KR101875116B1 - 저선량 방사선 피폭 면역반응 지표 단백질 및 이의 검출방법 - Google Patents

저선량 방사선 피폭 면역반응 지표 단백질 및 이의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저선량 방사선 피폭 지표 단백질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저선량 방사선 피폭 지표로 사용할 수 있는 단백질의 검출 및 그 검출하는 기술에 관한 것이다. 상기 저선량 방사선 피폭 지표 단백질은 방사선 작업 관련 종사자의 방사선 피폭에 대한 생체 내 피해 정도를 평가 할 수 있는 지표로 활용가능하다. 또한, 상기 특이면역반응과 관련된 단백질군은 방사선사고 시 방사선 피폭에 대한 면역계의 손상정도를 평가할 수 있는 저선량 특이적 지표로 활용가능하다.

Description

저선량 방사선 피폭 면역반응 지표 단백질 및 이의 검출방법 {IMMUNE-RESPONSE INDICATOR PROTEIN OF LOW-DOSE RADIATION EXPOSURE AND DETECTING METHOD THEREOF}
본 발명은 저선량 방사선 피폭 지표 단백질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저선량 방사선 피폭 지표로 사용할 수 있는 단백질의 검출 및 그 검출하는 기술에 관한 것이다.
저선량 방사선은 낮은 선량의 방사선을 가리키며, 일반적으로 100mSv이하의 방사선을 의미한다. 다량의 방사선은 생물체에 해를 줄 수 있지만, 낮은 선량인 저선량 방사선은 생명체의 생리활동이 촉진되어 수명이 연장되거나 성장촉진 또는 종양 발생률이 저하되는 등 유익한 효과가 있다.
단백질은 세포 내에서 성장, 분화, 사멸을 비롯한 모든 생명현상을 조절하는 능력을 지니고 있으며, DNA 상의 유전정보로부터 전사(transcription) 및 번역(translation)과정을 거쳐 만들어 진다. 단백질 인산화는 세포 상태의 조절에 이용되는 단백질 활성 조절 방법 중 가장 널리 알려진 일반적인 방법으로 세포의 대사, 성장, 분화와 세포막 전이를 포함한 세포 신호전달기작에 중요한 영향을 미친다. 인체 세포단위에서 특정 반응을 만들어 내는 것은 단백질의 인산화와 밀접하게 연관되어 있고, 외부의 자극에 의해 빠른 속도로 단백질 인산화가 이루어지기 때문에 이를 통해서 저선량 방사선에 특이적인 인산화 단백질 군을 검색할 필요가 있다.
종래 발명은 저선량 방사선에 민감한 유전자를 발굴하기 위한 RNA 또는 DNA 수준의 검색에 집중되어있다. 상기 RNA 또는 DNA의 수준에서 발굴된 저선량 방사선 민감성 유전자는 단백질 수준의 검증이 필요하다.
한국공개특허 제10-2014-0143216호 (2014.10.22.)
본 발명의 목적은, 방사선 작업 관련 종사자에서 저선량 방사선 노출에 대한 지표로 특이면역반응과 관련된 단백질군의 인산화 여부 및 인산화 위치(패턴)을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인산화 위치(패턴)을 이용한 저선량 방사선 피폭 진단방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 림프아세포(lymphoblast)에서 저선량 방사선 피폭 지표단백질의 검출방법을 제공한다. 상기 저선량방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법은 림프아세포(lymphoblast)에 저선량 방사선을 조사하는 단계 및 저선량 방사선이 조사 된 림프아세포의 단백질 인산화 프로파일을 분석하여 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 림프아세포(lymphoblast)는 IM-9세포주인 것을 특징으로 한다.
상기 저선량 방사선 조사단계는 누적선량 0.1 내지 2Gy가 되도록 조사하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 저선량 방사선 조사단계는 저선량 방사선 조사 후 1 내지 8시간동안 더 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 단백질 인산화 프로파일 분석은 항체 어레이(antibody array)를 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 검출된 저선량 방사선 피폭 지표 단백질은 GATA1, MEF2C, SRF, LYN 및 FOXO1 중 하나이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 단백질은 GATA1, MEF2C, SRF, LYN 및 FOXO1 중 하나이상 선택되는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 포함하는 저선량 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 저선량 방사선 노출에 따른 특이면역반응단백질군의 인산화 여부 및 인산화 위치(패턴)을 제공함으로써, 이를 저선량 방사선 피폭 지표 단백질로 활용할 수 있는 효과가 있다.
상기 저선량 방사선 피폭 지표 단백질은 방사선 작업 관련 종사자의 방사선 피폭에 대한 생체 내 피해 정도를 평가 할 수 있는 지표로 활용 가능하다. 또한, 상기 특이면역반응과 관련된 단백질군은 방사선 사고 시 방사선 피폭에 대한 면역계의 손상정도를 평가할 수 있는 저선량 특이적 지표로 활용 가능하다.
또한, 세포 수준에서 저선량 방사선에 의해 발생하는 유효한 효과를 설명하기 위한 기초자료로 활용할 수 있다.
도 1은 저선량 방사선 조사에 따른 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 상대적인 인산화를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따른 림프아세포(lymphoblast)에서 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법은 림프아세포(lymphoblast)에 저선량 방사선을 조사하는 단계 및 저선량 방사선이 조사 된 림프아세포의 단백질 인산화 프로파일을 분석하여 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 림프아세포(lymphoblast)는 IM-9세포주인 것을 특징으로 한다. 상기 림프아세포 IM-9세포주는 방사선에 민감한 면역세포주이므로 저선량 방사선 피폭에 대한 민감한 지표로 바람직하다. 종래 방사선 특이 지표로 단백질 인산화를 이용한 연구가 있으며, 이러한 연구는 폐에서 유래한 섬유아세포를 이용한 것이다. 상기 섬유아세포는 방사선에 저항성을 가지는 특성이 있어, 저선량 방사선 피폭에 대한 민감한 지표로 바람직하지 않다.
상기 저선량 방사선 조사단계는 누적선량 0.1 내지 2Gy가 되도록 조사하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 저선량 방사선 조사단계는 저선량 방사선 조사 후 1 내지 8시간동안 더 배양하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 3 내지6시간동안 더 배양하는 것이 바람직하다. 또한 상기 저선량 방사선 조사단계는 저선량방사선 조사 후 4시간동안 더 배양하는 것이 가장 바람직하다.
상기 단백질 인산화 프로파일 분석은 항체 어레이(antibody array)를 수행하는 것을 특징으로 한다.
외부의 자극에 의해 빠르게 반응하는 단백질의 인산화는 세포 내 반응을 일으키는 주요한 변화요인으로 DNA 또는 RNA의 발현변화를 확인하는 것 보다 직접적인 세포 반응을 보여주는 효과적인 지표로 이용할 수 있다. 또한 종래 DNA 또는 RNA의 발현변화를 확인하는 것보다 직접적인 세포 반응을 보여주는 효과적인 지표로 이용 될 수 있다. 또한 기존 DNA 또는 RNA를 이용한 지표의 발굴은 세포내 가장 하위(기초)단계에 있는 세포 반응을 이용한 것으로 여러 요인에 의해 그 발현 패턴이 영향을 받는다. 그러나 단백질 인산화는 세포내에 반응을 일으키는 최종단계로, DNA 또는 RNA의 발현보다 여러 요인에 영향을 받지 않아 좀 더 정확한 진단이 가능한 지표이다. 또한 외부 자극에 반응해서 발생하는 단백질의 인산화는 각 단백질마다 하나 혹은 여러 개의 서로 다른 펩타이드 위치에서 발생하고, 인산화가 일어나는 펩타이드의 위치에 따라 다른 세포반응을 유도하기 때문에 저선량 방사선에 의해서 발생하는 인산화 단백질군과 그 단백질 군들의 인산화 위치정보를 제공함으로써 보다 정확한 진단이 가능하다.
상기 검출 된 저선량 방사선 피폭 지표 단백질은 GATA1(UniProtKB No : P15976), MEF2C(UniProtKB No : Q06413), SRF(UniProtKB No : P11831), LYN(UniProtKB No : P07948) 및 FOXO1(UniProtKB No : Q12778) 중 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 단백질은 GATA1, MEF2C, SRF, LYN 및 FOXO1 중 하나이상 선택되는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 포함하는 저선량 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 림프아세포(lymphoblast)에서 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출
1-1 저선량 방사선 조사
인간 림프아세포(Lymphoblast) IM-9 세포주에 저선량 방사선을 조사하기 위하여, 세포는 5% CO2에 37℃로 유지되는 배양기에서 16시간 배양하였다.
상기 IM-9세포주에 137Cs g-irradiator (0.8 Gy/min, IBL 437C, CIS Bio International, France) 기기를 이용하여 누적선량 0.1Gy가 되도록 저선량 방사선을 조사하였다.
1-2 단백질 추출
저선량 방사선이 조사된 세포는 5%CO2, 온도 37℃로 유지되는 배양기에서 4시간동안 배양한 후, 1% phosphatase inhibitor cocktail (Sigma)과 lysis bead (Fullmoon Biosystems)가 포함된 protein extraction buffer (Fullmoon Biosystems)를 사용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 gel matrix column (Fullmoon Biosystems)을 사용하여 정제하고 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Pierce)을 이용하여 정량하였다.
1-3 단백질 인산화 프로파일 분석
추출된 단백질의 인산화 프로파일은 항체 어레이(antibody array)를 수행하여 분석하였다. 추출된 단백질시료 50μg는 biotin/DMF solution (10 ug/ul)을 이용하여 90분 동안 표지하고, antibody microarray slide (Fullmoon)와 2 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응한 slide는 GenePix 4100A scanner (Axon Instrument, USA)를 사용하여 단백질 인산화 정도 및 위치(패턴)를 측정하였다.
1-4 단백질의 기능 분석
상기 단백질 인산화 정도 및 위치 측정 결과는 IPA (ingenuity pathway analysis; Ingenuity System) 분석프로그램을 이용하여 단백질군의 생물학적 기능분석하였다. 분석방법은 저선량 방사선 0.1Gy에 특이적으로 인산화가 증가하는 단백질군을 먼저 분리한 후 다음으로 IPA 분석프로그램의 DB에 구축되어 있는 생물학적 분류법에 근거하여 분리된 단백질군의 기능을 분석하였다.
상기 antibody array 결과는 도 1에 도시하였다. 도 1에 따르면, 단백질 GATA1, SRF, LYN 및 FOXO1은 저선량 방사선 조사 시 단백질 인산화가 1.5배 이상 증가하는 것을 알 수 있다. 특히, 단백질 MEF2C는 저선량 방사선 조사 시 단백질 인산화가 2.5배 이상 증가한 것을 알 수 있다. 이에 반해 세포 증식과 관련된 단백질 PP2A-α, IKK-β, PDK1 및 SEK1/MKK4는 저선량 방사선을 조사하였음에도 단백질 인산화에 변화가 적었다. 따라서, 상기 단백질 GATA1, MEF2C, SRF, LYN 및 FOXO1은 저선량 방사선에 민감하게 반응하므로, 저선량 방사선 피폭 지표 단백질로 이용할 수 있다.
또한, 인산화 항체 어레이(phospho-antibody array)를 이용하여, 상기 분리 된 단백질의 인산화 위치(패턴)는 표 1과 같다.
저선량 방사선 노출에 따른 특이면역반응단백질군의 인산화 위치(패턴)
단백질 인산화 위치
GATA1 Ser 142
MEF2C Ser 396
SRF Ser 77
LYN Tyr 507
FOXO1/3/4-PAN Thr 24/32
또한, IPA(Ingenuity pathway analysis)를 이용하여 인산화 된 단백질군의 생물학적 기능분석 결과는 표 2와 같다. 상기 인산화 된 단백질은 항상성 유지에 관여한다는 것을 확인하였다.
인산화 항체 분석(phospho-antibody array)에 따른 저선량 방사선에 특이적인 생물학적 반응 및 기능
Categories Diseases or
Functions Annotation		 p-value Molecules
Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Hematological System Development and Function Activation of blood cells 6.11E-15 ADRBK1, BCL2L1, CD4, ERBB2, FOXO1 , GATA1 , HNF4A, LYN, MAP2K1, MAPK14, NFKB1, PRKCA, PRKCD, PRKCQ, SNCA, STK11, SYK, VAV1, ZAP70
Cellular Function and Maintenance Lymphocyte homeostasis 4.79E-15 BIRC5, CD4, DOK1, FOXO1 , GATA1 , LYN , MAP2K1, MAPK14, MAPK3, MEF2C, PRKCA, PRKCQ, SRF , STK11, SYK, VAV1, ZAP70
Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking, Inflammatory Response Activation of leukocytes 2.09E-13 BCL2L1, CD4, ERBB2, FOXO1 , HNF4A, LYN , MAP2K1, MAPK14, NFKB1, PRKCA, PRKCD, PRKCQ, SNCA, STK11, SYK, VAV1, ZAP70
Cell Death and Survival Cell viability of leukocytes 2.62E-19 BCL2L1, BIRC5, CHEK2, ERBB2, FOXO1 , GATA1 , LYN , MAP2K1, MAPK3, MEF2C , NFKB1, PLCG2, PRKCQ, STK11, SYK, YWHAZ
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 림프아세포(lymphoblast)에 저선량 방사선을 조사하는 단계; 및
    저선량 방사선이 조사 된 림프아세포의 단백질 인산화 프로파일을 분석하여 저선량 방사선 피폭 지표 단백질 GATA1(UniProtKB No : P15976), MEF2C(UniProtKB No : Q06413), SRF(UniProtKB No : P11831), LYN(UniProtKB No : P07948) 및 FOXO1(UniProtKB No : Q12778) 중 하나 이상 선택 검출하는 단계;를 포함하는 림프아세포(lymphoblast)에서 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 림프아세포(lymphoblast)는 IM-9 세포주인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 저선량 방사선 조사단계는 누적선량 0.1 내지 2Gy가 되도록 조사하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저선량 방사선 조사단계는 저선량 방사선 조사 후 1 내지 8시간동안 더 배양하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 인산화 프로파일분석은 항체 어레이(antibody array)를 수행하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질의 검출방법.
  6. 삭제
  7. 단백질 GATA1(UniProtKB No : P15976), MEF2C(UniProtKB No : Q06413), SRF(UniProtKB No : P11831), LYN(UniProtKB No : P07948) 및 FOXO1(UniProtKB No : Q12778)에서 하나 이상 선택되는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 포함하는 저선량 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물.
  8. 단백질 GATA1(UniProtKB No : P15976), MEF2C(UniProtKB No : Q06413), SRF(UniProtKB No : P11831), LYN(UniProtKB No : P07948) 및 FOXO1(UniProtKB No : Q12778) 중 하나 이상 선택되는 저선량 방사선 피폭 지표 단백질을 포함하는 저선량 방사선 피폭 진단용 키트.
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대한방사선방어학회 추계 학술발표, 2009, pp 40-41. *
대한방사선방어학회 추계 학술발표, 2009, pp 40-41.*
비특허문헌1 (2009) *
비특허문헌2 (2006) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210049488A (ko) 2019-10-25 2021-05-06 한국원자력의학원 방사선 피폭 검출을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 방사선 피폭 검출 방법

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