JP2017511156A

JP2017511156A - 標的化変異

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Publication number: JP2017511156A
Application number: JP2017505733A
Authority: JP
Inventors: エリザベスジェンキンソン; プリベンクラベン
Original assignee: グリーンバイオロジクスリミテッド
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2017-04-20
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Abstract

本発明は、細菌ゲノムにおける標的化変異を生成および選択するためのプロセスに関する。具体的には、プロセスは所望の変異を含む組換えエレメントによって細菌を形質転換した後、組換えエレメントを細菌ゲノムに相同組み換えし；その後ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて所望の変異を有さない細菌を除去することに関する。

Description

ソルベント（溶媒）生産クロストリジウムは、まず１９２０年代および１９３０年代に、アセトン、ブタノールおよびエタノールの工業的生産を目的として用いられた。１９５０年代には、これらの溶媒を合成するより効率的な石油化学技術の確立により、このような大規模な細菌発酵は放棄された。しかし、持続可能で更新可能なプロセスを用いた化学物質の開発を求める圧力が高まっている現在の状況において、溶媒の生産を目的としたクロストリジウム菌発酵に対する関心が新たなものとなりつつある。これは、いくつかのゲノムの配列分析、およびＲＮＡ配列分析およびトランスクリプトミクスによる、これらのソルベント産生クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）に対する生物学的な理解の進歩によっても促進されている。これらの研究領域は、ブタノールを過剰産生するか、または拮抗する副生成物の産生を消失させ、さらにソルベント産生性発酵の経済性を改善することの可能な新規菌株を操作する可能性を開いている。

このゲノム情報の出現を利用するために、商業的に意味のある組換えクロストリジウム菌株およびその他の細菌株を作製する迅速且つ信頼性の高い方法に対するニーズが残っている。

従来、組換えクロストリジウム菌株を作製することは非常に困難であった。低い形質転換効率と低い組換え効率が相まって、溶媒関連表現型の改善を示す安定した組換え株を作製する取り組みを妨げてきた。過去数年間、技術の発展により、ターゲトロン（シグマ）およびクロストロン（国際公開第２００７／１４８０９１号など）などのＩＩ型イントロンの使用による挿入不活化、および「対立遺伝子連鎖交換」（ＡＣＥ、国際公開第２００９／１０１４００号など）による新規経路遺伝子の組み込みが可能となったが、複数の変異の導入は困難であり、特異的塩基交換（一塩基変異多型：ＳＮＰ）の導入については極めてわずかな研究しか行われていない。現在の技術は、これらの目標のいずれも常用的に達成するには不十分である。

クロストリジウム遺伝子系に関する初期の研究により、特定遺伝子に変異を有する株を作製する単一交叉を担持する株が得られたものの、これらは精度が低く、遺伝的に不安定であり、細胞内にプラスミドおよび抗生物質マーカー遺伝子を残す。また、特に標的とした遺伝子がオペロンと関係する場合、潜在的な極性効果（たとえば他の遺伝子に影響する可能性があるなど）の可能性もあった。

Ｅ．ｃｏｌｉ等の組換え株の作製は、直鎖ＤＮＡ（しかし、必要とされる組換えは、Ｊｉａｎｇらが２０１３に用いたＥ．ｃｏｌｉＨＭＥ６３等のリコンビニアリング菌株においてのみ効率的に作動する、後述）または自殺ベクターによる形質転換で達成することができるが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａにおいては、組換え頻度が低いのでＤＮＡが細胞から消失する前に組換え事象を発生させることができないため、これらの方法は適用できない。これを克服するために、多くの方法で安定した複製ベクターを使用しているが、その場合、組換え事象後にこれらを細胞から除去しなければならず、そうしなければ抗生物質および他のマーカー遺伝子が取り残され、その後の操作を妨害する。温度感受性レプリコン；偽自殺ベクター（これらは不安定な分離を示し、結果的に集団から除去される複製起点を担持する）（Ｈｅａｐ他、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８（１），７９−８５．２００９など）；組換えベクターへの制限酵素部位の導入、および誘導プロモーター下での制限エンドヌクレアーゼのクローニング（または制限エンドヌクレアーゼのゲノムコピーの使用）を用いて、プラスミドを除去することができる。その代わりに、ＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼを用いて、組み入れ後に選択マーカーおよびプラスミドの他の選択領域を除去することができる（国際公開第２００８／０４０３８７号）。しかし、これらの方法は余分なステップを付け加え、系の複雑度を増加させる。

数多くの発表より、抗生物質耐性カセット（クロストロンなど）の挿入、または対抗選択と組み合わせた相同組み換えを用いたインフレームのいずれかによる、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａにおける特定の遺伝子の欠失が証明されている。これは、染色体（例：ｐｙｒＥ）上に位置する対立選択遺伝子相同体に依存するか、または不均一に導入される（例：Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｃｏｄＡ）。これまで、特定のＳＮＰを担持するよう操作されたクロストリジウム菌株のエビデンスは極めて少ない。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃａｒｔｍａｎ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．（２０１２）Ｊｕｌ；７８（１３）：４６８３−９０など）を用いて実施された研究がいくつかあるが、対立選択マーカーの使用は、その方法がＷＴ（野生種）復帰突然変異株と変異を組み入れた細胞を識別しないので、プラスミドにクローニングするマーカー遺伝子相同体、細胞が依然として遺伝子相同体を担持している場合に毒性となる化学物質を用いた選択（すなわち、二重交叉事象について選択）、またその後の所望の遺伝子変化についてのスクリーニングの必要が生じる。生成する組換え株が依然としてＰｙｒＥ欠失を担持している場合は、菌株を修復するために追加的ステップを実施しなければならない。

一部の対立選択法には、方法（ＡＣＥなど）を用いることが可能となる前に欠失株を作製する必要がある方法もあるので、毒性アナログを対立選択として用いることにより望ましくない追加的な変異を導入するリスクがある。たとえば、組換え株を作製するためにｐｙｒＥ変異体がしばしば使用される。これらの変異体は、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）上で発育可能である一方、野生型ｐｙｒＥ遺伝子を有する細胞は５−ＦＯＡを毒性アナログに変換し、細胞死を引き起こす。しかし、ｐｙｒＥはウラシル生合成経路の一部であるので、これらの変異体は発育のためにウラシルを培地に追加する必要もある。これらのようなヌクレオチド生合成経路における干渉は、予想外の望ましくない追加的効果を有することもある。

ＲＮＡノックダウンおよび干渉法は研究目的には有用であるものの、商業的ソルベント産生クロストリジウム株の構築には適していない。トランスポゾン変異生成も組換え株を作製するための有用な手段ではあるものの、化学的変異と同様に、特定のゲノム位置を標的とすることができないので、産業的に意味のあるクロストリジウム菌株を構築するための実施可能な方法というよりも、むしろ有用な研究ツールとなっている。

精度の高いゲノム変換を行うために使用することが潜在的に可能な新しい方法は、転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，４２０，７８２（Ｂ２）号明細書など）であるが、この技術は真核生物ゲノムを編集するために開発された方法であり、まだ産業的に意味のあるソルベント産生クロストリジウム菌株において使用するよう特に改変されてはいない。各遺伝子ターゲットに対してＴＡＬＥＮを操作するニーズは、高額な費用、時間がかかること、またＣｌｏｓｔｒｉｄｉａにおけるこの技術の正確な作動様態の実用性のすべてが、近い将来幅広く受け入れられるツールとなることに対して不利であるとみなされる。

したがって、現在Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａに対して使用できるツールを用いる際に遭遇する多くの困難、すなわち：低い形質転換頻度、低い組換え効率、ＷＴ復帰突然変異株から遺伝子置換株を選別することが不可能、望ましくない極性効果、対立選択ステップに毒性アナログを用いる際に起こりうる望ましくない追加的変異（およびこれらの方法の一部ではＷＴではなく欠失株を使用する必要がある）、多層化変異を作製することが困難、および二重交叉事象後に組換えベクターの消失を確認する必要性を克服する、遺伝子操作のための汎用的方法に対するニーズが依然として存在する。

したがって、クロストリジウムＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に基づいた新規方法が開発されている。（ＣＲＩＳＰＲはClustered, Regularly Interspaced, Short, Palindromic Repeats：クラスタ化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復の略語である。）これらの系は、通常は「原核生物適応免疫系」と記載され、細菌または古細菌細胞が、通常はファージまたはプラスミドＤＮＡである侵入ＤＮＡから自身を防御できる手段である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する細胞は、「侵入」ＤＮＡに由来する短いフラグメントをＣａｓ遺伝子クラスタに選択的に組み込むことができる。各フラグメントは「スペーサー」と呼ばれ、直列反復に隣接する。細胞が再度同じ侵入ＤＮＡと遭遇する場合、これを敵と認識してＣａｓエンドヌクレアーゼにより開裂して破壊することになる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が認識する侵入ＤＮＡの配列は「プロトスペーサー」と呼ばれ、ゲノム内のスペーサーコピーとの同一性を有する。細胞がスペーサーのゲノムコピーを誤って攻撃しないよう、ＣａｓＩまたはＣａｓＩＩ系のプロトスペーサーはＰＡＭ配列と呼ばれる短い配列が付随していなければならない。ＰＡＭ配列は、系の種類に応じてプロトスペーサーの上流にあることも下流にあることもある。存在しないか、または何らかの様態で変異していると、侵入ＤＮＡは細胞によって認識されることがなくなり、破壊されなくなる。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃａｓ９に随伴するＰＡＭ配列は周知であるが（Ｊｉａｎｇ他、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（Ｍａｒｃｈ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９）；しかし、クロストリジウム系に随伴するＰＡＭ配列はこれまで同定されていなかった。

原核生物のすべてがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子相同体を有するわけではなく、またこれを有するものはいくつかの異なるクラスに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９（６），４６７−７７．２０１１）。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＩＩ型Ｃａｓ９系については、多くの研究が発表されている（Ｊｉａｎｇ他、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（Ｍａｒｃｈ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９など）。これは、真核細胞に使用するためのゲノム編集ツールとして開発されており、酵母（ＤｉＣａｒｌｏ他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，４１（７），４３３６−４３４３，２０１３）、ゼブラフィッシュ（Ｈｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（３），２２７−９．２０１３）および哺乳類細胞（Ｒａｎ他、ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，８，２２８１−２３０８，２０１３）などにおける使用に成功している。

Ｅ．ｃｏｌｉなどの十分に研究された細菌での使用を目的として、多くのすぐれた分子的ツールが開発されている。これらのツールは、異なるプラスミドと効率の高い形質転換およびリコンビニアリング技術の組み合わせを含む。しかし、これらのツールの多くはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａなどの細菌に適用できない。たとえば、Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ他（米国特許出願公開第２０１２／０１９０１１６号明細書）は、直鎖フラグメントの短い細胞内および細胞外半減期、クロストリジウムＤＮＡアーゼによる分解およびＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにより、直鎖ＤＮＡの利用に基づいたＥ．ｃｏｌｉにおける従来の技術をＣｌｏｓｔｒｉｄｉａで実現することは不可能であると指摘する。

ＴｒａｃｙとＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓの特許明細書（米国特許出願公開第２０１２／０３０１９６４（Ａ１）号明細書および米国特許出願公開第２０１４／０１４１５１６（Ａ１）号明細書など）は、Ｒｏｃｈａ他の必須相同組み換え機構の比較ゲノミクス試験（ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．，２００５．１（２）：ｐ．ｅ１５）より、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは組換え中間体のヘテロ二重鎖の分子内分離反応を触媒する何らかの明らかなリゾルベース遺伝子を欠いていることを示すと述べる。これを克服するために、彼らはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおいてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するｒｅｃＵ遺伝子の発現により非内因性リゾルベース活性を付加した。しかし、組換え誘導株は遺伝的に不安定であるので、将来の商業的使用には適していない。

現在、組換え効率を高めるため細菌に酵素を補充する必要のない、迅速且つ効率的に細菌ゲノムに所望の変異を生成することを可能とする新たなプロセスが開発されている。このプロセスにおいては、低い形質転換および組換え効率はほとんど関係しない。「死滅ベクター」を未変異標的配列に配向させることにより、未変異配列を担持する細胞を標的として死滅させ、これにより所望の変異を担持する細胞のみが確実に回収され；スクリーニングは必要とされない。これは非常に精度の高いプロセスであるので、極性効果（より粗雑な方法を用いるときに頻繁にみられる）を除去することができる。さらに、対抗選択マーカーが必要でないので、欠失株を使用する必要がなくなり、また選択のために毒性アナログを使用することによって望ましくない変異を意図せずに生成する可能性が取り除かれる。

この新たなプロセスでは、ＤＮＡ変化は恒久的且つ安定であり；また形質転換したベクターの除去（もしくは減少）は複層変異が容易に作製できることを意味する。プロセスは、２つ以上の遺伝子またはＤＮＡエレメントを同時に標的化することを促進することにより、いくつかの遺伝子修飾を一度に作製することを可能とする。

したがって１つの実施形態において本発明は、細菌ゲノム内の目標変異生成領域（ＩＭＲ）に変異を生成するためのプロセスであって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、且つＩＭＲが細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含み、プロセスが：
（ａ）前記細菌の集団を組換えベクターで形質転換するステップであって、組換えベクターが組換えエレメントを含み、組換えエレメントが：
（ｉ）変異を含む置換エレメント、および
（ｉｉ）置換エレメントに隣接する相同アームであって、細菌ゲノム内のＩＭＲの全体または一部を、置換エレメントを含むエレメントで置換することを促進することが可能な相同アームを含み、
組換えエレメントがＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含まない、ステップ；
（ｂ）細菌集団内の１つまたはそれ以上の細菌において、それらの細菌のゲノム内のＩＭＲの全体または一部が置換エレメントを含むエレメントによって置換され、これによりＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーがそれらの細菌のゲノム内のＩＭＲから除去されるかまたはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となる条件下で、細菌集団を培養するステップ；
（ｃ）前記集団におけるＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーが除去されていないか、ｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となっていない任意の細菌のＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としたｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な死滅ベクターで細菌集団を形質転換し、これによりｃｒＲＮＡによって認識されるそれらのＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーのＣＡＳエンドヌクレアーゼ誘導開裂と、これに続くそれらの細菌の死滅を促進するステップ；および
（ｄ）そのゲノムが変異を含む置換エレメントを含む１つまたはそれ以上の細菌を前記集団から選択するステップを含むプロセスを提供する。

ＩＭＲ（目標変異生成領域）は、その中で所望の変異を作製することを意図する細菌ゲノム内のＤＮＡ配列である。

一部の実施形態においては、ＩＭＲは、その５’末端が組換えエレメントの５’相同アームの上流末端に対応し、またその３’末端が組換えエレメントの３’相同アームの下流末端に対応する細菌ゲノム内の領域に対応する。

本稿で用いる用語「細菌ゲノム」または「ゲノムＤＮＡ」は、主として環状細菌染色体を指すが、用語は、任意に一定の条件下で細菌の生存能力にとって不可欠な、または規定の条件下で選択されることができる、内因性プラスミド（クロストリジウムメガプラスミドまたはより小さな内因性プラスミドなど）を包含することもある。たとえば、これらの内因性プラスミドは、自然状態では毒性である物質（抗生物質または重金属）または競合する微生物の存在下で発育する能力、または特定の基質を発育に用いる能力を付与することも可能である。変異させようとする細菌ゲノムまたはゲノムＤＮＡがそのような内因性プラスミドである本発明の実施形態においては、プロセスは、プラスミドが存在するものを選択する条件下で細菌集団を培養するステップを任意に含む。

細菌集団内の細菌はＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を有していなければならない。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、依然としてＰＡＭ／プロトスペーサーを含む集団内の細菌を死滅ベクターで形質転換するとき、それらの細菌のゲノムを開裂することが可能な系となる。

一部の例においては、細菌集団内に汚染がある可能性も許容されることになる。本願で用いる用語「細菌集団」は、主として、組換えベクターおよび死滅ベクターによって形質転換することが所望される細菌を指す。

好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。

集団内の細菌が１つの内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有することもあれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が異種であることもある。たとえば、異種（heterologous）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はプラスミドベースであってもよい。

好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり、すなわち野生種細菌に存在する。本発明の一部の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はプラスミドに基づく系ではない。

集団内の細菌は、たとえば、グラム陽性またはグラム陰性菌である。好ましくは、細菌はグラム陽性である。

一部の実施形態においては、細菌は芽胞菌である。他の実施形態においては、細菌は糖分解性細菌である。細菌は好気性菌であっても嫌気性菌であってもよい。好ましくは、細菌は嫌気性菌である。細菌は好熱性細菌であってもよい。

さらに他の実施形態においては、細菌は基質をＲＣＯＯＨ、たとえば酢酸および／または酪酸に変換することができる。この文脈において、Ｒは脂肪族Ｃ１〜Ｃ５，好ましくはＣ１〜３，アルキルまたはアルケニル基である。細菌は、ＲＣＯＯＨを溶媒、好ましくはアセトン、エタノールおよび／またはブタノールのうち１つまたはそれ以上に変換することも可能でありうる。

他の実施形態においては、細菌はソルベント産生細菌である。本願で用いる用語「ソルベント産生」は、細菌が溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、および／またはブタノールなどの溶媒を産生することが可能な細菌であることを意味する。いくつかの特に好ましい実施形態においては、細菌はエタノール、アセトンおよびブタノールを産生することが可能である。好ましくは、細菌はブタノール産生菌またはブタノール耐性菌である。

一部の好ましい実施形態においては、細菌はクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属である。好ましいＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃ．ｍａｇｎｕｍ、Ｃ．Ｉｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ｒｏｓｅｕｍを含む。

本発明の一部の好ましい実施形態においては、細菌はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１株、たとえばＮ１−４株などである。本発明の他の実施形態においては、細菌はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４株（ＨＭＴ）である。本発明のさらなる他の実施形態においては、細菌はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ−５０４株（ＨＭＴ）である。

他の好ましい実施形態においては、細菌はＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＤＳＭ５２５など）、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ５２７５５など）、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＣＰ２５８およびＮＣＰ２６２など）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．ＤＬ−ＶＩＩＩである。

他の好ましい実施形態においては、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ属に由来する。他の好ましい実施形態においては、細菌はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に由来する。

本発明のいくつかの実施形態においては、細菌は非高度組換え誘導細菌（non-highly recombinogenic bacteria）である。本願で用いる「非高度組換え誘導」細菌は、「高度組換え誘導」株と比較して、標準的な組換え技術では組換え誘導の効率が低い細菌である。異なる細菌種間で相同組み換え率（ＨＲＲ）を測定し、比較するために多様な方法が用いられてきた。ＶｏｓとＤｉｄｅｌｏｔ（２００９）から有用な表と考察が提供される（「細菌と古細菌における相同組み換え率の比較」ＴｈｅＩＳＭＥＪｏｕｒｎａｌ３，１９９−２０８；参照文献として本明細書に援用）。ＶｏｓとＤｉｄｅｌｏｔは、点変異に対する組換えの比率（ｒ／ｍ）に応じて種を順位付けした；これは、種におけるＨＲＲの一般的指標と解釈することが可能である。具体的には、ｒ／ｍ値は組換えの結果によるヌクレオチドの変化の点変異に対する比率と定義される。ＣｌｏｎａｌＦｒａｍｅコンピュータパッケージ（ＤｉｄｅｌｏｔとＦａｌｕｓｈ（２００７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１７５：１２５１−１２６６；参照文献として本願に援用）を用いたＭａｉｄｅｎ他の多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）法（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：３１４０−３１４５（１９９８）；参照文献として本願に援用）によって推定可能である。ＶｏｓとＤｉｄｅｌｏｔ（表１、特に参照文献として本願に援用）は、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍからＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉまでの菌株を「非常に高いかまたは高い」相同組換え率（すなわちｒ／ｍ値が２を上回る）を有するとして分類した。本発明の好ましい実施形態においては、細菌は高組換え誘導性ではなく、すなわち細菌は中程度、低い、または非常に低いＨＲＲを有し、たとえばＶｏｓとＤｉｄｅｌｏｔの定義による細菌のｒ／ｍ値は２未満、より好ましくは１未満である。

一部の実施形態においては、細菌は組換え誘導活性を促進するよう修飾されない。具体的には、細菌の組換え誘導活性は、好ましくは非内因性または外因性組換え酵素の使用によって促進されない。

他の実施形態において細菌は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＥ．ｃｏｌｉでない。

ＩＭＲは、細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることが可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含む。

ＰＡＭ／プロトスペーサーは、ＰＡＭ配列とプロトスペーサーの機能的組み合わせを含む細菌ゲノム内の配列である。このＰＡＭ／プロトスペーサー配列は、使用されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることの可能な配列であり、またｃｒＲＮＡ産生時には、選択されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって分解の標的にされ、依然として機能的ＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを含むあらゆる細菌の細胞死をもたらす。

本願で用いる用語「機能的ＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサー」は、ＩＭＲのＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを意味する。一部の実施形態においては、単一変異（ＰＡＭ配列など）はＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを非機能的にするのに十分でありうる。

ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフの略語である。ＰＡＭエレメントは細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることが可能である。ＰＡＭエレメントは一般に３〜６ヌクレオチド長であり、各細菌種に特異的である。

細菌ゲノム中のプロトスペーサーに対するＰＡＭエレメントの配向は重要である。一部の細菌種においては、ＰＡＭエレメントは一般にプロトスペーサーの５’末端またはその付近に認められ；他の細菌種では、ＰＡＭエレメントは一般にプロトスペーサーの３’末端またはその付近に認められる。

ＰＡＭエレメントは、細菌ゲノムのいずれかの鎖上に存在しうるが、Ｃａｓスペーサーエレメントとして選択された配列は、ＰＡＭエレメントと同じＤＮＡ鎖上になければならない（ＰＡＭエレメントとプロトスペーサーが直接隣り合うよう）。

一部の研究では、ＰＡＭエレメントのほぼすべての変異によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の認識が消失することを確認している（Ｊｉａｎｇ他、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｃｈ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９など）。ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメントは、機能的プロトスペーサーに加えて機能的ＰＡＭエレメントを有していなければならない。本願で用いる用語「機能的ＰＡＭエレメント」または「細菌において機能的であるＣＲＩＳＰＲＰＡＭエレメント」は、細菌の内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって、または、細菌が内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有していない場合、細菌に導入されたベクターベースの異種ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によってＰＡＭエレメントが認識されることが可能であることを意味する。

選択した細菌種において、２つ以上の配列がＰＡＭエレメントとして機能できることもありうる。たとえば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２に由来するＩ−ＥＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は４つの機能的ＰＡＭ配列を有することが知られており（Ｇｏｍａａ他、（２０１４）ｍＢｉｏ，５（１）：ｅ００９２８−１３ＤＯＩ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００９２８−１３）、またＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）においては、実施例２に記載の方法を用いて、少なくとも４つの有効なＰＡＭ配列（ＣＣＣ、ＣＣＴ、ＣＣＡおよびＣＣＧ）が同定されている。

ＰＡＭエレメントが特定の細菌種において機能する能力は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する細菌（細菌の内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または異種プラスミド由来系のいずれか）を、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを含むプラスミド、および隣接するテストＰＡＭエレメントで形質転換することにより試験することが可能である。ＰＡＭエレメントが細菌において機能的である場合、ＰＡＭエレメントを含有するプラスミドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって破壊され、形質転換効率は著しく低下することになる。この概念は、本願の実施例２に例示されている。

ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサーは、ｃｒＲＮＡによって標的とされる細菌ゲノム内の配列である（ただし適合するＰＡＭエレメントも適切な位置にある場合）。

ＩＭＲはＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含む。

好ましくは、ＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは、組換えベクター内の置換エレメントに対応するＤＮＡの領域内にある。この実施形態においては、ＩＭＲがステップ（ｂ）の置換エレメントで置換されるとき、ＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは細菌ゲノムより機能的に除去される。一部の実施形態においては（変異が欠失である場合など）、置換エレメントに対応するＩＭＲ内のＤＮＡ領域は、置換エレメントとの同一性がほとんどないことがある。このような場合、組換えベクター内の置換エレメントに対応するＤＮＡ領域は，相同アームに対応する領域の内側の末端によって区画されるＩＭＲ内のＤＮＡ領域となる。

他の実施形態においては、ＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは置換エレメントの一部に対応するＤＮＡ領域内にあり、また組換えベクター内の３’相同アームの一部またはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは、組換えベクター内の３’相同アームに対応するＤＮＡの領域内にある。これらの例では、ＩＭＲのＰＡＭ／プロトスペーサーから３’側に発生する交叉事象（相同アームと細菌ゲノム内の対応する配列の間）は、細菌ゲノムからのＰＡＭ／プロトスペーサーの消失をもたらすことになる。ＰＡＭ／プロトスペーサーで発生する交叉事象によって、ＰＡＭ／プロトスペーサーは非機能的、すなわちｃｒＲＮＡによって標的とされることが不可能となりうる。したがって、このような交叉によって生じる細菌はｃｒＲＮＡによって標的化されないことになる。

他の実施形態においては、ＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは置換エレメントの一部に対応するＤＮＡ領域内にあり、また組換えベクター内の５’相同アームの一部またはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーは、組換えベクター内の５’相同アームに対応するＤＮＡの領域内にある。これらの例では、ＩＭＲのＰＡＭ／プロトスペーサーの５’側に発生する交叉事象（相同アームと細菌ゲノム内の対応する配列の間）は、細菌ゲノムからのＰＡＭ／プロトスペーサーの消失をもたらすことになる。ＰＡＭ／プロトスペーサーで発生する交叉事象によって、ＰＡＭ／プロトスペーサーは非機能的、すなわちｃｒＲＮＡによって標的とされることが不可能となりうる。したがって、このような交叉によって生じる細菌はｃｒＲＮＡによって標的化されないことになる。

相同アームと、細菌ゲノム内の対応する配列との間の交叉事象はランダムな事象であり、たとえばＰＡＭ／プロトスペーサーが上流の相同アームに対応するＩＭＲ内のＤＮＡ領域にある場合、置換エレメントによるＩＭＲの置換をもたらす交叉事象がＰＡＭ／プロトスペーサーの３’側で発生しうることを、当業者は認識することになる。この場合、ｃｒＲＮＡは依然としてＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としているので、当該細菌は死に至ることになる。しかし、集団内の他の細菌においては、置換エレメントによるＩＭＲの置換をもたらす交叉事象がＰＡＭ／プロトスペーサーの５’側で発生しうる。この場合、ＰＡＭ／プロトスペーサーは細菌のゲノムから取り除かれているので、細菌はｃｒＲＮＡの標的とならないことになる。したがって、相同アームに対応するＤＮＡ領域内にあるＰＡＭ／プロトスペーサーを用いた本発明の実施形態は、置換エレメントを含み、且つＰＡＭ／プロトスペーサーを含まないか、またはｃｒＲＮＡによって認識されることが可能なＰＡＭ／プロトスペーサーを含まない細菌をもたらすことが、依然として可能である。

置換エレメントによるＩＭＲの置換によって細菌ゲノムからのＰＡＭ／プロトスペーサーの除去ももたらされることになる確率を最大化するためには、ＰＡＭ／プロトスペーサーが組換えベクター内の置換エレメントと対応するＤＮＡ領域内にあるか、またはそのできるだけ近くにあることが好ましい。

したがって、ＩＭＲ内のＰＡＭ／プロトスペーサーは、好ましくは：
（ｉ）置換エレメント；
（ｉｉ）上流相同アームと置換エレメントのオーバーラップ；
（ｉｉｉ）下流相同アームと置換エレメントのオーバーラップ；
（ｉｖ）組換えエレメント内の上流相同アーム；または
（ｉｖ）組換えエレメント内の下流相同アームに対応するＤＮＡ領域内に存在する。

より好ましくは、ＩＭＲ内のＰＡＭ／プロトスペーサーは：
（ｉ）置換エレメント；
（ｉｉ）上流相同アームと置換エレメントのオーバーラップ；または
（ｉｉｉ）下流相同アームと置換エレメントのオーバーラップに対応するＤＮＡ領域内に存在する。

より好ましくは、ＩＭＲ内のＰＡＭ／プロトスペーサーは置換エレメントに対応するＤＮＡ領域内に存在する。

本発明のプロセスのステップ（ａ）の目的は、細菌集団を組換えベクターで形質転換することである。これは、標準的組換えプロトコルを用いて達成し、抗生物質などの適切な選択マーカーを用いて選択することができる。

組換えベクターは、組換えエレメントが置換エレメントおよび相同アームを含む組換えエレメントを含む。

置換エレメントは所望の変異を含む。

変異は、たとえば１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入、または１つまたはそれ以上の置換、欠失または挿入の組み合わせであってもよい。

置換エレメントは、置換しようとするＩＭＲの配列に基づくこともそうでないこともある。たとえば、置換エレメントはＩＭＲとほとんど同じＤＮＡ配列を有することもあるが、置換エレメントはＩＭＲのＤＮＡ配列と比較してＳＮＰ、挿入または欠失を含むこともある。他の例、たとえばＩＭＲを欠失すること、またはこれを異なるＤＮＡで置換することが所望される場合、置換エレメントは、ＩＭＲとの配列の同一性が著しくないこともある。

一部の実施形態においては、変異は、ＩＭＲの配列と比較して単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であるか、またはこれを含む。そのような実施形態においては、変異は、ＰＡＭ／プロトスペーサーが機能的でなくなるよう（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されなくなるよう）、好ましくはＰＡＭ／プロトスペーサー内にある。そうでない場合は、変異は置換エレメントの配列の他の部分に存在することもある。

他の実施形態においては、変異は、ＩＭＲの配列と比較して１つまたはそれ以上のヌクレオチドの１つまたはそれ以上の欠失を含みうる。欠失はインフレームであることも、インフレームでないこともある。好ましくは、欠失は、ＰＡＭ／プロトスペーサーが機能的でなくなるよう（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されなくなるよう）、ＰＡＭまたはＰＡＭ／プロトスペーサーの少なくとも一部を含む。

さらに他の実施形態においては、変異は、ＩＭＲの配列と比較して１つまたはそれ以上のヌクレオチドの１つまたはそれ以上の挿入を含む。一部の実施形態においては、挿入は、ＰＡＭ／プロトスペーサーが機能的でなくなるよう（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されなくなるよう）、ＰＡＭ／プロトスペーサー内にある。挿入はインフレーム挿入であることも、アウトオブフレーム挿入であることもある。

他の実施形態においては、変異はＰＡＭ／プロトスペーサーの全体または一部を置換する挿入である。好ましくは、ＰＡＭまたはＰＡＭ／プロトスペーサーが機能的でなくなるよう（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されなくなるよう）、ＰＡＭまたはＰＡＭ／プロトスペーサーは欠失するか、または変異する。

万一所望の変異（ＳＮＰ、挿入、または欠失など）によってＰＡＭ／プロトスペーサーが変化しない場合は、ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメントに追加的な変異を作製して、目的の細菌において非機能的にしなければならない。たとえば、ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメント内にサイレント変異を作製することがある（ＰＡＭ／プロトスペーサー配列がコード配列の場合）。

所望の変異が実際のＰＡＭ／プロトスペーサー内にない実施形態においては、ＰＡＭエレメントと変異部位の距離を最小に保つことが好ましい。ＰＡＭエレメントと変異部位が離れるほど、その間の場所で組換え事象が発生する確率が大きくなる。これにより、変異ＰＡＭエレメントを担持するが所望の変異については野性型である細菌が生じることがある。変異ＰＡＭは所望の変異より最大１５００ｂｐとすることも可能である。ＰＡＭ部位と所望の変異の距離は、好ましくは１００ｂｐまたはそれ以下である。より好ましくは、ＰＡＭエレメントと所望の変異部位の距離は５０ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは２５ヌクレオチド未満、また最も好ましくは１０ヌクレオチド未満である。

置換エレメントの長さは、１〜１００，０００ヌクレオチドから、好ましくは１〜５０，０００または１〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは１〜５０００から１〜２５００、１〜１０００、１〜５００、１〜５０または１〜１０ヌクレオチドである。

置換エレメントの最小サイズは所望の変異によって規定される。したがって、変異がＳＮＰであるかまたはこれを含む場合、置換エレメントは単一のヌクレオチドを含むこともある。変異がＰＡＭエレメントを含む欠失である場合、置換エレメントは０個のヌクレオチドを含む。挿入については、置換エレメントは挿入しようとするＤＮＡの長さである。

本発明の一部の実施形態においては、置換エレメントは、そのゲノムに置換エレメントが挿入されている宿主細菌細胞に対して選択表現型を付与する選択マーカーを含まない。

本発明の他の実施形態において、置換エレメントは、そのゲノムに置換エレメントが挿入されている宿主細菌細胞に選択表現型を付与する、選択マーカー対立遺伝子を生成するために、細菌ゲノムにおいて選択マーカーの第２のエレメントと並置することの可能な選択マーカーの第１のエレメントを含まない。

組換えエレメントは：
（ｉｉ）置換エレメントと隣接する相同アームであって、相同アームが、置換エレメントを含むエレメントによる、細菌ゲノム内のＩＭＲの全体または一部の置換を促進することが可能である相同アームも含む。

相同アームは、置換エレメントを含むエレメントによるＩＭＲの置換をもたらす、組換えエレメントと細菌ゲノムの相同組み換え（二重交叉）を促進する。

好ましくは、相同アームが２つあり、その一方は置換エレメントの５’側にあり、もう一方は置換エレメントの３’側にある。

上流（５’）相同アームは、その配列がＩＭＲの５’末端にあるＤＮＡの範囲と同一性を有するＤＮＡの範囲を含む。

下流（３’）相同アームは、その配列がＩＭＲの３’末端にあるＤＮＡの範囲と同一性を有するＤＮＡの範囲を含む。

好ましくは、５’相同アームと細菌ゲノム中の対応する配列の配列同一性の度合いは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、または９９％、または１００％である。好ましくは、３’相同アームと細菌ゲノム中の対応する配列の配列同一性の度合いは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、または９９％、または１００％である。

各相同アームは、個別に長さが５０〜１５００または２００〜１０００ヌクレオチドであり、好ましくは５００〜１０００、またより好ましくは個別に長さ７００〜９００ヌクレオチドである。より好ましくは、各相同アームは個別に長さ約８００ヌクレオチドである。

本願で用いる用語「置換エレメントを含むエレメント」は、一般に上流相同アームの一部、置換エレメント、および下流相同アームの一部を含むエレメントを指す。そのようなエレメントは、一旦二重交叉が遂行されると、ＩＭＲの一部または全体を置換することになる。

細菌ゲノム内のＩＭＲの全体および一部は、置換エレメントを含むエレメントによって置換されることになる。置換されるＩＭＲの正確な量は、組換えベクター中の相同アームとＩＭＲ中の対応する領域の間の交叉事象の位置に依存することになる。

組換えベクターは、好ましくは環状ベクターである。

組換えベクターは、好ましくは複製起点エレメント、最も好ましくはグラム陽性複製起点エレメント（たとえば「ｐＢＰ１」）を有する。一部の好ましい実施形態においては、組換えベクター複製起点エレメントは死滅ベクター複製起点エレメントと適合する。

組換えベクターは、適切な選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子など）も含むことがある。好ましくは、組換えベクターおよび死滅ベクターは異なる選択マーカーを有する。

組換えエレメントは、ＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含まない。これは、ｃｒＲＮＡによって認識されることができる新たなＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーが、二重交叉事象後に細菌ゲノムに挿入されていないことを保証するためである。

ステップ（ｂ）は、集団内の１つまたはそれ以上の細菌において、それらの細菌のゲノム内のＩＭＲの全体または一部が、置換エレメントを含むエレメントによって置換され、またこれによりＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーが、それらの細菌のゲノム内のＩＭＲから除去されるか、またはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となる条件下で、細菌集団を培養することを含む。

多くの細菌種において、この置換ステップはあまり効率が良くない。したがって、集団内のすべての細菌においてこのステップが成功することは概して期待されない。

このステップにおいては、組換えベクターによって形質転換された細菌を培養して、置換エレメントを含むエレメントが細菌ゲノムに組み込まれ、且つＩＭＲがベクター上でループを作る二重交叉事象を促進する。

本発明の方法においては、使用はリコンビニアリング技術から構成されない。具体的には、置換エレメントは直鎖ＤＮＡ上に位置しない。

ＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーがこれらの細菌のゲノム内のＩＭＲから除去されるか、またはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となる二重交叉事象が所望される。

好ましくは、１つまたはそれ以上の形質転換細菌が分離され、さらに（たとえば抗生物質を含む）選択培地上で継代培養して組換えベクターを維持して（１回またはそれ以上、たとえば１〜５回）１つまたはそれ以上のさらなる細菌集団が生成され、その一部は所望の二重交叉事象を受けることになる。

細菌を培養するのに適した条件は、当技術において容易に知られることになる。そのような条件は、たとえば、『Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ：バイオテクノロジーおよび医学的応用』Ｈ．Ｂａｈｌ、Ｐ．Ｄｕｒｒｅ編ＩＳＢＮ３−５２７−３０１７５−５、特に第３．４節「発育条件および栄養要求」に記載されている。詳細は、「Ｂｅｒｇｅｙ体系的細菌学マニュアル」の選択した細菌門に該当する巻である「第３巻ファーミキューテス」ＩＳＢＮ９７８−０−３８７−９５０４１−９などにも示されている。

本発明のプロセスのステップ（ｃ）においては、ＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーが除去されていないか、またはｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となっていない集団において、任意の細菌のＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としたｃｒＲＮＡを産生することが可能な死滅ベクターによって、細菌集団が形質転換され、これにより、ｃｒＲＮＡによって認識されるそれらのＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーのＣＡＳエンドヌクレアーゼ誘導開裂と、これに続くそれらの細菌の死滅が促進される。

本発明の方法の第３のステップの目的は、そのゲノムが依然として機能的ＰＡＭ／プロトスペーサーを含む細菌の集団内で、細菌細胞に対して選択することである。ｃｒＲＮＡは、単一の交叉事象のみが発生しているあらゆる細菌細胞を標的とすることになり；また交叉事象がないか、または二重交叉を経て野生種に復帰したあらゆる細胞も標的とすることになる。これらはすべて野性型（すなわち機能的）ＰＡＭ／プロトスペーサーを有するので、これらの細菌は死滅することになる。

結果として、このステップ後に生存していなければならない唯一の細菌細胞が、所望の変異を含む置換エレメントを有する細菌細胞であることが必須である。

死滅ベクターによって形質転換された細菌は、好ましくはこの時点で、死滅ベクターにのみ特異的な（且つ組換えベクターには特異的でない）選択マーカー（抗生物質耐性など）の存在下で培養される。

用語「ｃｒＲＮＡ」はＣＲＩＳＰＲＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって開裂しようとする標的スペーサー配列が隣接する短い直接反復配列からなる短い単鎖ＲＮＡ分子である。

好ましい実施形態においては、死滅ベクターは：
（ｉ）Ｃａｓリーダーエレメント
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント
（ｉｉｉ）Ｃａｓスペーサーエレメント、および
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含む。

「Ｃａｓリーダーエレメント」は、一般に直列反復クラスタの最初の反復の上流に認められるＤＮＡエレメントである。ｃｒＲＮＡの産生の促進を支援し、すなわちＲＮＡプロモーターとして機能する。これまで数多くのＣａｓリーダー配列が同定されており、またその配列は任意の特定のＣａｓ系において容易に確立することができる。好ましくは、Ｃａｓリーダー配列は、形質転換されつつある細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に対応する配列である。

Ｃａｓ直列反復配列は、細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されるＤＮＡエレメントである。これらの直列反復は、一般的に長さ２５〜３５ヌクレオチド、より一般的には長さ約２９または３０ヌクレオチドである。

直列反復は、同一の配列である必要はない（一般的には、１〜２ヌクレオチドの違いはＣａｓタンパク質によって許容される）。一般的に、直列反復はヘアピンループを形成することができるパリンドローム領域を有する。

任意の１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に適した直列反復のＤＮＡ配列は、その系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ直列反復スペーサークラスタの任意の試験によって容易に確認することができる。

Ｃａｓスペーサーエレメントは、目的の細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の選好に応じて、ＰＡＭプロトスペーサー内のＰＡＭエレメントの５’側（好ましくは直近）またはＰＡＭプロトスペーサー内のＰＡＭエレメントの３’側（好ましくは直近）に認められる、２０〜５０ヌクレオチド（好ましくは３０〜４０、より好ましくは３６〜３８ヌクレオチド）と高度な配列同一性を有する、２０〜５０ヌクレオチドの配列（好ましくは３０〜４０，より好ましくは３６〜３８ヌクレオチド）を含む。

好ましくは、（細菌ゲノム内の）ＩＭＲ内のＰＡＭエレメントは、（細菌ゲノム内の）プロトスペーサー配列の開始部に直接隣接する。

プロトスペーサー（ゲノムＤＮＡ内）とスペーサーエレメント配列（死滅ベクター内など）の配列同等性の程度は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、または１００％である。

好ましくは、Ｃａｓスペーサー配列は、非プロトスペーサーエレメントと相互作用する確率が低くなるように選択される。

本発明のプロセスを用いて、細菌ゲノム内の２つ以上のプロトスペーサーを同時に標的化することが可能である。この場合死滅ベクターは、各Ｃａｓスペーサーエレメントが直列反復と隣接する２つ以上のＣａｓスペーサーエレメントを含む。

細菌ゲノム内のプロトスペーサーエレメントとは異なり、スペーサーエレメントは随伴するＰＡＭエレメントを有していてはならない。

死滅ベクターは、組換えベクターの複製起点に適合する複製起点（好ましくはｐＣＢ１０２などのグラム陽性複製起点）を有する。

好ましくは、組換えベクターと死滅ベクターの複製起点は異なる。

組換えベクターおよび死滅ベクターは、抗生物質耐性エレメントまたは他の選択マーカーを含むことにより、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン，ストレプトマイシンといったある種の抗生物質の存在下などで、ベクターが個別に選択されることを可能とすることもできる。好ましくは、組換えベクターおよび死滅ベクターは、異なる抗生物質について個別の選択を可能とする抗生物質耐性エレメントを含む。

死滅ベクターが一旦細菌集団に形質転換されると、Ｃａｓリーダー配列は、直列反復およびＣａｓスペーサーエレメントを含むことになるｃｒＲＮＡの転写を促進する。するとｃｒＲＮＡは、置換エレメントを含むエレメントによるＩＭＲの置換によって除去されていない、細菌ゲノム内の任意のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする。すると、そのようなＰＡＭ／プロトスペーサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって開裂され、依然としてそのゲノムにＰＡＭ／プロトスペーサーを有している細菌の死滅をもたらす。

アミノ酸配列同一性およびヌクレオチドおよびヌクレオチド配列同一性百分率は、ＢＬＡＳＴアラインメント法を用いて得ることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検索プログラム」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータが使用される。

標準的タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）は、タンパク質データベース内で類似した配列を発見するために用いることができる。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様、ｂｌａｓｔｐは局在的類似領域を発見するようデザインされている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐはグローバルアラインメントも報告し、これはタンパク同定の目的にとって好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータを用いる。一部の例では、「低複雑度フィルター」を外すこともある。

ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワードの長さ＝３で実施することもある。比較を目的としたギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９の記載に従い、ギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に実装）を利用することができる。その代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に実装）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する反復検索を実施することもできる。（上述のＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）を参照。）ＢＬＡＳＴを利用する場合、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴそれぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。

ヌクレオチド配列比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔ、およびｂｌａｓｔｎを用いてこの目的を達成することができる。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータが使用される。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間の長いアラインメントを効率的に発見するよう特にデザインされている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を発見することも可能である。

ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、まずクエリワードとの完全一致（ワードヒット）を特定する。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを複数の段階で延長して、最終ギャップアラインメントを生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。

ＢＬＡＳＴ検索の感度を支配する重要なパラメータの１つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、短いデフォルトワードサイズを使用すること（１１）である。これの理由により、ｂｌａｓｔｎは他の細菌に由来する関連ヌクレオチド配列に対するアラインメントの発見においてＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりもすぐれている。ｂｌａｓｔｎにおけるワードサイズは調節可能であり、且つ検索感度を高めるためにデフォルト値より最低で７まで減少することが可能である。

より感度の高い検索は、新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）を用いることにより遂行することができる。このページは、Ｍａ他（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２Ｍａｒ；１８（３）：４４０−５）が報告したアルゴリズムと類似したアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、アラインメント延長のシードとしてワードの完全一致を必要とするのではなく、より長いテンプレートウィンドウ内で非連続的なワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置において一致を発見することに集中する一方で、第３の位置における不一致を無視することにより、第３の塩基の揺らぎが考慮に入れられる。同じワードサイズを用いて不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴで検索すると、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度と効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔ独自のパラメータは：ワードサイズ１１または１２；テンプレート：１６、１８、または２１；テンプレート種別：コーディング（０）、非コーディング（１）、または併用（２）。

本願で用いる用語「形質転換」および「形質転換する」は、組換えベクターまたは死滅ベクターを細菌細胞に挿入するあらゆるステップを指す。したがって、とりわけあらゆる形態のエレクトロポレーション、接合、またはトランスフェクションを含む。

ステップ（ｄ）は、そのゲノムが所望の変異を含む置換エレメントを含む１つまたはそれ以上の細菌を選択または分離することを含む。

ＷＴ（野性型）ＩＭＲは組換えベクター上で容易にループを形成するという事実により、所望の変異を担持する細菌は容易にこれを失うことになる。すると、死滅ベクターがこのときベクター上にあるＰＡＭ／プロトスペーサーを認識するので、そのような組換えベクターは細菌集団から容易に消滅しうる。したがって、組換えベクターを本来選択に用いられる選択マーカー（抗生物質など）上のこの点から除去しなければならない。

死滅ベクターが消失した細菌は、死滅ベクター選択マーカー（抗生物質など）を含有しない培地を用いて容易に分離できる。代替的な方法を用いることもできる。さらに、たとえば熱ショックまたはエレクトロポレーションなどの、細胞からのプラスミド消失率を高める可能性のある種のストレスを細胞にかけてもよい。

選択または分離される細胞は生菌である。

本発明は、本発明のプロセスにより細菌を変異させることを含む、変異細菌を作製するためのプロセスをさらに提供する。

本発明は、本発明のプロセスによってそのゲノムが変異した細菌も提供する。

本発明の１つの実施形態における組換えベクター、内因性細菌ＤＮＡ、および死滅ベクターのエレメント間の関係を図示する。数多くのクロストリジウム種に由来する直列反復配列のアラインメントを示す。Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）へのプラスミドの形質転換効率に対するＰＭＡ配列の影響を示す。ＳＮＰ置換実施例についての、変異およびＷＴＤＮＡ配列の高解像度融解曲線分析を示す。記載された技術を用いて作製されたＳＮＰを担持する２つのクローンからのＳａｎｇｅｒ配列分析データを示す。標的化欠失実施例についての、変異およびＷＴＤＮＡ配列の高解像度融解曲線分析を示す。標的化欠失実施例についてのＳａｎｇｅｒ配列分析結果を示す。

（数多くのクロストリジウム種に由来する直列反復配列のアラインメント）
（目的）
本発明のプロセスに用いることの可能ないくつかの直列反復配列を同定する。

（方法）
直列反復およびスペーサー配列は、Ｇｒｉｓｓａ，Ｉ．，Ｖｅｒｇｎａｕｄ，Ｇ．，とＰｏｕｒｃｅｌ，Ｃ．（２００７）のＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒプログラムを用いて確認した。ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ：クラスタ化され規則的な間隔を有する短いパリンドローム反復を同定するためのウェブツール。ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３５，Ｗ５２−７．

（結果）
数多くのクロストリジウム種から選択した直列反復配列を図２に示す。一部の例においては、特定の菌株が２つ以上の配列を有しているので、ここでは最も頻繁に用いられる直列反復配列を含める。略語は以下の通りである：Ｃ＿ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒ＝ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１ −４（ＨＭＴ）またはＮ１−５０４）、Ｃ＿ｓａｃｃｈａｒｏｂ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＣＰ２５８またはＮＣＰ２６２、＿１および＿２は２つの主要なＤＲクラスタを指す）、Ｃ＿ｔｙｒｏ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ５２７５５、＿１および＿２は２つの主要なＤＲクラスタを指す）、Ｃ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＤＳＭ５２５）、Ｃ＿ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＤＳＭ１００６１）、Ｃ＿ｓｐ＿ＤＬＶＩＩＩ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．（ＤＬ−ＶＩＩＩ）。

（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）におけるＰＡＭ配列の確認）
（目的）
推定ＰＡＭ配列の有効性を試験する方法を実証する。

（方法）
Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）の主要な直列反復クラスタに由来するＳｐａｃｅｒ＿５３の配列を、クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３２５１にクローニングした。このスペーサーエレメントの５’末端に隣接して、予測ＰＭＡ配列ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴおよび非ＰＡＭ配列ＧＡＣを含む、多様な異なるトリヌクレオチドの組み合わせが組み込まれていた。機能的ＰＡＭ配列と正しく組み合わせると、スペーサーエレメントはプロトスペーサーとして機能する。

標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、プラスミドでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を形質転換した後、５％グルコースも含有するクロストリジウム発育培地（ＣＧＭ）において一晩回復段階においた。次に、グルコース５％およびエリスロマイシン４０μｇ／ｍＬを含有するＣＧＭ寒天プレート上に混合物を塗布し、３２℃の嫌気性キャビネット内で少なくとも４８時間放置した。その後コロニー数を計測し、空のベクターによる形質転換と比較した形質転換効率の変化を判定した。

ＣＧＭ培地は、蒸留水７５０ｍＬに以下の量：酵母エキス５．０ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．７５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．７５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．４０ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ、ＮａＣＩ１．０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２．０ｇ、アスパラギン２．０ｇ（固形培地を作製する場合はさらに細菌学寒天Ｎｏ．１１５ｇ）を溶解し、オートクレーブで加熱して調製した。培地のｐＨは調節しなかった（通常は６．６の範囲内）。グルコース溶液（グルコース５０ｇを蒸留水２５０ｍＬに溶解して２０％（ｗ／ｖ）溶液とする）を調製して、個別にオートクレーブ加熱した。一旦冷ました後、グルコースおよびＣＧＭ溶液を必要に応じて混合した。

（結果）
各プラスミドの相対的形質転換効率を図３に示す。空のプラスミドｐＭＴＬ８３２５１もＰＡＭ配列のないＳｐａｃｅｒ＿５３を担持するプラスミドも大量のコロニーを生成した。５’ＣＣＣ（ＰＡＭＣ）、ＣＣＴ（ＰＡＭＴ）またはＣＣＡ（ＰＡＭＡ）に隣接するＳｐａｃｅｒ＿５３を担持するプラスミドは、得られたコロニー数が著しく少なかった。

（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）におけるＳＮＰ置換の作製）
（目的）
開示された技術を用いてどのように特定の点変異を作製することができるかを示す。

（方法）
Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）のゲノムＤＮＡにおける変異のためのＩＭＲ配列を選択した。その配列より、ＰＡＭ（本実施例においてはＣＣＡ）に隣接するプロトスペーサーエレメントの候補を特定した。このＰＡＭ／プロトスペーサーエレメントの配列を表１に示す。組換えベクターは１対の相同アームと隣接する置換エレメントを含めてデザインされ、各アームは約８００ｂｐ長であった。置換エレメント（表１）は、ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメントの本来のゲノム配列に対して３つのＳＮＰを担持する。３つのＳＮＰのうち１つは組み入れられてＰＡＭ配列をＣＴＡに変異させ；他の２つは制限部位（大文字および下線部）を除去するようデザインされた。

組換えベクターは、クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８２１５４を基にした。標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用い、このベクターでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を形質転換した。成功した形質転換細胞は、クロラムフェニコール（５０ｍｇ／ｍＬ）に対する耐性に基づいて選択した。単一コロニーを採取し、クロラムフェニコールを含有する液状強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）に移した。二重交叉事象およびＷＴ配列のループ形成を促進するために、それらを４回またはそれ以上継代培養した。

ＲＣＭ半固形培地を以下の方法で調整した：酵母エキス３ｇ・Ｌ^−１、Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ末１０ｇ・Ｌ^−１、ペプトン１０ｇ・Ｌ^−１、グルコース５ｇ・Ｌ^−１、可溶性デンプン１ｇ・Ｌ^−１、塩化ナトリウム５ｇ・Ｌ^−１、酢酸ナトリウム３ｇ・Ｌ^−１、塩酸システイン０．５ｇ・Ｌ^−１、寒天０．５ｇ・Ｌ^−１、ｐＨを６．８±０．２に調節した後、１２１℃のオートクレーブで滅菌。

次に、これらの培養を、リーダー配列および上で同定されたプロトスペーサー候補に対応するスペーサーエレメントを含む死滅ベクターであって、スペーサーエレメントがｐＭＴＬ８３２５１プラスミド骨格上で直列反復配列と隣接する死滅ベクターによって形質転換した。細胞は、５％グルコースを含有するＣＧＭで一晩回復させた後、５％グルコース＋エリスロマイシン４０μｇ／ｍＬを含有するＣＧＭ寒天上に播種した。

死滅ベクター上に存在するスペーサーエレメント（表１）は、ゲノム内の対応する配列を有効に機能的プロトスペーサーエレメントに変換する。死滅ベクターに担持されたこのスペーサーはＷＴ配列のみを標的とし、また細菌自体のＣａｓ系は自らのゲノムＤＮＡを侵入ＤＮＡとして感知して開裂し、細胞死に至る。したがって、死滅ベクターによる形質転換後に回収される唯一の細胞は、そのゲノムＤＮＡを置換エレメントに組換えていなければならない。

表１：実施例３で使用されたＰＡＭ／プロトスペーサーエレメント、スペーサーエレメント、および置換エレメントの配列）

（高解像度融解曲線分析（ＨＲＭ））
上記のプロセスによって選択されたコロニーを、高解像度融解曲線分析を用いてスクリーニングし、ＷＴ配列と比較してＳＮＰの存在を特定した。意図するＳＮＰ位置を含む１．１ｋｂ領域を、細菌染色体からの産生物のみを増幅するプライマーを用いて増幅した。次に、この産物に対して２回目のＰＣＲを実施し、高精度融解スーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて意図するＳＮＰ領域を含むより短いフラグメント（８５ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ後、７０℃から８０℃まで０．２℃ずつ温度を上げて融解曲線を測定し、試験クローン毎に融解曲線を作製した。

ゲノムＤＮＡ特異的ＰＣＲより生成した１．１ｋｂＰＣＲ産物も、制限酵素消化（ＳＮＰのうち２つがＡｖｒｌｌ部位を破壊したので）、その後ＤＮＡスクリーニングによって標的変異についてスクリーニングした。

（結果）
死滅ベクターで形質転換した後、有望なコロニーが２つ得られ、ＡおよびＢと命名された。したがってこの方法は、必要な変異を同定するためにスクリーニングする必要のあるコロニーの個数を著しく減少させる。

コロニーＡおよびＢをＨＲＭで分析し、図４に示すように、ＷＴおよび対照（control）菌株（組み入れた３つの変異のうち１つを担持）の双方と比較した。コロニーＡおよびＢの融解曲線のＷＴまたは対照の曲線と比較した違いは、ＳＮＰ配列にまたがるゲノム領域がＷＴ株と比較して変化したことを示した。

（Ｓａｎｇｅｒ配列分析）
上記のＨＲＭ分析のために作製した、ゲノム特異的ＰＣＲに由来する１．１ｋｂＰＣＲ産物についての配列分析の結果を図５に示す。「ＷＴ」のアラインメント＝ＷＴ培養から得られた配列、「Ｅｘｐｅｃｔｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ」＝予想される変異のインシリコ予測、「Ｃｏｎｔｒｏｌｓｅｑｕｅｎｃｅ」＝ＰＡＭ変異のみを担持する変異株から得られる配列、「ＣｏｌＡ」および「ＣｏｌＢ」＝Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を用いて記載の方法で作製した菌株、Ｃａｓ系は、ＳｅｑｍａｎＰｒｏ（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）を用いて作製した。

ＨＲＭ曲線の変化は、導入された３つのＳＮＰによるものであったことを確認する。

その後、この領域全体の配列分析により、これ以外の変異が導入されていないことが示された（データは示さず）。

（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）における高精度欠失作製）
（目的）
本発明のプロセスを用いどのように高精度なゲノム内欠失を作製できるかを示す。

（方法）
選択した遺伝子の開始点より１２個のアミノ酸を除去して新たな開始コドンを付加し、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）内の配列のインフレーム切断をもたらすＮ末端欠失変異体がデザインされ、「ΔＮｔ」と命名された。２つの追加的ＳＮＰも組み入れてＡｖｒｌｌ制限部位を除去した。このＷＴ領域内で、ＰＡＭ（本実施例においてはＣＣＡ）と隣接するプロトスペーサーエレメントの候補を特定した。ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメントを有するこの領域の配列および欠失の領域を強調して表２に示す。組換えベクターは１対の相同アームと隣接する置換エレメントを含めてデザインされ、各アームは約８００ｂｐ長であった。置換エレメント（表２）は、３６塩基対欠失および本来のゲノム配列に対する新規開始コドンを担持する。

組換えベクターは、クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８２１５４を基にした。標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、このベクターでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を形質転換し、クロラムフェニコール（５０ｐｇ／ｍＬ）に対する耐性に基づいて選択した。単一コロニーを採取し、クロラムフェニコールを含有する液状強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）に移した。二重交叉事象およびＷＴ配列のループ形成を促進するために、それらを３回またはそれ以上継代培養した。

したがって、死滅ベクターによる形質転換後に回収される唯一の細胞は、そのゲノムＤＮＡが置換エレメントに組換えられ、ゲノムのＮ末端で標的とした１２アミノ酸の高精度の欠失がもたらされていなければならない。

表２：実施例４で使用されたＰＡＭ／プロトスペーサーエレメント、スペーサーエレメント、および置換エレメントの配列）

（結果）
死滅ベクターで形質転換後に約３０個の有望なコロニーをスクリーニングし、このうち２１個がＷＴ対照と異なるＨＲＭ曲線を示した（図６）。これら２１コロニーのうち数個をさらに分析およびＳａｎｇｅｒ配列分析したところ、それらはすべて意図したＮ末端欠失を担持することが示された（図７）。

（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）ゲノムへの新規ＤＮＡの組み入れ）
（目的）
本発明のプロセスを用いて新規ＤＮＡをゲノムＤＮＡに組み入れる方法を詳述する。

（方法）
組換えベクターはｐＭＴＬ８２１５４骨格に基づいてデザインされた。コード配列のないことで選択されたＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）ゲノム内の領域から上流および下流の約８００ｂｐを担持する。Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）における発現を目的として、チオラーゼプロモーター配列に基づくプロモーターを２つの相同アーム間にクローニングし、挿入用遺伝子を、このプロモーターの下流に置換エレメントとしてクローニングすることとする。３’相同アームの５’末端において、ＷＴ細胞内で死滅ベクターにより認識されることとなる（ＩＭＲ内の）ＰＡＭ／プロトスペーサーエレメント配列は、ＰＡＭ配列内に単一のＳＮＰを担持する。これにより、死滅ベクターで細胞を形質転換するとき、組み入れられたＤＮＡを担持する細胞のみが確実に生存することとなる。

死滅ベクターは、ｐＭＴＬ８３２５１に基づいて構築されている。リーダー配列、および組み入れ部位として選択された遺伝子間領域内からデザインされたスペーサーエレメントに隣接する２つの直列配列を担持する。死滅ベクターはＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）において試験され、ＷＴ細胞を死滅させることが示されている。（このベクターでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を形質転換したところ、コロニーが回収されなかった。）

エレクトロポレーションを用い、当該組み入れベクターでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４（ＨＭＴ）を形質転換し、クロラムフェニコール耐性に基づいて形質転換細胞を選択している。３回またはそれ以上継代培養した後、死滅ベクターを導入して集団内のあらゆるＷＴ細胞を除去し、新規ＤＮＡをそのゲノムに組み入れた細胞のみを残すことになる。

ＳＥＱＩＤＮｏ：３＜２２３＞置換エレメントを有する組換えベクターの部分配列
ＳＥＱＩＤＮｏ：５＜２２３＞置換エレメントを有する組換えベクターの部分配列
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８＜２２３＞変異ＰＡＭ部位を有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ配列
ＳＥＱＩＤＮｏ：９＜２２３＞変異Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ配列
ＳＥＱＩＤＮｏ：２０＜２２３＞変異Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ配列
ＳＥＱＩＤＮｏ：２１＜２２３＞欠失を有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ配列

Claims

細菌ゲノム内の目標変異生成領域（ＩＭＲ）に変異を生成するためのプロセスであって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、且つＩＭＲが細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含み、プロセスが：
（ａ）前記細菌の集団を組換えベクターで形質転換するステップであって、組換えベクターが組換えエレメントを含み、組換えエレメントが：
（ｉ）変異を含む置換エレメント、および
（ｉｉ）置換エレメントに隣接する相同アームであって、細菌ゲノム内のＩＭＲの全体または一部を、置換エレメントを含むエレメントで置換することを促進することが可能な相同アームを含み、
組換えエレメントがＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを含まない、ステップ；
（ｂ）細菌集団内の１つまたはそれ以上の細菌において、それらの細菌のゲノム内のＩＭＲの全体または一部が置換エレメントを含むエレメントによって置換され、これによりＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーがそれらの細菌のゲノム内のＩＭＲから除去されるかまたはＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となる条件下で、細菌集団を培養するステップ；
（ｃ）前記集団におけるＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーが除去されていないか、ｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能となっていない任意の細菌のＩＭＲ内のＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としたｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な死滅ベクターで細菌集団を形質転換し、これによりｃｒＲＮＡによって認識されるそれらのＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーのＣＡＳエンドヌクレアーゼ誘導開裂と、これに続くそれらの細菌の死滅を促進するステップ；および
（ｄ）そのゲノムが変異を含む置換エレメントを含む１つまたはそれ以上の細菌を前記集団から選択するステップを含む、前記プロセス
請求項１に請求するプロセスであって、前記細菌が非高度組換え誘導細菌である前記プロセス。
請求項１または請求項２に請求するプロセスであって、ステップ（ｃ）に先立ち、１つまたはそれ以上の形質転換された細菌が分離され且つさらに継代培養されて１つまたはそれ以上のさらなる細菌集団を生成した後これを前記死滅ベクターで形質転換する前記プロセス。
請求項１から３のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記組換えエレメントにおいて：
（ｉ）前記置換エレメント；
（ｉｉ）前記上流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；
（ｉｉｉ）前記下流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；
（ｉｖ）前記上流相同アーム；または
（ｖ）前記下流相同アームに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
請求項４に請求するプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記組換えエレメントにおいて：
（ｉ）前記置換エレメント；
（ｉｉ）前記上流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップ；または
（ｉｉｉ）前記下流相同アームと前記置換エレメントのオーバーラップに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
請求項５に請求するプロセスであって、前記ＩＭＲ内の前記ＰＡＭ／プロトスペーサーが前記置換エレメントに対応するＤＮＡ領域内に存在する前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記死滅ベクターが：
（ｉ）Ｃａｓリーダーエレメント
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント
（ｉｉｉ）前記ＩＭＲ内の前記ＣＲＩＳＰＲＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とするｃｒＲＮＡを産生することの可能なＣａｓスペーサーエレメント；および
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含む前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記変異が１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入、または１つまたはそれ以上の置換、欠失または挿入の組み合わせである前記プロセス。
請求項８に請求するプロセスであって、前記変異が前記ＰＡＭ／プロトスペーサー内にある前記プロセス。
請求項８または請求項９に請求するプロセスであって、前記変異がＳＮＰである前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記細菌が内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記細菌がＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記細菌がグラム陽性菌である前記プロセス。
前述の請求項のうちいずれか１つに請求するプロセスであって、前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ目、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であるかまたは細菌がＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目またはＢａｃｉｌｌｕｓ属である前記プロセス。
請求項１４に請求するプロセスであって、前記細菌がＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃ．ｍａｇｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ｒｏｓｅｕｍからなる群から選択される前記プロセス。