KR20160047621A - 저준위 방사선에 반응하는 dna 회복 관련 유전자의 검출방법 - Google Patents

저준위 방사선에 반응하는 dna 회복 관련 유전자의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, (1) 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐를 저준위 방사선 환경에서 사육하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 사육된 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐의 흉선을 채취하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 채취된 흉선의 유전자를 분석하는 단계;와 (4) 상기 (3) 단계에 의해 분석된 유전자 중 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에 의해 검출된 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법을 제공함으로써, 산업 및 의료종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성을 평가할 수 있는 저준위 방사선 DNA 회복 지표 유전자로 활용할 수 있고, 암 환자의 암 진행 및 치료정도를 평가할 수 있는 저준위 방사선 DNA 회복 유전자로 활용할 수 있을 뿐만 아니라 방사선과 암 발생 인과관계를 평가할 수 있는 저준위 DNA 회복 지표로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법{DETECTION METHOD OF SENSITIVE GENES FOR LOW LEVEL RADIOACTIVERAY }
본 발명은 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 흉선암 모델 AKR/J 생위와 정상 ICR 생쥐에 저준위 방사선을 조사한 후 흉선을 채취하여 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하고 증폭하여 발현량을 측정하는 방법에 관한 것이다.
종래 저준위(0.7 mGy/시간) 방사선에 민감한 유전자를 발굴하기 위해 다양한 방법이 이용되었지만, 분자적으로 단백질 수준까지 확인하지 않았으며, 본 발명에 제시된 유전자들은 RNA 뿐만 아닐 단백질 수준까지 발현 차이를 확인하였다. 또한 기존에는 DNA 손상과 회복에 관련된 유전자를 저준위 방사선 조사된 건강한 쥐와 암 발생 쥐를 비교하여 확인한 적이 없으며, 본 발명에서 발굴된 유전자들은 기존에 저준위 방사선에 대해 민감한 유전자라 알려진바 없다. 저준위 방사선에 대해 민감한 유전자 프로파일 발굴에 선행되었던 기술을 보면 아래와 같다.
ⅰ) 인간 골수성 백혈병 세포주에 2-50cGy 방사선을 조사한 후 CDKN1A, GADD45A, MDM2, BTG2, PHLDA3 등의 유전자 발현 확인(Amundson 등, 2003)
ⅱ) 방사선 사고시 선량평가에 이용하기 위해 사람 혈액에 0.5, 2, 8 Gy 조사 후 선량에 따라 반응하는 FDXR, CDKN1A, PHPT1, BBC3, SESN1 유전자 발견함(Paul과 Amundson, 2008).
ⅲ) C57BL/6J 생쥐에 0.032-13μGy/분으로 485일 동안 방사선 조사 후 신장과 고환을 채취하여 마이크로어레이를 통해 저준위 방사선에 민감한 유전자를 발견함(Taki 등, 2009).
ⅳ) C57BL/6J 수컷 생쥐에 401-485일(8Gy, 0.4Gy 또는 0.02Gy) 동안 17-20mGy/일, 0.86-1.0mGy/일로 방사선 조사 후 간을 채취하여 마이크로어레이와 역전사핵산증폭법을 이용하여 저준위 방사선에 민감한 유저자를 발견함(Uehara 등, 2010).
ⅴ) 마이크로어레이와 정량적 핵산증폭법을 이용해 저준위 방사선 조사된 노랑초라리에서 저준위 방사선 민감 유전자 39개 발견함(Seong 등, 2011).
ⅵ) 인간 혈액에 0, 0.02, 0.1, 0.5, 1, 2, 4Gy 방사선 조사 후 마이크로어레이를 통해 저준위 방사선 민감 유전자 총 9개 발굴. 또한 생물학적 선량평가에 응용하기 위해 선량별, 조사 후 시간별로 발현양이 차이나는 유전자 그룹을 선정함(Knops 등, 2012).
ⅶ) 제이브라다니오 배아와 성체에 0.1 또는 1Gy 방사선 조사 후 간의 mRNA를 이용하여 마이크로어레이와 정량적 핵산증촉법을 수행. 방사선 민감 유전자를 발굴함(Jaafar 등, 2013).
ⅷ) 마이크로어레이를 통해 5-500mGy 방사선 조사된 인간 혈액에서 저준위 방사선 민감 유전자 발굴함(Nosel 등, 2013).
본 발명자는 방사선에 의한 암 발생 연구시, 일반적으로 세포주를 이용한 연구결과는 사람이나 동물에 바로 적용하여 해석하기 어렵고, 실험동물의 경우 일반 생쥐를 많이 이용해 왔지만 암 발병율이 낮고 저준위 방사선의 영향이 인체 영향으로 표현되기까지 많은 한계가 있으므로, 이러한 단점을 보완하기 위해 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 일반적으로 암 연구에 많이 사용하는 정상 ICR 생쥐를 이용하여 개체간의 차이를 다음과 같은 방법으로 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
1)흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에 저준위(0.7mGy/시간) 방사선을 조사한 후, 흉선에서 저준위 방사선에 민감한 유전자 프로파일을 발굴한 후 2) DNA 회복에 관련된 유전자를 중심으로 검증 후 그 기능을 분석
결론적으로 본 발명의 목적은 (1) 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐를 저준위 방사선 환경에서 사육하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 사육된 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐의 흉선을 채취하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 채취된 흉선의 유전자를 분석하는 단계;와 (4) 상기 (3) 단계에 의해 분석된 유전자 중 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에 의해 검출된 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐를 저준위 방사선 환경에서 사육하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 사육된 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐의 흉선을 채취하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 채취된 흉선의 유전자를 분석하는 단계;와 (4) 상기 (3) 단계에 의해 분석된 유전자 중 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에 의해 검출된 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 저준위 방사선량은 0.7mGy/시간인 것을 특징으로 한다.
상기 (1)단계에서 0.7mGy/시간의 저준위 방사선 환경에서 총 누적선량이 1.7Gy가 되도록 사육하는 것을 특징으로 한다.
상기 (5)단계에서 DNA 회복 관련 유전자는 Cyp11a1, Ptgs2, Rnd3, Plxncl 및 cyp2el에서 선택되는 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 한다.
상기 (5)단계에서 벤다이어그램, 정량적 핵산증폭법, 특수단백질 검출검사 및 통계프로그램 SAS를 통해서 발현량을 측정하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, (1) 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐를 저준위 방사선 환경에서 사육하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 사육된 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐의 흉선을 채취하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 채취된 흉선의 유전자를 분석하는 단계;와 (4) 상기 (3) 단계에 의해 분석된 유전자 중 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에 의해 검출된 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법을 제공함으로써, 산업 및 의료종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성을 평가할 수 있는 저준위 방사선 DNA 회복 지표 유전자로 활용할 수 있고, 암 환자의 암 진행 및 치료정도를 평가할 수 있는 저준위 방사선 DNA 회복 유전자로 활용할 수 있을 뿐만 아니라 방사선과 암 발생 인과관계를 평가할 수 있는 저준위 DNA 회복 지표로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1 은 실험예 1.의 DNA 손상/회복 관련 유전자 중 저준위 방사선에 종 특이적으로 반응을 보이는 유전자를 핵산증폭법을 이용하여 상대적인 발현양을 확인한 그래프.
도 2 는 실험예 2.의 저준위 방사선 조사된 AKR/J와 JCR 생쥐 흉선의 단백질 분석결과를 나타낸 그래프.((1) 저준위 방사선 DNA 회복 유전자(Cyp11a, Rnd3, Plxnc1) 단백질 양, (2) 로딩 컨트롤, (3) 특수단백질 검출법의 정량분석, 각 밴드 밀도 측정 후 β-tubulin 밀도치로 정량화)
도 3 은 생쥐 흉선 저준위 방사선 조사에 의한 분자적 변화 도식화.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 고선량 방사선은 DNA 손상을 일으키고 암을 발생시킨다고 알려져 있지만 반대로 저선량 방사선은 손상된 DNA 회복, 세포사멸 유도, 면역활성과 항산화 기능을 촉진하여 암을 억제한다고 알려져 있다. 그러나 유엔과학위원회(UNSCEAR, 2000)에서 제시한 저선량률 방사선(6≥mGy/h) 기준을 충족하지 못하는 경우가 많다. 또한 세포주를 이용하여 확보한 연구결과는 사람에 바로 적용하여 해석하기 어려우며, 실험동물을 이용한 경우라 하더라도 저준위 방사선이 DNA 회복에 미치는 영향에 대하여 단백질 수준까지 확인한 종래기술은 없다. 본 발명에서는 AKR/J와 정상 생쥐(ICR)를 저준위(0.7mGy/시간) 방사선 환경에 사육하면서 폐사가 시작되는 시기(100일)에 도달하였을 때 흉선을 채취하고 유전자를 분석하였다. 또한, 동일한 조건에서 사육한 정상 쥐와(ICR) 흉선을 채취하여 유전자를 분석하였다. 최종적으로 두 종 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 증폭하고, 단백질 검출을 통하여 최종적으로 유전, 단백체를 발굴하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
본 발명에서는 암컷(7주령) AKR/J와 ICR 생쥐를 일본 Shizuoka laboratory 센터에서 구입하고 1주일 동안 특정 병원균이 부재된 시설에서 사육하며 안정화시켰다.
각 그룹 당 5마리 생쥐를 이용하여 저준위(0.7mGy/시간) 방사선 환경에서 100일(누적선량 총 1.7Gy) 동안 사육한 후 흉선을 채취하여 액체질소에 금속 냉동시킨 후 유전자 분석을 수행하였다.
저준위 방사선 조사된 AKR 생쥐와 ICR 생쥐위 흉선을 비교하여 저준위(0.7mGy/시간) 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자를 발굴하고 기능을 해석하였다.
벤다이어그램, 정량적 핵산증폭법, 특수단백질 검출검사 및 통계프로그램 SAS(ANOVA, t-test)를 이용하여 분석하였다.
한편, 저준위(0.7mGy/시간) 방사선 조사된 생쥐 흉선에서 민감하게 반응하는 DNA 회복관련 유전자들에 대하여 발현량을 계측하기 위해 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 1.에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
Figure pat00001
실험예 1. DNA 손상/회복 관련 유전자의 발현량 측정
AKR/J와 ICR 생쥐에 대하여 저준위(0.7mGy/시간) 방사선을 조사한 다음, 암 발생 초기 단계(100일)에서 흉선을 채취한 후 DNA 손상/회복 관련 유전자 중 저준위 방사선에 종 특이적으로 반응을 보이는 유전자를 핵산증폭법을 이용하여 상대적인 발현양을 확인하였다.
그 결과 도 1.에 나타낸 바와 같이 저준위 방사선 조사된 AKR/J 생쥐에서 Cyp11a1, Ptgs2, Rnd3, Plxnc1, ICR 생쥐에서 Cyp2e1 등이 종 특이적으로 저준위 방사선에 민감하게 반응하였다.
실험예 2. 저준위 방사선 조사된 AKR/J와 ICR 생쥐 흉선의 단백질 분석
실시예 1.에서의 저준위 방사선 조사된 경우의 단백질과 대조군으로 고준위 방사선(0.8Gy/min, 총 선량: 4.5Gy) 조사된 생쥐 흉선의 단백질을 분석하였다.
그 결과 도 2.에 나타낸 바와 같이 저준위 방사선 조사된 AKR/J 생쥐에서 Cyp11a1, Rnd3, Plxnc1 등이 종 특이적으로 저준위 방사선에 민감하게 반응하는 것을 검증하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. (1) 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐를 저준위 방사선 환경에서 사육하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계에 의해 사육된 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐의 흉선을 채취하는 단계;
    (3) 상기 (2)단계에 의해 채취된 흉선의 유전자를 분석하는 단계;
    (4) 상기 (3) 단계에 의해 분석된 유전자 중 흉선암 모델 AKR/J 생쥐와 정상 ICR 생쥐에서 공통 또는 단독으로 발현되는 DNA 회복 관련 유전자를 검출하는 단계; 및
    (5) 상기 (4)단계에 의해 검출된 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 저준위 방사선량은 0.7mGy/시간인 것을 특징으로 하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 0.7mGy/시간의 저준위 방사선 환경에서 총 누적선량이 1.7Gy가 되도록 사육하는 것을 특징으로 하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (5)단계에서 DNA 회복 관련 유전자는 Cyp11a1, Ptgs2, Rnd3, Plxncl 및 cyp2el에서 선택되는 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (5)단계에서 벤다이어그램, 정량적 핵산증폭법, 특수단백질 검출검사 및 통계프로그램 SAS를 통해서 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 저준위 방사선에 반응하는 DNA 회복 관련 유전자의 검출방법.



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