KR20190110942A - 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도 - Google Patents

독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리아에서 유래한 독성이 약화된 세포밖 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체(bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity)를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 생체 내외에서의 부작용을 줄이고 효능을 증진시켜 암을 포함한 다양한 질병 치료제 또는 진단제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된, 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.

Description

독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도{Bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity and use thereof}
본 발명은 박테리아에서 유래한 독성이 약화된 세포밖 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체(bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity)를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법 등에 관한 것이다.
그람 음성 또는 그람 양성 박테리아(Gram-negative and Gram-positive bacteria)를 포함한 모든 세포는 세포밖 소포체를 자연적으로 분비하는 것으로 알려져 있다. 상기 그람 음성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 외막 소포체(outer membrane vesicles)로도 알려져 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 크기가 20-200 nm이고, 단백질(proteins), 지질(lipids) 및 유전 물질(DNA, RNA) 등 다양한 생물학적 활성을 가진 물질들을 가지고 있으며, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 각각 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)와 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA)와 같은 독성 인자(virulence factor)도 가지고 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 동종 간의 단백질 혹은 유전 물질의 전달, 세포 신호 전달과 같은 정보 전달체로서의 기능과 경쟁적 생물체의 제거 혹은 박테리아의 생존 증진에 기여하며, 숙주에 독소 등을 전달함으로써 박테리아 감염 질환의 병인 현상을 조절한다고 알려져 있다.
최근의 연구 결과에 의하면, 다양한 박테리아 세포밖 소포체가 암을 비롯한 여러 질병에 대한 직접적인 치료 효능이 있을 뿐만 아니라, 이들 질병을 치료하기 위한 약물 전달체로 사용 가능하며, 뇌수막염 등 다양한 질병을 예방하거나 치료하기 위한 백신 전달체로 임상에 사용되거나 개발되고 있다. 하지만 박테리아 세포밖 소포체는 전신 염증, 국부 염증, 또는 혈액 응고 유도 등을 통해 다양한 부작용을 유발할 수 있어 임상에 사용하기에는 한계가 있다.
또한 박테리아 세포밖 소포체를 질병 치료제, 약물 전달체 또는 백신 전달체로 사용하기 위해서는 대량 생산이 필수적이다. 박테리아 세포밖 소포체를 대량 생산하기 위해서는 다양한 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 균주, 돌연변이 및/또는 형질 전환된 균주를 선별하는 등 여러 문제들이 극복되어야 하지만, 박테리아 배양을 위해 사용하는 배지의 조성을 정확하게 조절하는 것이 필수적이다. 통상적으로 그람 음성 박테리아인 대장균의 경우 LB 배지(lysogeny broth)를 사용하지만, LB 배지의 경우 구성 성분이 명확하지 않을 뿐만 아니라, 배치(batch)별로 조성이 다를 수 있어 LB 배지에서 배양한 박테리아에서 분리한 세포밖 소포체는 구성 성분이나 치료 효능 등이 동일하지 않다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 박테리아 세포밖 소포체를 질병 치료제 또는 진단제, 약물 전달체, 백신 전달체 또는 백신 조성물로 사용함에 있어, 통상적으로 사용하는 LB 배지에서 배양한 박테리아로부터 분리한 세포밖 소포체를 이용할 때 세포밖 소포체의 구성 성분이나 치료 효능 등이 동일하지 않다는 종래 기술의 한계점을 해결하고자 연구한 결과, 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양한 후 이로부터 분리한 세포밖 소포체를 이용하여 상기 문제를 해결할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium), 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 암을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 항암 효과를 증진시키는 약물을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체에 로딩된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
또한, 본 발명은 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질 전달용 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병을 예방 또는 치료용 백신 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 "백신 조성물" 이라는 용어는 숙주 내에서 면역 반응을 유도시키는데 유용한, 약학적으로 허용 가능한 운반체 내의 하나 이상의 항원 또는 면역원을 포함한다. 본 발명의 상기 백신 조성물은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하며, 추가적인 항원 또는 면역원을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 개체의 나이, 성별, 중량, 종(species), 품종(breed) 및 수령 동물의 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여, 의학 또는 수의학 당업자에게 주지되어 있는 기술에 의해 주지되어 있는 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피적, 점막을 통한 투여(예를 들어, 경구, 비강, 항문, 질) 또는 비경구 경로를 통해서 (피내, 근육내, 피하, 정맥내, 또는 복강내) 일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 동시-투여 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태에는 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르, 및 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여용 제제 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀젼이 포함될 수 있다. 백신 조성물은 스프레이로서 투여되거나 식품 및/또는 물에 혼합되거나 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코오스 등과의 부가혼합물로 전달될 수 있다. 상기 조성물은 원하는 제제 및 투여 경로에 따라, 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 아쥬반트, 겔화 또는 증점 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 불필요한 실험을 거치지 않고 적합한 제제를 제조하는데 "Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990" 과 같은 표준 약학 교과서를 참고할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로, 상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류 등에 의한 감염인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예로, 상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상 동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 및 피부 질환 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물이나 면역 보강제를 병용 투여하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 막 단백질과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아; 또는 세포밖 소포체의 내강 수하물(luminal cargo)과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는 Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog), 또는 HER2/neu 등의 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 항원 단백질 또는 펩타이드를 로딩한 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는 Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog), 또는 HER2/neu 등의 돌연변이일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 분리 단계가 초원심 분리, 밀도 구배, 여과, 투석, 침전, 크로마토그래피 및 자유 유동 전기 이동법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 (d) 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 생체 내외에서의 부작용을 줄이고 효능을 증진시켜 암을 포함한 다양한 질병 치료제/진단제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된, 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 화학 조성 배지(a)와 포유류 세포 배양 배지(b)에서의 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균(지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균을, 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환시킨 대장균)의 생장 곡선을 나타낸 결과이다.
도 2는 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서의 ΔmsbB 대장균, 황색포도알균, 살모넬라균, 고초균의 생장 곡선을 나타낸 결과이다.
도 3은 대장균 세포밖 소포체(a) 및 다른 박테리아 세포밖 소포체(b)를 동적 광산란 입도 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양(a), 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체의 수(b)와 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 수(c)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 ΔmsbB 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 및 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVLB, EVM9, EVM9+와 ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 및 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVLB, EGFEVM9, EGFEVM9+에 존재하는 단백질 조성을 SDS-PAGE(a)로 분석하고 세포 외막 단백질인 OmpA의 양을 Western blotting(b)으로 분석한 결과이다.
도 6은 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVM9(a)과 DMEM 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVDMEM(b), 그리고 ΔmsbB 대장균과 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 LB 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVLB 및 EGFEVLB(c)의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증한 결과이다.
도 7은 황색포도알균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 SA EVM9+의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증한 결과이다.
도 8은 박테리아 세포밖 소포체 내에 로딩한 독소루비신의 정량 결과이다.
도 9는 ΔmsbB 대장균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체에 독소루비신을 로딩한 DoxEVM9+의 대장암 세포주(CT26; a) 및 내피 세포(HMEC-1; b)에 대한 약물 전달 효능을 평가한 것이다. 우측 패널에서 DoxEVM9+의 농도는 1x1010 EVs/mL로, 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있다.
도 10은 황색포도알균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체에 독소루비신을 로딩한 SA DoxEVM9+의 대장암 세포주(CT26; a) 및 내피 세포(HMEC-1; b)에 대한 약물 전달 효능을 평가한 것이다. 우측 패널에서 SA DoxEVM9+의 농도는 1x1010 EVs/mL로, 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있다.
도 11은 ΔmsbB 대장균과 황색포도알균을 각각 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVM9+(a)와 SA EVM9+(b)의 대장균 세포밖 소포체 및 황색포도알균 세포밖 소포체에 대한 항체 형성 효능을 평가한 것이다.
본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 독성이 약화된 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아를 포함한다. 상기 그람 음성 박테리아는 대장균, 녹농균, 및 살모넬라균 등을 포함하며, 그람 양성 박테리아는 황색포도알균 및 고초균 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아를 포함한다. 구체적으로, 상기 형질 전환된 박테리아는 상기 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 내독소(endotoxin) 생성 유전자 변형 박테리아를 들 수 있고, 구체적으로 ΔmsbB 대장균을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 특이 세포나 조직으로 타겟팅 되도록 형질 전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 암 혈관, 암 조직 또는 암 세포로 타겟팅 되도록 형질 전환된 박테리아를 들 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에서 사용되는 박테리아는 표적세포의 세포막과 융합(fusion)하도록 형질 전환된 박테리아, 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아, 및 상기 특정 물질의 억제와 특정 물질의 발현이 동시에 일어나도록 형질 전환된 박테리아 등을 포함한다. 그러나 본 발명의 박테리아 세포밖 소포체를 제조하는 박테리아는 상기에 제한되지 아니한다.
상기 박테리아는 물질 처리 또는 유전자 도입에 의해 형질 전환된 것일 수 있으며, 2회 이상 형질 전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아가, 하나 이상의 특정 단백질의 발현을 억제하도록 형질 전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아가, 세포 접합 분자(cell adhesion molecule), 항체(antibody), 표적 유도(targeting) 단백질, 세포막 융합(fusion) 단백질 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아는 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균을, 인간 EGF(Epidermal growth factor)와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환시킨 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 '화학 조성 배지'는 혈청, 조직 추출물 등 조성이 불분명한 자연 유래 소재를 사용한 '자연 배지'와 대비되는 것으로서, 조성물의 구성과 화학적 성상이 분명한 물질만으로 제조한 합성 배지(chemically defined medium)를 의미한다. 상기한 바와 같이 종래 박테리아 세포밖 소포체 제조에 널리 사용되었던 LB 배지(lysogeny broth) 또는 영양 배지(nutrient broth)로 인한 문제점을 해결하고, 균일한 효과를 나타내는 세포밖 소포체를 생산하기 위한 필수 구성요소이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 '질병'은 암을 포함한 다양한 질병을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 '박테리아 세포밖 소포체'는 박테리아에서 자연적으로 분비되는 '쉐딩 세포밖 소포체(shedding extracellular vesicles)', 및 박테리아를 유전적, 화학적, 또는 기계적 방법 등을 사용하여 인위적으로 제조된 '인공 세포밖 소포체(artificial extracellular vesicles)'를 포함한다.
본 발명의 '박테리아 세포밖 소포체'는 유래한 박테리아의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 박테리아의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid) 및 박테리아 성분 등을 가지고 있으며, 원래 박테리아보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체는 다양한 방법에 의해 얻을 수 있으며 그 예를 소개하면 하기와 같지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
(1) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아를 배양하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다.
(2) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아에 세제를 처리하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다. 상기 세제에는 제한이 없다.
(3) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아에 항생제를 처리하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다. 상기 항생제는 제한이 없으며, 젠타마이신, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 등을 포함한다.
본 발명의 인공 세포밖 소포체는 박테리아를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기 천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막이 상기 박테리아의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포막 이외의 성분으로서 표적 유도 물질, 세포막 융합 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킴으로써 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체 제조 시 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 약제학적 조성물은 상기 세포밖 소포체에 의한 독성을 억제시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약물을 세포밖 소포체에 로딩할 수도 있다. 상기 약물은 내독소에 의한 독성을 억제하는 약물을 포함하며, 그 예로 폴리믹신(polymyxin) B를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약제학적 조성물은 항암 효과를 증가시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약물을 세포밖 소포체에 로딩할 수도 있다.
본 발명에서 '로딩' 은 필요한 물질을 박테리아 세포밖 소포체의 표면에 노출시키거나 내부에 내포(encapsulation)시키는 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항암 효과를 증가시키는 약물은 Th17(T helper 17 세포) 면역반응을 억제하는 약물, 인터루킨(interleukin, IL)-6의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달을 억제하는 약물, 항암제, 약물을 로딩한 나노 입자 치료제, 암 치료를 위한 세포치료제 등을 포함한다. Th17 면역반응을 억제하는 약물의 예로는 아스피린(aspirin)을 들 수 있으며, VEGF의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물의 예로는 VEGF 수용체에 의한 신호전달을 억제하는 약물을 들 수 있다. 항암제를 로딩한 리포좀의 예로는 독실(DOXIL)을 들 수 있다. 상기 나노 입자 치료제는 10 nm ~ 10 μm 크기를 가지는 입자로써, 리포좀 (liposome), 덴드리머 (dendrimer), 폴리머 (polymer), 세포밖 소포체 (microvesicle) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 상기 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈(dextrose) 용액, 말토덱스트린(maltodextrin) 용액, 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol), 리포좀(liposome) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여함으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.1 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 박테리아 세포밖 소포체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명에서 '개체'란, 특정 질환 (예를 들면 암, 혈관질환, 또는 염증성 질환 등)의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류, 어류 및 조류를 포함하는 동물을 의미한다.
본 발명에서의 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양 등으로 이루어진 군으로부터 본 발명이 치료하려는 표적이 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 방법에서 사용되는 박테리아 및 박테리아 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 상기 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키기 위하여 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 사용할 수 있다.
상기 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키기 위하여는 하기와 같은 다양한 방법들이 있다.
(1) 박테리아의 독성이 약화되도록 유전적으로 형질 전환된 박테리아를 사용하여 세포밖 소포체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 숙주의 염증반응을 매개하는 지질다당류의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아(ΔmsbB mutant), 또는 리포타이코산(lipoteichoic acid, LTA)의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아(ΔltaS mutant)을 사용하여 세포밖 소포체를 제조할 수 있다.
(2) 내독소의 활성을 억제시키는 약물을 사용하여 박테리아의 독성을 감소시킬 수 있다. 상기 약물의 일 예로 폴리믹신 B를 들 수 있다. 상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체와 병용 투여할 수도 있으며, 배양 시 약물을 처리한 박테리아로부터 세포밖 소포체를 제조할 수도 있다.
(3) 항염증 및/또는 항응고 작용을 하는 약물을 사용하여 부작용을 감소시킬 수 있다. 상기 약물은 아스피린을 포함한다. 박테리아 세포밖 소포체와 아스피린을 병용 투여하면 박테리아 세포밖 소포체에 의한 염증반응, 혈액응고 반응 등의 부작용을 방지할 수 있다. 또한 배양 시 상기 약물을 처리한 박테리아로부터 세포밖 소포체를 제조할 수도 있다.
(4) 상기 세포밖 소포체의 막 성분에 화학적 방법으로 변형을 가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기 또는 아민기를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적 방법으로 결합시킴으로써 상기 세포밖 소포체의 막 성분을 화학적으로 변형시켜서 사용할 수 있다.
(5) 살균된 세포밖 소포체를 사용함으로써 살아 있는 박테리아의 감염을 막을 수 있다. 예를 들면, 자외선 및 감마선을 이용한 살균 또는 필터링을 이용한 박테리아의 제거 등을 통해 살균된 세포밖 소포체를 얻을 수 있다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키는 방법은 상기 예에 제한되지 아니하며 상기 방법 각각을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 항암 효능을 증가시키는 약물을 로딩한 세포밖 소포체를 사용할 수 있다. 항암 효능을 증가시키는 약물은 전술한 바와 같다.
또한 상기 방법의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체를 개체에 투여 시 상기 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키는 약물 및/또는 항암효능을 증가시키는 약물, 약물을 로딩한 나노입자 치료제 및 세포치료제 등을 병용 투여할 수 있다.
상기 나노입자 치료제는 10 nm ~ 10 μm 크기를 가지는 입자로써, 리포좀 (liposome), 덴드리머 (dendrimer), 폴리머 (polymer), 세포밖 소포체 (microvesicle) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체에 로딩되는 물질은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 치료용 및/또는 진단용 물질일 수 있으며, 상기 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아가 발현하고 있는 물질이 로딩될 수도 있으며 필요에 따라 상기 박테리아에서 유래하지 않고 박테리아의 외부에서 준비된 물질을 로딩할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질은 상기 박테리아에서 유래된 것 및 박테리아 외부에서 주입된 것 등을 포함한다. 또한 로딩되는 물질은 1개 일 수도 있고 2개 이상일 수도 있다. 또한, 상기 물질들을 박테리아 세포밖 소포체의 표면에 물리, 화학, 및/또는 생물학적 방법으로 로딩할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 본 발명의 박테리아 세포밖 소포체에 로딩하는 방법은 하기를 포함한다.
첫째, 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 이미 로딩한 박테리아에서 세포밖 소포체를 제조한다. 예를 들어, 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 배양액에 포함시켜서 박테리아를 배양하면 상기 물질이 로딩된 박테리아를 수득할 수 있으며, 또는 전기 천공 방법으로 박테리아에 물질을 로딩할 수도 있다. 또한, 이러한 박테리아에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 세포밖 소포체, 또는 초음파 분해, 압출, 기계적 분해 등의 방법으로 제조한 인공 세포밖 소포체에는 상기 물질이 로딩되어 있다.
둘째, 박테리아 세포밖 소포체의 제조 과정에서 상기 물질을 박테리아 세포밖 소포체에 로딩한다. 예를 들어, 박테리아가 포함된 용액에 상기 물질을 첨가한 후 박테리아보다 크기가 작은 필터를 통과시키는 압출법으로 세포밖 소포체를 제조하면 세포밖 소포체에 상기 물질이 로딩된다.
셋째, 쉐딩 세포밖 소포체 또는 인공 세포밖 소포체를 제조한 후에 상기 물질을 로딩할 수 있다. 예를 들어, 전기 천공 방법으로 이미 제조한 쉐딩 세포밖 소포체 또는 인공 세포밖 소포체에 물질을 로딩할 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 물질을 세포밖 소포체에 로딩하는 방법은 상기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 치료용 및/또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제(angiogenesis inhibitor), 펩타이드(peptide), 단백질(protein), 백신(vaccine), 독소(toxin), 핵산, 비드(bead), 마이크로입자(microparticle) 및 나노입자(nanoparticle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 항암제일 수 있다.
상기 항암제는 암의 성장과 전이를 억제시키기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 항암제는 암세포의 DNA의 복제, 전사, 번역 과정을 차단한다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 항암제의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 항암제는 암세포의 종류, 항암제의 흡수 속도(치료기간과 항암제 투여 경로), 종양의 위치, 종양의 크기 등의 항암제 선택 시 고려하는 일반적인 원칙하에 선택될 수 있다. 상기 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agent)인 메칠로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 시크로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin) 등이 사용될 수 있고, 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)인　닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 블레오마이신(C Bleomycin) 등이 사용될 수 있으며, 식물 알카로이드(plant alkaloid)인 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 다노루비신(daunorubicin), 탁솔(taxol), 온코빈(oncovin), 프레드니손(prednisone), 시스플라틴, 허셉틴(herceptin), 리툽시맵(rituximab), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테산(topotecan) 및 이리도테산(iridotecan) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방사성 물질들을 이용할 수도 있다. 그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제가 상기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 항염증제일 수 있다. 구체적으로, 상기 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 이부프로펜(ibuprofen), 클로베타졸 프로피오네이트(clobetasol propionate), 디팔오르손 디아세테이트(diflorasone diacetate), 할로베타솔 프로피오네이트(halobetasol propionate), 암시온니드(amcinonide), 플루시온니드(fluocinonide), 모메타손 푸로에이트(mometasone furoate), 데옥시메타손(desoximetasone), 디클로페낙(diclofenac) 및 피록시캄(piroxicam) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명에서 사용될 수 있는 항염증제가 상기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 혈관신생 저해제일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈관신생 저해제는 기존 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 과정을 억제하기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 혈관신생 저해제는 암의 성장과 전이를 억제하고 염증 반응을 억제할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 혈관신생 저해제의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드를 포함시킬 수 있다. 예를 들어, RNase A 뿐만 아니라, VEGF, EGF 등과 같은 성장 인자, IL-1, IFN-gamma, IL-10과 같은 사이토카인류, 각종 항체 치료제, 다양한 펩타이드 또는 단백질, DNase 이 외에 암의 성장과 전이를 억제하고 염증반응을 억제할 수 있는 다양한 단백질 및 펩타이드를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 백신을 포함시킬 수 있다. 백신은 병원체의 감염증을 예방하기 위해 인체 내에 인위적으로 약독화된 병원체(항원) 등을 주입하여 인체의 면역 체계를 활성화시키는 것으로서, 본 발명의 상기 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 독소를 포함시킬 수 있다. 독소는 다양한 생물체에서 유래된 것으로 체내에 흡수되었을 때 독성을 나타낼 수 있는 것을 총칭하며, 독소를 통해 세포 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 독소의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 핵산은 센스 효과, 안티센스 효과, RNA 간섭 및 단백질의 기능 저해 등의 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브(carbon nanotube), 또는 자기 비드(magnetic bead)를 포함하는 나노 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 자기 비드 등의 비드를 세포밖 소포체에 로딩하여 사용할 수도 있다. 산화철 등의 자성입자는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)을 얻는 조영제로 이용될 수 있다. 나노 입자와 결합한 핵산, 나노 입자와 결합한 단백질 등도 사용할 수 있으며 진단에 유용한 방사성 물질도 사용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 형광을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 형광을 방출하는 물질이 형광 단백질 또는 양자점(quantum dot, Qdot)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 형광단백질을 암호화(encode)하는 핵산 또는 다양한 형광물질을 로딩한 세포밖 소포체를 진단에 이용할 수 있다. 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포밖 소포체에 형광단백질을 암호화하고 있는 플라스미드 DNA를 로딩하여 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광단백질에서 방출되는 형광 신호로부터 알 수 있다. 또한, 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포밖 소포체에 형광 방출 양자점을 포함한 다양한 형광물질을 포함시켜서 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광 신호로부터 알 수 있다. 특정한 표적 세포 또는 조직에서 발생하는 형광을 진단에 이용할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 형광 방출 양자점은 치료 목적으로도 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 세포밖 소포체를 사용하여 2가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 2가지 이상의 물질을 동시에 로딩한 세포밖 소포체를 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 또는, 한 가지 또는 두 가지 이상의 물질이 로딩된 세포밖 소포체를 복수 개 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 및/또는 진단용 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 질병 치료용 및/또는 진단용 약물, 약물을 로딩한 나노 입자 치료제 및 세포치료제 등을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖 소포체를 사용하여 질병 치료용 또는 진단용 물질, 질병 치료용 및/또는 질병 진단용 물질을 로딩한 나노 입자 치료제 및 세포치료제 등을 표적 세포 또는 조직으로 전달하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포밖 소포체에 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 함께 로딩되어 있는 것을 사용하여 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 두 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 세포밖 소포체를 사용하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 2 개 이상의 세포밖 소포체를 동시에 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 세포밖 소포체를 순차적으로 투여하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체와 1 가지 이상의 질병 치료용 및/또는 질병 진단용 물질을 로딩한 나노 입자 치료제, 또는 질병 치료용 세포치료제를 조합하여 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 또는 진단용 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 질병 진단용 및/또는 치료용 약물전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 독성이 약화된 박테리아 및 박테리아 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류에 의한 감염을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 박테리아에 의한 감염은 그람 음성 박테리아에 의한 감염, 그람 양성 박테리아에 의한 감염을 포함한다. 구체적으로, 상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 및 피부 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질 전환된 박테리아를 사용하는 것, 박테리아에 화학물질을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화학물질은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물 또는 면역 보강제를 병용 투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다. 상기 박테리아 세포밖 소포체 제조 방법은 박테리아에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 세포밖 소포체 및 인공 세포밖 소포체를 제조하는 방법을 포함한다.
상기 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 제조 방법의 일 구현예로 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계.
상기 방법으로 제조된 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체는 항생제 처리, 자외선 노출, 감마선 노출, 및 필터링으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 세포밖 소포체를 살균하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
상기 제조 방법은 상기 박테리아보다 크기가 작고 상기 약물이 로딩된 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분리 단계는 초원심분리(ultracentrifugation), 밀도 구배(density gradient), 여과(filtration), 투석(dialysis), 침전(sediment), 크로마토그래피(chromatography) 및 자유 유동 전기이동법(free-flow electrophoresis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한 상기 본 발명의 제조 방법은 상기 박테리아의 세포막과 비교하여 토폴로지(topology)가 변형된 막을 갖는 세포밖 소포체를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 세포밖 소포체를 제조한 후에, 목적에 따라 원래 세포의 세포막과 토폴로지가 동일한 세포밖 소포체만을 선택하여 사용할 수 있다. 세포막 단백질 중 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 인지하는 항체와 같은 물질을 사용해서 이 세포질 도메인이 외부에 노출된 세포밖 소포체를 제거할 수 있다. 이렇게 하면 세포막의 안팎이 바뀐 세포밖 소포체는 제거되고 남은 세포밖 소포체의 외부에는 원래 세포의 세포막 외부에 노출된 세포막 단백질만이 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아를 포함하는 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
상기 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법의 일 구현예로 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계; 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계.
상기 본 발명의 치료용 또는 진단용 물질은 상술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 지질 다당류의 독성이 약화된 대장균 배양
상기한 문제를 극복하기 위해, 화학적으로 구성 성분이 정의된 다양한 화학 조성 배지(chemically defined media) 및 포유류 세포 배양 배지를 이용하여 형질 전환 대장균을 배양하고, 그 생장을 확인하였다.
구체적으로, 하기 [표 1]에 나타난 바와 같이 고농도 포스페이트 M9(High Phosphate-M9)과 저농도 포스페이트 M9(Low Phosphate-M9) 화학 조성 배지, 또는 저농도 포스페이트 M9 화학 조성 배지에 비타민과 미량 원소를 첨가한 배지(M9+)를 제조하였다. 이를 이용하여 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균에 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환된 ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 배양하였으며, 각 배지에서의 성장을 600 nm 파장에서 흡광도로 확인하였다. 그 결과, 고농도 포스페이트 M9 배지에서는 성장하지 않지만, 저농도 포스페이트 M9 배지에서는 잘 성장함을 관찰하였고, 그 성장 속도는 비타민(vitamins)과 미량 원소(trace elements)를 포함한 저농도 포스페이트 M9 배지에서 키우는 경우와 크게 차이가 없음을 관찰하였다(도 1a). 또한, ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 포유류 배양 배지인 DMEM과 RPMI 1640에서도 성장하지만, 최종 세포 농도는 흡광도(파장 600 nm) 값이 1 정도가 되고 나면 더 이상 성장하지 않았다(도 1b).
Figure pat00001
실시예 2. 다양한 박테리아 배양
다양한 박테리아를 저농도 포스페이트 M9 화학 조성 배지에 비타민과 미량 원소를 첨가한 배지(M9+), 그리고 화학적으로 구성 성분이 정의되지 않은 배지인 LB배지에 배양하고, 그 생장을 확인하였다. 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균(도 2a), 황색포도알균(Staphylococcus aureus; 도 2b), 살모넬라균(Salmonella enterica; 도 2c), 고초균(Bacillus subtilis; 도 2d)을 배양한 결과, M9+과 LB 모두에서 잘 성장함을 알 수 있었다(도 2).
실시예 3. 박테리아 세포밖 소포체의 분리
박테리아 세포밖 소포체를 분리하기 위해, ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+), 그리고 DMEM 배지에서 각각 배양하였다. 또한, prsA-EGF 융합 단백질 발현이 박테리아 세포밖 소포체의 생성, 조성 및 생리 활성에 차이가 있는지 여부를 규명하기 위해 ΔmsbB 대장균을 LB 배지와, 저농도 포스페이트 M9 배지, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에 배양하였다. 또한, 황색포도알균을 LB 배지와, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에, 살모넬라균과 고초균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에 배양하였다. 각각의 배양액을 고속 원심 분리 튜브(high speed centrifuge tube)에 담은 후, 4℃에서 6,000 x g로 20분 간 두 번 원심 분리하였다. 박테리아를 제거한 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 멤브레인을 사용하여 50배 농축하였다. 농축액을 구멍 크기가 0.22 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 70 mL 용량의 초원심 분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 담고, 4℃에서 150,000 x g로 3시간 동안 초원심 분리하였다. 침전물을 50% 옵티프렙 2.5 mL에 현탁한 후, 5 mL 용량의 초원심 분리 튜브에 넣은 후, 그 위에 40% 옵티프렙 1.5 mL, 10% 옵티프렙 1.25 mL을 차례로 담았다. 이후, 4℃에서 200,000 x g로 2시간 동안 초원심 분리하였다. 박테리아 세포밖 소포체를 10% 옵티프렙과 40% 옵티프렙 사이의 층에서 얻은 후, 구멍 크기가 0.22 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 분주하여 -80℃에 보관하였다.
본 명세서에서 다양한 박테리아 세포밖 소포체를 체계적으로 표현하기 위해 하기 [표 2]에 표시한 약어들을 사용하였다.
Figure pat00002
박테리아 세포밖 소포체의 크기를 동적 광산란 입도 분석기로 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 다양한 조건에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 크기는 40~50 nm로 비슷하였다.
실시예 4. 박테리아 세포밖 소포체 단백질 양 및 세포밖 소포체 수 측정
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양은 브래드포드 단백질 정량법(Bradford protein assay)으로 확인하였으며, 세포밖 소포체 수는 나노 입자 추적 분석법(nanoparticle tracking analysis)으로 확인하였다.
도 4a는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양을 측정한 그래프이고, 도 4b는 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체 수를 측정한 그래프이고, 도 4c는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체 수를 측정한 그래프이다. 도 4a에 나타난 바와 같이 ΔmsbB 대장균은 ΔmsbB prsA-EGF 대장균보다 모든 배양 조건에서 세포밖 소포체 단백질 양으로 보면 많은 양의 세포밖 소포체를 분비하지만, 도 4b에 나타난 바와 같이 ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 ΔmsbB 대장균보다 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체의 수가 현저히 많음을 관찰하였다. 따라서, 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체 수로 보면 도 4c에 나타난 바와 같이 ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 배양 조건에 따라 ΔmsbB 대장균보다 많은 수의 세포밖 소포체를 분비하거나 작은 수의 세포밖 소포체를 분비하더라도 도 4a와 비교했을 때 단백질의 분비량 차이보다 그 비율이 현저히 작음을 관찰하였다.
실시예 5. 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 조성 분석
다양한 배지에서 배양한 ΔmsbB 대장균 및 ΔmsbB prsA-EGF 대장균 유래 세포밖 소포체가 크기는 서로 비슷하지만, 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체 수가 현저하게 차이가 나는 원인을 규명하기 위해, 10 μg의 EVLB, EVM9, EVM9+, EGFEVLB, EGFEVM9, 및 EGFEVM9+에 대해 SDS-PAGE를 수행해 단백질 조성이 상이함을 확인하였고(도 5a), 1 μg의 EVLB, EVM9, EVM9+, EGFEVLB, EGFEVM9, 및 EGFEVM9+에 존재하는 세포 외막 단백질인 OmpA를 Western blotting으로 확인한 결과 OmpA의 양이 다양하게 존재함을 확인하였다(도 5b). 따라서, 한 개의 세포밖 소포체에 존재하는 OmpA의 양은 현저히 차이가 날 뿐만 아니라, 여러 단백질들의 종류와 양도 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 6. 독성이 약화된 그람 음성 박테리아 세포밖 소포체의 항암 활성
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EGFEVM9와 EGFEVDMEM, EGFEVLB, 그리고 항암 활성이 기존에 알려져 있는 EVLB의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증하였다.
구체적으로, 5주령 Balb/c 생쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 28마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐 대장암 세포(CT26) 1x106 개를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 키웠다. 생쥐 대장암 세포 투여 6일 후, 생쥐를 4마리씩 7개 실험군으로 나누고, 각각의 실험군 별로 EGFEVM9(3 μL 또는 30 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 EGFEVDMEM (8 μL 또는 40 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, EGFEVLB(6 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, EVLB(10 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일에 두 번씩(세포 투여 6일 째, 10일 째, 13일 째) 꼬리 정맥에 주사하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 EVLB의 결과와 비교하기 위해 5 μg의 EVLB 수(~1x1010 EVs)에 해당하는 양(EGFEVM9 3 μL 또는 EGFEVDMEM 8 μL), 그것의 10배(EGFEVM9 30 μL, EGFEVLB 6 μL, EVLB 10 μL), 또는 5배(EGFEVDMEM 40 μL)에 해당하는 양을 포함하도록 하였다.
다음으로 각 실험군 별로 대장암 세포 투여 10일 후, 12일 후, 그리고 14일 후, 대장암 조직의 크기를 측정하였다. 대장암 조직의 부피(V)는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 V = l x s2/2의 공식으로 계산하였다. 상기 대장암 세포를 피하 투여한 이후 대장암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. PBS만 투여한 대조군에 비하여 EGFEVM9을 투여한 경우, 용량에 관계없이 대장암 조직의 크기가 지속적으로 감소하였고(도 6a), EGFEVDMEM을 투여한 경우 용량 의존적으로 대장암 조직의 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 6b). 한편 EVLB, EGFEVLB를 투여한 경우에도 대장암 조직의 크기가 PBS만 투여한 대조군에 비해서 감소하는 것을 확인하였다(도 6c).
또한, 각 실험군 생쥐의 체중, 체온, 움직임의 변화, 눈곱 또는 털 솟음 현상을 지속적으로 관찰하였고, 암 조직의 외관이 검게 변하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과, PBS를 투여한 대조군과 비교해, EGFEVM9와 EGFEVDMEM을 투여한 경우에도 암 조직이 검게 변하는 현상은 관찰되지 않았다. 또한 생쥐의 체중, 체온과 움직임에 큰 변화가 없었으며, 눈곱이 끼거나 털이 솟는 부작용도 관찰되지 않았고 사망하는 생쥐도 관찰되지 않았다. 하지만 EVLB나 EGFEVLB를 투여하면 암의 성장을 효과적으로 저해하지만 동시에 암 조직이 검게 변하는 현상이 관찰되며, 부작용으로 생쥐의 체중이 감소하거나, 움직임이 둔해지거나, 눈곱 또는 털 솟음 현상이 관찰되며, 심지어 생쥐가 사망하는 경우가 발생하였다.
상기한 결과를 종합하면, EGFEVM9와 EGFEVDMEM은 EVLB와 비교할 때 항암 효과가 비슷하거나 좋을 뿐만 아니라, 항암 효과가 있는 양의 최소한 10배의 양을 투여하여도 부작용을 유도하지 않았다.
실시예 7. 독성이 약화된 그람 양성 박테리아 세포밖 소포체의 항암 활성
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, SA EVM9+의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증하였다.
구체적으로, 5주령 Balb/c 생쥐12마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐 대장암 세포(CT26) 1x106 개를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 키웠다. 생쥐 대장암 세포 투여 6일 후, 생쥐를 4마리씩 3개 실험군으로 나누고, 각각의 실험군 별로 SA EVM9+(1 μL 또는 10 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일에 두 번씩(세포 투여 6일 째, 10일 째, 13일 째) 꼬리 정맥에 주사하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 EVLB와 비교하기 위해 5 μg의 EVLB 수(~1x1010 EVs)에 해당하는 양(SA EVM9+ 1 μL), 또는 그것의 10배(SA EVM9+ 10 μL)에 해당하는 양을 포함하도록 하였다.
다음으로 각 실험군 별로 대장암 세포 투여 10일 후, 12일 후, 그리고 14일 후, 대장암 조직의 크기를 측정하였다. 대장암 조직의 부피(V)는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 V = l x s2/2의 공식으로 계산하였다. 상기 대장암 세포를 피하 투여한 이후 대장암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다. PBS만 투여한 대조군에 비하여 SA EVM9+을 투여한 경우, 용량 의존적으로 대장암 조직의 크기가 지속적으로 감소함을 관찰하였다(도 7).
또한, 각 실험군 생쥐의 체중, 체온, 움직임의 변화, 눈곱 또는 털 솟음 현상을 지속적으로 관찰하였고, 암 조직의 외관이 검게 변하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과, PBS를 투여한 대조군과 비교해, SA EVM9+을 투여한 경우에도 암 조직이 검게 변하는 현상은 관찰되지 않았다. 또한 생쥐의 체중, 체온과 움직임에 큰 변화가 없었으며, 눈곱이 끼거나 털이 솟는 부작용도 관찰되지 않았고 사망하는 생쥐도 관찰되지 않았다.
상기한 결과를 종합하면, SA EVM9+은 EVLB와 비교할 때 항암 효과가 비슷하거나 좋을 뿐만 아니라, 항암 효과가 있는 양의 최소한 10배의 양을 투여하여도 부작용을 유도하지 않았다.
실시예 8. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 약물 전달
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EVM9+와 SA EVM9+을 사용하여 약물을 전달할 수 있는지를 확인하기 위해 하기 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 약물의 일 예로 독소루비신을 사용하였다.
상기 실시예 3의 방법에 따라 얻은 EVM9+와 SA EVM9+에 0.8 mg/mL 농도의 독소루비신을 1:1 비율로 섞어 4℃에서 12시간 동안 처리한 후, 4℃에서 150,000 x g로 3시간 동안 초고속 원심 분리를 진행하여 독소루비신을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체와, 용액 내 박테리아 세포밖 소포체가 들어가지 않은 독소루비신을 분리하였다. 독소루비신을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체에 대해 형광 감도 측정기(fluorometer)와 나노 입자 추적 분석을 수행한 결과 독소루비신을 로딩한 EVM9+(DoxEVM9+)와 SA EVM9+(SA DoxEVM9+) 모두 1x1010 EVs에는 독소루비신 1 μg이 존재함을 확인하였다(도 8).
생쥐 대장암 세포(CT26) 2x103 개/well 또는 인간 혈관 내피 세포(HMEC-1) 4x103 개/well을 96웰 플레이트에서 하루 동안 배양하였다. PBS (Control), 다양한 양의 독소루비신을 로딩하지 않은 EVM9+, 독소루비신을 로딩한 DoxEVM9+ 및 독소루비신을 각각 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포에 24시간 동안 처리하였다. 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포의 생존율을 WST-1 assay를 이용하여 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 알 수 있는 바와 같이, EVM9+는 농도에 관계없이 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸에는 영향이 없지만 DoxEVM9+는 농도 의존적으로 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과를 나타냈다. 또한 DoxEVM9+ 1x1010 EVs/mL에는 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있는데, 같은 양의 독소루비신에 비해 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 크게 나타났으며, 그 양의 10배에 해당하는 독소루비신과 비슷한 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 나타났다.
한편 SA EVM9+와 독소루비신을 로딩한 SA DoxEVM9+도 상기와 같은 방법으로 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포에 처리하여 세포들의 생존율을 확인하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, SA EVM9+는 농도에 관계없이 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸에는 영향이 없지만 SA DoxEVM9+는 농도 의존적으로 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과를 나타냈다. 또한 SA DoxEVM9+ 1x1010 EVs/mL에는 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있는데, 같은 양의 독소루비신에 비해 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 크게 나타났으며, 그 양의 10배에 해당하는 독소루비신과 비슷한 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 나타났다.
상기 결과로부터, 약물을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 보다 효과적으로 약물을 전달할 수 있으며, 동일한 양의 약물을 투여하였을 때 세포밖 소포체를 통해 전달함으로써 치료 효과를 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 백신
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EVM9+ 및 SA EVM9+을 백신으로 활용할 수 있는지를 생쥐 모델을 이용하여 검증하였다.
구체적으로, 5주령 C57BL/6 생쥐(The Jackson Laboratory) 15마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐를 3마리씩 5개 실험군으로 나눴다. 각각의 실험군 별로 EVM9+(0.5 μL 또는 2.5 μL)을 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 SA EVM9+(7 μL 또는 33 μL)을 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일 간격으로 2주 동안 2번 생쥐의 허벅지 근육으로 주입하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 1 μg에 해당하는 양(EVM9+ 0.5 μL 또는 SA EVM9+ 7 μL), 또는 5 μg에 해당하는 양(EVM9+ 2.5 μL 또는 SA EVM9+ 33 μL)을 포함하도록 하였다.
생쥐에 세포밖 소포체를 마지막으로 주입하고 1주일 후에 생쥐 눈의 혈관에서 혈액을 일부 얻어 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체 특이적인 항체를 측정하였다. EVM9+ 또는 SA EVM9+ 200 ng이 코팅된 검정색 96 웰 플레이트에 1% BSA/PBS로 1:500으로 희석된 생쥐 혈청을 넣어 상온에서 2시간 배양한 후, peroxidase가 결합된, 생쥐 혈청에 대한 항체를 이용한 효소 결합 면역 침강 분석법(enzyme-linked immunesorbent assay, ELISA)으로 관찰하였다. 도 11은 생쥐 혈청 내 EVM9+(도 10a) 또는 SA EVM9+(도 10b) 특이적인 항체 양을 관찰한 결과로, 용량 의존적으로 세포밖 소포체에 대한 특이 항체 형성이 증가함을 보여준다. 이는 세포밖 소포체를 2회 이상 근육으로 주입하였을 때 박테리아 세포밖 소포체에 함유된 단백질에 대한 특이 항체가 형성됨을 의미한다.
상기한 결과를 종합해보면, 다양한 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아 균주들, 이들의 형질전환된 균주들과 배양 배지 등의 조합을 통해 얻은 세포밖 소포체의 독성, 질병 치료제, 약물 전달체 및/또는 백신 전달체로서의 안전성과 효능 등의 차이를 규명하고, 이들 세포밖 소포체의 다양한 구성 성분(단백질, 핵산, 지질, 펩티도글리칸 등)의 차이를 다중 오믹스(multiomics) 기술을 이용해 비교 분석함으로써 독성과 효능에 관여하는 물질을 규명할 수 있고, 발굴된 물질들을 이용해 부작용이 없거나 적으면서 치료 효능, 약물 전달 효능 및/또는 백신 효능이 증진된 새로운 세포밖 소포체 또는 물질을 개발할 수 있음을 시사하고 있다.
본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체는 다양한 방법을 이용해 추가적인 1) 크기 조절 및 균질화(size modulation)을 하거나, 2) 부작용 감소, 혈액을 포함한 체내외에서의 안정성 증가, 질병 치료 효능 증진, 약물 전달체 효능 증진, 백신 전달체 효능 증진, 및 세포 또는 조직 타겟팅에 필요한 화합물, 펩타이드, 단백질, 융합 단백질, 핵산, 압타머, 독소, 다양한 형태의 항원, 폴리머와 지질 등 다양한 물질들 또는 이들의 복합체를 단독 또는 복합으로 세포밖 소포체 내부에 로딩 또는 표면에 제시(loading and/or display)하거나, 3) 상기한 방법들을 조합함으로써, 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 줄여 질병 치료제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능 등을 효과적으로 증진시킬 수 있다.
또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.

Claims (53)

  1. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인, 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아인, 약제학적 조성물.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  9. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  10. 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 항암 효과를 증진시키는 약물을 추가적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체에 로딩된 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 항암제인, 약제학적 조성물.
  17. 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질 전달용 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  21. 제 17항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  22. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 예방 또는 치료용 백신 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류에 의한 감염인, 백신 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  25. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  26. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종 및 피부 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  27. 제 22항에 있어서,
    상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물이나 면역 보강제를 병용 투여하여 사용하는 것인, 백신 조성물.
  28. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인, 백신 조성물.
  29. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인, 백신 조성물.
  30. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 막 단백질과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아; 또는
    세포밖 소포체의 내강 수하물(luminal cargo)과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는
    Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog) 또는 HER2/neu의 돌연변이인, 백신 조성물.
  33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  34. 제 22항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  35. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아 세포밖 소포체에 항원 단백질 또는 펩타이드를 로딩한 것을 포함하는, 백신 조성물.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는
    Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog) 또는 HER2/neu의 돌연변이인, 백신 조성물.
  37. (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법.
  38. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인 제조 방법.
  39. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인 제조 방법.
  40. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  42. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아인 제조 방법.
  43. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  44. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  45. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  46. 제 40항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  47. 제 37항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
  48. 제 37항에 있어서,
    상기 분리 단계가 초원심 분리, 밀도 구배, 여과, 투석, 침전, 크로마토그래피 및 자유 유동 전기 이동법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는 것인 제조 방법.
  49. (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법.
  50. 제 49항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  51. 제 50항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  52. 제 50항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  53. 제 49항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
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