CN113774125A - 一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于辐射防护技术领域，涉及一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法。所述的方法包括如下步骤：(1)注射与辐照；(2)RNA提取；(3)建立测序用cDNA文库；(4)高通量测序；(5)测序结果分析。利用本发明的氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，能够筛选出氨磷汀抗辐射损伤相关基因，并进行功能分析，从而从基因层面揭示氨磷汀抗辐射机制。

Description

一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法
技术领域
本发明属于辐射防护技术领域，涉及一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法。
背景技术
随着核技术在生命科学、医学等方面应用的迅速发展，辐射对人类的影响日益增加。辐射可对机体产生严重的损伤，引起机体的代谢、形态和功能发生改变，导致机体免疫力降低，而且还可能引起基因突变或癌变。
目前，研究已发现了一些具有辐射防护作用的药物，如雌二醇、炔雄三醇、氨磷汀等，其中氨磷汀(amifostine)是目前临床上使用最为普遍且效果较为明确的一种抗辐射药物，在肿瘤放疗中被广泛使用。有很多人对氨磷汀的辐射防护机制进行研究，但仅停留在细胞水平，缺乏更深层次的研究。
随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现。其中，转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，目前在寻找生物标志物或者探寻发病新机制及制定个性化治疗方案等诸多方面有着重要应用。RNA测序(RNA-Seq)是近年来发展较为成熟的高通量测序技术，作为转录组分析技术的新手段，具有快捷分析、高分辨率等优势，可以应用其从基因层面对氨磷汀的作用机制提供一些解释。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，以能够筛选出氨磷汀抗辐射损伤相关基因，并进行功能分析，从而从基因层面揭示氨磷汀抗辐射机制。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)注射与辐照：对多只大鼠分别腹腔注射氨磷汀后，对部分大鼠分别进行辐照；
(2)RNA提取：分别摘取每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的脏器并分别进行组织RNA提取；
(3)建立测序用cDNA文库：由步骤(2)提取的RNA分别建立每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库；
(4)高通量测序：对步骤(3)建立的每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库分别进行高通量测序；
(5)测序结果分析：根据步骤(4)的高通量测序结果，计算每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的不同基因的表达量，筛选出未辐照的大鼠与辐照后的大鼠的差异表达基因，并寻找差异表达基因的富集通路，分析差异表达基因的功能。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中所述的大鼠为SD大鼠。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(1)中，每只大鼠的氨磷汀注射剂量为100-200mg/kg。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(1)中，每只大鼠在注射氨磷汀后20-60分钟进行辐照，辐照剂量为10-30Gy。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(2)中，所述的脏器为大鼠胸部肺脏。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(3)中，对步骤(2)提取的RNA富集mRNA，将RNA片段化，反转录合成cDNA并进行末端修复，连接产物通过特异的引物进行桥式PCR扩增，从而建立测序用cDNA文库。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(4)中，用BGISEQ-500平台进行所述的高通量测序。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其中步骤(5)中，寻找差异表达基因的富集通路通过KEGG通路富集分析实现。
本发明的有益效果在于，利用本发明的氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，能够筛选出氨磷汀抗辐射损伤相关基因，并进行功能分析，从而从基因层面揭示氨磷汀抗辐射机制。
附图说明
图1为辐照组与模型组相比差异表达基因的火山图。
图2为辐照组与模型组相比差异表达基因的KEGG通路富集分析图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1：氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析
1、实验动物与分组
6-8周龄SPF级雄性SD大鼠10只，体重(205±15)g，由北京维通利华实验动物公司提供【SCXK(京)2016－0006】。依据动物体重，随机分为模型组和辐照组，每组5只。大鼠分笼饲养，每笼5只，自由饮食、饮水，饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产的SPF级大、小鼠维持饲料。饲养室温度控制在20-25℃，湿度控制在40-70％，大鼠饲养笼具、饮水瓶定期消毒，使用垫料均经高压灭菌。分组后用苦味酸对大鼠进行通号标记。动物适应性饲养1周后开展试验。
2、试验方法
(1)10只大鼠在检疫结束后分别腹腔注射氨磷汀(150mg/kg)，然后30min后对其中5只在麻醉状态下分别胸部进行20Gy电子射线照射。
(2)在照射后6h时分别摘取5只辐照后大鼠(辐照组)的胸部肺脏，以及5只未辐照大鼠(模型组)的胸部肺脏，并分别用TRIZOL法进行肺组织RNA提取。
(3)由提取的RNA分别建立每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库(提取的RNA富集mRNA，将RNA片段化，反转录合成cDNA并进行末端修复，连接产物通过特异的引物进行桥式PCR扩增，从而建立测序用cDNA文库)。
(4)对每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库分别用BGISEQ-500平台进行高通量测序(RNA-seq)。
(5)根据高通量测序结果，计算每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的不同基因的表达量，筛选出未辐照的大鼠与辐照后的大鼠的差异表达基因，并寻找差异表达基因的富集通路(通过KEGG通路富集分析实现)，分析差异表达基因的功能。
3、试验结果
以log2(Fold Change)绝对值大于1且FDR小于0.001为标准筛选差异表达基因：辐照组与模型组比较有3648个差异基因，其中2761个上调基因，887个下调基因。其中Pik3r5、Myl7分别是上调基因及下调基因的代表，很可能是氨磷汀抗辐射的目标基因。如图1的火山图能够较好地展现差异显著基因的整体分布情况。
为了揭示差异表达基因在氨磷汀干预中参与的生物学过程，对差异基因进行KEGG通路富集分析，结果显示氨磷汀中显著富集的通路有107条，差异基因参与了癌症通路、Ras信号通路、Rap1信号通路及黏着斑等通路(如图2)，在众多作用通路中，黏着斑通路差异表达基因最为显著。由此说明，差异表达基因在粘着斑通路富集最为显著，可以初步判断氨磷汀通过大鼠的黏着斑通路对大鼠的辐射损伤进行调控(细胞-基质粘附在细胞运动、细胞增殖、细胞分化、基因表达调控和细胞存活等重要生物学过程中起着重要作用，在细胞-细胞外基质接触点，形成特殊结构，称为黏着斑(focal adhesion)，能够将细胞固定在胞外基质上)。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种氨磷汀抗辐射损伤相关基因筛选与功能分析方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)注射与辐照：对多只大鼠分别腹腔注射氨磷汀后，对部分大鼠分别进行辐照；
(2)RNA提取：分别摘取每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的脏器并分别进行组织RNA提取；
(3)建立测序用cDNA文库：由步骤(2)提取的RNA分别建立每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库；
(4)高通量测序：对步骤(3)建立的每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的测序用cDNA文库分别进行高通量测序；
(5)测序结果分析：根据步骤(4)的高通量测序结果，计算每只未辐照的大鼠与每只辐照后的大鼠的不同基因的表达量，筛选出未辐照的大鼠与辐照后的大鼠的差异表达基因，并寻找差异表达基因的富集通路，分析差异表达基因的功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的大鼠为SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，每只大鼠的氨磷汀注射剂量为100-200mg/kg。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，每只大鼠在注射氨磷汀后20-60分钟进行辐照，辐照剂量为10-30Gy。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的脏器为大鼠胸部肺脏。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，对步骤(2)提取的RNA富集mRNA，将RNA片段化，反转录合成cDNA并进行末端修复，连接产物通过特异的引物进行桥式PCR扩增，从而建立测序用cDNA文库。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，用BGISEQ-500平台进行所述的高通量测序。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，寻找差异表达基因的富集通路通过KEGG通路富集分析实现。
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