ES2844502T3 - Nanovesículas derivadas de la membrana celular y uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Nanovesículas, en las que las nanovesículas se derivan de membranas de células, cuyos componentes intracelulares se han eliminado tratando las células con una disolución alcalina de pH 9 a 14, y el tamaño de las nanovesículas es menor que el tamaño de las células.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanovesículas derivadas de la membrana celular y uso de las mismas
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a nanovesículas derivadas de la membrana celular, a un método de preparación de las mismas y a una composición farmacéutica que comprende las nanovesículas.
[Técnica anterior]
Cuando se administra un fármaco a un individuo para el tratamiento de enfermedades, es importante un sistema de suministro de fármacos (DDS) que controle el suministro y la liberación del fármaco administrado a células, tejidos y órganos para lograr una eficacia óptima. El sistema de suministro de fármacos se usa para mantener concentraciones sanguíneas adecuadas de un fármaco para lograr el máximo efecto terapéutico. Cuando se aplica el sistema de suministro de fármacos, pueden lograrse ventajas tales como maximizar la eficacia y estabilidad de un fármaco, prolongar el tiempo de residencia de un fármaco, aumentar la biodisponibilidad de un fármaco y minimizar los efectos secundarios de un fármaco. Por tanto, el sistema de suministro de fármacos es una técnica médica requerida para suministrar eficientemente un fármaco a partes específicas del cuerpo y se considera tan importante como la propia medicina. Desde principios de la década de 1960, se han desarrollado sistemas de suministro de fármacos en forma de inyección e infusión, en forma de supositorios, para administración nasal y oral, y para administración a través de la piel o los pulmones. En los últimos años, se han desarrollado diversos sistemas de suministro de fármacos (DDS), tales como DDS promotores de la absorción y controlados (orales, transdérmicos, mucosos), DDS sostenidos (inyecciones, orales, transdérmicos), DDS dirigidos (orales, inyecciones, etc.) y DDS de inteligencia artificial (inteligentes) (de tipo a demanda) y se han aplicado de manera diferente según los pacientes y el fin de uso.
Entre los DDS, los liposomas se han estudiado ampliamente como sistema de suministro de fármacos desde que los liposomas se usaron por primera vez en la década de 1960. Los liposomas son membranas artificiales similares a las membranas celulares hechas de diversos fosfolípidos, y pueden considerarse como dispersantes semisólidos coloidales con un tamaño de partícula a nanoescala. Las preparaciones liposomales tienen baja toxicidad y son altamente aplicables puesto que el tamaño, la carga, la composición de la membrana y la permeabilidad de la membrana de las preparaciones liposomales pueden controlarse según la prescripción. Recientemente, se han desarrollado liposomas sigilosos preparados mediante la conjugación de liposomas con un polímero tal como polietilenglicol (PEG). Los liposomas sigilosos aumentan la semivida circulatoria de los fármacos evitando que los liposomas que contienen fármacos se eliminen fácilmente de la sangre. Usando este método, se ha comercializado DOXIL que suministra doxorrubicina, un agente anticanceroso. Sin embargo, dado que los liposomas y los liposomas sigilosos carecen de la capacidad de reconocer tipos específicos de células, los liposomas y liposomas sigilosos no pueden usarse con el propósito de suministrar fármacos a tipos específicos de células o tejidos. Para permitir que los liposomas se unan a dianas específicas, se han desarrollado liposomas conjugados con anticuerpos específicos para una sola diana, pero ninguno se ha comercializado después de pasar los ensayos clínicos.
Por tanto, está desarrollándose un sistema de suministro usando membranas celulares naturales en lugar de liposomas hechos de lípidos sintetizados artificialmente. Dado que los sistemas de suministro derivados de células utilizan los sistemas de direccionamiento naturales de las células, a diferencia de los sistemas de suministro convencionales, tales como los liposomas, el direccionamiento puede inducirse fácilmente. Como ejemplo representativo, están en marcha estudios sobre el suministro de fármacos usando vesículas extracelulares que se secretan de manera natural a partir de células. Además, se han notificado estudios sobre la carga de diversos fármacos, tales como fármacos anticancerígenos, en nanovesículas (microvesículas) preparadas artificialmente a partir de células de mamíferos nucleadas y el suministro de las nanovesículas a tejidos cancerosos.
Sin embargo, además de las sustancias requeridas para su direccionamiento, las vesículas extracelulares y las nanovesículas preparadas artificialmente a partir de células incluyen componentes intracelulares, tales como proteínas citosólicas y materiales genéticos (ADN y ARN), que son innecesarios para el direccionamiento. Los componentes innecesarios para su direccionamiento tienen el potencial de disminuir la eficiencia de carga de fármacos o de inducir efectos secundarios cuando se administran al organismo, y por tanto el desarrollo de sistemas que carezcan de sus componentes intraluminales es esencial. El documento EP 2589377 A2 se refiere a microvesículas derivadas de un protoplasto que es una célula bacteriana, arquea, fúngica o vegetal o similares de las que se elimina la pared celular, y que comprenden el principio activo o material de diagnóstico.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Los presentes inventores han realizado estudios para solucionar los problemas convencionales descritos anteriormente. Como resultado, los inventores han encontrado que, cuando se tratan células con una disolución alcalina de pH 9 a 14, las membranas de las células a partir de las que se eliminan componentes intracelulares, tales como materiales genéticos y proteínas citosólicas, pueden extraerse selectivamente y que pueden prepararse nanovesículas usando estas membranas celulares extraídas. Por tanto, se completó la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a proporcionar nanovesículas, en las que las nanovesículas se derivan de las membranas de células, los componentes intracelulares, incluyendo material genético y proteínas citosólicas, están ausentes de las nanovesículas y el tamaño de las nanovesículas es menor que el tamaño de las células.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de preparación de las nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades.
Sin embargo, los problemas técnicos que van a solucionarse por la presente invención no se limitan a los problemas mencionados anteriormente, y otros problemas no mencionados pueden entenderse claramente por los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción.
[Solución técnica]
Un aspecto de la presente invención tal como se define en la reivindicación 1 proporciona nanovesículas, en el que las nanovesículas se derivan de las membranas de células, los componentes intracelulares, incluyendo material genético y proteínas citosólicas, están ausentes de las nanovesículas, y el tamaño de las nanovesículas es menor que el de las células.
Otro aspecto de la presente invención tal como se define en la reivindicación 4 proporciona una composición farmacéutica para suministrar sustancias, incluyendo las nanovesículas cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades.
Otro aspecto todavía de la presente invención tal como se define en la reivindicación 8 proporciona un método de preparación de las nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, incluyendo el método las siguientes etapas:
(a) una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14;
(b) una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico a una suspensión que contiene las membranas de las células a partir de las que se han eliminado los materiales intracelulares;
(c) una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a la suspensión a la que se añaden las sustancias terapéuticas o de diagnóstico; y
(d) una etapa de separación de las nanovesículas preparadas de la suspensión.
Otro aspecto más de la presente invención tal como se define en la reivindicación 8 proporciona un método de preparación de nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, incluyendo el método las siguientes etapas:
(a) una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14;
(b) una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a una suspensión que contiene las membranas de las células a partir del que se han eliminado los materiales intracelulares;
(c) una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico en la suspensión que contiene las nanovesículas y de incubar la mezcla; y
(d) una etapa de separar las nanovesículas incubadas de la suspensión.
Las realizaciones específicas de la presente invención son las definidas en las reivindicaciones dependientes.
[Efectos ventajosos]
Las nanovesículas derivadas de la membrana celular según la presente invención pueden impedir que aparezcan posibles efectos secundarios porque los materiales intracelulares o intraluminales (por ejemplo, materiales genéticos y proteínas citosólicas) innecesarios para el suministro de sustancias terapéuticas o de diagnóstico se eliminan de las vesículas extracelulares y nanovesículas artificiales. Además, dado que las nanovesículas pueden dirigirse a los tipos específicos de células o tejidos, pueden suministrarse predominantemente sustancias terapéuticas o de diagnóstico a las células o tejidos seleccionados como diana, mientras que el suministro de sustancias terapéuticas o de diagnóstico a sitios no seleccionados como diana puede inhibirse. Por tanto, cuando las nanovesículas derivadas de la membrana celular se aplican al tratamiento de enfermedades, los efectos secundarios de sustancias terapéuticas tales como fármacos pueden reducirse, de modo que el sufrimiento y los inconvenientes de los pacientes pueden aliviarse durante el transcurso del tratamiento de enfermedades, y puede mejorarse la eficacia terapéutica. Además, las nanovesículas derivadas de la membrana celular de la presente invención, en las que se cargan sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, y un método de preparación de las nanovesículas, pueden usarse in vitro o in vivo con fines terapéuticos o de diagnóstico, o para uso experimental.
[Descripción de los dibujos]
La figura 1 ilustra nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas o células de mamíferos nucleadas transformadas y muestra un diagrama esquemático de un método de preparación de las nanovesículas cargadas de diversas sustancias, tales como sustancias de direccionamiento y sustancias terapéuticas y de diagnóstico.
La figura 2A muestra una imagen de microscopio electrónico de transmisión de nanovesículas preparadas a partir de células de mamíferos nucleadas usando tratamiento con disolución alcalina, sonicación y un método de gradiente de densidad.
La figura 2B es un gráfico que muestra el tamaño de nanovesículas preparadas a partir de células de mamíferos nucleadas usando tratamiento con disolución alcalina, sonicación y un método de gradiente de densidad.
La figura 3 es un gráfico que muestra el tamaño de nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas transformadas.
La figura 4 muestra resultados de inmunotransferencia de tipo Western que confirman que las proteínas citoplasmáticas y nucleoproteínas están ausentes en nanovesículas derivadas de células nucleadas y que está presente una gran cantidad de proteínas de membrana.
La figura 5 muestra los resultados de RT-PCR en tiempo real y RT-PCR que confirman que el ADN y el ARN no están presentes en nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas.
La figura 6 muestra que la topología de las nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas es normal. Esto se confirmó al determinar si se expresaban una proteína ICAM1 de nanovesículas derivada de células de mamíferos nucleadas y una proteína EGFP cargada en las nanovesículas, después del tratamiento con tripsina.
La figura 7 muestra la unión de colesterol-polietilenglicol-biotina a las membranas de bicapa de nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas.
La figura 8 muestra imágenes de microscopio de fluorescencia que confirman que se cargó FITC-ARNip en nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas.
La figura 9 muestra imágenes de microscopio de fluorescencia que confirman que se cargó Qdot 705 en nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas.
La figura 10 muestra una imagen que confirma que se cargaron nanopartículas de óxido de hierro en nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas. Las nanopartículas de óxido de hierro se cargaron en la nanovesículas usando un método de gradiente de densidad en una disolución de Optiprep.
La figura 11 muestra que, en condiciones de tratamiento con TNF-a , pueden usarse nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas para suministrar doxorrubicina a células diana y que aumentó la muerte celular inducida por doxorubicina cuando se usaron las nanovesículas.
La figura 12 muestra que, en condiciones de tratamiento con TNF-a , pueden usarse nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas para suministrar ribonucleasa A (RNasa A) a células diana y que aumentó la muerte celular inducida por ribonucleasa A cuando se usaron las nanovesículas.
La figura 13 muestra que las nanovesículas derivadas de células nucleadas transformadas pueden usarse para suministrar doxorrubicina o RNasa A a tipos específicos de células y que aumentó la muerte celular inducida por doxorubicina o RNasa A cuando se usaron las nanovesículas.
La figura 14 muestra que pueden usarse nanovesículas derivadas de células nucleadas transformadas para suministrar específicamente doxorrubicina a células de cáncer de pulmón humanas y que aumentó la muerte celular inducida por doxorubicina cuando se usaron las nanovesículas.
[Modos de la invención]
La presente invención proporciona nanovesículas, en la que las nanovesículas se derivan de las membranas de células, los componentes intracelulares, que incluyen material genético y proteínas citosólicas, están ausentes de las nanovesículas, y el tamaño de las nanovesículas es menor que el de las células.
El interior y el exterior de las nanovesículas de la presente invención se distinguen por una membrana de bicapa lipídica compuesta por los componentes de membrana celular de una célula originaria. Estas nanovesículas incluyen lípidos de membrana celular y proteínas de las células originarias y tienen las mismas topologías que las células originarias. Sin embargo, los materiales intracelulares, tales como material genético (por ejemplo, ácidos nucleicos) y proteínas citosólicas, se eliminan de las nanovesículas, y el tamaño de las nanovesículas puede ser menor que el de la célula originaria, sin limitarse a lo mismo.
La disolución alcalina de la presente invención puede prepararse usando uno o más seleccionados del grupo que consiste en carbonato de sodio (Na2CO3), hidróxido de sodio (NaOH), amoníaco (NH3), hidróxido de calcio (Ca(OH)2), hidróxido de potasio (KOH), hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) e hidróxido de magnesio (Mg(OH)2), sin limitarse a los mismos.
Las células de la presente invención pueden seleccionarse del grupo que consiste en monocitos, macrófagos, células dendríticas y células madre como células de mamíferos nucleadas, y también pueden seleccionarse del grupo que consiste en células diferenciadas de células madre, y en particular, pueden incluir células transformadas que se dirigen a tipos específicos de células o tejidos. Específicamente, las células transformadas pueden incluir diversos tipos de células, que se transforman para expresar sustancias terapéuticas y de diagnóstico, sustancias de direccionamiento o sustancias necesarias para la fusión de la membrana celular con las células diana, y las células transformadas pueden incluir una combinación de dos o más de los tipos de células anteriores, sin limitarse a los mismos.
Las células de mamíferos nucleadas pueden transformarse mediante tratamiento material o introducción génica, transformarse más de una vez y transformarse para inhibir la expresión de una o más proteínas específicas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “transformación” se refiere a un método para aumentar o disminuir la expresión de sustancias tales como proteínas mediante la estimulación de células y un método para cambiar la expresión de proteínas por introducción génica, y pueden usarse métodos usados comúnmente en la técnica. Como métodos para aumentar o inhibir la expresión de proteínas específicas por introducción génica, pueden ejemplificarse interferencia de ARN (iARN), métodos mediados por virus, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, electroporación, microinyección, métodos mediados por ultrasonidos y similares, y pueden usarse todos los métodos conocidos en general.
Las células de la presente invención pueden ser células transformadas que expresen uno o más seleccionados del grupo que consiste en moléculas de adhesión celular, anticuerpos, proteínas de direccionamiento, proteínas de fusión de membranas celulares y proteínas de fusión de las mismas, y también pueden ser células transformadas que expresan uno o más seleccionados del grupo que consiste en factores de crecimiento, citocinas, receptores, proteínas fluorescentes y proteínas de fusión de los mismos, sin limitarse a los mismos.
Las membranas de las nanovesículas de la presente invención pueden incluir sustancias de direccionamiento, sustancias necesarias para la fusión de membranas celulares con células diana (por ejemplo, fusógeno), ciclodextrina, polietilenglicol y similares, además de las membranas celulares de las células originarias, y los componentes distintos de las membranas celulares pueden añadirse mediante diversos métodos, incluyendo modificación química de las membranas celulares.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para suministrar sustancias, que incluye las nanovesículas cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades.
Según la presente invención, las nanovesículas pueden prepararse en diversos tamaños dependiendo de los tejidos seleccionados como diana por sustancias de diagnóstico o terapéuticas, y el tamaño de las nanovesículas es preferiblemente de 10 nm o más y 10 |im o menos.
Las sustancias que van a cargarse en las nanovesículas de la presente invención no están particularmente limitadas, y pueden ser sustancias terapéuticas o de diagnóstico. Además, pueden cargarse sustancias preparadas fuera de las células, y las sustancias cargadas pueden numerarse como una o más.
Las sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades pueden ser una o más seleccionadas del grupo que consiste en agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de la angiogénesis, péptidos, proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, perlas, micropartículas y nanopartículas, sin limitarse a los mismos.
Los ácidos nucleicos pueden seleccionarse del grupo que consiste en ADN, ARN, aptámeros, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos peptidonucleicos (PNA) y morfolinos, y las nanopartículas pueden seleccionarse del grupo que consiste en óxidos de hierro, oro, nanotubos de carbono y perlas magnéticas, sin limitarse a los mismos.
Las sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades según la presente invención pueden ser materiales emisores de fluorescencia, preferiblemente proteínas fluorescentes o puntos cuánticos, sin limitarse a los mismos.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener uno o más de agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de la angiogénesis, péptidos, proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, perlas, micropartículas o nanopartículas como principios activos. Además, la composición farmacéutica puede mezclarse con portadores farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, agua esterilizada, disolución de Ringer, solución salina tamponada, ciclodextrina, una disolución de dextrosa, una disolución de maltodextrina, glicerol, etanol, liposomas y uno o más de estos portadores, y la composición farmacéutica puede contener además otros aditivos convencionales tales como antioxidantes, tampones, y similares, cuando se desee. Además, pueden añadirse adicionalmente diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes o lubricantes a la composición farmacéutica, y por tanto la composición farmacéutica puede formularse en formulaciones inyectables, tales como disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos. Además, la composición farmacéutica puede formularse adecuadamente según cada componente usando métodos apropiados en la técnica o métodos dados a conocer en la referencia de Remington (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA). La composición farmacéutica de la presente invención no está particularmente limitada en su formulación, sino que se formula preferiblemente como inyección o inhalante.
El método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención no está particularmente limitado, sino que la composición farmacéutica puede administrarse por vía parenteral, tal como por ejemplo por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación o aplicación tópica, u oral, dependiendo del propósito. La dosificación puede determinarse de forma variada dependiendo del peso corporal del paciente, la edad, el sexo, el estado de salud, la dieta, el momento de administración, los métodos de administración, la cantidad de excreción y la gravedad de las enfermedades. La dosis diaria se refiere a la cantidad de una sustancia terapéutica capaz de aliviar el estado patológico tras la administración de la sustancia terapéutica a un individuo que necesita tratamiento. La cantidad eficaz de la sustancia terapéutica depende de los compuestos particulares, el estado patológico y la gravedad de la enfermedad de los individuos que necesitan tratamiento, que pueden determinarse de manera rutinaria por los expertos habituales en la técnica. Como ejemplo no limitante, la dosificación de la composición de la presente invención a un organismo humano puede variar dependiendo de la edad del paciente, el peso, el sexo, la forma de dosificación, el estado de salud y la gravedad de la enfermedad. Basándose en un paciente adulto que pesa 70 kg, la dosis es generalmente de 0,1 a 1.000 mg/día, preferiblemente de 1 a 500 mg/día. La composición también puede administrarse de manera dividida una o varias veces al día a intervalos de tiempo regulares.
Además, la presente invención proporciona un método de preparación de nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, incluyendo el método una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14; una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico a una suspensión que contiene las membranas de las células a partir de las que se han eliminado los materiales intracelulares; una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a la suspensión a la que se añaden las sustancias terapéuticas o de diagnóstico; y una etapa de separar las nanovesículas preparadas a partir de la suspensión.
Además, la presente invención proporciona un método de preparación de nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas de sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, incluyendo el método una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14; una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a una suspensión que contiene las membranas de las células a partir de las que se han eliminado los materiales intracelulares; una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico a la suspensión que contiene las nanovesículas y de incubar la mezcla; y una etapa de separar las nanovesículas incubadas de la suspensión.
El método de la presente invención puede incluir además una etapa de extruir las nanovesículas preparadas por el método de sonicación.
En la presente invención, se prepararon nanovesículas a partir de una línea celular de monocitos, U937, y células HEK293 y HT1080 transformadas usando el método de preparación de las nanovesículas, es decir, usando tratamiento con disolución alcalina, sonicación y método de gradiente de densidad (véase el ejemplo 1).
En una realización de la presente invención, cuando se determinaron la forma y el tamaño de las nanovesículas preparadas a partir de monocitos y células transformadas, las nanovesículas estaban en forma de una bicapa lipídica esférica, y las nanovesículas derivadas de monocitos presentaban un tamaño de 100 a 200 nm, es decir, 180 nm en promedio, mientras que las nanovesículas derivadas de células transformadas presentaban un tamaño de 70 a 150 nm, es decir, 100 nm en promedio.
Además, cuando se realizó inmunotransferencia de tipo Western en las nanovesículas derivadas de monocitos y células de monocitos para determinar los niveles de expresión de p-actina (proteína citoplasmática), H2B (nucleoproteína), GM130, LFA1 e ICAM1 (proteínas de membrana celular), las nanovesículas no contenían proteínas citoplasmáticas ni nucleoproteínas, mientras que las proteínas de la membrana celular se expresaban en las nanovesículas. Además, como resultado de la PCR en tiempo real, se confirmó que las nanovesículas no contienen ADN ni ARN, es decir, ácidos nucleicos, a diferencia de células de monocitos. Como resultado del análisis de la topología de las nanovesículas, las proteínas de membrana de las nanovesículas estaban ubicadas fuera de las nanovesículas, al igual que las proteínas de membrana de células de monocitos. Es decir, las proteínas de membrana de las nanovesículas mantuvieron la misma topología que las proteínas de membrana de las células de monocitos (véase el ejemplo 2).
En otra realización de la presente invención, se prepararon nanovesículas que contenían polietilenglicol añadiendo colesterol-polietilenglicol-biotina a las nanovesículas derivadas de monocitos preparadas según el método del ejemplo 1. Después de eso, se añadió estreptavidina-HRP a las nanovesículas, seguido de incubación. Después de la incubación, se añadió BM-POD como sustrato a las mismas para medir la cantidad de desarrollo del color. Como resultado, se confirmó que el colesterol-polietilenglicol-biotina estaba unido a las nanovesículas que contenían polietilenglicol (véase el ejemplo 3).
En otra realización de la presente invención, cuando se prepararon las nanovesículas usando un tratamiento con disolución alcalina, sonicación y un método de gradiente de densidad según el método del ejemplo 1, en la etapa de realizar la sonicación, se cargaron cada uno de FITC-ARNip, Qdot 705 o nanopartículas de óxido de hierro en las nanovesículas, y se prepararon las nanovesículas que contenían cada uno de FITC-ARNip, Qdot 705 o nanopartículas de óxido de hierro. Después de la preparación, se inspeccionó si cada sustancia se cargó debidamente en las nanovesículas. La observación por microscopía de fluorescencia reveló que cada uno de FITC-ARNip y Qdot 705 se cargó correctamente en las nanovesículas. Además, el método de gradiente de densidad usando una disolución de Optiprep confirmó que las nanopartículas de óxido de hierro también se cargaron en las nanovesículas (véanse los ejemplos 4 a 6).
En otra realización de la presente invención, se demostró que el suministro de fármacos a nivel celular y el suministro de fármacos específico de célula son posibles cuando se usan nanovesículas derivadas de monocitos. Se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con doxorrubicina como fármaco químico o ribonucleasa A (RNasa A) como fármaco proteico. Después de eso, se trataron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), una línea celular de vasos sanguíneos humanos, con TNF-a para activar las HUVEC, dando como resultado una mayor expresión de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina en las membranas celulares. Se confirmó si las nanovesículas derivadas de monocitos reconocen estas moléculas y los fármacos se suministran a células diana. Como resultado, cuando se trató con TNF-a , tanto la doxorrubicina como la RNasa A se suministraron a HUVEC e indujeron muerte celular dependiendo de la concentración de tratamiento de las nanovesículas (véase el ejemplo 7).
En otra realización de la presente invención, se verificó la capacidad de suministro de fármaco de nanovesículas derivadas de células transformadas a nivel celular. Después de la preparación de nanovesículas cargadas con doxorrubicina o RNasa a partir de células transformadas HT1080 que sobreexpresan ICAM1, se trataron células de monocitos U937 con diferentes concentraciones de las nanovesículas preparadas y se incubaron durante 24 horas. Después de la incubación, las células de monocitos se tiñeron con una disolución de azul trípano para medir el grado de muerte celular. Como resultado, los fármacos se suministraron a las células de monocitos mediante las nanovesículas y en el caso de las células de monocitos se trataron con nanovesículas cargadas con doxorubicina, se indujo muerte celular a una concentración de 5 |i g/ml o más y en el caso de la RNasa A, se indujo muerte celular a una concentración de 10 |i g/ml o más (véase el ejemplo 8).
En otra realización de la presente invención, se prepararon nanovesículas a partir de células transformadas que expresaban moléculas de adhesión tales como EGF y GE11 que se ubicaban en las membranas de las células transformadas y eran capaces de unirse a EGFR expresado en las membranas celulares de A549, una línea celular de cáncer de pulmón humano. Entonces, se confirmó la capacidad de suministro de fármaco de las nanovesículas derivadas de células transformadas. Las nanovesículas cargadas con doxorrubicina se añadieron a placas sembradas con células A549 y se incubaron. Después de la incubación, se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia. Como resultado, se observó muerte celular. Basándose en el resultado, se confirmó que GE11 y EGF presentes en nanovesículas, que se han derivado de células transformadas que expresan EGF y GE11 en sus membranas celulares y cargado con fármacos anticancerosos, pueden unirse específicamente a células que expresan EGFR en la superficie celular y los fármacos anticancerígenos cargados pueden suministrarse a las células para inducir muerte celular (véase el ejemplo 9).
A continuación en el presente documento, se describen ejemplos preferidos para facilitar la comprensión de la presente invención. Sin embargo, los siguientes ejemplos se proporcionan solo para facilitar la comprensión de la presente invención, y la presente invención no está limitada por los siguientes ejemplos.
[Ejemplos]
Ejemplo 1. Preparación de nanovesículas mediante tratamiento con disolución alcalina y sonicación
Para preparar nanovesículas derivadas de células de mamíferos nucleadas o células de mamíferos nucleadas transformadas de las que se habían eliminado componentes intracelulares, se sometieron monocitos o células transformadas a tratamiento con disolución alcalina, sonicación y un método de gradiente de densidad, y en la figura 1 se muestra un diagrama esquemático para la preparación de las nanovesículas.
Se usaron 8 * 107 células U937 (ATCC n.° CRL-1593.2) como monocitos y se usaron 4 * 107 células HEK293 (ATCC n.° CRL-1573) o 4 * 107 células HT1080 (ATCC n.° CCL-121) como células transformadas. Cada tipo celular se trató con 8 ml de una disolución alcalina (Na2CO3200 mM, 1* inhibidor de fosfatasa, pH 11,5), la disolución se sonicó 30 veces con un sonicador en las condiciones de ciclo: 0,5 y amplitud: 50, y se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 15 minutos para obtener un sedimento. Se resuspendió el sedimento en 8 ml de la disolución alcalina, se almacenó en un conjunto de rotor a 4°C durante 30 minutos y se sometió a ultracentrifugación a 100.000 * g durante 15 minutos para obtener un sedimento. Se resuspendió el sedimento obtenido con 10 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBS) y se sometió de nuevo a ultracentrifugación a 100.000 * g durante 15 minutos para obtener un sedimento. Se suspendió el sedimento con 0,4 ml de una disolución de HBS, se realizó sonicación 30 veces con un sonicador, se realizó sonicación de nuevo durante 30 minutos en un sonicador de baño de agua y se suspendió la disolución con 6,6 ml de una disolución de HBS. A continuación, se añadieron secuencialmente 1 ml de Optiprep al 50%, 2 ml de Optiprep al 10% y 7 ml de la suspensión a un tubo de ultracentrífuga de 11 ml, y se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 2 horas para obtener nanovesículas presentes en la capa entre el Optiprep al 50% y Optiprep al 10%.
Ejemplo 2. Caracterización de nanovesículas
2-1. Identificación de la forma y el tamaño de las nanovesículas
Se analizaron la forma y el tamaño de las nanovesículas derivadas de monocitos y células transformadas preparadas por el método del ejemplo 1. En primer lugar, se observaron las nanovesículas derivadas de monocitos usando un microscopio electrónico de transmisión. Las nanovesículas derivadas de monocitos se absorbieron en una rejilla de cobre recubierta de carbono de descarga luminiscente durante 3 minutos. La rejilla se lavó con agua destilada, se tiñó con acetato de uranilo al 2% durante 1 minuto y se observó con JEM101 (Jeol, Japón), un microscopio electrónico.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 2a, se encontró que las nanovesículas preparadas a partir de monocitos usando tratamiento con disolución alcalina estaban compuestas por bicapas lipídicas, tenían un tamaño de 100 a 200 nm y presentaban una forma generalmente esférica. Además, las nanovesículas preparadas a partir de monocitos se diluyeron en 1 ml de HBS hasta una concentración de 0,5 |ig/ml, se colocó 1 ml de la disolución de HBS que contenía las nanovesículas en una cámara y se analizó con un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas. Tal como se muestra en la figura 2b, el tamaño de las nanovesículas era de 100 a 200 nm y el tamaño promedio era de 180 nm.
Además, se diluyeron nanovesículas preparadas a partir de células transformadas que expresan factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un péptido GE11 (YHWYGYTPQNVI) en 1 ml de HBS hasta una concentración de 5 |ig/ml, se añadió 1 ml de HBS que contenía las nanovesículas a una cubeta y se analizó con un instrumento de dispersión de luz dinámica.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 3, las nanovesículas preparadas a partir de las células transformadas tenían un tamaño de 70 a 150 nm, y el tamaño promedio de las mismas era de 100 nm.
2-2. Verificación de la presencia o ausencia de proteínas citoplasmáticas y nucleoproteínas en nanovesículas derivadas de monocitos
Para determinar si las nanovesículas preparadas a partir de monocitos usando tratamiento con disolución alcalina según el método del ejemplo 1 contenían proteínas citoplasmáticas y nucleoproteínas, se realizó inmunotransferencia de tipo Western sobre las nanovesículas y células de monocitos.
Se prepararon 5 |ig de cada una de las nanovesículas y células de monocitos, se añadió a las mismas 5* colorante de carga (Tris-HCl 250 mM, SDS al 10%, azul de bromofenol al 0,5%, glicerol al 50%) para que fueran finalmente 1*, y luego se trató la mezcla a 100°C durante 5 minutos. Se preparó un gel de poliacrilamida al 12%, se cargaron muestras sobre el gel y se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida a 80 V durante 2 horas. Se realizó un proceso de transferencia a 400 mA durante 2 horas, de modo que las proteínas sobre el gel se transfirieron a una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) por corriente eléctrica. Después de completar el proceso de transferencia, se realizó un proceso de bloqueo mediante el remojo de la membrana en TBS-T al 0,05% (Tween-20) que contenía leche desnatada al 3% y se incubó la membrana durante 2 horas. Después del bloqueo, la membrana se trató con anticuerpos primarios que se unen específicamente a las respectivas proteínas de p-actina, H2B, GM130, LFA1 e ICAM1, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar la membrana tres veces con TBS-T al 0,05% (Tween-20), se trató la membrana con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de eso, se lavó la membrana tres veces con TBST al 0,05% (Tween-20), y luego se determinó la expresión de cada proteína usando quimioluminiscencia potenciada (ECL, Amersham Co. n.° RPN2106), WEST-ZOL (INtRON. n.° 16024) o Femto (Thermo Scientific. n.° 37074).
Tal como se muestra en la figura 4, las células de monocitos expresaron p-actina (ACTB), que es un componente principal del citoesqueleto y está presente en el citoplasma, y H2B, una proteína que constituye una histona en el núcleo, mientras que las nanovesículas (MNV) preparadas usando el tratamiento con disolución alcalina no expresaron p-actina (ACTB) ni H2B. Además, en comparación con las células de monocitos, las nanovesículas preparadas usando tratamiento con disolución alcalina expresaron altamente proteínas de membrana celular tales como LFA-1, ICAM1 y GM130. Basándose en los resultados, las nanovesículas preparadas usando el tratamiento alcalino no expresaron proteínas citoplasmáticas ni nucleoproteínas, tales como p-actina y H2B, mientras que las nanovesículas contenían más proteínas de membrana celular, tales como LFA-1, ICAM1 y GM130, en comparación con las células.
2-3. Verificación de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos en nanovesículas derivadas de monocitos
Para determinar si las nanovesículas preparadas a partir de monocitos usando tratamiento con disolución alcalina según el método del ejemplo 1 contenían ácidos nucleicos, se realizaron RT-PCR en tiempo real y PCR en tiempo real sobre las nanovesículas y células de monocitos.
Se incubaron 100 ng de nanovesículas preparadas a partir de monocitos y 1 * 105 células de monocitos a 95°C durante 10 minutos. En consecuencia, las nanovesículas y las células estallan y todos los ácidos nucleicos internos se liberaron. Luego, se realizaron RT-PCR en tiempo real y PCR en tiempo real para determinar el nivel de expresión de GAPDH en condiciones en las que se trató con una enzima degradante de a Dn (por ejemplo, ADNasa) o no.
Tal como se muestra en la figura 5, para determinar si las nanovesículas preparadas a partir de monocitos contenían ácidos nucleicos, se realizó RT-PCR en tiempo real para medir la expresión de GADPH sin tratamiento con ADNasa. Como resultado, no estaban presentes ácidos nucleicos en las nanovesículas preparadas a partir de monocitos, mientras que estaban presentes ácidos nucleicos en las células de monocitos. Para determinar si las nanovesículas contenían ARN, la disolución que contenía la nanovesículas o células de monocitos que estallaron se trató con ADNasa para eliminar el ADN, y luego se añadieron inhibidores de ADNasa para inhibir la actividad de la ADNasa. Se realizó RT-PCR en tiempo real usando ARN como molde para medir la expresión de GADPH. Como resultado, no estaba presente ARN en las nanovesículas preparadas a partir de monocitos, mientras que estaba presente ARN en las células de monocitos. Para determinar si las nanovesículas contenían ADN, la disolución que contenía las nanovesículas o células de monocitos que estallaron se sometieron a PCR en tiempo real para GAPDH sin tratamiento con ADNasa. Como resultado, no estaba presente ADN en las nanovesículas preparadas a partir de monocitos, mientras que estaba presente ADN en las células de monocitos. Además, cuando se realizó PCR en tiempo real para GAPDH en la disolución que contenía las nanovesículas o células de monocitos que estallaron después del tratamiento con ADNasa, tampoco estaba presente ADN en las células de monocitos. Este resultado indicó que la ADNasa tenía actividad enzimática. Estos resultados indicaron que están presentes tanto ADN como ARN en las células de monocitos, mientras que no están presentes ADN y el ARN en las nanovesículas derivadas de células de monocitos.
2-4. Análisis de topología de nanovesículas
Para analizar la topología de las nanovesículas preparadas a partir de monocitos, entre el tratamiento con disolución alcalina, la sonicación y un método de gradiente de densidad según el método del ejemplo 1, en la etapa de sonicación, las nanovesículas se cargaron con una proteína fluorescente verde potenciada (EGFP).
Más específicamente, cuando se prepararon nanovesículas a partir de células U937, monocitos, tal como se muestra en el ejemplo 1, se suspendió el sedimento con 10 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBS), se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 15 minutos para obtener un sedimento. Luego, se suspendió el sedimento obtenido con HBS, se añadió EGFP a la disolución de HBS a una concentración de 50 |ig/ml para preparar una disolución con un volumen final de 0,4 ml. Se realizaron los siguientes procedimientos de la misma manera que el ejemplo 1, y se obtuvieron nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con EGFP. Se prepararon 10 |ig de nanovesículas cargadas con EGFP y 30 ng de proteínas EGFP y se trataron o no con 1 |ig de tripsina a 37°C durante 4 horas para preparar muestras tratadas con tripsina y muestras no tratadas con tripsina. Se realizó inmunotransferencia de tipo Western de la misma manera que se describe en el ejemplo 2-2. Se usaron anticuerpos específicos de ICAM1 o EGFP como anticuerpos primarios, y el signo '+' indica tratamiento con tripsina, mientras que el signo '-' indica tratamiento sin tripsina.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 6, cuando no se trató con tripsina, se detectaron proteínas ICAM1 y EGFP en el caso de nanovesículas (MNVegfp) y también se detectaron proteínas EGFP en el caso de EGFP. Sin embargo, cuando se trató con tripsina, en el caso de EGFP, las proteínas EGFP se degradaron por la tripsina y, por tanto, no se detectaron proteínas EGFP. Por otro lado, en el caso de las nanovesículas, el dominio extracelular de ICAM1 se degradó y no se detectó, y las proteínas EGFP cargadas en las nanovesículas no se degradaron. Cuando las partes interna y externa de la membrana celular están parcialmente invertidas y, de ese modo, el dominio extracelular de ICAM1 se dirige hacia el interior de las nanovesículas, el dominio extracelular de ICAM1 no se degrada por la tripsina y, por tanto, puede inducirse una reacción de anticuerpos. En las nanovesículas tratadas con tripsina, no se observó una reacción de anticuerpos con respecto a ICAM1. Este resultado indicó que el dominio extracelular de ICAM1 se dirigió hacia el exterior de las nanovesículas. Además, en el caso de las proteínas cargadas en las nanovesículas, puede observarse que las proteínas están protegidas por las membranas bicapa de las nanovesículas.
Basándose en estos resultados, en el caso de las nanovesículas preparadas usando tratamiento con disolución alcalina, se dedujo que los dominios extracelulares de proteínas de membrana celular distintas de ICAM1 se dirigían hacia el exterior de las nanovesículas como en las células originarias. Esto indicó que las membranas de las nanovesículas conservan la misma topología que las membranas celulares.
Ejemplo 3. Preparación de nanovesículas que contienen polietilenglicol
Se prepararon nanovesículas que contenían polietilenglicol cargando polietilenglicol en las nanovesículas derivadas de monocitos preparadas según el método del ejemplo 1.
Después de la sonicación, se realizó la suspensión mediante la adición de HBS, y la disolución se extruyó a través de un filtro de 1 |im (doble apilamiento). Se añadieron secuencialmente 0,5 ml de Optiprep al 50%, 1 ml de Optiprep al 10% y 3 ml de la suspensión en un tubo de ultracentrífuga, y luego se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 2 horas para obtener nanovesículas presentes en la capa entre el Optiprep al 50% y Optiprep al 10%. Después de la ultracentrifugación, se añadieron 5 |ig/ml de colesterol-polietilenglicol-biotina y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez más, se añadieron secuencialmente 0,5 ml de Optiprep al 50%, 1 ml de Optiprep al 10% y 3 ml de la suspensión en un tubo de ultracentrífuga de 5 ml, y luego se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 2 horas para obtener nanovesículas que contenían polietilenglicol presentes en la capa entre el Optiprep al 50% y Optiprep al 10%.
A continuación, se prepararon 10 |ig/ml de las nanovesículas que contenían polietilenglicol, se añadieron 100 |il de las nanovesículas preparadas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 12 horas para cubrir los pocillos de la placa. Después de lavar tres veces con PBS, se realizó el bloqueo durante 1 hora añadiendo 100 |il de BSA/PBS al 1%. Después del bloqueo, se lavó la placa tres veces con PBS, y luego se añadió estreptavidina-HRP y se incubó durante 20 minutos. Después de eso, se añadió un sustrato de BM-POD y se midió la cantidad de desarrollo del color.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 7, cuando se midieron las unidades de luminiscencia relativa (RLU) después del desarrollo del color, las nanovesículas pegiladas (MNVPEGilación) que contenían polietilenglicol presentaban un alto valor de RLU debido a la incorporación de colesterol-polietilenglicol-biotina en las nanovesículas. Por otro lado, las nanovesículas (MNVcontrol), que no se habían tratado con colesterol-polietilenglicol-biotina, presentaban un bajo valor de RLU.
Ejemplo 4. Preparación de nanovesículas que contienen FITC-ARNip
Para preparar nanovesículas derivadas de monocitos que contienen FITC-ARNip, entre el tratamiento con disolución alcalina, la sonicación y un método de gradiente de densidad según el método del ejemplo 1, en la etapa de sonicación, se cargaron nanovesículas con FITC-ARNip.
Más específicamente, cuando se prepararon nanovesículas a partir de células U937, monocitos, tal como se muestra en el ejemplo 1, se suspendió el sedimento con 10 ml de una solución salina tamponada con HEPES (HBS), se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 15 minutos para obtener un sedimento. Luego, se suspendió el sedimento obtenido con HBS, se añadió FITC-ARNip a la disolución de HBS a una concentración de 10 |iM para preparar una disolución con un volumen final de 0,4 ml. Luego, se realizó sonicación 30 veces con un sonicador, se realizó sonicación de nuevo durante 30 minutos en un sonicador de baño de agua y se suspendió la disolución con 0,6 ml de una disolución de HBS. La disolución se extruyó a través de un filtro de 1 |im (doble apilamiento) y se suspendió con 2,0 ml de HBS. Se añadieron secuencialmente 0,5 ml de Optiprep al 50%, 1 ml de Optiprep al 10% y 3 ml de suspensión en un tubo de ultracentrífuga de 5 ml y luego se realizó ultracentrifugación a 100.000 * g durante 2 horas para obtener nanovesículas cargadas con FITC-ARNip en la capa entre el Optiprep al 50% y el Optiprep al 10%.
Para verificar si las nanovesículas preparadas usando el método contenían FITC-ARNip, se prepararon 50 |il de las nanovesículas cargadas con FITC-ARNip, se añadió una disolución de Dil a una concentración de 10 |iM y se suspendieron las nanovesículas. La disolución se colocó sobre un cubreobjetos, el cubreobjetos se colocó en una cámara húmeda y se almacenó a 4°C durante al menos 12 horas. Se cargaron 5 |il de una disolución de montaje sobre un portaobjetos, se colocó el cubreobjetos sobre el mismo y se realizó la observación usando un microscopio de fluorescencia. Las nanovesículas se observaron por la fluorescencia roja de Dil (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3'3'-tetrametilindocarbocianina), y el ARNip se observó por la fluorescencia verde del FITC. Los resultados se muestran en la figura 8.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 8, las nanovesículas no cargadas con FITC-ARNip se marcaron con Dil y presentaron fluorescencia roja, pero no mostraron la fluorescencia verde del FITC-ARNip. Por otro lado, las nanovesículas cargadas con FITC-ARNip presentaron la fluorescencia roja de DiI así como la fluorescencia verde de FITC-ARNip. La presencia de fluorescencia verde y fluorescencia roja en la misma ubicación confirmó que se cargó FITC-ARNip en las nanovesículas.
Ejemplo 5. Preparación de nanovesículas cargadas con Qdot
Para preparar nanovesículas cargadas con Qdot 705, se usó el mismo método usado en la preparación de las nanovesículas cargadas con FITC-ARNip del ejemplo 4, y en la etapa de sonicación se añadieron Qdot 70520 nM en lugar de FITC-ARNip.
Para verificar si las nanovesículas preparadas usando el método contenían Qdot 705, se prepararon 50 |il de nanovesículas cargadas con 20 |ig/ml de Qdot 705. Las muestras se prepararon en el mismo método que el ejemplo 4, y la observación se realizó usando un microscopio de fluorescencia. Las nanovesículas se observaron por la fluorescencia roja de DiI, y se observó Qdot 705 por un pseudocolor azul.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 9, las nanovesículas no cargadas con Qdot 705 se marcaron con DiI y presentaron fluorescencia roja, pero no presentaron la fluorescencia azul de Qdot 705. Por otro lado, las nanovesículas cargadas con Qdot 705 presentaron la fluorescencia roja de DiI así como la fluorescencia azul. La presencia de fluorescencia azul y fluorescencia roja en la misma ubicación confirmó que se cargó Qdot 705 en las nanovesículas.
Ejemplo 6. Preparación de nanovesículas cargadas con nanopartículas de óxido de hierro
Para preparar nanovesículas cargadas con nanopartículas de óxido de hierro, se usó el mismo método usado en la preparación de las nanovesículas cargadas con FITC-ARNip del ejemplo 4, en la etapa de sonicación, se añadieron 20 |ig/ml de nanopartículas de óxido de hierro en lugar de FITC-ARNip. Luego, las nanovesículas (MNVóxido de hierro) cargadas con nanopartículas de óxido de hierro por un método de gradiente de densidad usando una disolución de Optiprep se compararon con nanovesículas (MNVcontrol) no cargadas con nanopartículas de óxido de hierro.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 10, las nanovesículas no cargadas con nanopartículas de óxido de hierro presentaron bandas blancas, mientras que las nanovesículas cargadas con nanopartículas de óxido de hierro presentaron bandas marrones oscuras. Estos resultados confirmaron que las nanopartículas de óxido de hierro se cargaron en nanovesículas.
Ejemplo 7. Validación del suministro de fármaco y suministro específico de célula usando nanovesículas derivadas de monocitos.
7-1. Confirmación del suministro in vitro de fármaco químico y suministro específico de célula usando nanovesículas derivadas de monocitos
Para verificar si las nanovesículas de la presente invención suministran fármacos químicos de una manera específica de célula in vitro, se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con doxorrubicina, un agente anticancerígeno, y se usó un microscopio de fluorescencia para verificar si el fármaco se suministró de una manera específica de célula.
Los pocillos de una placa de 24 pocillos se recubrieron con gelatina al 0,1%, cada pocillo de la placa se sembró con 3 x 104 células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y las células se cultivaron durante 12 horas. Se retiró el medio de cultivo existente y se añadió un medio de cultivo que contenía 10 ng/ml de TNF-a al mismo y se cultivó durante 16 horas. Cuando las HUVEC, una línea celular de vasos sanguíneos humanos, se trataron con TNF-a para activar las HUVEC, la expresión de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina aumenta en las membranas celulares. ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina aumentadas se unen a moléculas de adhesión celular tales como LFA-1 y Mac-1 presentes en monocitos y macrófagos. Esta interacción proteica permite que los monocitos y los macrófagos se unan a células endoteliales sanguíneas.
En consecuencia, se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con doxorrubicina según el método del ejemplo 1. En la etapa de sonicación, se añadieron 800 |ig/ml de doxorrubicina y se realizó la sonicación para preparar nanovesículas cargadas con doxorrubicina.
A continuación, las HUVEC se trataron con 0, 1,2 o 5 |ig/ml de nanovesículas cargadas con doxorrubicina durante 20 minutos, se reemplazó por un medio nuevo y se cultivaron durante 36 horas. Después del cultivo, las HUVEC se trataron con CellTracker 2 |iM (CellTracker, Invitrogen. N.° C2925), se incubaron durante 1 hora y luego se trataron con paraformaldehído al 4% para la fijación celular. Luego, se retiró el paraformaldehído al 4%, se añadió PBS y se usó un microscopio de fluorescencia para observar las células y medir el número de células.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 11, en las HUVEC sin tratamiento con TNF-a, el número de células disminuyó hasta cierto punto, lo que indica que se produjo parcialmente un suministro de fármaco no específico. Sin embargo, cuando se trataron con TNF-a a diversas concentraciones, el número de células disminuyó significativamente dependiendo de la concentración de las nanovesículas. Esto indicó que se suministró más doxorrubicina a las HUVEC debido a la presencia de las nanovesículas. Basándose en estos resultados, se confirmó que las nanovesículas pueden usarse para suministrar fármacos químicos de una manera específica de célula.
7-2. Confirmación del suministro in vitro de fármaco proteico y suministro específico de célula usando nanovesículas derivadas de monocitos
Para verificar si las nanovesículas de la presente invención suministran fármacos proteicos de una manera específica de célula in vitro, se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con ribonucleasa A (RNasa A) y se usó un microscopio de fluorescencia para verificar si la RNasa A se suministró de una manera específica de célula.
Se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con RNasa A según el método del ejemplo 1. En la etapa de sonicación, se añadieron 800 |ig/ml de RNasa A, y se realizó sonicación para preparar nanovesículas cargadas con RNasa A. Se prepararon muestras por el mismo principio y método que el ejemplo 7-1, y se observaron las células bajo un microscopio de fluorescencia, y luego se midió el número de células.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 12, cuando se trató con las nanovesículas cargadas con RNasa A a diversas concentraciones, se observó parcialmente suministro de fármaco no específico en las HUVEC sin tratamiento con TNF-a. Sin embargo, cuando se trataron con TNF-a, el número de células disminuyó significativamente. Esto indicó que se suministró más RNasa A las HUVEC debido a la presencia de las nanovesículas. Basándose en estos resultados, se confirmó que las nanovesículas pueden usarse para suministrar fármacos proteicos de una manera específica de célula.
Ejemplo 8. Validación del suministro in vitro de fármaco usando nanovesículas derivadas de células transformadas
Para verificar si las nanovesículas preparadas a partir de células transformadas suministran fármacos de una manera específica de célula como las nanovesículas derivadas de monocitos del ejemplo 7, se prepararon nanovesículas derivadas de monocitos cargadas con doxorrubicina, un agente anticancerígeno o RNasa A. Las células de monocitos se trataron con las nanovesículas preparadas, y luego se midió el número de células vivas.
Las nanovesículas, que se derivaron de células transformadas HT1080 que expresan ICAM-1 y cargadas con doxorrubicina o RNasa A, se prepararon según el método del ejemplo 1. En la etapa de sonicación, se añadieron 800 |ig/ml de doxorrubicina o RNasa A, y se realizó sonicación para preparar nanovesículas cargadas con doxorrubicina o RNasa A.
Después de eso, se añadieron 500 |il de un medio que contiene 1 * 105 células U937, monocitos, a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, y se añadieron 0, 1,2, 5 o 10 |ig/ml de nanovesículas derivadas de células HT1080 al mismo, seguido de incubación durante 24 horas. Después de la incubación, se añadieron 50 |il de una disolución que contenía las células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, y cada pocillo se trató con 50 |il de una disolución de azul trípano. En las células vivas, el azul trípano se secreta fuera de las células de nuevo, de modo que las células no se tiñen con azul trípano. Se añadieron 10 |il de la disolución mixta a un hemocitómetro, y se midió el número de células no teñidas con azul trípano bajo microscopio óptico.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 13, las nanovesículas preparadas a partir de células HT1080 transformadas que expresan ICAM-1 no se cargaron con fármacos o se cargaron con fármacos, y se compararon dos tipos de nanovesículas. En el caso de las nanovesículas no cargadas con fármacos, no se indujo muerte celular por el tratamiento con una alta concentración de nanovesículas. Por otro lado, cuando se trató con las nanovesículas cargadas con doxorrubicina, se indujo la muerte celular a partir de 5 |ig/ml. En el caso de las nanovesículas cargadas con RNasa A, se indujo muerte celular a partir de 10 |ig/ml.
Ejemplo 9. Validación del suministro in vitro de fármaco y suministro específico de célula usando nanovesículas derivadas de células transformadas que expresan GE11 y EGF en membranas celulares
Cada pocillo de una placa de 12 pocillos se sembró con 5 * 104 células A549, una línea celular de cáncer de pulmón humano, que expresaba EGFR, y las células se cultivaron durante 16 horas. EGFR presente en A549 es capaz de unirse a moléculas de adhesión tales como EGF y GE11.
La placa sembrada con las células A549 se lavó con PBS, y se añadió 1 ml de medio a cada pocillo de la placa. Luego, 0,1 * 109, 1 * 109 o 10 * 109 partículas/ml de nanovesículas, que se habían preparado a partir de células transformadas que expresaban EGF y GE11 en las membranas según el ejemplo 1 y cargadas con doxorrubicina, se añadieron a cada pocillo de la placa, seguido de incubación durante 20 minutos. Después de la incubación, cada pocillo se lavó con PBS, se añadió 1 ml de un medio al mismo y se cultivó durante 36 horas. Luego, después del lavado con PBS, se añadieron 500 |il de un medio libre de suero a cada pocillo, se añadió CellTracker 5 |iM (Invitrogen. n.° C2925) al mismo y se incubó durante 30 minutos. Después de eso, se añadieron 500 |il de paraformaldehído al 4% a cada pocilio, se incubó durante 10 minutos para la fijación celular y las células fijas se observaron bajo un microscopio de fluorescencia.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 14, se confirmó que el número de células vivas disminuyó a medida que aumentaba la concentración. En conclusión, las nanovesículas, que se habían derivado de células transformadas que expresaban EGF y GE11 en las membranas celulares y cargadas con fármacos anticancerígenos, eran capaces de unirse a células que expresaban EGFR en la superficie celular, y en consecuencia, los fármacos anticancerígenos cargados se suministraron selectivamente a células que expresaban EGFR, dando como resultado muerte celular.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Nanovesículas, en las que las nanovesículas se derivan de membranas de células, cuyos componentes intracelulares se han eliminado tratando las células con una disolución alcalina de pH 9 a 14, y el tamaño de las nanovesículas es menor que el tamaño de las células.
  2. 2. Nanovesículas según la reivindicación 1, en las que las células son células transformadas que expresan uno o más seleccionados del grupo que consiste en moléculas de adhesión celular, anticuerpos, proteínas de direccionamiento, proteínas de fusión de membranas celulares, factores de crecimiento, citocinas, receptores, proteínas fluorescentes y proteínas de fusión de los mismos.
  3. 3. Nanovesículas según la reivindicación 1, en las que membranas de las nanovesículas comprenden además componentes distintos de la membrana celular.
  4. 4. Composición farmacéutica para suministrar sustancias, que comprende las nanovesículas según la reivindicación 1 cargadas con sustancias para su uso en el tratamiento o diagnóstico de enfermedades.
  5. 5. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4, en la que las sustancias son uno o más seleccionados del grupo que consiste en agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de la angiogénesis, péptidos, proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, perlas, micropartículas, nanopartículas y materiales emisores de fluorescencia.
  6. 6. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en la que los ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en ADN, ARN, aptámeros, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos peptidonucleicos (PNA) y morfolinos.
  7. 7. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en la que las nanopartículas se seleccionan del grupo que consiste en óxidos de hierro, oro, nanotubos de carbono y perlas magnéticas.
  8. 8. Método de preparación de nanovesículas derivadas de la membrana celular cargadas con sustancias para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, comprendiendo el método: (a) una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14; (b) una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico a una suspensión que contiene membranas de las células a partir de las que se han eliminado los materiales intracelulares; (c) una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a la suspensión a la que se añaden las sustancias terapéuticas o de diagnóstico; y (d) una etapa de aislar las nanovesículas preparadas a partir de la suspensión, o (a) una etapa de eliminar materiales intracelulares mediante el tratamiento de células con una disolución alcalina de pH 9 a 14; (b) una etapa de preparar nanovesículas mediante la aplicación de un método de sonicación a una suspensión que contiene membranas de las células a partir de las que se han eliminado los materiales intracelulares; (c) una etapa de añadir sustancias terapéuticas o de diagnóstico a la suspensión que contiene las nanovesículas e incubar la mezcla; y (d) una etapa de separar las nanovesículas incubadas a partir de la suspensión.
  9. 9. Método según la reivindicación 8, que comprende además una etapa de extruir las nanovesículas preparadas por el método de sonicación.
  10. 10. Método según la reivindicación 8, en el que las células son células transformadas que expresan uno o más seleccionados del grupo que consiste en moléculas de adhesión celular, anticuerpos, proteínas de direccionamiento, proteínas de fusión de membranas celulares, factores de crecimiento, citocinas, receptores, proteínas fluorescentes y proteínas de fusión de los mismos.
  11. 11. Método según la reivindicación 8, en el que las membranas de las nanovesículas comprenden además componentes distintos de la membrana celular.
  12. 12. Método según la reivindicación 8, en el que las sustancias para tratar o diagnosticar enfermedades son uno o más seleccionados del grupo que consiste en agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de la angiogénesis, péptidos, proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, perlas, micropartículas, nanopartículas y materiales emisores de fluorescencia.
  13. 13. Método según la reivindicación 12, en el que los ácidos nucleicos se seleccionan del grupo que consiste en ADN, ARN, aptámeros, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos peptidonucleicos (PNA) y morfolinos.
  14. 14. Método según la reivindicación 12, en el que las nanopartículas se seleccionan del grupo que consiste en óxidos de hierro, oro, nanotubos de carbono y perlas magnéticas.
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