IT202000021871A1 - Nanoparticelle multi-bersaglio, ottenute da cellule, per uso come teranostico versatile - Google Patents
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Description
TITOLO: "Nanoparticelle multi-bersagliamento, ottenute da cellule, per uso come teranostico versatile".
DESCRIZIONE
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda sistemi di rilascio di farmaci, in particolare nanoparticelle da membrana cellulare, per controllare il rilascio e l'erogazione del farmaco somministrato.
STATO DELL'ARTE
Esiste un elevato numero di sostanze/molecole/strutture terapeutiche, diagnostiche e teranostiche che possono essere utilizzate per il trattamento di malattie pericolose per la vita (ad esempio, ictus ischemico, infarto del miocardio, aterosclerosi e cancro) [1-4]. Tuttavia, queste sostanze/molecole/strutture non possono essere rilasciate in modo sicuro ed efficiente nel tessuto malato a causa di diversi motivi. Alcuni di questi motivi includono: 1) la bassa stabilit? colloidale che pu? risultare in aggregati indesiderabili durante la circolazione sanguigna e successivi coaguli di sangue [5], 2) la rapida clearance dal sistema reticoloendoteliale (RES) per mancanza di una capacit? di opsonizzazione contraria o per la suddetta aggregazione [6], e infine 3) la biodistribuzione non controllata per mancanza di specificit? tissutale [7]. In alcuni casi, altre barriere fisiche e anatomiche come la barriera ematoencefalica o lo stroma desmoplastico pancreatico, inibiscono ulteriormente il rilascio sicuro di queste sostanze teranostiche, con conseguente riduzione dell'efficienza terapeutica e/o diagnostica. Per superare queste limitazioni, queste sostanze/molecole/strutture possono essere incapsulate all'interno di matrici adeguatamente progettate, denominate sistemi di rilascio di farmaci (DDS, Drug Delivery System).
Quando un farmaco viene somministrato a un individuo, un DDS che controlla il rilascio e l'erogazione del farmaco somministrato in cellule, tessuti e organi ? molto importante per un'efficacia ottimale. Quando viene applicato il DDS, ? possibile ottenere vantaggi come la massimizzazione dell'efficacia e della stabilit? di un farmaco, il prolungamento del tempo di permanenza, l'aumento della biodisponibilit? e la minimizzazione degli effetti collaterali. Pertanto, il DDS pu? essere considerato importante quanto il componente terapeutico stesso. Dagli inizi degli anni '60, i DDS sono stati sviluppati in varie forme.
I sistemi artificiali, come i liposomi, sono stati ampiamente studiati come sistemi di rilascio di farmaci. I preparati liposomiali hanno una bassa tossicit? e sono altamente applicabili perch? le dimensioni, la carica, la composizione della membrana e la permeabilit? della membrana dei preparati liposomiali possono essere controllati secondo la prescrizione. Recentemente, sono stati sviluppati liposomi stealth preparati coniugando liposomi con un polimero, come polietilenglicole (PEG). I liposomi stealth aumentano l'emivita circolatoria dei farmaci impedendo ai liposomi contenenti farmaci di essere facilmente eliminati dal sangue. Tuttavia, poich? i liposomi e i liposomi stealth non hanno la capacit? di riconoscere tipi specifici di cellule, non possono essere utilizzati allo scopo di rilasciare farmaci a tipi specifici di cellule o tessuti, a meno che non siano coniugati con anticorpi specifici per una cellula bersaglio.
L'uso di DDS fornisce una migliore stabilit? colloidale, capacit? di stealth contro la clearance RES, specificit? di bersagliamento avanzata e maggiore interiorizzazione da parte di tessuti specifici. Sebbene questi sistemi di rilascio comportino una maggiore efficienza terapeutica complessiva, essi si ritengono insufficienti in condizioni reali. Le ragioni di questa inadeguatezza sono diverse e includono tossicit? indesiderata dovuta ai loro prodotti di biodegradazione o alla loro biodistribuzione non controllata nei tessuti sani, bassa efficienza di incapsulamento che comporta dosi pi? elevate che non possono essere tollerate in modo sicuro dai pazienti e dalla clearance del sistema del reticolo endoteliale (RES) poich? la loro capacit? di stealth viene persa quando vengono somministrati ai pazienti. Inoltre, nel caso delle barriere fisiche/anatomiche, anche se la capacit? di attraversamento di questi sistemi di rilascio ? migliorata, le dosi elevate necessarie per entrare nel tessuto malato e dimostrare un effetto terapeutico non possono essere raggiunte.
Recentemente, un ulteriore miglioramento di questi sistemi ? stato ottenuto combinando nuclei organici e/o inorganici con un guscio biomimetico derivato dalla membrana di varie cellule. [8, 9] Questa strategia ha portato a notevoli miglioramenti nella stabilit?, nell'internalizzazione delle cellule e nella specificit? tissutale, consentendo una maggiore internalizzazione e una migliore specificit? tissutale [10-14].
Un altro esempio di sistema di rilascio di farmaci comprendente un nucleo organico e/o inorganico racchiuso in un guscio biomimetico ? fornito da D. Dehaini e colleghi (D. Dehaini et al., "Erythrocyte-Platelet Hybrid Membrane Coating for Enhanced Nanoparticle Functionalization", 2017 HHS Public Access), che ha preparato nanoparticelle rivestite con doppia membrana ottenute fondendo la membrana di globuli rossi (RBC, Red Blood Cell) e la membrana piastrinica. Le nanoparticelle rivestite con membrana sono state fabbricate preparando nuclei di poli(acido latticoco-glicolico) (PLGA), e poi rivestendoli con membrana di RBC, membrana piastrinica o membrana piastrinica-RBC fusa. Una miscela di nuclei PLGA e materiale di membrana ? stata poi sonicata usando un sonicatore a bagno Fisher Scientific FS30D per 2 minuti per formare le nanoparticelle rivestite finali.
In US2018/0036240 vengono descritte nanovescicole derivate da membrane cellulari A1; il loro metodo di produzione prevede l'estrazione di membrane cellulari da cellule, i cui componenti intracellulari sono stati rimossi trattando le cellule con una soluzione alcalina da pH 9 a 14, e una dimensione delle nanovescicole ? inferiore a una dimensione delle cellule. Il documento descrive anche un metodo di preparazione di nanovescicole derivate dalla membrana cellulare caricate con sostanze per il trattamento o la diagnosi di malattie, il metodo comprendendo: (a) una fase di rimozione di materiali intracellulari mediante trattamento delle cellule con una soluzione alcalina di pH da 9 a 14; (b) una fase di aggiunta di sostanze terapeutiche o diagnostiche in una sospensione contenente membrane delle cellule da cui sono stati rimossi i materiali intracellulari; (c) una fase di preparazione di nanovescicole mediante applicazione di un metodo di sonicazione alla sospensione a cui sono aggiunte le sostanze terapeutiche o diagnostiche; e (d) una fase di isolamento delle nanovescicole preparate dalla sospensione. Vale la pena notare che il metodo ivi descritto ? adatto alla produzione di nanoparticelle comprendenti membrane cellulari derivate da una singola linea cellulare (si vedano gli esempi 1-13 in cui sono caratterizzate nanoparticelle derivate da monociti o derivate da cellule trasformate).
Studi sulle nanovescicole direttamente derivate dalle membrane delle cellule dimostrano che la rimozione dei componenti intracellulari, che non sono necessari per il bersagliamento, pu? aumentare l'efficienza del caricamento del farmaco e prevenire gli effetti collaterali quando somministrato nel corpo. Pertanto, lo sviluppo di sistemi privi delle loro componenti intraluminali ? considerato molto promettente.
Poich? i sistemi di rilascio derivati da cellule utilizzano i sistemi di bersagliamento naturali delle cellule, il bersagliamento pu? essere facilmente indotto. Sono stati riportati studi su sistemi di rilascio di farmaci che utilizzano vescicole extracellulari, che sono naturalmente secrete dalle cellule, o nanovescicole, preparate artificialmente da cellule di mammifero nucleate.
La crescente domanda di DDS iniettabile che utilizza nanoterapeutici intelligenti e tecnologicamente avanzati ? attribuita alle esigenze dei pazienti affetti da malattie croniche (ad esempio, diabete, morbo di Parkinson, broncopneumopatia ostruttiva cronica), nonch? malattie pericolose per la vita tra cui cancro, ictus ischemico e infarto del miocardio. Sebbene l'evoluzione della nanomedicina abbia portato alla fabbricazione di specifici sistemi di rilascio con una migliore localizzazione nei tessuti malati difficili da bersagliare, nonch? all?erogazione controllata delle loro sostanze terapeutiche/diagnostiche, c'? ancora una forte necessit? di fabbricazione di una nanopiattaforma versatile che possa essere utilizzata come approccio multi-teranostico mirato a una variet? di malattie.
Problema tecnico della tecnica anteriore
Sebbene il guscio biomimetico migliori l'interiorizzazione e la specificit? tissutale del DDS, la tossicit? indesiderata dovuta ai prodotti di biodegradazione del nucleo organico e/o inorganico rimane irrisolta.
Le nanovescicole a membrana cellulare composte da cellule di un singolo tipo hanno solo la capacit? di bersagliare con cellule di alta precisione dello stesso tipo.
Studi recenti hanno riferito che ? possibile utilizzare diversi tipi di membrana cellulare per formare nanoparticelle ibride, poich? queste nanoparticelle ibride trasportano propriet? da entrambi i tipi cellulari.
Tuttavia, la maggior parte dei metodi attuali per raccogliere le membrane cellulari estratte richiede ultra-centrifugazione. L'uso dell'ultra-centrifugazione aumenta notevolmente il costo a causa del prezzo elevato sia dell'apparecchiatura che dei materiali di consumo.
Inoltre, il pH alcalino utilizzato nella tecnica nota per la fabbricazione di nanovescicole artificiali denatura le proteine della membrana, riducendone la capacit? di bersagliamento. Oltre a ci?, questa denaturazione porter? a cambiamenti conformazionali di varie proteine transmembrana riducendo ulteriormente la stabilit? di una vescicola fabbricata. In aggiunta, il pH alcalino pu? fungere da fattore limitante per la combinazione di pi? di una membrana cellulare in un tipo di vescicola, poich? l'elevata resistenza ionica e la maggiore carica superficiale contrastano potenziali interazioni idrofobe che mantengono unite le diverse membrane.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Lo scopo principale della presente invenzione ? la fornitura di un modo pi? semplice e diretto per fabbricare nanoparticelle derivate da membrane cellulari ibride che combinano capacit? di bersagliamento multiplo con elevata specificit? e capacit? di evasione dalla fagocitosi.
Scopo della presente invenzione ? quindi un metodo per la produzione di nanoparticelle derivate da membrane cellulari, comprendente le fasi di estrarre le membrane cellulari da cellule di due o pi? linee cellulari differenti ed unirle (fonderle) per mezzo di omogeneizzazione ad alta pressione in presenza di un ingrediente terapeutico o diagnostico disperso.
Un altro oggetto della presente invenzione sono nanoparticelle derivate da membrane cellulari che racchiudono un principio attivo; queste nanoparticelle sono ottenibili mediante il metodo dell'invenzione e possono essere impiegate come sistemi di rilascio di farmaci per uso medico o diagnostico.
Vantaggi rispetto alla tecnica anteriore
Scalabilit? - L'uso dell'omogeneizzatore ad alta pressione consente l'estrazione di milioni e persino miliardi di nanoparticelle, nonch? la fusione delle cellule e l'estrazione di membrane cellulari miste. Ci? consente l'estrazione e la fabbricazione di nanoparticelle a membrana cellulare fusa (F-CMNPs, Fused Cell Membrane Nanoparticles) su scala industriale.
Semplicit? - Un omogeneizzatore ad alta pressione, insieme all'uso di tecniche di filtraggio rispettivamente per l'estrazione e la pulizia, semplifica la procedura e costa cinque volte meno di un?ultracentrifuga.
Alta velocit? - L'estrazione e la pulizia della membrana possono essere eseguite in soli 45 minuti e a velocit? molto bassa (circa 4000 g), dove l'ultracentrifuga richiede almeno sei ore e ad alta velocit? (circa 100000-200000 g).
Bersagliamento multiplo - L'invenzione consente la fabbricazione di F-CMNP con una capacit? di bersagliamento multiplo che pu? essere controllata dalla scelta selettiva e dalla percentuale delle membrane cellulari desiderate.
Biocompatibilit? - Il metodo consente di produrre un sistema interamente biocompatibile, poich? le F-CMNPs inventate sono costituite solo da membrane cellulari.
Elevata capacit? di caricamento - Elevata capacit? di caricamento le nanoparticelle con farmaci (circa il 25%, che ? quattro volte superiore ai nanosistemi esistenti).
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Immagini SEM di A) CMNPs da una combinazione di U251-MG e membrane cellulari hCMEC/(UH-CMNP) e B) CMNPs da una combinazione di membrane cellulari U251-MG, hCMEC/D3 e T98G (UHT-CMNP).
Figura 2. A) Dimensioni e B) distribuzioni di carica superficiale di CMNPs da una combinazione di membrane cellulari U251-MG, hCMEC/D3 e T98G (UHT-CMNPs)
Figura 3. SDS-PAGE di vari CMNP. L1: Marcatore, L2: H-CMNPs, L3: U-CMNPs, L4: UH-CMNPs, L5: UHT-CMNPs, L6: nanoparticelle di sfingomielina funzionalizzate con angiopep-2 (SM-AP2) (controllo positivo)
Figura 4. Valutazione dell'internalizzazione utilizzando varie linee cellulari cancerose e non cancerose trattate con particelle derivate da hCMEC/D3 (H-CMNP), particelle derivate da U251-MG (U-CMNP), da una combinazione di U251-MG e hCMEC/D3 (UH-CMNP), da una combinazione di U251-MG, hCMEC/D3 e T98G (UHT-CMNP), e come controllo positivo, nanoparticelle di sfingomielina funzionalizzate con angiop-2 (SM-AP2).
Figura 5. Proliferazione cellulare % della linea cellulare U-251 MG, dopo 72 ore, usando varie concentrazioni del farmaco modello 3PO non incapsulato e incapsulato (UHT-CMNP).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Metodo
Per una maggiore intelligibilit? del testo, il metodo di produzione delle nanoparticelle sar? descritto passo dopo passo, descrivendo, se necessario, le forme di realizzazione preferite dell'invenzione per ciascuna fase.
Come accennato sopra, il metodo secondo l'invenzione ? dedicato alla produzione di nanoparticelle derivate da membrane cellulari e, a tal fine, comprende i seguenti passaggi:
I) fornire da due a quattro colture cellulari, ciascuna coltura cellulare essendo di una linea cellulare diversa, e raccogliere un predeterminato numero di cellule da ciascuna linea cellulare;
II) lisare il numero predeterminato di cellule di ciascuna linea cellulare per ottenere lisati di ciascuna linea cellulare;
III) estrarre membrane cellulari dal lisato di ciascuna linea cellulare per ottenere dispersioni di membrane cellulari di ciascuna linea cellulare;
IV) miscelare la dispersione della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare in quantit? tali che il corrispondente predeterminato numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare rappresenti da 0,25 a 4 parti del numero totale di cellule raccolte nella fase (I), ed aggiungere una soluzione acquosa o dispersione contenente un ingrediente terapeutico o diagnostico per ottenere una dispersione mista;
V) omogeneizzare la dispersione mista a una pressione di omogeneizzazione compresa tra 24.000 psi e 50.000 psi, con un numero di passaggi compreso tra 6 e 14, per formare una dispersione contenente una pluralit? di nanoparticelle;
VI) isolare la pluralit? di nanoparticelle dalla dispersione che le contiene.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il metodo dell'invenzione viene eseguito mantenendo il pH < 7,5 in ogni fase, preferibilmente tra 5 < pH < 7,5, preferibilmente tra 5 < pH < 6,5, preferibilmente a un pH di 5,5 circa.
Fase I: fornitura di due o pi? colture cellulari, ciascuna coltura cellulare essendo di una linea cellulare diversa.
Ai fini dell'invenzione, per membrana cellulare si intende la membrana citoplasmatica (o membrana plasmatica), ossia la membrana biologica che separa l'interno di una cellula dal suo ambiente esterno.
Per linea cellulare si intende una pluralit? di cellule che sono state continuamente sottoposte a passaggi per un lungo periodo di tempo (20 ? 80 passaggi) e hanno acquisito caratteristiche genotipiche e fenotipiche omogenee. Le linee cellulari possono essere finite o immortalizzate.
Preferibilmente, le due o pi? linee cellulari utilizzate ai fini dell'invenzione sono linee cellulari animali o umane, indipendentemente selezionate dal gruppo costituito da linee cellulari primarie e linee cellulari immortalizzate, in cui per cellule primarie si intendono cellule isolate direttamente dal tessuto umano o animale, mentre per linea cellulare immortalizzata (o continua) si intende una linea cellulare che ha acquisito la capacit? di proliferare indefinitamente, sia attraverso mutazioni genetiche che modificazioni artificiali.
Preferibilmente, vengono utilizzate linee cellulari immortalizzate; linee cellulari immortalizzate adatte vengono selezionate dal gruppo costituito da
- linee cellulari di glioblastoma, tra cui preferibilmente U-251 MG, U87 MG, T98G;
- linee cellulari di neuroblastoma, tra cui preferibilmente SH-SY5Y e la sua forma differenziata simile a cellule neurali (Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research, NeuroToxicology 30 (2009) 127?135).
- linee cellulari endoteliali, tra cui preferibilmente hCMEC/D3,
e relative combinazioni.
Esempi di combinazioni adatte per lo scopo dell'invenzione sono:
- U-251 MG hCMEC/D3
- U-251 MG hCMEC/D3 T98G
- hCMEC/D3 cellule neurali - SH-SY5Y differenziate.
Il vantaggio di utilizzare diverse linee cellulari risiede nel fatto che, a seconda della quantit? dei vari estratti di membrana cellulare utilizzati per realizzare le nanoparticelle, ? possibile sintonizzare le propriet? delle nanoparticelle e, in particolare, il loro tempo di interiorizzazione da parte di diversi tipi cellulari. Infatti, la combinazione di diverse membrane cellulari fornisce alle nanoparticelle un'elevata specificit? verso diversi tipi di cellule e complessivamente migliori risultati di interiorizzazione.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il metodo prevede l'uso combinato di membrane cellulari derivate da quattro diverse linee cellulari, in cui la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare rappresenti preferibilmente da 0,25 a 4 parti, preferibilmente da 0,5 a 3 parti, preferibilmente da 1 a 2 parti, preferibilmente da 1 a 1,5 parti, del numero totale di cellule utilizzate (n. cellule/n. cellule).
Preferibilmente, la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare sia in un rapporto 1:1:1:1 in base al numero totale di cellule usate.
Ad esempio: UHTS-CMNPs (CMNP: nanoparticelle derivate da membrane cellulari (Cell Membranes Derived NanoParticle)) derivano combinando 1 parte di membrane cellulari derivate da cellule U-251 MG, 1 parte di membrane cellulari derivate da cellule hCMEC/D3, 1 parte di membrane cellulari derivate da cellule T98G e 1 parte di membrane cellulari derivate da cellule SH-SY5Y.
In altre parole, la quantit? di membrane cellulari combinate insieme viene dedotta sulla base (considerata uguale a) del numero di cellule usate per estrarre le membrane cellulari corrispondenti (ad esempio: una miscela di membrane cellulari comprendente parti uguali ? rapporto 1:1 ? di membrane cellulari dalla linea cellulare A e membrane cellulari dalla linea cellulare B, si ottiene usando la dispersione di membrane cellulari estratte da 3,5x10<6 >cellule della linea cellulare A e 3,5x10<6 >cellule della linea cellulare B).
Secondo una forma di realizzazione preferita, il metodo prevede l'uso combinato di membrane cellulari derivate da tre diverse linee cellulari, in cui la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare rappresenti preferibilmente da 0,25 a 4 parti, preferibilmente da 0,5 a 3 parti, preferibilmente da 1 a 2 parti, preferibilmente da 1 a 1,5 parti, del numero totale di cellule utilizzate.
Preferibilmente, la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare sia in un rapporto 1:1:1 in base al numero totale di cellule usate.
Ad esempio: le UHT-CMNPs sono derivate mediante combinazione di 1 parte delle membrane cellulari derivate da cellule U-251 MG, 1 parte delle membrane cellulari derivate da cellule hCMEC/D3 e 1 parte delle membrane cellulari derivate da cellule T98G.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il metodo prevede l'uso combinato di una prima e una seconda linea cellulare, in cui la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare rappresenti da 0,25 a 4 parti, preferibilmente da 0,5 a 3 parti, preferibilmente da 1 a 2 parti, preferibilmente da 1 a 1,5 parti del numero totale di cellule utilizzate.
Preferibilmente, la membrana cellulare di ciascuna linea cellulare viene miscelata in quantit? tali che il corrispondente numero di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare sia in un rapporto 1:1 in base al numero totale di cellule usate.
Ad esempio: le UH-CMNP sono derivate combinando 1 parte delle membrane cellulari derivate da cellule U-251 MG e 1 parte delle membrane cellulari derivate da cellule hCMEC/D3.
Preferibilmente, ciascuna linea cellulare, prima di essere sottoposta al metodo dell'invenzione, viene coltivata fino a una percentuale di confluenza compresa tra 50% e 80%, pi? preferibilmente pari a 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% e 80% (misurata mediante microscopia ottica). La confluenza percentuale potrebbe variare a seconda della linea cellulare; il tecnico del settore sa, secondo le specificit? della linea cellulare, se una confluenza del 50%, una confluenza dell'80% o qualsiasi confluenza % tra loro ? adatta allo scopo della successiva fase di estrazione della membrana cellulare.
Una volta raggiunta la confluenza desiderata, ciascuna linea cellulare viene tripsinizzata e preferibilmente raccolta in numeri compresi tra 3,5 x 10<6 >e 100 x10<6>. Il numero di cellule potrebbe variare a seconda del numero di linee cellulari utilizzate/combinate; il tecnico del settore determiner? facilmente il numero di cellule necessario da ciascuna linea cellulare, in base alle caratteristiche specifiche di ciascuna linea cellulare.
Una volta raccolto, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono preferibilmente ridisperse in acqua sterile all'interno di un recipiente di plastica (ad esempio, una provetta Falcon), che viene poi conservato per almeno 1 ora, preferibilmente da 1 ora a 4 ore, a -20 ?C o -80 ?C. Ogni linea cellulare deve essere preferibilmente conservata in un recipiente di plastica diverso.
Fase II: lisi della coltura cellulare di ciascuna linea cellulare per ottenere lisati di ciascuna linea cellulare.
Ai fini dell'invenzione, le cellule possono essere lisate usando metodi chimici, biologici (ad esempio, mediante lisozima) o meccanici noti all'esperto del settore e disponibili in letteratura (https://www.thermofisher.com/it/en/home/lifescience/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resourcelibrary/pierce-protein-methods/traditional-methods-cell-lysis.html).
Preferibilmente, la coltura cellulare di ciascuna linea cellulare viene lisata separatamente (il che significa ciascuna linea cellulare in un recipiente diverso).
Preferibilmente, le cellule vengono lisate usando metodi meccanici selezionati dal gruppo costituito da estrusione, sonicazione, omogeneizzazione, congelamentoscongelamento, elettroporazione, distruzione meccanica e lisi cellulare per mezzo di additivi/adiuvanti.
La lisi cellulare per mezzo di additivi/adiuvanti pu?, per esempio, essere promossa sospendendo le cellule in un tampone ipotonico, il che provoca il gonfiore e la rottura delle cellule pi? facilmente in condizioni di taglio fisico.
Ancora pi? preferibilmente, il congelamento-scongelamento ? impiegato come tecnica di lisi preferita.
Preferibilmente, la fase (II) prevede la lisi della coltura cellulare di ciascuna linea cellulare per ottenere lisati di ciascuna linea cellulare in acqua distillata sterile.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la fase di lisi (II) comprende le sottofasi di
- lisare la coltura di ciascuna linea cellulare da 2 a 4 volte, preferibilmente 3 volte per ottenere lisati preliminari di ciascuna linea cellulare; e
- omogeneizzare il lisato preliminare di ciascuna linea cellulare a una pressione dell'aria esterna compresa tra 16 e 24 psi (pressione di omogeneizzazione compresa tra 4.800 e 7.200 psi), con un numero di passaggi compreso tra 6 e 14, per ottenere il lisato di ciascuna linea cellulare.
Secondo una forma di realizzazione preferita, i lisati preliminari di ciascuna linea cellulare sono sospesi in un terreno acquoso prima dell'omogeneizzazione; detto terreno acquoso essendo preferibilmente acqua distillata sterile. Il lisato risultante di ciascuna linea cellulare ? quindi una sospensione in acqua distillata sterile.
Preferibilmente l'acqua distillata sterile utilizzata ai fini dell'invenzione ha un pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 6,5, preferibilmente pari a circa 5,5 unit? di pH.
Si noti che la pressione dell'aria esterna ? il valore di pressione impostato dal tecnico sullo strumento; mentre la pressione di omogeneizzazione ? la pressione effettiva all'interno dello strumento.
Preferibilmente, l'omogeneizzazione viene eseguita a una pressione dell'aria esterna compresa tra 18 e 22 psi (pressione di omogeneizzazione 5.400-6.600 psi), preferibilmente tra 19 e 21 psi (pressione di omogeneizzazione 5.700-6.300 psi), preferibilmente a 20 psi (pressione di omogeneizzazione 6.000 psi).
Preferibilmente, il numero di passaggi attraverso la valvola di omogeneizzazione varia da 8 a 12, preferibilmente da 9 a 11, preferibilmente il numero di passaggi ? 10.
Si noti che il numero di passaggi e la pressione di omogeneizzazione sono stati definiti dal richiedente con un omogeneizzatore dotato di valvola di omogeneizzazione dinamica. Tuttavia, date le condizioni operative definite dagli inventori su un omogeneizzatore cos? progettato, l'esperto del settore non avrebbe alcun onere indebito nel trovare le condizioni operative adatte da applicare al campione quando utilizza un omogeneizzatore con una progettazione diversa per gli stessi scopi.
Preferibilmente, l'omogeneizzazione viene condotta a una temperatura compresa tra 20 ?C e 28 ?C, preferibilmente tra 20 ?C e 26 ?C, preferibilmente tra 22 ?C e 26 ?C, preferibilmente a 24 ?C.
Preferibilmente, l'omogeneizzatore impiegato nella fase II ? un omogeneizzatore ad alta pressione.
I richiedenti ritengono che la combinazione di lisi, preferibilmente eseguita mediante congelamento-scongelamento, e omogeneizzazione sia particolarmente vantaggiosa ai fini dell'invenzione, in quanto consente il controllo sia della dimensione che del successivo caricamento delle nanoparticelle.
Fase III: estrazione delle membrane cellulari dal lisato di ciascuna linea cellulare per ottenere dispersioni di membrane cellulari di ciascuna linea cellulare.
Preferibilmente, la fase (III) prevede l'estrazione di membrane cellulari dal lisato di ciascuna linea cellulare per ottenere dispersioni di membrane cellulari di ciascuna linea cellulare in acqua distillata sterile.
Una volta ottenuto ciascun lisato della linea cellulare, i lisati vengono sottoposti alla fase di estrazione, contenente preferibilmente le seguenti sottofasi:
- centrifugare da 1 a 4 volte il lisato di ciascuna linea cellulare a 4.000 a 12.000 giri al minuto per 4 a 12 minuti a 4 ?C, raccogliendo ogni volta il surnatante;
- centrifugare da 2 a 4 volte il surnatante a 2.000 a 8.000 giri al minuto per 8-12 minuti a 4 ?C, utilizzando un filtro centrifugo con un vaglio di selezione (?cut-off?) molecolare da 50 kDa a 150 kDa, preferibilmente da 50 kDa a 100 kDa, raccogliendo ogni volta la frazione non filtrata del surnatante, al fine di ottenere la dispersione della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare.
Secondo una forma di realizzazione preferita, le membrane cellulari vengono estratte da ciascuna linea cellulare separatamente.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la frazione non filtrata del surnatante viene ogni volta ridispersa in un terreno acquoso; questa procedura semplifica e ottimizza la procedura di filtrazione del campione e consente di ottenere dispersioni acquose di membrana cellulare di ciascuna linea cellulare.
Il terreno acquoso adatto a questo scopo ? preferibilmente acqua distillata sterile. Preferibilmente l'acqua distillata sterile utilizzata ai fini dell'invenzione ha un pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 6,5, preferibilmente pari a circa 5,5 unit? di pH.
Preferibilmente, la prima sottofase di centrifugazione viene eseguita a giri al minuto compresi tra 6.000 e 12.000 giri al minuto, preferibilmente tra 8.000 e 11.000 giri al minuto, preferibilmente pari a 10.000 giri al minuto.
Preferibilmente, la prima sottofase di centrifugazione viene eseguita da 6 a 12 minuti, preferibilmente da 8 a 12 minuti, preferibilmente da 9 a 11 minuti, preferibilmente per 10 minuti.
Preferibilmente, la seconda sottofase di centrifugazione viene eseguita a giri al minuto compresi tra 3.000 e 7.000, preferibilmente tra 4.000 e 6.000, preferibilmente pari a 5.000.
Preferibilmente, la seconda sottofase di centrifugazione viene eseguita da 6 a 12 minuti, preferibilmente da 8 a 12 minuti, preferibilmente da 9 a 11 minuti, preferibilmente per 10 minuti.
Il richiedente ritiene che l'uso di tecniche di filtrazione in combinazione con la successiva omogeneizzazione della dispersione mista sia particolarmente vantaggioso ai fini dell'invenzione in quanto comporta una procedura molto semplificata e scalabile.
Fase IV: miscelazione da 0,5 a 4 parti in peso della dispersione della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare, e aggiunta di una soluzione o dispersione acquosa contenente un ingrediente terapeutico o diagnostico per ottenere una dispersione mista.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la soluzione o dispersione acquosa contenente l'ingrediente terapeutico o diagnostico contiene come solvente o disperdente acqua sterile.
Preferibilmente l'acqua distillata sterile utilizzata ai fini dell'invenzione ha un pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 6,5, preferibilmente pari a circa 5,5 unit? di pH.
Preferibilmente, l'ingrediente terapeutico ? selezionato nel gruppo costituito da: inibitori metabolici (ad esempio, 6-fosforofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bisfosfatasi), inibitori dello stress ossidativo (ad esempio, L-N6-(1-imminoetil)-lisina), antiossidanti (ad esempio, vitamina A), agenti antinfiammatori (ad esempio, nimesulide), agenti antitumorali (erlotinib), agenti neuroprotettivi (ad esempio, acido retinoico), antibiotici (ad esempio, amoxicillina), antidepressivi (ad esempio, sertralina), anticoagulanti (ad esempio, warfarin), antifungini (ad esempio, fluconazolo), agenti anti-diabetici (ad esempio, voglibosio), agenti anti-ipertensivi (ad esempio, losartan).
Secondo una forma di realizzazione preferita l'ingrediente terapeutico ha una massa molecolare compresa tra 100 e 900 Da, preferibilmente tra 200 Da e 500 Da.
Preferibilmente, l'ingrediente diagnostico ? selezionato dal gruppo costituito da agenti di contrasto, radiofarmaci.
Esempi di agenti di contrasto adatti sono fludeossiglucosio, fluoromisonidazolo, fluorotimidina F-18, citrato di gallio, Ga-67 e ioxeolo.
Secondo una forma di realizzazione preferita l'ingrediente diagnostico presenta una massa molecolare compresa tra 100 e 900 Da, preferibilmente compresa tra 700 e 900 Da.
Pi? preferibilmente, l'ingrediente terapeutico o diagnostico ?:
un ingrediente idrofobo avente un coefficiente di ripartizione compreso tra 0,5 e 2,5, o
un ingrediente idrofilo avente un coefficiente di ripartizione compreso tra -3 e -0,5, e preferibilmente funzionalizzato con strategie di bioconiugazione dello stato dell'arte. Preferibilmente, gruppi funzionali adatti vengono selezionati dal gruppo costituito da: ammine, acidi carbossilici, tioli e relative combinazioni.
Fase V: omogeneizzazione della dispersione mista a una pressione di omogeneizzazione compresa tra 24.000 psi e 50.000 psi (circa 80-167 pressione dell'aria esterna), con un numero di passaggi compreso tra 6 e 14, per formare una dispersione contenente una pluralit? di nanoparticelle.
Una volta che la dispersione della membrana cellulare ottenuta da ciascuna linea cellulare viene miscelata insieme, con una soluzione o una dispersione dell'ingrediente terapeutico o diagnostico, si ottiene una dispersione mista.
Tale dispersione mista viene sottoposta a omogeneizzazione a una pressione di omogeneizzazione preferibilmente compresa tra 26.000 psi e 48.000 psi (pressione esterna 87-160 psi), preferibilmente tra 28.000 psi e 44.000 psi (pressione esterna 93-147 psi), tra 30.000 psi e 42.000 psi (pressione esterna 100-140), tra 32.000 psi e 40.000 psi (pressione esterna 107-133 psi), tra 34.000 psi e 38.000 psi (pressione esterna 113-127 psi), preferibilmente tra 35.000 psi e 37.000 psi (pressione esterna 116-123 psi), preferibilmente pari a 36.000 psi (pressione esterna 120 psi).
Preferibilmente, il numero di passaggi attraverso la valvola di omogeneizzazione varia da 8 a 12, preferibilmente da 9 a 11, preferibilmente il numero di passaggi ? 10.
Preferibilmente, l'omogeneizzazione viene eseguita a una temperatura compresa tra 2 ?C e 8 ?C, preferibilmente tra 2 ?C e 6 ?C, preferibilmente tra 3 ?C e 5 ?C, preferibilmente pari a 4 ?C.
Preferibilmente, l'omogeneizzatore impiegato nella fase V ? un omogeneizzatore ad alta pressione.
Fase VI: isolamento della pluralit? di nanoparticelle dalla dispersione che le contiene.
L'isolamento della pluralit? di particelle dalla dispersione ottenuta dalla fase V pu? essere eseguito mediante tecniche di isolamento note al tecnico del settore e disponibili in letteratura, come ad esempio, ultra-centrifugazione, microfluidica, microsfere magnetiche e metodi di isolamento basati sulla filtrazione.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la fase di isolamento VI viene eseguita ripetendo le sottofasi della fase di estrazione III sulla dispersione contenente la pluralit? di nanoparticelle.
In altre parole, la fase di isolamento VI comprende le sottofasi di:
- centrifugare da 1 a 4 volte la dispersione contenente la pluralit? di nanoparticelle da 4.000 a 12.000 giri al minuto per 4-12 minuti a 4 ?C, raccogliendo ogni volta il surnatante;
- centrifugare da 2 a 4 volte il surnatante a 2.000 a 8.000 giri al minuto per 8-12 minuti a 4 ?C, utilizzando un filtro centrifugo con cut-off molecolare di 50-150 kDa, preferibilmente 50-100 kDa, raccogliendo ogni volta la frazione non filtrata del surnatante, al fine di ottenere un campione purificato di nanoparticelle.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la frazione non filtrata del surnatante viene ogni volta ridispersa in un terreno acquoso; questa procedura semplifica e ottimizza la procedura di filtrazione del campione.
Il terreno acquoso adatto a questo scopo ? acqua distillata sterile. Preferibilmente l'acqua distillata presenta un pH < 9, preferibilmente 5 < pH < 9, preferibilmente 5 < pH < 7,5, preferibilmente 5 < pH < 6,5, preferibilmente pari a circa 5,5 unit? di pH.
Preferibilmente, la prima sottofase di centrifugazione viene eseguita a giri al minuto compresi tra 4.000 e 8.000 giri al minuto, preferibilmente tra 4.000 e 6.000 giri al minuto, preferibilmente pari a 5.000 giri al minuto.
Preferibilmente, la prima sottofase di centrifugazione viene eseguita da 6 a 12 minuti, preferibilmente da 8 a 12 minuti, preferibilmente da 9 a 11 minuti, preferibilmente per 10 minuti.
Preferibilmente, la seconda sottofase di centrifugazione viene eseguita a giri al minuto compresi tra 3.000 e 7.000, preferibilmente tra 4.000 e 6.000, preferibilmente pari a 5.000.
Preferibilmente, la seconda sottofase di centrifugazione viene eseguita da 6 a 12 minuti, preferibilmente da 8 a 12 minuti, preferibilmente da 9 a 11 minuti, preferibilmente per 10 minuti.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il campione purificato di nanoparticelle ottenuto dalla seconda sotto-fase di centrifugazione della fase di isolamento VI pu? essere ulteriormente filtrato con un filtro a siringa sterile da 0,20 ?m, per sterilizzare ulteriormente e rimuovere le particelle grandi dal campione. Il campione ottenuto dalla filtrazione aggiuntiva pu? essere successivamente conservato a 4 ?C per un ulteriore utilizzo.
Nanoparticelle
Altro scopo della presente invenzione sono nanoparticelle derivate da membrane cellulari comprendenti
- un guscio esterno contenente membrane cellulari, ciascuna membrana cellulare derivante da due a quattro linee cellulari diverse,
- un nucleo interno costituito da una soluzione o dispersione acquosa contenente un ingrediente terapeutico o diagnostico,
in cui il guscio contiene da 0,25 a 4 parti della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare.
Come descritto in precedenza, la quantit? di membrane cellulari ? quantificata in numero di cellule, in quanto la presunzione ? che il numero di cellule di origine per l'estrazione corrisponda al numero di membrane estratte. In altre parole, la quantit? in parti di membrane cellulari contenute nel guscio delle nanoparticelle ? uguale al numero di cellule della corrispondente linea cellulare di origine, sul numero totale di cellule di tutte le linee cellulari originarie utilizzate.
Secondo una forma di realizzazione preferita, le nanoparticelle derivate da membrana cellulare sono ottenute con il metodo descritto in precedenza. In tal senso, qualsiasi informazione data in precedenza con riferimento al metodo si applica, mutatis mutandis, alle nanoparticelle dell'invenzione.
Preferibilmente, le nanoparticelle di membrane cellulari ottenute con il metodo dell'invenzione sono caratterizzate da una capacit? di caricamento percentuale compresa tra il 10% e il 25%.
In generale, per nanoparticella si intende un nanomateriale con qualsiasi dimensione esterna compresa tra circa 1 nm e 100 nm, costituito per il 50% o pi? da particelle aventi una dimensione compresa tra 1 nm-100 nm (direttiva UE 2011/696/UE).
Le nanoparticelle dell'invenzione hanno una dimensione media numerica (ponderata in numero) inferiore a 100 nm, come calcolato dalla microscopia elettronica a scansione (SEM, Scanning Electron Microscopy) ad alta risoluzione.
Preferibilmente, la dimensione delle nanoparticelle calcolata dalle immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) ad alta risoluzione varia da 1 nm a 250 nm, preferibilmente da 10 nm a 250 nm, preferibilmente da 20 nm a 250 nm, preferibilmente da 20 nm a 220 nm.
Preferibilmente, il diametro idrodinamico medio basato sull'intensit? delle nanoparticelle misurate in acqua, come calcolato dalle misurazioni di diffusione dinamica della luce (DLS, Dynamic Light Scattering) varia da 200 a 250 nm.
Preferibilmente, la carica superficiale delle nanoparticelle, calcolata mediante misurazioni DLS in acqua, varia da -10 mV a -25 mV.
Preferibilmente, le nanoparticelle dell'invenzione hanno una capacit? di caricamento compresa tra 10% e 25%, preferibilmente tra 12% e 25%, preferibilmente tra 16 e 25%, preferibilmente tra 18% e 25%, preferibilmente tra 20% e 25%, preferibilmente tra 22% e 25%.
Si noti che la capacit? di caricamento ? la quantit? di farmaco caricata per unit? di peso della nanoparticella, indicando la percentuale della massa della nanoparticella che ? dovuta al farmaco incapsulato. La capacit? di caricamento (LC%) pu? essere calcolata dalla quantit? totale di farmaco intrappolato divisa per il peso totale delle nanoparticelle. Nel rilascio di farmaci, la resa, espressa in percentuale, riflette la quantit? di farmaco rilasciato per quantit? incapsulata. (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/materials-science/drugdelivery/drug-deliveryquestions.html#:~:text=Loading%20capacity%20is%20the%20amount,by%20the%2 0total%20nanoparticle%20weight)
Preferibilmente, le nanoparticelle derivate da membrane cellulari sono per uso medico e/o diagnostico; in particolare, possono essere usate come sistemi di rilascio di farmaci per uso medico o diagnostico o teranostico (medico e diagnostico).
Preferibilmente, se le nanoparticelle sono fornite per uso medico, possono essere indirizzate al trattamento di varie malattie; per esempio, una qualsiasi delle malattie selezionate dal gruppo costituito da: cancro, malattie cerebrali, ictus ischemico, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, diabete, degenerazione del disco intervertebrale, infarto del miocardio, broncopneumopatia cronica ostruttiva.
Secondo una forma di realizzazione preferita, combinazioni di linee cellulari selezionate dal gruppo costituito da U-251 MG, U87 MG, T98G, SH-SY5Y, SH-SY5Y simili a cellule neurali, hCMEC/D3 e loro combinazioni sono fornite per uso medico, preferibilmente per il trattamento di cancro, ictus ischemico, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, diabete, degenerazione del disco intervertebrale, infarto miocardico o broncopneumopatia cronica ostruttiva.
Preferibilmente, le nanoparticelle ottenute da (U-251 MG hCMEC/D3) e da (U-251 MG hCMEC/D3 T98G) possono essere usate per il trattamento di malattie cerebrali tra cui glioblastoma.
Preferibilmente, le nanoparticelle ottenute da hCMEC/D3 cellule neurali (differenziate SH-SY5Y) possono essere usate per il trattamento dell'ictus ischemico.
Preferibilmente, se fornite per uso diagnostico, le nanoparticelle possono essere indirizzate alla diagnosi di varie malattie, come malattia tiroidea, feocromocitoma, neuroblastoma, metastasi ossee, tumori neuroendocrini.
Pi? preferibilmente, le nanoparticelle sono per l'uso nel trattamento e/o nella diagnosi di malattie cerebrali, preferibilmente selezionate dal gruppo costituito da tumori cerebrali, ictus ischemico, morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer.
Secondo una forma di realizzazione preferita, le nanoparticelle sono per l'uso nel trattamento e/o nella diagnosi di tumori cerebrali selezionati dal gruppo costituito da gliomi e neuroblastomi.
ESEMPIO
A scopi illustrativi e non limitativi, viene qui presentato un esempio del metodo e delle nanoparticelle secondo l'invenzione.
1. Protocollo di fabbricazione di nanoparticelle di membrane cellulari fuse (F-CMNP), ottenute da 3 linee cellulari diverse, caricate con l'inibitore di glucosio (2E)-3-(3-piridinil)-1-(4-piridinil)-2-propen-1-one (3PO), usato come farmaco modello.
1. Sottoporre a coltura cellule hCMEC/D3, U251 e SY-SY5Y fino all'80%, 80% e 50% della confluenza, rispettivamente
2. Tripsinizzare ciascuna linea cellulare separatamente e raccogliere le cellule (10x10<6 >per ciascuna linea cellulare) mediante centrifugazione a 2000 giri al minuto per 5 minuti a 25 ?C.
3. Rimuovere i surnatanti e ridisperdere le cellule in 1 ml di acqua distillata sterile all'interno di un recipiente di plastica (ad esempio, una provetta Falcon), che successivamente viene posizionato a -20 ?C o -80 ?C per almeno 1 ora. Ogni linea cellulare deve essere in una provetta Falcon diversa.
4. Eseguire un ciclo di congelamento-scongelamento per 3 volte per ciascuna provetta Falcon.
5. Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile e trasferire le cellule in un omogeneizzatore ad alta pressione. Sottoporre le cellule lisate a passaggio 10 volte a una pressione dell'aria esterna di 20 psi (pressione di omogeneizzazione di 6000 psi). Ogni linea cellulare separatamente.
6. Far ruotare le cellule lisate a 10000 giri al minuto per 10 minuti e raccogliere il surnatante. Ripetere la rotazione altre 2 volte e raccogliere sempre il surnatante. Ogni linea cellulare deve essere pulita separatamente.
7. Successivamente trasferire i campioni in filtri Amicon con un cut-off di peso molecolare pari a 100 kDa, e far ruotare 3 volte a 5000 giri al minuto per 10 min. Ridisperdere sempre in acqua distillata sterile. Al termine della terza rotazione, ridisperdere ciascun materiale sulla parte superiore dei filtri Amicon in 333 ?l di acqua distillata sterile.
8. Mescolare le tre membrane cellulari estratte (rapporto 1:1:1) e aggiungere il farmaco [(2E)-3-(3-piridinil)-1-(4-piridinil)-2-propen-1-one)] disperso in 1 ml di acqua distillata sterile. Per le nanoparticelle non caricate mescolare solo le membrane cellulari con un rapporto 1:1:1.
9. Trasferire la dispersione mista nell'omogeneizzatore ad alta pressione e omogeneizzare il campione (misto) a 120 psi (36000 psi di pressione di omogeneizzazione) mantenendo lo stesso numero di passaggi (10 passaggi). (La pressione di omogeneizzazione, come descritta dal produttore, ? 300 volte superiore alla pressione dell'aria esterna).
10. Far ruotare 2 volte a 5000 giri al minuto per 10 minuti, e raccogliere il surnatante.
11. Trasferire i campioni in filtri Amicon con cut-off di peso molecolare pari a 100 kDa e far ruotare 3 volte a 5000 giri al minuto. Questa volta conservare il precipitato nella parte superiore del filtro e ridisperderlo in 500 ?l di acqua distillata sterile.
12. Filtrare il campione usando un filtro a siringa da 0,2 ?m e conservare a 4 ?C fino a ulteriore uso. La soluzione sul fondo dei filtri Amicon pu? essere utilizzata per la quantificazione del caricamento.
2. Prototipo delle nanoparticelle - caratterizzazione
Le F-CMNP fabbricate hanno una morfologia sferica (figura 1) e una dimensione media di < 200 nm come ? stato calcolato da immagini di microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione (SEM).
Il diametro idrodinamico medio delle CMNP, cos? come ? stato calcolato dalle misurazioni di diffusione dinamica della luce (DLS) (figura 2), varia da 200 a 220 nm, mentre la loro carica superficiale varia da -10 a -15 mV.
La presenza di proteine sulla superficie delle F-CMNP ? stata dimostrata usando saggio di elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato poli acrilammide (SDS-PAGE) e i risultati sono presentati nella figura 3. Come controllo positivo sono state usate nanoparticelle a base di lipidi fatti da sfingomielina e funzionalizzate con il peptide angiopep-2 (SM-AP2).
La capacit? di bersagliamento multiplo delle F-CMNP ? stata dimostrata dopo aver eseguito esperimenti di interiorizzazione, utilizzando diverse linee cellulari raffigurate nella figura 4. I dati di interiorizzazione suggeriscono che la capacit? di bersagliamento omologa pu? essere utilizzata solo in linee cellulari specifiche e non pu? essere generalizzata per la maggior parte di esse. Inoltre, questi dati suggeriscono che una corretta combinazione di membrane cellulari e successivamente la corretta combinazione di recettori di superficie pu? risultare in una pi? rapida e specifica interiorizzazione di diverse linee cellulari.
Da questi dati preliminari si pu? anche supporre che la corretta combinazione di proteine di superficie non solo fornisca una capacit? di bersagliamento multiplo, ma pu? anche fornire una capacit? di multi-evasione dalle cellule dei sistemi fagocitici.
Infine, la corretta combinazione di membrane cellulari e dei successivi recettori di superficie pu? migliorare l'interiorizzazione mediante linee cellulari specifiche, in particolare rispetto alla robusta tecnica di bersagliamento peptidico che utilizza peptidi specifici come l'angiopep-2.
? stata anche studiata la capacit? delle F-CMNP di agire come sistemi di rilascio di farmaci. I risultati che sono presentati nella figura 5, hanno mostrato che le F-CMNP sono altamente biocompatibili, ma possono anche uccidere le cellule tumorali se viene incapsulata la sostanza chemioterapica appropriata. A riprova del concetto, ? stato caricato l'inibitore del glucosio (2E)-3-(3-piridinil)-1-(4-piridinil)-2-propen-1-one (3PO) nelle F-CMNP. I dati nella figura 5 mostrano che a una concentrazione dell'inibitore pari a 5 ?M, l'inibitore libero non influenza la proliferazione delle cellule U-251, al contrario di quello incapsulato (alla stessa concentrazione dell'inibitore libero calcolata mediante cromatografia liquida ad alta pressione), che riduce la proliferazione delle cellule del 60% dopo 72 ore.
Tutti i dati presentati mostrano che le nanoparticelle derivate da membrane cellulari fuse possono agire come una sostanza teranostica versatile senza rivali.
Claims (12)
1. Metodo per la produzione di nanoparticelle derivate da membrane cellulari comprendendo le fasi di:
I) fornire da due a quattro colture cellulari, ciascuna coltura cellulare essendo di una linea cellulare diversa, e raccogliere un predeterminato numero di cellule da ciascuna linea cellulare;
II) lisare il numero predeterminato di cellule di ciascuna linea cellulare per ottenere lisati di ciascuna linea cellulare;
III) estrarre le membrane cellulari dal lisato di ciascuna linea cellulare per ottenere dispersioni di membrane cellulari di ciascuna linea cellulare;
IV) miscelare la dispersione della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare in quantit? tali che il corrispondente numero predeterminato di cellule raccolte da ciascuna linea cellulare rappresenti da 0,25 a 4 parti del numero totale di cellule raccolte nella fase (I), e aggiungere una soluzione o una dispersione acquosa contenente un ingrediente terapeutico o diagnostico per ottenere una dispersione mista;
V) omogeneizzare della dispersione miscelata a una pressione dell'aria esterna compresa tra 80 e 167 psi, con un numero di passaggi compreso tra 6 e 14, per formare una dispersione contenente una pluralit? di nanoparticelle;
VI) isolare della pluralit? di nanoparticelle dalla dispersione che le contiene.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase di lisi II comprende le sottofasi di
- lisare la coltura di ciascuna linea cellulare da 2 a 4 volte per ottenere lisati preliminari di ciascuna linea cellulare;
- omogeneizzare il lisato preliminare di ciascuna linea cellulare a una pressione dell'aria esterna compresa tra 16 e 24 psi, con un numero di passaggi compreso tra 6 e 14 per ottenere il lisato di ciascuna linea cellulare.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la lisi viene eseguita mediante un metodo meccanico selezionato nel gruppo costituito da: estrusione, sonicazione, omogeneizzazione, congelamento-scongelamento, elettroporazione, distruzione meccanica e lisi cellulare mediante additivi/adiuvanti.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui la fase di estrazione III comprende le sottofasi di
- centrifugazione da 1 a 4 volte del lisato di ciascuna linea cellulare a 4.000 a 12.000 giri al minuto per 4 a 12 minuti a 4 ?C, raccogliendo ogni volta il surnatante;
- centrifugazione da 2 a 4 volte del surnatante a 2.000 a 8.000 giri al minuto per 8-12 minuti a 4 ?C, utilizzando un filtro centrifugo con un cut-off di 100 kDa, raccogliendo ogni volta la frazione non filtrata del surnatante, al fine di ottenere la dispersione della membrana cellulare di ciascuna linea cellulare.
5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la fase di isolamento VI viene eseguita ripetendo le sottofasi della fase di estrazione III sulla dispersione contenente la pluralit? di nanoparticelle, in modo da isolare la pluralit? di nanoparticelle dalla dispersione.
6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui ciascuna linea cellulare ? una linea cellulare animale o umana indipendentemente selezionata dal gruppo costituito da linee cellulari primarie e linee cellulari immortalizzate.
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui l'ingrediente terapeutico ? selezionato dal gruppo costituito da inibitori metabolici, inibitori dello stress ossidativo, antiossidanti, agenti antinfiammatori, agenti antitumorali, agenti neuroprotettivi, antibiotici, antidepressivi, anticoagulanti, antifungini, agenti antidiabetici, agenti antipertensivi.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui l'ingrediente diagnostico ? selezionato dal gruppo costituito da agenti di contrasto, radiofarmaci.
9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui l'ingrediente terapeutico o diagnostico ha una massa molecolare compresa tra 100 e 900 Da.
10. Nanoparticelle di membrana cellulare comprendenti
- un guscio esterno contenente membrane cellulari derivanti da un predeterminato numero di cellule da due a quattro differenti linee cellulari, il guscio contenente membrane cellulari di ciascuna linea cellulare in quantit? tali che il corrispondente predeterminato numero di cellule di ciascuna linea cellulare rappresenti da 0,25 a 4 parti del numero totale di cellule di tutte le linee cellulari,
- un nucleo interno costituito da una soluzione o dispersione acquosa contenente un ingrediente terapeutico o diagnostico,
caratterizzato da una capacit? di caricamento percentuale compresa tra il 10% e il 25%.
11. Nanoparticelle di membrana cellulare secondo la rivendicazione 10, ottenute con il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9.
12. Nanoparticelle di membrana cellulare secondo la rivendicazione 10 o 11 per uso medico e/o diagnostico.
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