KR20160095738A - 황칠 발효 식초를 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠을 미생물 발효시켜서 얻은 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황칠 발효 식초 성분은 순환기계에서는 혈관 이완 작용, 중추신경계에서는 신경 전달 물질로, 면역계에서는 방어 물질로 알려진 산화질소의 생성을 촉진함으로써 항염증 및 항알러지 효과를 기대할 수 있으며, 면역 활성 사이토카인인, TNF-α, IL-1β의 분비량을 증가시킴으로써 면역증강제로서 기능할 수 있으며, 뿐만 아니라 피브린 클롯의 형성을 억제시키는 항-피브린 클롯 활성을 나타내고, 피브린 클롯 에세이를 통해 혈전의 주요 구성물인 피브린 클롯 형성시 황칠 발효 식초에서 상당히 높은 억제 효능이 존재함을 확인하였고 농도 의존적으로 효능이 증가하였으며, 항-혈전 활성 에세이를 통해 실험동물의 혈액에서 혈전의 형성시 황칠 발효 식초에서 혈전억제 효능이 존재함을 확인하였고, u-PA의 억제 효능과 유사한 수준의 억제 효능을 확인하여 상당한 수준의 혈행개선 효과를 나타내었다. 또한, 칼슘재첨가 시간 에세이를 통해 황칠 발효 식초에서 인간유래 혈장의 응고반응을 억제하는 항응고 효과가 있음을 확인하였고, 중성지방 성분을 분해하고 리파아제 유사하거나 높은 효능의 지질분해 활성을 나타내어 이를 요하는 식품으로 이용될 수 있다.

Description

황칠 발효 식초를 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조방법{Functional food comprising Dendropanax morbifera Lev. fermentation vinegar and process for preparing the same}

본 발명은 황칠을 미생물 발효시켜서 얻은 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

황칠나무는 그 학명이 Dendropanax morbifera Lev.로서 우리나라에서만 자생하는 천연보호림이며, 두릅나무과에 속하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않으며, 세계적으로도 귀한 난지성 수목으로, 우리나라에는 1속 1종 밖에 없으며 서남해안 및 제주도, 진도, 장흥, 완도, 해남, 거제도 등 도서지역에 자생하고, 특히 전라남도가 전국 재배량의 99%를 차지하고 있으며, 10년생 이상의 수목들이 대량 재배되고 있는 상록활엽교목으로 예전부터 다양한 용도로 사용되어 왔으며, 수피에 상처를 주면 수지액이 흘러나오는데 이러한 수지액을 황칠이라 부른다. 그 수피에서 나오는 황칠은 찬란한 금빛을 띄어서 예전부터 황칠은 황제의 갑옷, 금속 장신구 등의 외간을 황금색으로 장식하는 진귀한 도료로 사용되어 왔으며, 안식향을 함유하여 예로부터 약리효과가 탁월한 신비한 나무로 주목을 받아 왔다.

황칠나무는 인간의 질병의 치유 및 예방에 유용한 성분을 다량 함유하고 있고, 최근 들어 다양한 기능성 연구결과가 보고되고 있어 전문적인 제품화기술 및 마케팅 지원을 통하여 충분히 건강기능식품 및 웰빙식품으로 고부가가치화 제품을 개발 할 수 있고 지역경제 활성화에 큰 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

종래 황칠은 그 희귀성 때문에 사업화가 어려웠으나, 최근 대량재배와 조직배양 성공 등에 힘입어 기능성 식품 등으로서의 용도를 포함하는 다양한 연구 개발이 이루어지고 있다.

한편, 천연물을 이용하여 식초를 제조하는 기술로서는 등록 특허 제10-0393682호(2003.07.23)에 다슬기를 이용한 천연 양조식초의 제조방법이 개시되어 있는데, 이 기술은 다슬기, 송엽, 쑥, 생강 등 생약식물과 과실을 혼용하여 양조식초를 제조하고 이를 음용하여 건강을 보조할 수 있는 양조식초를 제조하고자 하는 것이며 다슬기, 송엽, 생강을 청정수에 넣고 닳여서 다슬기액을 추출하고, 동 다슬기액과 고두밥, 누룩가루, 식혜, 생수를 적정비율로 배합하고 이를 7-8일간 자연발효시켜 술을 빚은 후 걸러서 초두루미에 술과 과실을 적정비율로 넣어 1년 이상 자연숙성시켜 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 등록특허 제10-0516359호(2005.09.14)에는 유자과즙을 이용한 식초의 제조방법이 개시되어 있는데, 더욱 상세하게는 희석한 유자과즙에 부영양원을 첨가하고 여기에 에탄올과 종초(Seed Vineger)를 접종하여 면전한 후, 산도가 2％ 되게 초산(acetic acid)을 첨가한 상태에서 발효시켜 유자식초를 제조하고, 이를 피복물질인 말토덱스트린(maltodextrin)과 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 사용하여 분무건조법(spraying process) 또는 동결건조법에 의해 분말화한 분말유자식초를 제공하기 위한 것이다.

등록특허 제10-0500161호(2005.06.29)호에는 현미에 배양한 상황버섯 균사체를 주 재료로 이용한 상황버섯 식초 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 이는 배양기질로 사용하고자 하는 현미를 쪄서 수분함량을 조절함과 동시에 1차 멸균을 한 다음 배양하고자 하는 양적인 면이나 형태적인 면을 조절하여 배양 용기에 담은 후 2차적으로 멸균하여 현미를 기질로 하여 상황버섯균사체 고체 배양물을 배양하는 단계; 주모 담금과 1, 2단 담금에 의해 상황버섯 균사체 고체 배양물을 술덧제조에 사용하는 알콜발효단계; 향과 맛을 한층 더 좋게 하기 위한 초산균의 분리 및 종초 제조단계; 알코올 발효단계에서 생성된 발효물을 활용한 초산발효단계; 및 초산발효단계에서 생성된 발효물의 여과 및 숙성단계;가 구비하는 것을 특징으로 한다.

1. 등록특허 제10-0393682호(2003.07.23) 2. 등록특허 제10-0516359호(2005.09.14) 3. 등록특허 제10-0500161호(2005.06.29)

본 발명자는 황칠나무를 대상으로 새로운 기능성 제품을 개발하고자 예의 연구한 결과, 후술하는 바와 같이 황칠나무 분말을 미생물 발효시켜 얻은 식초가 혈행개선 효능 등의 다양한 생리활성을 나타내어 건강 기능성 식품 등으로 효율적으로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 일면에 있어서 후술하는 방법에 의해 제조된 황칠 발효식초를 주요 성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 황칠 발효 식초의 효능을 식품에 반영시켜 성인병 예방과 치료에 도움이 되는 건강 기능성 식품으로 개발하여 건강증진에 기여하고 지역의 특산물로서 개발하여 지역 경제를 활성화시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 황칠 발효 식초 성분은 순환기계에서는 혈관 이완 작용, 중추신경계에서는 신경 전달 물질로, 면역계에서는 방어 물질로 알려진 산화질소의 생성을 촉진함으로써 항염증 및 항알러지 효과를 기대할 수 있으며, 면역 활성 사이토카인인, TNF-α, IL-1β의 분비량을 증가시킴으로써 면역증강제로서 기능할 수 있으며, 뿐만 아니라 피브린 클롯의 형성을 억제시키는 항-피브린 클롯 활성을 나타내고, 피브린 클롯 에세이를 통해 혈전의 주요 구성물인 피브린 클롯 형성시 황칠 발효 식초에서 상당히 높은 억제 효능이 존재함을 확인하였고 농도 의존적으로 효능이 증가하였으며, 항-혈전 활성 에세이를 통해 실험동물의 혈액에서 혈전의 형성시 황칠 발효 식초에서 혈전억제 효능이 존재함을 확인하였고, u-PA의 억제 효능과 유사한 수준의 억제 효능을 확인하여 상당한 수준의 혈행개선 효과를 나타내었다. 또한, 칼슘재첨가 시간 에세이를 통해 황칠 발효 식초에서 인간유래 혈장의 응고반응을 억제하는 항응고 효과가 있음을 확인하였고, 중성지방 성분을 분해하고 리파아제 유사하거나 높은 효능의 지질분해 활성을 나타내어 이를 요하는 식품으로 이용될 수 있다.

도 1 내지 6은 황칠 발효 식초의 NIH3T3 세포주, HeLa 세포주, SH-SY5Y 세포주, B16F10 세포주, Raw264.7 세포주 및 HaCaT 세포주에서 세포 생존능에 대한 영향을 나타내는 그라프도.
도 7은 Raw 264.7 세포에서 산화 질소(NO)의 생산에 미치는 황칠 발효 식초의 억제효과를 나타내는 그라프도.
도 8은 LPS-자극 Raw 264.7 세포에서 TNF-α의 생성에 미치는 황칠 발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도.
도 9는 LPS-자극 Raw 264.7 세포에서 IL-1β의 생성에 미치는 황칠 발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도.
도 10은 황칠 발효 식초의 Turbidity assay 결과를 나타내는 그라프도.
도 11은 황칠 발효 식초의 항-피브린 클롯 형성 활성을 나타내는 그라프도.
도 12는 항-혈전 활성 에세이 결과를 나타내는 그라프도.
도 13은 칼슘 재첨가 시간 에세이를 나타내는 그라프도.
도 14는 설치류 혈액을 이용한 황칠 발효 식초의 항응고 특성을 나타내는 그라프도.
도 15는 황칠 발효 식초의 트리부티린 플레이트 에세이 결과를 나타내는 사진.

본 발명은 일면에 있어서

황칠나무의 잎 또는 줄기를 초산균에 발효시켜서 얻어진 황칠 발효 식초를 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 다른 일면에 있어서

상기 황칠 발효 식초는

a) 채취한 황칠나무의 잎 또는 줄기를 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하여 황칠 분말을 얻는 단계,

b) 상기 황칠 분말을 발효 용기에 각각 넣고 분말, 설탕 및 증류수를 1: 0.4~0.6:1.4~1.6의 중량비로 혼합하여 발효 배지를 준비하는 단계,

c) 상기 발효 배지에 초산균을 접종하여 25∼30℃에서 150~200 일간 발효시키는 단계, 및

d) 초산발효단계에서 얻어진 황칠 발효물을 원심분리에 의해 5~20 분간 잔류물을 분리한 후 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 황칠 발효식초를 얻는 단계에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 상기 a) 단계에서는 자연 채취한 황칠나무의 잎 또는 줄기(잎과 줄기의 혼합물을 포함함)를 깨끗이 세척한 후, 이물질을 제거하고 세절하여 분말로 얻는다. 분말은 50~200 메쉬의 입도로 분말화하는 더욱 바람직할 수 있다.

이어서 상기 b) 단계에서는 얻어진 황칠 분말을 발효 용기에 각각 넣고 황칠 분말, 설탕 및 정제수를 1:0.4~0.6:1.4~1.6의 중량비로 혼합하여 발효 배지를 준비한다. 위 혼합비에 있어서 설탕의 양이 중요한데, 설탕의 양이 상기한 범위를 벗어나게 되면 유효 성분이 적절하게 용출되지 못할 우려가 있고, 생성된 식초의 품질이 열등할 우려가 있다.

그 다음 c) 단계에서는 상기 발효 배지에 초산균을 접종하여 초산 발효를 수행한다.

초산균은 글루코노백터(Gluconobacter)와 아세토박터(Acetobacter)의 2종류로 나눌 수 있으며, 이들은 당과 알코올을 초산으로 산화시킬 수 있는 능력을 가지고 있는 세균의 집단에 속한다. 두 균의 차이점은 Gluconobacter는 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 재산화시키는 능력이 없는 반면 Acetobacter는 초산과 젖산을 재 산화시킬 수 있는데, 여기서 재산화과정(over-roxidation)이란 에탄올을 이용하여 초산을 생성하고 이어서 초산을 CO₂와 H₂O로 산화시키는 두 가지 과정을 의미한다.

지금까지 알려진 대표적인 초산균 종으로서는 Acetobacter aceti , A. pasteurianus, A. liquefaciens , A. xylinum 그리고 A. methanolicus 등이 있으며, Acetobacter 속은 식초 생산을 위해서 산업적으로 매우 중요하기 때문에 새로운 균주의 분리와 함께 초산균의 개량을 위해서 유전자 재조합 기술을 이용한 주요 효소의 클로닝과 spheroplast fusion을 이용한 돌연변이 획득에 대해서도 연구되고 있는 실정이다.

본 발명에서 사용되는 초산균은 특별한 제한이 없고 식초 제조에 사용되는 통상의 초산균을 상업적으로 구매하여 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti, KCCM 12654)를 액체 배지에 배양하여 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 초산균의 접종량은 발효 배지의 중량을 기준으로 2~10%로 사용하는 것이 바람직하고, 발효는 25∼30℃에서 150~200일간 수행하는 것이 유효 성분의 용출 및 식초의 맛, 향, 색 등의 품질면에서 바람직한 결과를 초래할 수 있다.

이어서, d) 단계에서는 초산 발효에서 얻어진 황칠 발효물을 원심분리(조건: 3,000 ~ 10,000rpm, 10분 전후)한 후 멤브레인 필터(예, 0.20~0.50㎛)를 통과시켜 잔류물을 제거하여 황칠 발효 식초를 얻는다.

상기 발효 식초는 제품화에 앞서 추가로, 55~65℃에서 25~35분간 저온 살균하여 잡균을 제거하는 것이 더욱 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 황칠 발효 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물은 천연 발효 물질의 추출물을 주성부능로 포함하고, 후술하는 실시예 및 시험예의 결과로부터 잘 알 수 있는 바와 같이 피부에 대한 자극성이나 독성이 없어서 안정성이 우수하며, 순환기계에서는 혈관 이완 작용, 중추신경계에서는 신경 전달 물질로, 면역계에서는 방어 물질로 알려진 산화질소의 생성을 촉진함으로써 항염증 및 항알러지 효과를 기대할 수 있으며, 면역 활성 사이토카인인, TNF-α, IL-1β의 분비량을 증가시킴으로써 면역증강제로서 기능할 수 있으며, 뿐만 아니라 피브린 클롯의 형성을 억제시키는 항-피브린 클롯 활성을 나타내고, 피브린 클롯 에세이를 통해 혈전의 주요 구성물인 피브린 클롯 형성시 황칠 발효 식초에서 상당히 높은 억제 효능이 존재함을 확인하였고 농도 의존적으로 효능이 증가하였으며, 항-혈전 활성 에세이를 통해 실험동물의 혈액에서 혈전의 형성시 황칠 발효 식초에서 혈전억제 효능이 존재함을 확인하였고, u-PA의 억제 효능과 유사한 수준의 억제 효능을 확인하여 상당한 수준의 혈행개선 효과를 나타내었다. 또한, 칼슘재첨가 시간 에세이를 통해 황칠 발효 식초에서 인간유래 혈장의 응고반응을 억제하는 항응고 효과가 있음을 확인하였고, 중성지방 성분을 분해하고 리파아제 유사하거나 높은 효능의 지질분해 활성을 나타내어 이를 요하는 식품으로 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 건강 식품으로 이용될 수 있다. 상기 건강기능성 식품은 일반 건강식품 또는 다이어트나 피로회복, 숙취해소용 등의 다목적 기능을 갖는 기능성 건강 식품으로도 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 식품 조성물은 당해 분야에서의 통상적인 방법에 따라, 예를 들면 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태를 포함하는 제형으로 제공할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 섭취량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 개체의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당, 예컨대 25 mg∼2,000 ㎎/㎏이다. 물론 복용량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 섭취량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.

또한, 본 발명의 황칠 발효 식초가 기능성 식품(건강기능식품 및 일반 식품) 조성물로 제조되는 경우에는 식품에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 감미료, 예를 들면 감초, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다.

이들은 본 발명의 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.

음료수는, 예를 들면, 상기 황칠 발효 식초를 0.01~20 중량%으로 넣고, 액상과당 5~20중량%, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~20 중량% 폴리덱스트로스 0.1~3 중량%, 배농축액 0.1~1 중량%, 벌꿀 0.1~0.5중량%, 젖산칼슘 0.01~1 중량%, 향료 0.1~1 중량%, 색소 0.01~0.05 중량%, 구연산나트륨 0.01~0.5중량%, 스테비텐후레쉬 0.01~0.5 중량%, 니코틴산아미드 0.01~0.5 중량%, 로얄제리추출물 0.01~0.5 중량%, L-멘톨 0.0001~0.5 중량% 등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 기능성 음료수로 제조할 수 있다.

또한 본 발명에 의해 황칠 발효 식초를 이용하여 기능성 식품을 개발하게 되면, 벼농사 및 기존 작물의 소득저하로 인한 농가소득 보전을 위한 신 소득 작물의 개발 필요성이 대두되고 있는 농가의 소득 작목으로 자리 매김될 수 있다.

이와 같은 기능성 식품을 제공함으로써 국내 황칠나무 관련 산업의 경쟁력 확보와 고부가가치 상품개발을 통한 수출산업으로의 기반구축이 가능하고, 황칠 가공 식품은 향후 성장가능성이 존재하는 분야로 판단되고 있기 때문에 지역특산품화로 지역경제 활성화가 가능하며, 최근 기능성을 강화한 식초에 대한 소비자 선호와 수요가 점차 확대되면서 식초의 고급화, 다양화 전략으로 기능성식초시장 선점이 가능하며, 식습관 및 쇼핑형태는 지역에 따라 폭넓은 다양성을 나타내고 있기 때문에 시장차별화와 시장세분화 전략으로 시장진입 해소하고, 소비추세나 소비성향을 보면 자연 건강식품생산 소비에 따라 성인병 예방이나 치료에 효능이 좋아 국민건강 증진도모가 가능할 뿐만 아니라, 농산물을 이용 부가가치향상 제품 생산으로 지역브랜드화에 기여할 수 있다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 황칠 발효 식초의 제조

전남 완도군에서 구입한 황칠나무의 잎과 줄기를 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하고 50 메쉬로 분말화하였다. 이 중 1 Kg을 취하여 20 L 발효 용기에 각각 넣고 황칠 분말:설탕을 70 : 30 비율로 혼합한 후 황칠 분말과 설탕의 혼합량과 동일한 무게의 증류수를 넣고, 미리 배양한 초산균 배양액 100mL을 미리 준비한 황칠 배지에 각각 넣고, 27℃에서 180일간 발효시켰다. 초산발효공정에서 얻어진 황칠 발효물을 5,000rpm의 원심분리기에서 10분간 잔류물을 분리한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 황칠 발효식초 650ml을 얻었다.

실시예 2: 황칠 발효 식초를 이용한 동결 건조 분말 제품의 제조

황칠 발효 식초의 기호성 및 휴대성을 제공하기 위하여 실시예 1에서 얻은 황칠발효 식초 100 ml를 동결건조한 후 분쇄기(FM-681C, HANIL, Korea)로 마쇄하여 100 메쉬 체를 통과한 분말을 취하고 식품용 첨가제를 첨가하여 식이섬유 분말 제품을 제조하였다.

실시예 3: 황칠추출물 발효 식초를 이용한 음료의 제조

실시예 1에서 얻은 황칠 발효 식초 5중량%, 액상과당 12중량%, 폴리덱스트로스 1중량%, 배농축액 0.73중량%, 벌꿀 0.5중량%, 구연산 0.1중량%, 젖산칼슘 0.02중량%, 비타민 C 0.04중량%, 수박향료 0.2중량%, 색소 0.05중량%, 구연산나트륨 0.1중량%, 스테비텐후레쉬 0.02중량%, 니코틴산아미드 0.01중량%, 로얄제리추출물 0.01중량%, L-멘톨 0.0005중량% 및 잔여량의 정제수를 첨가하여 황칠발효 식초를 함유하는 음료조성물을 제조하였다.

시험예 1: 항산화 효과

(1) DPPH (1,1- diphenol -2- picrylhydrazyl ) radical 제거 효능 검색

유리 라디칼인 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DDPH)는 자주색을 띄며 515nm에서 최대 흡광도를 보이므로 유리 라디칼 제거 작용을 가지고 있는 물질과 반응 시 노란색이 되면서 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 상기 실시예 1의 시료를 각 농도별로 조제한 용액에 1.5 x 10^-4 M의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 일정량 가하였다. 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분간 방치한 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid와 BHA(butylated hydroxy anisole)를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 대조군으로는 Vitamin C와 BHT를 사용하였다. 황칠 발효식초의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 0~5000 μg/ml 농도에서 소거능이 나타나지 않았다.

(2) 총 폴리페놀 함량 분석

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 실시예 2의 발효 식초 0.1 g에 methanol 10 ㎖을 가하여 70℃에서 30분 동안 추출한 후 1 ㎎/㎖로 희석하여 사용하였다. 검액 50 ㎕에 증류수 650 ㎕를 넣은 후 Folin-Denis reagent를 50 ㎕가하여 3분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응시킨 후 10% Na₂CO₃ 포화용액을 100 ㎕을 첨가하고, 최종 볼륨을 1 ㎖로 맞추기 위해 증류수 150 ㎕을 넣어 잘 혼합시켰다. 37℃ 수조에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV-Vis 분광광도계를 이용하여 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 메탄올 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준 곡선은 탄닌산의 농도를 0~500 ㎍/㎖이 되도록 하고 이로부터 총 페놀 함량을 구하였다. 황칠 발효 식초의 총 페놀 함량을 분석한 결과 황칠 발효 식초에서는 페놀이 측정되지 않았다.

시험예 2: 동물 세포 배양

NIH 3T3(mouse embryo fibroblast cell line), HaCaT(human keratinocyte cell line), SH-SY5Y(human neuroblastoma cell line), HeLa(Human Cervical Adenocarcinoma cell line), Raw 264.7(mouse leukaemic monocyte macrophage cell line), 및 B16F10(mouse skin melanoma cell line)의 동물 세포주를 한국 세포주 은행으로 부터 분양받아 각각의 세포주 배지에 10% 태아 송아지 혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 혼합하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂, 습도 95% 조건하에서 배양하였다. 48 시간을 주기로 배지를 교체하였으며, 70~80% confluency에 도달하였을 때 Trypsin/EDTA를 이용하여 트립신화(trypsinization)한 후 계대 배양하여 유지하였다. 상기 세포주에 실시예 1의 추출물을 일정한 투여량의존(dose-dependent)와 시간 의존(time-dependent) 방식으로 처리하였다. 이를 후속의 시험에 사용하였다.

시험예 3: 세포 생존율 측정

96 웰 플레이트에 1 x 10⁴ cells/well의 밀도로 상기 각각의 세포주를 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 실시예 2의 황칠 식초를 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000μg/ml가 되도록 처리하였다. 24시간 후, MTT 시약(최종 농도: 0.5㎎/㎖을 각 well에 100㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시켰다. 형성된 포르마잔은 DMSO를 이용하여 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과를 도 1 내지 6에 나타내었다. 도 1 내지 6은 NIH3T3 세포주, HeLa 세포주, SH-SY5Y 세포주, B16F10 세포주, Raw264.7 세포주 및 HaCaT 세포주에서 세포 생존능에 대한 영향을 나타내는 그라프도이다.

모든 시료에서 1000μg/ml까지는 세포 생존율에서 큰 변화를 나타내지는 않았지만 모든 세포주에서 2000μg/ml 이상의 농도에서는 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 항염증 및 항알러지 효과

(1) NO 생성량 측정

산화질소(Nitric oxide, NO)는 면역계에서 외부로부터 들어온 물질에 대해 방어작용을 하는 중요한 신호 전달 물질 중 하나이다. NO는 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 생성되며 대부분의 세포에 영향을 미쳐 순환기계에서는 혈관 이완 작용, 중추신경계에서는 신경 전달 물질로, 면역계에서는 방어 물질로 알려져 있다. 황칠 발효식초가 대식 세포를 활성화시켜 NO 생성에 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여 Griess reagent를 이용하여 세포 배양액 내의 nitrite 생성량을 측정하였다. Raw 264.7 세포를 1.5 x 10⁵ cells로 조절하여 24 웰 플레이트에 분주하여, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 실시예 1의 황칠 발효 식초를 50, 100, 300 ㎍/㎖을 처리하고, 양성 대조군으로는 1 μg/mL의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하였다. 플레이트에서 배양액 100㎕를 분리하여 Griess reagent(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H₂O) 100㎕를 더해준 후 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 시킨 후 마이크로플레이트 판독기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 sodium nitrite를 사용하여 농도별 표준곡선을 그린 후 이를 이용하여 배양액 내의 NO 생성량을 정량하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 Raw 264.7 세포에서 산화 질소(NO)의 생산에 미치는 황칠 발효 식초의 억제효과를 나타내는 그라프도이다. 값은 3회 독릴 실험의 평균±S.D.으로 나타내었다.

황칠 발효 식초에서 NO의 생성량은 양성 대조군인 LPS의 NO 생성량 수준에는 미치지 못하였으나, 농도 의존적으로 증가하였다.

(2) ELISA

황칠 발효 식초에 의한 배양액 내의 사이토카인(cytokine) 생성량 변화를 측정하기 위하여 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포를 1.5 x 10⁵cells로 조절하여 24 웰 플레이트에 분주하여, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 실시예 1의 황칠 발효 식초를 50, 100, 300 ㎍/㎖을 처리하고, 양성대조군으로는 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하였다. 24시간 후 플레이트에서 배양액 100㎕를 분리하여 시료로 사용하였으며 각 kit의 매뉴얼에 따라 생성량을 측정하였다.

(3) Cytokine 생성 시험

외부 자극에 의해 활성화된 대식 세포는 IL-1β, TNF-α 등과 같은 사이토카인(cytokine)을 분비함으로써 면역반응을 유도한다. 실시예 1에 따른 황칠 발효 식초에 의한 대식세포의 또 다른 면역 증강 효과를 확인하기 위하여 활성이 증가된 대식 세포로부터 분비되는 면역 활성 사이토카인, TNF-α, IL-1β의 분비량을 ELISA를 이용하여 분석하였다. Raw 264.7 세포들을 다양한 농도(50, 100 및 300 μg/ml)의 DMV(황칠 발효 식초) 또는 LPS (1 μg/ml)로 처리한 후 상층액을 수확하여 분석하였다.

그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 도 8은 LPS-자극 Raw 264.7 세포에서 TNF-α의 생성에 미치는 황칠 발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도이고, 도 9는 LPS-자극 Raw 264.7 세포에서 IL-1β의 생성에 미치는 황칠 발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도이다.

도 8 및 9의 결과로부터 LPS를 처리한 경우 대조군에 비하여 높은 양의 IL-1β와 TNF-α를 생성하였다. 양성 대조군인 LPS의 IL-1β와 TNF-α 생성량 수준에는 미치지 못하였으나, 대조군에 비하여 황칠 발효 식초의 처리 농도가 증가할수록 IL-1β와 TNF-α의 생성량은 증가하였다.

시험예 5: 황칠 발효 식초의 항혈전 효과 분석

(1) Turbidity assay

피브린 클롯(fibrin clot)의 밀도를 실시간 추적하여 시료의 억제 활성을 분석하였다. Turbidity assay법은 혈전(thrombus)의 주요 구성물인 피브린 클롯을 형성시키기 위한 주요 인자인 인간 피브리노겐과 인간 트롬빈을 이용한 것이다.

실시예 1의 황칠 발효 식초와 피브린 클롯 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 405 nm에서 피브린 클롯을 실시간 추적하여 황칠 발효 식초의 피브린 클롯 억제효능을 분석하였다.

100 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)에 준비된 1% 인간 피브리노겐 90 μl에 10 U/ml 트롬빈 10 μl과 다양한 농도의 시료(음성 대조군(피브리노겐 + 트롬빈); 5-500 μg, 시료군(피브리노겐 + 트롬빈 + DVM 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 μg); 8 IU u-PA, 양성 대조군(피브리노겐 + 트롬빈 + 8 IU u-PA))를 동시에 첨가한 후 수회 피펫팅(pipetting)하여 완전히 섞은 혼합물을 96-웰 마이크로플레이트에 부하하여 24시간 동안 350nm와 405nm로 측정 대조군은 시료를 첨가하지 않은 혼합물을 같은 조건으로 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 혼합물(fibrinogen + thrombin + sample or u-PA)의 OD 값을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10은 황칠 발효 식초의 Turbidity assay 결과를 나타내는 그라프도이다.

도 10의 결과로부터, 인간 피브리노겐과 인간 혈전만 반응시킨 음성 대조군에서 60분 동안 지속적으로 피브린 클롯의 밀도가 증가하여 0.8422의 OD₄₀₅ 값을 확인하였고 인간 피브리노겐과 인간 혈전에 8 IU u-PA를 첨가한 양성 대조군에서는 반응 시작 후 10분 동안 피브린 클롯의 밀도가 증가했으나 이후 피브린 클롯 형성이 강하게 억제된 것을 확인하였으며, 60 분 후 0.0548의 OD₄₀₅ 값을 확인하였다. 황칠 발효 식초를 다양한 농도로 (5-500 μg) 처리한 실험군에서는 각 농도에서 0.8331 (5 μg), 0.8123 (10 μg), 0.7863 (20 μg), 0.7403 (50 μg), 0.7395 (100 μg), 0.6597 (200 μg), 0.658 (500 μg)의 OD₄₀₅ value가 확인되었다.

이는 인간 피브리노겐과 인간 트롬빈만 반응시킨 대조군 음성 대조군의 피브린 클롯 밀도와 비교해볼 때 황칠 발효 식초의 가장 높은 농도에서 약 22.9 %의 피브린 클롯 억제 효능이 확인되었으며, 5 μg에서는 1.1 %, 10 μg에서는 3.6 %, 20 μg에서는 6.6 %, 50 μg에서는 12.1 %, 100 μg에서는 12.2 %, 200 μg에서는 21.7 %의 피브린 클롯 억제효능을 확인하였다. 8 IU u-PA를 이용한 양성 대조군의 억제효능(93.5 %)과 황칠식초의 억제효능을 비교해보면 기존의 혈전증 질환 치료에 이용되고 있는 u-PA 효능과 약 4배의 차이를 보였으나 피브린 클롯의 형성을 약 1-23 %까지 억제시키는 항-피브린 클롯 활성이 있음을 확인하였다.

(2) 피브린 클롯 에세이

피브린 클롯을 형성시키기 위해 모든 재료를 첨가한 혼합물과 다양한 농도의 시료를 동시에 반응시키거나 각 재료와 다양한 시간으로 미리 반응시켜 피브린 형성에 대한 억제 활성을 분석하였다.

피브린 클롯 에세이법은 피브린 클롯을 형성시킬 때 시료를 동시에 처리하거나 전처리하여 시료의 피브린 클롯 형성억제 효능을 평가하기 위한 가시적 분석 실험법이다.

구체적으로, 100 mM NaCl를 함유한 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 준비한 1% 인간 피브리노겐 90 μl에 0.5 U/ml 트롬빈 10 μl과 다양한 농도의 시료(NC, 피브린 클롯 단독의 음성 대조군; PC, 피브린 클롯 + 8 IU u-PA의 양성 대조군; DMV(황칠 발효 식초) + 피브린 클롯 5-500, 5-500 μg)를 동시에 또는 미리 반응시킨 것을 첨가한 후 수회 피펫팅하여 완전히 섞은 혼합물을 37℃에서 6시간 동안 반응시켜 형성된 피브린 클롯의 무게를 측정하여 억제 효능을 분석하고, 대조군은 시료를 첨가하지 않은 혼합물을 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하였다.

다양한 농도 (5-500 μg)의 황칠 발효 식초와 피브린 클롯 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 6 시간 동안 반응시킨 후 형성된 피브린 클롯의 무게를 측정하여 황칠 발효 식초의 피브린 클롯 형성억제 효능을 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11은 황칠 발효 식초의 항-피브린 클롯 형성 활성을 나타내는 그라프도이다.

음성 대조군을 통해 피브린 클롯이 강하게 형성된 것을 확인하였고 인간 ㅍ피브리노겐과 인간 혈전만 반응시킨 음성 대조군의 억제 효능을 0 %라고 볼 때, 양성 대조군인 8 IU u-PA에서 약 90 %의 피브린 클롯 형성억제 효능을 확인하였다. 실시예 1의 황칠 발효 식초(DMV)를 처리한 실험군에서는 가장 높은 농도에서 약 75 %의 억제 효능을 보였으며, 5 μg에서 약 5 %, 10 μg에서 약 16 %, 20 μg에서 약 20 %, 50 μg에서 약 30 %, 100 μg에서 약 45 %, 200 μg에서 약 60 %, 500 μg에서 약 75 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다. 피브린 클롯 에세이를 통해 thrombus(혈전)의 주요 구성물인 피브린 클롯 형성시 황칠발효 식초에서 5-75 % 범위에서 억제 효능이 존재함을 확인하였고 농도 의존적으로 효능이 증가하였으며, u-PA의 억제 효능보다 다소 낮았지만 유사한 수준의 효능 (0.83 fold, DMV activity/u-PA activity)을 검증하였다.

(3) 설치류 혈액을 사용한 항-혈전 활성 에세이

인간 혈액과 실험동물로부터 분리한 마우스 또는 래트 혈액을 이용한 시료의 혈전 억제 활성을 분석하였다.

항-혈전 활성 에세이법은 실험동물의 혈액(rodent blood)를 이용한 항혈전 효능 평가법이며, 혈액 채취 후 곧바로 시료와 반응시켜 혈액응고 후 형성되는 혈전의 양을 분석하여 시료의 혈전억제 효능을 평가하는 에세이법이다.

구체적으로, 실시예 1의 황칠 발효 식초를 포함하는 다양한 농도의 시료(NC, 혈액 클롯 단독의 음성 대조군; PC, 혈액 클롯 + 20 IU u-PA의 양성 대조군; DMV + 혈액 클롯 10-500 μg)를 각 혈액 300 μl에 첨가한 후 37 ℃에서 6시간 반응시켜 혈액 클롯을 형성시킨 후 생성된 혈전의 밀도를 분석하되, 대조군은 시료를 첨가하지 않고 ㅅ시식염수만을 첨가 후 같은 조건으로 반응시킨 것을 비교하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12는 항-혈전 활성 에세이 결과를 나타내는 그라프도이다.

음성 대조군을 통해 혈액 클롯이 강하게 형성된 것을 확인하였고 양성 대조군인 20 IU u-PA에서 약 70 %의 혈액 클롯 억제 효능을 확인하였다. 황칠 발효 식초(DMV)를 처리한 실험군에서는 가장 높은 농도에서 약 60 %의 혈전억제 효능을 보였으며, 10 μg에서 약 30 %, 20 μg에서 약 25 %, 50 μg에서 약 40 %, 100 μg에서 약 40 %, 200 μg에서 약 50 %, 500 μg에서 약 60 %의 혈전억제 효능을 확인하였다. 항-혈전 활성 에세이를 통해 실험동물의 혈액에서 혈전의 형성시 황칠 발효 식초에서 30-60 % 범위에서 혈전억제 효능이 존재함을 확인하였고, u-PA의 억제 효능과 유사한 수준의 억제 효능을 확인하였다. 이는 황칠식초 (DMV)에서 실험동물의 혈액에 작용하여 과도한 혈전형성 억제를 통해 응고계 (coagulation system) 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.

시험예 7: 황칠 발효 식초( DMV )의 항응고 효과 분석

1) 칼슘재첨가 시간 에세이

혈행개선 효능 검증을 위해 항응고 효과를 탐색 및 분석하였다. 항응고 효능은 응고반응을 지연시켜 혈행 건강을 유지하고 심혈관 관련 질환을 예방하는 데 중요하다. 항응고 효능 평가를 위해, 인간 유래 혈장과 CaCl₂을 이용한 칼슘재첨가 시간측정법(recalcification time assay)을 수행하여 황칠 발효 식초의 항응고 효능을 분석하였다. 실험법은 혈장에 적정 농도의 CaCl₂를 첨가하면 혈장은 점점 점도가 증가하여 결국 응고되는 반응을 650 nm에서 30분 동안 밀도를 추적하여 분석하는 방법이다. 인간 혈액에서 2000 x g로 10분간 원심분리하여 얻은 혈장 30 μl에 시료 30 μl (20 mM Tris-HCl (pH 7.4)에 녹인 0.05-0.2 mM)을 첨가하여 10분간 37 ℃에서 반응시키고, 여기에 37 ℃에 미리 반응시킨 25 mM CaCl₂ 30 μl을 첨가한 후 20초 간격으로 30분 동안 OD값을 650nm으로 측정하고, 대조군은 시료를 첨가하지 않은 혼합물을 같은 조건으로 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

시료를 처리하지 않은 혈장 대조군과 다양한 농도 (10-500 μg)의 황칠 발효식초를 10 분간 전처리된 혈장 실험군을 동시에 CaCl₂를 첨가 후 30분 동안 650 nm에서 혈장의 밀도를 추적하였다. 또한, 혈장 밀도의 최고점에 도달하는 시간을 측정하여 비교분석 하였다. 그 결과를 도 13 및 표 1에 나타내었다. 도 13은 칼슘 재첨가 시간 에세이를 나타내는 그라프도이다.

	응고 시간 (sec)
담체		1440±50
DMV(㎍)	10	1440±50
	20	1500±70
	50	1710±30
	100	1770±40
	200	1770±30
	500	1770±10

시료를 처리하지 않은 대조군에서는 30 분 후 혈장의 밀도인 OD₆₅₀ 값이 약 0.185로 확인되었고, 가장 높은 농도의 황칠 발효 식초에서는 OD₆₅₀ 값이 약 0.168로 확인되었으며, 황칠 발효 식초 10 μg에서는 0.177, 20 μg에서는 0.176, 50 μg에서는 0.175, 100 μg에서는 0.174, 200 μg에서는 0.171, 500 μg에서는 0.168 로 측정되었다.

혈장의 밀도분석을 통해, 대조군과 비교 시 가장 높은 농도의 황칠 발효 식초에서 약 10 %의 항응고 효능이 확인되었다. 또한, 표 1을 통해 혈장 밀도의 최고점에 도달하는 시간을 분석한 결과, 대조군의 도달시간은 1410 초로 확인되었고 황칠 발효 식초 10 μg에서는 1440, 20 μg에서는 1500, 50 μg에서는 1710, 100 μg에서는 1770, 200 μg에서는 1770, 500 μg에서는 1770 초로 측정되었다. 이는 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 최고점 도달시간을 22.92 % 지연시키는 항응고 효능을 확인하였다. 결국, 칼슘재첨가 시간 에세이를 통해 황칠 발효 식초에서 인간유래 혈장의 응고반응을 10-23 % 억제하는 항응고 효과가 있음을 확인하였다.

(2) 응고 에세이

인간 혈액에서 2000 x로 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장에 다양한 농도의 시료를 전처리 또는 동시에 처리하여 APTT(밝은 색), PT(어두운 색)를 측정하여 시료의 항응고 활성을 분석하고, 대조군은 시료를 첨가하지 않은 혈장을 이용하여 비교분석하고 Automated coagulometer(Sysmex CA-1500, Mittan Keynes, UK)를 이용하여 측정하였다. 혈액응고 검사는 혈액이 응고하는데 걸리는 시간을 측정하는 검사이며 응고인자 결핍 및 혈전증이나 동맥경화증을 조기 발견하고 관리하기 위하여 혈관벽 이상을 사전에 예측하고 예방하기 위한 지표로 이용된다. 혈액응고 검사를 위해, 활성 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time; aPTT)과 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT)을 측정하여 황칠식초의 항응고 효능과 내인성 및 외인성 응고 기작에 대한 영향을 분석하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14는 설치류 혈액을 이용한 황칠 발효 식초의 항응고 특성을 나타내는 그라프도이다.

황칠 발효 식초의 항응고 효능 평가를 수행한 결과, 내인성 경로분석인 aPTT에서 황칠 발효 식초 5 μg일 때 응고 시간이 30.7 초, 10 μg일 때 33.9 초, 20 μg일 때 36.3 초, 50 μg일 때 37.3 초, 100 μg일 때 38.3 초, 200 μg일 때 39.7 초, 500 μg일 때 40.2 초로 확인되었으며, 일반적인 수치인 24.3 초와 비교해 볼 때 응고시간이 최대 약 1.7 배 지연되는 효과가 확인되었다 (1.3 ~ 1.7-fold). 또한, 외인성 경로분석인 PT에서는 황칠식초 5 μg일 때 응고시간이 11.8 초, 10 μg일 때 11.9 초, 20 μg일 때 11.8 초, 50 μg일 때 11.9 초, 100 μg일 때 11.4 초, 200 μg일 때 11.8 초, 500 μg일 때 11.5 초로 확인되었다. 일반적인 수치인 11.2 초와 비교해 볼 때 황칠 발효 식초는 PT의 응고시간에 영향을 주지 못했다. 이는 aPTT가 40.2 초로 대조군에 비해 약 1.7 지연된 결과를 통해, 내인성 경로의 응고인자들(I, II, V, X, XII, XI, IX, VIII 응고인자, 프리칼리크레인(prekallikrein), 고분자중량 키니노겐(high molecular weight kininogen, HMWK))과 반응하여 혈액응고를 지연시켰음을 확인하였다. 또한, 황칠식초는 PT에 영향을 미치지 못하여 외인성 경로의 응고인자들(I, II, V, VII, X)의 기능에 큰 영향을 주지 못하였음을 확인하였다.

실시예 8: 황칠식초 ( DMV )의 항고지혈 효과 분석

(1) 트리부티린 플레이트 에세이

황칠 발효 식초의 항고지혈 효과를 분석하기 위해, 황칠 발효 식초가 갖는 지질 분해 및 억제 효능을 탐색하였다. 동맥 내 지질의 침착으로 고지혈증과 동맥경화증이 유발될 수 있으며, 이 후 허혈성 심혈관 질환이나 뇌졸중으로 악화될 수 있다. 지질 분해 및 억제 효능은 이들 질환을 예방하는 데 중요한 작용을 하며, 항고지혈 효능 평가의 검색 시 활용할 수 있는 트리부티린(tributyrin) 플레이트 에세이 법을 이용하여 분석하였다.

1 % 트리부티린 용액을 적정량으로 희석하여 2 % 아가 용액과 함께 최종 ㅂ부피 5 ml로 트리부티린 플레이트를 준비한 후, 트리부티린 플레이트에 지름 3mm 웰을 만들어 2가지 농도 (5 μg와 10 μg)를 침적시킨 후 37 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 맑은 대역을 측정하여 시료의 지질 분해 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15는 황칠 발효 식초의 트리부티린 플레이트 에세이 결과를 나타내는 사진이다.

그 결과, 황칠식초는 트리부티린 플레이트를 분해시켜 지질분해 효능을 확인하였으며, 10 μg 이하에서는 일정한 분해 효능을 보였다.

(2) 지질 분해 활성 에세이

황칠식초의 항고지혈 효과를 분석하기 위해, 지질 분해 활성 에세이법을 이용한 지질 분해 및 억제 효능을 탐색하였다.

P-니트로페닐 부티레이트(PNPB)의 기질(10 mM)를 이용하여 분광광도기로 에세이를 수행하였다. 기질 용액에 다양한 농도의 시료(5-500 μg)를 60℃에서 15분 동안 반응시킨 후 405 nm에서 10분간 p-니트로페놀(PNP)를 측정하여 V_max 값으로 분석하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하고, 지질 분해제 (lipase)와 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

기질	DMV (μg)								Lipase (μg)
	담체	5	10	20	50	100	200	500	5
p-nitrophenyl butyrate	Vmax (mU/min/μg)								Vmax (μmol/min/mg)
	0	0	0	0	0.12	0.45	0.56	0.95	0.2

음성 대조군에서 담체(vehicle)만 처리한 군의 효능은 0 V_max (mU/min/μg), 양성 대조군에서 lipase 5 μg를 처리한 군의 효능은 0.2 V_max (μmol/min/mg)로 확인되었다. 황칠 발효 식초의 지질 분해 및 억제 효능 평가를 수행한 결과, 황칠식초 추출물 5 μg일 때 0, 10 μg일 때 0, 20 μg일 때 0, 50 μg일 때 0.12, 100 μg일 때 0.45, 200 μg일 때 0.56, 500 μg일 때 0.95 V_max (mU/min/μg)의 결과를 얻었다. 이는 가장 높은 농도의 황칠 발효 식초에서 양성 대조군인 lipase보다 4.74 배(-fold) 높은 효능을 보였으며, 황칠 발효 식초 50~100 μg에서 lipase 5 μg와 유사한 효능을 보였다. 결국, 트리부티린 플레이트 에세이와 지질 분해 활성 에세이법을 통해 황칠 발효 식초에서 중성지방 성분을 분해하고 lipase와 유사하거나 높은 효능의 지질분해 활성을 확인하였다.

시험예 9: 관능 검사

상기 실시예 3에서 얻은 황칠 발효 식초를 포함하는 제품의 색, 향, 맛 및 전체적인 기호도를 측정하기 위하여, 패널 테스트를 수행하였다. 관능검사를 진행한 결과는 표 3에서 나타내었다. 비교 제품으로는 국내 A사제품을 사용하였다.

본 관능시험에는 다양한 나이대의 자원자 40명을 패널리스트로 선별하고, 선별한 패널리스트로 하여금 각 항목에 대하여 "7점은 최고로 좋다, 6점 매우 좋다, 5점은 좋다, 4점은 보통이다, 3점은 약간 열등하다. 2점은 매우 열등하다. 1점은 가장 열등하다" 로 평가하게 한 다음, 그 평균값을 나타내었다.

항목	실시예 3	비교예
색	5.75±0.3	4.1±0.3
향	5.89±1.7	4.6±1.6
맛	5.25±0.5	4.5±0.1
전체적인 기호도	5.68±0.7	4.3±0.2

상기 표 3에 나타낸 결과를 분석하면, 황칠 발효 식초를 포함하는 제품의 색, 향, 맛 및 전체적인 기호도에서 모두 우수한 것으로 확인되었다.

Claims (3)

1. 황칠나무의 잎 또는 줄기를 초산균에 발효시켜서 얻어진 황칠 발효 식초를 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 황칠 발효 식초는
   a) 채취한 황칠나무의 잎 또는 줄기를 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하여 황칠 분말을 얻는 단계,
   b) 상기 황칠 분말을 발효 용기에 각각 넣고 분말, 설탕 및 증류수를 1: 0.4~0.6:1.4~1.6의 중량비로 혼합하여 발효 배지를 준비하는 단계,
   c) 상기 발효 배지에 초산균을 접종하여 25∼30℃에서 150~200 일간 발효시키는 단계, 및
   d) 초산발효단계에서 얻어진 황칠 발효물을 원심분리에 의해 5~20 분간 잔류물을 분리한 후 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 황칠 발효식초를 얻는 단계에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태인 것인 식품 조성물.

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