이러스의 불활화를 간편하게 실시할 수 있다.
또한, 본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을 로션으로 함으로써, 화장품, 혹은 의약품 또는 의약 부외품인 피부 외용제로서 사용할 수 있다.
[일례]
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은 예를 들어, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는 함수 유동상 조성물로서, 상기 극성 유기 용제의 함유량이 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하이고, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하일 수 있다. 이 경우, 상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 상기 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있다.
이 경우, 상기 극성 유기 용제는 에탄올을 포함하고, 상기 에탄올의 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하일 수 있다.
또 이 경우, 그 함수 유동상 조성물은, 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 포함할 수 있다.
또한 이 경우, 그 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 3.0 이상이 될 수 있다. 함수 유동상 조성물의 항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액 0.1 질량부에 대해 상기 함수 유동상 조성물 1 질량부를 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값.
또, 그 함수 유동상 조성물은, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 4 주간 보존 후의 항바이러스 활성이 보존 전의 항바이러스 활성에 대해 50 ％ 이상 (바람직하게는 70 ％ 이상, 통상 100 ％ 이하) 일 수 있다.
＜리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법＞
본 발명의 일 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법은, 상기 정의에서 규정된 형광 강도가 4,000 이상인 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 제조하는 방법으로서, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한 리소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 리소자임의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정 (이하, 간단히 「제 1 가열 공정」이라고도 한다) 과, 상기 제 1 가열 공정 후에, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만의 극소값까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정 (이하, 간단히 「제 2 가열 공정」이라고도 한다) 과, 상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정 (이하, 간단히 「제 3 가열 공정」이라고도 한다) 을 포함한다.
본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 의하면, 상기 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해, 상기 정의에서 규정된 형광 강도가 4,000 이상인 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 얻을 수 있고, 또한 상기 리소자임의 제조 방법에 의해 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합함으로써, 그 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖고, 또한 노로바이러스의 불활화 작용의 저하가 억제된 함수 유동상 조성물을 얻을 수 있다.
[가열의 메커니즘]
도 1 은, 본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서의 가열 시간과 투과율의 관계를 모식적으로 나타내는 도면이다. 본 발명자들은, 리소자임을 포함하는 수용액을 가열할 때에, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 가열 시간에 따라 도 1 에 나타내는 바와 같이 변화하는 것을 알아냈다. 당해 투과율의 변화는 주로, 얻어지는 리소자임 가공품의 표면 소수성의 변화 및 수용성의 변화 (수용성의 저하 및 이것에 이어지는 수용성의 증가) 에서 기인한다고 추측된다.
도 1 에 나타내는 바와 같이, 제 1 가열 공정에 의해, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과인 수용액의 그 광의 투과율이 저하하여 70 ％ 가 된다. 보다 구체적으로는, 제 1 가열 공정에 의해 수용액의 투명도가 저하한다.
또, 제 2 가열 공정에 의해, 제 1 가열 공정에 의해 70 ％ 가 된 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 더 저하한 후, 다시 상승하여 70 ％ 로 할 수 있다. 보다 구체적으로는, 도 1 에 나타내는 바와 같이 제 2 가열 공정에 의해, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율은 저하하여, 70 ％ 미만의 극소값까지 저하한 후에, 70 ％ 까지 상승한다. 즉, 이 경우, 육안으로 수용액의 백탁 및/또는 침전이 확인된 후 (바꿔 말하면, 그 수용액의 투과율 (투명성) 이 저하한 후), 그 백탁 및/또는 침전이 점차 소실할 (바꿔 말하면, 그 수용액의 투과율 (투명성) 이 상승할) 수 있다.
또한, 제 3 가열 공정에 의해, 제 2 가열 공정에 의해 70 ％ 가 된 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율을, 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열한다. 보다 구체적으로는, 제 3 가열 공정에 있어서는, 그 수용액 중에 백탁 및/또는 침전이 생기지 않는 (바꿔 말하면, 그 수용액의 투과율 (투명성) 이 유지되고 있는) 것이 바람직하다.
[제 1 가열 공정]
제 1 가열 공정의 가열 대상은, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과 (바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 통상 100 ％ 이하) 이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한 리소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 리소자임 및/또는 그 염의 수용액이다.
제 1 가열 공정에 의해, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과인 수용액에 있어서의 그 광의 투과율이 70 ％ 가 되는 것은, 그 수용액의 투과율이 저하하는 것을 의미하고, 예를 들어 육안으로 그 수용액의 백탁을 확인할 수 있다.
즉, 제 1 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 리소자임의 입체 구조 및/또는 리소자임의 표면의 표면 소수성이 상승하고, 소수성 부분이 서로 끌어당겨 응집하여, 상기 수용액 중의 리소자임의 용해성이 저하하는 결과, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과로부터 70 ％ 로 저하한다고 추측된다.
(원료)
제 1 가열 공정에 있어서 수용액 중에서 사용하는, 원료인 리소자임 및/또는 그 염은, 상기 서술한 함수 유동상 조성물의 난에서 예시한 리소자임 및/또는 그 염을 사용할 수 있다. 저비용이고 입수 용이한 점에서, 원료인 리소자임 및/또는 그 염은 난백 리소자임인 것이 바람직하다.
(원료의 농도)
리소자임의 입체 구조를 확실하게 변화시킬 수 있고, 또한 리소자임의 응집을 방지하여, 노로바이러스의 불활화 작용을 높일 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정에 있어서, 수용액 중의 리소자임의 농도는 0.5 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 1 질량％ 이상인 것이 보다 바람직하며, 한편 7 질량％ 이하인 것이 바람직하고, 5 질량％ 이하인 것이 보다 바람직하다.
(리소자임 및/또는 그 염의 수용액)
리소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매는 물이지만, 리소자임 및/또는 그 염의 물에 대한 용해성에 영향을 주지 않는 범위에서 물과 혼화하는 유기 용매를 사용해도 된다. 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매에 있어서의 물의 비율은 통상 80 질량％ 이상 100 질량％ 이하이다. 또, 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매가, 물과 혼화하는 유기 용매를 포함하는 경우, 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매에 있어서의 그 유기 용매의 비율은 통상 1 질량％ 이상 20 질량％ 이하이다.
상기 유기 용매로는, 물과 혼화하는 유기 용매이면 되고, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 알코올계 용매, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
(pH)
리소자임의 응집을 방지할 수 있고, 또한 얻어지는 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 표면 소수성을 높일 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서, 상기 수용액의 pH 는 5.0 이상인 것이 바람직하고, 5.0 을 초과하는 것이 보다 바람직하며, 5.5 이상인 것이 더 바람직하고, 한편 7.0 이하인 것이 바람직하고, 6.5 이하인 것이 보다 바람직하다.
또, 필요에 따라, 산 (예를 들어, 염산, 황산, 질산 등의 무기산, 시트르산, 아세트산, 인산 등의 유기산), 알칼리 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 무기 염기) 또는 완충액 (예를 들어, 아세트산 완충액) 을 사용하여, 상기 수용액을 상기 범위의 pH 로 조정해도 된다.
예를 들어, 리소자임이 리소자임의 염 (예를 들어 염화리소자임) 인 경우, 산, 알칼리 또는 완충액을 사용하여, 수용액의 pH 를 상기 범위의 pH 로 조정한 후에, 제 1 가열 공정을 실시하는 것이 바람직하다.
[제 2 가열 공정]
제 2 가열 공정에 있어서, 제 1 가열 공정에서 얻어진 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 에서 70 ％ 미만의 극소값이 되고, 또한 70 ％ 가 되도록 가열한다는 것은, 제 1 가열 공정에서 얻어진 수용액의 투과율이 더 저하한 후, 증가로 변하여, 육안으로 점차 투명하게 되어 가는 것을 확인할 수 있는 것을 말한다.
즉, 제 2 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 리소자임의 입체 구조가 더 변화하여, 리소자임의 표면 소수성이 더욱 높아짐에 따라, 리소자임의 수용성이 일단 저하한 후에 높아지는 결과, 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 된다고 추측된다.
제 2 가열 공정에 있어서 리소자임의 표면 소수성이 더욱 높아짐에 따라, 리소자임의 수용성이 일단 저하한 후에 높아지는 메커니즘은 분명하지 않지만, 제 2 가열 공정에 의해, 제 1 가열 공정에 있어서 생긴 리소자임의 응집이 더욱 진행되고, 이어서 응집한 리소자임끼리가 결합하여 선상의 응집체로 변화하고, 이 응집체가 상기 수용액에 용해되기 때문에, 상기 수용액 중의 리소자임의 용해성이 상승하기 때문이라고 추측된다.
도 1 에 나타내는 바와 같이, 제 2 가열 공정에 의해, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율은 70 ％ 에서 70 ％ 미만의 극소값까지 저하한 후, 70 ％ 까지 상승한다. 상기 수용액 중의 리소자임의 입체 구조를 보다 확실하게 변화시킬 수 있는 점에서, 제 2 가열 공정에 의한, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율의 극소값은 60 ％ 미만인 것이 바람직하고, 50 ％ 미만인 것이 보다 바람직하다 (통상 0 ％ 이상).
제 2 가열 공정은 제 1 가열 공정 후에 계속해 실시할 수 있다. 즉, 제 2 가열 공정은 제 1 가열 공정과 연속적으로 실시할 수 있다.
[제 3 가열 공정]
제 3 가열 공정에서는, 상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열한다. 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해, 리소자임 가공품을 얻을 수 있다.
즉, 제 3 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 리소자임의 입체 구조가 더 변화하여, 리소자임의 수용성을 유지한 상태에서, 리소자임의 표면 소수성이 더욱 높아지는 결과, 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 값을 유지할 수 있다고 추측된다.
상기 수용액 중의 리소자임의 입체 구조를 보다 확실하게 변화시킬 수 있는 점에서, 제 3 가열 공정은, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 75 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하고, 80 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하다 (통상 100 ％ 이하이다).
또한, 제 3 가열 공정은, 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 바람직하고, 90 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하다 (통상 100 ％ 이하이다).
제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 되는 것은, 상기 정의에서 규정된 형광 강도가 4,000 이상인 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 얻어진 지표로 할 수 있다.
제 3 가열 공정은 제 2 가열 공정 후에 계속해서 실시할 수 있다. 즉, 제 3 가열 공정은 제 1 가열 공정 및 제 2 가열 공정과 연속적으로 실시할 수 있다.
제 3 가열 공정에 있어서, 상기 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 가열되어 투명화한 수용액은, 실온 (예를 들어 25 ℃) 으로 되돌려도 그 투과율을 유지할 수 있다 (바꿔 말하면, 투명성을 유지할 수 있다). 그 원인으로는, 그 수용액 중에 포함되는 리소자임 등의 형태인 선상의 응집체의 입체 구조가 실온에서도 유지되고 있기 때문이라고 추측된다.
(가열 온도 및 가열 시간)
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 제조 방법에 있어서의, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조에 있어서, 높은 수율을 달성할 수 있고, 또한 그 수용액을 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서 각각 규정되는 투과율로 조정할 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서의 그 수용액의 중심 품온을 70 ℃ 이상이 되도록 가열하는 것이 바람직하고, 가열 시간이 짧기 때문에 제조 시간을 단축할 수 있는 점에서, 80 ℃ 이상이 보다 바람직하고, 90 ℃ 이상이 더 바람직하며, 통상 130 ℃ 여도 되고, 나아가서는 약 100 ℃ 이하여도 된다. 또한, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 가열 온도 및 처리량에 따라 각 공정에서 규정하는 투과율을 만족하도록 적절히 결정할 수 있다.
보다 구체적으로는, 제 1 가열 공정과 제 2 가열 공정을 동일한 가열 온도에서 연속적으로 실시하는 경우, 제 1 가열 공정에 있어서의 가열 시간 및 제 2 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 합계로 중심 품온이 70 ℃ 이상 75 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 120 분간 이하, 중심 품온이 75 ℃ 초과 80 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 75 분간 이하, 중심 품온이 80 ℃ 초과 85 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 65 분간 이하, 중심 품온이 85 ℃ 초과 90 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 45 분간 이하, 중심 품온이 90 ℃ 초과 95 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 35 분간 이하, 중심 품온이 95 ℃ 초과 100 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 20 분간 이하인 것이 바람직하다.
제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 중심 품온이 70 ℃ 이상 75 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 600 분간 이하, 중심 품온이 75 ℃ 초과 80 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 360 분간 이하, 중심 품온이 80 ℃ 초과 85 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 240 분간 이하, 중심 품온이 85 ℃ 초과 90 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 195 분간 이하, 중심 품온이 90 ℃ 초과 95 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 150 분간 이하, 중심 품온이 95 ℃ 초과 100 ℃ 이하인 경우에는 5 분간 이상 100 분간 이하인 것이 바람직하다.
제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정을 동일한 가열 온도에서 연속적으로 실시하는 경우, 제 1 가열 공정에 있어서의 가열 시간 및 제 2 가열 공정에 있어서의 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 합계로 중심 품온이 70 ℃ 이상 75 ℃ 이하인 경우에는 125 분간 이상 720 분간 이하, 중심 품온이 75 ℃ 초과 80 ℃ 이하인 경우에는 80 분간 이상 435 분간 이하, 중심 품온이 80 ℃ 초과85 ℃ 이하인 경우에는 70 분간 이상 305 분간 이하, 중심 품온이 85 ℃ 초과 90 ℃ 이하인 경우에는 50 분간 이상 240 분간 이하, 중심 품온이 90 ℃ 초과 95 ℃ 이하인 경우에는 40 분간 이상 185 분간 이하, 중심 품온이 95 ℃ 초과 100 ℃ 이하인 경우에는 25 분간 이상 120 분간 이하인 것이 바람직하다.
(분무 건조/동결 건조)
또한, 본 실시형태에 관련된 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법에 있어서, 상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 얻는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
분무 건조 및 동결 건조는, 통상적인 방법에 준거해 실시하면 된다.
＜함수 유동상 조성물의 제조 방법＞
본 발명의 일 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 제조 방법은, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염 (보다 구체적으로는, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법으로 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염) 과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함한다. 즉, 상기 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 상기 제조 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 실시형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하를 보다 확실하게 억제할 수 있는 점에서, 함수 유동상 조성물을 얻는 공정에 있어서, 그 함수 유동상 조성물에 있어서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 바람직하게는 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하 (보다 바람직하게는 0.2 질량％ 이상, 더 바람직하게는 0.5 질량％ 초과, 예를 들어 0.6 질량％ 이상이고, 더 바람직하게는 0.7 질량％ 이상, 한편 보다 바람직하게는 4 질량％ 이하, 더 바람직하게는 2 질량％ 이하) 가 되도록, 상기 극성 유기 용제와 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 혼합하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물의 난에서 예시된 다른 성분을 추가로 혼합할 수 있다.
또, 본 실시형태에 관련된 제조 방법에 있어서, 노로바이러스의 불활화 효과의 저하를 보다 확실하게 억제할 수 있는 점에서, 상기 함수 유동상 조성물을 얻는 공정에 있어서, 예를 들어 극성 유기 용제는 에탄올을 포함하고, 그 함수 유동상 조성물에 있어서의 에탄올의 농도가 바람직하게는 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하 (보다 바람직하게는 60 질량％ 이상, 더 바람직하게는 65 질량％ 이상, 또 보다 바람직하게는 85 질량％ 이하, 더 바람직하게는 80 질량％ 이하) 가 되도록, 상기 극성 유기 용제와 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 혼합하는 것이 바람직하다.
＜함수 유동상 조성물의 사용 방법 (바이러스의 불활화 방법)＞
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물을, 바이러스 (노로바이러스) 를 불활화하는 대상 영역에 분무 또는 도포하거나, 바이러스를 불활화하는 대상물과 혼합하거나, 섭취시키는 등의 방법 (바이러스를 불활화하는 방법) 을 취할 수 있다.
＜작용 효과＞
본 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 함유하므로, 바이러스의 불활화 작용을 갖는다. 특히, 실시형태에 관련된 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 함유함으로써, 노로바이러스의 불활화 작용을 갖고, 또한 그 리소자임 가공품 및/또는 그 염이, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있음으로써, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하를 억제할 수 있으므로, 노로바이러스의 불활화 작용이 장기간에 걸쳐서 지속되고 있다.
실시예
[실시예 1]
청수 980 g 에 리소자임 (계란 난백를 원료로 하는 난백 리소자임) 20 g 을 첨가, 혼합하여, 그 리소자임의 2 질량％ 수용액을 조제하였다. 그 후, 상기 수용액을 중심 품온 80 ℃ 에서 10 분간 가열한 결과, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 로 저하하였다 (제 1 가열 공정). 이어서, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만의 극소값 (20 ％) 이 될 때까지 가열한 후, 추가로 그 수용액을 80 ℃ 에서 60 분간 가열 처리를 실시하였다 (제 2 가열 공정). 이어서, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 상승하고, 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 중심 품온 80 ℃ 에서 110 분간 가열하였다 (제 3 가열 공정). 이로써, 리소자임 가공품 2 질량％ 를 함유하는 수용액을 얻었다.
또한, 제 3 가열 공정 후의 수용액의 투과율은 96 ％ 이고, 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 그 수용액을 에탄올과 질량비로 1 : 1 로 혼합했을 때의 투과율은 97 ％ 였다.
얻어진 리소자임 가공품의 2 질량％ 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 후, 얻어진 여과액 25 g 을 극성 유기 용제 (에탄올 60 g, 글리세린 1 g), 물 13 g 및 글리세린 지방산 에스테르 1 g 과 혼합하여, 시험 번호 1 의 함수 유동상 조성물을 얻었다.
표 1 에 나타내는 조건을 변경하여, 시험 번호 2 내지 22 의 리소자임 가공품을 조제하였다. 이어서, 표 1 의 조성으로, 각 리소자임 가공품을 포함하는 함수 유동상 조성물 (점도 : 3 mPa·s) 을 조제하였다.
Figure pct00001
또한, 시험 번호 1 내지 22 의 각 예에 있어서의 함수 유동상 조성물 및 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율은, 흡광 광도계 (형명 「UV-2450」, 주식회사 시마즈 제작소 제조) 에 의해 측정되었다. 표 1 에서는, 시험 번호 1 내지 22 의 각 예에 있어서의 제 1 가열 공정 전의 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율 (％), 제 2 가열 공정 중에서의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율의 극소값 (％), 그리고 가열 종료 시의 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율 (즉, 제 3 가열 공정 후의 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율)(％) 을 나타내고 있다. 또한, 시험 번호 1 내지 22 에서는, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정을 연속적으로 실시하고 있고, 표 1 의 가열 시간은 제 1, 제 2 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간의 합계이다.
시험 번호 1 내지 16 은, 가열 전의 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한 리소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을, 제 1 가열 공정에 의해, 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하고, 이어서 제 2 가열 공정에 의해, 상기 수용액이 일단 백탁한 후, 백탁이 점차 소실되어 투명성이 높아질 (파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될) 때까지 그 수용액을 가열하고, 이어서 제 3 가열 공정에 의해, 그 수용액의 투명성을 유지하면서 (보다 구체적으로는, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태를 유지하면서) 그 수용액을 가열 함으로써, 리소자임 가공품을 얻었다.
또, 시험 번호 2 내지 16 의 리소자임 가공품을 얻기 위한 제조 공정에 있어서, 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율은 모두 85 ％ 이상이었다.
또한, 시험 번호 18 및 19 에서는, 수용액에 있어서의 상기 광의 투과율이 70 ％ 미만 (20 ％) 으로 저하한 후, 다시 70 ％ 이상으로는 상승하지 않았다. 또, 시험 번호 21 에서는, 수용액에 있어서의 상기 광의 투과율이 70 ％ 미만 (15 ％) 으로 저하한 후, 40 ％ 까지 상승했지만, 70 ％ 이상으로는 상승하지 않았다.
[시험예 1]
본 시험예에서는, 시험 번호 1 내지 21 의 함수 유동상 조성물에 대해, 노로바이러스의 불활화 작용 및 그 불활화 작용의 시간 경과적 변화를 확인하였다.
＜항 노로바이러스 활성의 평가＞
플라크 어세이법에 의해, 시험 번호 1 내지 21 의 함수 유동상 조성물의 노로바이러스 활성을 다음과 같이 평가하였다. 또한, 시험 번호 1 내지 21 의 함수 유동상 조성물의 항 노로바이러스 활성은 각각, 리소자임 가공품의 농도 (고형분 환산) 가 표 1 에 나타내는 값인 함수 유동상 조성물에 대해 측정된 값이다.
(매크로파지 세포의 배양)
(1) 6 웰 플레이트에, 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 를 컨플루언트의 60 ∼ 80 ％ 까지 배양하였다.
(노로바이러스액의 조제)
(2) 한편, 노로바이러스의 감염가 (PFU/㎖) 가 106 ∼ 107 PFU/㎖ 정도인 노로바이러스액을 다음과 같이 하여 조제하였다.
먼저, 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 를 컨플루언트까지 배양하고, 컨플루언트가 된 세포에 노로바이러스 원액 1 ㎖ 를 접종하고, 2 일간, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 배양하였다. 이 경우, 노로바이러스 원액으로서 Murine norovirus strain 1 (MNV-1)(Effect of Food Residues on Norovirus Survival on Stainless Steel Surfaces) 을 사용하였다.
MNV-1 은, 워싱턴 대학 (Washington University) 의 허버트. W. 버진 박사 (Dr. Herbert W. Virgin) 로부터 공여되었다.
배양 후, 세포가 박리되어 있는 것을 육안으로 확인하고, 동결 융해를 4 회 반복하여 세포를 파괴하여, 세포 중의 바이러스를 방출시켰다. 그 후, 50 ㎖ 원심관에 분주 (分注) 하고, 원심분리 (8000 g, 20 분) 를 실시하여, 감염가 (PFU/㎖) 가 106 ∼ 107 PFU/㎖ 정도인 노로바이러스액을 얻었다. 이 노로바이러스액은, -80 ℃ 에서 보존하고, 해동하여 사용하였다. 이 노로바이러스액에 대해, 하기 방법으로 감염가를 측정하였다.
(노로바이러스 혼합액의 조제)
(3) 함수 유동상 조성물의 노로바이러스 감염가를 측정하기 위해서, 시험 번호 1 내지 21 의 함수 유동상 조성물 1 질량부에 대해, (2) 에서 얻은 노로바이러스액 0.1 질량부를 첨가한 후, 실온에서 1 분간 방치함으로써 각 함수 유동상 조성물과 노로바이러스의 혼합액 (노로바이러스 혼합액) 을 얻었다.
(감염가의 측정)
다음으로, 상기 (2) 에서 조제된 노로바이러스액의 감염가와 1 분간 방치 후의 혼합액의 감염가를 이하의 방법으로 산출하였다.
상기 노로바이러스 혼합액 (또는 노로바이러스액) 을 10x 배 희석하여, 희석 샘플로 하였다. 여기서, x 는 정수이고, 후술하는 (8) 에 있어서 육안으로 플라크수를 카운트할 수 있는 수로 한다. 즉, (8) 에서 플라크수가 10 이상 100 이하 정도가 되도록 희석 배율을 조정하였다. 또한, 노로바이러스 혼합액 (또는 노로바이러스액) 은, 그 혼합액 중의 잔존 알코올의 영향으로 세포가 변성되어 버리기 때문에, 10 배 희석은 실시하지 않았다.
(4) (1) 의 플레이트에 있어서 배양액을 전체량 철거하고, 소정 시간 방치 후 희석한 희석 샘플을 500 ㎕/well 로 2 웰씩 접종하였다.
(5) 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 가 마르지 않도록 진탕하면서, 실온에서 1 시간 인큐베이트하여, 노로바이러스를 마우스 매크로파지 주화 세포에 감염시켰다.
(6) 플레이트 상의 500 ㎕/well 의 접종액을 전체량 제거하고, 1.5 ％ Sea Plaque Agarose-DMEM (37 ℃) 을 2 ㎖/well 로 중층하고, 그것이 굳어진 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 2 일간 배양하였다.
(7) 2 일간 배양 후의 플레이트에 염색액인 0.03 ％ 뉴트럴 레드 용액을 2 ㎖/well 로 중층하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 1 시간 인큐베이트하였다.
(8) (7) 의 인큐베이트 후에 0.03 ％ 뉴트럴 레드 용액의 전체량을 철거하고, 육안으로 플라크수를 카운트하였다. 얻어진 플라크수와 희석 배율로부터 상기 1 분간 방치 후의 노로바이러스 혼합액 (또는 노로바이러스액) 의 감염가 (PFU/㎖) 를 산출하였다. 또한, 1 분간 방치 전의 노로바이러스 혼합액의 감염가는, 상기 노로바이러스액의 감염가에 노로바이러스 혼합액에 있어서의 노로바이러스액과 함수 유동상 조성물의 혼합 비율 (0.1/1.1) 을 곱한 값을 사용하였다.
(9) 이하의 식으로 시험 번호 1 내지 21 의 함수 유동상 조성물의 항 노로바이러스 활성을 산출하였다. 항 노로바이러스 활성 = Log10 (1 분간 방치 전의 노로바이러스 혼합액의 감염가) - Log10 (1 분간 방치 후의 노로바이러스 혼합액의 감염가)
시험 번호 1 내지 9 의 함수 유동상 조성물은, 1 분간 방치 후의 감염가가 104 이하이고, 표 1 에 나타내는 바와 같이, 상기 식으로부터 산출된 항 노로바이러스 활성은 3 이상이었다. 즉, 시험 번호 1 내지 9 의 함수 유동상 조성물은, 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하고, 상기에 규정된 형광 강도가 5,000 이상임으로써, 제조 직후에 있어서 노로바이러스 불활화 작용을 갖는 것이 확인되었다.
또, 시험 번호 1 내지 9 의 함수 유동상 조성물에서는, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염이 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고, 또한 그 함수 유동상 조성물에 있어서의 그 극성 유기 용제의 함유량이 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하임으로써, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 2 주간, 4 주간, 및 8 주간 보존한 후에 있어서도, 노로바이러스 불활화 작용을 가지고 있어, 노로바이러스의 불활화 작용의 저하가 억제되어 있는 것이 확인되었다.
보다 구체적으로는, 시험 번호 1 내지 9 의 함수 유동상 조성물에서는, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 4 주간 보존 후의 항 노로바이러스 활성이, 보존 전 (제조 직후) 의 항 노로바이러스 활성에 대해 50 ％ 이상 (70 ％ 이상) 인 것이 확인되었다.
이에 대하여, 시험 번호 10 내지 15 의 함수 유동상 조성물은, 극성 유기 용제의 함유량이 55 질량％ 미만 (50 질량％) 이었기 때문에, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 2 주간, 4 주간, 8 주간 보존한 후에는, 노로바이러스 불활화 작용이 저하된 것이 확인되었다. 보다 구체적으로는, 시험 번호 10 내지 15 의 함수 유동상 조성물에서는, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 4 주간 보존 후의 항 노로바이러스 활성이 보존 전 (제조 직후) 의 항 노로바이러스 활성에 대해 50 ％ 미만으로 저하된 것이 확인되었다.
또, 시험 번호 16 의 함수 유동상 조성물은, 극성 유기 용제의 함유량이 20 질량％ 미만 (0 질량％) 이었기 때문에, 40 ℃ × 75 ％RH 에서 4 주간 보존 후의 항 노로바이러스 활성이, 보존 전 (제조 직후) 의 항 노로바이러스 활성에 대해 대폭 저하한 것이 확인되었다.
또한, 시험 번호 17 내지 21 에서 조제된 리소자임 가공품의 형광 강도는 4,000 미만이고, 항 노로바이러스 활성이 낮은 것이 확인되었다.
또, 시험 번호 17 내지 21 에서 조제된 리소자임 가공품에 극성 유기 용제와 혼합하면 백탁이 생겼기 때문에, 그 리소자임 가공품을 함유하는 함수 유동상 조성물의 형광 강도 및 항 노로바이러스 활성을 측정할 수 없었다.
또한, 시험 번호 22 에 있어서 리소자임 가공품의 농도가 10 질량％ 인 수용액을 조제한 바, 실온 (25 ℃) 의 수용액 중에서 침전이 생겼기 때문에, 형광 강도 및 항 노로바이러스 활성을 측정할 수 없었다.
[시험예 2]
본 시험예에서 얻어진 리소자임 가공품에 대해 전기 영동을 실시하였다. 본 시험예에서는, 시험 번호 1 에 있어서의 가열 조건 (가열 온도, 가열 시간 및 난백 리소자임의 농도) 을 바꿔 리소자임 가공품을 조제하였다.
보다 구체적으로는, 난백 리소자임의 2 질량％ 수용액을 가열 온도 80 ℃ 에서 가열 시간 0 분, 15 분, 30 분, 60 분, 90 분, 및 120 분 시점에서 채취한 그 수용액 50 ㎕ 에 샘플 버퍼 950 ㎕ 를 첨가하고, 100 ℃ 에서 10 분간 가열한 후, 빙랭하고, 10 ㎕ (리소자임 가공품으로서 10 ㎍) 를 전기 영동 겔에 차지하였다. 또한, 샘플 버퍼로서 2-메르캅토에탄올을 첨가하지 않은 것 (비환원) 을 사용하였다. 전기 영동의 겔은, SDS-PAGEmini (테프코 주식회사 제조, 겔 농도 4-10 ％, 겔두께 1 ㎜) 를 사용하여, 20 mA 의 정전류로 영동하였다. 염색액에는 쿠마시 블루 R250 을 사용하였다.
도 2 는, 전기 영동의 결과를 나타내는 사진이다. 도 2 에 나타내는 바와 같이, 가열 시간 60 분, 90 분 및 120 분 시점에서, 약 29 KDa 의 단백질 (이량체로 추측) 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질 (삼량체로 추측) 을 나타내는 밴드가 분명히 검출되었다. 또, 가열 시간이 길수록, 이들 단백질을 나타내는 밴드가 진해지는 (즉, 생성되는 상기 단백질의 양이 증가하는) 것이 확인되었다. 또, 동일한 가열 온도에 있어서는, 가열 시간이 길수록, 그 단백질의 표면 소수성이 증가하여, 노로바이러스 불활화 작용이 높은 단백질이 얻어진다고 추측된다.
[실시예 2]
실시예 1 의 시험 번호 2 에 있어서 얻어진 리소자임 가공품을 사용하고, 그 리소자임 가공품의 농도를 0.3 질량％, 0.6 질량％ 및 2 질량％ 로 한 것 이외에는 시험 번호 2 와 동일한 방법으로, 시험 번호 23 내지 26 의 함수 유동상 조성물을 얻었다. 시험 번호 23 내지 26 의 함수 유동상 조성물에 대해 상기 방법으로 측정된 형광 강도 및 항 노로바이러스 활성을 측정한 바, 그 형광 강도는 모두 5,000 이상이고, 또 제조 직후 및 40 ℃ × 75 ％RH 에서 8 주간 보존한 후의 항 노로바이러스 활성이 모두 3.0 이상이었다.
[배합예 1]
하기 배합비로, 시험 번호 9 에서 얻어진 함수 유동상 조성물과 하기 성분을 혼합시켜, 젤상의 소독제 (함수 유동상 조성물) 를 조제하였다.
함수 유동상 조성물 (시험 번호 9) 98 질량％
글리세린 1 질량％
카르복시비닐 폴리머 1 질량％
[배합예 2]
하기 배합비로, 시험 번호 9 에서 얻어진 함수 유동상 조성물과 하기 성분의 혼합물을 부직포에 함침시켜, 웨트 티슈를 조제하였다.
함수 유동상 조성물 (시험 번호 5) 99 질량％
PEG-40 수소 첨가 피마자유 1 질량％
산업상 이용가능성
본 발명의 함수 유동상 조성물은, 예를 들어 손가락, 체구, 의료 기구, 학교, 병원, 복지 시설 등의 시설, 공장, 주거 등의 소독을 실시하는 소독제, 식품 첨가물, 바이러스 (노로바이러스) 의 제거제로서 유용하다.
본 발명에 관련된 실시형태의 설명은 이상이다. 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성과 실질적으로 동일한 구성, 예를 들어 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 혹은 목적 및 결과가 동일한 구성을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성의 본질적이지 않은 부분을 치환한 구성을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.

Claims (19)

  1. 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 포함하는 함수 유동상 조성물로서,
    상기 함수 유동상 조성물은, 하기에 규정되는 형광 강도가 5,000 이상이고,
    상기 함수 유동상 조성물에 있어서, 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 극성 유기 용제에 접촉한 상태에서 그 함수 유동상 조성물에 용해되어 있고,
    상기 함수 유동상 조성물에 있어서의 상기 극성 유기 용제의 함유량이, 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인, 함수 유동상 조성물.
    형광 강도 : 상기 함수 유동상 조성물을 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 3.0 이상인, 함수 유동상 조성물.
    항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액 0.1 질량부에 대해 상기 함수 유동상 조성물 1 질량부를 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 형광 강도가 6,000 이상인, 함수 유동상 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 극성 유기 용제는 에탄올을 포함하고,
    상기 에탄올의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인, 함수 유동상 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하인, 함수 유동상 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    물 및 에탄올 이외의 수용성 알코올 혹은 어느 일방을 추가로 함유하는, 함수 유동상 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염은, 난백 리소자임에서 유래하는, 함수 유동상 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스프레이식 용기에 충전된, 함수 유동상 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    펌프식 용기에 충전된, 함수 유동상 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    부직포에 함침시킨 함수 유동상 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 함수 유동상 조성물을 대상물에 접촉시키는 공정을 포함하는, 균 및/또는 바이러스의 불활화 방법.
  12. 하기 정의에 의해 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 리소자임 가공품 및/또는 그 염 :
    형광 강도 : 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되고, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  13. 제 12 항에 있어서,
    하기에 규정되는 항 노로바이러스 활성이 2.0 이상인, 리소자임 가공품 및/또는 그 염.
    항 노로바이러스 활성 : 노로바이러스액과 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 로그로부터 방치 후의 감염가의 로그를 뺀 값
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 제조하는 방법으로서,
    파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한 리소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 리소자임 및/또는 그 염의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정과,
    상기 제 1 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만의 극소값까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정과,
    상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정을 포함하는, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 제 3 가열 공정의 가열 조건이, 그 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 조건인, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 얻는 공정을 추가로 포함하는, 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 제조 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법으로 얻어진 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함하는, 함수 유동상 조성물의 제조 방법.
  18. 제 12 항 또는 제 13 항에 기재된 리소자임 가공품 및/또는 그 염과 극성 유기 용제를 혼합하여, 상기 극성 유기 용제의 농도가 55 질량％ 이상 90 질량％ 이하인 함수 유동상 조성물을 얻는 공정을 포함하는, 함수 유동상 조성물의 제조 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    상기 함수 유동상 조성물을 얻는 공정에 있어서, 그 함수 유동상 조성물에 있어서의 리소자임 가공품 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.1 질량％ 이상 10 질량％ 이하가 되도록, 상기 극성 유기 용제와 상기 리소자임 가공품 및/또는 그 염을 혼합하는, 함수 유동상 조성물의 제조 방법.
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