WO2019182372A1 - 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도 - Google Patents

독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019182372A1
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cancer
medium
bacterium
extracellular vesicles
group
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PCT/KR2019/003285
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Inventor
고용송
고경윤
이창진
이재민
이재욱
딘티홍늉
김상수
Original Assignee
㈜로제타엑소좀
포항공과대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to attenuated extracellular vesicles derived from bacteria and uses thereof, and more particularly, to include or treat bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity.
  • All cells including Gram-negative and Gram-positive bacteria, are known to secrete extracellular vesicles naturally.
  • the extracellular vesicles secreted by the Gram-negative bacteria are also known as outer membrane vesicles.
  • Bacterial extracellular vesicles are 20-200 nm in size and have a variety of biologically active substances, including proteins, lipids, and genetic material (DNA, RNA), which are secreted by gram-negative and gram-positive bacteria.
  • Extracellular vesicles also have virulence factors, such as lipopolysaccharides (LPS) and lipoteichoic acid (LTA).
  • LPS lipopolysaccharides
  • LTA lipoteichoic acid
  • Bacterial extracellular vesicles contribute to the function of information carriers, such as the transfer of proteins or genetic material between allogeneic species, cellular signal transduction, to the elimination of competitive organisms, or to enhance the survival of bacteria, and to pathogens of bacterial infections by delivering toxins to the host. It is known to regulate.
  • mass production is essential for the use of bacterial extracellular vesicles as disease agents, drug carriers or vaccine carriers. While mass production of bacterial extracellular vesicles has to be overcome, including the selection of various Gram-negative and Gram-positive bacterial strains, mutants and / or transformed strains, precisely controlling the composition of the medium used for bacterial culture It is essential. Normally, Gram-negative bacteria Escherichia coli uses LB medium (lysogeny broth), but in the case of LB medium, the composition is not clear and the composition may be different from batch to batch to isolate from bacteria cultured in LB medium. One extracellular endoplasmic reticulum is problematic in that its components and therapeutic efficacy are not identical.
  • the present inventors when the bacterial extracellular vesicles are used as a disease treatment agent or a diagnostic agent, drug carrier, vaccine carrier or vaccine composition, the present inventors have found that extracellular vesicles separated from bacteria cultured in conventional LB medium are used. As a result of studies to solve the limitations of the prior art that the components and therapeutic effects are not the same, the problem can be solved by culturing the toxic weakened bacteria in a chemical composition medium and using the extracellular vesicles isolated therefrom. Confirmed and completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or diagnosing a disease, a composition for delivering a substance, a vaccine composition, and a method for preparing the same, including bacterial extracellular vesicles having weakened toxicity.
  • the present invention comprises a bacterial extracellular endoplasmic reticulum is weakened toxicity, the therapeutic or diagnostic pharmaceutical composition, characterized in that the bacteria are cultured in a chemical composition medium It provides a pharmaceutical composition.
  • the bacteria may be Gram negative bacteria.
  • the bacteria may be Gram positive bacteria.
  • the bacterium may be a transformed bacterium.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to attenuate the toxicity of the extracellular vesicles.
  • the bacteria may be endotoxin producing genetically modified bacteria.
  • the bacteria may be bacteria transformed to express the cell membrane fusion material.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to be targeted to a specific cell or tissue.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to express one or more from the group consisting of a cell conjugation molecule, an antibody, a target inducing protein, a cell membrane fusion protein itself, and a fusion protein thereof.
  • the bacterium may be a transformed bacterium two or more times.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium), and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640). have.
  • the disease may comprise cancer.
  • the cancer is thyroid cancer, liver cancer, osteosarcoma, oral cancer, brain tumor, gallbladder cancer, colon cancer, lymphoma, bladder cancer, leukemia, small intestine cancer, tongue cancer, esophageal cancer, kidney cancer, stomach cancer, breast cancer, pancreatic cancer, lung cancer, skin cancer, testicular cancer, penis It may be selected from the group consisting of cancer, prostate cancer, ovarian cancer and cervical cancer.
  • the disease is hypertension, osteoporosis, irritable bowel syndrome, acute coronary syndrome, stroke, diabetes, arteriosclerosis, obesity, peptic ulcer, Alzheimer's disease, emphysema, skin disease, skin infection, respiratory infection, It may be selected from the group consisting of urogenital infections, bone joint infections, central nervous system infections and sepsis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a drug that enhances the anticancer effect.
  • the drug may be loaded in bacterial extracellular vesicles.
  • the drug may be an anticancer agent.
  • the present invention is a composition for treating or diagnosing a disease, comprising a bacterium extracellular vesicle with a weakened toxicity loaded with a disease treating or diagnosing material, wherein the bacterium is cultured in a chemical composition medium.
  • a composition for delivery is provided.
  • the therapeutic or diagnostic material is selected from the group consisting of anticancer agents, anti-inflammatory agents, angiogenesis inhibitors, peptides, proteins, vaccines, toxins, nucleic acids, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent proteins and quantum dots It may be.
  • the nucleic acid may be selected from the group consisting of DNA, RNA, aptamer, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), and morpholino. .
  • the nanoparticles may be selected from the group consisting of iron oxide, gold, carbon nanotubes and magnetic beads.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640).
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating a disease, comprising a bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity, wherein the bacteria are cultured in a chemical composition medium.
  • the term "vaccine composition” includes one or more antigens or immunogens in a pharmaceutically acceptable carrier, useful for inducing an immune response in a host.
  • the vaccine composition of the present invention includes bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity and may include additional antigens or immunogens.
  • the vaccine composition is provided to a medical or veterinary artisan in consideration of such factors as the age, sex, weight, species, breed and condition of the recipient animal, and route of administration. It may be administered at known doses by well-known techniques.
  • the route of administration may be percutaneous, mucosal administration (eg, oral, nasal, anal, vaginal) or parenteral routes (intradermal, intramuscular, subcutaneous, intravenous, or intraperitoneal).
  • the vaccine composition may be administered alone or may be administered co-administered or sequentially with other treatments or therapies.
  • Dosage forms may include suspensions, syrups or elixirs, and preparations for parenteral, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intravenous administration such as sterile suspensions or emulsions.
  • the vaccine composition can be administered as a spray or mixed with food and / or water or delivered in admixture with a suitable carrier, diluent or excipient such as sterile water, saline, glucose and the like.
  • the composition may contain auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffers, adjuvants, gelling or thickening additives, preservatives, flavors, colorants and the like, depending on the desired formulation and route of administration. Standard pharmaceutical textbooks such as "Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990" can be consulted to prepare suitable formulations without unnecessary experimentation.
  • the disease may be characterized in that the infection by bacteria, viruses or fungi.
  • the bacteria may comprise gram negative bacteria or gram positive bacteria.
  • the infection may be selected from the group consisting of skin infection, respiratory infection, genitourinary infection, bone joint infection, central nervous system infection, sepsis and the like.
  • the disease is thyroid cancer, liver cancer, osteosarcoma, oral cancer, brain tumor, gallbladder cancer, colon cancer, lymphoma, bladder cancer, leukemia, small intestine cancer, tongue cancer, esophageal cancer, kidney cancer, gastric cancer, breast cancer, pancreatic cancer, lung cancer It may be selected from the group consisting of skin cancer, testicular cancer, penis cancer, prostate cancer, ovarian cancer and cervical cancer.
  • the disease is selected from the group consisting of hypertension, osteoporosis, irritable bowel syndrome, acute coronary syndrome, stroke, diabetes, arteriosclerosis, obesity, peptic ulcer, Alzheimer's, emphysema, skin disease, and the like. It may be.
  • the vaccine may be used in combination with a drug or an adjuvant for the purpose of increasing efficacy or reducing side effects.
  • the bacteria may be Gram negative bacteria.
  • the bacteria may be Gram positive bacteria.
  • the bacterium may be a transformed bacterium.
  • the bacteria are bacteria transformed to express the fusion protein of the membrane protein and antigen of the extracellular vesicles; Or a bacterium transformed to express a fusion protein of an antigen with a luminal cargo of extracellular vesicles.
  • the antigen is a bacterial antigen, virus-derived antigen, fungal-derived antigen, cancer-derived antigen; Or Ras protein, Raf protein, Src protein, Myc protein, epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), p53, phosphatase and tensin homolog (PTEN), Or a mutation such as HER2 / neu.
  • the bacterium may be a transformed bacterium two or more times.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640).
  • the bacterial extracellular vesicles may include loading an antigen protein or peptide.
  • the antigen is a bacterial antigen, virus-derived antigen, fungal-derived antigen, cancer-derived antigen; Or Ras protein, Raf protein, Src protein, Myc protein, epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), p53, phosphatase and tensin homolog (PTEN), Or a mutation such as HER2 / neu.
  • the present invention comprises the steps of (a) culturing the toxic attenuated bacteria in a chemical composition medium; And (b) isolating bacterial extracellular vesicles secreted from the culture medium.
  • the bacteria may be Gram negative bacteria.
  • the bacteria may be Gram positive bacteria.
  • the bacterium may be a transformed bacterium.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to attenuate the toxicity of the extracellular vesicles.
  • the bacteria may be endotoxin producing genetically modified bacteria.
  • the bacteria may be bacteria transformed to express the cell membrane fusion material.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to be targeted to a specific cell or tissue.
  • the bacterium may be a bacterium transformed to express one or more from the group consisting of a cell conjugation molecule, an antibody, a target inducing protein, a cell membrane fusion protein itself, and a fusion protein thereof.
  • the bacterium may be a transformed bacterium two or more times.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640).
  • the separation step can be carried out using a method selected from the group consisting of ultracentrifugation, density gradient, filtration, dialysis, precipitation, chromatography and free flow electrophoresis.
  • Another aspect of the invention comprises the steps of (a) culturing the attenuated bacteria in the chemical composition medium; (b) separating the bacterial extracellular vesicles secreted from the culture medium; (c) culturing by adding a therapeutic or diagnostic substance to the suspension containing the isolated bacterial extracellular vesicles; And (d) separating the bacterial extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material secreted from the culture medium, the method for producing bacterial extracellular vesicles for mass transfer.
  • the therapeutic or diagnostic material is selected from the group consisting of anticancer agents, anti-inflammatory agents, angiogenesis inhibitors, peptides, proteins, vaccines, toxins, nucleic acids, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent proteins and quantum dots It may be.
  • the nucleic acid may be selected from the group consisting of DNA, RNA, aptamer, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA) and morpholino. have.
  • the nanoparticles may be selected from the group consisting of iron oxide, gold, carbon nanotubes and magnetic beads.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640). .
  • the toxic attenuated bacterial extracellular vesicles of the present invention loaded with a substance for the treatment of a disease or a vaccine and a method for preparing the same can be used for treatment, drug delivery, vaccine, or experiment in vitro or in vivo . have.
  • FIG. 1 shows a fusion protein of ⁇ msbB-prsA-EGF Escherichia coli ( ⁇ msbB Escherichia coli with reduced toxicity of lipid polysaccharides, human EGF and bacterial inner membrane protein PrsA ) in various chemical composition media (a) and mammalian cell culture media (b).
  • E. coli transformed with the expressed pHCE-prsA-EGF vector shows the growth curve.
  • Figure 2 is a result showing the growth curve of ⁇ msbB Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus subtilis in low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements.
  • Figure 3 shows the results of the analysis of E. coli extracellular vesicles (a) and other bacterial extracellular vesicles (b) with a dynamic light scattering particle size analyzer.
  • Figure 4 shows the protein amount of bacterial extracellular vesicles derived from 1 liter of culture (a), the number of bacterial extracellular vesicles corresponding to 1 ⁇ g of protein (b) and the number of bacterial extracellular vesicles derived from 1 liter of culture (c). ) Shows the result of the measurement.
  • FIG. 5 shows the bacterial extracellular vesicles EV LB , EV M9 , EV M9 + and ⁇ msbB prsA-EGF Escherichia coli obtained by culturing ⁇ msbB Escherichia coli in LB medium, low concentration phosphate M9 medium, and low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements.
  • the protein composition present in the bacterial extracellular vesicles EGF EV LB , EGF EV M9 , and EGF EV M9 + obtained by culturing in LB medium, low phosphate M9 medium, and low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements was analyzed by SDS-PAGE (a ) And the amount of extracellular membrane protein OmpA was analyzed by Western blotting (b).
  • Figure 6 is an EGF-EGF EV DMEM ⁇ msbB -prsA coli low concentration phosphate cultured in M9 medium bacterial cells outside the ER EGF EV M9 (a) and cultured in DMEM medium outside the bacterial cells, vesicles obtained obtained (b), and ⁇ msbB
  • the anticancer activity of the bacterial extracellular vesicles EV LB and EGF EV LB (c) obtained by culturing E. coli and ⁇ msbB -prsA-EGF Escherichia coli in LB medium was verified in a mouse model.
  • Figure 7 is a result of verifying the anticancer activity of the bacterial extracellular vesicles SA EV M9 + obtained by culturing the Staphylococcus aureus in low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements in a mouse model.
  • CT26 colon cancer cell line
  • CT26 endothelial cells
  • Dox EV M9 + loaded with doxorubicin onto bacterial extracellular vesicles obtained by culturing ⁇ msbB Escherichia coli in low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements; Drug delivery efficacy for b) was evaluated.
  • the concentration of Dox EV M9 + is 1 ⁇ 10 10 EVs / mL, loaded with 1 ⁇ g / mL of doxorubicin.
  • FIG. 10 shows colon cancer cell lines (CT26; a) and endothelial cells (CT26; a) of SA Dox EV M9 + loaded with doxorubicin onto bacterial extracellular vesicles obtained by culturing Staphylococcus aureus in low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements. Drug delivery efficacy for 1; b) was evaluated.
  • the concentration of SA Dox EV M9 + is 1 ⁇ 10 10 EVs / mL, loaded with 1 ⁇ g / mL of doxorubicin.
  • FIG. 11 shows E. coli extracellular vesicles and yellow cells of EV M9 + (a) and SA EV M9 + (b), which are bacterial extracellular vesicles obtained by culturing ⁇ msbB Escherichia coli and Staphylococcus aureus in low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements, respectively. The efficacy of antibody formation against staphylococcal extracellular vesicles was evaluated.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or diagnosing a disease, comprising bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity.
  • the attenuated bacteria include gram negative or gram positive bacteria.
  • the Gram-negative bacteria include Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, and the like, and Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.
  • the bacterium of the present invention includes a transformed bacterium.
  • the transformed bacteria include bacteria transformed to attenuate the toxicity of the extracellular vesicles, such as endotoxin producing genetically modified bacteria, and specifically may include ⁇ msbB Escherichia coli.
  • the present invention is not limited thereto. It also includes bacteria transformed to be targeted to specific cells or tissues, and examples include bacteria transformed to be targeted to cancer vessels, cancer tissues or cancer cells.
  • the bacterium used in the present invention is a bacterium transformed to be fused with a cell membrane of a target cell, a bacterium transformed to express a substance for treating a disease, and / or a diagnostic agent, and an inhibitory and specific substance for the specific substance. And bacteria transformed so that the expression occurs simultaneously.
  • the bacteria producing the bacterial extracellular vesicles of the present invention are not limited to the above.
  • the bacteria may be transformed by material treatment or gene introduction, and may be transformed two or more times.
  • the bacteria may be transformed to inhibit the expression of one or more specific proteins.
  • the bacterium is selected from the group consisting of a cell adhesion molecule, an antibody, a targeting protein, a cell membrane fusion protein, or a fusion protein thereof It may be transformed to express one or more, but is not limited thereto.
  • the bacterium transforms ⁇ msbB Escherichia coli, which is less toxic to lipid polysaccharides, with a pHCE-prsA-EGF vector expressing a fusion protein of human epidermal growth factor (EGF) and PrsA, a bacterial inner membrane protein. but it may include that ⁇ msbB -prsA-EGF E. coli, but not limited thereto.
  • the 'chemical composition medium' of the present invention is contrasted with the 'natural medium' using a natural-derived material whose composition is unclear, such as serum and tissue extract, and a synthetic medium prepared only with a substance having a clear composition and chemical properties of the composition (chemically defined medium).
  • a natural-derived material whose composition is unclear, such as serum and tissue extract
  • a synthetic medium prepared only with a substance having a clear composition and chemical properties of the composition (chemically defined medium).
  • LB medium lysogeny broth
  • nutrient broth which has been widely used in the preparation of bacterial extracellular vesicles, and to produce extracellular vesicles having a uniform effect.
  • the chemical composition medium may include M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) or RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640), but is not limited thereto. .
  • the term 'disease' of the present invention may include various diseases including cancer.
  • the cancer is thyroid cancer, liver cancer, osteosarcoma, oral cancer, brain tumor, gallbladder cancer, colon cancer, lymphoma, bladder cancer, leukemia, small intestine cancer, tongue cancer, esophageal cancer, kidney cancer, gastric cancer, breast cancer, pancreatic cancer, lung cancer, It may be selected from the group consisting of skin cancer, testicular cancer, penis cancer, prostate cancer, ovarian cancer and cervical cancer, but is not limited thereto.
  • the disease is hypertension, osteoporosis, irritable bowel syndrome, acute coronary syndrome, stroke, diabetes, arteriosclerosis, obesity, peptic ulcer, Alzheimer's disease, emphysema, skin disease, skin infection, respiratory infection, urinary It may be selected from the group consisting of genital infection, bone joint infection, central nervous system infection and sepsis, but is not limited thereto.
  • the 'bacterial extracellular vesicles' of the present invention are' shedding extracellular vesicles' which are naturally secreted from bacteria, and 'artificial cells artificially produced using a genetic, chemical, or mechanical method. 'Artificial extracellular vesicles'.
  • the 'bacterial extracellular vesicles' of the present invention are distinguished from the inside and the outside by a lipid bilayer composed of the cell membrane components of the bacteria derived from the bacteria, plasma membrane lipids (plasma membrane lipid), plasma membrane protein (plasma membrane protein), nucleic acid ( nucleic acid) and bacterial components, and the like, but is not limited thereto.
  • the bacterial extracellular vesicles of the present invention can be obtained by a variety of methods and examples thereof are as follows, but are not limited thereto.
  • the shedding extracellular vesicles can be obtained by culturing bacteria or transformed bacteria and filtration and ultracentrifugation of the culture.
  • Bacteria or transformed bacteria can be treated with detergent and the culture solution can be filtered and ultracentrifuged to obtain shedding extracellular vesicles.
  • detergent There is no limitation to the detergent.
  • Bacteria or transformed bacteria can be treated with antibiotics, and the culture solution can be filtered and ultracentrifuged to obtain shedding extracellular vesicles.
  • the antibiotic is not limited and includes gentamycin, ampicillin, kanamycin and the like.
  • Artificial extracellular vesicles of the present invention can be prepared using a method selected from the group consisting of extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation, and chemical treatment of a suspension comprising bacteria. However, it is not limited thereto.
  • the membrane of the bacterial extracellular vesicles may further comprise components other than the bacterial cell membrane.
  • Components other than the cell membrane may include a target inducing substance, a cell membrane fusion substance (fusogen), a cyclodextrin, a polyethylene glycol, and the like.
  • components other than the cell membrane may be added by various methods, and include chemical modification of the cell membrane.
  • the membrane component of the bacterial extracellular vesicles is modified by a chemical method using a thiol group (-SH) or an amine group (-NH 2 ), or by chemically bonding polyethylene glycol to the bacterial extracellular vesicles.
  • the membrane component of the extracellular vesicles may be chemically modified.
  • the preparation of the bacterial extracellular vesicles of the present invention may further comprise chemically modifying the membrane components of the bacterial extracellular vesicles.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a drug that inhibits toxicity by the extracellular vesicles.
  • the drug may also be loaded into extracellular vesicles.
  • the drug includes a drug that inhibits toxicity by endotoxin, and examples thereof include polymyxin B.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a drug that increases the anticancer effect.
  • the drug may also be loaded into extracellular vesicles.
  • 'loading' means, but is not limited to, exposing the necessary material to the surface of the bacterial extracellular vesicles or encapsulation therein.
  • the drug that increases the anticancer effect is a drug that suppresses the Th17 (T helper 17 cells) immune response, a drug that inhibits the production or activity of interleukin (IL) -6, vascular endothelial drugs that inhibit the production or activity of growth factor (VEGF), drugs that inhibit signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling, anticancer agents, nanoparticle therapeutics loaded with drugs, and cell therapies for cancer treatment do.
  • drugs that inhibit the Th17 immune response include aspirin
  • examples of drugs that inhibit the production or activity of VEGF include drugs that inhibit signaling by the VEGF receptor.
  • liposomes loaded with anticancer agents include doxyl (DOXIL).
  • the nanoparticle therapeutic agent is a particle having a size of 10 nm to 10 ⁇ m, and may include, but is not limited to, a liposome, a dendrimer, a polymer, an extracellular vesicle, and the like.
  • the pharmaceutical composition in the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and / or lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but is preferably formulated as an injection or inhalant.
  • the method of administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be parenterally or orally administered such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation or topical application depending on the desired method. Dosage ranges depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and the severity of the disease. Daily dosage refers to the amount of therapeutic substance of the invention sufficient for treatment for a disease state alleviated by administration to a subject in need thereof. Effective amounts of therapeutic agents depend on the particular compound, disease state and severity thereof, and on the individual in need thereof, and can be routinely determined by one skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to the present invention to the human body may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient and may be based on an adult patient weighing 70 kg. At this time, it is generally 0.1 to 1000 mg / day, preferably 1 to 500 mg / day, and may be dividedly administered once to several times a day at regular time intervals.
  • Another aspect of the invention provides a method of treating cancer and / or cancer comprising administering the bacterial extracellular vesicles to a subject.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment for a specific disease (for example, cancer, vascular disease, or inflammatory disease, etc.), and more specifically, a human or non-human primate or mouse ), Including rats, dogs, cats, horses and cattle, and animals including mammals, fish, and birds.
  • a specific disease for example, cancer, vascular disease, or inflammatory disease, etc.
  • a human or non-human primate or mouse Including rats, dogs, cats, horses and cattle, and animals including mammals, fish, and birds.
  • 'cancer' refers to a group of diseases in which cells are excessively proliferated and infiltrated into surrounding tissues when a normal apoptosis balance is broken.
  • the target to be treated by the present invention may be selected from the group consisting of hematopoietic cells derived from sarcoma, leukemia, lymphoma, multiple myeloma and the like, cancers occurring in neural tissues, and the like. May be, but is not limited to this.
  • the bacteria and bacterial extracellular vesicles used in the method of the present invention are as described above.
  • the method may use bacterial extracellular vesicles loaded with drugs to reduce the side effects of the extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles can be prepared using bacteria that have been genetically transformed so that the toxicity of the bacteria is weakened. For example, a bacterium transformed to attenuate the toxicity of a lipopolysaccharide that mediates the inflammatory response of the host ( ⁇ msbB mutant), or a bacterium transformed to attenuate the toxicity of lipotaichoic acid (LTA) ( ⁇ ltaS mutant). Extracellular vesicles can be prepared using
  • a drug that inhibits the activity of endotoxins can be used to reduce the toxicity of bacteria.
  • One example of the drug is polymyxin B.
  • the drug may be administered in combination with bacterial extracellular vesicles, or extracellular vesicles may be prepared from bacteria treated with the drug in culture.
  • the drug includes aspirin. Concomitant administration of bacterial extracellular vesicles and aspirin can prevent side effects such as inflammatory and coagulation reactions caused by bacterial extracellular vesicles. It is also possible to prepare extracellular vesicles from the bacteria treated with the drug in culture.
  • the membrane component of the extracellular vesicles can be modified by chemical method.
  • the membrane component of the extracellular vesicles may be modified by a chemical method using a thiol group or an amine group, or the membrane component of the extracellular vesicles may be chemically modified by chemically bonding polyethylene glycol to the extracellular vesicles.
  • sterile extracellular vesicles can prevent infection of living bacteria.
  • sterilized extracellular vesicles can be obtained through sterilization using ultraviolet rays and gamma rays or removal of bacteria using filtering.
  • the method of reducing the side effects of the bacterial extracellular vesicles of the present invention is not limited to the above examples, and each of the above methods can be used alone or in combination.
  • extracellular vesicles loaded with drugs that increase anticancer efficacy may be used.
  • Drugs that increase anticancer efficacy are as described above.
  • the drug to reduce the side effects of the extracellular vesicles and / or drugs to increase the anti-cancer efficacy when the extracellular vesicles administered to the subject, drug-loaded nanoparticles and cell therapy It may be administered in combination.
  • the nanoparticle therapeutic agent is a particle having a size of 10 nm to 10 ⁇ m, and may include, but is not limited to, a liposome, a dendrimer, a polymer, an extracellular vesicle, and the like.
  • compositions for treating and / or diagnosing a substance comprising a bacterial extracellular vesicle loaded with a substance for treating and / or diagnosing a disease.
  • the bacteria of the present invention is characterized in that cultured in a chemical composition medium.
  • the chemical composition medium may be selected from the group consisting of M9 medium (M9 medium), DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) and RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute medium 1640), It is not limited to this.
  • the material loaded into the bacterial extracellular vesicles of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a therapeutic and / or diagnostic material, and may be loaded with a material expressing the bacterium or transformed bacterium.
  • a material prepared from the outside of the bacterium but not from the bacterium may be loaded, but is not limited thereto. That is, the therapeutic and / or diagnostic material includes those derived from the bacterium and those injected from outside the bacterium.
  • the material to be loaded may be one or two or more.
  • the materials may be loaded onto the surface of the bacterial extracellular vesicles by physical, chemical, and / or biological methods, but are not limited thereto.
  • Methods of loading various substances for the treatment and / or diagnosis into bacterial extracellular vesicles of the invention include the following.
  • extracellular vesicles are prepared from bacteria that have already been loaded with various substances for treatment and / or diagnosis.
  • culturing bacteria by incorporating various substances into the culture for treatment and / or diagnosis may yield the bacteria loaded with the substance, or may load the substance into the bacteria by an electroporation method.
  • the material is loaded into shedding extracellular vesicles naturally secreted from such bacteria, or artificial extracellular vesicles prepared by methods such as sonication, extrusion, and mechanical degradation.
  • the material is loaded into bacterial extracellular vesicles during the preparation of bacterial extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicles are prepared by adding the material to a solution containing bacteria and then passing through a filter smaller than the bacteria, the material is loaded into the extracellular vesicles.
  • the material may be loaded after preparing the shedding extracellular vesicles or artificial extracellular vesicles.
  • the material may be loaded into shedding extracellular vesicles or artificial extracellular vesicles previously prepared by electroporation.
  • the method of loading an extracellular vesicle with a substance which can be used in the present invention is not limited by the above examples.
  • Therapeutic and / or diagnostic agents used in the present invention include anticancer agents, anti-inflammatory agents, angiogenesis inhibitors, peptides, proteins, vaccines, toxins, nucleic acids, beads ), One or more selected from the group consisting of microparticles and nanoparticles, but is not limited thereto.
  • the therapeutic and / or diagnostic material may be one or more anticancer agents.
  • the anticancer drugs are generic to all drugs used to inhibit the growth and metastasis of cancer, and most anticancer drugs block the replication, transcription, and translation processes of DNA of cancer cells.
  • the kind of anticancer agent that can be used as the therapeutic substance of the present invention is not particularly limited.
  • the anticancer agent may be selected under general principles to be considered when selecting an anticancer agent such as the type of cancer cells, the rate of absorption of the anticancer agent (the duration of treatment and the route of administration of the anticancer agent), the location of the tumor, and the size of the tumor.
  • the anticancer agent which can be used in the present invention is a DNA alkylating agent (DNA alkylating agent), methylethamine (mechloethamine), chlorambucil (chlorambucil), phenylalanine (phenylalanine), mustard (mustard), cyclophosphamide (cyclophosphamide) ), Ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), streptozotocin (streptozotocin), busulfan, thiotepa, cisplatin and Carboplatin and the like can be used, anti-cancer antibiotics (dactinomycin: actinomycin D), doxorubicin (adriamycin), epirubicin (erubirubicin), idarubicin (idarubicin) ), Mitoxantrone, plicamycin, mitomycin and C bleomycin can be used, and plant alkaloids such as vincri
  • Vinblastine green onion Paclitaxel, docetaxel, daunorubicin, taxol, oncovin, prednisone, cisplatin, herceptin, rituximab, etoposide It may be selected from the group consisting of (etoposide), teniposide, topotecan, and iridotecan. It is also possible to use radioactive materials conventionally used in the art. However, anticancer agents that can be used in the present invention are not limited by the above examples.
  • the therapeutic and / or diagnostic material may be one or more anti-inflammatory agents.
  • the anti-inflammatory agent is dexamethasone (dexamethasone), indomethacin (indomethacin), ibuprofen, clobetasol propionate, dipalorson diacetate, halobetasol propionate (halobetasol propionate), amcionide, fluocinonide, mometasone furoate, deoxymethasone, diclofenac and piroxicam
  • anti-inflammatory agents that can be used in the present invention is not limited by the above examples.
  • the therapeutic and / or diagnostic agent may be one or more angiogenesis inhibitors.
  • the angiogenesis inhibitors are generic to all drugs used to inhibit the process of making new blood vessels in existing vessels, and most of the angiogenesis inhibitors can inhibit the growth and metastasis of cancer and inhibit the inflammatory response.
  • the type of angiogenesis inhibitor that can be used as the therapeutic substance of the present invention is not particularly limited.
  • the therapeutic and / or diagnostic material may comprise one or more proteins or peptides.
  • proteins or peptides for example, in addition to RNase A, growth factors such as VEGF and EGF, cytokines such as IL-1, IFN-gamma, and IL-10, various antibody therapeutic agents, various peptides or proteins, and DNase, Various proteins and peptides capable of inhibiting metastasis and inhibiting inflammatory responses can be used without limitation.
  • the therapeutic and / or diagnostic agent may comprise one or more vaccines.
  • the vaccine is to activate the body's immune system by injecting artificially attenuated pathogens (antigens), etc. in the human body to prevent infection of the pathogen, and may include the above-described attenuated bacterial extracellular vesicles of the present invention. It is not limited to this.
  • the therapeutic and / or diagnostic material may comprise one or more toxins.
  • Toxins are derived from various organisms and are generic to be toxic when absorbed into the body. Toxins can induce cell death through toxins.
  • the type of toxin that can be used as the therapeutic substance of the present invention is not particularly limited.
  • the nucleic acid is selected from the group consisting of DNA, RNA, aptamer, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), and morpholino May be, but is not limited thereto.
  • LNA locked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • morpholino May be, but is not limited thereto.
  • Such nucleic acids can be used for the purpose of sense effects, antisense effects, RNA interference, and protein function inhibition.
  • the nanoparticles of the present invention may be, but are not limited to, nanoparticles including iron oxide, gold, carbon nanotubes, or magnetic beads. Beads such as magnetic beads may be loaded onto and used in extracellular vesicles. Magnetic particles such as iron oxide may be used as a contrast agent for obtaining magnetic resonance imaging (MRI). Nucleic acids bound to nanoparticles, proteins bound to nanoparticles, and the like can also be used.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the therapeutic and / or diagnostic material may be a material that emits fluorescence, but is not limited thereto.
  • the fluorescence emitting material may be a fluorescent protein or a quantum dot (Qdot).
  • nucleic acids encoding fluorescent proteins or extracellular vesicles loaded with various fluorescent materials can be used for diagnosis.
  • extracellular vesicles targeting specific cells or tissues are loaded with plasmid DNA encoding a fluorescent protein and injected into the living body
  • the presence of the target cells or tissues can be known from the fluorescent signal emitted from the fluorescent protein.
  • the presence of the target cells or tissues can be determined from the fluorescence signal by incorporating various fluorescent substances including fluorescence emitting quantum dots into extracellular vesicles targeting specific cells or tissues. Fluorescence generated in specific target cells or tissues can be used for diagnosis. Fluorescence emitting quantum dots that induce cell death can also be used for therapeutic purposes.
  • the extracellular vesicles according to the invention can be used to deliver two or more substances.
  • extracellular vesicles loaded with two or more materials simultaneously can be used to deliver two or more materials.
  • two or more substances may be delivered using a plurality of extracellular vesicles loaded with one or two or more substances.
  • Another aspect of the present invention is characterized by the use of bacterial extracellular vesicles loaded with a drug for treating and / or diagnosing a disease, a drug for treating and / or diagnosing a disease, a nanoparticle therapeutic drug loaded with a drug, and a cell therapy. Provide a way to deliver it.
  • the extracellular vesicles of the present invention it is possible to deliver a therapeutic agent or a diagnostic agent for a disease, a nanoparticle therapeutic agent or a cell therapeutic agent loaded with a therapeutic agent for a disease, and / or a diagnostic agent to a target cell or tissue.
  • two or more of the therapeutic or diagnostic agents can be delivered to specific cells or tissues.
  • the two or more therapeutic or diagnostic agents loaded together with the extracellular vesicles may be used to deliver two or more therapeutic or diagnostic agents.
  • one or more extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material two or more extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material, and combinations thereof are selected.
  • Two or more extracellular vesicles may be used to deliver the therapeutic or diagnostic material.
  • the two or more extracellular vesicles may be administered simultaneously.
  • one or more extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material two or more extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material, and combinations thereof are selected. Two or more extracellular vesicles may be administered sequentially to deliver the therapeutic or diagnostic material.
  • the nanoparticle therapeutic agent, or the cell for the treatment of diseases loaded with one or more of the above-mentioned therapeutic or diagnostic material for extracellular vesicles and one or more diseases for treatment and / or disease diagnostic material
  • the therapeutic agents may be administered sequentially in combination.
  • Another aspect of the present invention provides a drug delivery system for diagnosing and / or treating a disease using bacterial extracellular vesicles loaded with a drug for treating or diagnosing a disease.
  • Another aspect of the present invention provides a vaccine composition for preventing or treating a disease comprising bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity.
  • the attenuated bacteria and bacterial extracellular vesicles of the present invention are as described above.
  • the disease comprises infection by bacteria, virus or fungus.
  • the bacterial infection includes infection with Gram-negative bacteria, infection with Gram-positive bacteria.
  • the infection may be a skin infection, a respiratory infection, a genitourinary infection, a bone joint infection, a central nervous system infection, and sepsis, but are not limited thereto.
  • the disease is thyroid cancer, liver cancer, osteosarcoma, oral cancer, brain tumor, gallbladder cancer, colon cancer, lymphoma, bladder cancer, leukemia, small intestine cancer, tongue cancer, esophageal cancer, kidney cancer, gastric cancer, breast cancer, pancreatic cancer, Lung cancer, skin cancer, testicular cancer, penile cancer, prostate cancer, ovarian cancer and cervical cancer may be selected from the group consisting of.
  • the disease is selected from the group consisting of hypertension, osteoporosis, irritable bowel syndrome, acute coronary syndrome, stroke, diabetes, arteriosclerosis, obesity, peptic ulcer, Alzheimer's, emphysema, and skin disease It may be.
  • the vaccine may be modified and used for the purpose of increasing efficacy or reducing side effects.
  • modifications include using transformed bacteria, treating the bacteria with chemicals, and the like, including the drug.
  • the vaccine may be used in combination with a drug or an adjuvant for the purpose of increasing efficacy or reducing side effects, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the invention provides a method for producing bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity.
  • the method for producing bacterial extracellular vesicles includes methods for preparing shedding extracellular vesicles and artificial extracellular vesicles that are naturally secreted from bacteria.
  • the method includes the steps of: culturing the reduced toxicity bacteria in a chemical composition medium; And separating the bacterial extracellular vesicles secreted from the culture.
  • the toxic attenuated bacterial extracellular vesicles prepared by the above method may further comprise sterilizing the extracellular vesicles using a method selected from the group consisting of antibiotic treatment, ultraviolet exposure, gamma exposure, and filtering.
  • the preparation method may further comprise the step of separating the extracellular vesicles smaller in size than the bacteria and loaded with the drug.
  • the separation step is ultracentrifugation, density gradient, filtration, dialysis, sediment, chromatography and free-flow electrophoresis. It can be carried out using a method selected from the group consisting of.
  • the production method of the present invention may further comprise the step of removing the extracellular vesicles having a membrane with a modified topology compared to the bacterial cell membrane. That is, after the extracellular vesicles are prepared, only the extracellular vesicles having the same topology as the cell membrane of the original cell can be selected and used according to the purpose. Materials such as antibodies that recognize the cytoplasmic domain of cell membrane proteins can be used to remove extracellular vesicles exposed to the cytoplasmic domain. This removes the extracellular vesicles that have changed inside and outside of the cell membrane, and outside the remaining extracellular vesicles, there is only cell membrane proteins exposed outside the cell membrane of the original cell.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing bacterial extracellular vesicles for the treatment of a disease and / or for the delivery of a diagnostic substance comprising a bacterium with reduced toxicity.
  • the method for producing the bacterial extracellular vesicles for delivery of the material provides a method comprising the steps of: culturing the weakened toxicity in a chemical composition medium; Separating the bacterial extracellular vesicles secreted from the culture medium; Culturing by adding a substance for treating or diagnosing a disease to the suspension containing the isolated bacterial extracellular vesicles; And separating the bacterial extracellular vesicles loaded with the therapeutic or diagnostic material secreted from the culture.
  • the therapeutic or diagnostic material of the present invention is as described above.
  • transgenic Escherichia coli was cultured using various chemically defined media and mammalian cell culture media in which chemical components were defined, and their growth was confirmed.
  • vitamins and trace elements were added to the high concentration phosphate M9 and low phosphate M9 chemical composition medium, or the low concentration phosphate M9 chemical composition medium.
  • Medium (M9 +) was prepared.
  • ⁇ msbB prsA-EGF Escherichia coli transformed with a pHCE-prsA-EGF vector expressing a fusion protein of human EGF and bacterial inner membrane protein PrsA was cultured in ⁇ msbB Escherichia coli, which has reduced toxicity of lipid polysaccharides. Growth was confirmed by absorbance at 600 nm wavelength.
  • ⁇ msbB prsA-EGF to isolate bacterial extracellular vesicles E. coli was cultured in LB medium, low concentration phosphate M9 medium, low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements (M9 +), and DMEM medium, respectively.
  • prsA-EGF fusion protein is produced in a bacterial cell outside the endoplasmic reticulum, the composition and the LB medium for ⁇ msbB E. coli to identify whether there is a difference in the physiological activity, low concentration of phosphate of M9 medium, a low concentration that contains vitamins and trace elements, phosphate Incubated in M9 medium (M9 +).
  • Staphylococcus aureus was cultured in LB medium, low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements (M9 +), and Salmonella and Bacillus subtilis in low concentration phosphate M9 medium (M9 +) containing vitamins and trace elements.
  • M9 + low concentration phosphate M9 medium containing vitamins and trace elements
  • M9 + Salmonella and Bacillus subtilis in low concentration phosphate M9 medium
  • Each culture was placed in a high speed centrifuge tube and then centrifuged twice at 20 ° C. at 6,000 ⁇ g at 4 ° C.
  • the bacteria-free supernatant was once passed through a membrane filter with a pore size of 0.45 ⁇ m and then concentrated 50 times with a membrane capable of removing proteins below 100 kDa molecular weight.
  • the concentrate was once passed through a membrane filter with a pore size of 0.22 ⁇ m, then placed in a 70 mL ultracentrifuge tube and ultracentrifuged at 40,000 ° C. for 15 hours at 150,000 ⁇ g.
  • the precipitate was suspended in 2.5 mL of 50% Optiprep, and then placed in a 5 mL volume ultracentrifuge tube, on which 1.5 mL of 40% Optiprep and 1.25 mL of 10% Optiprep were added. Thereafter, ultracentrifugation was performed at 40,000C for 20 hours at 200,000 xg.
  • Bacterial extracellular vesicles were obtained in a layer between 10% Optiprep and 40% Optiprep, then passed through a membrane filter with a pore size of 0.22 ⁇ m, then aliquoted and stored at -80 ° C.
  • the size of the bacterial extracellular vesicles derived from various conditions were similar to 40 ⁇ 50 nm.
  • the protein amount of the bacterial extracellular vesicles obtained according to the method of Example 3 was confirmed by Bradford protein assay, and the number of extracellular vesicles was confirmed by nanoparticle tracking analysis.
  • Figure 4a is a graph measuring the amount of protein of bacterial extracellular vesicles derived from 1 liter culture
  • Figure 4b is a graph measuring the number of bacterial extracellular vesicles corresponding to 1 ⁇ g of protein
  • Figure 4c is derived from a 1 liter culture This is a graph of the number of bacterial extracellular vesicles.
  • ⁇ msbB Escherichia coli secretes a greater amount of extracellular vesicle protein in all culture conditions than ⁇ msbB prsA-EGF Escherichia coli, but as shown in FIG.
  • ⁇ msbB prsA-EGF Escherichia coli is ⁇ msbB Escherichia coli. It was observed that the number of bacterial extracellular vesicles corresponding to 1 ⁇ g of protein was significantly higher. Therefore, as seen in the bacterial extracellular vesicles derived from 1 liter of culture medium, as shown in Figure 4c ⁇ msbB prsA-EGF E. coli secrete more extracellular vesicles than ⁇ msbB E. coli or secrete a small number of extracellular vesicles depending on the culture conditions Even if compared with Figure 4a it was observed that the ratio is significantly smaller than the difference in secretion amount of protein.
  • Example 3 Among the bacterial extracellular vesicles obtained according to the process of Example 3, was tested for EGF and EGF EV EV M9 DMEM, EGF EV LB, and anti-cancer activity of anti-cancer activity of EV LB it is known in the existing models in mice.
  • mice 28 5-week-old Balb / c mice (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) were used in the experiment, and 1 ⁇ 10 6 mouse colon cancer cells (CT26) were injected and raised under the skin of the mice.
  • C26 mouse colon cancer cells
  • the mice were divided into seven groups of four, and 100 ⁇ L of PBS solution containing EGF EV M9 (3 ⁇ L or 30 ⁇ L), or EGF EV DMEM (8 ⁇ L or 40) for each experimental group.
  • EGF EV M9 3 ⁇ L or 30 ⁇ L
  • EGF EV DMEM 8 ⁇ L or 40
  • Amount (EGF EV M9 3 ⁇ L or EGF EV DMEM 8 ⁇ L) for the EV LB can ( ⁇ 1x10 10 EVs) of 5 ⁇ g for the amount of treated mice extracellular vesicles to compare the result of the EV LB, its 10 30 ⁇ L of EGF EV M9 , 6 ⁇ L of EGF EV LB , 10 ⁇ L of EV LB , or 5 ⁇ L (40 ⁇ L of EGF EV DMEM ).
  • the size of the colorectal cancer tissue was measured 10 days, 12 days, and 14 days after colon cancer cell administration for each experimental group.
  • V shows the results of measuring the size of the colorectal cancer tissue after subcutaneous administration of the colorectal cancer cells.
  • EGF EV M9 was administered as compared to the control group administered with PBS
  • colorectal cancer tissues were continuously reduced in size regardless of the dose (FIG. 6A).
  • EGF EV DMEM was administered, the size of colon cancer tissues was dose-dependently. It was confirmed to decrease (FIG. 6B). Meanwhile, even when EV LB and EGF EV LB were administered, the size of colorectal cancer tissue was reduced compared to the control group administered with PBS only (FIG. 6C).
  • EGF EV M9 and EGF EV DMEM had similar or better anticancer effects than EV LB, and did not induce side effects even when administered at least 10 times the amount of anticancer effects.
  • mice 12 5-week old Balb / c mice were used for the experiment, and 1 ⁇ 10 6 mouse colorectal cancer cells (CT26) were injected and raised under the skin of the mice.
  • mice were divided into three experimental groups of four, and 100 ⁇ L of PBS solution containing SA EV M9 + (1 ⁇ L or 10 ⁇ L) for each experimental group, or no extracellular vesicles as a control. 100 ⁇ L of PBS solution was injected into the tail vein twice a week (day 6, day 10, day 13 of cell administration).
  • Amount (SA EV M9 + 1 ⁇ L) for the EV LB can ( ⁇ 1x10 10 EVs) of 5 ⁇ g for the amount of the outside ER administered to mice cells to compare with the EV LB, or its 10-fold (SA EV M9 + 10 ⁇ L ) Is included.
  • the size of the colorectal cancer tissue was measured 10 days, 12 days, and 14 days after colon cancer cell administration for each experimental group.
  • the results of measuring the size of the colorectal cancer tissue after subcutaneous administration of the colorectal cancer cells are shown in FIG. 7.
  • SA EV M9 + was administered compared to the control group administered only with PBS, it was observed that the size of colorectal cancer tissues decreased continuously in a dose dependent manner (FIG. 7).
  • the SA EV M9 + has similar or better anticancer effects as compared to EV LB, and did not induce side effects even when administered at least 10 times the amount of anticancer effects.
  • Example 3 Among the bacterial extracellular vesicles obtained according to the method of Example 3, the following experiment was carried out to determine whether the drug can be delivered using EV M9 + and SA EV M9 + .
  • doxorubicin was used as an example of a drug.
  • EV M9 + and SA EV M9 + obtained according to the method of Example 3 were mixed in a 1: 1 ratio of doxorubicin at a concentration of 0.8 mg / mL for 1 hour at 4 ° C., followed by ultrafast for 3 hours at 40,000 ° C. at 150,000 xg.
  • doxorubicin concentration of 0.8 mg / mL for 1 hour at 4 ° C.
  • ultrafast for 3 hours at 40,000 ° C. at 150,000 xg.
  • the bacterial extracellular vesicles loaded with doxorubicin and the doxorubicin containing no bacterial extracellular vesicles in solution were separated.
  • Fluorescence sensitivity and nanoparticle tracking analysis of bacterial extracellular vesicles loaded with doxorubicin revealed that 1x10 10 EVs for both EV M9 + ( Dox EV M9 + ) and SA EV M9 + (SA Dox EV M9 + ) loaded with doxorubicin It was confirmed that 1 ⁇ g of doxorubicin is present (FIG. 8).
  • Mouse colon cancer cells (CT26) 2 ⁇ 10 3 / well or human vascular endothelial cells (HMEC-1) 4 ⁇ 10 3 / well were cultured in 96 well plates for one day.
  • PBS Control
  • Dox EV M9 + with doxorubicin and doxorubicin were treated with mouse colon cancer cells and human vascular endothelial cells for 24 hours, respectively. Survival rates of mouse colon cancer cells and human vascular endothelial cells were confirmed using the WST-1 assay, and the results are shown in FIG. 9.
  • EV M9 + had no effect on cancer cell and vascular endothelial cell death regardless of concentration, but Dox EV M9 + showed cancer cell and vascular endothelial cell death effects in a concentration-dependent manner.
  • Dox EV M9 + 1x10 10 EVs / mL was loaded with 1 ⁇ g / mL of doxorubicin, which showed a greater effect of killing cancer cells and vascular endothelial cells than the same amount of doxorubicin, which was similar to that of doxorubicin. Cancer cell and vascular endothelial cell killing effect was shown.
  • SA Dox EV M9 + loaded with SA EV M9 + and doxorubicin was also treated with mouse colon cancer cells and human vascular endothelial cells in the same manner to confirm the survival rate of the cells.
  • SA EV M9 + did not affect cancer cell and vascular endothelial cell death regardless of the concentration, but SA Dox EV M9 + showed cancer cell and vascular endothelial cell death effects in a concentration-dependent manner.
  • drug-loaded bacterial extracellular vesicles can be used to deliver drugs more effectively, and when the same amount of drug is administered through the extracellular vesicles, it can be seen that the therapeutic effect can be enhanced.
  • Example 9 Vaccine with attenuated bacterial extracellular vesicles
  • mice 15 5-week-old C57BL / 6 mice (The Jackson Laboratory) were used for the experiment, and the mice were divided into 5 experimental groups of 3 mice each. 100 ⁇ L of PBS solution containing EV M9 + (0.5 ⁇ L or 2.5 ⁇ L) for each experimental group, or 100 ⁇ L of PBS solution containing SA EV M9 + (7 ⁇ L or 33 ⁇ L), or no extracellular vesicles as a control 100 ⁇ L of PBS solution was injected into the thigh muscles of mice twice for two weeks at weekly intervals.
  • PBS solution containing EV M9 + 0.5 ⁇ L or 2.5 ⁇ L
  • SA EV M9 + 7 ⁇ L or 33 ⁇ L
  • the amount of extracellular vesicles administered to the mice should include an amount corresponding to 1 ⁇ g (EV M9 + 0.5 ⁇ L or SA EV M9 + 7 ⁇ L), or an amount equivalent to 5 ⁇ g (EV M9 + 2.5 ⁇ L or SA EV M9 + 33 ⁇ L). It was.
  • FIG. 11 shows the amount of specific antibody to extracellular vesicles in a dose dependent manner as a result of observing the amount of EV M9 + (FIG. 10A) or SA EV M9 + (FIG. 10B) specific antibodies in mouse serum. This means that when the extracellular vesicles are injected into the muscle two or more times, specific antibodies to proteins contained in the bacterial extracellular vesicles are formed.
  • the bacterial extracellular vesicles with weakened toxicity according to the present invention can be additionally controlled using various methods: 1) size control and homogenization (size modulation), 2) reduction of side effects, increased stability in and out of the body including blood, improvement of disease treatment efficacy, A variety of substances or complexes thereof, including compounds, peptides, proteins, fusion proteins, nucleic acids, aptamers, toxins, various forms of antigens, polymers and lipids, for enhancing drug delivery efficacy, vaccine delivery efficacy, and cell or tissue targeting By loading or / or displaying inside or outside the extracellular vesicles alone or in combination, or 3) combining the above methods to reduce the side effects of bacterial extracellular vesicles, thereby treating a drug, drug carrier, and / or vaccine. It can effectively enhance the stability and efficacy as a carrier.
  • the toxic attenuated bacterial extracellular vesicles of the present invention loaded with a substance for the treatment of a disease or a vaccine and a method for preparing the same may be used for treatment, drug delivery, vaccine, or experiment in vitro or in vivo . .

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Abstract

본 발명은 박테리아에서 유래한 독성이 약화된 세포밖 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체(bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity)를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 생체 내외에서의 부작용을 줄이고 효능을 증진시켜 암을 포함한 다양한 질병 치료제 또는 진단제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된, 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.

Description

독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 이의 용도
본 발명은 박테리아에서 유래한 독성이 약화된 세포밖 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체(bacterial extracellular vesicles with reduced toxicity)를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법 등에 관한 것이다.
그람 음성 또는 그람 양성 박테리아(Gram-negative and Gram-positive bacteria)를 포함한 모든 세포는 세포밖 소포체를 자연적으로 분비하는 것으로 알려져 있다. 상기 그람 음성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 외막 소포체(outer membrane vesicles)로도 알려져 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 크기가 20-200 nm이고, 단백질(proteins), 지질(lipids) 및 유전 물질(DNA, RNA) 등 다양한 생물학적 활성을 가진 물질들을 가지고 있으며, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 각각 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)와 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA)와 같은 독성 인자(virulence factor)도 가지고 있다. 박테리아 세포밖 소포체는 동종 간의 단백질 혹은 유전 물질의 전달, 세포 신호 전달과 같은 정보 전달체로서의 기능과 경쟁적 생물체의 제거 혹은 박테리아의 생존 증진에 기여하며, 숙주에 독소 등을 전달함으로써 박테리아 감염 질환의 병인 현상을 조절한다고 알려져 있다.
최근의 연구 결과에 의하면, 다양한 박테리아 세포밖 소포체가 암을 비롯한 여러 질병에 대한 직접적인 치료 효능이 있을 뿐만 아니라, 이들 질병을 치료하기 위한 약물 전달체로 사용 가능하며, 뇌수막염 등 다양한 질병을 예방하거나 치료하기 위한 백신 전달체로 임상에 사용되거나 개발되고 있다. 하지만 박테리아 세포밖 소포체는 전신 염증, 국부 염증, 또는 혈액 응고 유도 등을 통해 다양한 부작용을 유발할 수 있어 임상에 사용하기에는 한계가 있다.
또한 박테리아 세포밖 소포체를 질병 치료제, 약물 전달체 또는 백신 전달체로 사용하기 위해서는 대량 생산이 필수적이다. 박테리아 세포밖 소포체를 대량 생산하기 위해서는 다양한 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 균주, 돌연변이 및/또는 형질 전환된 균주를 선별하는 등 여러 문제들이 극복되어야 하지만, 박테리아 배양을 위해 사용하는 배지의 조성을 정확하게 조절하는 것이 필수적이다. 통상적으로 그람 음성 박테리아인 대장균의 경우 LB 배지(lysogeny broth)를 사용하지만, LB 배지의 경우 구성 성분이 명확하지 않을 뿐만 아니라, 배치(batch)별로 조성이 다를 수 있어 LB 배지에서 배양한 박테리아에서 분리한 세포밖 소포체는 구성 성분이나 치료 효능 등이 동일하지 않다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 박테리아 세포밖 소포체를 질병 치료제 또는 진단제, 약물 전달체, 백신 전달체 또는 백신 조성물로 사용함에 있어, 통상적으로 사용하는 LB 배지에서 배양한 박테리아로부터 분리한 세포밖 소포체를 이용할 때 세포밖 소포체의 구성 성분이나 치료 효능 등이 동일하지 않다는 종래 기술의 한계점을 해결하고자 연구한 결과, 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양한 후 이로부터 분리한 세포밖 소포체를 이용하여 상기 문제를 해결할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물, 물질 전달용 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium), 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 암을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 항암 효과를 증진시키는 약물을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체에 로딩된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
또한, 본 발명은 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질 전달용 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병을 예방 또는 치료용 백신 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 "백신 조성물" 이라는 용어는 숙주 내에서 면역 반응을 유도시키는데 유용한, 약학적으로 허용 가능한 운반체 내의 하나 이상의 항원 또는 면역원을 포함한다. 본 발명의 상기 백신 조성물은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하며, 추가적인 항원 또는 면역원을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 개체의 나이, 성별, 중량, 종(species), 품종(breed) 및 수령 동물의 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여, 의학 또는 수의학 당업자에게 주지되어 있는 기술에 의해 주지되어 있는 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피적, 점막을 통한 투여(예를 들어, 경구, 비강, 항문, 질) 또는 비경구 경로를 통해서 (피내, 근육내, 피하, 정맥내, 또는 복강내) 일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 동시-투여 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태에는 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르, 및 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여용 제제 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀젼이 포함될 수 있다. 백신 조성물은 스프레이로서 투여되거나 식품 및/또는 물에 혼합되거나 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코오스 등과의 부가혼합물로 전달될 수 있다. 상기 조성물은 원하는 제제 및 투여 경로에 따라, 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 아쥬반트, 겔화 또는 증점 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 불필요한 실험을 거치지 않고 적합한 제제를 제조하는데 "Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990" 과 같은 표준 약학 교과서를 참고할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로, 상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류 등에 의한 감염인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예로, 상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상 동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 및 피부 질환 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물이나 면역 보강제를 병용 투여하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 막 단백질과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아; 또는 세포밖 소포체의 내강 수하물(luminal cargo)과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는 Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog), 또는 HER2/neu 등의 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 항원 단백질 또는 펩타이드를 로딩한 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는 Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog), 또는 HER2/neu 등의 돌연변이일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 및 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아는 2회 이상 형질 전환된 박테리아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 분리 단계가 초원심 분리, 밀도 구배, 여과, 투석, 침전, 크로마토그래피 및 자유 유동 전기 이동법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 (d) 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 생체 내외에서의 부작용을 줄이고 효능을 증진시켜 암을 포함한 다양한 질병 치료제/진단제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능을 증진시킬 수 있다. 또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된, 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 화학 조성 배지(a)와 포유류 세포 배양 배지(b)에서의 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균(지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균을, 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환시킨 대장균)의 생장 곡선을 나타낸 결과이다.
도 2는 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서의 ΔmsbB 대장균, 황색포도알균, 살모넬라균, 고초균의 생장 곡선을 나타낸 결과이다.
도 3은 대장균 세포밖 소포체(a) 및 다른 박테리아 세포밖 소포체(b)를 동적 광산란 입도 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양(a), 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체의 수(b)와 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 수(c)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 ΔmsbB 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 및 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVLB, EVM9, EVM9+와 ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 및 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVLB, EGFEVM9, EGFEVM9+에 존재하는 단백질 조성을 SDS-PAGE(a)로 분석하고 세포 외막 단백질인 OmpA의 양을 Western blotting(b)으로 분석한 결과이다.
도 6은 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVM9(a)과 DMEM 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EGFEVDMEM(b), 그리고 ΔmsbB 대장균과 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 LB 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVLB 및 EGFEVLB(c)의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증한 결과이다.
도 7은 황색포도알균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 SA EVM9+의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증한 결과이다.
도 8은 박테리아 세포밖 소포체 내에 로딩한 독소루비신의 정량 결과이다.
도 9는 ΔmsbB 대장균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체에 독소루비신을 로딩한 DoxEVM9+의 대장암 세포주(CT26; a) 및 내피 세포(HMEC-1; b)에 대한 약물 전달 효능을 평가한 것이다. 우측 패널에서 DoxEVM9+의 농도는 1x1010 EVs/mL로, 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있다.
도 10은 황색포도알균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체에 독소루비신을 로딩한 SA DoxEVM9+의 대장암 세포주(CT26; a) 및 내피 세포(HMEC-1; b)에 대한 약물 전달 효능을 평가한 것이다. 우측 패널에서 SA DoxEVM9+의 농도는 1x1010 EVs/mL로, 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있다.
도 11은 ΔmsbB 대장균과 황색포도알균을 각각 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지에서 배양해 얻은 박테리아 세포밖 소포체인 EVM9+(a)와 SA EVM9+(b)의 대장균 세포밖 소포체 및 황색포도알균 세포밖 소포체에 대한 항체 형성 효능을 평가한 것이다.
본 발명은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는, 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 독성이 약화된 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아를 포함한다. 상기 그람 음성 박테리아는 대장균, 녹농균, 및 살모넬라균 등을 포함하며, 그람 양성 박테리아는 황색포도알균 및 고초균 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아를 포함한다. 구체적으로, 상기 형질 전환된 박테리아는 상기 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 내독소(endotoxin) 생성 유전자 변형 박테리아를 들 수 있고, 구체적으로 ΔmsbB 대장균을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 특이 세포나 조직으로 타겟팅 되도록 형질 전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 암 혈관, 암 조직 또는 암 세포로 타겟팅 되도록 형질 전환된 박테리아를 들 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에서 사용되는 박테리아는 표적세포의 세포막과 융합(fusion)하도록 형질 전환된 박테리아, 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아, 및 상기 특정 물질의 억제와 특정 물질의 발현이 동시에 일어나도록 형질 전환된 박테리아 등을 포함한다. 그러나 본 발명의 박테리아 세포밖 소포체를 제조하는 박테리아는 상기에 제한되지 아니한다.
상기 박테리아는 물질 처리 또는 유전자 도입에 의해 형질 전환된 것일 수 있으며, 2회 이상 형질 전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아가, 하나 이상의 특정 단백질의 발현을 억제하도록 형질 전환된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아가, 세포 접합 분자(cell adhesion molecule), 항체(antibody), 표적 유도(targeting) 단백질, 세포막 융합(fusion) 단백질 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아는 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균을, 인간 EGF(Epidermal growth factor)와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환시킨 ΔmsbB-prsA-EGF 대장균을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 '화학 조성 배지'는 혈청, 조직 추출물 등 조성이 불분명한 자연 유래 소재를 사용한 '자연 배지'와 대비되는 것으로서, 조성물의 구성과 화학적 성상이 분명한 물질만으로 제조한 합성 배지(chemically defined medium)를 의미한다. 상기한 바와 같이 종래 박테리아 세포밖 소포체 제조에 널리 사용되었던 LB 배지(lysogeny broth) 또는 영양 배지(nutrient broth)로 인한 문제점을 해결하고, 균일한 효과를 나타내는 세포밖 소포체를 생산하기 위한 필수 구성요소이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 '질병'은 암을 포함한 다양한 질병을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 '박테리아 세포밖 소포체'는 박테리아에서 자연적으로 분비되는 '쉐딩 세포밖 소포체(shedding extracellular vesicles)', 및 박테리아를 유전적, 화학적, 또는 기계적 방법 등을 사용하여 인위적으로 제조된 '인공 세포밖 소포체(artificial extracellular vesicles)'를 포함한다.
본 발명의 '박테리아 세포밖 소포체'는 유래한 박테리아의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 박테리아의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid) 및 박테리아 성분 등을 가지고 있으며, 원래 박테리아보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체는 다양한 방법에 의해 얻을 수 있으며 그 예를 소개하면 하기와 같지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
(1) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아를 배양하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다.
(2) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아에 세제를 처리하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다. 상기 세제에는 제한이 없다.
(3) 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아에 항생제를 처리하고 그 배양액을 여과 및 초원심분리하여 쉐딩 세포밖 소포체를 얻을 수 있다. 상기 항생제는 제한이 없으며, 젠타마이신, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 등을 포함한다.
본 발명의 인공 세포밖 소포체는 박테리아를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기 천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막이 상기 박테리아의 세포막 이외의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포막 이외의 성분으로서 표적 유도 물질, 세포막 융합 물질(fusogen), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함한다.
예를 들어, 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 박테리아 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시킴으로써 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체 제조 시 상기 박테리아 세포밖 소포체의 막 성분을 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 약제학적 조성물은 상기 세포밖 소포체에 의한 독성을 억제시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약물을 세포밖 소포체에 로딩할 수도 있다. 상기 약물은 내독소에 의한 독성을 억제하는 약물을 포함하며, 그 예로 폴리믹신(polymyxin) B를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약제학적 조성물은 항암 효과를 증가시키는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약물을 세포밖 소포체에 로딩할 수도 있다.
본 발명에서 '로딩' 은 필요한 물질을 박테리아 세포밖 소포체의 표면에 노출시키거나 내부에 내포(encapsulation)시키는 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항암 효과를 증가시키는 약물은 Th17(T helper 17 세포) 면역반응을 억제하는 약물, 인터루킨(interleukin, IL)-6의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물, STAT3(signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달을 억제하는 약물, 항암제, 약물을 로딩한 나노 입자 치료제, 암 치료를 위한 세포치료제 등을 포함한다. Th17 면역반응을 억제하는 약물의 예로는 아스피린(aspirin)을 들 수 있으며, VEGF의 생성 혹은 활성을 억제하는 약물의 예로는 VEGF 수용체에 의한 신호전달을 억제하는 약물을 들 수 있다. 항암제를 로딩한 리포좀의 예로는 독실(DOXIL)을 들 수 있다. 상기 나노 입자 치료제는 10 nm ~ 10 μm 크기를 가지는 입자로써, 리포좀 (liposome), 덴드리머 (dendrimer), 폴리머 (polymer), 세포밖 소포체 (microvesicle) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 상기 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈(dextrose) 용액, 말토덱스트린(maltodextrin) 용액, 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol), 리포좀(liposome) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여함으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로는 0.1 ~ 1000 ㎎/일, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 박테리아 세포밖 소포체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명에서 '개체'란, 특정 질환 (예를 들면 암, 혈관질환, 또는 염증성 질환 등)의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류, 어류 및 조류를 포함하는 동물을 의미한다.
본 발명에서의 '암'이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양 등으로 이루어진 군으로부터 본 발명이 치료하려는 표적이 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 방법에서 사용되는 박테리아 및 박테리아 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 상기 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키기 위하여 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 사용할 수 있다.
상기 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키기 위하여는 하기와 같은 다양한 방법들이 있다.
(1) 박테리아의 독성이 약화되도록 유전적으로 형질 전환된 박테리아를 사용하여 세포밖 소포체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 숙주의 염증반응을 매개하는 지질다당류의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아(ΔmsbB mutant), 또는 리포타이코산(lipoteichoic acid, LTA)의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아(ΔltaS mutant)을 사용하여 세포밖 소포체를 제조할 수 있다.
(2) 내독소의 활성을 억제시키는 약물을 사용하여 박테리아의 독성을 감소시킬 수 있다. 상기 약물의 일 예로 폴리믹신 B를 들 수 있다. 상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체와 병용 투여할 수도 있으며, 배양 시 약물을 처리한 박테리아로부터 세포밖 소포체를 제조할 수도 있다.
(3) 항염증 및/또는 항응고 작용을 하는 약물을 사용하여 부작용을 감소시킬 수 있다. 상기 약물은 아스피린을 포함한다. 박테리아 세포밖 소포체와 아스피린을 병용 투여하면 박테리아 세포밖 소포체에 의한 염증반응, 혈액응고 반응 등의 부작용을 방지할 수 있다. 또한 배양 시 상기 약물을 처리한 박테리아로부터 세포밖 소포체를 제조할 수도 있다.
(4) 상기 세포밖 소포체의 막 성분에 화학적 방법으로 변형을 가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포밖 소포체의 막 성분이 티올기 또는 아민기를 이용한 화학적 방법으로 변형되거나, 상기 세포밖 소포체에 폴리에틸렌글리콜을 화학적 방법으로 결합시킴으로써 상기 세포밖 소포체의 막 성분을 화학적으로 변형시켜서 사용할 수 있다.
(5) 살균된 세포밖 소포체를 사용함으로써 살아 있는 박테리아의 감염을 막을 수 있다. 예를 들면, 자외선 및 감마선을 이용한 살균 또는 필터링을 이용한 박테리아의 제거 등을 통해 살균된 세포밖 소포체를 얻을 수 있다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키는 방법은 상기 예에 제한되지 아니하며 상기 방법 각각을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 항암 효능을 증가시키는 약물을 로딩한 세포밖 소포체를 사용할 수 있다. 항암 효능을 증가시키는 약물은 전술한 바와 같다.
또한 상기 방법의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체를 개체에 투여 시 상기 세포밖 소포체의 부작용을 감소시키는 약물 및/또는 항암효능을 증가시키는 약물, 약물을 로딩한 나노입자 치료제 및 세포치료제 등을 병용 투여할 수 있다.
상기 나노입자 치료제는 10 nm ~ 10 μm 크기를 가지는 입자로써, 리포좀 (liposome), 덴드리머 (dendrimer), 폴리머 (polymer), 세포밖 소포체 (microvesicle) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 및/또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 박테리아 세포밖 소포체에 로딩되는 물질은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 치료용 및/또는 진단용 물질일 수 있으며, 상기 박테리아 또는 형질 전환된 박테리아가 발현하고 있는 물질이 로딩될 수도 있으며 필요에 따라 상기 박테리아에서 유래하지 않고 박테리아의 외부에서 준비된 물질을 로딩할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질은 상기 박테리아에서 유래된 것 및 박테리아 외부에서 주입된 것 등을 포함한다. 또한 로딩되는 물질은 1개 일 수도 있고 2개 이상일 수도 있다. 또한, 상기 물질들을 박테리아 세포밖 소포체의 표면에 물리, 화학, 및/또는 생물학적 방법으로 로딩할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 본 발명의 박테리아 세포밖 소포체에 로딩하는 방법은 하기를 포함한다.
첫째, 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 이미 로딩한 박테리아에서 세포밖 소포체를 제조한다. 예를 들어, 치료 및/또는 진단을 위한 다양한 물질을 배양액에 포함시켜서 박테리아를 배양하면 상기 물질이 로딩된 박테리아를 수득할 수 있으며, 또는 전기 천공 방법으로 박테리아에 물질을 로딩할 수도 있다. 또한, 이러한 박테리아에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 세포밖 소포체, 또는 초음파 분해, 압출, 기계적 분해 등의 방법으로 제조한 인공 세포밖 소포체에는 상기 물질이 로딩되어 있다.
둘째, 박테리아 세포밖 소포체의 제조 과정에서 상기 물질을 박테리아 세포밖 소포체에 로딩한다. 예를 들어, 박테리아가 포함된 용액에 상기 물질을 첨가한 후 박테리아보다 크기가 작은 필터를 통과시키는 압출법으로 세포밖 소포체를 제조하면 세포밖 소포체에 상기 물질이 로딩된다.
셋째, 쉐딩 세포밖 소포체 또는 인공 세포밖 소포체를 제조한 후에 상기 물질을 로딩할 수 있다. 예를 들어, 전기 천공 방법으로 이미 제조한 쉐딩 세포밖 소포체 또는 인공 세포밖 소포체에 물질을 로딩할 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 물질을 세포밖 소포체에 로딩하는 방법은 상기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 치료용 및/또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관신생 저해제(angiogenesis inhibitor), 펩타이드(peptide), 단백질(protein), 백신(vaccine), 독소(toxin), 핵산, 비드(bead), 마이크로입자(microparticle) 및 나노입자(nanoparticle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 항암제일 수 있다.
상기 항암제는 암의 성장과 전이를 억제시키기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 항암제는 암세포의 DNA의 복제, 전사, 번역 과정을 차단한다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 항암제의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 항암제는 암세포의 종류, 항암제의 흡수 속도(치료기간과 항암제 투여 경로), 종양의 위치, 종양의 크기 등의 항암제 선택 시 고려하는 일반적인 원칙하에 선택될 수 있다. 상기 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agent)인 메칠로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 시크로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin) 등이 사용될 수 있고, 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)인　닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 블레오마이신(C Bleomycin) 등이 사용될 수 있으며, 식물 알카로이드(plant alkaloid)인 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 다노루비신(daunorubicin), 탁솔(taxol), 온코빈(oncovin), 프레드니손(prednisone), 시스플라틴, 허셉틴(herceptin), 리툽시맵(rituximab), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테산(topotecan) 및 이리도테산(iridotecan) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방사성 물질들을 이용할 수도 있다. 그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제가 상기 예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 항염증제일 수 있다. 구체적으로, 상기 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 이부프로펜(ibuprofen), 클로베타졸 프로피오네이트(clobetasol propionate), 디팔오르손 디아세테이트(diflorasone diacetate), 할로베타솔 프로피오네이트(halobetasol propionate), 암시온니드(amcinonide), 플루시온니드(fluocinonide), 모메타손 푸로에이트(mometasone furoate), 데옥시메타손(desoximetasone), 디클로페낙(diclofenac) 및 피록시캄(piroxicam) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명에서 사용될 수 있는 항염증제가 상기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 혈관신생 저해제일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈관신생 저해제는 기존 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 과정을 억제하기 위해 사용되는 모든 약제를 총칭하며, 대부분의 혈관신생 저해제는 암의 성장과 전이를 억제하고 염증 반응을 억제할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 혈관신생 저해제의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드를 포함시킬 수 있다. 예를 들어, RNase A 뿐만 아니라, VEGF, EGF 등과 같은 성장 인자, IL-1, IFN-gamma, IL-10과 같은 사이토카인류, 각종 항체 치료제, 다양한 펩타이드 또는 단백질, DNase 이 외에 암의 성장과 전이를 억제하고 염증반응을 억제할 수 있는 다양한 단백질 및 펩타이드를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 백신을 포함시킬 수 있다. 백신은 병원체의 감염증을 예방하기 위해 인체 내에 인위적으로 약독화된 병원체(항원) 등을 주입하여 인체의 면역 체계를 활성화시키는 것으로서, 본 발명의 상기 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 하나 이상의 독소를 포함시킬 수 있다. 독소는 다양한 생물체에서 유래된 것으로 체내에 흡수되었을 때 독성을 나타낼 수 있는 것을 총칭하며, 독소를 통해 세포 사멸을 유도할 수 있다. 본 발명의 치료용 물질로 사용될 수 있는 독소의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 핵산은 센스 효과, 안티센스 효과, RNA 간섭 및 단백질의 기능 저해 등의 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소나노튜브(carbon nanotube), 또는 자기 비드(magnetic bead)를 포함하는 나노 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 자기 비드 등의 비드를 세포밖 소포체에 로딩하여 사용할 수도 있다. 산화철 등의 자성입자는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)을 얻는 조영제로 이용될 수 있다. 나노 입자와 결합한 핵산, 나노 입자와 결합한 단백질 등도 사용할 수 있으며 진단에 유용한 방사성 물질도 사용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 치료용 및/또는 진단용 물질이 형광을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 형광을 방출하는 물질이 형광 단백질 또는 양자점(quantum dot, Qdot)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 형광단백질을 암호화(encode)하는 핵산 또는 다양한 형광물질을 로딩한 세포밖 소포체를 진단에 이용할 수 있다. 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포밖 소포체에 형광단백질을 암호화하고 있는 플라스미드 DNA를 로딩하여 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광단백질에서 방출되는 형광 신호로부터 알 수 있다. 또한, 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포밖 소포체에 형광 방출 양자점을 포함한 다양한 형광물질을 포함시켜서 생체에 주입하면 그 표적 세포 또는 조직의 존재를 형광 신호로부터 알 수 있다. 특정한 표적 세포 또는 조직에서 발생하는 형광을 진단에 이용할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 형광 방출 양자점은 치료 목적으로도 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 세포밖 소포체를 사용하여 2가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 2가지 이상의 물질을 동시에 로딩한 세포밖 소포체를 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다. 또는, 한 가지 또는 두 가지 이상의 물질이 로딩된 세포밖 소포체를 복수 개 사용하여 2 가지 이상의 물질을 전달할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 및/또는 진단용 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 질병 치료용 및/또는 진단용 약물, 약물을 로딩한 나노 입자 치료제 및 세포치료제 등을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖 소포체를 사용하여 질병 치료용 또는 진단용 물질, 질병 치료용 및/또는 질병 진단용 물질을 로딩한 나노 입자 치료제 및 세포치료제 등을 표적 세포 또는 조직으로 전달하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 일 구현예에서, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 특이 세포 또는 조직에 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포밖 소포체에 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 함께 로딩되어 있는 것을 사용하여 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 두 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 세포밖 소포체를 사용하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 2 개 이상의 세포밖 소포체를 동시에 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 2 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 2개 이상의 세포밖 소포체를 순차적으로 투여하여 상기 치료용 또는 진단용 물질을 전달할 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 1 가지 이상의 상기 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 세포밖 소포체와 1 가지 이상의 질병 치료용 및/또는 질병 진단용 물질을 로딩한 나노 입자 치료제, 또는 질병 치료용 세포치료제를 조합하여 순차적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 치료용 또는 진단용 약물이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 질병 진단용 및/또는 치료용 약물전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 독성이 약화된 박테리아 및 박테리아 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류에 의한 감염을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 박테리아에 의한 감염은 그람 음성 박테리아에 의한 감염, 그람 양성 박테리아에 의한 감염을 포함한다. 구체적으로, 상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 및 피부 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 변형하여 사용할 수 있다. 상기 변형은 형질 전환된 박테리아를 사용하는 것, 박테리아에 화학물질을 처리하는 것 등을 포함하며, 상기 화학물질은 약물을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물 또는 면역 보강제를 병용 투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다. 상기 박테리아 세포밖 소포체 제조 방법은 박테리아에서 자연적으로 분비되는 쉐딩 세포밖 소포체 및 인공 세포밖 소포체를 제조하는 방법을 포함한다.
상기 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 제조 방법의 일 구현예로 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계.
상기 방법으로 제조된 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체는 항생제 처리, 자외선 노출, 감마선 노출, 및 필터링으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용하여 세포밖 소포체를 살균하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
상기 제조 방법은 상기 박테리아보다 크기가 작고 상기 약물이 로딩된 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분리 단계는 초원심분리(ultracentrifugation), 밀도 구배(density gradient), 여과(filtration), 투석(dialysis), 침전(sediment), 크로마토그래피(chromatography) 및 자유 유동 전기이동법(free-flow electrophoresis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한 상기 본 발명의 제조 방법은 상기 박테리아의 세포막과 비교하여 토폴로지(topology)가 변형된 막을 갖는 세포밖 소포체를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 세포밖 소포체를 제조한 후에, 목적에 따라 원래 세포의 세포막과 토폴로지가 동일한 세포밖 소포체만을 선택하여 사용할 수 있다. 세포막 단백질 중 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 인지하는 항체와 같은 물질을 사용해서 이 세포질 도메인이 외부에 노출된 세포밖 소포체를 제거할 수 있다. 이렇게 하면 세포막의 안팎이 바뀐 세포밖 소포체는 제거되고 남은 세포밖 소포체의 외부에는 원래 세포의 세포막 외부에 노출된 세포막 단백질만이 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면은 독성이 약화된 박테리아를 포함하는 질병 치료용 및/또는 진단용 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법을 제공한다.
상기 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법의 일 구현예로 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계; 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계.
상기 본 발명의 치료용 또는 진단용 물질은 상술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 지질 다당류의 독성이 약화된 대장균 배양
상기한 문제를 극복하기 위해, 화학적으로 구성 성분이 정의된 다양한 화학 조성 배지(chemically defined media) 및 포유류 세포 배양 배지를 이용하여 형질 전환 대장균을 배양하고, 그 생장을 확인하였다.
구체적으로, 하기 [표 1]에 나타난 바와 같이 고농도 포스페이트 M9(High Phosphate-M9)과 저농도 포스페이트 M9(Low Phosphate-M9) 화학 조성 배지, 또는 저농도 포스페이트 M9 화학 조성 배지에 비타민과 미량 원소를 첨가한 배지(M9+)를 제조하였다. 이를 이용하여 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균에 인간 EGF와 박테리아 내막 단백질인 PrsA의 융합 단백질을 발현하는 pHCE-prsA-EGF 벡터로 형질 전환된 ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 배양하였으며, 각 배지에서의 성장을 600 nm 파장에서 흡광도로 확인하였다. 그 결과, 고농도 포스페이트 M9 배지에서는 성장하지 않지만, 저농도 포스페이트 M9 배지에서는 잘 성장함을 관찰하였고, 그 성장 속도는 비타민(vitamins)과 미량 원소(trace elements)를 포함한 저농도 포스페이트 M9 배지에서 키우는 경우와 크게 차이가 없음을 관찰하였다(도 1a). 또한, ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 포유류 배양 배지인 DMEM과 RPMI 1640에서도 성장하지만, 최종 세포 농도는 흡광도(파장 600 nm) 값이 1 정도가 되고 나면 더 이상 성장하지 않았다(도 1b).
Figure PCTKR2019003285-appb-T000001
실시예 2. 다양한 박테리아 배양
다양한 박테리아를 저농도 포스페이트 M9 화학 조성 배지에 비타민과 미량 원소를 첨가한 배지(M9+), 그리고 화학적으로 구성 성분이 정의되지 않은 배지인 LB배지에 배양하고, 그 생장을 확인하였다. 지질 다당류의 독성이 약화된 ΔmsbB 대장균(도 2a), 황색포도알균(Staphylococcus aureus; 도 2b), 살모넬라균(Salmonella enterica; 도 2c), 고초균(Bacillus subtilis; 도 2d)을 배양한 결과, M9+과 LB 모두에서 잘 성장함을 알 수 있었다(도 2).
실시예 3. 박테리아 세포밖 소포체의 분리
박테리아 세포밖 소포체를 분리하기 위해, ΔmsbB prsA-EGF 대장균을 LB 배지, 저농도 포스페이트 M9 배지, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+), 그리고 DMEM 배지에서 각각 배양하였다. 또한, prsA-EGF 융합 단백질 발현이 박테리아 세포밖 소포체의 생성, 조성 및 생리 활성에 차이가 있는지 여부를 규명하기 위해 ΔmsbB 대장균을 LB 배지와, 저농도 포스페이트 M9 배지, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에 배양하였다. 또한, 황색포도알균을 LB 배지와, 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에, 살모넬라균과 고초균을 비타민과 미량 원소가 포함된 저농도 포스페이트 M9 배지(M9+)에 배양하였다. 각각의 배양액을 고속 원심 분리 튜브(high speed centrifuge tube)에 담은 후, 4℃에서 6,000 x g로 20분 간 두 번 원심 분리하였다. 박테리아를 제거한 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 멤브레인을 사용하여 50배 농축하였다. 농축액을 구멍 크기가 0.22 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 70 mL 용량의 초원심 분리 튜브(ultracentrifuge tube)에 담고, 4℃에서 150,000 x g로 3시간 동안 초원심 분리하였다. 침전물을 50% 옵티프렙 2.5 mL에 현탁한 후, 5 mL 용량의 초원심 분리 튜브에 넣은 후, 그 위에 40% 옵티프렙 1.5 mL, 10% 옵티프렙 1.25 mL을 차례로 담았다. 이후, 4℃에서 200,000 x g로 2시간 동안 초원심 분리하였다. 박테리아 세포밖 소포체를 10% 옵티프렙과 40% 옵티프렙 사이의 층에서 얻은 후, 구멍 크기가 0.22 μm인 멤브레인 필터에 1회 통과시킨 후, 분주하여 -80℃에 보관하였다.
본 명세서에서 다양한 박테리아 세포밖 소포체를 체계적으로 표현하기 위해 하기 [표 2]에 표시한 약어들을 사용하였다.
Figure PCTKR2019003285-appb-T000002
박테리아 세포밖 소포체의 크기를 동적 광산란 입도 분석기로 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 다양한 조건에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 크기는 40~50 nm로 비슷하였다.
실시예 4. 박테리아 세포밖 소포체 단백질 양 및 세포밖 소포체 수 측정
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양은 브래드포드 단백질 정량법(Bradford protein assay)으로 확인하였으며, 세포밖 소포체 수는 나노 입자 추적 분석법(nanoparticle tracking analysis)으로 확인하였다.
도 4a는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 양을 측정한 그래프이고, 도 4b는 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체 수를 측정한 그래프이고, 도 4c는 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체 수를 측정한 그래프이다. 도 4a에 나타난 바와 같이 ΔmsbB 대장균은 ΔmsbB prsA-EGF 대장균보다 모든 배양 조건에서 세포밖 소포체 단백질 양으로 보면 많은 양의 세포밖 소포체를 분비하지만, 도 4b에 나타난 바와 같이 ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 ΔmsbB 대장균보다 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체의 수가 현저히 많음을 관찰하였다. 따라서, 1리터 배양액에서 유래한 박테리아 세포밖 소포체 수로 보면 도 4c에 나타난 바와 같이 ΔmsbB prsA-EGF 대장균은 배양 조건에 따라 ΔmsbB 대장균보다 많은 수의 세포밖 소포체를 분비하거나 작은 수의 세포밖 소포체를 분비하더라도 도 4a와 비교했을 때 단백질의 분비량 차이보다 그 비율이 현저히 작음을 관찰하였다.
실시예 5. 박테리아 세포밖 소포체의 단백질 조성 분석
다양한 배지에서 배양한 ΔmsbB 대장균 및 ΔmsbB prsA-EGF 대장균 유래 세포밖 소포체가 크기는 서로 비슷하지만, 단백질 1 μg에 해당하는 박테리아 세포밖 소포체 수가 현저하게 차이가 나는 원인을 규명하기 위해, 10 μg의 EVLB, EVM9, EVM9+, EGFEVLB, EGFEVM9, 및 EGFEVM9+에 대해 SDS-PAGE를 수행해 단백질 조성이 상이함을 확인하였고(도 5a), 1 μg의 EVLB, EVM9, EVM9+, EGFEVLB, EGFEVM9, 및 EGFEVM9+에 존재하는 세포 외막 단백질인 OmpA를 Western blotting으로 확인한 결과 OmpA의 양이 다양하게 존재함을 확인하였다(도 5b). 따라서, 한 개의 세포밖 소포체에 존재하는 OmpA의 양은 현저히 차이가 날 뿐만 아니라, 여러 단백질들의 종류와 양도 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 6. 독성이 약화된 그람 음성 박테리아 세포밖 소포체의 항암 활성
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EGFEVM9와 EGFEVDMEM, EGFEVLB, 그리고 항암 활성이 기존에 알려져 있는 EVLB의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증하였다.
구체적으로, 5주령 Balb/c 생쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 28마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐 대장암 세포(CT26) 1x106 개를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 키웠다. 생쥐 대장암 세포 투여 6일 후, 생쥐를 4마리씩 7개 실험군으로 나누고, 각각의 실험군 별로 EGFEVM9(3 μL 또는 30 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 EGFEVDMEM (8 μL 또는 40 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, EGFEVLB(6 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, EVLB(10 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일에 두 번씩(세포 투여 6일 째, 10일 째, 13일 째) 꼬리 정맥에 주사하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 EVLB의 결과와 비교하기 위해 5 μg의 EVLB 수(~1x1010 EVs)에 해당하는 양(EGFEVM9 3 μL 또는 EGFEVDMEM 8 μL), 그것의 10배(EGFEVM9 30 μL, EGFEVLB 6 μL, EVLB 10 μL), 또는 5배(EGFEVDMEM 40 μL)에 해당하는 양을 포함하도록 하였다.
다음으로 각 실험군 별로 대장암 세포 투여 10일 후, 12일 후, 그리고 14일 후, 대장암 조직의 크기를 측정하였다. 대장암 조직의 부피(V)는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 V = l x s2/2의 공식으로 계산하였다. 상기 대장암 세포를 피하 투여한 이후 대장암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. PBS만 투여한 대조군에 비하여 EGFEVM9을 투여한 경우, 용량에 관계없이 대장암 조직의 크기가 지속적으로 감소하였고(도 6a), EGFEVDMEM을 투여한 경우 용량 의존적으로 대장암 조직의 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 6b). 한편 EVLB, EGFEVLB를 투여한 경우에도 대장암 조직의 크기가 PBS만 투여한 대조군에 비해서 감소하는 것을 확인하였다(도 6c).
또한, 각 실험군 생쥐의 체중, 체온, 움직임의 변화, 눈곱 또는 털 솟음 현상을 지속적으로 관찰하였고, 암 조직의 외관이 검게 변하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과, PBS를 투여한 대조군과 비교해, EGFEVM9와 EGFEVDMEM을 투여한 경우에도 암 조직이 검게 변하는 현상은 관찰되지 않았다. 또한 생쥐의 체중, 체온과 움직임에 큰 변화가 없었으며, 눈곱이 끼거나 털이 솟는 부작용도 관찰되지 않았고 사망하는 생쥐도 관찰되지 않았다. 하지만 EVLB나 EGFEVLB를 투여하면 암의 성장을 효과적으로 저해하지만 동시에 암 조직이 검게 변하는 현상이 관찰되며, 부작용으로 생쥐의 체중이 감소하거나, 움직임이 둔해지거나, 눈곱 또는 털 솟음 현상이 관찰되며, 심지어 생쥐가 사망하는 경우가 발생하였다.
상기한 결과를 종합하면, EGFEVM9와 EGFEVDMEM은 EVLB와 비교할 때 항암 효과가 비슷하거나 좋을 뿐만 아니라, 항암 효과가 있는 양의 최소한 10배의 양을 투여하여도 부작용을 유도하지 않았다.
실시예 7. 독성이 약화된 그람 양성 박테리아 세포밖 소포체의 항암 활성
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, SA EVM9+의 항암 활성을 생쥐 모델에서 검증하였다.
구체적으로, 5주령 Balb/c 생쥐12마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐 대장암 세포(CT26) 1x106 개를 생쥐의 피부 밑에 주사하고 키웠다. 생쥐 대장암 세포 투여 6일 후, 생쥐를 4마리씩 3개 실험군으로 나누고, 각각의 실험군 별로 SA EVM9+(1 μL 또는 10 μL)를 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일에 두 번씩(세포 투여 6일 째, 10일 째, 13일 째) 꼬리 정맥에 주사하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 EVLB와 비교하기 위해 5 μg의 EVLB 수(~1x1010 EVs)에 해당하는 양(SA EVM9+ 1 μL), 또는 그것의 10배(SA EVM9+ 10 μL)에 해당하는 양을 포함하도록 하였다.
다음으로 각 실험군 별로 대장암 세포 투여 10일 후, 12일 후, 그리고 14일 후, 대장암 조직의 크기를 측정하였다. 대장암 조직의 부피(V)는 가장 긴 길이(l)와 이에 수직한 길이(s)를 측정하여 V = l x s2/2의 공식으로 계산하였다. 상기 대장암 세포를 피하 투여한 이후 대장암 조직의 크기를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다. PBS만 투여한 대조군에 비하여 SA EVM9+을 투여한 경우, 용량 의존적으로 대장암 조직의 크기가 지속적으로 감소함을 관찰하였다(도 7).
또한, 각 실험군 생쥐의 체중, 체온, 움직임의 변화, 눈곱 또는 털 솟음 현상을 지속적으로 관찰하였고, 암 조직의 외관이 검게 변하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과, PBS를 투여한 대조군과 비교해, SA EVM9+을 투여한 경우에도 암 조직이 검게 변하는 현상은 관찰되지 않았다. 또한 생쥐의 체중, 체온과 움직임에 큰 변화가 없었으며, 눈곱이 끼거나 털이 솟는 부작용도 관찰되지 않았고 사망하는 생쥐도 관찰되지 않았다.
상기한 결과를 종합하면, SA EVM9+은 EVLB와 비교할 때 항암 효과가 비슷하거나 좋을 뿐만 아니라, 항암 효과가 있는 양의 최소한 10배의 양을 투여하여도 부작용을 유도하지 않았다.
실시예 8. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 약물 전달
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EVM9+와 SA EVM9+을 사용하여 약물을 전달할 수 있는지를 확인하기 위해 하기 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 약물의 일 예로 독소루비신을 사용하였다.
상기 실시예 3의 방법에 따라 얻은 EVM9+와 SA EVM9+에 0.8 mg/mL 농도의 독소루비신을 1:1 비율로 섞어 4℃에서 12시간 동안 처리한 후, 4℃에서 150,000 x g로 3시간 동안 초고속 원심 분리를 진행하여 독소루비신을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체와, 용액 내 박테리아 세포밖 소포체가 들어가지 않은 독소루비신을 분리하였다. 독소루비신을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체에 대해 형광 감도 측정기(fluorometer)와 나노 입자 추적 분석을 수행한 결과 독소루비신을 로딩한 EVM9+(DoxEVM9+)와 SA EVM9+(SA DoxEVM9+) 모두 1x1010 EVs에는 독소루비신 1 μg이 존재함을 확인하였다(도 8).
생쥐 대장암 세포(CT26) 2x103 개/well 또는 인간 혈관 내피 세포(HMEC-1) 4x103 개/well을 96웰 플레이트에서 하루 동안 배양하였다. PBS (Control), 다양한 양의 독소루비신을 로딩하지 않은 EVM9+, 독소루비신을 로딩한 DoxEVM9+ 및 독소루비신을 각각 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포에 24시간 동안 처리하였다. 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포의 생존율을 WST-1 assay를 이용하여 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 알 수 있는 바와 같이, EVM9+는 농도에 관계없이 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸에는 영향이 없지만 DoxEVM9+는 농도 의존적으로 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과를 나타냈다. 또한 DoxEVM9+ 1x1010 EVs/mL에는 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있는데, 같은 양의 독소루비신에 비해 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 크게 나타났으며, 그 양의 10배에 해당하는 독소루비신과 비슷한 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 나타났다.
한편 SA EVM9+와 독소루비신을 로딩한 SA DoxEVM9+도 상기와 같은 방법으로 생쥐 대장암 세포와 인간 혈관 내피 세포에 처리하여 세포들의 생존율을 확인하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, SA EVM9+는 농도에 관계없이 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸에는 영향이 없지만 SA DoxEVM9+는 농도 의존적으로 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과를 나타냈다. 또한 SA DoxEVM9+ 1x1010 EVs/mL에는 독소루비신 1 μg/mL이 로딩되어 있는데, 같은 양의 독소루비신에 비해 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 크게 나타났으며, 그 양의 10배에 해당하는 독소루비신과 비슷한 암세포 및 혈관 내피 세포 사멸 효과가 나타났다.
상기 결과로부터, 약물을 로딩한 박테리아 세포밖 소포체를 이용하여 보다 효과적으로 약물을 전달할 수 있으며, 동일한 양의 약물을 투여하였을 때 세포밖 소포체를 통해 전달함으로써 치료 효과를 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 이용한 백신
상기 실시예 3의 방법에 따라 수득한 박테리아 세포밖 소포체 중에서, EVM9+ 및 SA EVM9+을 백신으로 활용할 수 있는지를 생쥐 모델을 이용하여 검증하였다.
구체적으로, 5주령 C57BL/6 생쥐(The Jackson Laboratory) 15마리를 실험에 사용하였으며, 생쥐를 3마리씩 5개 실험군으로 나눴다. 각각의 실험군 별로 EVM9+(0.5 μL 또는 2.5 μL)을 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 SA EVM9+(7 μL 또는 33 μL)을 포함하는 PBS 용액 100 μL, 또는 대조군으로서 세포밖 소포체를 포함하지 않는 PBS 용액 100 μL를 일주일 간격으로 2주 동안 2번 생쥐의 허벅지 근육으로 주입하였다. 생쥐에 투여한 세포밖 소포체의 양은 1 μg에 해당하는 양(EVM9+ 0.5 μL 또는 SA EVM9+ 7 μL), 또는 5 μg에 해당하는 양(EVM9+ 2.5 μL 또는 SA EVM9+ 33 μL)을 포함하도록 하였다.
생쥐에 세포밖 소포체를 마지막으로 주입하고 1주일 후에 생쥐 눈의 혈관에서 혈액을 일부 얻어 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체 특이적인 항체를 측정하였다. EVM9+ 또는 SA EVM9+ 200 ng이 코팅된 검정색 96 웰 플레이트에 1% BSA/PBS로 1:500으로 희석된 생쥐 혈청을 넣어 상온에서 2시간 배양한 후, peroxidase가 결합된, 생쥐 혈청에 대한 항체를 이용한 효소 결합 면역 침강 분석법(enzyme-linked immunesorbent assay, ELISA)으로 관찰하였다. 도 11은 생쥐 혈청 내 EVM9+(도 10a) 또는 SA EVM9+(도 10b) 특이적인 항체 양을 관찰한 결과로, 용량 의존적으로 세포밖 소포체에 대한 특이 항체 형성이 증가함을 보여준다. 이는 세포밖 소포체를 2회 이상 근육으로 주입하였을 때 박테리아 세포밖 소포체에 함유된 단백질에 대한 특이 항체가 형성됨을 의미한다.
상기한 결과를 종합해보면, 다양한 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아 균주들, 이들의 형질전환된 균주들과 배양 배지 등의 조합을 통해 얻은 세포밖 소포체의 독성, 질병 치료제, 약물 전달체 및/또는 백신 전달체로서의 안전성과 효능 등의 차이를 규명하고, 이들 세포밖 소포체의 다양한 구성 성분(단백질, 핵산, 지질, 펩티도글리칸 등)의 차이를 다중 오믹스(multiomics) 기술을 이용해 비교 분석함으로써 독성과 효능에 관여하는 물질을 규명할 수 있고, 발굴된 물질들을 이용해 부작용이 없거나 적으면서 치료 효능, 약물 전달 효능 및/또는 백신 효능이 증진된 새로운 세포밖 소포체 또는 물질을 개발할 수 있음을 시사하고 있다.
본 발명에 따른 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체는 다양한 방법을 이용해 추가적인 1) 크기 조절 및 균질화(size modulation)을 하거나, 2) 부작용 감소, 혈액을 포함한 체내외에서의 안정성 증가, 질병 치료 효능 증진, 약물 전달체 효능 증진, 백신 전달체 효능 증진, 및 세포 또는 조직 타겟팅에 필요한 화합물, 펩타이드, 단백질, 융합 단백질, 핵산, 압타머, 독소, 다양한 형태의 항원, 폴리머와 지질 등 다양한 물질들 또는 이들의 복합체를 단독 또는 복합으로 세포밖 소포체 내부에 로딩 또는 표면에 제시(loading and/or display)하거나, 3) 상기한 방법들을 조합함으로써, 박테리아 세포밖 소포체의 부작용을 줄여 질병 치료제, 약물 전달체, 및/또는 백신 전달체로서의 안정성과 효능 등을 효과적으로 증진시킬 수 있다.
또한, 질병 치료용 또는 백신용 물질이 로딩된 본 발명의 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체 및 그의 제조 방법은 in vitro 또는 in vivo에서 치료용, 약물 전달용, 백신용, 또는 실험용으로 사용될 수 있다.

Claims (53)

  1. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 약제학적 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인, 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아인, 약제학적 조성물.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  9. 제 4항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  10. 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인, 약제학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종, 피부 질환, 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 항암 효과를 증진시키는 약물을 추가적으로 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 박테리아 세포밖 소포체에 로딩된 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 항암제인, 약제학적 조성물.
  17. 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 치료용 또는 진단용 물질 전달용 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 조성물.
  21. 제 17항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  22. 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 질병 예방 또는 치료용 백신 조성물로서, 상기 박테리아는 화학 조성 배지에서 배양한 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 박테리아, 바이러스 또는 진균류에 의한 감염인, 백신 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 감염은 피부 감염, 호흡기 감염, 비뇨 생식기 감염, 골관절 감염, 중추신경계 감염 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  25. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 갑상선암, 간암, 골육종, 구강암, 뇌종양, 담낭암, 대장암, 림프종, 방광암, 백혈병, 소장암, 설암, 식도암, 신장암, 위암, 유방암, 췌장암, 폐암, 피부암, 고환암, 음경암, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  26. 제 22항에 있어서,
    상기 질병은 고혈압, 골다공증, 과민성 장증후군, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 당뇨, 동맥경화증, 비만, 소화성 궤양, 알츠하이머, 폐기종 및 피부 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  27. 제 22항에 있어서,
    상기 백신은 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물이나 면역 보강제를 병용 투여하여 사용하는 것인, 백신 조성물.
  28. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인, 백신 조성물.
  29. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인, 백신 조성물.
  30. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 막 단백질과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아; 또는
    세포밖 소포체의 내강 수하물(luminal cargo)과 항원의 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는
    Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog) 또는 HER2/neu의 돌연변이인, 백신 조성물.
  33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인, 백신 조성물.
  34. 제 22항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 백신 조성물.
  35. 제 22항에 있어서,
    상기 박테리아 세포밖 소포체에 항원 단백질 또는 펩타이드를 로딩한 것을 포함하는, 백신 조성물.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 항원은 박테리아 유래 항원, 바이러스 유래 항원, 진균류 유래 항원, 암 유래 항원; 또는
    Ras 단백질, Raf 단백질, Src 단백질, Myc 단백질, EGFR(epidermal growth factor receptor), PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), p53, PTEN(phosphatase and tensin homolog) 또는 HER2/neu의 돌연변이인, 백신 조성물.
  37. (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 독성이 약화된 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법.
  38. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인 제조 방법.
  39. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인 제조 방법.
  40. 제 37항에 있어서,
    상기 박테리아는 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  42. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 내독소 생성 유전자 변형 박테리아인 제조 방법.
  43. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포막 융합 물질이 발현되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  44. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 특이 세포 또는 조직으로 타겟팅되도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  45. 제 40항에 있어서,
    상기 박테리아는 세포 접합 분자, 항체, 표적 유도 단백질, 세포막 융합 단백질 자체, 또는 이들의 융합 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상을 발현하도록 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  46. 제 40항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아가 2회 이상 형질 전환된 박테리아인 제조 방법.
  47. 제 37항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
  48. 제 37항에 있어서,
    상기 분리 단계가 초원심 분리, 밀도 구배, 여과, 투석, 침전, 크로마토그래피 및 자유 유동 전기 이동법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는 것인 제조 방법.
  49. (a) 독성이 약화된 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양액에서 분비되는 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리된 박테리아 세포밖 소포체를 포함하는 현탁액에 질병 치료용 또는 진단용 물질을 첨가하여 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 배양액으로부터 분비되는 질병 치료용 또는 진단용 물질이 로딩된 박테리아 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 물질 전달용 박테리아 세포밖 소포체의 제조 방법.
  50. 제 49항에 있어서,
    상기 치료용 또는 진단용 물질은 항암제, 항염증제, 혈관 신생 저해제, 펩타이드, 단백질, 백신, 독소, 핵산, 비드, 마이크로 입자, 나노 입자, 형광 단백질, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  51. 제 50항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA, 압타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  52. 제 50항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산화철, 금, 탄소 나노 튜브, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  53. 제 49항에 있어서,
    상기 화학 조성 배지는 M9 배지(M9 medium), DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 제조 방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111494417A (zh) * 2020-02-10 2020-08-07 寇晓星 诱导性细胞外囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用
WO2022011014A1 (en) * 2020-07-09 2022-01-13 Exocure Biosciences, Inc. Bacteria-derived vesicles and use thereof for generating immune response to sars-cov-2
WO2023114293A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Evelo Biosciences, Inc. Extracellular vesicle assays
WO2023114295A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Evelo Biosciences, Inc. Veillonella parvula bacteria extracellular vesicle preparations

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012002760A2 (ko) * 2010-07-01 2012-01-05 포항공과대학교 산학협력단 세균유래 마이크로베시클을 이용한 암치료 및 암진단 방법
WO2012020307A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
WO2013138427A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 The General Hospital Corporation Microvesicle-mediated delivery of therapeutic molecules
KR101632962B1 (ko) * 2015-07-29 2016-06-23 한국생명공학연구원 변형 외막소포체를 포함하는 항감염성 면역증강용 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012002760A2 (ko) * 2010-07-01 2012-01-05 포항공과대학교 산학협력단 세균유래 마이크로베시클을 이용한 암치료 및 암진단 방법
WO2012020307A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
WO2013138427A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 The General Hospital Corporation Microvesicle-mediated delivery of therapeutic molecules
KR101632962B1 (ko) * 2015-07-29 2016-06-23 한국생명공학연구원 변형 외막소포체를 포함하는 항감염성 면역증강용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KLIMENTOVA , JANA: "Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria", MICROBIOLOGICAL RESEARCH, vol. 170, no. 4, 2015, pages 1 - 9, XP029107295, doi:10.1016/j.micres.2014.09.006 *
YANG, YOOSOO: "Extracellular vesicles as a platform for membrane- associated therapeutic protein delivery", JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES, vol. 7, no. 1, 1 March 2018 (2018-03-01), pages 1440131, XP55639224 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111494417A (zh) * 2020-02-10 2020-08-07 寇晓星 诱导性细胞外囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用
CN111494417B (zh) * 2020-02-10 2024-04-09 寇晓星 诱导性细胞外囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用
WO2022011014A1 (en) * 2020-07-09 2022-01-13 Exocure Biosciences, Inc. Bacteria-derived vesicles and use thereof for generating immune response to sars-cov-2
WO2023114293A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Evelo Biosciences, Inc. Extracellular vesicle assays
WO2023114295A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-22 Evelo Biosciences, Inc. Veillonella parvula bacteria extracellular vesicle preparations
WO2023114296A3 (en) * 2021-12-14 2023-08-10 Evelo Biosciences, Inc. Extracellular vesicle preparations

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