KR20160147844A - 표적화된 돌연변이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아 게놈에서의 표적화된 돌연변이의 생성 및 선택 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 요망되는 돌연변이를 포함하는 재조합 요소로의 박테리아의 형질전환에 이어서, 박테리아 게놈 내로의 재조합 요소의 상동성 재조합에 관한 것이며; 이어서, CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 요망되는 돌연변이를 갖지 않는 박테리아를 제거한다.

Description

표적화된 돌연변이{TARGETED MUTATIONS}
본 발명은 박테리아 게놈 내의 표적화된 돌연변이의 생성 및 선택 방법에 관한 것이다. 특히, 당해 방법은 요망되는 돌연변이를 포함하는 재조합 요소(Recombination Element)로의 박테리아의 형질전환에 이어서 박테리아 게놈 내로의 재조합 요소의 상동성 재조합에 관한 것이며; 이어서, CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 요망되는 돌연변이를 갖지 않는 박테리아를 제거한다.
아세톤, 부탄올 및 에탄올의 산업적 생성을 위하여 용매-생성 클로스트리디아(clostridia)를 1920년대 및 1930년대에 처음 사용하였다. 1950년대 동안 이들 용매를 합성하기 위한 더욱 효율적인 석유화학 기술의 확립에 의해, 그러한 대규모 박테리아 발효의 중단이 초래되었다. 그러나 현 환경에서, 지속가능하고 재생가능한 공정을 사용한 화학물질의 발생에 대한 압박이 증가되어, 용매의 생성을 위한 클로스트리디아 발효에 관심이 재개되고 있다. 또한, 이것은 몇몇의 게놈의 서열분석(sequencing) 및 RNA 서열분석 및 전사체학의 이용과 함께, 이들 용매발생 클로스트리디아의 생물학적 이해의 진전에 의해 보조된다. 이들 연구 영역은 부탄올을 과다생성하거나, 경쟁하는 부산물의 생성을 없애서, 용매발생 발효의 경제학을 추가로 개선시킬 수 있는 새로운 균주의 조작 가능성을 열었다.
이러한 게놈 정보의 유입을 이용하기 위하여, 상업적으로 적절한 재조합 클로스트리디아 균주 및 기타 박테리아 균주의 신속하고 신뢰가능한 생성 방법이 여전히 필요하다.
종래에는 재조합 클로스트리디아 균주를 생성하는 것이 매우 어려웠다. 낮은 재조합 효율과 조합된 낮은 형질전환 효율은 안정적인 재조합 균주가 개선된 용매-관련 표현형을 나타내게 하는 노력을 방해한다. 지난 수년에 걸쳐, II형 인트론, 예를 들어, 타게트론(Targetron)(Sigma) 및 클로스트론(Clostron)(예를 들어, WO 2007/148091호)의 사용을 통한 유전자의 삽입 불활성화 및 '대립형질 결합 교환'(ACE, 예를 들어, WO 2009/101400호)의 사용을 통한 신규 경로 유전자의 통합을 가능하게 하는 기술이 개발되었으나, 다수의 돌연변이의 도입이 어렵고, 특정 염기 교환(단일의 뉴클레오티드 다형성, SNP)의 도입에 대한 연구가 거의 행해지지 않았다. 현재의 기술은 이들 목적 중 어느 하나를 일상적으로 달성하기에 충분히 우수하지 않다.
클로스트리디아 유전계에 대한 조기의 연구에 의해, 단일의 교차를 지니는 균주를 초래하여, 특정 유전자 내에 돌연변이를 지니는 균주를 생성하였지만, 이들은 정밀하지 않고, 그들은 유전학적으로 불안정하며, 세포에 플라스미드 및 항생제 마커 유전자를 남겨둔다. 또한, 특히, 표적화된 유전자가 오페론이면, 그들은 잠재적으로 극성 효과를 가질 수 있다(예를 들어, 그들은 다른 유전자에 영향을 미칠 수 있다).
예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E. coli)의 재조합 균주의 제조는 선형 DNA(그러나 필요한 재조합은 오직 재조합 균주, 예를 들어, 하기 문헌[Jiang et al. 2013]에 의해 사용되는 바와 같은 에스케리키아 콜라이 HME63에서만 효율적으로 작동함) 또는 자살 벡터(suicide vector)로의 형질전환을 통해 달성될 수 있지만, 클로스트리디아에서, 이들 방법은 적용가능하지 않는데, 그 이유는 낮은 재조합 빈도에 의해, DNA가 세포로부터 소실되기 전에 재조합 사건이 발생하게 되지 않기 때문이다. 이를 극복하기 위하여, 많은 방법은 안정적인 복제성 벡터를 사용하지만, 재조합 사건 후에, 이들은 항생제 및 다른 마커 유전자가 남겨지는 것 외에 세포로부터 소실되어, 추가의 조작을 방지해야 한다. 플라스미드는 온도 감수성 레플리콘(replicon); 슈도-자살 벡터(이들은 불안정한 분리를 나타내고, 결국 모집단으로부터 소실될 수 있는 원점을 지님)(예를 들어, 문헌[Heap et al., J. Microbiol. Methods, 78(1), 79-85. 2009]); 재조합 벡터 내로의 제한 효소 부위의 도입; 및 유도성 프로모터 하의 제한 엔도뉴클레아제의 클로닝(또는 제한 엔도뉴클레아제의 게놈 카피의 이용)을 사용함으로써 소실될 수 있다. 대안적으로, FLP/FRT 재조합효소를 사용하여, 통합 후에 선택가능한 마커 및 플라스미드의 다른 선택된 영역을 제거할 수 있다(예를 들어, WO 2008/040387호). 그러나 이들 방법은 추가의 단계를 더하고, 시스템에 복잡성을 증가시킨다.
수많은 공보에 의해, 대항-선택과 결합된 상동성 재조합을 사용한 프레임-내 또는 항생제 내성 카세트(예를 들어, 클로스트론)의 삽입을 통한 클로스트리디아 내의 특정 유전자의 결실이 입증되어 있다. 이것은 염색체(예를 들어, pyrE) 상에 위치하거나, 이종 도입된(예를 들어, 에스케리키아 콜라이 유래의 codA) 대항-선택 유전자 상동체에 좌우된다. 현재까지, 특정 SNP를 지니도록 조작된 클로스트리디아 균주의 증거가 거의 없다. 몇몇 연구가 클로스트리듐 디피실레(C. difficile)에서 행해졌지만(예를 들어, 문헌[Cartman et al., Appl. Environ. Micro. (2012) Jul;78(13):4683-90]), 대항-선택 마커의 이용은 마커 유전자 상동체가 플라스미드 내로 클로닝되어야 하고, 세포가 여전히 유전자 상동체를 지닌다면 독성인 화학물질을 사용하여 선택한 다음(즉, 이중 교차 사건에 대한 선택), 당해 방법이 WT(야생형) 복귀 돌연변이체와 돌연변이가 혼입된 세포 간을 구별하지 못하기 때문에, 요망되는 유전자 변경에 대한 스크리닝을 필요로 하게 한다. 생성된 재조합 균주가 여전히 PyrE 결실을 지닌다면, 균주를 수선하기 위하여 추가의 단계를 행해야 한다.
일부 대항-선택 방법은 방법이 사용될 수 있기 이전에 결실 균주가 생성되는 것을 필요로 하고(예를 들어, ACE), 대항-선택으로서 독성 유사체의 사용을 통해 추가의 원치 않는 돌연변이를 도입할 위험이 있다. 예를 들어, 종종 pyrE 돌연변이체를 사용하여 재조합 균주를 생성한다. 이들 돌연변이체는 5-플루오로오로트산(5-FOA)에서 성장할 수 있는 한편, 야생형 pyrE 유전자를 지닌 세포는 5-FOA를 독성 유사체로 전환시켜 세포사를 야기한다. 그러나 pyrE는 우라실 생합성 경로의 부분이며, 그래서, 이들 돌연변이체는 또한, 성장을 위하여 우라실을 배지에 첨가하는 것을 필요로 한다. 이들과 같은 뉴클레오티드 생합성 경로의 간섭은 예상하지 못한, 그리고 원치 않는 추가의 영향도 가질 수 있다.
RNA 낙-다운 및 간섭 방법은 연구 목적에 유용할 수 있지만, 상업적 용매발생 클로스트리디아 균주의 작제에 적합하지 않다. 또한, 전이인자(transposon) 돌연변이유발은 재조합 균주를 생성하기 위한 가치있는 도구이지만, 화학물질 돌연변이유발과 같이, 특정 게놈 위치에 표적화될 수 없어, 그에 의해, 그것이 산업적으로 적절한 클로스트리디아 균주를 작제하기 위한 실행가능한 방법이라기보다는 가치있는 연구 도구가 되게 한다.
정밀한 게놈 변경을 이루기 위하여 잠재적으로 사용될 수 있는 신규한 방법은 전사 활성화제-유사 엔도뉴클레아제(TALEN, 예를 들어, US 8,420,782 B2호)이지만, 상기 기술은 진핵 게놈을 교정하기 위하여 개발되었으며, 아직 산업적으로 적절한 용매발생 클로스트리디아 균주에 사용하기 위해 구체적으로 조정된 적이 없다. 각 유전자 표적을 위한 TALEN의 조작 요구는 비용이 들고, 시간이 소모되며, 기술이 클로스트리디아에서 정밀하게 작용할 방식의 실제 능력은 그것이 가까운 장래에 광범위하게 허용가능한 도구가 되는 것에 불리한 것으로 여겨진다.
따라서, 클로스트리디아를 위해 현재 이용가능한 도구를 사용하는 경우 마주치는 다수의 챌린지(challenge), 즉, 낮은 형질전환 빈도, 낮은 재조합 효율, 야생형 복귀 돌연변이체에 대하여 유전자 대체 균주를 선택할 수 없음, 원치 않는 극성 효과, 대항-선택 단계를 위해 독성 유사체를 사용하는 경우 발생할 수 있는 원치 않는 추가의 돌연변이(그리고 이들 방법의 일부에 있어서 야생형보다는 결실 균주를 사용할 필요성), 다수의 적층 돌연변이의 제조의 어려움 및 이중 교차 사건 후의 재조합 벡터의 소실을 보장할 필요성을 극복할 유전자 조작을 위한 다목적 방법이 여전히 필요하다.
따라서, 클로스트리디아 CRISPR/Cas 시스템의 사용에 기초한 신규한 방법이 개발되었다. (CRISPR는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered, Regularly Interspaced, Short, Palindromic Repeats)에 대한 약어이다.) 이들 시스템은 통상 '원핵 적응 면역계'로 기재되며, 박테리아 또는 조류 세포가 그 자신을 침입하는 DNA, 통상 파지 또는 플라스미드 DNA로부터 보호할 수 있는 수단이다.
CRISPR/Cas 시스템이 있는 세포는 짧은 단편을 '침입' DNA로부터 Cas 유전자 클러스터 내로 선택적으로 통합시킬 수 있다. 각 단편은 '스페이서'로 지칭되며, 직접 반복부가 측부 배치된다(flanked). 세포가 동일한 침입 DNA와 다시 마주치면, 세포는 침입 DNA를 적으로 인식할 것이며, Cas 엔도뉴클레아제로 침입 DNA를 절단함으로써 침입 DNA를 파괴할 것이다.
CRISPR/Cas 시스템이 침입 DNA에서 인식하는 서열은 '프로토스페이서'로 지칭되며, 게놈 내의 스페이서 카피에 대하여 동일성을 갖는다. 세포가 스페이서의 게놈 카피를 우연히 공격하지 않는 것을 확실히 하기 위하여, Cas I 또는 Cas II 시스템에서 프로토스페이서는 PAM 서열로 지칭되는 것과 회합된 짧은 서열을 가져야 한다. PAM 서열은 시스템의 유형에 따라 프로토스페이서 서열의 상류 또는 하류일 수 있다. 침입 DNA가 존재하지 않거나, 어떠한 방식으로든 돌연변이되면, 침입 DNA는 세포에 의해 더이상 인식되지 않을 것이며, 침입 DNA는 파괴되지 않을 것이다.
스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 cas9와 회합된 PAM 서열은 널리 알려져 있지만(문헌[Jiang et al., Nature Biotech. (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]); 그러나 클로스트리디아 시스템과 회합된 PAM 서열은 이전에 확인된 적이 없다.
모든 원핵생물이 CRISPR/Cas 유전자 상동체를 갖는 것은 아니며, 그들 중에서, 그들은 몇몇 별개의 부류에 속한다(문헌[Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol., 9(6), 467-77. 2011]). 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 II형 cas 9 시스템에 대한 다수의 연구가 공개되어 있다(예를 들어, 문헌[Jiang et al., Nature Biotech. (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]). 이것은 진핵 세포에서 이용하기 위한 게놈-교정 도구로 개발되었으며, 이는 예를 들어, 효모(문헌[DiCarlo et al., Nucleic Acids Research, 41(7), 4336-4343, 2013]), 제브라피시(문헌[Hwang et al., Nat. Biotechnol., 31(3), 227-9. 2013]) 및 포유류 세포(문헌[Ran et al., Nature Protocols, 8, 2281-2308, 2013])에서 성공적으로 사용되어 왔다.
널리 연구된 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이와 함께 사용하기 위하여 많은 뛰어난 분자적 도구가 개발되었다. 이들 도구는 상이한 플라스미드 및 매우 효율적인 형질전환 및 재조합 기술의 모음을 포함한다. 그러나 이들 도구 중 다수는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리디아에 적용가능하지 않다. 예를 들어, 수카일레(Soucaille) 등(US 2012/0190116호)은 선형 DNA의 이용에 기초하여 에스케리키아 콜라이에서 사용되는 통상의 기술이 선형 단편의 짧은 세포내 및 세포외 반감기, 클로스트리디아 DNAse 및 DNA 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해로 인하여 클로스트리디아에서 실현가능하지 않음을 언급한다.
트라시(Tracy) 및 파포우챠키스(Papoutsakis)로부터의 특허 출원(예를 들어, US 2012/0301964 A1호 및 US 2014/0141516 A1호)은 필수 상동성 재조합 기구의 로차(Rocha) 등에 의한 비교 유전체학 연구(문헌[PLoS Genet., 2005. 1(2): p. e15])에 의해, 재조합 중간체의 헤테로듀플렉스 간의 분자내 분리 반응을 촉매작용시키기 위한 임의의 명백한 레졸바제(resolvase) 유전자가 클로스트리디아에 결여되어 있음이 나타났음을 언급한다. 이를 극복하기 위하여, 그들은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 내에서의 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 유래의 recU 유전자의 발현에 의해 비-내인성 레졸바제 활성을 부가하였다. 그러나 재조합발생(recombinogenic) 균주는 유전학적으로 불안정하며, 이에 따라, 장래의 상업적 이용에 적합하지 않다.
재조합 효율을 증가시키기 위하여 박테리아에 효소를 보충할 필요 없이, 신속하고 효율적인 방식으로 박테리아 게놈에서 요망되는 돌연변이의 생성을 가능하게 하는 새로운 방법이 이제 개발되었다. 이러한 방법에서, 낮은 형질전환 및 재조합 효율은 크게 중요하지 않게 된다. 비돌연변이 표적 서열로 "사멸 벡터"를 지향시킴으로써, 비돌연변이 서열을 지니는 세포가 표적화되고 사멸되어, 그에 의해, 오직 회수된 세포만이 요망되는 돌연변이를 지니는 세포임을 보장할 수 있으며; 스크리닝이 요구되지 않는다. 이것이 매우 정밀한 과정임에 따라, 극성 효과(더욱 조잡한 방법을 사용하여 관찰됨)가 제거될 수 있다. 추가로, 대항-선택 마커가 필요하지 않으며, 이에 따라, 결실 균주를 사용할 필요가 없어지고, 선택을 위한 독성 유사체의 사용을 통하여 원치 않는 돌연변이의 우발적인 생성 가능성이 없어진다.
이러한 신규한 방법에서, DNA 변화는 영구적이며, 안정적이고; 형질전환된 벡터의 제거(또는 소실)는 다수의 층의 돌연변이가 용이하게 이루어질 수 있음을 의미한다. 또한, 당해 방법은 한번에 1개 초과의 유전자 또는 DNA 요소의 표적화를 용이하게 하여, 몇몇의 유전자 변형이 한번에 이루어지게 한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 박테리아 게놈 내의 의도된 돌연변이유발 영역(Intended Mutagenesis Region, IMR)에 돌연변이를 생성하는 방법을 제공하며, 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, IMR은 박테리아의 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하며, 당해 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 상기 박테리아의 모집단을 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 재조합 벡터가 재조합 요소를 포함하며, 재조합 요소가
(i) 돌연변이를 포함하는 치환 요소, 및
(ii) 치환 요소의 측부 배치된(flank) 상동성 암(arm)으로서, 상동성 암이 치환 요소를 포함하는 요소로의 박테리아 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분의 대체를 촉진시킬 수 있는 상동성 암을 포함하고,
재조합 요소가 IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하지 않는 단계;
(b) 박테리아의 모집단을 모집단 내의 하나 이상의 박테리아에서, 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분이 치환 요소를 포함하는 요소에 의해 대체되어, 그에 의해, CRISPR PAM/프로토스페이서가 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR로부터 제거되거나, IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 되는 조건하에 배양하는 단계;
(c) 박테리아의 모집단을 CRISPR PAM/프로토스페이서가 제거되지 않거나, crRNA에 의해 인식될 수 없게 되지 않은 모집단 내의 임의의 박테리아의 IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서를 표적화하는 crRNA의 생성을 지시할 수 있는 사멸 벡터로 형질전환시켜, 그에 의해, crRNA에 의해 인식되는 그들 CRISPR PAM/프로토스페이서의 CAS 엔도뉴클레아제-유도 절단 및 이후의 그들 박테리아의 사멸을 촉진시키는 단계; 및
(d) 게놈이 돌연변이를 포함하는 치환 요소를 포함하는 모집단으로부터 하나 이상의 박테리아를 선택하거나 단리하는 단계.
IMR(의도된 돌연변이유발 영역)은 요망되는 돌연변이를 만들도록 의도된 박테리아 게놈 내의 DNA 서열이다.
본 발명의 일부 구현예에서, IMR은 5'-말단이 재조합 요소의 5'-상동성 암의 상류 말단에 상응하고, 3'-말단이 재조합 요소의 3'-상동성 암의 하류 말단에 상응하는 박테리아 게놈 내의 영역에 상응한다.
본원에 사용되는 용어 "박테리아 게놈" 또는 "게놈 DNA"는 주로 환형 박테리아 염색체를 말하지만, 당해 용어는 또한 임의로 특정 조건하에서 박테리아의 생존력에 필수적이거나, 또는 정의된 조건하에서 선택될 수 있는 내인성 플라스미드(예를 들어, 클로스트리디아 메가플라스미드(megaplasmid) 또는 더 작은 내인성 플라스미드)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 내인성 플라스미드는 다른 독성 물질(예를 들어, 항생제 또는 중금속) 또는 경쟁 미생물의 존재하에 성장하거나, 성장을 위해 특정 기질을 사용하는 능력을 부여할 수 있다. 돌연변이될 박테리아 게놈 또는 게놈 DNA가 그러한 내인성 플라스미드인 본 발명의 구현예에서, 당해 방법은 임의로 플라스미드의 존재를 위해 선택되는 조건하에서 박테리아의 모집단을 배양하는 단계를 포함한다.
박테리아의 모집단 내의 박테리아는 CRISPR/Cas 시스템을 가져야 한다. 이러한 CRISPR/Cas 시스템은 그들 박테리아가 사멸 벡터로 형질전환되는 경우, PAM/프로토스페이서를 여전히 포함하는 모집단 내의 박테리아의 게놈을 절단할 수 있는 것일 것이다.
일부 경우에, 박테리아 모집단 내에 오염이 존재할 수 있음이 허용될 것이다. 본원에 사용되는 용어 "박테리아의 모집단"은 주로 재조합 벡터 및 사멸 벡터로 형질전환시키고자 하는 박테리아를 말한다.
바람직하게는 CRISPR/Cas 시스템은 I형 CRISPR/Cas 시스템이다.
모집단 내의 박테리아는 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 가질 수 있거나, CRISPR/Cas 시스템은 이종일 수 있다. 예를 들어, 이종 CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드-기반일 수 있다.
바람직하게는, CRISPR/Cas 시스템은 내인성 CRISPR/Cas 시스템이고, 다시 말하면, 그것은 야생형 박테리아에 존재한다. 본 발명의 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드-기반의 시스템이 아니다.
모집단 내의 박테리아는 예를 들어, 그람(Gram)-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 그람-양성이다.
일부 구현예에서, 박테리아는 포자-형성 박테리아이다. 다른 구현예에서, 박테리아는 당분해 박테리아이다. 박테리아는 호기성 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 혐기성 박테리아이다. 박테리아는 호열성 박테리아일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 기질을 RCOOH로, 예를 들어, 아세트산염 및/또는 부티르산염으로 전환시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, R은 지방족 C1-C5, 바람직하게는 C1-3, 알킬 또는 알케닐기이다. 또한, 박테리아는 RCOOH를 용매로, 바람직하게는 아세톤, 에탄올 및/또는 부탄올 중 하나 이상으로 전환시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 박테리아는 용매-생성 박테리아이다. 본원에 사용되는 용어 "용매-생성"은 박테리아가 용매, 바람직하게는, 아세톤, 에탄올, 프로판올 및/또는 부탄올과 같은 용매를 생성할 수 있는 박테리아임을 의미한다. 특히 바람직한 특정 구현예에서, 박테리아는 에탄올, 아세톤 및 부탄올을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 박테리아는 부탄올-생성 박테리아 또는 부탄올-내성 박테리아이다.
일부 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 속의 것이다. 바람직한 클로스트리듐 종은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 클로스트리듐 아르부스티(C. arbusti), 클로스트리듐 아우란티부티리쿰(C. aurantibutyricum), 클로스트리듐 베이예린키이(C. beijerinckii), 클로스트리듐 셀룰로보란스(C. cellulovorans ), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(C. cellulolyticum), 클로스트리듐 써모셀룸(C. thermocellum), 클로스트리듐 써모부티리쿰(C. thermobutyricum), 클로스트리듐 파스퇴리아눔(C. pasteurianum), 클로스트리듐 클루이베리(C. kluyveri), 클로스트리듐 노브이이(C. novyi), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리듐 써모석시노게네스(C. thermosuccinogenes), 클로스트리듐 써모팔마리움(C. thermopalmarium), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰(C. saccharolyticum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리듐 테타노모르품(C. tetanomorphum), 클로스트리듐 마그눔(C. magnum), 클로스트리듐 륭달리(C. ljungdahlii), 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리듐 푸니세움(C. puniceum), 클로스트리듐 디올리스(C. diolis), 클로스트리듐 호모프로피오니쿰(C. homopropionicum) 및 클로스트리듐 로세움(C. roseum)을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 균주 N1, 예를 들어, N1-4이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-504이다.
다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 클로스트리듐 파스퇴리아눔(예를 들어, DSM 525), 클로스트리듐 티로부티리쿰(예를 들어, ATCC 52755), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(예를 들어, NCP 258 및 NCP 262) 또는 클로스트리듐 종 DL-VIII이다.
다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 바실러스 속의 박테리아이다. 다른 바람직한 구현예에서, 박테리아는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목의 박테리아이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 박테리아는 비-고도의 재조합발생 박테리아이다. 본원에 사용되는 "비-고도의 재조합발생" 박테리아는 표준 재조합 기술이 "고도의 재조합발생" 균주에서의 재조합에 비하여 재조합을 유도하기에 비효율적인 박테리아이다. 상이한 박테리아 종 간의 상동성 재조합 비(HRR)를 측정하고 비교하기 위하여 다양한 방법이 사용되어 왔다. 유용한 표 및 논의는 문헌[Vos and Didelot (2009) ("A comparison of homologous recombination rates in bacteria and archaea," The ISME Journal 3, 199-208); 본원에 참조로 포함]에 제공되어 있다. 보스(Vos) 및 디델롯(Didelot)은 점 돌연변이(r/m) 비에 비한 재조합에 따라 종의 순위를 정하고; 이는 종에서의 HRR의 일반적 지표로 해석될 수 있다. 특히, r/m 값은 점 돌연변이에 비한 재조합의 결과로서의 뉴클레오티드 변경의 비로 정의된다. 그것은 ClonalFrame 컴퓨터 패키지(문헌[Didelot and Falush (2007), Genetics 175: 1251-1266]; 본원에 참조로 포함)를 사용하여 마이든(Maiden) 등(문헌[PNAS (USA) 95: 3140-3145 (1998)]; 본원에 참조로 포함)의 다중 유전자좌 서열 타이핑(Multi Locus Sequence Typing, MLST) 방법으로부터 추정될 수 있다. 보스 및 디델롯(본원에 구체적으로 참조로 포함되는 표 1)은 플라보박테리움 사이크로필룸(Flavobacterium psychrophilum)으로부터 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)까지 '매우 높은 또는 높은' 상동성 재조합 비(즉, 2 초과의 r/m 값)를 갖는 것으로 분류한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 박테리아는 고도로 재조합발생성이 아니며, 다시 말하면, 박테리아는 중간의, 낮은 또는 매우 낮은 HRR을 갖고, 예를 들어, 박테리아는 보스 및 디델롯에 의해 정의되는 바와 같이 2 미만, 더욱 바람직하게는 1 미만의 r/m 값을 갖는다.
일부 구현예에서, 박테리아는 재조합발생 활성을 증진시키도록 변형되지 않는다. 특히, 박테리아의 재조합발생 활성은 바람직하게는 비-내인성 또는 외인성 재조합 효소의 사용에 의해 증진되지 않는다.
다른 구현예에서, 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스 또는 에스케리키아 콜라이가 아니다.
IMR은 박테리아의 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함한다.
PAM/프로토스페이서는 PAM 서열 및 프로토스페이서의 작용적 조합을 포함하는 박테리아 게놈 내의 서열이다. 이러한 PAM/프로토스페이서 서열은 사용되고 있는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있는 것이며, crRNA의 생성시에, 그것은 분해를 위해 선택된 CRISPR/Cas 시스템에 의해 표적화되어, 작용성 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 여전히 포함하는 임의의 박테리아의 세포사를 야기할 것이다.
본원에 사용되는 용어 "작용성 CRISPR/PAM 프로토스페이서"는 IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 의미한다. 일부 경우에, 단일의 돌연변이(예를 들어, PAM 서열 내)가 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 비작용성이 되게 하기에 충분할 수 있다.
PAM은 프로토스페이서-인접 모티프에 대한 약어이다. PAM 요소는 박테리아 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있다. PAM 요소는 일반적으로 3 내지 6개 뉴클레오티드 길이이며, 각 박테리아 종에 특이적이다.
박테리아 게놈 내의 프로토스페이서에 관한 PAM 요소의 배향이 중요하다. 일부 박테리아 종에서, PAM 요소는 일반적으로 프로토스페이서의 5' 말단에 또는 그 근처에서 관찰되며; 다른 종에서, PAM 요소는 일반적으로 프로토스페이서의 3' 말단에 또는 그 근처에서 관찰된다.
PAM 요소는 박테리아 게놈의 어느 하나의 가닥에 존재할 수 있지만, Cas 스페이서 요소로서 선택된 서열은 (PAM 요소 및 프로토스페이서가 바로 인접하도록) PAM 요소와 동일한 DNA 가닥 상에 존재하여야 한다.
일부 연구에 의해, PAM 요소 내의 거의 임의의 돌연변이가 CRISPR/Cas 시스템에 의한 인식을 없앤다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Jiang et al., Nature Biotech (March 2013), vol. 31, no. 3, pp. 233-239]). PAM/프로토스페이서 요소는 작용성 프로토스페이서에 더하여 작용성 PAM 요소를 가져야 한다. 본원에 사용되는 용어 "작용성 PAM 요소" 또는 "박테리아에서 작용성인 CRISPR PAM 요소"는 PAM 요소가 박테리아의 내인성 CRISPR/Cas 시스템에 의해, 또는 박테리아가 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 갖지 않는다면, 박테리아 내로 도입된 벡터-기반의 이종 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있음을 의미한다.
1개 초과의 서열이 선택된 박테리아 종에서 PAM 요소로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 K-12로부터의 I-E CRISPR-Cas 시스템은 4개의 작용성 PAM 서열을 갖는 것으로 알려져 있으며(문헌[Gomaa et al. (2014). mBio, 5 (1): e00928-13 DOI: 10.1128/mBio.00928-13]), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)에서, 적어도 4개의 효율적인 PAM 서열(CCC, CCT, CCA 및 CCG)이 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 확인되었다.
CRISPR/Cas 시스템(그의 내인성 CRISPR/Cas 시스템 또는 이종 플라스미드-유래 시스템)을 갖는 박테리아를 CRISPR 스페이서 및 인접 시험-PAM 요소를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 특정 박테리아 종에서 작용하는 PAM 요소의 능력을 시험할 수 있다. PAM 요소가 박테리아에서 작용성이면, PAM 요소-함유 플라스미드가 CRISPR/Cas 시스템에 의해 파괴될 것이며, 형질전환 효율은 유의미하게 감소될 것이다. 개념은 본원에 실시예 2에 예시되어 있다.
CRISPR 프로토스페이서는 crRNA에 의해 표적화되는 박테리아 게놈 내의 서열이다(단, 양립가능한 PAM 요소도 또한 적절하게 위치한다).
IMR은 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함한다.
바람직하게는, IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서는 재조합 벡터 내의 치환 요소에 상응하는 DNA의 영역에 포함된다. 이러한 구현예에서, IMR이 단계 (b)에서 치환 요소에 의해 대체되는 경우, CRISPR PAM/프로토스페이서는 박테리아 게놈으로부터 작용상 제거된다. 일부 구현예(예를 들어, 돌연변이가 결실임)에서, 치환 요소에 상응하는 IMR 내의 DNA의 영역은 치환 요소와 서열 동일성 정도가 거의 없거나, 없을 수 있다. 그러한 경우에, 재조합 벡터 내의 치환 요소에 상응하는 DNA의 영역은 상동성 암에 상응하는 영역의 내부 말단에 의해 한정되는 IMR 내의 DNA의 영역일 것이다.
다른 구현예에서, IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서는 재조합 벡터 내의 5'-상동성 암의 부분 및 치환 요소의 부분에 상응하는 DNA의 영역에 포함되거나, IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서는 재조합 벡터 내의 5'-상동성 암에 상응하는 DNA의 영역에 포함된다. 이들 경우에, IMR 내의 PAM/프로토스페이서에 대하여 5'에서 발생하는 교차 사건(상동성 암과 박테리아 게놈 내의 상응하는 서열 사이에서)은 박테리아 게놈으로부터의 PAM/프로토스페이서의 소실을 초래할 것이다. PAM/프로토스페이서에서 발생하는 교차 사건은 PAM/프로토스페이서가 비작용성이 되게 할 수 있으며, 다시 말하면, crRNA에 의해 표적화될 수 없게 할 수 있다. 이런 이유로, 그러한 교차로부터 초래된 박테리아는 crRNA에 의해 표적화되지 않을 것이다.
다른 구현예에서, IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서는 재조합 벡터 내의 3'-상동성 암의 부분 및 치환 요소의 부분에 상응하는 DNA의 영역에 포함되거나, IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서는 재조합 벡터 내의 3'-상동성 암에 상응하는 DNA의 영역에 포함된다. 이들 경우에, IMR 내의 PAM/프로토스페이서에 대하여 3'에서 발생하는 교차 사건(상동성 암과 박테리아 게놈 내의 상응하는 서열 사이에서)은 박테리아 게놈으로부터의 PAM/프로토스페이서의 소실을 초래할 것이다. PAM/프로토스페이서에서 발생하는 교차 사건은 PAM/프로토스페이서가 비작용성이 되게 할 수 있으며, 다시 말하면, crRNA에 의해 표적화될 수 없게 할 수 있다. 이런 이유로, 그러한 교차로부터 초래된 박테리아는 crRNA에 의해 표적화되지 않을 것이다.
당업자는 상동성 암과, 박테리아 게놈 내의 상응하는 서열 사이의 교차 사건이 무작위 사건이며, PAM/프로토스페이서가 상류 상동성 암에 상응하는 IMR 내의 DNA 영역 내에 존재한다면, 예를 들어, 치환 요소로의 IMR의 대체를 초래하는 교차 사건이 PAM/프로토스페이서에 대해 3'에서 발생할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 경우, crRNA는 여전히 PAM/프로토스페이서를 표적화하여, 박테리아의 사멸을 초래할 것이다. 그러나 모집단 내의 다른 박테리아에서, 치환 요소로의 IMR의 대체를 초래하는 교차 사건은 PAM/프로토스페이서에 대해 5'에서 발생할 수 있다. 이러한 경우, PAM/프로토스페이서가 박테리아 게놈으로부터 제거될 것이며, 이런 이유로, 박테리아는 crRNA에 의해 표적화되지 않을 것이다. 따라서, 상동성 암에 상응하는 DNA 영역에 포함되는 PAM/프로토스페이서를 갖는 본 발명의 구현예가 여전히 치환 요소를 포함하고, PAM/프로토스페이서를 포함하지 않거나, crRNA에 의해 인식될 수 있는 PAM/프로토스페이서를 포함하지 않는 박테리아를 초래할 수 있음을 알 수 있다.
PAM/프로토스페이서가 재조합 벡터 내의 치환 요소에 상응하는 DNA 영역에 존재하거나, 치환 요소에 의한 IMR의 대체가 박테리아 게놈으로부터의 PAM/프로토스페이서의 제거를 초래할 기회가 최대화되도록 가능한 한 그에 가까이 존재하는 것이 바람직하다.
따라서, 바람직하게는, IMR 내의 PAM/프로토스페이서는 다음에 상응하는 DNA 영역 내에 존재한다:
(i) 치환 요소;
(ii) 상류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부;
(iii) 하류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부;
(iv) 재조합 요소 내의 상류 상동성 암; 또는
(v) 재조합 요소 내의 하류 상동성 암.
더욱 바람직하게는, IMR 내의 PAM/프로토스페이서는 다음에 상응하는 DNA 영역 내에 존재한다:
(i) 치환 요소;
(ii) 상류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부; 또는
(iii) 하류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부.
가장 바람직하게는, IMR 내의 PAM/프로토스페이서는 치환 요소에 상응하는 DNA 영역 내에 존재한다.
본 발명의 방법의 단계 (a)의 목적은 박테리아 모집단을 재조합 벡터로 형질전환시키는 것이다. 이것은 표준 재조합 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있으며, 적절한 선택 마커, 예를 들어, 항생제를 사용하여 선택될 수 있다.
재조합 벡터는 재조합 요소를 포함하며, 재조합 요소는 치환 요소 및 상동성 암을 포함한다.
치환 요소는 요망되는 돌연변이를 포함한다.
돌연변이는 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입의 조합일 수 있다.
치환 요소는 그것이 대체할 IMR의 서열을 기반으로 하거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 치환 요소는 IMR과 실질적으로 동일한 DNA 서열을 가질 수 있지만, 치환 요소는 IMR의 DNA 서열에 비하여 SNP, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, IMR을 결실시키거나, 그것을 상이한 DNA로 대체하는 것이 요망되는 다른 경우에, 치환 요소는 IMR과 임의의 유의미한 정도의 서열 동일성을 갖지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 IMR의 서열에 비하여 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이거나, 이를 포함한다. 그러한 구현예에서, 돌연변이는 바람직하게는 PAM/프로토스페이서에 존재하여, PAM/프로토스페이서가 더 이상 작용성이 되지 않게 한다(즉, 더 이상 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않음). 그렇지 않으면, 돌연변이는 치환 요소의 서열의 다른 부분에 존재할 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이는 IMR의 서열에 비하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 결실(들)은 프레임-내이거나 프레임-내가 아닐 수 있다. 바람직하게는, 결실은 PAM 또는 PAM/프로토스페이서의 적어도 부분을 포함하여, PAM/프로토스페이서가 더 이상 작용성이 되지 않게 한다(즉, 더 이상 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않음).
또 다른 구현예에서, 돌연변이는 IMR의 서열에 비하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입은 PAM/프로토스페이서 내에 존재하여, PAM/프로토스페이서가 더 이상 작용성이 되지 않게 한다(즉, 더 이상 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않음). 삽입은 프레임-내 삽입이거나 프레임-외 삽입일 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이는 PAM/프로토스페이서의 전부 또는 부분을 대체하는 삽입이다. 바람직하게는, PAM 또는 PAM/프로토스페이서는 결실되거나 돌연변이되어, 그것이 더 이상 작용성이지 않게 한다(즉, 더 이상 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되지 않음).
요망되는 돌연변이(예를 들어, SNP, 삽입 또는 결실)가 PAM/프로토스페이서에 영향을 미치지 않는 사건에서, PAM/프로토스페이서 내에 추가의 돌연변이가 이루어져서, 그것이 관심 박테리아 종에서 비작용성이 되게 해야 한다. 예를 들어, (PAM/프로토스페이서 서열이 코딩 서열이라면) 침묵 돌연변이가 PAM/프로토스페이서 요소에서 이루어질 수 있다.
요망되는 돌연변이가 실제 PAM/프로토스페이서에 존재하지 않는 구현예에서, PAM 요소와 돌연변이 위치 사이의 거리를 최소로 유지하는 것이 바람직하다. PAM 요소와 돌연변이 위치가 더 멀어질수록, 그들 사이의 공간에서 재조합 사건이 발생할 기회가 더 많아진다. 이것은 돌연변이된 PAM 요소를 지니지만, 요망되는 돌연변이에 대해서는 야생형인 박테리아를 초래할 수 있다. 돌연변이된 PAM은 요망되는 돌연변이로부터 최대 1500 bp일 수 있다. PAM 위치와 요망되는 돌연변이 사이의 거리는 바람직하게는 100 bp 이하이다. 더욱 바람직하게는, PAM 요소와 요망되는 돌연변이 위치 사이의 거리는 50개 뉴클레오티드 미만, 더더욱 바람직하게는 25개 뉴클레오티드 미만, 가장 바람직하게는 10개 뉴클레오티드 미만이다.
치환 요소의 길이는 1 내지 100,000개 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 50,000개 또는 1 내지 10,000개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 1 내지 5000개, 1 내지 2500개, 1 내지 1000개, 1 내지 500개, 1 내지 50개 또는 1 내지 10개 뉴클레오티드일 수 있다.
치환 요소의 최소 크기는 요망되는 돌연변이에 의해 한정된다. 이런 이유로, 돌연변이가 SNP이거나, 이를 포함하는 경우에, 치환 요소는 단일의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 돌연변이가 PAM 요소를 포함하는 결실인 경우에, 치환 요소는 0개 뉴클레오티드일 수 있다. 삽입에 있어서, 치환 요소는 삽입되어야 하는 DNA의 길이이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 치환 요소는 게놈 내로 치환 요소가 삽입되는 숙주 박테리아 세포에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택가능한 마커를 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 치환 요소는 게놈 내로 치환 요소가 삽입되는 숙주 박테리아 세포에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택가능한 마커 대립형질을 생성하도록 박테리아의 게놈 내의 선택가능한 마커의 제2 요소와 병치될 수 있는 선택가능한 마커의 제1 요소를 포함하지 않는다.
또한, 재조합 요소는 다음을 포함한다:
(ii) 치환 요소의 측부 배치된 상동성 암으로서, 상동성 암이 치환 요소를 포함하는 요소로의 박테리아 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분의 대체를 촉진시킬 수 있는 상동성 암.
상동성 암은 재조합 요소와 박테리아 게놈 사이에 상동성 재조합(이중 교차)을 촉진시키며, 이는 치환 요소를 포함하는 요소로의 IMR의 대체를 초래한다.
바람직하게는, 2개의 상동성 암이 존재하며, 그 중 하나는 치환 요소에 대하여 5'이며, 그 중 하나는 치환 요소에 대하여 3'이다.
상류(5') 상동성 암은 서열이 IMR의 5' 말단에 놓인 DNA의 스트레치(stretch)와 동일성을 갖는 DNA의 스트레치를 포함한다.
하류(3') 상동성 암은 서열이 IMR의 3' 말단에 놓인 DNA의 스트레치와 동일성을 갖는 DNA의 스트레치를 포함한다.
바람직하게는, 5' 상동성 암과 박테리아 게놈 내의 상응하는 서열 사이의 서열 동일성 정도는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 또는 99%이거나, 그것은 100%이다. 바람직하게는 3' 상동성 암과 박테리아 게놈 내의 상응하는 서열 사이의 서열 동일성 정도는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 또는 99%이거나, 그것은 100%이다.
상동성 암은 각각 독립적으로, 50 내지 1500개 또는 200 내지 1000개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 500 내지 1000개, 더욱 바람직하게는 독립적으로 700 내지 900개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상동성 암은 각각 독립적으로 약 800개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 사용되는 용어 "치환 요소를 포함하는 요소"는 일반적으로 상류 상동성 암의 부분, 치환 요소 및 하류 상동성 암의 부분을 포함하는 요소를 지칭한다. 일단 이중 교차가 수행되면, 그러한 요소는 IMR의 부분 또는 전부를 대체할 것이다.
박테리아 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분은 치환 요소를 포함하는 요소로 대체될 것이다. 대체되는 IMR의 정확한 양은 재조합 벡터 내의 상동성 암과, IMR 내의 상응하는 영역 사이의 교차 사건의 위치에 따라 달라질 것이다.
재조합 벡터는 바람직하게는 환형 벡터이다.
재조합 벡터는 바람직하게는 원점 요소, 가장 바람직하게는 그람 양성 원점 요소(예를 들어, "pBP1")를 갖는다. 일부 바람직한 구현예에서, 재조합 벡터 원점 요소는 사멸 벡터 원점 요소와 양립가능하다.
또한, 재조합 벡터는 적절한 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 벡터 및 사멸 벡터는 상이한 선택 마커를 갖는다.
재조합 요소는 IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하지 않는다. 이것은 crRNA에 의해 인식될 수 있는 신규한 CRISPR PAM/프로토스페이서가 이중 교차 사건 후에 박테리아 게놈 내로 삽입되지 않게 보장하기 위한 것이다.
단계 (b)는 박테리아의 모집단을 모집단 내의 하나 이상의 박테리아에서, 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분이 치환 요소를 포함하는 요소에 의해 대체되어, 그에 의해, CRISPR PAM/프로토스페이서가 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR로부터 제거되거나, IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 하는 조건하에 배양하는 것을 포함한다.
많은 박테리아 종에서, 이러한 대체 단계는 매우 효율적이지 않다. 이런 이유로, 일반적으로 이러한 단계가 모집단 내의 모든 박테리아에서 성공적일 것으로 예상되지 않는다.
이러한 단계에서, 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아를 배양하여, 이중 교차 사건을 조장하고, 여기서, 치환 요소를 포함하는 요소는 박테리아 게놈 내로 통합되고 IMR은 벡터 상에 루프를 형성한다.
본 발명의 방법에서, 재조합 기술이 이용되지 않는다. 특히, 치환 요소는 선형 DNA에 배치되지 않는다.
이중 교차 사건이 요망되며, 여기서, CRISPR PAM/프로토스페이서는 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR로부터 제거되거나, IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 된다.
바람직하게는, 하나 이상의 형질전환된 박테리아를 단리하고, 선택 배지(예를 들어, 항생제 존재)에서 추가로 계대 배양하여, 재조합 벡터를 유지시켜(1회 이상, 예를 들어, 1 내지 5회), 하나 이상의 추가의 박테리아의 모집단을 생성하며, 그 중 일부는 요망되는 이중 교차 사건을 겪을 것이다.
박테리아를 배양하기에 적합한 조건은 당업계에 널리 알려져 있을 것이다. 그러한 조건은 예를 들어, 문헌["Clostridia: Biotechnology and Medical Applications", Eds H. Bahl and P. Durre, ISBN 3-527-30175-5, especially section 3.4 "Growth conditions and nutritional requirements"]에 기재되어 있다. 상세사항은 또한, 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume appropriate to the chosen phylum of bacteria], 예를 들어, 문헌[Volume Three for the Firmicutes, ISBN 978-0-387-95041-9]에도 제공되어 있다.
본 발명의 방법의 단계 (c)에서, 박테리아의 모집단을 CRISPR PAM/프로토스페이서가 제거되지 않거나, crRNA에 의해 인식될 수 없게 되지 않은 모집단 내의 임의의 박테리아의 IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서를 표적화하는 crRNA의 생성을 지시할 수 있는 사멸 벡터로 형질전환시켜, 그에 의해, crRNA에 의해 인식되는 그들 CRISPR PAM/프로토스페이서의 CAS 엔도뉴클레아제-유도 절단 및 이후의 그들 박테리아의 사멸을 촉진시킨다.
본 발명의 제3 단계의 목적은 게놈이 작용성 PAM/프로토스페이서를 여전히 포함하는 박테리아의 모집단 내의 박테리아 세포를 가려내는 것이다. crRNA는 오직 단일의 교차 사건이 발생하는 임의의 박테리아 세포를 표적화할 것이며; 그것은 또한, 교차 사건을 갖지 않거나, 이중 교차를 통해 야생형으로 복귀된 임의의 세포를 표적화할 것이다. 이들이 모두 야생형(즉, 작용성) PAM/프로토스페이서를 가질 것이기 때문에, 이들 박테리아는 사멸될 것이다.
결과적으로, 본질적으로 이러한 단계 후에 살아있을 박테리아 세포만이 요망되는 돌연변이를 포함하는 치환 요소를 갖는 박테리아 세포일 것이다.
사멸 벡터로 형질전환된 박테리아를 이번에는 바람직하게는 오직 사멸 벡터에 대해서만(재조합 벡터에 대해서는 아님) 특이적인 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성)의 존재하에 배양한다.
용어 "crRNA"는 CRISPR RNA를 의미한다. crRNA는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 절단되어야 하는 표적 스페이서 서열의 측부 배치된 짧은 직접 반복 서열로 이루어진 짧은 단일-가닥 RNA 분자이다.
바람직한 구현예에서, 사멸 벡터는 다음을 포함한다:
(i) Cas 리더 요소
(ii) 제1 Cas 직접 반복 요소
(iii) Cas 스페이서 요소, 및
(iv) 제2 Cas 직접 반복 요소.
"Cas 리더 요소"는 일반적으로 직접 반복 클러스터 내의 제1 반복부의 상류에서 관찰되는 DNA 요소이다. 그것은 crRNA의 생성을 촉진시키는데 도움을 주며, 다시 말하면, 그것은 RNA 프로모터로서 작용한다. 현재까지, 수많은 Cas 리더 서열이 확인되었으며, 그들의 서열은 용이하게 임의의 특정 Cas 시스템에서 확립될 수 있다. 바람직하게는, Cas 리더 서열은 형질전환되는 박테리아 모집단 내에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템에 상응하는 것이다.
Cas 직접 반복 서열은 박테리아의 모집단에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식되는 DNA 요소이다. 이들 직접 반복부는 일반적으로 25 내지 35개 뉴클레오티드 길이, 더욱 일반적으로 약 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다.
직접 반복부는 동일한 서열의 것일 필요가 없다(일반적으로, 1 내지 2개의 뉴클레오티드의 차이가 Cas 단백질에 의해 용인됨). 직접 반복부는 일반적으로 헤어핀 루프를 형성할 수 있는 팔린드롬 영역을 갖는다.
임의의 하나의 CRISPR/Cas 시스템에 적합한 직접 반복부의 DNA 서열은 상기 시스템의 CRISPR/Cas 직접 반복부-스페이서 클러스터의 임의의 검사로부터 용이하게 관찰될 수 있다.
Cas 스페이서 요소는 관심 박테리아 모집단에 존재하는 CRISPR/Cas 시스템의 선호에 따라, PAM/프로토스페이서 내의 PAM 요소에 대하여 (바람직하게는 인접) 5'에서, 또는 PAM/프로토스페이서 내의 PAM 요소에 대하여 (바람직하게는 인접) 3'에서 관찰되는 20 내지 50개 뉴클레오티드(바람직하게는 30 내지 40개, 더욱 바람직하게는 36 내지 38개 뉴클레오티드)에 대하여 높은 수준의 서열 동일성을 갖는 20 내지 50개 뉴클레오티드(바람직하게는 30 내지 40개, 더욱 바람직하게는 36 내지 38개 뉴클레오티드)의 서열을 포함한다.
바람직하게는, (박테리아 게놈 내의) IMR 내의 PAM 요소는 (박테리아 게놈 내의) 프로토스페이서 서열의 시작에 바로 인접한다.
(게놈 DNA 내의) 프로토스페이서와 (예를 들어, 사멸 벡터 내의) 스페이서 요소 서열 간의 서열 동일성 정도는 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 100%이다.
바람직하게는, 비-프로토스페이서 요소와의 상호작용이 낮은 가능성으로 존재하도록 Cas 스페이서 서열이 선택된다.
박테리아 게놈 내의 1개 초과의 프로토스페이서를 한번에 표적화하기 위하여 본 발명의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 경우, 사멸 벡터는 1개 초과의 Cas 스페이서 요소를 포함하며, 각 Cas 스페이서 요소는 직접 반복부가 측부 배치된다.
박테리아 게놈 내의 프로토스페이서 요소와 달리, 스페이서 요소는 회합된 PAM 요소를 갖지 않아야 한다.
사멸 벡터는 재조합 벡터의 원점과 양립가능한 원점(바람직하게는 그람 양성 원점, 예를 들어, pCB102)을 갖는다.
바람직하게는 재조합 벡터 및 사멸 벡터에 대한 원점은 상이하다.
재조합 벡터 및 사멸 벡터는 항생제-내성 요소 또는 다른 선택 마커를 포함하여, 이에 따라, 벡터가 독립적으로 예를 들어, 특정 항생제, 예를 들어, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 등의 존재하에서 선택되게 할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 벡터 및 사멸 벡터는 상이한 항생제에서의 그들의 독립적인 선택을 가능하게 하는 항생제-내성 요소를 포함한다.
일단, 사멸 벡터가 박테리아 모집단 내로 형질전환되면, Cas 리더 서열은 직접 반복부 및 Cas 스페이서 요소를 포함할 crRNA의 전사를 촉진시킬 것이다. 이어서, crRNA는 치환 요소를 포함하는 요소로의 IMR의 대체에 의해 제거되지 않은 박테리아 게놈 내의 임의의 PAM/프로토스페이서를 표적화할 것이다. 그 다음, 그러한 PAM/프로토스페이서는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 절단되어, 그들의 게놈 내에 그러한 PAM/프로토스페이서를 여전히 갖는 그들 박테리아의 사멸을 초래할 것이다.
아미노산 서열 동일성 백분율 및 뉴클레오티드 서열 동일성은 BLAST 정렬 방법(문헌[Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 사용하여 수득될 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다.
단백질 데이터베이스에서 유사한 서열을 찾기 위하여 표준 단백질-단백질 BLAST(blastp)가 사용될 수 있다. blastp는 다른 BLAST 프로그램과 같이, 국소 유사성 영역을 찾기 위해 설계된다. 서열 유사성이 전체 서열에 걸쳐 있는 경우, blastp는 또한 전체 정렬을 보고할 것이며, 이는 단백질 확인 목적을 위한 바람직한 결과이다. 바람직하게, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. 일부 예에서, "저 복잡성 필터"가 중단될 수 있다.
또한, BLAST 단백질 검색은 BLASTX 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위하여 갭이 있는 정렬을 수득하기 위하여, Gapped BLAST(BLAST 2.0에서)는 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST(BLAST 2.0에서)를 사용하여, 분자 간의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다(상기 문헌[Altschul et al. (1997)] 참조). BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST를 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열 비교에 관하여, MEGABLAST, 불연속-megablast 및 blastn을 사용하여, 이러한 목적을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 파라미터가 사용된다. MEGABLAST는 구체적으로 매우 유사한 서열 간에 긴 정렬을 효율적으로 찾기 위하여 설계된다. 불연속 MEGABLAST를 사용하여, 본 발명의 핵산과 유사하지만 동일하지 않은 뉴클레오티드 서열을 찾을 수 있다.
BLAST 뉴클레오티드 알고리즘은 질의를 워드로 지칭되는 짧은 부분수열로 나눔으로써 유사한 서열을 찾는다. 프로그램은 먼저 질의 워드에 대한 정확한 일치(워드 히트(hit))를 확인한다. 그 다음, BLAST 프로그램은 다수의 단계로 이들 워드 히트를 연장시켜, 갭이 있는 최종 정렬을 생성한다. 일부 구현예에서, BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 점수=100, 워드 길이=12를 사용하여 수행될 수 있다.
BLAST 검색의 감수성을 지배하는 중요한 파라미터 중 하나는 워드 크기이다. blastn이 MEGABLAST보다 더 민감한 가장 중요한 이유는 그것이 더 짧은 디폴트 워드 크기를 사용한다는 점이다(11). 이 때문에, blastn은 다른 유기체 유래의 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬을 찾는데 있어서 MEGABLAST보다 더 낫다. 워드 크기는 blastn에서 조정가능하며, 디폴트 값으로부터 최소 7까지 감소시켜, 검색 민감성을 증가시킬 수 있다.
더욱 민감한 검색은 신규하게 도입된 불연속 megablast 페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 페이지는 문헌[Ma et al. (Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5)]에 의해 보고된 것과 유사한 알고리즘을 사용한다. 불연속 megablast는 정렬 연장을 위한 씨드로서 정확한 워드 일치를 필요로 하는 것보다는, 더 긴 주형의 창 내의 불연속 워드를 사용한다. 코딩 방식에서, 제1 및 제2 코돈 위치에서 일치를 찾는데 집중하면서, 제3 위치에서 불일치를 무시함으로써 제3 염기 워블링(wobbling)을 고려한다. 동일한 워드 크기를 사용하는 불연속 MEGABLAST에서의 검색은 동일한 워드 크기를 사용하는 표준 blastn보다 더욱 민감하고 효율적이다. 불연속 megablast에 독특한 파라미터는 워드 크기: 11 또는 12; 주형: 16, 18 또는 21; 주형 유형: 코딩(0), 비-코딩(1) 또는 둘 모두(2)이다.
본원에 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질전환하는"은 재조합 벡터 또는 사멸 벡터가 박테리아 세포 내로 삽입되는 임의의 단계를 지칭한다. 이런 이유로, 그것은 특히 전기천공법, 컨쥬게이션 또는 트랜스펙션 중 임의의 형태를 포함한다.
단계 (d)는 게놈이 요망되는 돌연변이를 포함하는 치환 요소를 포함하는 하나 이상의 박테리아를 선택하거나 단리하는 것을 포함한다.
요망되는 돌연변이(들)를 지니는 박테리아는 그것이 재조합 벡터 상에 루프를 형성할 것이라는 사실 때문에, WT(야생형) IMR을 용이하게 소실할 것이다. 그 다음, 그러한 변형된 재조합 벡터는 사멸 벡터가 현재 벡터 상에 있는 PAM/프로토스페이서를 인식할 것이기 때문에, 박테리아 모집단으로부터 용이하게 소실될 수 있다. 따라서, 이 지점으로부터 원래 재조합 벡터를 선택하기 위해 사용되는 선택 마커(예를 들어, 항생제)가 중단될 것이다.
사멸 벡터를 소실한 박테리아는 사멸 벡터 선택 마커(예를 들어, 항생제)를 함유하지 않는 배지를 사용하여 용이하게 단리될 수 있다. 또한, 대안적인 방법이 사용될 수 있다. 또한, 세포를 세포로부터의 플라스미드 소실률을 증가시킬 수 있는 특정 응력, 예를 들어, 열 충격 또는 전기천공법으로 처리할 수 있다.
선택되거나 단리되는 박테리아는 생 박테리아일 것이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 박테리아를 돌연변이시키는 단계를 포함하는 돌연변이된 박테리아의 제조 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 게놈이 본 발명의 방법에 의해 돌연변이되는 박테리아를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에서, 재조합 벡터, 내인성 박테리아 DNA 및 사멸 벡터의 요소 간의 관계를 예시한 것이다.
도 2는 다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 정렬을 보여준다.
도 3은 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)로의 플라스미드의 형질전환 효율에 대한 PAM 서열의 영향을 보여준다.
도 4는 SNP 대체 예에 대한 돌연변이 및 야생형 DNA 서열의 고해상도 용융 곡선 분석을 보여준다.
도 5는 기재된 기술을 사용하여 생성되었던 SNP를 지니는 2개의 콜로니로부터의 생거(Sanger) 서열분석 데이터를 보여준다.
도 6은 표적화된 결실 예에 대한 돌연변이 및 야생형 DNA 서열의 고해상도 용융 곡선 분석을 보여준다.
도 7은 표적화된 결실 예에 대한 생거 서열분석 결과를 보여준다.
실시예
실시예 1: 다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 정렬
목적: 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 일부 직접 반복 서열을 확인하기 위함.
방법:
직접 반복 및 스페이서 서열은 CRISPRFinder 프로그램(Grissa, I., Vergnaud, G., & Pourcel, C. (2007))을 사용하여 관찰되었다. CRISPRFinder: 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부를 확인하기 위한 웹 도구(Nucleic Acids Res., 35, W52-7).
결과:
다수의 클로스트리디아 종 유래의 직접 반복 서열의 선택은 도 2에 나타나 있다. 일부 경우에, 특정 균주는 1개 초과의 서열을 가지며, 그래서, 가장 빈번하게 사용되는 직접 반복 서열(들)이 여기 포함된다. 약어는 하기와 같다: C_saccharoper = 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 또는 N1-504), C_saccharob = 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(NCP258 또는 NCP262, _1 및 _2는 2개의 주요 DR 클러스터를 나타냄), C_tyro = 클로스트리듐 티로부티리쿰(ATCC 52755, _1 및 _2는 2개의 주요 DR 클러스터를 나타냄), C_pasteurianum = 클로스트리듐 파스퇴리아눔(DSM 525), C_autoethanogenum = 클로스트리듐 오토에타노게눔(DSM10061), C_sp_DLVIII = 클로스트리듐 종(DL-VIII).
실시예 2: 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4( HMT )에서의 PAM 서열의 확인
목적: 추정의 PAM 서열의 유효성을 시험하는 방법을 입증하기 위함.
방법:
클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)의 주요 직접 반복부 클러스터로부터의 스페이서_53의 서열을 클로스트리디아 셔틀 벡터, pMTL83251로 클로닝하였다. 이러한 스페이서 요소의 5' 말단에 바로 인접하여, 예측된 PAM 서열 CCC, CCG, CCT 및 비-PAM 서열 GAC를 포함하는 다양한 상이한 트리뉴클레오티드 조합을 혼입하였다. 작용성 PAM 서열과 정확하게 조합되는 경우, 스페이서 요소는 프로토스페이서로 작용한다.
플라스미드를 표준 전기천공법 프로토콜을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)로 형질전환시킨 다음, 5% 글루코스도 함유하는 클로스트리디아 성장 배지(CGM)에서의 하룻밤 회복 단계로 이어졌다. 그 다음, 혼합물을 5% 글루코스 및 40 ㎍/㎖ 에리트로마이신을 함유하는 CGM 아가 플레이트 상으로 스프레딩하고, 32℃에서 무산소 캐비넷에 적어도 48시간 동안 두었다. 그 다음, 콜로니를 계수하여, 빈 벡터의 형질전환에 비한 형질전환 효율의 변화를 결정하였다.
750 ㎖ dH2O에 하기의 양을 용해시킴으로써 CGM 배지를 제조하고: 5.0 g 효모 추출물, 0.75 g K2HPO4, 0.75 g KH2PO4, 0.40 g MgSO4.7H2O, 0.01 g FeSO4.7H2O, 0.01 g MnSO4.4H2O, 1.0 g NaCl, 2.0 g (NH4)2SO4, 2.0 g 아스파라긴(그리고, 고체 배지를 제조한다면, 15 g의 박테리아 아가 번호 1), 오토클레이브시켰다. 배지의 pH(보통 6.6의 영역)를 조정하지 않았다. 글루코스 용액(20%(w/v) 용액을 제공하기 위하여 250 ㎖ dH2O 중 용해된 50 g 글루코스)을 제조하고, 따로 오토클레이브시켰다. 일단 냉각되면, 글루코스 및 CGM 용액을 필요에 따라 조합하였다.
결과:
상이한 플라스미드의 형질전환의 상대적 효율은 도 3에 제시되어 있다. 빈 플라스미드 pMTL83251 및 PAM 서열 없이 스페이서_53을 지니는 플라스미드 둘 모두는 콜로니의 론(lawn)을 제공하였다. 5' CCC(PAMC), CCT(PAMT) 또는 CCA(PAMA)에 인접한 스페이서_53을 지니는 플라스미드는 유의미하게 더 적은 콜로니를 제공하였다.
실시예 3: 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4( HMT )에서의 SNP 대체의 제조
목적: 특정 점 돌연변이가 개시된 기술을 사용하여 이루어질 수 있는 방법을 보여주기 위함.
방법:
클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)의 게놈 DNA에서의 돌연변이를 위해 IMR 서열을 선택하였다. 상기 서열로부터, PAM(이러한 예에서 CCA)에 인접한 후보 프로토스페이서 요소를 확인하였다. 이러한 PAM/프로토스페이서 요소의 서열은 표 1에 제공되어 있다. 상동성 암의 쌍이 측부 배치된 치환 요소를 포함하는 재조합 벡터를 설계하였으며, 각 암은 대략 800 bp 길이이다. 치환 요소(표 1)는 PAM/프로토스페이서 요소의 원래의 게놈 서열에 비하여 3개의 SNP를 지닌다. 3개의 SNP 중 하나를 혼입시켜, PAM 서열을 CTA로 돌연변이시키고; 다른 2개는 제한 부위를 제거하도록 설계하였다(대문자 및 밑줄).
재조합 벡터는 클로스트리디아 셔틀 벡터 pMTL82154에 기초하였다. 그것을 표준 전기천공법 프로토콜을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내로 형질전환시켰다. 클로람페니콜(50 ㎍/㎖)에 대한 내성에 기초하여, 성공적인 형질전환체를 선택하였다. 단일의 콜로니를 선택하고, 클로람페니콜을 함유하는 액체 강화 클로스트리디아 배지(RCM)로 옮겼다. 그들을 4회 이상 계대배양하여, 이중 교차 사건을 촉진시키고, 야생형 서열 밖으로 루프를 형성시켰다.
RCM 반고체 배지를 하기와 같이 제조하고: 3 g.ℓ-1 효모 추출물, 10 g.ℓ-1 Lab-Lemco 분말, 10 g.ℓ-1 펩톤, 5 g.ℓ-1 글루코스, 1 g.ℓ-1 용해성 전분, 5 g.ℓ-1 염화나트륨, 3 g.ℓ-1 아세트산나트륨, 0.5 g.ℓ-1 시스테인 하이드로클로라이드, 0.5 g.ℓ-1 아가, pH를 6.8 ± 0.2로 조정한 다음, 121℃에서 오토클레이브시킴으로써 멸균시켰다.
그 다음, 이들 배양물을 리더 서열 및 상기 확인된 후보 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 요소를 포함하는 사멸 벡터로 형질전환시켰으며, 스페이서 요소는 pMTL83251 플라스미드 백본 상에 직접 반복 서열이 측부 배치되어 있다. 5% 글루코스 + 40 ㎍/㎖ 에리트로마이신을 함유하는 CGM-아가 상에 플레이팅시키기 전에, 5% 글루코스가 있는 CGM에서 세포가 하룻밤 회복되게 하였다.
사멸 벡터 상에 존재하는 스페이서 요소(표 1)는 게놈 내의 상응하는 서열이 효율적으로 작용성 프로토스페이서 요소로 되게 한다. 사멸 벡터가 지니는 이러한 스페이서는 오직 야생형 서열만을 표적화하며, 박테리아 자체의 Cas 시스템은 그의 자체의 게놈 DNA를 침입 DNA로서 여기며, 그것을 절단하여 세포사를 초래한다. 따라서, 사멸 벡터로의 형질전환 후에 회수되는 세포만이 치환 요소가 그들의 게놈 DNA 내로 재조합되어야 한다.
Figure pct00001
고해상도 용융 곡선 분석(HRM)
상기 방법에 의해 선택되는 콜로니를 고해상도 용융 곡선 분석을 사용하여 스크리닝하여, 야생형 서열에 비하여 SNP의 존재를 확인하였다. SNP의 의도된 위치를 함유하는 1.1 kb 영역을 박테리아 염색체로부터 생성물을 증폭시키기만 할 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 그 다음, 프리시젼 멜트 슈퍼믹스(Precision Melt supermix)(BioRad)를 사용하여 이러한 생성물에서 제2 PCR을 수행하여, 의도된 SNP 영역을 포괄하는 더 짧은 단편(85 bp)을 증폭시켰다. PCR 후에, 용융 곡선을 0.2℃ 증분으로 70℃에서 80℃까지 수행하여, 시험되는 콜로니 각각에 대하여 용융 곡선을 제공하였다.
또한, 게놈 DNA 특이적 PCR로부터의 1.1 kb PCR 생성물을 제한 효소 분해(SNP 중 2개가 AvrII 위치에서 파괴되기 때문에)에 이어서 DNA 시퀀싱에 의해 표적 돌연변이에 대하여 스크리닝하였다.
결과:
사멸 벡터로의 형질전환 후에 A 및 B로 명명한 2개의 유력한 콜로니가 수득되었다. 따라서, 이러한 방법은 요구되는 돌연변이를 확인하기 위해 스크리닝될 필요가 있는 콜로니의 수를 유의미하게 감소시킨다.
콜로니 A 및 B를 HRM에 의해 분석하고, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 및 대조군 균주(혼입되는 3개의 돌연변이 중 하나를 지님) 둘 모두와 비교하였다. 야생형 또는 대조군에 비한, 콜로니 A 및 B에 대한 용융 곡선의 차이에 의해, SNP 서열에 걸쳐 있는 게놈의 영역이 야생형 균주에 비하여 변경되는 것으로 나타났다.
생거 서열분석
상기 HRM 분석을 위해 생성된 게놈 특이적 PCR로부터의 1.1 kb PCR 생성물에 대한 서열분석 결과는 도 5에 나타나 있다. "야생형"의 정렬 = 야생형 배양물로부터 수득된 서열, "예측되는 돌연변이" = 예측된 돌연변이의 인 실리코 예측, "대조군 서열" = 오직 PAM 돌연변이만을 지니는 돌연변이 균주로부터 수득되는 서열, "Col A" 및 "Col B" = 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) Cas 시스템을 사용하여 기재된 바와 같이 제조된 균주를 Seqman Pro(DNAStar, Lasergene)를 사용하여 생성하였다.
그것은 HRM 곡선의 변화가 도입된 3개의 SNP로 인한 것이었음을 확인시켜준다.
이러한 전체 영역에 걸친 이후의 서열분석은 도입되는 추가의 돌연변이를 보이지 않았다(데이터 미도시).
실시예 4: 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4( HMT )에서의 정밀한 결실의 제조
목적: 본 발명의 방법을 사용하여 게놈 내에 정밀한 결실을 만들 수 있는 방법을 보여주기 위함.
방법:
12개의 아미노산이 선택된 유전자의 출발로부터 제거되고 신규한 출발 코돈이 부가된 N-말단 결실 돌연변이체를 설계하여, "ΔNt"로 지칭되는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내의 서열의 프레임-내 절두를 초래하였다. 또한, 2개의 추가의 SNP를 혼입시켜, AvrII 제한 위치를 제거하였다. 이러한 야생형 영역 내에서, PAM(이러한 예에서 CCA)에 인접한 후보 프로토스페이서 요소를 확인하였다. PAM/프로토스페이서 요소가 있는 이러한 영역 및 강조표시된 결실을 위한 영역의 서열은 표 2에 제공되어 있다. 상동성 암의 쌍이 측부 배치된 치환 요소를 포함하는 재조합 벡터를 설계하였으며, 각 암은 대략 800 bp 길이이다. 치환 요소(표 2)는 원래의 게놈 서열에 비하여 36개 염기쌍 결실 및 신규한 출발 코돈을 지닌다.
재조합 벡터는 클로스트리디아 셔틀 벡터 pMTL82154에 기초하였다. 그것을 표준 전기천공법 프로토콜을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내로 형질전환시키고, 클로람페니콜(50 ㎍/㎖)에 대한 내성에 기초하여 선택하였다. 단일의 콜로니를 선택하고, 클로람페니콜을 함유하는 액체 강화 클로스트리디아 배지(RCM)로 옮겼다. 그들을 3회 이상 계대배양하여, 이중 교차 사건을 촉진시켜, 야생형 서열 밖으로 루프를 형성시켰다.
그 다음, 이들 배양물을 리더 서열 및 상기 확인된 후보 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 요소를 포함하는 사멸 벡터로 형질전환시켰으며, 스페이서 요소는 pMTL83251 플라스미드 백본 상에 직접 반복 서열이 측부 배치되어 있다. 5% 글루코스 + 40 ㎍/㎖ 에리트로마이신을 함유하는 CGM-아가 상에 플레이팅시키기 전에, 5% 글루코스가 있는 CGM에서 세포가 하룻밤 회복되게 하였다.
따라서, 사멸 벡터로의 형질전환 후에 회수되는 세포만이 치환 요소가 그들의 게놈 DNA 내로 재조합되어, 유전자의 N-말단에서 표적화된 12개 아미노산의 정밀한 결실을 초래해야 한다.
Figure pct00002
결과:
사멸 벡터로의 형질전환 후에 대략 30개의 유력한 콜로니를 스크리닝하고, 이들 중 21개가 야생형 대조군과 상이한 HRM 곡선을 보였다(도 6). 이들 21개의 콜로니 중 소수의 추가의 분석 및 생거 서열분석에 의해, 그들이 모두 의도된 N-말단 결실을 지니는 것이 나타났다(도 7).
실시예 5: 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4( HMT ) 게놈 내로의 신규한 DNA의 통합
목적: 신규한 DNA를 게놈 DNA 내로 통합시키기 위하여 본 발명의 방법을 이용하는 방법을 상세화하기 위함.
방법:
재조합 벡터를 pMTL82154 백본에 기초하여 설계하였다. 그것은 그의 코딩 서열의 부재에 대해 선택된 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 게놈 내의 영역으로부터 상류 및 하류 대략 800 bp를 지닌다. 티올라제 프로모터 서열에 기초한 프로모터를 2개의 상동성 암 사이에 클로닝하고, 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)에서의 발현을 위하여, 치환 요소로서 이러한 프로모터의 하류에 삽입을 위한 유전자를 클로닝할 것이다. 3' 상동성 암의 5' 말단에서, 사멸 벡터에 의해 야생형 세포에서 인식될 PAM/프로토스페이서 요소 서열(IMR 내)은 PAM 서열 내에 단일의 SNP를 지닌다. 이것은 사멸 벡터가 세포 내로 형질전환되는 경우, 통합된 DNA를 지니는 세포만이 생존할 것을 보장할 것이다.
사멸 벡터를 pMTL83251에 기초하여 작제하였다. 그것은 리더 서열, 및 통합 부위로서 선택된 유전자간 영역 내로부터 설계된 스페이서 요소의 측부 배치된 2개의 직접 반복부를 지닌다. 사멸 벡터를 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT)에서 시험하였으며, 야생형 세포를 사멸시키는 것으로 나타났다. (클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내로의 이러한 벡터의 형질전환은 회수되는 콜로니를 초래하지 않는다.)
통합 벡터를 전기천공법을 사용하여 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 N1-4(HMT) 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 클로람페니콜 내성에 기초하여 선택하였다. 이어서, 3회 이상 계대배양한 후에, 사멸 벡터를 도입하여, 모집단으로부터 임의의 야생형 세포를 제거하여, 그들의 게놈 내로 신규한 DNA가 통합된 세포만을 남길 것이다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID NO: 3 <223> 치환 요소가 있는 재조합 벡터의 부분 서열
SEQ ID NO: 5 <223> 치환 요소가 있는 재조합 벡터의 부분 서열
SEQ ID NO: 18 <223> 돌연변이된 PAM 위치가 있는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 서열
SEQ ID NO: 19 <223> 돌연변이된 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 서열
SEQ ID NO: 20 <223> 돌연변이된 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 서열
SEQ ID NO: 21 <223> 결실이 있는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 서열
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Claims (15)

  1. 박테리아 게놈 내의 의도된 돌연변이유발 영역(IMR)에서의 돌연변이의 생성 방법으로서, 상기 박테리아가 CRISPR/Cas 시스템을 포함하고, 상기 IMR이 상기 박테리아의 CRISPR/Cas 시스템에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하며, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (a) 상기 박테리아의 모집단을 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계로서, 상기 재조합 벡터가 재조합 요소를 포함하며, 상기 재조합 요소가
    (i) 돌연변이를 포함하는 치환 요소, 및
    (ii) 상기 치환 요소의 측부 배치된(flank) 상동성 암으로서, 상기 상동성 암이 상기 치환 요소를 포함하는 요소로 박테리아 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분의 대체를 촉진시킬 수 있는 상동성 암을 포함하고,
    상기 재조합 요소가 IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 있는 CRISPR PAM/프로토스페이서를 포함하지 않는 단계;
    (b) 상기 박테리아의 모집단을 상기 모집단 내의 하나 이상의 박테리아에서, 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR의 전부 또는 부분이 치환 요소를 포함하는 요소에 의해 대체되어, 그에 의해, CRISPR PAM/프로토스페이서가 그들 박테리아의 게놈 내의 IMR로부터 제거되거나, IMR 내의 CRISPR/PAM 프로토스페이서를 인식하는 crRNA에 의해 인식될 수 없게 되는 조건하에 배양하는 단계;
    (c) 상기 박테리아의 모집단을 CRISPR PAM/프로토스페이서가 제거되지 않거나, crRNA에 의해 인식될 수 없게 되지 않은 모집단 내의 임의의 박테리아의 IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서를 표적화하는 crRNA의 생성을 지시할 수 있는 사멸 벡터로 형질전환시켜, 그에 의해, crRNA에 의해 인식되는 게놈 DNA 내의 그들 CRISPR PAM/프로토스페이서의 CAS 엔도뉴클레아제-유도 절단 및 이후의 그들 박테리아의 사멸을 촉진시키는 단계; 및
    (d) 게놈이 상기 돌연변이를 포함하는 치환 요소를 포함하는 모집단으로부터 하나 이상의 박테리아를 선택하거나 단리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리아가 비-고도의 재조합발생 박테리아인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c) 이전에, 하나 이상의 형질전환된 박테리아를 단리하고, 추가로 계대-배양하여, 이어서 사멸 벡터로 형질전환되는 하나 이상의 추가의 박테리아의 모집단을 생성하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IMR 내의 PAM/프로토스페이서가 재조합 요소에서 하기에 상응하는 DNA의 영역 내에 존재하는 방법:
    (i) 치환 요소;
    (ii) 상류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부;
    (iii) 하류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부;
    (iv) 상류 상동성 암; 또는
    (v) 하류 상동성 암.
  5. 제4항에 있어서, IMR 내의 PAM/프로토스페이서가 재조합 요소에서 하기에 상응하는 DNA의 영역 내에 존재하는 방법:
    (i) 치환 요소;
    (ii) 상류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부; 또는
    (iii) 하류 상동성 암과 치환 요소 사이의 중첩부.
  6. 제5항에 있어서, IMR 내의 PAM/프로토스페이서가 치환 요소에 상응하는 DNA의 영역 내에 존재하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사멸 벡터가
    (i) Cas 리더 요소
    (ii) 제1 Cas 직접 반복 요소
    (iii) IMR 내의 CRISPR PAM/프로토스페이서를 표적화하는 crRNA를 생성할 수 있는 Cas 스페이서 요소; 및
    (iv) 제2 Cas 직접 반복 요소를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입의 조합인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이가 PAM/프로토스페이서 내에 존재하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 돌연변이가 SNP인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 내인성 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 I형 CRISPR/Cas 시스템을 갖는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 그람 양성 박테리아인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아가 클로스트리디아(Clostridia) 강의 박테리아, 바람직하게는 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 목의 박테리아, 더욱 바람직하게는 클로스트리듐(Clostridium) 속의 박테리아이거나, 상기 박테리아가 악티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목의 박테리아 또는 바실러스(Bacillus) 속의 박테리아인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 박테리아가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 클로스트리듐 아르부스티(C. arbusti), 클로스트리듐 아우란티부티리쿰(C. aurantibutyricum), 클로스트리듐 베이예린키이(C. beijerinckii), 클로스트리듐 셀룰로보란스(C. cellulovorans ), 클로스트리듐 셀룰롤라이티쿰(C. cellulolyticum), 클로스트리듐 써모셀룸(C. thermocellum), 클로스트리듐 써모부티리쿰(C. thermobutyricum), 클로스트리듐 파스퇴리아눔(C. pasteurianum), 클로스트리듐 클루이베리(C. kluyveri), 클로스트리듐 노브이이(C. novyi), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(C. saccharobutylicum), 클로스트리듐 써모석시노게네스(C. thermosuccinogenes), 클로스트리듐 써모팔마리움(C. thermopalmarium), 클로스트리듐 사카롤라이티쿰(C. saccharolyticum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 티로부티리쿰(C. tyrobutyricum), 클로스트리듐 테타노모르품(C. tetanomorphum), 클로스트리듐 마그눔(C. magnum), 클로스트리듐 륭달리(C. ljungdahlii), 클로스트리듐 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리듐 푸니세움(C. puniceum), 클로스트리듐 디올리스(C. diolis), 클로스트리듐 호모프로피오니쿰(C. homopropionicum) 및 클로스트리듐 로세움(C. roseum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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