KR20160113590A - 반추류의 사료의 효소 조성물의 이용 - Google Patents

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브누아 들로드
마티유 투르나
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에따블리스멍 제이. 수플레
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Abstract

반추류의 사료에서 효소 조성물의 사용.
본 발명은, 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로 발효된, 밀, 밀기울, 평지씨 케이크 및 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 주된 기질을 포함하는 효소 조성물로, 상기 효소 조성물이 (i) 조성물의 그램 당 500 AXC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 자일라나제 활성, (ii) 조성물의 그램 당 500 BGU와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성, 및 (iii) 조성물의 그램 당 50 CMC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성을 갖는 효소 조성물;과 더불어 반추류의 사료로의 그것의 사용에 대한 것이다.

Description

반추류의 사료의 효소 조성물의 이용{USE OF AN ENZYMATIC COMPOSITION IN THE FEED OF RUMINANTS}
본 발명은 사료의 비-의학적 식품 첨가물들의 첨가에 의한 반추류의 축산학적 성과의 개선에 대한 것이다.
반추류에서 유전적 진보는 매우 높은 축산학적 성과(performances)에 의하여 특징되는 가축들을 얻을 가능성을 주었다. 이것은 살찌는 것을 위한 소에서의 매우 높은 체중 증가들(1,500 g/동물/일(day)보다 많음) 및 매우 높은 우유 생산 레벨들(40 kg/암소(cow)/일(day)보다 많음)에 의하여 표현된다. 이들 성과들은 생산 요구성들 및 그것들의 유지를 커버하기 위하여 매우 기름진(rich) 사료 및 동물들에 의한 식품류의 더 큰 섭취를 요구한다.
반추류의 배급의 농축물 부분의 증가 및 섭취 레벨의 증가는 동물들의 물질 대사 효율의 감소 효과를 갖는다. 그 동물들은 영양소를 훨씬 덜 이용하는데, 수송(transit)이 가속화되고 그러므로 덜 효과적이기 때문이다. 그러므로 배급(ration)(사료(fodder) 및 농축물들)을 산물들(우유 또는 고기)의 변형 수율을 개선할 수 있는 영양 해법들을 찾을 중요한 필요가 존재한다.
반추류의 식량의 효소들의 이용이 선행기술에 기재되어 있는 반면, 반추류의 배급(ration)의 전체 소화율을 제한하는 것은 섬유들, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 소화율이라는 것이 알려져 있다 (Beauchemin et al. (2003) J. Anim. Sci. E.Suppl.2:E37-E47). 게다가, 박테리아 아밀라제들(US 2009/0324571) 또는 진균류 아밀라제들 (WO 03/068256)의 이용은 반추류에서 녹말의 소화율(digestibility)을 증가시키기 위하여 증가되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 본 작가들은 효소들의 보충에 대한 동물들의 반응에서의 중요한 변동성, 그러므로 반면 반추류에 대한 특이적 첨가제들을 발견할 필요, 및 반면, 반추류의 사료(feed)에서 다수 다당류의 소화율(digestibility)에서 개선을 타겟팅하는 첨가제들을 찾을 필요:셀룰로스 및 헤미셀룰로스를 인식한다. 이런 식으로 섭취되는 사료(fodder)의 소화율을 증가시키기 위하여 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase), β-글루카나제(glucanase), 펙티나제(pectinase), 만나제(mannanase), 및 α-갈락토시다제(galactosidase) 활성들을 포함하는 정제된 효소 복합체들을, 반추류의 사료(feed)에 첨가하는 것이 제안되었다 (WO 2009/0006362). 그러나, 농축된 식품류의 첨가가 반추류의 축산학적 성과들을 개선하는데 사용되는 주된 수단들인 반면, 이들 첨가제들은 사료(fodder)와만 사용되며, 농축된 식품류 (시리얼들, 부산물들, 압착 케이크들(pressed cakes))과는 사용될 수 없다.
그러므로 예를 들어 농축된 식품류를 포함하는 최적화된 사료(feed)를 먹이는, 동물들의 축산학적 성과(performances)을 개선하는 것이 가능한 반추류의 사료(feed)에의 새로운 첨가제들에 대한 중요한 필요가 있다.
효소들을 생산하는 미생물들의 다른 종류들의 이용이 반추류의 축산학적 성과를 개선하기 위하여 제안되어 왔다 (Beauchemin et al. (2004) Can. J. Anim Sci. 84:23-36). 이들 효소들의 생산을 이끄는 발효가 일단 완료되면, 효소들은 일반적으로 생산하는 미생물들로부터 그리고 발효 잔여물(residues)로부터 분리된다. 그러나, 동물들에서 관찰된 효과들에서 강한 이질성(heterogeneity)을 이끄는, 그리고 그러므로 농부를 위한 그것들의 이점을 제한하는, 사용된 배양 조건들, 사용된 기질, 및 사용된 미생물의 종류에 따라, 생산된 효소들의 활성들 및 종류들이, 매우 다르다. 특히, 효소적 활성들의 효율적인 조합의 사용은, 액체-상태 발효에서 유전적으로 변형된 생물들에 의하여 생산된 효소들로 특히, 결정하기 어렵다. 효소들을 투여하는 방법은 또한 효소들이 액체 형태로 사용될 때도 문제인데, 왜냐하면 그것들이 반추위(rumen)에서 불활성화되고 급히 걸러지기 때문이다.
본 발명은 곡물(cereal)들의 고체-상태 발효에 의하여 및/또는 곡물(cereal) 부산물의 및/또는 섬질(filamentous) 진균인 아스퍼질러스(Aspergillus) 섹션(section) 니그리(Nigri) 타입, 더욱 특히, 아스퍼질러스(Aspergillus) 터빈겐시스(tubingensis) 타입으로 지방종자(oilseed) 부산물의, 정한 레벨들에서, 셀룰라제, 자일라나제 및 β-글루카나제 효소적 활성들을 보이는 다중(multi)-효소 조성물을 다시만들 수 있게 얻는 것이 가능하고, 이 효소 조성물은, 그것이 반추동물의 사료(feed) 배급(ration)으로 제공될 때, 그것이 무엇이든간에, 그것의 축산학적 성과를 개선하는 것, 특히, 우유 생산, 식품 효율, 소비 지수(consumption index), 체중 증가, 증가하는 반추 활성, 섭취하는 사료(fodder)의 용량(capability)을 증가시키는 것, 농축물들 및/또는 사료(fodder)의 소화율을 증가시키는 것 및 메탄의 생산을 감소시키는 것이 가능하다는, 본 발명자들에 의한 예상하지 않은 발견이 원인이다.
이런 식으로 본 발명은 아스퍼질러스(Aspergillus) 섹션(section) 니그리(Nigri), 더욱 특히 아스퍼질러스(Aspergillus) 터빈겐시스(tubingensis)의 균주와 발효되는, 밀(wheat), 밀기울(wheat bran), 평지씨(rapeseed) 케이크(cake), 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 주된 기질을 포함하는 효소 조성물에 대한 것이고, 상기 효소 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 조성물의 그램(gram) 당 500 AXC과 동일하거나 또는 그보다 큰 자일라나제 활성,
(ii) 조성물의 그램 당 500 BGU와 동일하거나 또는 더 큰 β-글루카나제 활성, 및
(iii) 조성물의 그램 당 50 CMC와 동일하거나 또는 더 큰 셀룰라제 활성.
그것은 나아가, 서브-분기군(sub clade) A. 터빈겐시스의 균주로, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스 또는 아스퍼질러스(Aspergillus) 네오나이거(neoniger)의 균주로, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로, 적어도 발효 산물이 하기 효소 활성의 최소 값들을 보일 때까지, 밀, 밀기울, 평지씨 케이크(cake), 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 주된 기질의 고체-상태 발효의 단계를 포함하는, 이 효소 조성물의 제조 방법에 대한 것이다:
(i) 조성물의 그램 당 500 AXC과 동등하거나 그보다 더 큰 자일라나제 활성,
(ii) 조성물의 그램 당 500 BGU과 동등하거나 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성, 및
(iii) 바람직하게는 발효가 배양 배지에서 첫 번째 포자들(spores)이 나타나자마자 멈추는, 조성물의 그램 당 50 CMC과 동등하거나 그보다 더 큰 셀룰라제 활성.
그것은 또한 이 효소 조성물을 포함하는 반추류의 사료(feed)를 위한 첨가제에 대한 것이다.
본 발명의 목적은 또한 반추류를 먹이기 위한 프리믹스(미리 섞은 것(premix)) 또는 사료(feed) 조성물들의 성분(ingredient), 특히 비-의료적 성분으로서, 이 첨가제의 사용이다.
그것은 또한 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)과 관련하여, 이 첨가제 또는 이 프리믹스의 효과적인 양을 포함하는, 반추류를 위한, 보충된 사료(feed) 조성물과 함께, 이 첨가제를 포함하는, 반추류를 먹이기 위하여, 프리믹스를 다룬다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)로 정의된 프리믹스 또는 앞서 정의된 대로 보충제를 혼합하는 단계를 포함하는, 반추류를 위한 보충된 사료(feed) 조성물을 제조하는 방법에 대한 것이다.
본 발명은 또한 반추동물의 축산학적 성과를 개선하기 위하여, 앞서 정의한 대로, 사료(feed) 조성물의 또는 앞서 정의된 대로 프리믹스의, 앞서 정의된 대로 첨가제의, 앞서 정의된 대로 효소 조성물의 사용에 대한 것이다.
마지막으로, 그것은 앞서 정의된 대로 사료(feed) 조성물의 또는 앞서 정의된 대로 프리믹스의, 앞서 정의된 대로 첨가제의, 앞서 정의된 대로 효소 조성물의 효과적인 양을 섭취하도록 된 반추동물의 축산학적 성과를 개선하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
반추류
본 발명의 맥락에서, 용어 << 반추류 >>는 사료(feed)의 섭취 후 사료(feed)를 다시 씹는 것을 통하여 소화가 완전히 또는 부분적으로 일어나는, 임의의 복수 위(polygastric)의 초식성(herbivorous) 포유동물을 지정한다.
반추류의 소화관은 4개 구획들로 구성된다: 반추위(rumen), 벌집위(reticulum), 겹주름위(omasum) 및 주름위(abomasum). 이들 4개 구획들 중, 반추위(rumen)가 가장 중요한데, 대부분의 영양소가 거기에서 소화되기 때문이다. 그 안의 소화는 셀룰로스 가수분해(cellulolysis), 헤미셀룰로스 가수분해(hemicellulolysis), 단백질 가수분해(proteolysis), 산의, 메탄의, 생산, 비타민들의 합성 등에 원인이 되는 중요하고 다양한 미생물상(microbial flora)을 포함하는 발효 공정에 대응한다. 반추위(ruminal) 군(flora)의 원시부터의 역할 때문에, 반추류의 소화적 생리학은 그러므로, 군(flora)이 두번째 역할을 하는 단위(monogastric) 동물들의 그것과는 상당히 다르다.
이러한 동물들은 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어 소(bovine) 동물들, 양(ovine) 동물들, 염소(caprine) 동물들, 사슴과 동물들(cervids) 및 낙타과 동물들(camelids)를포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 배경 내에서, 반추동물은 소(bovine) 동물이다.
<<소(bovine) >> 또는 <<소 동물>>에 의하여 여기에서 가축의 몇몇 중요한 종들을 포함하는 소과(Bovidae)의 아과(sub-family)가 의미된다. 소 동물들은 특히 암소들(cows), 특히 젖소들(dairy cows), 수유용 암소들(suckler cows), 어린 암소들(heifers), 송아지들(calves), 막 젖 뗀 새끼들(weanlings), 거세한 숫송아지들(bullocks), 사육된(raised) 소고기(beef), 살찌운(fattening) 소고기, 황소들(bulls), 버팔로들(buffalos), 야크들(yaks), 큰 들소들(gaurs) 및 들소들(bantengs)을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서 사용된 반추동물이 소 동물일 때, 그것은 암소들(cows), 특히 젖소들(milk cows), 송아지들(calves), 막 젖 뗀 새끼들(weanlings), 우유를 먹인 송아지들(milk-fed calves), 사육된 소고기 및 살찌운 소고기로부터 선택된다.
<< 양(ovine) >>에 의하여 여기에서 양속(Ovis)의 반추동물 초식동물(herbivores)이 의미된다. 양 속 동물들은 특히 야생양(wild sheep), 양(sheep), 암양들(ewes), 어린 암양들(ewes) 및 새끼양들(lambs)을 포함한다.
<< 염소(caprine) 동물 >>에 의하여, 여기에서 벌호랑하는소(Capra) 속(genus)의 반추동물 초식동물(herbivores)이 의미된다. 염소 동물들은 특히, 염소들(goats), 숫염소들(billy goats), 어린 염소들(goats) 및 아이벡스들(ibexes)을 포함한다.
<< 사슴과 동물(cervid) >>에 의하여, 여기에서 가지진 뿔(antler)을 가진, 사슴과(Cervidae)로부터의 반추류가 의미된다. 사슴과 동물들(cervids)은 특히, 수사슴들(stags), 새끼 사슴들(fawns), 어린 수사슴들(young stags), 암사슴들(hinds), 새끼사슴들(fawns), 로벅들(roebucks), 벅들(bucks), 암사슴들(does), 순록(reindeer), 다마사슴(fallow deer), 암사슴들(does) (다마사슴(fallow deer)의 암컷들) 및 엘크들(elks)을 포함한다.
<< 낙타과 동물들(camelids) >>에 의하여, 여기에서 낙타과(Camelidae)의 우제류(artiodactyla) 포유류들이 의미된다. 낙타과 동물들은 특히 단봉낙타들(dromedaries), 낙타들(camels), 암컷낙타들(she-camels), 리마들(llamas) 및 알파카들(alpacas)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락 내에서, 반추동물은 가축 동물이다.
효소 조성물
본 발명에 따른 효소(enzymatic) 조성물은 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주, 바람직하게는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 발효된, 밀, 밀기울, 평지씨 케이크(cake), 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된, 주된 기질로 구성되거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 이를 포함하며, 상기 효소 조성물은 하기를 보인다:
(i) 조성물 그램 당 500 AXC과 동등하거나 또는 그보다 큰 자일라나제 활성,
(ii) 조성물 그램 당 500 BGU와 동등하거나 또는 그보다 큰 β-글루카나제 활성, 및
(iii) 조성물 그램 당 50 CMC와 동등하거나 또는 그보다 큰 셀룰라제 활성.
상기 효소 활성들은 건조 조성물의 그램 당 표현된다.
<< 자일라나제 >>에 의하여, 여기에서, 선형 다당류 β-1,4-자일란(xylane)을 자일로스로 분해하는, 특히 이에 의하여 헤미셀룰로스를 분해하는, International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)의 효소들의 명명법으로부터 EC 3.2.1.8 클래스(class)의 효소가 의미된다.
자일라나제 활성을 측정하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 보통, 활성을 입증하기 위하여, 발색단(chromophore), Remazol Brillant Blue R에 결합된 용해성 귀리들 자일란의 용액 상에 작용하는 효소 용액을 만들고, 효소 용액(solution)의 작용에 의하여 방출된 올리고머들을 측정하는 것이 가능하다. 올리고머들은 에탄올로 침전 후 용해성 분획에서 발견된다. 이 방법에서 사용된 반응 배지는 바람직하게는, 아세테이트 버퍼 0.4 M, pH 4.70에 희석된 50 μL의 효소 용액, 귀리 아조(azo)-자일란(xylan) 용액 (MEGAZYME) 10 g/L 의 130 μL으로 구성된다. 반응은 바람직하게는 31℃에서 20 분 동안 수행된다. 반응은 보통 500 μL의 96% 에탄올의 첨가에 의하여 중지된다. 원심분리(10 분, 3,000 rpm으로 20℃에서) 후 수득되는 상청액의 흡광도(optical density)는 590 nm에서 읽어졌다. 그 다음에 자일라나제 활성 단위(unit) (AXC)는 에탄올에서 침전될 수 없어 상청액의 흡광도가 590 nm에서 0.93인, Remazol Brillant Blue R 자일란, 올리고머들의 용액으로부터, 방출되는, 30℃에서 4.70의 pH에서, 1 unit/mL으로 희석되는 효소의 양으로 정의될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 효소 조성물은 조성물의 그램 당 500 AXC 보다 더 큰 자일라나제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 750 AXC보다 더 큰 자일라나제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 1,000 AXC보다 더 큰 자일라나제 활성을, 가장 바람직하게는 조성물의 그램 당 2,000 AXC 와 동일하거나 또는 더 큰 자일라나제 활성을 보인다.
<< β-글루카나제 >>에 의하여 여기에서 글루칸(glucan)을 절단(clealve)하는, International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)의 효소들의 명명법으로부터 클래스 EC 3.2.1.6 의 효소가 의미된다. β-글루카나제들은 특히 캘로스(callose) 또는 컬드란(curdlan)과 같은, β-1,3-글루칸들을 절단하는 β-1,3-글루카나제, β-1,6-글루칸들을 절단하는 β-1,6-글루카나제, 셀룰라제, 자일로글루칸(xyloglucan)에 특이적인 엔도(endo)-β-1,4-글루카나제 또는 자일로글루칸에 특이적인 엑소(exo)-β-1,4-글루카나제를 포함한다.
β-글루카나제 활성을 측정하는 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다. 보통, 이 활성을 입증하기 위하여, 효소 용액을, 발색단, Remazol Brillant Blue R에 결합된 보리 β-글루칸의 용액 상에 반응하게 만드는 것이 가능하다. β-글루카나제 활성들에 의한 이 기질의 pH 4.8에서의 가수분해는, 에탄올로 침전될 수 없고, 그 농도가 590 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가되는, 발색단에 결합된 올리고머들을 방출한다. 방법에서 사용되는 반응 배지(medium)은 바람직하게는 pH 4.60 0.1 M 아세테이트 포스페이트 버퍼에서 희석된 50 μL의 효소 용액, 0.1 M 아세테이트 포스페이트 희석 버퍼 에서 4/5번째(th)로 희석되고 pH 4.75로 조정된, 아조(azo)-보리(barley) 글루칸 (MEGAZYME)의 용액 130 μL으로 구성된다. 바람직하게는 반응은 20 분 동안 31℃에서 수행된다. 반응은 보통 620 μL의 침전 용액 (96% 에탄올 1 리터에 30 g의 소듐(sodium) 아세테이트 트리하이드레이트(trihydrate) 및 3 g의 징크(zinc) 아세테이트)를 첨가함으로써 중단된다. 원심분리 (20℃에서 3,000 rpm 으로 10 분) 후 수득된 상청액의 흡광도는 590 nm에서 읽어졌다. 그 다음, β-글루카나제 활성의 단위(BGU)는 분석 조건들(30℃ 및 pH 4.8) 하, mL 당 1 단위(unit)의 농도로 희석된, 에탄올에서 침전될 수 없는 Remazol Brillant Blue R에 결합된 보리 β-글루칸의 올리고머들을 방출하는 효소의 양으로 정의될 수 있어, 상청액의 흡광도는 590 nm 에서 0.9이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 효소 조성물은 조성물의 그램 당 500 BGU보다 더 큰 β 글루카나제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 600 BGU 보다 더 큰 β 글루카나제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 1,000 BGU 보다 더 큰 β 글루카나제 활성을, 가장 바람직하게는 조성물의 그램 당 1,500 BGU와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β 글루카나제 활성을 보인다.
<< 셀룰라제 >>에 의하여 여기에서 β1-4에 결합된 글루코스들의 폴리머, 곡물들의 셀룰로스, 리케닌(lichenin) 및 β-글루칸들을 절단하는 International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)의 효소들의 명명법의 클래스 EC 3.2.1.4로부터의 효소가 의미된다. << 셀룰라제들 >>은 특히 엔도(endo)-1,4-β-D-글루카나제, β-1,4-글루카나제, β-1,4-엔도글루칸(endoglucane) 하이드롤라제(hydrolase), 셀룰라제 A, 셀룰로신(cellulosin) AP, 엔도글루카나제(endoglucanase) D, 알칼리 셀룰라제, 셀룰라제 A 3, 셀루덱스트리나제(celludextrinase), 9.5 셀룰라제, 아비셀라제(avicelase), 판셀라제(pancellase) SS 및 1,4-(1,3,1,4)-β-D-글루칸(glucane) 4-글루카노하이드롤라제(glucanohydrolase)를 포함한다.
셀룰라제 활성을 측정하는 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다. 보통 이 활성을 입증하기 위하여, 효소 용액을, 발색단, Remazol Brillant Blue R에 결합되고 부분적으로 단량체화된(depolymerized) 카르복시메틸(carboxymethyl) 셀룰로스의 용액 상에 반응하게 만드는 것이 가능하다. 셀룰라제 활성들에 의한 이 기질의 pH 4.5에서의 가수분해는 에탄올로 침전될 수 없고, 발색단에 결합된 올리고머들을 방출하고, 그것의 농도는 590 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가된다. 이 방법에서 사용되는 반응 배지(medium)은 바람직하게는 0.1 M 아세테이트 버퍼, pH 4.60에서 희석된 효소 용액 100 μL, pH 4.5 및 20 g/L에서 아조-카르복시메틸-셀룰로스 용액 (Megazyme 90504a) 100 μL 로 구성된다. 반응은 바람직하게는 41℃에서 10 분 동안 수행된다. 반응은 보통 침전 용액 (96% 에탄올 1 리터에 40 g의 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 및 4 g의 징크 아세테이트) 500 μL을 첨가함으로써 중단된다. 원심분리 (20℃에서 3,000 rpm으로 10 분) 후 수득되는 상청액의 흡광도는 590 nm에서 읽어진다. 그 다음, 카르복시메틸셀룰라제 활성의 단위 (CMC)는 분석 조건들(41℃ 및 pH 4.5) 하 mL 당 1 단위의 농도로 희석된, 침전 용액으로 침전될 수 없는 Remazol Brillant Blue R에 결합된 부분적으로 단량체화된 카르복시메틸 셀룰로스의 올리고머들을 방출하는 효소의 양으로 정의될 수 있고, 상청액의 흡광도는 590 nm에서 1.0이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 효소 조성물은 조성물의 그램 당 50 CMC보다 더 큰 셀룰라제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 75 CMC보다 더 큰 셀룰라제 활성을, 더욱 바람직하게는 조성물의 그램 당 120 CMC보다 더 큰 셀룰라제 활성을, 가장 바람직하게는 조성물의 그램 당 180 CMC과 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성을 보인다.
특히 선호되는 예에서, 본 발명에 따른 효소 조성물은 조성물의 그램 당 2,000 AXC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 자일라나제 활성, 조성물의 그램 당 1,500 BGU과 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성 및 조성물의 그램 당 180 CMC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성을 보인다.
발명에 따른 효소 조성물은 상기 자일라나제, β-글루카나제 및 셀룰라제 활성들이 아닌 효소 활성들을 더 포함할 수도 있지만, 매우 낮은 레벨들이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 효소 조성물은 임의의 펙티나제(pectinase), 만난나제(mannanase), 아밀라제 및/또는 α-갈락토시다제(galactosidase) 활성이 없다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 효소 조성물은 임의의 페룰산(ferulic acid) 에스테라제(esterase) 활성이 없다.
<<임의의 효소 활성 X가 없는 조성물>>에 의하여, 여기에서 효소 활성을 검출하는 현재의 기술로 효소 활성 X가 검출불가능한 조성물이 의미된다. 즉, 임의의 효소 활성 X이 없는 조성물은 효소 활성 X을 갖는 임의의 단백질을 포함하지 않거나 또는 (예를 들어, 단백질체학 기술에 의하여 결정되는) 매우 낮은 농도로 효소 활성 X를 갖는 단백질들을 포함하여, 대응하는 효소 활성 X가 효소 활성을 검출하는 현재의 기술들로 측정될 수 없다.
기질, 특히 주된 기질의 발효로부터 유래하는 상기 자일라나제, β-글루카나제 및 셀룰라제 활성들은 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로, 본 발명에 따른 효소 조성물에 포함됐다.
<<주된 기질>>에 의하여 여기에서, 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 발효 동안 사용되는 기질의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 를 대표하는 기질이 의미된다.
이 기질, 특히 이 주된 기질은 밀, 밀기울, 평지씨 케이크(cake), 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 기질은 밀기울, 평지씨 케이크(cake) 및 그 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 기질, 특히 주된 기질은 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물이다. 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)는 혼합물 안에서 10/90 (다시 말해서 90%의 평지씨 케이크에 대하여 10%의 밀기울)부터 90/10 (다시 말해서 10%의 평지씨 케이크에 대하여 90%의 밀기울)까지, 바람직하게는 15/85 (다시 말해서 85%의 평지씨 케이크에 대하여 15% of 밀기울) 내지 80/20 (다시 말해서 20%의 평지씨 케이크에 대하여 80%의 밀기울), 바람직하게는 20/80 (다시 말해서 80%의 평지씨 케이크에 대하여 20%의 밀기울)부터 70/30 (다시 말해서 30%의 평지씨 케이크에 대하여 70%의 밀기울)까지, 바람직하게는 25/75 (다시 말해서 75%의 평지씨 케이크에 대하여 25%의 밀기울)부터 60/40 (다시 말해서 40%의 평지씨 케이크에 대하여 60%의 밀기울)까지, 더더욱 바람직하게는 20/80 (다시 말해서 80%의 평지씨 케이크에 대하여 20%의 밀기울)부터 50/50 (다시 말해서 50%의 평지씨 케이크에 대하여 50%의 밀기울)까지, 더더욱 바람직하게는 30/70 (다시 말해서 70%의 평지씨 케이크에 대하여 30%의 밀기울)부터 50/50 (다시 말해서 50%의 평지씨 케이크에 대하여 50%의 밀기울)까지의 범위의 중량(mass) 비로 존재할 수 있다.
아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 발효 동안 사용되는 기질은:
- 대두(soybean) 케이크들, 옥수수(maize) 싹(germ) 케이크들, 해바라기 케이크들, 파미스트(palmist) 케이크들, 아마(flax 케이크들, 땅콩(groundnut) 케이크들, 코코아 케이크들, 코프라(coprah) 케이크들, 목화(cotton) 케이크들, 포도씨(grape pip) 케이크들, 올리브 찌꺼기(pomace), 카멜린(cameline) 케이크들, 자트로파(jatropha) 종자 케이크들 또는 참깨(sesame) 케이크들과 같은 지방종자(oilseed) 케이크들;
- 밀가루(flour), 샤프들(sharps), 브라운(brown) 리몰딩(remolding), 겨(bran), 글루텐 사료(feed), 글루텐 밀(meal), 양조장들(distilleries)/에탄올 공장들(plants)로부터 건조된 낟알들(grains), 양조장들/에탄올 공장들로부터의 건조되고 용해성인 낟알들, 맥주양조업자의 낟알들, 옥수수(corn)의 진드(ginned) 이어들(ears), 귀리, 밀, 보리, 라이밀(triticale), 쌀, 호밀 또는 옥수수(maize)의 지근들(rootlet), 싹들 또는 밀(meal)과 같은, 밀기울 외 곡물(cereal) 부산물들:
- 아미노산들, 콩(soya) 단백질들의 농축물들, 감자 단백질들의 농축물들, 밀 글루텐 또는 옥수수(maize) 글루텐과 같은 유기 질소 소스들;
- 요소(urea), 암모니아, 암모늄 염들 또는 폐액(stillage)과 같은 무기 질소 소스들;
- 소듐, 포타슘, 염소, 칼슘 또는 인(phosphorus) 미네랄 염들; 및/또는
- 철, 구리, 아연, 망간, 코발트, 요오드 또는 셀레늄과 같은 미량 원소들
을 추가적인 기질로서 더 포함할 수 있다.
바람직하게는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 발효 동안 사용되는 기질은 지방종자 케이크들, 특히 옥수수(maize) 싹(germ) 케이크들을 추가적인 기질로서 더 포함할 수 있다.
앞서 정의된 대로의 기질은, 앞서 정의된 대로 자일라나제, β-글루카나제 및 셀룰라제 활성들을 얻기 위하여, 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로, 바람직하게는 아스퍼질러스 섹션 니그리 분기군(clade) A. 나이거(niger)의 균주로, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 터빈겐시스 또는 아스퍼질러스 네오나이거의 균주로, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 발효된다. 대체의 예에서, 앞서 정의된 대로의 기질은, 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주가 아닌 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로 발효된다. 발효는 담근(immersed) 발효 (또는 액체-상태 발효), 고체-상태 발효 또는 고체/액체-상태 발효일 수 있다. 바람직하게는, 발효는 고체-상태 발효이다.
본 발명의 맥락에서, <<고체-상태 발효>>는 에너지 및 탄소원으로서 사용될 수 있는 불용성 기질들 상에, 비활성(inert) 기질들 상에, 또는 습한 고체 기질들 상에, 미생물들의 배양으로서 정의된다. 발효 공정은 기질 입자들 사이의 공간의 유리수의 부존재 또는 준(quasi)-부존재에서 일어난다. 반면, 여기에서 <<담근(immersed) 발효>>는 영양소 및 미생물들 둘 다 수성 배지에 담겨 있는, 미생물들의 배양을 가리킨다.
바람직하게는, 앞서 정의된 대로 기질은 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주로 고체-상태 발효 에 의하여 발효된다.
<< 아스퍼질러스 섹션 니그리 >>에 의하여 5 개의 분기군들(clades)로 분류되는, Varga et al. (2011) Studies in Mycology 69:1-17에 기재된 바와 같이, 보통 26 개 종을 포함하는, 그룹 A. 나이거로 전에 지정된 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 섹션이 의미된다: A. 네오나이거(neoniger), A. 코스타리캐넨시스(costaricaensis), A. 바덴시스(vadensis), A. 유칼립티콜라(eucalypticola), A. 파이페리스(piperis), A 아시두스(acidus), A. 터빈겐시스, A. 아와모리(awamori), A. 나이거 및 A. 브라질리엔시스( brasiliensis) 종들을 포함하는 분기군(clade) A. 나이거; A. 이베리쿠스(ibericus), A. 슬레로티카르보나리우스( sclerotiicarbonarius), A 카르보나리우스(carbonarius) 및 A. 슬레로티오니거(sclerotioniger) 종들을 포함하는 분기군(clade) A. 카르보나리우스(carbonarius)); A. 엘립티쿠스(ellipticus) 및 A. 헤테로모르퍼스(heteromorphus) 종들을 포함하는 분기군(clade) A. 헤테로모르퍼스(heteromorphus); A. 호모모르퍼스(homomorphus) 종들을 포함하는 분기군(clade) A. 호모모르퍼스(homomorphus); 및 A. 피지엔시스(fijiensis), A. 아쿨리아투스(aculeatus), A. 아쿨리아티누스(aculeatinus), A. 우바룸(uvarum), A. 인돌로게누스(indologenus), A. 자포니쿠스(japonicus) 및 A. 비올라세오퍼스커스(violaceofuscus) 종들을 포함하는 분기군(clade) A. 아쿨리아투스(aculeatus). 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에 사용되는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 분기군(clade) A. 나이거의 균주이다. 특정 예에서, 본 발명의 범위 내에 사용되는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 A. 터빈겐시스의 균주가 아닌 분기군(clade) A. 나이거의 균주이다.
앞서 지적한 바와 같이, 분기군(clade) A. 나이거는 3 서브(sub) 분기군들(clades)로 분류되는 10 종들을 포함한다: A. 네오나이거(neoniger), A. 코스타리카엔시스(costaricaensis), A. 바덴시스(vadensis), A. 유칼립티콜라(eucalypticola), A. 파이페리스(piperis), A 아시두스(acidus) 및 A. 터빈겐시스 종들을 포함하는 서브-분기군 A. 터빈겐시스; A. 아와모리(awamori) 및 A. 나이거 종들을 포함하는 서브-분기군 A. 나이거; 및 A. 브라질리엔시스(brasiliensis) 종을 포함하는 서브 분기군(sub clade) A. 브라질리엔시스(brasiliensis). 바람직하게는, 본 발명의 범위 내 사용되는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 서브-분기군 A. 터빈겐시스의 균주이다. 특정 예에서, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 A. 터빈겐시스의 균주가 아닌 서브-분기군 A. 터빈겐시스의 균주이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 아스퍼질러스 터빈겐시스 또는 아스퍼질러스 네오나이거의 균주이고, 더더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주이다.
<< 아스퍼질러스 터빈겐시스 >>에 의하여, 여기에서 La Cellule (1934) 43:245-247에 기재된 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리(Mosseray) 균주인 특징적 균주, 아스퍼질러스(Aspergillus) 섹션(section) 니그리(nigri)의 일원이 의미된다. 그것은 많은 복합 자연 기질들 상에서 자랄 수 있고, 부패유기성이며(saprophytic) 땅에 아주 흔한, 검은 분생자(conidia)를 생산하는 섬질(filamentous) 진균이다. 아스퍼질러스 터빈겐시스는 작업 중 생물학적 제제들과 관련된 위험들로부터 노동자들을 보호하는 것에 관련된 Directive 2000/54/EC의 부속문서(annex) III의 병원체들의 리스트에 나타나지 않는다.
아스퍼질러스 터빈겐시스 균주들의 예들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리(Mosseray) ATCC MYA-81, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-83, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-84, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-4879, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-77, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-78, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-79, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-82, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC MYA-80, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC 10550, 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC 76608 및 아스퍼질러스 터빈겐시스 모세리 ATCC 201255을 포함한다.
"아스퍼질러스 네오나이거(neoniger)"에 의하여, 여기에서 특징적인 균주가 Varga et al. (2011) Studies in Mycology 69:1-17에 기재된 아스퍼질러스 네오나이거 바르가(Varga) 균주인, 아스퍼질러스 섹션 니그리의 일원이 의미된다.
아스퍼질러스 네오나이거의 균주들의 예들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 아스퍼질러스 네오나이거 CBS 115656 또는 NRRL 62634 및 아스퍼질러스 네오나이거 CBS 115657를 포함한다.
바람직하게는, 앞서 정의된 대로 기질은 저온살균(pasteurized) 또는 살균(sterilize)되기 위하여 발효 전 전처리된다. 열처리는 예를 들어 오토클레이브에서 가열로 구성될 수 있다. 이런 식으로 기질은 90 및 125℃ 사이, 바람직하게는 95 및 115℃ 사이에 포함되는 온도에서, 더욱 바람직하게는 105℃의 온도에서, 15 내지 45 분 동안, 바람직하게는 20 내지 40 분 동안, 더욱 바람직하게는 35 분 동안 오토클레이브될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 앞서 정의된 대로 기질은 건조물의 40 내지 100% , 건조물의 바람직하게는 45 내지 90%, 바람직하게는 건조물의 50부터 80%까지, 바람직하게는 건조물의 55부터 70%까지, 건조물의 바람직하게는 60%을 이루기 위하여 미리-적셔진다(humidified).
유리하게, 열 처리의 저온살균 효과를 개선하고 원하는 발효를 시작하기 위하여, 4.8부터 6.2까지, 바람직하게는 5.0부터 6.0까지, 바람직하게는 5.2부터 5.8까지, 가장 바람직하게는 5.6까지의 범위에서 가습(humidification) 동안 pH를 조정하는 것이 가능하다.
앞서 정의된 대로 기질의 접종(inoculation)은 임의의 적절한 접종원(inoculum)으로 수행될 수 있다. 당업자는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 선택된 균주로부터 적절한 접종원을 준비하는 많은 방법들을 알고 있다. 접종 투여량(dose)은 유리하게는 기질의 처음 건조물의 그램 당 적어도 1×107 포자들(spores)이다.
발효의 시작 시 기질의 물 함량은 물 및 기질의 총 중량(mass)의 40 및 50% 사이, 바람직하게는 45% 로 조정되고, 바람직하게는 발효 동안 대체로 이 간격으로, 예를 들어 배지의 물의 손실을 보상하기 위하여 주기적으로 물의 첨가와 함께 진행하여, 유지된다. "대체로 유지된다"는 표현은 습도 함량이 발효 말에 또는 습도 레벨의 두 연속적인 조정들 사이의 상대적으로 짧은 기간 동안 40-50% 간격으로부터 5 단위들 %를 벗어난 값을 갖게 웬만큼 괜찮다는 것을 의미한다. 기질의 습도 레벨은 정말로 진균 성장에 따라 생기는 온도의 증가의 효과 하 증발에 의하여 발효 동안 감소하는 경향을 가질 수 있다.
발효는 임의의 적절한 반응기에서 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 반응기들의 예들은 Agro-Food-Industry Hi-Tech (Mai-Juin 1997, pages 39-42)에서 발표된 A. Durand et al.의 기사에 기재된 것들이다.
발효는 1부터 3 일(days), 바람직하게는 30부터 60까지의 시간(hours), 더욱 바람직하게는 48 시간 동안의 기간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는 발효는 배양 배지 내 첫 번째 포자들의 출연 시 멈춰지는데, 이는 포자들의 존재가 그것들의 휘발성(volatile) 특성 때문에 동물들이 섭취하는 것을 방해할 수 있기 때문이다.
배지의 온도는 바람직하게는 28 및 38℃ 사이, 바람직하게는 30 및 36℃ 사이, 더욱 바람직하게는 33℃까지로 유지된다.
바람직하게는, 발효는 호기 조건들 하, 그리고 바람직하게는 어둠에서 수행된다.
이로써 얻어지는 발효 산물은 습한 고체 산물이다. 그것은 효소 활성에 영향을 미치지 않도록 바람직하게는 온화한 온도에서, 예를 들어 45℃ 미만에서, 탈수(dehydrate)되거나 또는 건조한 것일 수 있다. 건조 또는 탈수(dehydration)는 유동층(fluidized bed), 동결건조(freeze-drying), 증열(steaming), 진공 증열 또는 지오드레이션(zeodration)과 같은, 당업계에 잘 알려진 임의의 적당한 기술로 수행될 수 있다.
그것은 바람직하게는 습한 상태에서, 낮은 온도, 예를 들어 -20℃에서 동결될 수 있다.
발효 산물은 또한 물에서 추출되고 당업계에 잘 알려진 임의의 적절한 기술에 의하여 액체 형태로 회수될 수 있다. 발효 산물의 추출은 당업계에 잘 알려진 임의의 기술, 특히, 수용액에서의 추출, 알코올 용액에서의 추출, 용제들(solvents)로 추출, 고압 균질화(homogeneization), 초임계 추출, 유동층(fluidized bed)들로 추출, 밀링(milling), 극저온(cryogenic) 밀링(milling), 감압(decompression), 캐비테이션(cavitation), 버블링(bubbling), 수지들 상 흡착, 초음파로 추출 또는 제올라이트들에 의하여 수행될 수 있다. 액체 형태의 효소(들)은 그 다음에 당업계에 잘 알려진 임의의 기술, 특히, 원심분리, 여과, 한외여과, 크로마토그래피, 막 이용 또는 침전에 의하여 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 효소 조성물은 그것의 첨가제에의 이용을 위한 임의의 적절한 형태일 수 있다. 그것은 바람직하게는 비-추출된, 크루드(crude) 형태이다.
<<크루드(crude) 형태>>에 의하여, 여기에서 앞서 정의된 대로 효소 활성들, 발효된 기질 및 진균 아스퍼질러스 섹션 니그리, 특히 진균 아스퍼질러스 터빈겐시스를 포함하는 발효 배지가 의미된다. 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주에 의하여, 더욱 특히 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주에 의하여 기질의 발효 후 발효 배지는 특히 본 발명에 따른 효소 조성물에서 직접적으로 사용되기 전에 탈수(dehydrated) 및/또는 밀링(milled)될 수 있다. 이 밀링은 원자화(micronization), 잘라내며(shearing) 밀링, 충격(impact)에 의한 밀링, 동결분쇄(cryomilling) 또는 붕해(crumbling)와 같은, 당업계에 잘 알려진, 임의의 적절한 기술에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 효소 조성물는 더 표준화될 수 있다. 이러한 표준화는 유리하게 사료들(feedstuffs)을 제조하는 단계 동안 그것의 이용을 가능하게 하고 조성물의 좋은 균질성을 보장하는 가능성을 준다.
반추류를 먹이기 위한 첨가제
본 발명은 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 바와 같은 효소 조성물으로 구성되는, 본질적으로 구성되는, 또는 포함하는, 상기 <<반추류>> 섹션에서 정의된 바와 같은, 반추류를 위한 사료(feed)를 위한, 첨가제, 바람직하게는 비-의료적 첨가제에 대한 것이다.
<<첨가제>>에 의하여, 여기에서 동물에 의하여 섭취되도록 주어지는, 또는 동물의 사료(feed) 식이(diet)에, 사료(feed) 배급(ration)에, 또는 사료(feedstuff)에 첨가될 수 있는 성분 또는 성분들의 혼합물이 의미된다.
본 발명에 따른 첨가제는 프로테아제들(proteases), 피타제들(phytases), 만나나제들(mannanases), 아밀라제들(amylases), 알파-갈락토시다제들(galactosidases), 페룰산(ferulic acid) 에스테라제들 및/또는 펙티나제들(pectinases)과 같은 추가적인 효소들과 더불어, 생리학적으로 허용가능한 담체들, 안정화제들(stabilizers), 항산화제들, 또는 방부제들과 같은 추가적인 성분들을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 첨가제는 특히 액체, 분말 또는 그래뉼(granule) 형태인, 그것의 그 다음의 사용에 적절한 임의의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 첨가제는 상기 <<반추류>> 섹션에서 정의된 바와 같이 반추류를 먹이기 위한, 비-의료적 성분으로서, 사료(feed) 조성물들 또는 프리믹스의, 성분으로서 사용될 수 있다.
프리믹스(premix)
<<프리믹스>>에 의하여, 여기에서 반추류를 위하여 의도되는 사료(feed)의 완성을 작업완료하기 위한 다른 원재료들과 낮은 퍼센트로 관련된, 선택적으로 미량 원소들, 비타민들 및 미네랄들의, 그리고 효소들의 농축물이 의미된다.
프리믹스는 바람직하게는 타겟 동물들에서 그것의 사용을 가능하게 하기 위하여 그리고 효소 활성을 표준화하기 위하여, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제의 도움 상 퇴적 또는 희석으로부터 만들어진다.
본 발명은 이런 식으로 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제를 포함하는, 상기 <<반추류>> 섹션에서 정의된 대로 반추류를 먹이기 위한 프리믹스에 대한 것이다.
본 발명에 따른 프리믹스는 동물들, 특히 반추류의 사료(feed)에 현재 사용되는 다른 첨가제들을 포함할 수 있다.
이러한 첨가제들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 방부제들, 항산화제들, 유화제들(emulsifiers), 안정화제들(stabilizers), 농축제들(thickeners), 겔화제들(gelling agents), 바인더들(binders), 방사성핵종들(radionuclides)의 오염을 통제하기 위한 물질(substance)들, 항 응집(agglomeration) 제제들, 신맛(acidity) 중화제들(correctors), 사일리지(silage)를 위한 첨가제들, 변성(denaturating) 제제들(agents)과 같은 기술적 첨가제들; 착색제들(동물들을 위한 사료(feed)의 색깔을 도핑(doping) 또는 변형하는, 이들 동물들로부터 생산되는 식품류에 색깔을 주는 동물들의 사료(feed) 내에 포함되는, 물질들(substances)), 향이 좋은 물질들(substances)과 같은 감각 첨가제들; 비타민들, 프로비타민들(provitamins), 오메가 3 지방산들, 및 <<유사한 효과를 갖는 화학적으로 잘 정의된 물질들(substances)>>, 미량 원소들의 화합물들, 아미노산들, 요소(urea)과 같은 영양 첨가제들; <<환경에 긍정적인 효과>>를 갖는 물질들(substances), 장내 균총의 안정화제들(stabilizers) 또는 효소들과 같은 소화율(digestibility) 개선 제제들과 같은 축산학적 첨가제들 및 지방산들을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 프리믹스는 하기 조성물을 가질 수 있다:
본 발명에 따른 효소 조성물 0.3 - 3%
비타민들 (A, B, D, E, 니코틴산 등)의 혼합물 0.1 - 1%
미네랄 염들 (CaHPO4, CaCO3, NaCl, CuO, MnO, FeSO4, ZnO 등) 0 - 99.6%
곡물(겨(bran), 리몰딩(remolding), 사료(fodder) 밀가루, 옥수수속대( corncob), 보리 잔뿌리들(rootlets) 등)의 물질들(substances) 0 - 99.6%
본 발명에 따른 프리믹스는 그것의 물질 사용에 적합한 임의의 형태, 특히 액체, 분말 또는 그래뉼 형태일 수 있다.
사료(feed) 조성물
본 발명은 또한 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 바와 같이 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)과 관련되어, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 바와 같이 프리믹스의 또는 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 바와 같은 첨가제의 효과적인 양을 포함하는, 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 바와 같은 반추류를 위한 보충된 사료(feed) 조성물에 대한 것이다.
반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)은 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어 풀 및 다른 사료(fodder) 풀들, 사료(fodder) 곡물들(보리, 옥수수(maize), 귀리들, 밀, 단수수, 콩(soya), 호밀), 레귐들(legumes) (완두콩들(pea), 잠두( faba bean), 루핀(lupin), 콩(soya), 자주개자리(lucerne), 사인포인(sainfoin), 클로버들(clovers)), 뿌리들, 덩이뿌리들(tubers) 및 그것들의 부산물들(비트들(beets), 비트(beets) 펄프(pulp), 감자, 감자 펄프(pulp), 등), 양배추, 평지씨(rapeseed), 해바라기, 채소 폐기물들(윗부분들, 줄기들, 곡물 겉껍질들, 겨들, 겉껍질벗긴(husked) 옥수수속대들(corncobs) 바가스들(bagasse)) 및 녹말들, 농식품 산업의 부산물들 (녹말 제조, 족말 생산, 에탄올 공장들, 맥주 공장들, 밀링 등), 더불어 지방종자 케이크들, 시럽들 및 요소(urea) 및 그 유도체들(뷰렛(biuret), 우레이드들(ureides) 및 암모니아 염들과 같은 질소-함유 식품 물질들과 같은 임의의 종류들의 사료들(fodders) 및 그것들의 모든 형태들(녹색채소들, 건조된(dehydrate), 사일리지, 뭉쳐진것들(agglomerates) 등)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 범위 내 사용되는 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)은, 사료(fodder), 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지 typically representing from 10 to 50% of the ingested 건조물, 사료(fodder), 바람직하게는 섭취된 건조물의 10부터 50%까지로 보통 대표되는 옥수수(maize) 사일리지, 바람직하게는 매일, 바람직하게는 건초, 짚 또는 풀 또는 곡류(cereal) 사일리지 및 바람직하게는 시리얼들(cereals), 지방종자 케이크들 또는 구성된(composed) 사료들(feedstuffs)를 포함한다.
반추류를 위한 사료(feed) 배급(ration)는:
- 습한, 건조한 또는 0 부터 100 %까지, 바람직하게는 40부터 70%까지 범위의 비례들로, 건조된 사료(fodder)
- 0부터 100%까지, 바람직하게는 30부터 60%까지 범위의 비례로(농축된 원재료 또는 구성된(composed) 사료들(feedstuff)) 농축된 사료들(feedstuffs)
과 함께 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 바와 같은 효소 조성물을 특히 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제> 섹션에서 정의된 대로 첨가제 또는 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스가 하기 <<효과적인 일일(daily) 투여량(dose)>> 섹션에서 정의된 대로, 효과적인 일일 투여량이 동물에 제공되는 양의 사료(feed) 조성물 내에 존재한다.
본 발명에 따른 사료(feed) 조성물은 반추류, 특히 가축 반추류를 먹이기 위한 임의의 적합한 형태일 수 있다. 특히 그것은 플레이크들(flakes), 그래뉼들, 부스러기들(crumbs) 또는 가루(flour)의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 바와 같은 첨가제 또는 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스를 상기 정의된 대로 반추류, 특히 가축 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)과 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 대로 반추류를 위한 보충된 사료(feed) 조성물을 제조하는 방법에 대한 것이다.
첨가제 또는 프리믹스를 사료(feedstuff)와 혼합하는 단계는 당업계에 잘 알려진 임의의 기술에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 사료(feed) 조성물을 제조하는 방법은 컨디셔닝(conditioning) 단계와 더불어 사료(feed) 조성물을 만들어내는(formulating) 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 단계들은 당업계에 잘 알려진 임의의 현재 기술에 의하여 수행될 수 있다. 이런 식으로, 첨가제 또는 프리믹스는, 그것들이 분말 형태일 때, 제형화(formulation) (또는 혼합) 단계 시에 사료(feedstuff)에 첨가될 수 있고, 또는 그것들이 액체 형태일 때, 사료(feed)의 그래뉼화 후 분무될 수 있다.
효과적인 일일(daily) 투여량(dose)
상기 <<첨가제>>에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료(feed) 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 타겟 동물들에 효소 활성들의 효과적인 양을 제공하기 위하여 제형화된다. 첨가제의, 프리믹스의 또는 사료(feed) 조성물의 제형화는 특히 혼합, 희석, 담체 상 퇴적(deposition), 분무 또는 그래뉼들 상 분말뿌리기, 또는 동물들에 직접적 분배(distribution)와 같은, 당업계에 잘 알려진 임의의 기술에 의하여 수행될 수 있다.
채택된 제형화는 타겟 동물에 의존하며 바람직하게는 β-글루카나제 활성의 레벨에 의하여 만들어진다.
효과적인 일일 투여량들은 보통:
- 젖소들(milk cows): 2,250부터 9,000 BGU/동물/일(day)까지, 바람직하게는 4,500 BGU/동물/일(day)
- 비육(fattening)을 위한 소 동물들: 500 kg의 생체중까지 2,250부터 9,000 BGU/동물/일(day)까지, 바람직하게는 2,250 BGU/동물/일(day) 그리고 500 kg의 생체중을 넘어(beyond) 3,375 BGU/동물/일(day)
이다.
다른 종류들의 반추류를 위한 효과적인 일일 투여량들(doses)은, 특히 생체중에 의존하는, 대사성(metabolic) 생체중 (PV0. 75)에 의존하는, 반추위(rumen)의 부피에 의존하는, 일(day) 당 섭취된 건조물의 총량에 의존하여, 특히 생체중 100 kg 미만인 동물들에서, 바람직하게는 1,125 BGU/동물/일(day)의 최소 양으로와 같은, 당업계에 잘 알려진 기술에 따라, 비육을 위한 소 동물들 또는 젖소와의 비교에 의하여 당업자에 의하여 계산될 수 있다.
축산학적 성과들을 증가시키기 위한 이용들
본 발명자들은 본 발명에 따른 효소 조성물로 비육을 위한 소 동물들 또는 젖소들의 사료(feed) 배급(ration)을 보충하는 것은 그것들의 축산학적 성과를 증가시키는 것, 특히 부티르산의(butyrous) 레벨 및 생산된 우유의 단백질 레벨을 포함하는 우유 생산을 개선하는 것, 증체량(weight gain)을 증가시키는 것, 반추(rumination) 활성을 증가시키는 것, 식품 효율 및 소비 지수를 개선하는 것, 사료(fodder)의 섭취 능력을 증가시키는 것, 사료(fodder) 및/또는 농축물들의 소화율(digestibility)을 증가시키는 것 및 메탄의 생산을 감소시키는 것을 놀랍게도 가능하게 한다는 것을 보여주었다.
본 발명의 목적은 또한 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 대로 반추동물의 축산학적 성과를 증가시키기 위하여, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물의, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제의, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스의, 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물의 이용이다.
<<축산학적 성과(performance)>>에 의하여, 여기에서 동물의 질, 여러가지 기능들(성장, 일, 재생산...)을 위한 그것의 생물학적 능력을 추정하는 것이 가능한 지표가 의미된다. 축산학적 성과들은 특히 동물의 증체량, 특히, 일일 평균 증체량, 그것의 소비 지수 또는 그것의 식품 효율, 특정 연령에서 체중, 도체육량(carcass yield), 도체 체중(carcass weight), 도체 형태(carcass conformation), 식품 섭취, 사료(fodder) 섭취 능력, 사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 소화율(digestibility), 우유 생산, 우유의 단백질 레벨, 우유의 지방 레벨, 반추 활성, 메탄의 생산, 리터 크기 또는 털 생산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 "프리믹스"에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 체중 증가를 촉진시키는 것 및/또는 소비 지수를 개선하는 것 및/또는 식품 섭취를 촉진하는 것 및/또는 도체육량(carcass yield), 도체 체중(carcass weight),도체 형태(carcass conformation), 우유 생산, 우유의 단백질 레벨, 우유의 지방 레벨, 리터 크기 및/또는 털의 생산을 개선하는 것 및/또는 반추 활성을 증가시키는 것 및/또는 사료들(fodders)을 섭취하는 능력을 개선하는 것 및/또는 사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 소화율을 증가시키는 것 및/또는 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 대로 반추동물에서 메탄의 생산을 감소시키는 것을 가능하게 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로의 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로의 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 사료(feed) 조성물은 우유 생산을 증가시키는 것 및/또는 소비 지수를 개선하는 것 및/또는 체중 증가를 촉진하는 것 및/또는 반추 활성을 증가시키는 것 및/또는 사료들(fodders)의 섭취 능력을 증가시키는 것 및/또는 사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 소화율을 증가시키는 것 및/또는 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 대로의 반추동물 내 메탄의 생산을 감소시키는 것을 가능하게 한다. 제일 바람직하게는, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 및 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 우유 생산을 증가시키는 것 및/또는 소비 지수를 개선하는 것 및/또는 체중 증가를 촉진하는 것 및/또는 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 대로 반추동물에서 반추 활성을 증가시키는 것을 가능하게 한다.
<<증체량(체중 증가)>> 또는 <<일일 평균 증가(gain)>>에 의하여, 여기에서 g/일(day)로 표현되는, 동물의 체중 성장의 발전이 의미된다.
<<소비 지수>>에 의하여 여기에서 식품 변환의 효율이 의미된다. 이 지수는 우유-생산 반추류의 경우에 소모되는 사료들(feedstuffs)의 양 및 우유 생산 사이의 비율에 의하여, 비육을 위한 반추류의 경우 소모된 사료들(feedstuffs)의 양 및 생체중 증가 사이의 비율에 의하여 결정된다.
<<식품 효율>>에 의하여, 여기에서 반추류의 사료(feed) 배급(ration)의 산물로의 변화(transformation)의 측정이 의미된다. 이것은 앞서 정의된 대로 소비 지수의 역비(inverse ratio)이다.
<<보통의 연령에서의 체중>> 에 의하여 여기에서 비교들을 가능하게 하는 참고 연령(예를 들어 1살 또는 18 개월)에서 동물의 체중이 의미된다.
<<도체육량(carcass yield)>>에 의하여 여기에서 <<진짜 육량(yield)>>를 추정하는 것을 가능하게 하는, 동물의 도체(carcass)의 무게 및 동물의 생체중 사이의 비율이 의미된다.
< <도체 체중(carcass weight)>>에 의하여 여기에서 칠링(chilling) 후 도체의 무게가 의미된다.
<<식품 섭취>>에 의하여 동물에 의하여 섭취된 사료들(feedstuffs)의 양이 의미된다.
<<사료들(fodders)을 섭취하는 능력>>에 의하여 동물에 의하여 자발적으로 섭취되는 사료들(fodders)의 양이 의미된다.
<<사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 소화율>>에 의하여 동물에 의하여 소화되거나 또는 효과적으로 보유되는 사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 몫이 의미된다.
<<우유의 생산>> 또는 <<우유 생산>>에 의하여 무게의 단위 또는 부피의 단위로 표현되는, 일(day) 당 생산되는 우유의 양이 의미된다. 본 발명의 범위 내에서, 우유 생산의 개선은 생산되는 우유의 양의 증가에 의하여 그러나 또한 우유의 부티르산(butyrous) 레벨 및/또는 단백질 레벨의 개선에 의하여 표현될 수 있다.
<<우유의 단백질 레벨>>에 의하여, 우유 내 함유되는 단백질 성분(matter)의 양이 의미된다.
<<우유의 지방(fats) 레벨>>에 의하여, 우유 내 함유된 지방의 양이 의미된다.
<<리터(litter) 크기>>에 의하여 청년 또는 새끼의 출생 시 체중 및 수가 의미된다.
<<반추 활성>>에 의하여 여기에서 식품 덩어리(bolus)를 씹는데 전념하는 일(day) 당 분(minutes)의 수가 의미된다.
<<털의 생산>>에 의하여 털을 위하여 사육되는 포유동물(예를 들어 캐시미어 염소)에 의하여 생산되는 털의 양이 의미된다.
바람직하게는, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 우유 생산을 개선하는 것, 특히 우유의 부티르산(butyrous) 레벨 및/또는 단백질 레벨을 개선하는 것, 및/또는 소비 지수 및/또는 식품 효율을 개선시키는 것 및/또는 체중 증가를 촉진시키는 것 및/또는 반추 활성을 개선하는 것 및/또는 사료들(fodders)을 섭취하는 능력을 증가시키는 것 및/또는 사료들(fodders) 및/또는 농축물들의 소화율을 증가시키는 것 및/또는 상기 << 반추류들 >> 섹션에서 정의된 대로 반추동물에서 중요한 방법으로 메탄 생산을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
특히, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은, 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지(silage), 바람직하게는, 4,500 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위한, 바람직하게는 사료(feed)에 존재하는 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물, 짚 또는 건초, 지방종자 케이크들, 비트들 펄프 및 질소-포함 및 활동적인(energetic) 농축물들과 같은 대충 한(rough) 사료(fodder)를 포함하는 사료(feed)를 먹인, 반추동물, 특히 소 동물, 바람직하게는 젖소에서 0.5 내지 1.5%, 바람직하게는 1% 까지, 우유의 단백질 레벨을 개선하는 것, 및/또는 우유 생산을 1 내지 5%, 바람직하게는 3%까지 개선시키는 것을 가능하게 한다.
특히, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 또한 생체중 500 kg 까지 2,250 BGU/동물(anima)/일(day) 및 생체중 500 kg을 넘어 3,375 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여, 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지(silage)를 포함하는 사료(feedstuff), 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지 및 질소-함유 활동적인(energetic) 농축물들을 포함하는 사료(feedstuff), 바람직하게는 사료(feed) 내 존재하는 상기 "효소 조성물" 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물을 먹인, 반추동물에서, 특히 소 동물에서, 바람직하게는 비육을 위한 소 동물에서, 1 내지 15%, 바람직하게는 10%까지 증체량을 개선하는 것을 가능하게 한다.
특히, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물는 또한 4,500 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 바람직하게는 사료(feed) 내 존재하는, 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지(silage)을 포함하는 사료(feedstuff), 바람직하게는 옥수수(maize) 사일리지 및 질소-포함 및 활동적인 농축물들, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물을 먹인, 반추동물에서, 특히 소 동물에서, 바람직하게는 젖소에서, 5 내지 15%로, 바람직하게는 8 부터 11%까지 반추 활성을 증가시키는 것을 가능하게 한다.
특히, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물은 또한, 3,375 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 바람직하게는 풀 건초, 옥수수(maize) 사일리지 및/또는 grass 사일리지(silage)를 포함하는 사료(feedstuff), 바람직하게는 풀 건초를 포함하는 사료(feedstuff), 바람직하게는 사료(feed) 내 존재하는 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물을 먹인, 반추동물에서, 특히 소 동물에서, 바람직하게는 도태시킨(culled) 암소에서, 0.5 내지 9%로, 바람직하게는 2.5 내지 8%로, 메탄 생산을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로의 첨가제, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로의 프리믹스 및 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 사료(feed) 조성물은 그것들이 투여되는 반추동물 또는 반추류의 떼를 전반적으로 좋은 상태로 유지시키는 것, 및 특히 농부에게 허용가능한 떼(herd)의 생식력, 질병률(morbidity) 및/또는 사망률(mortality)을 유지시키는 것, 또는 이 생식력(fertility)을 촉진시키는 것 및/또는 이 질병률(morbidity) 및/또는 이 사망률(mortality)을 감소시키는 것을 더 가능하게 한다.
본 발명은 또한 반추동물이, 바람직하게는 사료(feed) 배급에서, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물의, 상기 <<첨가제>> 섹션에서 정의된 대로 첨가제의, 상기 <<프리믹스>> 섹션에서 정의된 대로 프리믹스의, 또는 상기 <<사료 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 사료(feed) 조성물의 효과적인 양을 섭취하게 만들어지는 것을 특징으로 하는 반추동물의 축산학적 성과를 증가시키는 방법에 대한 것이다.
<<효과적인 양>>에 의하여 여기에서 상기 정의된 대로의 축산학적 성과를 증가시키는 것을 가능하게 하는, 사료(feed) 조성물 또는 프리믹스, 선택적으로 첨가제 내 존재하는, 효소 조성물의 양이 의미된다. 당업자에게는 명백히 분명할 것이듯이, 이 양은 관련된 반추동물에, 그것이 연령에, 그것의 성(gender)에, 그것의 유전적 종류에, 그것의 생리적 단계에, 그것의 체중에, 그것의 예상되는 성과 레벨에 그리고 그것의 사료(feed) 배급에 의존할 것이다.
보통, 소 동물들의 경우에, 효과적인 섭취되는 양은 섭취된 β-글루카나제 활성이 2,250 및 9,000 BGU/일(day) 사이, 젖소를 위한 바람직하게는 4,500 BGU/일(day), 및 비육을 위한 소 동물에 대하여 2,250 내지 9,000 사이의 BGU/일(day), 바람직하게는 500 kg까지의 생체중을 갖는 비육을 위한 소 동물에 대하여 2,250 BGU/일(day), 및 500 kg을 넘는(above) 생체중을 갖는 비육을 위한 소 동물에 대하여 3,375 BGU/일(day)로 포함되는 그런 것이다.
일반적으로 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물은, 예를 들어 매일의 리듬에 따라, 주2회로(biweekly), 매주, 또는 월 2회(bimonthly) 리듬으로, 시간 맞춰 퍼지는, 연속적인 섭취들의 형태로 반추동물에 제공된다. 바람직하게는, 반추류는 일일 투여량에 따라 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로 효소 조성물의 효과적인 양을 섭취하도록 된다.
목초지(grazing)에 의하여 독점적으로 먹이는 반추류에 대하여, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물은 바람직하게는 그것들의 주된 사료(feed)로부터 분리되어 제공될 것이다.
신선한 사료(fodder) 또는 저장된 사료(fodder) (예컨대 건초), 또는, 사료(feed) 농축물들과 포함하는, 산업적 사료들(feedstuffs)로 먹인 반추류들에 대하여, 상기 <<효소 조성물>> 섹션에서 정의된 대로의 효소 조성물은 이들 사료들(feedstuffs)의 분리된 형태 또는 이들 사료들(feedstuffs)과의 혼합물로 제공될 수 있다.
본 발명은 하기 예들에 더욱 상세히 설명될 것이다.
예들
예 1 : 고체-상태 배양에 의한 본 발명에 따른 효소 조성물의 생산
이 예에서, 아스퍼질러스 터빈겐시스 균주의 존재 하 평지씨 케이크(cake) and 밀기울 혼합물의 고체-상태 발효에 의하여 본 발명에 따른 효소 조성물을 수득하는 방법이 기재된다.
영양 배지는 중량으로 7/3의 비율인 가루(flour)로써 평지씨 케이크(cake) 및 밀기울의 혼합물로 형성된다. 혼합물은 그 다음에 60%의 건조물로 전(pre)-가습되고(humidified) 그리고 35분 동안 105℃에서 오토클레이브된다. 냉각 후 배지는 45%의 처음 습도 및 건조물의 그램 당 1×107 포자들의 농도를 얻기 위하여 아스퍼질러스 터빈겐시스의 포자들의 용액으로 접종된다. 황산(sulfuric acid)을 첨가함으로써 pH는 4.9로 조정된다. 이로써 얻어지는 배양 배지는 바이알(vial) 당 10 g의 건조물의 양으로 에를렌마이어(Erlenmeyer) 바이알들에 분포된다. 에를렌마이어(Erlenmeyer) 바이알들은 그 다음에 임의의 젓기 없이 48 시간 동안 어둠에서 호기 조건들 하 33℃에서 배양된다. 배양은 배양 배지에서 첫 번째 포자들의 발생으로 중단된다(포자들의 존재는 섭취 동안 동물들을 방해할 수 있는데, 이는 그것들의 휘발성(volatility) 때문으로, 발효 산물들은 최소 가능한 양의 포자들을 함유하도록 설계된다).
발효 말에 얻어지는 혼합물은 그 다음에 건조되고 보통 말하는, 동물들을 먹이는 데 사용되고, 또는 액체 형태로 첨가되기 위하여 물로 추출될 수 있다.
예 2 : 젖소들의 생산 성과들에 대한 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과의 측정
이 예에서, 매우 생산적인 젖소들 떼의 생산 성과에 대한 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과가 기재된다.
물질들 및 방법들
프림(Prim) 홀스타인(Holstein) 품종(breed)의 38 마리의 매우 생산적인 젖소들이 2 그룹들로 분배되고 서로 짝지어졌다. 그것들을 함께 분류하는 것(batching)은 하기 기준들에 따라 수행되었다:우유 생산, 우유의 단백질 레벨, 우유의 지방 레벨, 젖의 분비(lactation) 등급(rank), 생체중.
동물들은 9.5 kg의 DM (건조물(dry material))의 옥수수(maize) 저장목초(ensilage), 2.1 kg DM의 섬유질 사료(feedstuff) (짚 + 긴 가닥의 자주개자리(lucerne)), 4.9 kg DM의 질소-함유 중화제(corrector) (그 조성은 표 1에 기재됨), 8.0 kg의 생산 사료(feedstuff) (그 조성은 표 1에 기재됨)로 구성되는 혼합된 배급(ration)을 받았다.
예 1에 기재된 방법에 의하여 수득된 효소 조성물은 조성물의 좋은 균질성을 보장하기 위하여 프리믹스로서 표준화되었고, 사료들(feedstuffs)의 제조 단계 동안 그것의 이용을 가능하게 한다. 이로써 표준화된 프리믹스는 4,500 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 0.25%의 양으로 생산 사료(feedstuff) 내에 포함되었다. 이로써 표준화된 프리믹스의 특성들은: 130 AXC/g, 290 BGU/g 및 35 CMC/g이다. 시험 기간은 8주이다.
모노프로필렌글리콜(monopropyleneglycol (Sandi+, 에너지원)을 포함하는 사료(feedstuff)의 1 kg/일(day)의 공급은 젖 분비(lactation)의 30일 미만으로 암소들에게서 달성된다.
배급(ration)의 평균 특성들은 (%/건조물로서): 총 질소-함유 성분(matter):17.7%; 중성세제들(neutral detergents)에 불용성인 섬유들(Fibers) (NDF): 35.8% 및 녹말(starch): 17.6% 이다.
원재료 ( % ) 질소-포함 중화제(corrector) 생산 사료(feedstuff) (대조군) 생산 사료( feedstuff )
(+ 본 발명에 따른 효소 조성물) 		Sandi +
평지씨 케이크 착유기(expeller) 18.0
보리 18.5 15.2 15.3 42.3
콩(soya) 케이크 52.9 5.8 6.6
평지씨 낟알(grain) 7.8 7.9
평지씨 케이크 24.8 24.3 32.6
콩(Soya) 겉껍질(husk) 20.0 20.0
비트 펄프 22.0 21.6
짚 2.0 2.0
겨 15.1
대두유 1.7
Na 비카보네이트(bicarbonate) 1.3 1.5 1.5
미네랄(Mineralized) 또는 비타민들(vitamins) 보충제(supplement) (MVS) 3.9 0.3 0.3
요소 1.1
프리믹스 0.5 0.5 0.5
모노크로필렌 글리콜 10.0
밀 2.3 0.3
본 발명에 따른 효소 조성물 0.25
건조물 (%) 90.1 88.7 88.7 88.2
단백질 (크루드의 %) 35.0 18.0 18.0 18.0
지방들 (크루드의 %) 5.0 5.1 5.1 2.2
크루드 셀룰로스 (%) 6.4 16.4 16.4 8.0
NDF (크루드의 %) 16.4 35.0 35.0 24.0
산성 세제(acid detergents)에서 불용성
인 섬유질(fibers)(ADF) (% of crude)		 9.2 21.1 21.0 11.0
리그닌(ADL)(크루드의 %) 2.0 3.4 3.4 3.5
UF 우유 (/kg 크루드) 100.1 95.0 95.0 90.0
PDIA (g/kg 크루드) 116.1 55.7 56.0 48.6
PDIN (g/kg 크루드) 245.2 119.7 119.8 117.9
PDIE (g/kg 크루드) 164.3 106.5 106.9 97.5
표 1: 젖소를 위한 식품류의 조성물.
동물 무리들(batches)의 특성들은 표 2에 기재되어 있다.
　 대조군 처리군
동물들의 수 19 19
젖분비(Lactation) 단계(stage) (d) 168 185
우유 생산 (kg/d) 39.5 39.5
부티르산 레벨 (g/kg) 35.9 35.9
단백질 레벨 (g/kg) 31.6 32.1
우유 체세포 (1,000/mL) 391 220
요소(Urea) (mg/L) 267 284
생체중(Live weight) (kg) 658 670
표 2: (실험 전 2주 후) 함께 무리묶은 것(batching)에 대한 젖소들의 무리들(batches)의 특성들
결과들
그룹들 둘다의 생산 결과들은 표 3에 상세히 기재되어 있다.
　 대조군 처리군 무리(Batch) 효과
동물들의 수 19 19
우유 생산 (MP) (kg/d) 39.3 40.4 ***
부티르산 레벨(BL) (g/kg) 35.8 35.6 NS
단백질 레벨 (PL) (g/kg) 31.0 31.3 **
내보내진(Exported) 지방 (g/d) 1395 1413 NS
내보내진(Exported) 단백질 (g/d) 1210 1244 ***
7% 정정된(Corrected) 우유 생산(kg/d) 37.2 38.0 **
우유 체세포 (1,000/mL) 94 106 NS
생체중(Live weight) (kg) 682 671 ***
NS: 중요하지 않음(not significant); *: p<0.10; **: p<0.05; ***: p<0.001
표 3: 무리들 및 통계의 생산 결과들
본 발명자들은 효소 조성물의 공급이 많은 기준들에 매우 확연한 효과를 갖는다는 것에 주목하였다:
- 우유 생산에 있어 중요한 증가;
- 단백질 레벨 (+0.3 g/kg) 및 생산된 단백질 성분(matter)에서 중요한 증가;
-MP 7% (레벨 = MP * (BL + PL)/70에 의하여 수정된 우유 생산)에서 중요한 증가 : +0.7 kg.
이들 효과들은 섭취된 건조물의 증가를 동반하지 않고, 그러므로 더 나은 식품 효율을 보인다(생산된 우유의 양/섭취된 건조물).
이 예는 본 발명에 따른 효소 조성물을 제공하는 것이 매우 생산적인 젖소들의 사료(feed) 배급(ration)의 더 나은 공정가격설정(valorization) 및 우유 생산의 축산학적 성과을 개선하는 것을 가능하게 하는 것을 보인다.
예 3 : 비육을 위한 소 동물들의 성장 성과에 대한 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과 측정
이 예에서, 비육을 위한 소 동물들의 성장 성과들이 기재된다.
물질들 및 방법들
샤롤레(Charolais) 품종의 비육을 위한 40 마리의 소 동물들이 2개 그룹으로 분포되었다. 무리묶는 것(batching)은 생체중 기준으로 수행되었다.
동물들은 혼합된 완전 배급을 받았고, 그것의 조성은 표 4에 상세히 기재되어 있다.
예 1에 기재된 방법에 의하여 수득된 효소 조성물은 조성물의 좋은 균질성을 보장하기 위하여 프리믹스로서 표준화되었고, 동물들에 투여 단계 동안 그것의 사용을 가능하게 한다. 이로써 표준화된 프리믹스는 9,000 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 혼합된 완전 배급(ration) 내로 포함되었다. 이로써 표준화된 프리믹스의 특성들은: 80 AXC/g, 150 BGU/g 및 17 CMC/g이다.
시험은 10 달 동안 지속되었다.
분배된(distributed) 양 (크루드/동물/일(day)의 kg)
성분 생체중 300 부터 500 kg까지의 비육 생체중 500부터 750 kg까지의 마무리(Finishing)
감자 펄프(pulp) 3.0 3.0
밀짚 0.8 0.8
둘러싼(Wrapped) 자주개자리(lucerne) (건조물의 33%) 3.0 3.0
질소-함유 농축물
(44% MAT)		 0.8 0.65
에너지(Energetic) 농축물
(1 UFV/kg)		 2.5 3.5
미네랄들 0.1 0.1
요소 0.01 0.06
옥수수(Maize) 사일리지 및 과압착된(over-pressed) 비트 펄프들(건조물의 50/50) 14.0 20.0
표 4: 비육을 위한 소 동물들을 위한 혼합된 완전(complete) 배급의 조성물
결과들
그룹들 둘다의 생산 결과들은 표 5에 상세히 기재되어 있다.
DAWG (g/동물/일(day)) T0에서 출생
(평균
8.3개월)		 T0 내지 T0+1 개월 T0+1개월 내지
T0+2개월		 T0+2개월 내지
T0+8개월		 T0 내지 T0+8개월 도체 체중 (kg)
대조군 평균 1 139 1 564 1 633 1 095 1 219 415
표준편차 139 369 340 236 186 30
처리군 평균 1 139 1 708 1 709 1 218 1 342 425
표준편차 117 590 293 197 200 39
대조군의 베이스 100으로 표현된 처리군에 의하여 유도된 개선
(개선의 %)		 100
(0%)		 109
(9%)		 105
(5%)		 111
(11%)		 110
(10%)		 102
(2%)
표 5: 무리들(batches)의 성장 결과들
본 발명자들은 비육을 위한 어린 소 동물들의 사료(feed)에 효소 조성물을 첨가함으로써, 일일(Daily) 평균(Average) 증체량(Weight Gain) (DAWG)을 10%로 개선시키는 것이 가능하였다는 것에 주목하였다. 이것은 도축 즉시 도체 무게(carcass weight)에 의하여 표현되며, 본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된 동물들의 무리(batch)에서 2%로 개선된다.
이 예는 본 발명에 따른 효소 조성물을 제공하는 것이 비육을 위한 소 동물들의 성장의 축산학적 성과를 개선시키는 것을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
예 4 : 본 발명에 따른 효소 조성물의 젖소의 반추 활성 및 생산 성과들에 대한 영향 측정
이 예에서, 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과는 동물들의 반추 활성 상에 그리고 매우 생산적인 젖소들의 떼의 생산 성과들 상에 대하여 기재된다.
물질들 및 방법들
프림(Prim) 홀스타인(Holstein) 품종의 36 마리의 매우 생산적인 젖소들이 두 그룹들로 분포되었다. 동물들의 무리나누기(batching)는 우유 생산, 생체중, 젖의 분비(lactation) 등급(rank) 및 일들(day)인 수유 기간의 기준들로 수행되었다. 시험은 85일 동안 지속되었다.
동물들은 옥수수(maize) 사일리지(silage), 자주개자리(Lucerne) 건초, 호밀(rye)-목건초(grass hay), 옥수수(corn) 글루텐 사료(feed), 생산 농축물 및 물로 주로 구성되는, 혼합된 완전 배급을 받았다. 상세한 조성물은 표 6에 주어진다.
예 1에 기재된 생산 방법에 따라 준비된 효소 조성물은 동물들에의 분배 단계 (<<위쪽(top) 먹이기(feeding)>>와 같은 분포) 동안 그것의 사용을 가능하게 하고 조성물의 좋은 균질성을 보장하기 위하여 프리믹스로서 표준화되었다. 수득된 프리믹스는 4,500 BGU/동물/일(day)을 공급하기 위하여 총 배급에서 혼합되었다. 이로써 표준화된 프리믹스의 특성들은: 400 AXC/g, 270 BGU/g 및 69 CMC/g이다.
36 마리 암소들의 반추 활성은 매일 음향 탐지기로 기록되었다 (RuminAct, Milkline, Italy).
옥수수(Maize) 사일리지 kg 22.0
농축물1 + 목화 케이크 kg 6.0
옥수수(corn) 글루텐 밀(meal)-플레이크된(flaked) 보리 믹스(mix.) (60:40) kg 6.8
물 kg 8.0
호밀-목건초(grass hay) kg 1.1
자주개자리(Lucerne) 건초 kg 4.4
1: 콩(soya) 케이크 44%: 41.2%; 목화 케이크: 33%, 해바라기 케이크: 7.21%; 옥수수(Corn) 글루텐 밀(meal): 7.21%; CaCO3: 2.68%; NaHCO3: 2.68%; MgO: 1.00%; CaHPO4: 0.67%; NaCl: 0.67%; ZnSO4: 0.10%; 프리믹스: 0.54%.
표 6: 젖소들의 혼합된 완전 배급의 조성물
혼합된 완전 배급의 영양가들이 분석되었다: 건조물 48.69%, 크루드(crude) 단백질들: 15.75 %/ 건조물 (dry); 지방들: 2.70 %/ 건조물; 크루드 셀룰로스: 18.45 %/ 건조(dry); NDF: 37.86 %/ 건조(dry); ADF: 21.15 %/ 건조(dry) 및 녹말: 25.57 %/ 건조.
이 시험 동안 무리들(batches) 둘다 사이의 섭취 차이는 없었다.
결과들
두 그룹들의 우유 생산 결과들은 표 7에 자세히 기재되어 있다.
기간들 대조군 처리군 처리군 vs. 대조군 처리군의 효과
P=		 기간의 효과
P=		 상호작용
(처리군 x 기간)
P=
D0 - D21 36.7±8.5 37.5±8.4 +0.8 0.7840 0.0001 0.9896
D21 - D37 36.9±8.4 38.3±8.6 +1.4 0.6135 0.0001 0.4114
D37 - D53 35.6±9.2 37.6±8.1 +2.0 0.4786 0.0001 0.1807
D53 - D69 34.1±8.7 35.5±8.1 +1.4 0.6024 0.1024 0.9907
D69 - D85 33.7±9.2 35.0±8.0 +1.3 0.6424 0.0001 0.9938
D21 - D85 35.1±8.9 36.6±8.3 +1.5 0.5795 0.0001 0.9472
표 7: 무리들(batches) 및 통계의 우유 생산 (kg/동물/일(day)) 결과들
우유 생산은 젖 분비(lactation) 단계에 따른 시험 동안 감소하였다. 시험 동안, 본 발명에 따른 효소 조성물을 받은 무리(batch)는 대조군에 비교하여 동물 당 그리고 일(day) 당 +1.5 kg의 우유의 우유 생산에서의 개선을 보였다.
우유 조성물(지방들 및 단백질들)의 결과들은 표 8에 상세히 기재되어 있다.
일(Day) 대조군 처리군 처리군 vs. 대조군 처리군 효과
P=		 표준 오차
우유의 부티르산 레벨 (%)
D0 3.99±0.52 3.87±0.54 -0.12 0.5102 0.1251
D21 4.01±0.74 4.00±0.58 -0.01 0.9421 0.1558
D37 3.98±0.49 4.02±0.49 +0.04 0.7988 0.1162
D53 4.12±0.73 4.34±0.61 +0.22 0.3368 0.1581
D69 4.15±0.54 4.30±0.69 +0.15 0.4860 0.1462
D85 4.09±0.62 4.21±0.55 +0.12 0.5305 0.1376
우유 지방의 생산 (kg/일)
D0 1.42±0.33 1.38±0.29 -0.04 0.7318 0.0731
D21 1.42±0.25 1.47±0.31 +0.05 0.5751 0.0662
D37 1.44±0.23 1.51±0.27 +0.07 0.4430 0.0585
D53 1.38±0.29 1.51±0.33 +0.13 0.2094 0.0729
D69 1.37±0.31 1.48±0.26 +0.11 0.2739 0.0675
D85 1.26±0.23 1.34±0.22 +0.08 0.2790 0.0535
우유의 단백질 레벨 (%)
JD0 3.57±0.40 3.46±0.31 -0.11 0.3732 0.0844
D21 3.60±0.45 3.78±0.22 +0.18 0.1243 0.0832
D37 3.66±0.32 3.80±0.43 +0.14 0.2724 0.0887
D53 3.66±0.33 3.87±0.22 +0.21 0.0324 0.0671
D69 3.67±0.30 3.84±0.23 +0.17 0.0659 0.0624
D85 3.69±0.31 3.82±0.31 +0.13 0.2092 0.0727
우유 단백질들의 생산 (kg/일)
D0 1.26±0.19 1.24±0.22 -0.02 0.7599 0.0490
D21 1.29±0.23 1.42±0.35 +0.13 0.2103 0.0705
D37 1.34±0.30 1.41±0.19 +0.07 0.4245 0.0590
D53 1.24±0.27 1.37±0.35 +0.13 0.2293 0.0729
D69 1.23±0.32 1.34±0.29 +0.11 0.2692 0.0708
D85 1.15±0.253 1.23±0.24 +0.08 0.3567 0.0579
표 8: 무리들(batches) 및 통계의 우유의 조성물
시험 동안, 대조군에서 부티르산(butyrous) 레벨은 계속 안정적인 반면, 그것은 (본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된) 처리(treatment) 군에서 증가하였다. 부티르산(butyrous) 레벨은 대조군 암소들의 무리에서보다 처리된 암소들의 무리에서 항상 더 높았다. 시험 85 일 후, 처리군의 암소들은 대조군의 암소들의 그것보다 0.12 포인트(point) 더 큰 부티르산(butyrous) 레벨을 가졌다.
시험 동안, 우유의 단백질 레벨은 대조군보다 처리군에서 더 빠르게 증가하였다. 통계적으로, 본 발명자들은 D53 및 D69에서의 단백질 레벨에서, 각각 +0.21 및 +0.17 포인트들(points)씩의 중요한 증가에 주목하였다. 이것은 또한 (시험 말에 +0.08 kg/일(day)의) 단백질들의 더 큰 내보내기(export)에 의하여 표현되었다.
반추 활성은 젖소들의 대사 활성에 크게 중요하고, 동물 건강을 모니터링하는데 유용한 도구일 수 있다. 반추(rumination)은 타액의 생산을 자극하고 그러므로 반추위(rumen)에서 셀룰로스 가수분해(cellulolytic) 활성을 위한 최적의 조건들을 보장한다.
평균 일일 반추 활성 데이터는 표 9에 주어져 있다. 반추 활성은 동물 당 그리고 일(day) 당 반추의 분(minutes)의 수로서 표현된다.
기간 대조군 처리군 처리군 vs. 대조군 처리군의 효과
P=		 기간의 효과
P=		 상호작용
(처리군 x
기간)
P=
D0 - D21 500.6 511.6 +11.0 0.6513 0.0001 0.4360
D21 - D37 497.0 515.8 +18.8 0.4730 0.0001 0.6990
D37 - D53 458.3 497.8 +39.5 0.1858 0.0001 0.2840
D53 - D69 482.3 528.1 +45.9 0.1210 0.0322 0.3747
D69 - D85 471.7 523.9 +52.2 0.1019 0.0001 0.0132
D21 - D85 477.3 516.4 +39.1 0.1657 0.0001 0.0066
표 9: 동물들의 반추 활성 (반추의 분들(minutes)/동물/일(day))
그룹들 둘 다 시험 초반에 어떻나 통계적 차이를 보이지 않는다(대조군 및 처리군들에 대하여 각각 500.6 vs. 511.6 분/일/동물). 그럼에도 불구하고, 시험 16일 후, 반추 활성은 처리 무리(batch)에서 숫자상으로 증가한다. 시험의 마지막 기간에서(D69-D85), 상호작용(처리 x 기간)은 대조군의 그것보다 더 큰 처리군의 반추 활성으로 중요하다(P=0.0132)(+52.2 분/일/동물). D21-D85 기간 동안 통계적 분석은 처리군의 암소들에서의 반추 활성의 +39 분/일/동물의 동일한 상호작용 효과를 보인다.
이 예는 본 발명에 따른 효소 조성물을 제공하는 것이 개선된 반추 활성 및 매우 생산적인 젖소들의 사료(feed) 배급(ration)의 더 나은 공정가격설정(valorization), 우유 생산의 축산학적 성과를 개선시키는 것(일일 우유 생산, 우유 단백질들 및 우유 지방들의 생산)을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
예 5 : 본 발명에 따른 효소 조성물의 인 비트로(in vitro)에서 반추위(ruminal) 발효들에 미치는 효과의 측정(가스 방출)
이 예에서, 인 비트로(in vitro)에서 반추위(ruminal) 발효들, 특히 가스의 방출 및 특히 메탄의 생산,에 미치는 발명에 따른 효소 조성물의 효과가 기재된다.
물질들 및 방법들
동물들
반추위(rumen)로 캐뉼라들(cannulas)을 가진 두 마리의 도태시킨(culled) 암소들이 사용되었다. 인 비트로에서 실험 기간의 전체 동안, 동물들은 생목초(haylage) 풀(grass) (4 kg), 옥수수(maize) 사일리지 (5 kg/d), 썬(chopped) 짚 (1 kg) 및 농축물 (1kg)의 혼합물로 먹였다.
성분들
4 개의 사료들(feedstuffs)이 인 비트로에서 연구되었다: 목건초(grass hay), 풀 사일리지(silage), 옥수수(maize) 사일리지 및 콩(soya) 케이크. 실험 성분들의 화학적 조성은 표 10에 나와 있다.
성분들 MAT1 (%) NDF(%) 전분(%) 크루드 에너지 (kcal/kg DM)
콩(Soya) 55.37 15.18 N/A2 4636.92
생목초(Haylage) 17.90 44.72 N/A 4106.45
옥수수(Maize) 5.07 53.53 19.5 4546.62
건초 6.89 65.93 N/A 4306.68
1MAT: 총(Total) 질소(nitrogen)-함유(containing) 물질(material)
2N/A: 적용불가능함(Not applicable)
표 10: 사용된 성분들의 화학 조성물
다른 성분들은 동결 건조되었고 실험실 그라인더(grinder)를 수단으로서 1 mm로 그라인딩되었다.
아스퍼질러스 네오나이거의 균주를 이용하여 예 1에 기재된 생산 방법에 따라 준비된 효소 조성물은 <<위쪽(top) 먹이기(feeding)>>에서 동물들에게 분포하는 단계 동안 그것의 사용을 가능하게 하고 조성물의 좋은 균질성을 보장하기 위하여 프리믹스로서 표준화되었다. 수득된 프리믹스는 3,375 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 총 배급으로 혼합되었다. 이로써 표준화된 프리믹스의 특성들은 70 AXC/g, 213 BGU/g 및 28 CMC/g이다.
인 비트로에서의 발효들은 Menke and Steingass (1988)에 기재된 방법에 따라 달성되었다. 접종원은 2 마리의 캐뉼라 삽입된(cannulated) 암소들에서 모아진 반추위(rumen) 액(fluid)의 1/3 및 Menke and Steingass 버퍼 (Menke K H, Steingass H. (1988) Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Animal Research Development. 28, 7-55)의 2/3로 구성되었다. 200 mg의 기질이 접종원의 존재 하 100 ml 유리 흡입기들(syringes)에 포함되었다. 가스 부피의 판독은 정기적으로 수행되었다.
반추위액은 정상 사료(feed) 식이가 된 동물들에서 샘플 채취되었고(대조군), 그 다음에 식품의 1 g/kg의 양(~15 g/d/동물)으로 본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된 식이에의 3 주 동안의 적응 후 동일한 동물들에서 샘플 채취되었다(시험군).
시험 계획은 하기와 같았다: 4 기질들 × 2 처리들(treatments) (대조군 또는 시험군) × 3 흡입기들(syringes) + 3 블랭크들(blanks) = 시리즈 당 27 흡입기들(syringes)
두 시리즈들이 메탄 (CH4) 및 암모니아성 질소 (N-NH3)의 생산을 결정하기 위하여 수행되었다(그러므로 54 개 흡입기들(syringes)).
CH4 및 N-NH3의 생산에 사용된 시리즈들의 발효들은 24 시간 동안 수행되었다. 24 시간의 말에, N-NH3의 생산을 결정하기 위하여 액체 상의 샘플 및 가스 크로마토그래피에 의하여 CH4의 생산을 결정하기 위하여 발효 병들의 가스 상의 샘플이 샘플 채취되었다. 발효들을 시작한 직후, 접종원의 3 개의 샘플들 또한 원심분리되었고 그것들의 N-NH3 함량에 대하여 분석되었다.
CH4 생산은 발효에 착수하는 기질의 DM의 g에 관련되고, 값들은 블랭크들(blanks) 및 접종원들(inocula)에 따라 수집되었다.
결과들
발효 24 시간 후 메탄 생산량의 관점에서 볼 때, 표 11에서 보이는 대로, 반추위(ruminal) 미소생물학(microbiot)에 의한 암모니아의 더 큰 이용 (낮은 NH3 함량) 및 사료(fodder) 성분들(건초, 생목초 및 옥수수(maize) 사일리지)을 위한 본 발명에 따른 효소 조성물로 메탄을 덜 생산하는 경향이 나타나는 것으로 보인다.
　 　 CH4 (mmol/g) 변화 /
대조군 (%)		 NH3 (mg/g) 변화 / 대조군 (%)
건초
 대조군 1.779 　 27.50 　
시험군 1.623 -8.8 26.90 -2.2
옥수수(Maize) 사일리지 대조군 2.293 21.40
시험군 2.274 -0.8 20.70 -3.3
풀(Grass) 사일리지
 대조군 1.428 28.90
시험군 1.391 -2.6 25.80 -10.7
콩(Soya) 케이크
 대조군 2.315 67.70
시험군 2.513 8.6 68.00 0.4
SEM 　 0.075 　 2.90 　
표 11: 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 또는 비존재 하 반추위액으로 사료들(feedstuffs)의 24 시간 동안 인 비트로 발효 후 메탄 및 암모늄의 생산(N = 6)
24 시간 후 수행된 측정들에서(메탄 및 NH3), 본 발명자들은 반추위(rumen)의 미생물들에 의한 발효 버퍼의 암모니아의 더 큰 이용과 메탄의 생산의 감소로 모든 섬유질 사료들(feedstuffs) (사료들(fodders): 건초, 옥수수(maize) 사일리지 및 풀 생목초)에 대한 지속적 경향을 관찰할 수 있었다. 이것은 발효의 처음 시간들에서, 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 하 배양된 사료들(fodders)이 박테리아 성장을 더 촉진하고 그 결과 암소들에 대한 미생물의 기원의 아미노산들 단백질들의 더 나은 공급을 보장할 수 있다는 것을 의미한다.
이 예는 본 발명에 따른 효소 조성물을 제공함으로써 반추류의 반추위에 함유된 미생물들에 의하여 메탄의 생산을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
예 6 : 반추류를 위한 사료들( feedstuffs ) 의 인 새코 (in sacco ) 소화율에 미치는 본 발명에 따른 효소 조성물의 영향 측정
이 예에서 반추류의 사료(feed)의 여러가지 공통의 원(raw) 재료들의 인 새코(in sacco) 소화율에 미치는 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과가 기재된다.
물질들 및 방법들
동물들
반추위로 캐뉼라 삽입된(cannulateD) 두 마리의 도태시킨(culled) 암소들이 사용되었다. 인 새코(in sacco) 실험의 전체 기간 동안, 동물들은 생목초 풀 (4 kg), 옥수수(maize) 사일리지 (5 kg/j), 썬(chopped) 짚 (1 kg) 및 농축물 (1kg)의 혼합물로 먹였다.
성분들
4 개의 사료들(feedstuffs)이 인 새코(in sacco)로 연구되었다: 목건초, 건초 사일리지(silage), 옥수수(maize) 사일리지 및 콩(soya) 케이크. 실험 성분들의 화학적 조성물이 표 12에 보여진다.
성분들 MAT1 (%) NDF(%) 전분 (%) 크루드 에너지
(kcal/kg DM)
콩(Soya) 55.37 15.18 N/A2 4636.92
생목초(Haylage) 17.90 44.72 N/A 4106.45
옥수수(maize) 5.07 53.53 19.5 4546.62
건초 6.89 65.93 N/A 4306.68
표 12: 사용된 성분들의 화학적 조성물
1MAT: 총 질소-함유 물질
2N/A : 적용할 수 없음
다른 성분들은 동결건조되었고, 실험실 그라인더를 수단으로 하여 1 mm으로 그라인딩되었다.
아스퍼질러스 네오나이거의 균주를 이용하여 예 1에 기재된 생산 방법에 따라 준비된 효소 조성물은 <<위쪽(top) 먹이기(feeding)>>로서 동물들에 분포 단계 동안 그것의 사용을 가능하게 하고 조성물의 좋은 균질성을 보장하기 위하여 프리믹스로서 표준화되었다. 수득된 프리믹스는 3,375 BGU/동물/일(day)을 제공하기 위하여 총 배급으로 혼합되었다. 이로써 표준화된 프리믹스의 특성들은: 70 AXC/g, 213 BGU/g 및 28 CMC/g이다.
동물의 반추위 대사 상에 본 발명에 따른 효소 조성물에 의하여 유도된 변화들을 연구하기 위하여, 2 마리의 캐뉼라 삽입된(cannulateD) 건조된(dry) 젖소들(dairy cows)이 나일론 가방들로 기술의 사용으로 인 새코(in sacco) 실험을 수행하는데 이용되었다. (Ørskov, E. R., Hovell, D and Mould, F. L. (1980). The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs. Tropical Animal Production 5: 195-213.). 인 새코(in sacco) 소화율들의 두 시리즈들이 4 개의 시험된 사료들(feedstuffs) 상에 수행되었다: 상기 기재된 사료(feed) 식이를 겪은 동물들로의 한 시리즈(대조군), 뒤이어 약 1 g/kg of 사료(feedstuff)의 양으로 본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된 식이에 3주간 적응 후 동일한 동물들 상에 수행된 한 시리즈(시험군)(~15 g/d/동물). 실험 계획은 하기와 같았다: 4 성분들 × 2 처리들 (대조군 또는 시험군) × 4 가방들 × 7 측정 시간들 (0, 3, 6, 9, 12, 24, 48 h) = 224 가방들. 가방들 안의 발효된 사료들(feedstuffs) (0, 6, 12, 24, 48 시간)이 그것들의 크루드 단백질 함량들, NDF, 에너지 및 녹말 함량들(옥수수(maize) 사일리지 전용(exclusively) 녹말)에 대하여 분석되었다.
가수분해 전 및 후 성분들의 건조물 및 크루드 단백질들 함량들은 참고 방법들을 통하여 결정되었다 (method 967.03; method 981.10; "Official methods of analysis", AOAC, 1990, Ed. Kenneth Helrich). 옥수수(maize) 사일리지의 녹말 함량들은 효소 및 비색(colorimetric) 방법에 의하여 결정되었다(Megazyme Ltd, Ireland). Van Soest et al. (Van Soest P.J., Robertson J.B., Lewis B.A. (1991): Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch saccharide in relation to animal nutrition. J. Dairy Sci., 74, 3583-3597)의 방법에 따른 NDF (중성(Neutral) 세제(Detergent) 섬우(Fiber)) 함량들은 ANKOM 시스템으로 내열성 아미라제를 이용함으로써 결정되었다.
인 새코(in sacco) 소화의 말에, 건조물의, 단백질들의, 에너지의, NDF의 그리고 녹말의 소화율들이 계산되었고, 분해(degradation) 동역학(kinetics) 및 보충이 없는(N = 8) 그리고 관련 성분에 따라 통계적으로 비교된 값들이 Orskov 및 McDonald의 모델의 수단에 의하여 견본을 만들었다(Orskov, E.R. and McDonald, Y. 1979. Protein 분해성 in the rumen was estimated from determining the digestibility of feeds in the rumen. (Daynal Agricultural Science, Cambridge 92:499-503). 암소는 무작위(random) 요소(factor)로 고려되었다.
결과들
캐뉼라 삽입된(cannulated) 암소들의 반추위에서 배양된 나일론 가방들에 함유된 성분들의 건조물들의 최종 소화율은 암소들에게 본 발명에 따른 효소 조성물의 분포에 의하여 중요하게 변하지 않았다(표 13). 그러나, 분해 동역학은 실제로 사료들(fodders), 특히 생목초 풀에게 영향을 받았는데, 이는 24 시간 후 소화율이 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 하 0.820에 도달한 것에 비하여, 그것이 없이 0.645였기 때문이다(P<0.05).
이 경향은 중성 세제에서의 불용성 섬유들 (NDF)의 부분(fraction)의 더 급격한 분해로 확인되었다(표 14). 정말, 본 발명에 따른 효소 조성물의 첨가는 24 시간 후 NDF의 분해성을 생목초 풀에 대하여 0.370부터 0.685까지 되게 만들고(P<0.05), 같은 경향이 중요하지 않은 차이이지만 질소와 더불어, 옥수수(maize) 및 건초에서 관찰된다(표 15) (P>0.05).
본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된 암소들이 비-보충된 암소들과 비교될 때 6 및 12 시간 후 콩(soya)에 함유된 크루드(crude) 에너지의 분해성은 더 컸다(0.600 및 0.540 vs. 0.420 및 0.490)(표 16).
　 　 건조물의 소화율
(사료( feedstuff )의 g/g, n=4)
발효 시간(h) 0 3 6 9 12 24 48
콩(Soya)
 시험군 0.409 0.480 0.625 0.695 0.715 0.880 0.968
대조군 0.409 0.496 0.480 0.651 0.735 0.860 1.001
풀 사일리지
 시험군 0.409 0.424 0.495 0.551 0.560 0.820 0.855
대조군 0.409 0.444 0.470 0.540 0.590 0.645 0.845
옥수수(Maize) 사일리지 시험군 0.407 0.477 0.515 0.489 0.605 0.650 0.760
대조군 0.407 0.474 0.480 0.534 0.545 0.585 0.735
건초
　		 시험군 0.235 0.242 0.270 0.307 0.320 0.445 0.570
대조군 0.235 0.263 0.290 0.316 0.315 0.390 0.550
굵은 활자: 중요한 차이 (p<0.05)
표 13: 0, 3, 6, 9, 12, 24 및 48 시간 후 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 또는 부존재 하 인 새코(in sacco) 건조물의 소화율(N = 4)(사료(feedstuff))의 g/g)
　 　 NDF의 소화율
(사료( feedstuff )의 g/g, n=2)
발효 시간 (h) 　 0 6 12 24 48
콩(Soya)
 시험군 0.242 0.390 0.480 * *
대조군 0.240 0.270 0.605 * *
풀(Grass) 사일리지
 시험군 0.028 0.080 0.270 0.685 0.765
대조군 0.028 0.060 0.200 0.370 0.730
옥수수(Maize) 사일리지
 시험군 0.072 0.225 0.360 0.440 0.620
대조군 0.072 0.180 0.285 0.335 0.585
건초
　		 시험군 0.028 0.045 0.120 0.285 0.455
대조군 0.028 0.100 0.125 0.220 0.430
*: 본 분석을 수행하기 위한 나일론 가방 샘플이 불충분함.
굵은 활자: 중요한 차이 (P<0.05)
표 14: 0, 6, 12, 24 및 48 시간 후 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 또는 부존재 하 인 새코(in sacco) NDF의 소화율 (N = 2) (사료(feedstuff)의 g/g)
　 　 MAT의 소화율
(사료( feedstuff )의 g/g, n=2)
발효 시간(h) 　 6 6 12 24 48
콩(Soya)
 시험군 0.228 0.590 0.595 * *
대조군 0.228 0.325 0.625 * *
풀 사일리지
 시험군 0.303 0.665 0.720 0.910 0.955
대조군 0.303 0.640 0.740 0.785 0.935
옥수수(maize) 사일리지
 시험군 0.705 0.705 0.745 0.765 0.780
대조군 0.705 0.715 0.705 0.745 0.780
건초
　		 시험군 0.303 0.420 0.395 0.525 0.655
대조군 0.303 0.375 0.415 0.475 0.655
*: 분석을 수행하기 위한 나일론 가방 샘플이 불충분함.
굵은 활자: 중요한 차이 (P<0.05)
표 15 : 0, 6, 12, 24 및 48 시간 후 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 또는 부존재 하 인 새코(in sacco) 질소의 소화율(N = 2) (사료(feedstuff)의 g/g)
　 크루드 에너지의 소화율
(사료( feedstuff )의 g/g, n=2)
발효 시간 (h) 　 0 6 12 24 48
콩(Soya)
 시험군 0.374 0.600 0.540 * *
대조군 0.374 0.420 0.490 * *
풀 사일리지
 시험군 0.199 0.435 0.660 0.806 0.838
대조군 0.199 0.415 0.505 0.678 0.827
옥수수(maize) 사일리지
 시험군 0.414 0.520 0.530 0.570 0.760
대조군 0.414 0.490 0.550 0.590 0.680
건초
　		 시험군 0.199 0.240 0.285 0.415 0.490
대조군 0.199 0.220 0.285 0.350 0.515
*: 분석을 수행하기 위한 나일론 가방 샘플이 불충분함.
굵은 활자: 중요한 차이 (P<0.05)
표 16 : 0, 6, 12, 24 및 48 시간 후 본 발명에 따른 효소 조성물의 존재 또는 부존재 하 인 새코(in sacco) 크루드 에너지의 소화율 (N = 2) (사료(feedstuff)의 g/g)
섬유질 사료들(feedstuffs)에 대한 본 발명에 따른 효소 조성물의 중요한 영향의 가설이 이들 인 새코(in sacco) 분해성 측정들로 확인된다. 본 발명에 따른 효소 조성물은 3개의 섬유질 사료들(feedstuffs)의 분해 공정들을 가속화하고, 중요하게는 생목초 풀 특히 그것의 섬유질(fiber) 부분(fraction) (NDF)의 발효를 가속화하는 것을 가능하게 한다. 젖소들에서의 결과들은 반추위의 매우 큰 것(bulkiness)의 감소 및 사료들(fodders)의 섭취 능력의 증가일 수 있다. 이 효과는 사료들(fodders)을 소모함으로써 음식에 대한 그것들의 필요를 만족시키는데 어려움들이 있고, 따라서 사료(fodder) 자원들보다 더욱 비싼 생산 농축물들에 의하여 중요한 방식으로 보충되어야 하는 젖 분비(lactation) 동물들에 대한 특정 관심일 수 있다.
이 예는 본 발명에 따른 효소 조성물을 제공하는 것이 동물들에 의한 사료(fodder) 자원들의 더 나은 공정가격설정(valorization) 및 그러므로 더 나은 식품 효율을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
예 7 : 본 발명에 따른 효소 조성물이 배양 튜브들에서 그리고 오버플로우(overflow)인 호기성(anaerobic) 반응기(reactor)( OARs )에서 반추위의 미생물의 물질대사에 미치는 영향의 측정.
이 예의 목적들은:
1) 소 가축의 세 개의 특징적인 배급들 상에 6개의 오버플로우(overflow) 호기성(anaerobic) 반응기들(reactors) (OAR)에서 배양되는 소 반추위의 미생물의 물질대사에 대한 본 발명에 따른 효소 조성물의 효과들을 정량화 하는 것. OAR들은 이중(double) 폐수(effluent)로 계속된 발효기들이다.
2) 배양 튜브들에서, 크루드 효소 조성물의, 그것의 가용성 및 불용성 부분들 및 배양 24 시간 후 가스의 그리고 휘발성(volatile) 지방산들(fatty acids)(VFA)의 생산들에 오토클레이브를 통하여 불활성화되는 효소 조성물의 영향을 측정함으로써, 반추위 발효들에 본 발명에 따른 효소 조성물의 작용의 모드를 명시하는 것
이다.
물질들 및 방법들
오버플로우(overflow) 호기성(anaerobic) 반응기(reactor) (OAR)에서의 시험
1 리터(litre)의 작업량으로 6 개의 발효기들이 사용되며, 각각 0.03 및 0.06 h- 1 의 고체상 및 액체상의 갱신률(renewal rates)들로 조정된다. 이들 발효기들은 1 mm 웹(web) 상 여과된 젖소 반추위의 내용물(contents)들로 접종된다. 발효기의 pH는 버퍼 용액들(카보네이트 및 포스페이트)의 계속적인 투입에 의하여 6.0 이 넘게 유지된다. 기질들 (feedstuffs)의 공급은 규정된 시간에 수행된다: 11시간 및 23 시간. 발효기들의 평형 단계(phase)은 샘플 채취들 및 측정의 단계(phase) 전 처음 5일 동안 수행된다.
본 발명에 따른 효소 조성물은 DM 배급량(ration)의 kg 당 10 g의 레벨에서 넣어진다. 일일 공급량은 발효기 당 0.25 g이다. 두 개의 효소 조성물 무리들(batches)이 한편으로는 아스퍼질러스 터빈겐시스 (no. 1) 의 균주 및 다른 한편으로는 아스퍼질러스 네오나이거 (no. 2)의 균주를 이용함으로써 예 1에 기재된 생산 방법에 따라 준비된다. 이로써 얻어지는 효소 조성물들은 하기 특징들을 갖는다: no. 1 버젼을 위하여, 1,037 AXC/g, 1,063 BGU/g 및 262 CMC/g; no. 2 버젼을 위하여, 3,399 AXC/g, 3,623 BGU/g 및 846 CMC/g. 수득된 조성물들 둘다, 그것의 발효기들로의 편입(incorporation)을 가능하게 하기 위하여 두 개의 프리믹스들로서, 표준화되었다. 이로써 표준화된 프리믹스들의 특성들은: 버젼 no. 1에 대하여 171 AXC/g, 225 BGU/g 및 67 CMC/g; 버젼 no. 2에 대하여 122 AXC/g, 280 BGU/g 및 75 CMC/g.
이소(iso)-질소함유(nitrogenous) 및 이소(iso)-에너지의(energetic) 식이들(diets)을 만들어내기 위하여 배급량(rations)은 밀 및 콩(soya) 케이크를 함유한다.
여러가지 시험된 요인들은:
1) 3가지 레벨들에서 요인, 산물: 부존재(absence) / 효소 조성물 no. 1 / 효소 조성물 no. 2
2) 3가지 레벨들에서 요인, 식이들: 옥수수(maize) 사일리지 / 풀(grass) 사일리지 / 새발풀(orchard grass) 건초(hay)에 기초함.
이다.
선택된 실험 계획은 각각 5-일(day) 평형(equilibration) 상(phase) 및 측정들의 상(phase) 및 2 일(days)의 샘플 채취를 포함하는, 3개의 7일의 실험 기간들에 대응하는, 3개의 균형 잡힌 불완전한 단위들(blocks)(표 17)에서의 계획이다.
발효기들
A B C D E F
단위 1 식이 효소 조성물 EH
No.1		 EM
No.1		 F
0		 F
No.2		 EM
0		 EH
No.2
단위 2 식이 효소 조성물 F
No.2		 EH
0		 EH
No.1		 EM
No.2		 F
No.1		 EM
0
단위 3 식이 효소 조성물 EH
0		 EM
No.1		 EM
No.2		 F
0		 EH
No.2		 F
No.1
EH: 풀(grass) 사일리지; EM: 옥수수(maize) 사일리지; F: 대초원(prairie) 건초(hay)
표 17: 여러가지 사료들(feedstuffs) 및 두 버젼들의 효소 조성물로 OAR들에서의 시험들의 실험 계획.
시험들 동안 수행되는 샘플 채취들 및 측정들은:
- pH, 산화환원전위(redox potential).
- 발효 외관(facies)의 결정 및 원생동물문(protozoa)을 세기 위한 발효기 내용물들(contents) (VFA, 암모니아성(ammoniacal) 질소).
- 생산된 부피 및 그것의 조성물을 측정하기 위한 (2일 동안 수집된) 가스
- 배급들(rations), 발효 및 미생물 단백질들의 합성의 분해 결과를 위한, 2일 동안 수집된 폐수들(effluents)
- 신선한 폐수들의 이중(double) 원심분리에 의한 미생물 알갱이들(pellets)
이다.
하기 분석들이 샘플들에 대하여 수행되었다:
-사일리지들, 폐수들 및 발효기 내용들에서 VFA (크로마토그래피)
- 암모니아성 질소(특정 프로브)
- 가스 (크로마토그래피)
- DM, 사료들(feedstuffs) 및 동결건조된 폐수들의 유기 물질
- 사료들(feedstuffs) 및 동결건조된 폐수들의 녹말
- 사료들(feedstuffs) 및 동결건조된 폐수들의 Van Soest에 따른 벽들(walls)의 분별(fractionation)(NDF, ADF, ADL)
- 사료들(feedstuffs) 및 동결건조된 폐수들 및 미생물 알갱이들의 질소 (Dumas 방법)
- 동결건조된 폐수들 및 미생물 알갱이들의 핵(nucleic) 염기들(bases) (크로마토그래피).
통계적 분석은 하기와 같이 분산(variance) 분석 모델로 수행된다: 각각 산물 및 식이 요인들, 블록(block) 및 실험 오차인, P, R, B 및 e로, Yijkl = Pi + Rj + Pi*Rj + Bk + eijkl.
배양 튜브들에서 시험
부틸(butyl)-테플론(teflon) 중격(septum)으로 플러그들(plugs) 설비가 된 72 mL의 60 개의 배양 튜브들이 배급(ration)의 마지막 공급 후 12 시간 샘플 채취된 발효기의 내용물(contens)로 접종되고 표준 절차들에 따라 24 시간 동안 배양된다. 연구된 요인들은:
1) 산물, 5 개 레벨들에서 P 요인: 부존재/조성물 no. 2/ 조성물 no. 2의 불용성 부분 / 조성물 no. 2의 액체 부분(발효 기질 없음) / 오토클레이브로 불활성화된 효소 조성물. 조성물 no. 2의 액체 부분은 조성물 no. 2의 나머지로부터 수성 상(phase)에서 추출된 효소들에 대응한다.
2) 접종원(inoculum), 3 개 레벨들에서 R 요인: 옥수수(maize) 사일리지 / 풀 사일리지 / 닥틸(dactyl) 건초(hay)에 기초한 식이에 적응되고 배양 튜브들에서 동일한 식이를 받음.
본 발명 no. 2에 따른 효소 조성물은 DM 배급(ration)의 kg 당 10 g의 레벨에서 배급(ration)과 같이 넣어진다.
실험 게획은 각 접종원을 위하여 연이어 2일 동안의 2 기간으로 체계화된다. 접종원들은 평형기간 후 효소 조성물을 받지 않은 OAR들 (OAR들에서 실험 계획에서의 산물 요인의 레벨 0)상에서 샘플 채취된다. 두 개의 배양 튜브들은 배양의 일(day) 당 및 처리 당(산물 × 접종원 조합) 시작된다.
시험들 동안 수행된 샘플 채취들 및 측정들은:
- 그것의 VFA 조성물을 결정하기 위한 접종원
- VFA 조성물을 결정하기 위한 튜브들을 위한 배양의 24 시간 후 배양 배지.
- 그것의 조성물의 결정 및 24 시간 배양 후 생산량을 측정하기 위한 가스.
이다.
하기 분석들은 샘플 채취들 상 수행된다:
- 사일리지들, 폐수들 및 발효기들 내용물들에서 VFA (크로마토그래피)
- 가스 (크로마토그래피)
통계적 분석이 분산 분석 모델로 수행된다.
이 분석은 이 물질대사 상 발효 기질의 분리된 효소들의 효과와 비교하여, 반추위의 미생물의 물질대사에 본 발명에 따른 효소 조성물의 유익한 효과를 보여준다.
예 8 : 고체-상태 발효에 의한 본 발명에 따른 효소 조성물의 생산
이 예에서 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주의 존재 하 그리고 옥수수(maize) 싹(germ) 케이크 (추가 기질)의 그리고 평지씨 케이크(cake) 및 밀기울 (주된 기질)의 혼합물로 구성되는 기질의 고체-상태 발효에 의하여 본 발명에 따른 효소 조성물을 수득하는 방법이 기재된다.
영양 배지는 하기 중량 비율로 옥수수(maize) 싹(germ) 케이크가 완비된, 밀기울 및 가루(flour)로서 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 형성된다: 36%의 평지씨 케이크(cake), 36%의 밀기울 및 28%의 옥수수(maize) 싹(germ) 케이크. 그 다음에 혼합물은 60%의 건조물로 전-가습되고(humidified), 35 분 동안 105℃에서 오토클레이브된다. 냉각 후, 배지는 45%의 초기 습도 및 건조물의 그램 당 1×107 포자들의 농도를 얻기 위하여 아스퍼질러스 터빈겐시스의 포자들의 용액으로 접종된다. pH는 황산을 첨가함으로써 4.9로 조정된다. 이로써 얻어지는 배양 배지는 바이알(vial) 당 10 g의 건조물의 양으로 에를렌마이어 바이알들에서 분포된다. 에를렌마이어 바이알들은 그 다음에 임의의 젓는 것 없이 72 시간 동안 어둠에서 호기 조건들 하 33℃에서 배양된다. 배양은 배양 배지에서 첫 번째 포자들의 출연 즉시 중단된다(포자들의 존재는 섭취 동안 그것들의 휘발성 때문에 동물들을 방해할 수 있어, 그것들을 가능한한 적게 포함하기 위하여 발효된 산물들이 설계된다).
발효 말에 수득된 혼합물은 건조되고 동물들의 사료(feed)로 사용되고 또는 액체 형태로 첨가되기 위하여 물로 추출될 수 있다.
발효 72 시간 후 이로써 수득되는 조성물의 특성들은: 2,650 AXC/g, 4,808 BGU/g 및 1,050 CMC/g이다.

Claims (20)

  1. 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로 발효된, 밀, 밀기울, 평지씨 케이크(cake), 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 주된 기질을 포함하는 효소 조성물로,
    상기 효소 조성물은,
    (i) 조성물의 그램 당 500 AXC과 동등하거나 또는 그보다 더 큰 자일라나제 활성,
    (ii) 조성물의 그램 당 500 BGU와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성, 및
    (iii) 조성물의 그램 당 50 CMC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성
    을 보이는 효소 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 분기군(clade) 아스퍼질러스 나이거의 균주인 효소 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 서브-분기군 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주인 효소 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 아스퍼질러스 터빈겐시스 또는 아스퍼질러스 네오나이거의 균주인 효소 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주인 효소 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질은 고체-상태 발효에 의하여 아스퍼질러스 섹션 니그리의 균주로 발효되는 효소 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    기질은 밀기울 및 평지씨 케이크의 혼합물로 구성되는 효소 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    밀기울 및 평지씨 케이크는 20/80부터 50/50까지의 범위의 질량(mass) 비인 효소 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 조성물의 그램 당 1000 AXC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 자일라나제 활성,
    (ii) 조성물의 그램 당 800 BGU와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성,및
    (iii) 조성물의 그램 당 120 CMC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성
    을 보이는 효소 조성물.
  10. 적어도 발효 산물이 효소 활성의 하기 최소 값들을 보일 때까지, 서브-분기군 A. 터빈겐시스의 균주로, 밀, 밀기울, 평지씨 케이크, 밀 및 밀기울의 혼합물, 밀 및 평지씨 케이크의 혼합물, 밀기울 및 평지씨 케이크(cake)의 혼합물, 및 밀, 밀기울 및 평지씨 케이크의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 주된 기질의 고체-상태 발효의 단계를 포함하는,
    제 3항에서 정의된 효소 조성물의 제조 방법:
    (i) 조성물의 그램 당 500 AXC과 동등하거나 또는 그보다 더 큰 자일라나제 활성,
    (ii) 조성물의 그램 당 500 BGU와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 β-글루카나제 활성, 및
    (iii) 조성물의 그램 당 50 CMC와 동등하거나 또는 그보다 더 큰 셀룰라제 활성.
  11. 제 10항에 있어서,
    서브-분기군 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주는 아스퍼질러스 터빈겐시스 또는 아스퍼질러스 네오나이거의 균주인 제조 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    서브-분기군 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주는 아스퍼질러스 터빈겐시스의 균주인 제조 방법.
  13. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 효소 조성물을 포함하는 반추류의 사료(feed)용 첨가제.
  14. 반추류를 먹이기 위한 프리믹스들 또는 사료(feed) 조성물들의 성분으로서 제 13항의 첨가제의 사용.
  15. 제 13항의 첨가제를 포함하는 반추류의 사료(feed)용 프리믹스.
  16. 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)과 관련하여, 제 15항의 프리믹스 또는 제 13항의 첨가제의 효과적인 양을 포함하는 반추류를 위한 보충된 사료(feed) 조성물.
  17. 반추류에 적합한 사료들(feedstuffs)과 제 15항의 프리믹스 또는 제 13항의 첨가제를 혼합하는 단계를 포함하는 반추류를 위한 보충된 사료(feed) 조성물의 제조 방법.
  18. 반추동물의 축산학적 성과를 개선시키기 위한, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 효소 조성물, 제 13항의 첨가제, 제 15항의 프리믹스, 또는 제 16항의 사료(feed) 조성물의 사용.
  19. 제 18항에 있어서,
    우유 생산을 증가시키는 것 및/또는 소비 지수 및/또는 식품 효율을 개선시키는 것 및/또는 체중 증가를 촉진시키는 것 및/또는 반추 활성을 증가시키는 것 및/또는 사료들(fodders) 및 농축물의 소화율을 증가시키는 것 및/또는 메탄의 생산을 감소시키는 것을 위한 사용.
  20. 반추동물이 유효한 양의 제 1항 내지 제 9항 어느 한 항의 효소 조성물, 제 13항의 첨가제, 제 15항의 프리믹스 또는 제 16항의 사료(feed) 조성물을 섭취하게 만들어지는 반추동물의 축산학적 성과를 개선시키는 방법.


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KR102082427B1 (ko) * 2019-03-19 2020-03-02 주식회사 씨티씨바이오 반추동물의 사료전환효율 증진용 저단백 사료 조성물
WO2020189916A1 (ko) * 2019-03-19 2020-09-24 주식회사 씨티씨바이오 반추동물의 사료전환효율 증진용 저단백 사료 조성물

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