KR20160093321A - 세포의 지질막에서 유래된 나노소포체 및 이의 용도 - Google Patents

세포의 지질막에서 유래된 나노소포체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 지질막(cell membrane)에서 유래된 나노소포체(nanovesicles), 이의 제조방법, 및 상기 나노소포체를 이용한 약제학적 조성물, 진단 키트 등에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 지질막 유래 나노소포체는 치료용 또는 진단용 물질 전달에 불필요한 세포 내 물질(유전 물질 및 세포 내 단백질)이 제거되어 잠재적 부작용을 없앨 수 있고, 세포 또는 조직 타겟팅이 가능하므로 목표한 세포 또는 조직에 주로 치료용 또는 진단용 물질을 전달하고 다른 곳에 치료용 또는 진단용 물질의 전달을 억제함으로써 약물 등 치료용 물질의 부작용을 줄여서 질병 치료 과정에서 환자의 고통과 불편을 줄일 수 있으며, 치료효능을 증가시킬 수 있다.
또한, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 본 발명의 세포 지질막 유래 나노소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료 또는 진단용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.

Description

세포의 지질막에서 유래된 나노소포체 및 이의 용도{Nanovesicles derived from cell membrane and use thereof}
본 발명은 세포의 지질막(cell membrane)에서 유래된 나노소포체(nanovesicles), 이의 제조방법, 및 상기 나노소포체를 이용한 약제학적 조성물, 진단 키트 등에 관한 것이다.
질병 치료를 위해 약물을 개체에 투여하는 경우, 투여되는 약물이 최적의 효력을 발휘하도록 세포, 조직, 장기 및 기관으로의 전달 및 방출을 제어하는 약물전달 시스템(drug delivery system (DDS))이 중요하다. 약물전달시스템은 약물의 혈중농도를 적절히 유지시켜 최대의 치료효과를 낼 수 있고 이를 이용하여 의약품의 약효 및 안정성 극대화, 약물제제의 시간 연장, 생물학적 이용도 증가, 부작용을 최소화하여 필요한 신체부위로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술이므로 의약품 자체에 못지않게 중요하다. 1960년대 초창기부터 주사 및 주입형태, 좌약식 형태, 비강 및 구강 투여, 그리고 피부나 폐를 통한 약물전달 시스템 개발이 이루어졌으나, 최근에는 환자 및 사용 목적에 따라 흡수촉진 및 제어형 DDS(경구, 경피, 점막), 약효지속형 DDS(주사제, 경구, 경피), 표적부위 타겟형 DDS(경구, 주사 등) 및 인공지능(intelligent) DDS(on demand형)등 그 유형이 더욱 다양해지고 있다.
그 중 리포좀(liposome)은 1960년대에 처음 사용된 이래 약물 전달 시스템으로 널리 연구되어왔다. 리포좀은 다양한 인지질 성분으로 만들어지는 세포막과 유사한 인공막으로, 입자 크기범위가 나노형 즉, 콜로이드성 반고형 분산제제로 볼 수 있다. 리포좀 제제는 독성이 적고 처방에 따라 크기, 전하, 막 구성, 막의 투과성 등의 조절이 가능하기 때문에 응용가능성이 매우 크다. 최근에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol (PEG))과 같은 폴리머를 리포좀과 접합(conjugation)하여 약물을 내포한 리포좀이 혈액에서 쉽게 제거되지 않도록 하여 약물의 혈액 내 유지 시간(circulatory half-life)을 증가시킨 스텔스 리포좀(stealth liposome)이 개발되었고, 이 방법으로 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 전달하는 독실(DOXIL)이 상용화되었다. 그러나 리포좀과 스텔스 리포좀은 특정 세포를 인식하는 능력이 없기 때문에 특정 세포나 특정 조직으로 약물을 전달하는 목적으로는 사용할 수 없다. 특정 표적에 결합할 수 있도록 단일표적항체 등을 접합한 리포좀도 개발되고 있으나 아직 임상 시험을 통과하여 상용화된 것은 없다.
따라서 인공적으로 합성한 지질로 이루어진 리포좀 대신 자연적인 세포막을 이용한 전달 시스템이 개발되고 있다. 세포에서 유래된 전달 시스템은 세포의 자연적 타겟팅(targeting) 시스템을 그대로 이용하기 때문에, 기존의 리포좀 등의 전달 시스템과 달리, 쉽게 타겟팅을 유도할 수 있다. 대표적인 예로, 세포에서 자연적으로 분비되는 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 이용하여 약물을 전달하는 연구가 진행 중이다. 또한, 포유류 유핵세포에서 인공적으로 제조된 나노소포체(microvesicle)를 이용하여 항암 약물 등 다양한 약물을 로딩하여 암 조직으로 전달한 연구가 보고되었다.
하지만, 상기 세포밖 소포체 및 세포에서 인공적으로 제조된 나노소포체는 타겟팅에 필요한 물질 이외에 유전 물질(DNA 및 mRNA) 뿐만 아니라, 타겟팅에 불필요한 세포 내 단백질(cytosolic proteins) 등 세포 내 물질들을 포함하고 있다. 상기 물질들은 약물 로딩의 효율성을 떨어뜨리거나, 체내에 투여될 경우 부작용을 유도할 수 있는 잠재적 능력을 가지고 있어, 이를 제거한 시스템 개발이 필수적이다.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 연구한 결과, 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리할 경우 세포 내 유전 물질 및 세포 내 단백질이 제거된 지질막(cell membrane)만을 추출할 수 있으며, 추출된 지질막을 이용하여 나노소포체를 제조할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 성분이 제거된 세포의 지질막에서 유래되고, 상기 세포보다 작은 나노소포체 및 이를 이용한 약물 전달방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 내 성분이 제거된 세포의 지질막에서 유래되고 상기 세포보다 작은 나노소포체로서, 세포 내 성분은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 제거된 것인 나노소포체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(Na2CO3), 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화칼륨(KOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 및 수산화마그네슘(Mg(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포는 포유류의 유핵세포로 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 특이 세포 또는 조직으로 유도되도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 세포 접합분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 형광 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체의 막은 상기 세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포막 이외의 성분은 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체는 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체는 그 기원이 되는 세포의 세포막 단백질의 토폴로지가 유지되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체에 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 물질전달용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 외부에서 주입된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 형광을 방출하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 형광을 방출하는 물질은 형광단백질 또는 양자점인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법을 제공한다.
(a) 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계;
(b) 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 추가하는 단계;
(c) 상기 치료용 또는 진단용 물질이 추가된 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계; 및
(d) 상기 현탁액으로부터 제조된 나노소포체를 분리하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법을 제공한다.
(a) 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계;
(b) 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계;
(c) 상기 나노소포체를 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및
(d) 상기 현탁액으로부터 배양된 나노소포체를 분리하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 초음파 분해 방법을 통해 제조된 나노소포체에 압출 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(Na2CO3), 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화칼륨(KOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 및 수산화마그네슘(Mg(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 포유류의 유핵세포로 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 특이 세포 또는 조직으로 유도되도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 세포 접합분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포가 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 형광 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체의 막은 상기 세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포막 이외의 성분은 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체는 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노소포체는 그 기원이 되는 세포의 세포막 단백질의 토폴로지가 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 상기 세포 이외의 외부에서 주입된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 형광을 방출하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 형광을 방출하는 물질은 형광단백질 또는 양자점인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체에 질병의 진단에 필요한 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 핵산(antisense nucleic acid), 또는 항체(antibody)가 로딩(loading)된 것을 포함하는, 질병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 질병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체를 사용하여 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 단계를 포함하는, 물질 전달방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체를 사용하여 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체의 질병 치료 또는 진단 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 세포 지질막 유래 나노소포체는 치료용 또는 진단용 물질 전달에 불필요한 세포 내 물질(유전 물질 및 세포 내 단백질)이 제거되어 잠재적 부작용을 없앨 수 있고, 세포 또는 조직 타겟팅이 가능하므로 목표한 세포 또는 조직에 주로 치료용 또는 진단용 물질을 전달하고 다른 곳에 치료용 또는 진단용 물질의 전달을 억제함으로써 약물 등 치료용 물질의 부작용을 줄여서 질병 치료 과정에서 환자의 고통과 불편을 줄일 수 있으며, 치료효능을 증가시킬 수 있다.
또한, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 본 발명의 세포 지질막 유래 나노소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료 또는 진단용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.
도 1은, 포유류 유핵세포 또는 형질전환된 포유류 유핵세포에서 나노소포체와 표적 유도물질, 치료용 물질, 진단용 물질 등 다양한 물질이 로딩된 나노소포체를 제조하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는, 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 및 밀도 구배법으로 제조한 포유류의 유핵세포 유래 나노소포체의 투과전자현미경 사진과, 크기를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 형질전환된 포유류 유핵세포 유래 나노소포체의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 유핵세포 유래 나노소포체 안에 세포질 단백질과 핵단백질이 없고, 막 단백질이 많이 존재함을 보여주는 Western blotting 결과이다.
도 5는, 실시간 RT-PCR 및 RT-PCR을 통해 포유류 유핵세포 유래 나노소포체 안에 DNA와 RNA가 존재하지 않음을 확인한 결과이다.
도 6은, 트립신(trypsin) 처리시 포유류 유핵세포 유래 나노소포체의 ICAM1과 내부에 로딩된 EGFP 단백질의 발현여부를 통해 포유류 유핵세포 유래 나노소포체 토폴로지(topology)가 정상임을 보여주는 결과이다.
도 7은, 포유류 유핵세포 유래 나노소포체의 이중막에 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴이 결합된 것을 보여주는 결과이다.
도 8은, 형광현미경 관찰을 통해 포유류 유핵세포 유래 나노소포체에 FITC-siRNA가 로딩 되었음을 보여주는 사진이다.
도 9는, 형광현미경 관찰을 통해 포유류 유핵세포 유래 나노소포체에 Qdot 705가 로딩 되었음을 보여주는 사진이다.
도 10은, 옵티프렙 용액을 이용한 밀도구배법을 통해 포유류 유핵세포 유래 나노소포체에 산화철(iron oxide) 나노입자가 로딩 되었음을 보여주는 사진이다.
도 11은, 포유류 유핵세포 유래 나노소포체를 이용하여 TNF-α처리에 의해 독소루비신을 표적 세포 특이적으로 전달함으로써 세포사멸을 유도함을 보여주는 결과이다.
도 12는, 포유류 유핵세포 유래 나노소포체를 이용하여 TNF-α처리에 의해 RNase A(Ribonuclease A)를 표적 세포 특이적으로 전달함으로써 세포사멸을 유도함을 보여주는 결과이다.
도 13은, 형질전환 유핵세포 유래 나노소포체를 이용하여 독소루비신 또는 RNase A를 세포에 특이적으로 전달함으로써 세포사멸을 유도함을 보여주는 결과이다.
도 14는, 형질전환 유핵세포 유래 나노소포체를 이용하여 독소루비신을 인간 폐암세포에 특이적으로 전달함으로써 세포사멸을 유도함을 보여주는 결과이다.
본 발명은 세포 내 성분이 제거된 세포의 지질막에서 유래되고 상기 세포보다 작은 나노소포체로서 세포 내 성분은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 제거된 것인 나노소포체를 제공한다.
본 발명의 상기 나노소포체는 기원이 되는 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질을 포함하고 동일한 토폴로지(topology)를 가지지만, 핵산 등의 유전물질 및 세포 내 단백질 등 세포 내 물질이 제거되어 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(Na2CO3), 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화칼륨(KOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 및 수산화마그네슘(Mg(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 세포는 포유류의 유핵세포로써 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 또한 줄기세포에서 분화된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 특이 세포 또는 조직으로 유도되는 형질전환된 세포를 포함한다. 구체적으로, 상기 형질전환된 세포는 치료, 진단, 표적유도 물질, 또는 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질을 발현하도록 형질전환된 세포 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 형질전환된 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 포유류의 유핵세포는 물질 처리 또는 유전자 도입에 의해 형질전환된 것일 수 있고, 2회 이상 형질전환된 것일 수 있으며, 하나 이상의 특정 단백질의 발현을 억제하도록 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “형질전환”은 세포에 자극을 주어 단백질 등 물질 발현을 증가 또는 억제 등 변화시키는 방법과 유전자 도입을 통해 단백질의 발현을 변화시키는 방법으로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법들을 사용할 수 있다. 유전자 도입을 통한 특정 단백질의 발현을 증가 또는 억제시키는 방법으로는 RNAi(RNA interference), 바이러스 매개, 인산 칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 리포좀(liposome), 전기천공법(electroporation), 미량주사법(microinjection), 초음파 유도(ultrasound mediated)등을 포함하여 일반적으로 알려진 모든 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 세포는 세포 접합분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 것일 수 있고, 또한 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 형광 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 나노소포체 막은 기원이 되는 세포의 세포막 이외의 성분으로써 표적유도 물질(targeting molecule), 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질(fusogen), 사이클로덱스트린, 또는 폴리에틸렌클리콜 등을 포함할 수 있고, 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노소포체에 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는 물질전달용 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명에서 상기 나노소포체의 크기는 진단용 또는 치료용 물질이 필요한 조직에 따라 다양한 크기로 제조될 수 있고, 바람직하게는 10 ㎚ 이상 10 ㎛이하일 수 있다.
본 발명의 나노소포체에 로딩되는 물질은 특별히 제한되지 않으며, 치료용 또는 진단용 물질일 수 있고, 세포 외부에서 준비된 물질을 로딩할 수 있으며, 로딩되는 물질은 1개 또는 2개 이상일 수 있다.
상기 진단용 또는 치료용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 또는 치료용 물질은 형광을 방출하는 물질일 수 있으며, 바람직하게는 형광단백질 또는 양자점일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 상기 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자 또는 나노 입자 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설량 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.1 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계; 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 추가하는 단계; 상기 치료용 또는 진단용 물질이 추가된 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계; 및 상기 현탁액으로부터 제조된 나노소포체를 분리하는 단계를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계; 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계; 상기 나노소포체를 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 상기 현탁액으로부터 배양된 나노소포체를 분리하는 단계를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 초음파 분해 방법을 통해 제조된 나노소포체에 압출 단계를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기 나노소포체의 제조방법 즉, 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 및 밀도 구배방법을 이용하여 단핵구 세포인 U937과 형질전환세포인 HEK293, HT1080세포로부터 나노소포체를 제조하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 일 실시예에서는, 단핵구와 형질전환세포로부터 제조된 나노소포체의 형태 및 크기를 확인한 결과 지질 이중층으로 이루어진 구형의 형태이며, 단핵구 유래 나노소포체는 100 ~ 200 ㎚로 평균적으로 180 ㎚의 크기인 것으로 나타났고, 형질전환세포 유래 나노소포체의 크기는 70 ~ 150 ㎚이며, 평균적으로 100 ㎚인 것을 확인하였다.
또한 상기 단핵구 유래 나노소포체를 단핵구 세포와 함께 Western blotting을 수행함으로써 세포질 단백질인 베타-액틴(β-actin), 핵단백질인 H2B, 세포막 단백질인 GM130, LFA1, ICAM1의 발현을 확인한 결과, 나노소포체는 세포질 및 핵단백질을 포함하지 않으며, 세포막 단백질들만 발현함을 확인하였다. 또한 real-time PCR을 수행을 통해 상기 나노소포체는 단핵구 세포와 달리 DNA와 RNA 즉, 핵산을 포함하지 않는 것으로 확인되었고, 나노소포체의 토폴로지(topology)분석 결과, 나노소포체의 막에 결합된 막 단백질이 단핵구 세포의 세포막과 동일하게 세포 밖으로 위치하며 동일한 토폴로지를 유지함을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 실시예 1의 방법에 따라 제조한 단핵구 유래 나노소포체 제조과정에서 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴을 첨가하여 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 나노소포체를 제조하였다. 이후 상기 나노소포체에 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP를 넣고 배양한 후 BM-POD 기질을 넣은 뒤 발색양을 측정한 결과, 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 나노소포체에 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴이 결합된 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 실시예 1의 방법의 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 밀도 구배방법 과정 중 초음파 분해법 단계에서 FITC-siRNA, Qdot 705, 또는 산화철 나노입자를 로딩하여 각각을 포함하는 나노소포체를 제조한 후 그 결과를 분석하였다. 형광현미경 관찰을 통해서 FITC-siRNA와 Qdot 705이 각각의 나노소포체에 잘 로딩된 것을 알 수 있었으며, 옵티프렙 용액을 이용한 밀도구배법을 통해 산화철 나노입자 역시 나노소포체에 로딩된 것을 확인하였다(실시예 4 내지 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 단핵구 유래 나노소포체를 이용하여 세포 수준에서 약물 전달 및 세포 특이적 전달능을 검증하였다. 화학적 약물로써 독소루비신(doxorubicin)과 단백질 약물로써 RNase A(Ribonuclease A)를 이용하여 각 약물을 로딩한 단핵구 유래 나노소포체를 제조하였고, 인간 혈관세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)에 TNF-α를 처리함으로써 세포를 활성화시켜 세포막에 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 등의 세포 접합 분자의 발현을 증가시켜 단핵구 유래 나노소포체가 이를 인식해 특이적으로 약물이 전달되도록 하였다. 그 결과, TNF-α가 처리된 경우 상기 나노소포체 처리농도에 의존적으로 독소루비신과 RNase A 약물 모두 HUVEC 세포에 전달되어 세포사멸을 유도함을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 형질전환세포 유래 나노소포체의 약물전달을 세포수준에서 검증하였다. ICAM1이 과발현된 HT1080 형질전환세포에서 독소루비신 또는 RNase A가 로딩된 나노소포체를 제조한 후 U937 단핵구 세포에 상기 나노소포체를 농도별로 처리하고 24시간 배양 후 트립판 블루(trypan blue)용액으로 단핵구 세포를 염색하여 세포사멸 정도를 측정하였다. 그 결과, 나노소포체에 의해 단핵구 세포로 약물이 전달되어 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 처리한 경우 5 ㎍/㎖에서부터 세포사멸이 유도되었고, RNase A의 경우 10 ㎍/㎖에서부터 세포사멸이 유도되었다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간 폐암 세포주인 A549의 세포막에 발현된 EGFR에 결합할 수 있는 EGF와 GE11 접합 분자를 세포막에 발현하는 형질전환 세포 유래 나노소포체를 제조하여 세포 특이적 약물전달을 검증하였다. 독소루비신이 로딩된 상기 나노소포체를 A549 세포가 접종된 plate에 처리하고 배양한 후 형광현미경으로 관찰한 결과, 세포사멸이 유도된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 EGF 및 GE11의 세포막 발현 형질전환 세포에서 유래되고, 항암 약물이 로딩된 나노소포체에 존재하는 GE11 및 EGF가 EGFR를 표면에 발현하고 있는 세포와 특이적으로 결합할 수 있고, 로딩된 항암 약물을 세포에 전달하여 세포 사멸을 일으킬 수 있음을 확인하였다(실시예 9 참조).
또한, 본 발명은 상기 나노소포체에 질병의 진단에 필요한 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 핵산(antisense nucleic acid), 또는 항체(antibody)가 로딩(loading)된 것을 포함하는, 질병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 질병 진단용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 알칼리 용액 처리법 및 초음파 분해법에 의한 나노소포체( nanovesicle )의 제조
포유류 유핵세포 또는 형질전환된 포유류 유핵세포에서 세포 내 성분이 제거된 나노소포체(nanovesicle)를 제조하기 위해 단핵구 또는 형질전환된 세포로부터 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 및 밀도 구배방법을 이용하여 나노소포체를 제조하였으며, 도 1에 모식도를 나타내었다.
단핵구는 8 × 107개의 U937 세포(ATCC No. CRL-1593.2)를 사용하였고, 형질전환세포로는 4 × 107개의 HEK293 세포(ATCC No. CRL-1573) 또는 HT1080 세포(ATCC No. CCL-121)를 사용하였다. 각 세포에 알칼리 용액(200 mM Na2CO3, 1× phosphatase inhibitor, pH 11.5) 8 ㎖을 처리하고 상기 용액을 cycle 0.5와 amplitute 50의 조건에서 초음파 발생기로 30회 초음파 분해를 한 후 100,000 × g에서 15분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)를 하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 펠렛에 다시 상기 알칼리용액 8 ㎖을 처리하여 현탁한 다음, 로터(rotor)에서 4℃, 30분 동안 보관한 후 100,000 × g에서 15분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 펠렛을 얻었다. 얻어진 펠렛에 HBS(HEPES bufferd saline) 용액 10 ㎖을 처리하여 현탁한 후, 다시 한 번 100,000 × g에서 15분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 HBS용액 0.4 ㎖로 현탁한 후, 초음파 발생기로 30회 초음파 분해를 한 후 다시 물통 초음파 발생기(water bath sonicator)에서 30분간 초음파 분해를 하고, 상기 용액에 HBS용액 6.6 ㎖을 넣어 현탁하였다. 이후 11 ㎖ 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙(Optiprep) 1 ㎖, 10% 옵티프렙 2 ㎖, 현탁액 7 ㎖을 차례로 담고, 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 나노소포체를 얻었다.
실시예 2. 나노소포체의 특성 분석
2-1. 나노소포체의 형태 및 크기 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 단핵구 및 형질전환세포 유래 나노소포체의 형태 및 크기를 분석하기 위해 먼저 단핵구로부터 제조한 나노소포체를 투과전자현미경을 통해 관찰하였다. 단핵구로부터 제조한 나노소포체를 글로방전 탄소 코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grid)에서 3분간 흡착시켰다. 상기 그리드를 증류수로 세척하고 2% 우라닐아세테이트(uranylacetate)로 1분 동안 염색(staining)한 후 JEM101(Jeol, Japan) 전자현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 단핵구로부터 알칼리 용액 처리법으로 제조한 나노소포체가 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100 ~ 200 ㎚이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있었다. 또한 단핵구로부터 제조된 나노소포체를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 HBS 1 ㎖에 희석(dilution)한 후 나노소포체가 들어있는 HBS 1 ㎖을 챔버(chamber)에 넣고 나노입자 추적 분석기로 분석한 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 나노소포체의 크기는 100 ~ 200 ㎚이며, 평균 크기는 180 ㎚임을 확인하였다.
또한 EGF(epidermal growth factor) 및 GE11 펩타이드(YHWYGYTPQNVI)를 발현하도록 형질전환된 세포로부터 제조된 나노소포체를 5 ㎍/㎖의 농도로 HBS 1 ㎖에 희석(dilution)한 후 나노소포체가 들어있는 HBS 1 ㎖을 큐벳(cuvette)에 넣고 동적 광산란 입도 분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 형질전환세포로부터 제조된 나노소포체의 크기는 70 ~ 150 ㎚이며, 평균 크기는 100 ㎚임을 확인하였다.
2-2. 단핵구 유래 나노소포체의 세포질 단백질 및 핵단백질 유무 검증
상기 실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 알칼리 용액 처리법으로 제조된 나노소포체의 세포질 단백질 및 핵단백질 유무를 검증하기 위해 단핵구 세포와 함께 Western blotting을 수행하였다.
상기 나노소포체와 단핵구 세포를 각각 5㎍ 준비한 후 5× 로딩 염색제(loading dye, 250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol)를 최종적으로 1×가 되도록 넣고, 100℃에서 5분간 처리하였다. 12% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 준비하고, 샘플을 로딩한 후 80V에서 2시간 동안 폴릴아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 겔 상의 단백질이 전기적인 흐름에 따라 PVDF(polyvinylidene fluoride) membrane으로 이동하도록 400 mA에서 2시간 동안 트랜스퍼(transfer)과정을 수행하였다. 이후 membrane에 0.05% TBST(Tween-20)에 녹인 3% Non-fat milk 용액을 처리하여 2시간 동안 블로킹(blocking)을 수행한 후 membrane에 베타-액틴(β-actin), H2B, GM130, LFA1, ICAM1 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05% TBST(Tween-20)로 membrane을 3회 세척한 후 각각 페록시다아제(peroxidase)가 붙어있는 2차 항체를 처리하여 상온에서 1.5 시간 반응시켰다. 다시 0.05% TBST(Tween-20)로 membrane을 3번 세척한 후 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Co. No. RPN2106), WEST-ZOL(iNtRON. No. 16024), 또는 Femto(Thermo Scientific. No. 37074)를 사용하여 각 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 단핵구(cell)의 경우 세포 골격을 이루는 주된 구성요소로서 세포질에 존재하는 베타-액틴(ACTB), 핵 내의 히스톤의 구성 단백질인 H2B가 발현되는 반면, 알칼리 용액 처리법으로 제조한 나노소포체의 경우에는 베타-액틴(ACTB), H2B가 발현되지 않았다. 또한 알칼리 용액 처리법으로 제조한 나노소포체에서는 단핵구 세포와 비교하여 세포막 단백질들인 LFA-1, ICAM1, GM130이 많이 발현되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 알칼리 처리법으로 제조한 나노소포체에는 베타-액틴, H2B와 같은 세포질 유래 단백질 및 핵단백질이 존재하지 않으며, LFA-1, ICAM1, GM130과 같은 세포막 단백질을 세포에 비해 더 많이 가지고 있음을 알 수 있다.
2-3. 단핵구 유래 나노소포체의 핵산 유무 검증
상기 실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 알칼리 용액 처리법으로 제조된 나노소포체의 핵산 유무를 검증하기 위해 단핵구 세포와 함께 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)과 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다.
단핵구에서 제조한 100 ng의 나노소포체와 1 × 105개의 단핵구 세포를 95℃에서 10분 동안 배양하여 나노소포체와 세포를 터트려 안에 존재하는 모든 핵산(nucleic acid)이 나오도록 한 뒤에 DNA 분해효소(DNase)를 처리하거나 처리하지 않고 GAPDH에 대한 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)과 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 단핵구에서 제조한 나노소포체에 핵산이 존재하는지 확인하기 위해 DNase 처리 없이 GAPDH에 대한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 단핵구 세포에는 핵산이 존재하는 반면에 단핵구에서 제조한 나노소포체에는 핵산이 존재하지 않았다. RNA가 존재하는지 확인하기 위해, 나노소포체 또는 단핵구 세포를 터트린 용액에 DNase를 처리하여 DNA를 제거한 뒤에 DNase 억제제를 통해 DNase 활성을 저해하였다. RNA를 주형으로 하여 GAPDH에 대한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 단핵구 세포에는 RNA가 존재하는 반면에 단핵구에서 제조한 나노소포체에는 RNA가 존재하지 않았다. DNA가 존재하는지 확인하기 위해 나노소포체 또는 단핵구 세포를 터트린 용액에 DNase 처리과정 없이 GAPDH에 대한 실시간 PCR을 수행한 결과, 단핵구 세포에는 DNA가 존재하는 반면에 단핵구에서 제조한 나노소포체에는 DNA가 존재하지 않았다. 더 나아가 나노소포체 또는 단핵구 세포를 터트린 용액에 DNase 처리한 뒤에 GAPDH에 대한 실시간 PCR을 수행한 결과, 단핵구 세포에서도 DNA가 존재하지 않음을 통해 DNase의 활성을 확인하였다. 이는 단핵구 세포에는 DNA와 RNA가 모두 존재하는 반면에, 단핵구 세포 유래 나노소포체 안에는 DNA와 RNA가 모두 존재하지 않음을 의미한다.
2-4. 나노소포체의 토폴로지 ( topology ) 분석
단핵구로부터 제조된 나노소포체의 토폴로지를 분석하기 위하여 상기 실시예 1의 방법의 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 밀도 구배의 방법 과정 중 초음파 분해법 단계에서 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 첨가하여 나노소포체에 로딩하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에 나타낸 단핵구인 U937 세포를 이용한 나노소포체 제조과정 중 펠렛에 HBS(HEPES bufferd saline) 용액 10 ㎖을 처리하여 현탁하고, 100,000 × g에서 15 분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 펠렛을 얻은 후 상기 펠렛을 HBS로 현탁하고, 다음 단계로 EGFP를 50 ㎍/㎖ 농도가 되도록 넣어 최종 0.4 ㎖ 용액을 만들었다. 이후 과정은 실시예 1의 과정과 동일하게 진행하였고, EGFP가 로딩된 단핵구 유래 나노소포체를 얻었다. EGFP가 로딩된 나노소포체 10 ㎍과 EGFP 단백질 30 ng을 준비한 후 트립신(trypsin) 1 ㎍을 37℃에서 4시간 동안 처리하여 트립신을 처리한 것과 처리하지 않은 샘플을 준비하고 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 Western blotting을 수행하였다. 1차 항체는 ICAM1과 EGFP 특이적 항체를 사용하였으며, ‘+’로 표시한 것은 트립신을 처리한 결과를, ‘-’로 표시한 것은 트립신을 처리하지 않은 결과를 나타낸다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 트립신을 처리하지 않은 경우, 나노소포체(MNVEGFP)의 경우 ICAM1과 EGFP 단백질이 검출되었고, EGFP의 경우에도 EGFP 단백질이 검출되었다. 그러나 트립신을 처리하였을 때, EGFP의 경우 트립신 처리에 의해 분해되어 검출되지 않은 반면, 나노소포체에서는 ICAM1의 세포외 영역이 사라져 검출되지 않았고, 나노소포체 안에 로딩된 EGFP는 사라지지 않는 것으로 확인되었다. 만약 세포막이 일부라도 안팎이 바뀌어 일부 ICAM1의 세포외 영역이 나노소포체 내부를 향한다면 이것은 트립신에 의해 분해되지 않기 때문에 항체반응을 유발해야 한다. 트립신을 처리한 나노소포체에서는 ICAM1항체 반응이 나타나지 않았기 때문에 존재하던 ICAM1의 세포외 영역은 나노소포체 외부를 향하고 있었음을 알 수 있다. 또한, 나노소포체 안에 로딩된 단백질의 경우, 나노소포체의 이중막에 의해 보호되고 있음을 알 수 있다.
상기 결과로부터 알칼리 용액 처리법으로 제조한 나노소포체의 경우, ICAM1 이외의 다른 세포막 단백질도 마찬가지로 원래 세포막에서 세포 외부를 향하던 부분이 모두 나노소포체 외부를 향하고 있음을 추론할 수 있고 이것은 나노소포체 막이 세포의 세포막과 동일한 토폴로지를 유지하고 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. 폴리에틸렌글리콜을 포함한 나노소포체의 제조
상기 실시예 1의 방법에 따라 제조한 단핵구 유래 나노소포체에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 로딩하여 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 나노소포체를 제조하고자 하였다.
초음파 분해법 이후 HBS을 넣어 현탁하였고, 용액을 1 ㎛ 필터(two-stack)에 통과시켜 압출과정을 거쳤다. 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙(Optiprep) 0.5 ㎖, 10% 옵티프렙 1 ㎖, 현탁액 3 ㎖을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 나노소포체를 얻었다. 이후 5 ㎍/㎖의 농도로 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴(cholesterol-polyethylene glycol-biotin)을 넣고, 실온에서 1 시간 동안 보관하였다. 다시 한 번 5 ㎖ 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 0.5 ㎖, 10% 옵티프렙 1 ㎖, 현탁액 3 ㎖을 차례로 담은 후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 폴리에틸렌글리콜을 포함한 나노소포체를 얻었다.
다음으로 10 ㎍/㎖의 폴리에틸렌글리콜을 포함한 나노소포체를 준비하고 96 well plate에 준비한 나노소포체 100 ㎕을 넣고, 상온에서 12 시간 이상 보관하여 코팅하였다. PBS로 3회 세척한 후 1% BSA/PBS를 100 ㎕ 넣어 1 시간 동안 블로킹(blocking)하고 다시 PBS로 3회 세척한 후 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP를 넣고 20 분간 배양하였다. 이후 BM-POD 기질을 넣은 뒤 발색양을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 발색 후에 RLU(relative luminescence units) 값들을 측정하였을 때 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 나노소포체(MNVPEGylation)의 경우, 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴이 나노소포체에 결합(incorporation)되어 높은 RLU 값을 나타냄을 알 수 있다. 한편, 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜-바이오틴을 처리하지 않은 나노소포체(MNVcontrol)에서는 낮은 RLU 값을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4. FITC - siRNA 를 포함한 나노소포체의 제조
FITC-siRNA를 포함하는 단핵구 유래 나노소포체를 제조하기 위하여 상기 실시예 1의 방법의 알칼리 용액 처리법, 초음파 분해법, 밀도 구배의 방법 과정 중 초음파 분해법 단계에서 FITC-siRNA를 넣어 나노소포체에 로딩하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에 나타낸 단핵구인 U937 세포를 이용한 나노소포체 제조과정 중 펠렛에 HBS(HEPES bufferd saline) 용액 10 ㎖을 처리하여 현탁하고, 100,000 × g에서 15 분 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 펠렛을 얻은 후 상기 펠렛을 HBS로 현탁한 다음 FITC-siRNA를 10 μM 농도가 되도록 넣어 최종 0.4 ㎖ 용액을 만들었다. 이후 초음파 발생기로 30회 초음파 분해를 하였고 다시 물통 초음파 발생기(water bath sonicator)에서 30분간 초음파 분해를 한 후 상기 용액에 HBS 0.6 ㎖을 넣어 현탁하였다. 용액을 1 ㎛ 필터(two-stack)에 통과시켜 압출과정을 거친 후 다시 HBS 2.0 ㎖을 넣어 현탁하였다. 5 ㎖ 용량의 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 각각 50% 옵티프렙 0.5 ㎖, 10% 옵티프렙 1 ㎖, 현탁액 3 ㎖을 차례로 담았다. 이후 100,000 × g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 FITC-siRNA가 로딩된 나노소포체를 얻었다.
상기 방법으로 제조된 나노소포체가 FITC-siRNA를 포함하는지 검증하기 위해, 20 ㎍/㎖의 FITC-siRNA가 로딩된 나노소포체 50 ㎕를 준비하고, 10 μM DiI solution을 넣고 현탁하였다. 용액을 커버글라스에 올린 뒤, 습기가 있는 챔버(chamber)에 넣고, 4℃에서 12시간 이상 보관하였다. 슬라이드 글라스에 마운팅 용액(mounting solution)을 5 ㎕ 올린 뒤, 그 위로 커버글라스를 올리고, 형광 현미경에서 관찰하였다. 나노소포체는 DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'- tetramethylindocarbocyanine perchlorate)의 빨간색 형광으로 관찰하였으며, siRNA은 FITC의 녹색 형광으로 관찰하여 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, FITC-siRNA가 로딩되지 않은 나노소포체는 DiI로 표지되어 빨간색 형광을 나타내지만, FITC-siRNA의 녹색 형광은 보이지 않음을 알 수 있다. 반면, FITC-siRNA가 로딩된 나노소포체는 녹색 형광뿐만 아니라, DiI의 빨간색 형광까지 나타남을 확인하였으며, 녹색 형광과 빨간색 형광이 같은 위치에 있음을 통해 FITC-siRNA가 나노소포체에 로딩 되었음을 확인하였다.
실시예 5. Qdot 이 로딩된 나노소포체의 제조
Qdot 705가 로딩된 나노소포체를 제조하기 위해, 상기 실시예 4의 FITC-siRNA가 로딩된 나노소포체 제조와 동일한 방법을 이용하였으며, 초음파 분해법 단계에서 FITC-siRNA 대신에 Qdot 705를 20 nM이 되도록 넣어 제조하였다.
상기 방법으로 제조된 나노소포체가 Qdot 705를 포함하는지 검증하기 위해, 20 ㎍/㎖의 Qdot 705가 로딩된 나노소포체 50 ㎕를 준비하여 상기 실시예 4와 같은 방법으로 샘플을 준비한 후 형광현미경으로 관찰하였으며, 나노소포체는 DiI의 빨간색 형광으로, Qdot 705는 파란색의 인위적인 색상으로(pseudo color) 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, Qdot 705가 로딩되지 않은 나노소포체는 DiI로 표지되어 빨간색 형광을 나타내지만, Qdot 705의 파란색 형광은 보이지 않음을 알 수 있다. 반면, Qdot 705가 로딩된 나노소포체는 파란색 형광뿐만 아니라, DiI의 빨간색 형광까지 나타남을 확인하였으며, 파란색 형광과 빨간색 형광이 같은 위치에 있음을 통해 Qdot 705가 나노소포체에 로딩 되었음을 확인하였다.
실시예 6. 산화철( iron oxide ) 나노입자가 로딩된 나노소포체의 제조
산화철(iron oxide) 나노입자가 로딩된 나노소포체를 제조하기 위해, 상기 실시예 4의 FITC-siRNA가 로딩된 나노소포체 제조와 동일한 방법을 이용하였으며, 초음파 분해법 단계에서 FITC-siRNA 대신에 산화철 나노입자를 20 ㎍/㎖이 되도록 넣어 제조하였다. 이후 옵티프렙 용액을 이용한 밀도구배법으로 산화철 나노입자가 로딩된 나노소포체(MNViron oxide)와 로딩되지 않은 나노소포체(MNVcontrol)를 비교하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 산화철 나노입자가 로딩되지 않는 나노소포체의 경우, 하얀색 밴드가 나타났고, 산화철 나노입자가 로딩된 나노소포체의 경우, 암갈색의 밴드가 나타났다. 이를 통해, 산화철 나노 입자가 나노소포체에 로딩되어 있음을 확인하였다.
실시예 7. 단핵구 유래 나노소포체를 이용한 in vitro 약물 전달 및 세포 특이적 전달 검증
7-1. 단핵구 유래 나노소포체를 이용한 in vitro 화학약물 전달 및 세포 특이적 전달 확인
본 발명의 나노소포체가 in vitro 수준에서 화학약물을 세포 특이적으로 전달하는지 검증하기 위하여 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 로딩한 단핵구 유래 나노소포체를 제조한 후 형광현미경을 통해 약물이 세포특이적으로 전달되는지를 검증하였다.
24 well plate를 0.1% 젤라틴(gelatin)으로 코딩하고 인간 혈관세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)를 3 × 104개만큼 접종한 후, 12 시간 동안 배양하였다. 기존의 배지를 제거하고, 10 ng/㎖의 TNF-α를 넣은 배지를 넣어준 뒤 16 시간 동안 배양하였다. 인간 혈관 세포인 HUVEC에 TNF-α를 처리하면 세포가 활성화되어 세포막에 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin과 같은 세포 접합 분자의 발현이 증가되어 단핵구 및 대식 세포에 존재하는 LFA-1, Mac-1과 같은 세포 접합 분자와 결합하여 단핵구 및 대식 세포가 혈관 내피 세포에 결합할 수 있게 된다.
실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 제조하였다. 초음파 분해법 단계에서 800 ㎍/㎖의 독소루비신를 넣어 초음파 분해를 하여 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 제조하였다.
다음으로 HUVEC에 0, 1, 2, 5 ㎍/㎖의 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 20 분 동안 처리하고, 새로운 배지로 교체한 다음 36시간 동안 배양하였다. 이후 HUVEC에 2 μM 셀트래커(CellTracker, Invitrogen. No. C2925)를 처리하고, 1시간 동안 배양한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 10분간 처리하여 세포를 고정하였다. 4% 파라포름알데하이드를 제거하고 PBS를 넣어준 후, 형광현미경으로 세포를 관찰하였고, 세포의 개수를 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 여러 농도로 처리하였을 때, TNF-α를 처리하지 않은 HUVEC에서도 어느 정도 세포 수가 감소한 것으로 보아 일부 비특이적으로 약물이 전달된 것을 확인하였다. 그러나 TNF-α를 처리한 경우 나노소포체의 처리 농도에 의존적으로 세포 수가 현저히 감소한 것으로 보아 HUVEC에 더 많은 독소루비신이 전달된 것을 알 수 있었다. 이를 통해 나노소포체를 이용하여 화학약물을 세포 특이적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
7-2. 단핵구 유래 나노소포체를 이용한 in vitro 단백질약물 전달 및 세포 특이적 전달 확인
본 발명의 나노소포체가 in vitro 수준에서 단백질약물을 세포 특이적으로 전달하는지 검증하기 위하여 RNase A(Ribonuclease A)를 로딩한 단핵구 유래 나노소포체를 제조한 후 형광현미경을 통해 약물이 세포 특이적으로 전달되는지를 검증하였다.
실시예 1의 방법에 따라 단핵구로부터 RNase A가 로딩된 나노소포체를 제조하였으며, 초음파 분해법 단계에서 800 ㎍/㎖의 RNase A를 넣어 초음파 분해를 하여 RNase A가 로딩된 나노소포체를 제조하였다. 상기 실시예 7-1과 동일한 원리와 실험방법으로 샘플을 준비하여 형광현미경으로 세포를 관찰한 후 세포의 개수를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, RNase A가 로딩된 나노소포체를 여러 농도로 처리하였을 때, TNF-α를 처리하지 않은 HUVEC에도 일부 비특이적으로 약물이 전달되었다. 그러나 TNF-α를 처리한 경우에 세포 수가 확연히 감소한 것으로 보아 HUVEC에 더 많은 RNase A가 전달되는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 나노소포체를 이용하여 단백질 약물을 세포 특이적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8. 형질전환세포 유래 나노소포체를 이용한 in vitro 약물 전달 검증
상기 실시예 7의 단핵구 유래 나노소포체와 같이 형질전환세포로부터 제조한 나노소포체가 세포 특이적으로 약물을 전달하는지 검증하기 위하여 항암제인 독소루비신 또는 RNase A가 로딩된 단핵구 유래 나노소포체를 제조한 후 이를 단핵구 세포에 처리한 뒤, 살아있는 세포 수를 측정하였다.
ICAM-1이 과발현된 HT1080 형질전환세포에서 독소루비신, RNase A가 로딩된 나노소포체를 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. 초음파 분해법 단계에서 독소루비신, RNase A를 각각 800 ㎍/㎖씩 넣어 초음파 분해를 하여 독소루비신 또는 RNase A가 로딩된 나노소포체를 제조하였다.
이후 단핵구인 U937 세포를 24 well plate에 1 × 105개의 세포를 500 ㎕의 배지에 접종한 후, HT1080 세포에서 얻은 나노소포체를 0, 1, 2, 5, 10 ㎍/㎖의 농도로 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포 용액 50 ㎕를 96 well plate에 넣고, 트립판 블루(trypan blue) 용액 50 ㎕를 처리하였다. 살아있는 세포에서는 트립판 블루가 다시 세포 밖으로 분비되기 때문에, 트립판 블루로 염색되지 않는다. 혼합된 용액 10 ㎕를 혈구 계산기(hemocytometer)에 넣고, 광학 현미경에서 트립판 블루가 없는 세포의 개수를 세었다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, ICAM-1이 발현되는 형질전환된 HT1080 세포에서 얻은, 약물이 로딩되지 않은 나노소포체와 약물이 로딩된 나노소포체를 비교하였을 때, 약물이 로딩되지 않은 나노소포체의 경우, 높은 농도를 처리하여도 세포 사멸을 유도하지 않는 반면, 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 처리한 경우 5 ㎍/㎖에서부터 세포사멸을 유도하였고, RNase A의 경우 10 ㎍/㎖에서부터 세포사멸이 유도되었다.
실시예 9. GE11 및 EGF 세포막 발현 형질전환세포 유래 나노소포체를 이용한 in vitro 약물 전달 및 세포 특이적 전달 검증
12 well plate에 EGFR 발현 인간 폐암 세포주 A549를 5 × 104의 양만큼 접종한 후, 16 시간 동안 배양하였다. A549에 있는 EGFR는 EGF와 GE11과 같은 접합 분자와 결합할 수 있다.
A549 세포가 접종된 plate를 PBS로 세척한 후 배지 1㎖을 넣고 0.1, 1, 10 × 109 particles/㎖의 농도로, 실시예 1의 방법에 따라 EGF 및 GE11 세포막 발현 형질전환세포로부터 제조된 독소루비신이 로딩된 나노소포체를 첨가하여 처리한 후, 20분 동안 배양하였다. 다시 PBS로 세척한 후, 배지 1 ㎖을 넣고, 36시간 동안 배양한 다음 PBS로 세척한 후 혈청이 없는 배지 500 ㎕를 넣고 셀트래커(CellTracker, Invitrogen. No. C2925)를 5 μM이 되도록 넣은 후 30분간 배양하였다. 이후 4% 파라포름알데하이드 500 ㎕를 넣고 실온에서 10분 동안 고정한 후, 형광 현미경 상에서 관찰하였다.
그 결과, 도 14 에 나타낸 바와 같이, 농도가 증가함에 따라 살아있는 세포의 수가 감소함을 확인했다. 결론적으로, EGF 및 GE11 세포막 발현 형질전환세포에서 유래되고, 항암 약물이 로딩된 나노소포체에 존재하는 GE11 및 EGF가 EGFR를 표면에 발현하고 있는 세포와 특이적으로 결합할 수 있고, 로딩된 항암 약물을 세포에 특이적으로 전달하여 세포 사멸을 일으킬 수 있음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (37)

  1. 세포 내 성분이 제거된 세포의 지질막에서 유래되고 상기 세포보다 작은 나노소포체로서, 세포 내 성분은 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 제거된 것인 나노소포체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(Na2CO3), 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화칼륨(KOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 및 수산화마그네슘(Mg(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제조된 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 포유류의 유핵세포로 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 특이 세포 또는 조직으로 유도되도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 세포 접합분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 형광 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노소포체의 막은 상기 세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포막 이외의 성분은 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노소포체는 막 성분이 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노소포체는 그 기원이 되는 세포의 세포막 단백질의 토폴로지가 유지되는 것을 특징으로 하는, 나노소포체.
  11. 제 1 항의 나노소포체에 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 것을 포함하는, 물질전달용 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 외부에서 주입된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 형광을 방출하는 물질인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 형광을 방출하는 물질은 형광단백질 또는 양자점인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  18. 하기 단계들을 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법:
    (a) 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계;
    (b) 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 추가하는 단계;
    (c) 상기 치료용 또는 진단용 물질이 추가된 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 현탁액으로부터 제조된 나노소포체를 분리하는 단계.
  19. 하기 단계들을 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩(loading)된 세포 지질막 유래 나노소포체의 제조방법:
    (a) 세포에 pH 9 내지 14의 알칼리 용액을 처리하여 세포 내 물질을 제거하는 단계;
    (b) 상기 세포 내 물질이 제거된 세포 지질막을 포함하는 현탁액을 초음파 분해 방법을 사용하여 나노소포체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 나노소포체를 포함하는 현탁액에 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 현탁액으로부터 배양된 나노소포체를 분리하는 단계.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 초음파 분해 방법을 통해 제조된 나노소포체에 압출 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  21. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(Na2CO3), 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화칼륨(KOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 및 수산화마그네슘(Mg(OH)2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제조된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  22. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 세포는 포유류의 유핵세포로 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  23. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 세포는 특이 세포 또는 조직으로 유도되도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  24. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 세포는 세포 접합분자, 항체, 표적유도 단백질, 세포막융합 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  25. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 세포가 성장 인자, 사이토카인, 수용체, 형광 단백질, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  26. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 나노소포체의 막은 상기 세포의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 세포막 이외의 성분은 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  28. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 나노소포체는 막 성분이 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  29. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 나노소포체는 그 기원이 되는 세포의 세포막 단백질의 토폴로지가 유지되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  30. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 상기 세포 이외의 외부에서 주입된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  31. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  33. 제 31 항에 있어서,
    상기 나노입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  34. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 형광을 방출하는 물질인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 형광을 방출하는 물질은 형광단백질 또는 양자점인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  36. 제 1 항의 나노소포체에 질병의 진단에 필요한 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 핵산(antisense nucleic acid), 또는 항체(antibody)가 로딩(loading)된 것을 포함하는, 질병 진단용 조성물.
  37. 제 36 항의 조성물을 포함하는, 질병 진단용 키트.
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